KR20080069993A - 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적인 번역후 변형 - Google Patents

파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적인 번역후 변형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 번역후 변형에 관한 것이다. 이 디스플레이된 폴리펩티드는 적절한 오르소고날(orthogonal) 아미노아실-tRNA 합성효소 및 적절한 오르소고날 tRNA 종을 포함하는 생체내 오르소고날 번역 시스템을 사용함으로써 선별된 위치에서 파지-디스플레이된 융합 폴리펩티드 내로 도입된 1개 이상의 비천연 아미노산, 예를 들어, 아릴-아지드 아미노산 예컨대, p-아지도-L-페닐알라닌, 또는 알키닐-아미노산 예컨대, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함한다. 이 비천연 아미노산은 아지드-알킨 [3 + 2] 시클로부가 반응 및 슈타우딩거 변형과 같은 번역후 변형에 대한 표적을 유리하게 제공한다.

Description

파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적인 번역후 변형{SELECTIVE POSTTRANSLATIONAL MODIFICATION OF PHAGE-DISPLAYED POLYPEPTIDES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 모든 목적을 위해 그 내용이 본원에 완전히 참고로 도입되는, 2005년 10월 12일 출원된 미국 가출원 제60/726,137호 및 2005년 11월 16일 출원된 미국 가출원 제60/737,622호에 대한 우선권 및 이익을 주장한다.
연방 지원 연구 및 개발 하에 완성된 발명에 대한 권리에 관한 진술
본 발명은 허가 제ER46051호 하에 에너지부로부터의 정부 지원 및 허가 제GM56528호 하에 국립보건원으로부터의 정부 지원으로 완성되었다. 상기 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 단백질 화학, 예컨대, 번역 생화학의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 박테리오파지의 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 파지는 번역후 변형된 파지를 발생시키는 선별적 공유 번역후 변형에 대한 표적으로서 작용할 수 있는 비천연 아미노산을 가진 디스플레이된 폴리펩티드를 포함한다.
단백질 구조 및 기능 연구는 역사적으로 천연 발생 아미노산의 반응성 기를 사용하여 이용할 수 있는 화학반응에 의존하여 왔다. 불운하게도, 박테리아부터 인 간까지 모든 공지된 유기체는 (셀라노시스테인(예컨대, 문헌(A. Bock et al., (1991), Molecular Microbiology 5:515-20) 참조) 및 피롤라이신(예컨대, 문헌(G. Srinivasan, et al., (2002), Science 296:1459-62) 참조)이라는 희귀 아미노산을 제외하고) 동일한 20종의 공통된 아미노산을 코딩한다. R-기의 이러한 한정된 선택은 단백질 구조 및 기능 연구를 제한하는데, 이때 상기 연구는 천연 발생 아미노산의 화학적 성질에 의해 제한된다.
천연 아미노산의 한정된 수는 단백질 내의 모든 다른 아미노산을 배제하면서 고도로 표적화된 번역 후 단백질 변형을 일으키는 능력을 제한한다. 당업계에서 현재 이용되는 대부분의 변형 반응은 단백질 아미노산 측쇄에 존재하는 천연 발생 친핵성 잔기들을 표적화하는 친핵성 및 친전자성 반응 파트너들 사이의 공유결합 형성, 예를 들어, α-할로 케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 수반한다. 이 경우에서 선별성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근가능성에 의해 결정된다. 불운하게도, 천연 발생 단백질은 변형 반응에서 낮은 선택성을 초래하여 친핵성/친전자성 시약에 의한 고도로 표적화된 단백질 변형을 어렵게 만드는, 좋지 않은 위치에 있는 (예를 들어, 접근불가능한) 반응 부위 또는 다수의 반응 표적(예를 들어, 라이신, 히스티딘 및 시스테인 잔기)을 종종 함유한다. 게다가, 변형 부위는 전형적으로 라이신, 히스티딘 또는 시스테인의 천연 발생 친핵성 측쇄에 한정된다. 다른 부위에서의 변형은 어렵거나 불가능하다.
합성 물질 및 프로브를 사용하여 단백질을 선별적으로 변형시키고 단백질을 표면에 공유부착시키는 별법이 시도되고 있다. 이 별법에는 반합성(Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003, 72, 249-289), 시스테인 및 라이신 잔기를 선별적으로 표지하는 친전자성 시약의 사용(Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Rosendahl et al., Bioconjugate Chem. 2005, 16, 200-207), 및 화학적으로 아미노아실화된 tRNA를 사용한 시험관내 생합성에 의한, 반응성 측쇄를 가진 아미노산의 단백질 내로의 선별적 도입(Bain et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013-8014; Ellman et al., Methods Enzymol. 1991, 202, 301-336)이 포함된다. 이 방법들 각각은 표적 특이성의 결핍 또는 다른 실행불가능성이라는 문제점을 가진다.
기존 유전 레파토리(genetic repertoire)의 한계를 극복하기 위한 한 가지 방법은 구별가능한 화학적 성질을 가진 아미노산을 유전 코드에 부가하는 것이다. 이 방법은 숙주 세포 예를 들어, 진정세균(eubacterial) 대장균(이 콜라이(E. coli))의 생체내 단백질 생화학적 기구를 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 부가하는 오르소고날(orthogonal) tRNA 분자 및 상응하는 신규 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소를 사용하여 실행할 수 있는 것으로 입증되었다. 이 방법은 다양한 문헌, 예컨대, 문헌(Chin et al., Science (2003) 301:964-967; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:7566-7571; Wang et al., (2001) Science 292:498-500; Chin et al., (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; Chin and Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin, et al., (2002) PNAS United States of America 99:11020-11024; Wang and Schultz, (2002) Chem. Comm., 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); and Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005))에 기재되어 있다. 또한, 국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 국제특허공개공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 국제특허공개공보 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 2004년 7월 7일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2005/019415호; 2004년 7월 7일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2005/007870호; 2004년 7월 7일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2005/007624호; 및 2005년 9월 20일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2006/034332호를 참조한다.
파지 디스플레이 기법은 다양한 생물학적 분야에서 적용되고 있는 용이하고 널리 사용되는 기법이다. 예를 들어, 문헌(Smith and Petrenko, Chem. Rev., 97:391-410 (1997); Sidhu, Bimolecular Engineering 18:57-63 (2001); Rodi and Makowski, Current Opinion in Biotechnology 10:87-93 (1999); and Willats, Plant Molecular Biology 50:837-854 (2002))을 참조한다. 예를 들어, 파지 디스플레이는 큰 폴리펩티드 라이브러리로부터 고-친화성 리간드 및 수용체를 단리하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 파지 디스플레이는 큰 라이브러리가 재조합 방법에 의해 용이하게 발생될 수 있고, 라이브러리 구성원들이 반복된 농축 순환(round)을 위해 증폭될 수 있고, 일차 구조가 DNA 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다는 장점을 가진다. 그러나, 일반적으로 단백질과 마찬가지로, 파지-디스플레이된 펩티드 라이브러리 역시 번역후 변형에 대한 표적이 될 수 있는 작용기를 제한하는 20종의 공통된 아미노산 구축 블록(building block)으로 한정된다. 더욱이, 변형 반응이 단백질 활성 및 파지 생존력을 보존하는 생리학적으로 상용가능한 조건을 사용한, 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 번역후 변형 방법은 훨씬 더 어려운 도전 과제이다(Leieux and Bertozzi (1998) TIBTECH, 16:506).
파지-디스플레이 이용가능성의 범위를 확장하고자 하는 시도에서, 노렌(Noren)과 그의 동료들은 천연 셀레노시스테인 오팔 억제 tRNA를 사용하여 셀레노시스테인을 파지 디스플레이된 펩티드 내로 도입하였다(Sandman et al., J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:960-961). 로버츠(Roberts)와 그의 동료들은 화학적으로 아미노아실화된 앰버 억제자 tRNA(Noren et al., Science (1989) 244:182-188)를 사용한 시험관내 mRNA 디스플레이(Li et al., J. Am. Chem. Soc., (2002) 124:9972)를 이용하여 상기 방법을 다른 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드 라이브러리에 일반화시키고자 하였다. 그러나, 상당수의 이러한 tRNA들의 발생은 실행불가능하고, 상기 tRNA들은 화학양론적으로 소모된다.
당업계에 필요한 것은 단백질 구조 및 기능을 변형시키고 연구하기 위해 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입하기 위한 새로운 방법인데, 이때 디스플레이된 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산은 파지 상에 디스플레이되어 있는 동안 번역후 변형에 대한 선별적 표적이 될 수 있다. 고도로 선별적인 방식으로 파지-디스플레이된 단백질을 변형시킬 뿐만 아니라 변형 반응 후 파지 생존력을 보존하는 생리학적 조건 하에 파지-디스플레이된 단백질의 변형을 허용하는 단백질 변형 반응을 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 당업계에 존재한다. 당업계에 필요한 것은 파지-디스플레이된 단백질에 대한 표적화된 단백질 변형을 발생시키는 신규 방법인데, 이때 상기 변형은 고도로 특이적인 변형, 예를 들어, 폴리펩티드 내의 천연 발생 아미노산 중 어떠한 아미노산도 교차 반응되거나 부반응되지 않는 변형이다. 본원에 기재된 본 발명은 하기 개시내용을 검토할 때 자명한 바와 같이 상기 필요성 및 다른 필요성을 충족시킨다.
발명의 개요
고도로 선별적인 방식으로 단백질, 예를 들어, 파지-디스플레이된 단백질을 변형시키는 화학 반응이 필요하다. 단백질의 선별적인 변형을 위해 당업계에서 현재 이용되는 대부분의 반응은 낮은 선택성을 나타내며 천연 발생 아미노산 잔기로 한정된다. 본 발명은 이러한 문제점들에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명은 재조합 파지 발현 시약들과 함께 작동되도록 오르소고날 번역 시스템을 개조함으로써 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 단백질 내로 계획적, 부위-특이적 및 생화학적으로 도입하기 위한 시스템을 제공한다. 본 발명은 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입된 비천연 아미노산 잔기의 후속적 표적화 변형 방법을 제공한다. 본 발명은 신규 조성물(예를 들어, 다양한 번역후 변형을 포함하는 파지) 및 번역후 변형된 파지의 신규 제조 방법을 제공한다.
본원에 의해 제공된 파지-제조 시스템은 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 선별적으로 도입한 후 비천연 아미노산 잔기의 선별적 변형을 이용하여 상기 폴리펩티드를 변형시키기 위해 이. 콜라이 숙주 세포를 사용하는 오 르소고날 번역 시스템의 장점을 가진다. [3 + 2] 시클로부가 반응 및 슈타우딩거 결찰(Staudinger ligation)을 비롯하여, 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산 잔기를 변형시키기 위한 다양한 화학반응이 입증되어 있다. 비천연 아미노산 표적을 통해 파지-디스플레이된 단백질에 접합되는 물질의 성질은 특별히 한정되지 않고 임의의 원하는 물질일 수 있다.
본 발명은 디스플레이된 융합 폴리펩티드를 가진 파지를 제공하는데, 이때 상기 폴리펩티드는 1개 이상의 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 다양한 반응성 비천연 아미노산이 디스플레이된 폴리펩티드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 아릴-아지드 비천연 아미노산(예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알라닌) 또는 알키닐 비천연 아미노산(예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌)일 수 있다. 파지는 섬유상(filamentous) 파지, 예를 들면, M13-유래의 파지일 수 있다.
디스플레이된 폴리펩티드는 일반적으로 파지 캡시드(capsid) 단백질 (또는 이의 일부 또는 변이체) 및 원하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 부위-특이적 단백질분해효소, 예컨대, 인자 Xa, 인자 XIa, 칼리크베인(Kallikvein), 트롬빈, 인자 XIIa, 콜라게나제 또는 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 링커 단백질분해효소 인식 서열을 포함하도록 디자인된다.
다양한 종류의 변형 반응이 비천연 아미노산을 가진 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 변형에 사용된다. 예를 들어, (트리아졸 결합을 생성시키는) 아지드-알킨 [3 + 2] 시클로부가 반응 또는 슈타우딩거 결찰 반응이 이용될 수 있다. 아릴-아지드 및 알키닐 비천연 아미노산의 독특한 화학반응 때문에, 이들이 도입되는 파지-디스플레이된 단백질은 극히 높은 선택성을 가지도록 변형될 수 있다. 일부 경우, 비천연 아미노산 반응성 기는 생체내 시스템과 완전히 무관하여 반응 선택성을 개선한다는 장점을 가진다. 유리하게는, 슈타우딩거 반응의 이용은 바이러스 감염성을 보존한다.
본 발명의 변형된 파지는 경우에 따라 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 파지는 파지 폴리펩티드 라이브러리를 포함하는데, 이때 복수개의 폴리펩티드들이 파지에 의해 발현된다. 이 복수개의 파지 또한 본 발명의 특징이다. 본 발명의 파지는 정제되거나 단리될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 번역후 변형된 파지의 제조 방법들을 제공한다. 일반적으로 이 방법들은 (a) 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기(예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알라닌) 또는 알키닐 비천연 아미노산 잔기(예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌)인 1개 이상의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드를 포함하는 파지를 제공하는 단계; 및 (b) 비천연 아미노산 잔기가 공유 변형될 수 있는 조건 하에서 상기 파지를 반응시켜 번역후 변형된 파지를 제조하는 단계를 가진다. 이 변형 반응들은 아지드-알킨 [3 + 2] 시클로부가 반응 또는 슈타우딩거 결찰 반응을 이용할 수 있다. 슈타우딩거 변형 반응이 이용되는 경우, 생성된 변형된 파지는 생존가능한 비리온(virion)일 수 있다.
보다 구체적으로, 변형된 파지의 제공은 (i) (A) 파지를 코딩하는 핵산 분 자(이때, 원하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분은 1개 이상의 셀렉터(selector) 코돈을 포함함); (B) 상기 숙주 세포 내에서 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 코딩하는 핵산 분자; (C) 숙주 세포 내에서 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 코딩하는 핵산 분자(이때, O-RS는 숙주 세포 내에서 우선적으로 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화시키고, 상기 셀렉터 코돈은 O-tRNA에 의해 인식됨); 및 D) 아릴-아지드 또는 알키닐 비천연 아미노산을 포함하는 진정세균 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (ii) 상기 숙주 세포를 배양함으로써 상기 폴리뉴클레오티드 하위서열(subsequence)에 의해 코딩된 폴리펩티드를 생성하고(이때, 아릴-아지드 또는 알키닐 비천연 아미노산은 셀렉터 코돈에 반응하여 번역 도중에 폴리펩티드 내로 도입됨), 상기 폴리뉴클레오티드 하위서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 파지를 제조하는 단계(이때, 아릴-아지드 또는 알키닐 비천연 아미노산은 상기 폴리펩티드 내로 도입됨)를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 이. 콜라이 숙주 세포도 제공된다.
본 방법에서 사용되는 오르소고날 tRNA 및 합성효소는 특별히 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii) 아미노아실-tRNA 합성효소, 예컨대, 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소로부터 유도된 O-RS를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사용된 O-tRNA는 앰버 억제자 tRNA이다.
다른 실시양태에서, 번역후 변형을 위한 파지를 표적화하기 위해 추가 비천연 아미노산을 사용할 수 있다는 것도 고려되는데, 이때 비천연 아미노산은 억제자 tRNA 및 돌연변이 합성효소를 포함하는 오르소고날 번역 시스템을 사용함으로써 파지 내로 도입된다.
일부 측면에서, 1개 이상의 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 임의의 파지가 본 발명의 파지이고, 이때 1개 이상의 비천연 아미노산은 표적화된 공유 변형을 허용한다. 일부 측면에서, 파지는 번역후 변형 후에 생존할 수 있다. 이러한 방식으로 파지 내로 도입될 수 있는 반응성 아미노산은 파라-프로파르길옥시페닐알라닌, 파라-아지도-L-페닐알라닌, 파라-아세틸-L-페닐알라닌, 메타-아세틸-L-페닐알라닌, 파라-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌, 파라-(2-아민-1-히드록시에틸)-L-페닐알라닌, 파라-이소프로필티오카르보닐-L-페닐알라닌 및 파라-에틸티오카르보닐-L-페닐알라닌을 포함할 수 있다.
정의
본 발명을 상세히 기술하기 전, 본 발명이 특정한 생물학적 시스템으로 한정되지 않으며 상기 생물학적 시스템은 당연히 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정한 실시양태만을 기술하기 위한 것이지 한정하기 위한 것이 아님을 이해할 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용상 명확히 달리 명시하지 않는 한 복수 형태의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합물을 포함하고; "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 실질적으로 그 폴리뉴클레오티드의 많은 카피(copy)를 포함한다.
여기서 및 본 명세서의 하기 나머지 부분에서 달리 정의하지 않는 한, 본원 에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
오르소고날(Orthogonal): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "오르소고날"은 세포 또는 번역 시스템에 대한 내재성을 가진 상응하는 분자에 비해 감소된 효율을 가진 세포의 내재성 성분들과 함께 작용하거나, 세포의 내재성 성분들과 함께 작용하지 못하는 분자(예컨대, 오르소고날 tRNA(O-tRNA) 및/또는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS))를 지칭한다. tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소의 관점에서, 오르소고날은 내재성 tRNA 합성효소와 함께 작용하는 내재성 tRNA에 비해 내재성 tRNA 합성효소와 함께 작용하는 오르소고날 tRNA, 또는 내재성 tRNA와 함께 작용하는 내재성 tRNA 합성효소에 비해 내재성 tRNA와 함께 작용하는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소의 불능 또는 감소된 효율, 예컨대 20% 미만의 효율, 10% 미만의 효율, 5% 미만의 효율 또는 1% 미만의 효율을 의미한다. 오르소고날 분자는 세포 내에서 기능적으로 정상인 내재성 상보적 분자를 갖지 않는다. 예를 들어,세포 내에서 오르소고날 tRNA는 내재성 RS에 의한 내재성 tRNA의 아미노아실화에 비해 감소된 또는 심지어 0% 효율로 세포의 임의의 내재성 RS에 의해 아미노아실화된다. 또 다른 예에서, 오르소고날 RS는 내재성 RS에 의한 내재성 tRNA의 아미노아실화에 비해 감소된 또는 심지어 0% 효율로 원하는 세포의 임의의 내재성 tRNA를 아미노아실화시킨다. 제1 오르소고날 분자와 함께 작용하는 제2 오르소고날 분자를 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 오르소고날 tRNA/RS 쌍은 대조군, 예컨대, 상응하는 tRNA/RS 내재성 쌍 또는 활성 오르소고날 쌍(예컨대, 티로실 오르소고날 tRNA/RS 쌍)의 효율에 비해 일정한 효율(예컨대, 45% 효율, 50% 효율, 60% 효율, 70% 효율, 75% 효율, 80% 효율, 90% 효율, 95% 효율 또는 99% 이상의 효율)로 세포 내에서 함께 작용하는 도입된 상보적 성분들을 포함한다.
오르소고날 티로실-tRNA: 본원에서 사용된 바와 같이, 오르소고날 티로실 tRNA(티로실-O-tRNA)는 원하는 번역 시스템에 대해 오르소고날 tRNA이며, 이때 tRNA는 (1) 천연 발생 티로실-tRNA와 동일하거나 실질적으로 유사하거나, (2) 천연 또는 인공 돌연변이유발에 의해 천연 발생 티로실-tRNA로부터 유도되거나, (3) (1) 또는 (2)의 야생형 또는 돌연변이체 티로실-tRNA의 서열을 고려하는 임의의 과정에 의해 유도되거나, (4) 야생형 또는 돌연변이체 티로실-tRNA와 상동성을 나타내거나, (5) 도 1 또는 2에서 티로실-tRNA 합성효소에 대한 기질로서 표시된 임의의 예시적 tRNA와 상동성을 나타내거나, (6) 도 1 또는 2에서 티로실-tRNA 합성효소에 대한 기질로서 표시된 임의의 예시적 tRNA의 보존적 변이체이다. 티로실-tRNA는 아미노산으로 충전된 상태로 존재할 수 있거나 충전되지 않은 상태로 존재할 수 있다. 경우에 따라 "티로실-O-tRNA"는 동족 합성효소에 의해 티로신 또는 류신 외의 아미노산, 예컨대, 비천연 아미노산으로 충전(아미노아실화)된다는 것도 이해할 것이다. 사실상, 본 발명의 티로실-O-tRNA는 번역과정 동안에 셀렉터 코돈에 반응하여 본질적으로 임의의 천연 또는 인공 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 내로 삽입시키는 데 유리하게 사용된다는 것을 인식할 것이다.
오르소고날 티로실 아미노산 합성효소: 본원에서 사용된 바와 같이, 오르소고날 티로실 아미노산 합성효소(티로실-O-RS)는 원하는 번역 시스템 내에서 우선적 으로 티로실-O-tRNA를 아미노산으로 아미노아실화시키는 효소이다. 티로실-O-RS가 티로실-O-tRNA 상에 적재시키는 아미노산은 임의의 천연, 비천연 또는 인공 아미노산일 수 있고 본원에서 한정되지 않는다. 상기 합성효소는 경우에 따라 천연 발생 티로실 아미노산 합성효소와 동일하거나 상동성을 나타내거나, 도 1 또는 2에서 O-RS로서 표시된 합성효소와 동일하거나 상동성을 나타낸다(서열 번호 4 내지 10 참조). 예를 들어, O-RS는 도 1의 티로실-O-RS의 보존적 변이체일 수 있고/있거나, 서열 면에서 도 1의 O-RS와 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
동족체: 용어 "동족체"는 예를 들어, 오르소고날 tRNA 및 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소와 함께 작용하는 성분들을 지칭한다. 상기 성분들은 상보적인 것으로서 지칭될 수도 있다.
우선적으로 아미노아실화시킨다: 오르소고날 번역 시스템에 대하여 본원에서 사용된 바와 같이, O-RS는 그 자신이 발현 시스템 내에서 임의의 내재성 tRNA를 충전시키는 것보다 더 효율적으로 O-tRNA를 아미노산으로 충전시킬 때 동족체 O-tRNA를 "우선적으로 아미노아실화시킨다". 즉, O-tRNA 및 임의의 소정의 내재성 tRNA가 대략적으로 동등한 몰 비로 번역 시스템에 존재하는 경우, O-RS는 내재성 tRNA를 충전시키는 것보다 더 자주 O-tRNA를 충전시킬 것이다. 바람직하게는, O-tRNA 및 내재성 tRNA가 동등한 몰 농도로 번역 시스템에 존재하는 경우, O-RS에 의해 충전된 내재성 tRNA에 대한 O-RS에 의해 충전된 O-tRNA의 상대적 비율은 바람직하게는 O-RS가 O-tRNA만을 충전시키거나 거의 O-tRNA만을 충전시킬 정도로 높다. O-tRNA 및 O-RS가 동등한 몰 농도로 존재하는 경우, O-RS에 의해 충전되는 O-tRNA와 내재성 tRNA 사이의 상대적 비율은 1:1보다 높은, 바람직하게는 약 2:1 이상, 보다 바람직하게는 5:1, 보다 더 바람직하게는 10:1, 훨씬 더 바람직하게는 20:1, 훨씬 더 바람직하게는 50:1, 보다 더 바람직하게는 75:1, 훨씬 더 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.
O-RS는 (a) O-RS가 내재성 tRNA에 비해 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 경우 및 (b) O-RS가 O-tRNA를 임의의 천연 아미노산으로 아미노아실화시키는 것에 비해 아미노아실화가 비천연 아미노산에 대해 특이적인 경우 "우선적으로 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화시킨다". 즉, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산이 O-RS 및 O-tRNA를 포함하는 동등한 몰 양으로 번역 시스템에 존재하는 경우, O-RS는 천연 아미노산보다 더 자주 비천연 아미노산을 O-tRNA에 적재시킬 것이다.
바람직하게는, 천연 아미노산으로 충전된 O-tRNA에 대한 비천연 아미노산으로 충전된 O-tRNA의 상대적 비율은 높다. 보다 바람직하게는, O-RS는 O-tRNA만 또는 거의 O-tRNA만을 비천연 아미노산으로 충전시킨다. 천연 아미노산 및 비천연 아미노산이 동등한 몰 농도로 번역 시스템에 존재하는 경우, 비천연 아미노산을 사용한 O-tRNA의 충전과 천연 아미노산을 사용한 O-tRNA의 충전 사이의 상대적 비율은 1:1보다 높은, 바람직하게는 약 2:1 이상, 보다 바람직하게는 5:1, 보다 더 바람직하게는 10:1, 훨씬 더 바람직하게는 20:1, 훨씬 더 바람직하게는 50:1, 보다 더 바람직하게는 75:1, 훨씬 더 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.
셀렉터 코돈: 용어 "셀렉터 코돈"은 번역과정에서 O-tRNA에 의해서는 인식되나 내재성 tRNA에 의해서는 인식되지 않는 코돈을 지칭한다. O-tRNA 안티코돈 루프(loop)는 mRNA 상의 셀렉터 코돈을 인식하여 그의 아미노산 예컨대, 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내의 인식된 부위에 도입시킨다. 셀렉터 코돈은 예를 들어, 넌센스(nonsense) 코돈, 예컨대, 정지 코돈, 예를 들어, 앰버(amber), 오커(ochre) 및 오팔(opal) 코돈; 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈; 희귀 코돈; 천연 또는 비천연 염기 쌍으로부터 유도된 코돈 등을 포함할 수 있다.
억제자 tRNA: 억제제 tRNA는 예를 들어, 셀렉터 코돈에 반응하여 아미노산을 폴리펩티드 쇄 내로 도입시키는 기작을 제공함으로써 소정의 번역 시스템 내의 메신저 RNA(mRNA)의 판독을 변경시키는 tRNA이다. 예를 들어, 억제자 tRNA는 예컨대, 정지 코돈(예를 들어, 앰버, 오커 또는 오팔 코돈), 4 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 통해 판독할 수 있다.
억제 활성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제 활성"은 일반적으로 번역의 종결 또는 오번역(mistranslation)(예컨대, 프레임-변동)을 초래하는 코돈(예를 들어, 앰버 코돈 또는 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈인 셀렉터 코돈)을 통한 번역 판독을 허용하는 tRNA(예를 들어, 억제자 tRNA)의 능력을 지칭한다. 억제자 tRNA의 억제 활성은 제2 억제자 tRNA에 비해 또는 대조군 시스템 예컨대, O-RS를 갖지 않은 대조군 시스템에 비해 관찰된 번역 판독 활성율(%)로서 표시될 수 있다.
본 발명은 억제 활성을 정량화할 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 원하는 셀렉터 코돈(예컨대, 앰버 코돈)에 대한 특정한 O-tRNA 및 O-RS의 억제율은 그 자산을 코딩하는 핵산 내에 셀렉터 코돈을 포함하는 소정의 발현된 시험 마커(예컨대, LacZ)가 원하는 번역 시스템에서 나타내는 활성율(%)을 지칭하는데, 이때 상기 원하는 발현 시스템은 양성 대조군 구축물(construct)에 비해 O-RS 및 O-tRNA를 포함하고, 이때 상기 양성 대조군은 O-tRNA, O-RS 및 셀렉터 코돈을 갖지 않는다. 따라서, 예를 들어, 셀렉터 코돈을 갖지 않은 활성 양성 대조군 마커 구축물이 소정의 번역 시스템에서 해당 마커 분석에 대한 유니트(unit)로 X의 관찰된 활성을 나타내는 경우, 셀렉터 코돈을 포함하는 시험 구축물의 억제율은 시험 마커 구축물이 O-tRNA 및 O-RS를 포함하는 번역 시스템에서 발현된다는 점을 제외하고 양성 대조군 마커가 발현된 환경 조건과 본질적으로 동일한 환경 조건 하에서 시험 마커 구축물이 나타내는 X의 활성율(%)이다. 전형적으로, 시험 마커를 발현하는 번역 시스템은 O-RS 및 O-tRNA에 의해 인식되는 아미노산도 포함한다. 경우에 따라, 억제율 측정은 O-tRNA 및/또는 O-RS에 의해 인식되는 O-tRNA, O-RS 및/또는 관련 아미노산을 포함하지 않는 시스템에서 시험 마커와 동일한 셀렉터 코돈을 포함하는 "배경" 또는 "음성" 대조군 마커 구축물과 시험 마커의 비교에 의해 달성된다. 이 음성 대조군은 원하는 번역 시스템에서 마커로부터의 배경 신호 효과를 고려하여 억제율 측정을 표준화하는 데 유용하다.
억제 효율은 당업계에 공지된 다수의 분석법 중 임의의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제 리포터 분석법이 이용될 수 있는데, 예를 들어, 유도체화된 lacZ 플라스미드(이때, 구축물은 lacZ 핵산 서열 내에 셀렉터 코 돈을 가짐)가 본 발명의 O-tRNA를 포함하는 플라스미드와 함께 적절한 유기체(예컨대, 오르소고날 성분들이 사용될 수 있는 유기체)로부터 유래된 세포 내로 도입된다. 동족체 합성효소도 (발현된 경우 동족체 합성효소를 코딩하는 폴리펩티드 또는 폴리튜클레오티드로서) 도입될 수 있다. 세포는 소정의 밀도, 예를 들어, 약 0.5의 OD600까지 배지 중에서 생장시키고, β-갈락토시다제 분석법을 예컨대, BetaFluor™ β-갈락토시다제 분석 키트(Novagen)를 사용하여 수행한다. 억제율은 비교 대조군에 대한 상대적인 샘플 활성율로서, 예를 들어, 셀렉터 코돈보다 오히려 소정의 위치에서 상응하는 센스 코돈을 가진 유도체화된 lacZ 구축물로부터 관찰된 값으로서 계산될 수 있다.
번역 시스템: 용어 "번역 시스템"은 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 쇄(단백질) 내로 도입시키는 성분을 지칭한다. 번역 시스템의 성분은 예를 들어, 리보좀, tRNA, 합성효소, mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 O-tRNA 및/또는 O-RS는 시험관내 또는 생체내 번역 시스템, 예를 들어, 비-진핵 세포, 예컨대, (이. 콜라이와 같은) 박테리아, 또는 진핵 세포, 예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 해조류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 등에 첨가될 수 있거나 이들의 일부일 수 있다.
비천연 아미노산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산"은 20종의 공통된 천연 발생 아미노산 중 하나, 셀레노 시스테인 또는 피롤라이신이 아닌 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 지칭한다. 예를 들어, 비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌이 본 발명에서 사용될 수 있다.
로부터 유도된: 본원에서 사용된 용어 "로부터 유도된"은 특정한 분자 또는 유기체로부터 단리되거나, 특정한 분자 또는 유기체 또는 특정한 분자 또는 유기체의 정보를 사용하여 만든 성분을 지칭한다. 예를 들어, 제2 폴리펩티드로부터 유도된 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 유도된 종은 예를 들어, 천연 발생 돌연변이유발, 인공 지정 돌연변이유발 또는 인공 랜덤 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩티드를 유도하는 데 이용되는 돌연변이유발은 의도적으로 지정될 수 있거나 의도적으로 무작위적일 수 있거나, 각각의 조합일 수 있다. 제1 폴리펩티드로부터 유도된 상이한 폴리펩티드를 생성하기 위한 폴리펩티드의 돌연변이유발은 (예를 들어, 중합효소 부정확성에 의해 야기된) 무작위적 사건일 수 있고, 유도된 폴리펩티드는 예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같은 적절한 검색 방법에 의해 확인될 수 있다. 폴리펩티드의 돌연변이유발은 전형적으로 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 개조를 수반한다.
양성 선별 또는 검색 마커: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양성 선별 또는 검색 마커"는 존재하는 경우 예컨대, 발현되거나 활성화된 경우 특징을 갖는 세포 예를 들어, 양성 선별 마커를 가진 세포를 그 특징을 갖지 않는 세포로부터 구별시켜주는 마커를 지칭한다.
음성 선별 또는 검색 마커: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "음성 선별 또는 검색 마커"는 존재하는 경우 예컨대, 발현되거나 활성화된 경우 (예를 들어, 선 택된 성질 또는 특징을 갖는 세포와 비교할 때) 상기 성질 또는 특징을 갖지 않는 세포를 구별시켜주는 마커를 지칭한다.
리포터: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포터"는 원하는 시스템의 표적 성분들을 확인하고/하거나 선별하는 데 사용될 수 있는 성분을 지칭한다. 예를 들어, 리포터는 항생제 내성 또는 감수성을 부여하는 단백질 예컨대, 효소(예를 들어, β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 등), 형광 검색 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(예를 들어, (GFP), YFP, EGFP, RFP 등), 발광 마커(예를 들어, 초파리 루시퍼라제 단백질), 친화성 기초 검색 마커, 또는 양성 또는 음성 선별 마커 유전자 예컨대, lacZ, β-gal/lacZ(β-갈락토시다제), ADH(알코올 데히드로게나제), his3, ura3, leu2, lys2 등을 포함할 수 있다.
진핵유기체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "진핵유기체"는 진핵생물 계에 속하는 유기체를 지칭한다. 일반적으로, 진핵생물은 그들의 전형적인 다세포 조직화(그러나, 오로지 다세포 조직화로만 한정되지 않는다; 예컨대, 효모의 경우), 막-결합 핵 및 다른 막-결합 소기관의 존재, 선형 유전 물질(예컨대, 선형 염색체), 오페론의 부재, 인트론, 메세지 캡핑(message capping) 및 폴리-A mRNA의 존재, 및 다른 생화학적 특징 예컨대, 구별가능한 리보좀 구조에 의해 원핵유기체로부터 구별될 수 있다. 진핵유기체는 예를 들어, 동물(예컨대, 포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등), 섬모충, 식물(예컨대, 단자엽, 쌍자엽, 해조류 등), 진균, 효모, 편모충, 미포자충(microsporidia), 원생생물 등을 포함한다.
원핵유기체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "원핵유기체"는 모네라 계(Kingdom Monera)(원핵생물로도 지칭됨)에 속하는 유기체를 지칭한다. 일반적으로, 원핵유기체는 그들의 단세포 조직화, 발아 또는 분열(fission)에 의한 무성 생식, 막-결합 핵 또는 다른 막-결합 소기관의 부재, 원핵 염색체, 오페론의 존재, 인트론, 메세지 캡핑 및 폴리-A mRNA의 부재, 및 다른 생화학적 특징 예컨대, 구별가능한 리보좀 구조에 의해 진핵유기체로부터 구별될 수 있다. 원핵생물에는 진정세균(Eubacteria) 및 고세균(Archaea)(종종 "원시세균(Archaebacteria)"으로 불림)이 포함된다. 시아노박테리아(청녹색 해조류) 및 마이코플라즈마는 종종 모네라 계 하에 별도로 분류된다.
박테리아: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "박테리아" 및 "진정세균"은 고세균으로부터 구별될 수 있는 원핵유기체를 지칭한다. 유사하게, 고세균은 진정세균으로부터 구별될 수 있는 원핵유기체를 지칭한다. 진정세균과 고세균은 다수의 형태학적 및 생화학적 기준에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 리보좀 RNA 서열에서의 차이, RNA 중합효소 구조, 인트론의 존재 또는 부재, 항생제 감수성, 세포 벽 펩티도글리칸 및 다른 세포 벽 성분들의 존재 또는 부재, 막 지질의 분지 구조 대 비분지 구조, 및 히스톤 및 히스톤-유사 단백질의 존재/부재를 이용하여 유기체를 진정세균 또는 고세균으로 분류한다.
진정세균의 예에는 이. 콜라이, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)가 포함된다. 고세균의 예에는 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii)(Mj), 메타노사르시나 메이제이(Methanosarcina mazei)(Mm), 메타노박테리움 써모오토트로피 컴(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mt), 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노파이러스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 할로박테리움 예컨대, 할로페락스 볼케이니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus)(Af), 파이로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)(Pf), 파이로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii)(Ph), 파이로바큘럼 애로필럼(Pyrobaculum aerophilum), 파이로코커스 애비스시(Pyrococcus abyssi), 설폴로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus)(Ss), 설폴로버스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 애우로파이럼 페르닉스(Aeuropyrum pernix)(Ap), 써모플라스마 애시도필럼(Thermoplasma acidophilum) 및 써모플라스마 볼케이늄(Thermoplasma volcanium)이 포함된다.
보존적 변이체: 본원에서 사용된 바와 같이, 번역 성분에 대한 내용에 있어서 용어 "보존적 변이체"는 기능적으로 기준 성분과 유사한 작용을 하는 번역 성분, 예를 들어, 보존적 변이체 O-tRNA 또는 보존적 변이체 O-RS를 지칭하고, 기준 O-tRNA 또는 O-RS와 비교할 때 서열 내에 변이를 가진 보존적 변이체는 예를 들어, O-tRNA 또는 O-RS와 유사하다. 예를 들어, O-RS 또는 이 O-RS의 보존적 변이체는 비천연 아미노산, 예를 들어, N-아세틸갈락토스아민 잔기를 포함하는 아미노산으로 동족체 O-tRNA를 아미노아실화시킬 것이다. 본 실시예에서, O-RS와 보존적 변이체 O-RS는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다. 보존적 변이체가 상응하는 O-tRNA 또는 O-RS와 여전히 상보적인 한, 상기 보존적 변이체는 서열 내에 예를 들어, 1개의 변이, 2개의 변이, 3개의 변이, 4개의 변이 또는 5개 이상의 변이를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 보존적 변이체 O-RS는 그 자신의 기원인 O-RS에 비해 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보존적 변이체 O-RS는 그 자신의 기원인 O-RS에 비해 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 뿐만 아니라, O-RS의 생물학적 활성을 보유하는데, 예를 들어, 보존적 변이체 O-RS는 그 자신의 기원인 모 O-RS의 생물학적 활성의 10% 이상, 또는 20% 이상, 30% 이상 또는 40% 이상을 보유한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 보존적 변이체 O-RS는 그 자신의 기원인 모 O-RS 분자의 생물학적 활성의 50% 이상을 보유한다. 보존적 변이체 O-RS의 보존적 아미노산 치환은 아미노산 결합 주머니(pocket)를 비롯한 O-RS의 임의의 도메인에서 일어날 수 있다.
선별제 또는 검색제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "선별제 또는 검색제"는 존재하는 경우 집단으로부터 특정 성분들의 선별/검색을 가능하게 하는 시약을 지칭한다. 예를 들어, 선별제 또는 검색제는 예를 들어, 영양분, 항생제, 광의 파장, 항체, 발현된 폴리뉴클레오티드 등일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 선별제는 예를 들어, 농도, 강도 등에 의해 다양해질 수 있다.
에 반응하여: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에 반응하여"는 본 발명의 O-tRNA가 셀렉터 코돈을 인식하고 상기 tRNA에 커플링된 비천연 아미노산이 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입되는 것을 매개하는 과정을 지칭한다.
코딩: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "코딩"은 중합체성 거대분자 또는 서열 스트링(string) 내의 정보를 사용하여 제1 분자 또는 서열 스트링과 상이한 제2 분자 또는 서열 스트링을 생성시키는 임의의 과정을 지칭한다. 본원에서 사용 된 바와 같이, 상기 용어는 광범위하게 사용되며, 다양하게 응용될 수 있다. 일부 측면에서, 용어 "코딩"은 반-보존적 DNA 복제 과정을 지칭하는데, 이때 이중-가닥 DNA 분자의 한 가닥은 DNA-의존성 DNA 중합효소에 의해 새로이 합성된 상보적 시스터 가닥을 코딩하기 위한 주형으로서 사용된다.
또 다른 측면에서, 용어 "코딩"은 한 분자 내의 정보를 사용하여 제1 분자와 상이한 화학적 성질을 가진 제2 분자를 생성시키는 임의의 과정을 지칭한다. 예를 들면, DNA 분자는 (예를 들어, DNA-의존성 RNA 중합효소를 사용하는 전사 과정에 의해) RNA 분자를 코딩할 수 있다. 또한, RNA 분자는 번역과정에서와 같이 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 번역과정을 기술하는 데 사용되는 경우, 용어 "코딩"은 아미노산을 코딩하는 3 염기 코돈으로 확장된다. 일부 측면에서, RNA 분자는 예를 들어, RNA-의존성 DNA 중합효소를 사용하는 역전사 과정에 의해 DNA 분자를 코딩할 수 있다. 또 다른 측면에서, DNA 분자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는데, 이때 이 경우에서 사용되는 "코딩"은 전사 과정 및 번역과정 둘다를 수반한다는 것을 이해할 것이다.
아지도: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아지도"는 하기 화학식으로 표시되는, 전형적으로 탄소 원자에 부착된 화학적 기인 -N3을 지칭한다:
R-N=N+=N-
예를 들어, 비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌(도 3, 화학식 2)은 아지도 잔기를 포함한다. 또한, 아지도 염료는 아지도 치환기를 가진 염료 분자이다 (예를 들어, 도 16에서 아지도 염료 10 및 11 참조). 용어 "아지드"는 아지도 기(예를 들어, 벤질 아지드, 소듐 아지드 등)를 함유하는 화합물을 지칭한다. 아릴-아지드는 아지드 잔기를 포함하는 방향족 분자이고, 예를 들어, 비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌이 아릴-아지드이다.
알킨: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알킨"(종종 "아세틸렌"으로도 지칭됨)은 하기 화학식으로 표시되는, 2개 탄소 원자 사이의 삼중 결합을 함유하는 화학적 구조를 지칭한다:
C≡C-R
상기 식에서, R은 임의의 원자 또는 구조이다. 치환기로서 사용되는 경우, 알킨 잔기는 "알키닐" 기로 지칭된다. 알키닐 탄소 원자는 sp2 혼성화되어 있고 2개의 다른 원자와의 결합만을 형성하는데; 이 결합들 중 하나는 단일 결합인 반면, 제2 결합은 삼중 결합이다. 예를 들어, 아미노산 파라-프로파르길옥시페닐알라닌(pPRO-Phe)은 알키닐 기를 포함한다. 도 15의 화학식 9를 참조한다. 알키닐 치환기가 천연적으로 아미노산 상에 존재하지 않기 때문에, 임의의 알키닐 아미노산은 비천연 아미노산이다. 또한, 도 5의 화학식 6은 알킨-유도체화된 플루오레세인 염료의 화학식을 제공한다.
폴리펩티드: 폴리펩티드는 전형적으로 펩티드 공유결합(그러나, 펩티드 공유결합으로 한정되지 않음)에 의해 연결된 아미노산(천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합물)으로 이루어진 임의의 길이의 임의의 올리고머이다. 폴리펩티드는 임의의 공급원으로부터 유래된 것 예를 들어, 천연 발생 폴리펩티드, 재조합 분 자 유전적 기법에 의해 제조된 폴리펩티드, 세포 또는 번역 시스템으로부터의 폴리펩티드, 또는 무세포 합성 수단에 의해 제조된 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열 예를 들어, 그의 성분 아미노산의 일차 구조를 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 전장 서열로 한정되지 않지만, 일부 또는 완전한 서열일 수 있다. 게다가, 폴리펩티드가 임의의 특정한 생물학적 활성을 보유하거나 보유하지 않는다는 것에 의해 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩티드와 동의어이다. 용어 "펩티드"는 예를 들어, 길이에 있어서 2 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 작은 폴리펩티드를 지칭하나, 이로 한정되지 않는다.
번역후 변형: 본원에서 사용된 바와 같이, 번역후 변형은 폴리펩티드가 완전히 번역된 후 또는 번역과 동시에 세포 또는 무세포 시스템에서 일어날 수 있는 폴리펩티드에 대한 변형이다. 번역후 변형은 생체내에서 천연적으로 일어날 수 있고, 많은 경우 천연 폴리펩티드가 생물학적 활성을 갖기 위해 요구된다. 예를 들어, 글리코실화 및/또는 인산화를 비롯한 매우 다양한 번역후 변형이 생체내에 존재하는 것으로 알려져 있고, 전형적으로 세포 단백질과 같은 내재성 세포 성분에 의해 조절된다. 폴리펩티드는 많은 종류의 번역후 변형을 받을 수 있고, 변형은 폴리펩티드 분자 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다.
공지된 번역후 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유부착, 헴(heme) 잔기의 공유부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유부착, 포스포티딜이노시톨의 공유부착, 가 교-결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 데메틸화(demethylation), 공유 가교-결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미체화, 셀레노일화, 황화, 단백질로의 아미노산의 tRNA 매개 부가 예컨대, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 포함한다. 이러한 변형은 당업자에게 잘 공지되어 있고 과학 문헌, 예컨대, 문헌(Creighton, T. E., Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993); Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, B. C., ed., Academic Press, New York (1983), pp. 1-12; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors," Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990), and Rattan et al., Ann. N.Y Acad. Sci., 663:48-62 (1992))에 매우 상세히 기재되어 있다.
고체 지지체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고체 지지체"는 직접적으로 또는 간접적으로 폴리펩티드(예를 들어, 폴리펩티드를 포함하는 파지)의 합성, 부착 또는 고정화를 가능하게 하도록 작용화될 수 있는 실질적으로 고정화된 배열의 물질로 이루어진 매트릭스를 지칭한다. 또한, 용어 "고체 지지체"는 "수지" 또는 "고체 상(phase)"과 같은 용어를 포함한다. 고체 지지체는 중합체, 예를 들어, 유기 중합체 예컨대, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리 에틸렌옥시 및 폴리아크릴아미드뿐만 아니라 이들의 공중합체 및 그래프트 중합체로 구성될 수 있다. 고체 지지체는 무기 물질, 예컨대, 유리, 실리카, 실리콘, 조절된-공극-유리(CPG), 역상 실리카, 또는 임의의 적절한 금속일 수 있다. 여기에 기재된 것 외에, 용어 "고체 지지체"는 임의의 종류의 코팅 또는 임의의 다른 종류의 2차 처리를 받은 임의의 고체 지지체, 예를 들어, 랭뮤이르-블로제트(Langmuir-Blodgett) 필름, 자가-조립 단일층(SAM), 솔-겔 등 또한 포함한다.
어레이: 본원에서 사용된 바와 같이, "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 예를 들어, 고체 지지체 상에 및/또는 용기 배열 내에 존재하는 요소들(예컨대, 파지-디스플레이된 폴리펩티드)의 배열이다. 어레이는 가장 흔하게는 특정한 공간적-물리적 관계를 가진 물리적 요소들로서 간주되지만, 본 발명은 적접적인 공간적 구조화를 갖지 않는 "가상" 어레이를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 물리적으로 상이한 성분들 내에 또는 상에 위치하는 원하는 하나 또는 수개의 성분들의 위치를 추적하는 데 컴퓨터 시스템을 사용할 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템은 어레이 구성원들의 물리적 위치의 "검색" 표를 제공함으로써 가상 어레이를 생성시킨다. 따라서, 어레이의 구성원들이 특정되고 위치될 수 있는 한, 움직이는 성분들조차도가상 어레이의 일부일 수 있다. 이것은 본 발명의 어레이가 유동하는 미세규모 시스템에 존재하거나 1개 이상의 마이크로타이터 트레이(microtiter tray)에 존재하는 경우에 적절하다.
특정 어레이 포맷은 종종 "칩" 또는 "바이오칩"으로서 지칭된다. 어레이는 어드레스로 불러낼 수 있는(addressable) 다수의, 예를 들어, 2 내지 약 10개의 저 밀도 위치, 예를 들어, 약 100개 이상의 중밀도 위치, 또는 다수의, 예를 들어, 1000개 이상의 고밀도 위치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 칩 어레이 포맷은 용이한 제작, 취급, 배치, 적층, 시약 도입, 검출 및 저장을 가능하게 하는 기하학적으로 규칙적인 형태이다. 그러나, 상기 포맷은 불규칙적일 수 있다. 한 전형적인 포맷에서, 어레이는 이 어레이 상의 구성원 세트의 각 위치 사이에 규칙적인 공간을 두면서 열(row) 및 단(column) 포맷으로 형상화되어 있다. 별법으로, 상기 위치들은 균등한 처리 또는 샘플링을 위해 묶이거나, 혼합되거나, 또는 균일하게 블렌딩될 수 있다. 어레이는 각 위치가 고-처리 취급, 로보트에 의한 전달, 마스킹, 또는 시약 샘플링을 위해 공간적으로 어드레스로 불러낼 수 있도록 형상화된 어드레스로 불러낼 수 있는 복수개의 위치를 포함할 수 있다. 어레이는 레이저 조명에 의한 스캐닝, 공초점 또는 편향 광 모음, CCD 검출 및 화학적 발광을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 특정한 수단에 의한 검출 또는 정량화를 용이하게 하도록 형상화될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "어레이" 포맷은 어레이(즉, 다수의 칩으로 이루어진 어레이), 마이크로칩, 마이크로어레이, 단일 칩 상에 조립된 마이크로어레이, 마이크로웰 플레이트에 부착된 생체물질로 이루어진 어레이, 또는 원하는 시스템과 함께 사용하기에 적합한 임의의 다른 포맷을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
공유결합: 본원에서 사용된 바와 같이, 공유결합은 원자들 사이에 공유된 전자를 포함하는 결합이다. 공유결합은 "화학결합"과 동의어이다. 비-공유결합은 공유결합이 아닌 임의의 결합이다. 비-공유결합의 한 종류는 이온결합이다. 이온결합 은 반대로 하전된 화학적 잔기들 사이의 인력이다. 이온결합에서, 전자는 공유되지 않으나, 불균등하게 전달되어 불균등한 전하 분포 및 양성/음성 전하 인력을 초래한다.
도 1은 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 예를 제공한다.
도 2는 오르소고날 tRNA를 비천연 아미노산인 파라-아지도-L-페닐알라닌으로 충전시키는 능력을 가진 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체의 아미노산 서열의 예를 제공한다.
도 3은 O-메틸-티로신(1), 파라-아지도-L-페닐알라닌(2), 파라-아세틸-L-페닐알라닌(3), 파라-벤조일-L-페닐알라닌(4) 및 3-(2-나프틸)알라닌(5)인 5개(1번 내지 5번으로 지칭된다)의 비천연 아미노산의 구조 및 상응하는 명칭을 제공한다.
도 4는 M13-SBP 파지 수율(PFU/㎖로서 표현된다)이 상응하는 비천연 아미노산의 존재에 의존한다는 것을 보여주는 실험 결과를 제공한다.
도 5는 알킨-유도체화된 플루오레세인 염료의 화학식(화학식 6)을 제공한다.
도 6은 항-플루오레세인(I) 또는 항-pIII(II) 일차 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석 후의 화학발광 이미지를 제공하는데, 이때 샘플은 M13KE-SBP 파지의 [3 + 2] 시클로부가 반응 후의 반응 물질을 구성하고, 상기 파지는 (a) p-아지도-L-페닐알라닌(2)의 존재 하에 균주 TTS/RS에서 제조되거나, (b) XL1-Blue 내에서 제조된다.
도 7은 파지 스트렙타비딘 결합 ELISA의 흡광도 값 결과를 제공한다. 흡광도는 492 nm에서 측정되었다.
도 8은 도 7에 나타낸 파지 스트렙타비딘 결합 ELISA의 그래픽 결과를 제공한다. (▲) M13KE; (□) p-아세틸-L-페닐알라닌(3)의 존재 하에 균주 TTS/RS에서 제조된 M13KE-SBP 파지; (○) p-아지도-L-페닐알라닌(2)의 존재 하에 TTS/RS에서 제조된 M13KE-SBP 파지; (×) XL1-Blue에서 제조된 M13KE-SBP.
도 9는 파지 회수의 농축률 결정의 결과를 제공한다.
도 10은 포스핀(7 또는 8)과 함께 (파지 Ph-Az로부터의) 파라-아지도-L-페닐알라닌 잔기를 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드를 수반하는 슈타우딩거 접합 반응을 개략적으로 보여준다.
도 11은 포스핀(7 또는 8)과의 슈타우딩거 결찰 후 파지 Ph-Az 및 Ph-Q의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 이미지를 제공한다. 상기 분석은 항-플루오레세인 일차 항체(레인 1 내지 4) 또는 항-pIII 일차 항체(레인 5 내지 8)를 사용하였다.
도 12는 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 단백질과 포스핀(7)의 슈타우딩거 결찰로부터의 반응 생성물의 MALDI-TOF 분석을 제공한다. 피크 A 및 B는 각각 접합 생성물 및 환원 생성물로 배정될 수 있고; 소수의 피크 a2, b2, a1 및 b1은 매트릭스-부가물로부터 유래되고, A 및 B로부터의 메티오닌은 제외된다.
도 13은 pAzPhe 함유 Z-도메인 단백질과 포스핀(8)의 슈타우딩거 결찰로부터의 반응 생성물의 MALDI-TOF 분광 분석을 제공한다.
도 14는 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 단백질과 포스핀(7)의 슈타우딩거 결찰 및 필적할만한 양의 진정한 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 돌연변이체로의 도핑으로부터 얻은 반응 생성물의 MALDI-TOF 분석을 제공한다.
도 15는 비천연 알키닐 아미노산 파라-프로파르길옥시페닐알라닌(pPRO-Phe; IUPAC 명명법에 따라 2-아미노-3-[4-(프로프-2-이닐옥시)페닐]-프로피온산으로도 공지되어 있음)의 화학식(9)을 제공한다. 도 15는 실온에서 구리의 존재 하에 아지도와 알킨의 [3 + 2] 시클로부가 반응에 의한 트리아졸 구조의 비가역적 형성의 일반화된 화학반응을 제공한다.
도 16은 2개의 아지도-작용화 염료의 화학식(10 및 11)을 제공한다. 염료(10)는 댄실 형광단(dansyl fluorophore)을 함유하고, 염료(11)는 플루오레세인 형광단을 함유한다.
고도로 선별적인 방식으로 파지-디스플레이된 단백질을 변형시키는 화학반응이 필요하다. 단백질 활성 및 파지 생존력을 보존하기 위해 생리학적으로-상용가능한 조건 하에서 작동할 수 있는 변형 반응도 필요하다. 단백질, 예를 들어, 파지-디스플레이된 단백질의 선별적 변형을 위해 당업계에서 현재 사용되고 있는 대부분의 반응은 아미노산 측쇄 내의 천연 발생 친핵성 잔기들을 표적화하는 친핵성 및 친전자성 반응 파트너들 사이의 공유결합 형성을 수반한다. 이 경우 선별성은 단백질 내의 친핵성 잔기들의 수 및 접근가능성에 의해 결정된다. 불운하게도, 천연 발생 단백질은 친핵성/친전자성 시약에 의한 고도로 표적화된 단백질 변형을 어렵게 만드는 변형 반응의 낮은 선별성을 초래하는, 좋지 않은 위치에 있는 (예를 들어, 접근불가능한) 반응 부위 또는 다수의 반응 표적(예를 들어, 라이신, 히스티딘 및 시스테인 잔기들)을 종종 함유한다. 더욱이, 변형 부위는 전형적으로 라이신, 히스티딘 또는 시스테인의 천연 발생 친핵성 측쇄로 한정된다. 다른 부위에서의 변형은 어렵거나 불가능하다.
본 발명은 이 문제점들에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명은 재조합 파지 발현 시약들과 함께 작동되도록 오르소고날 번역 시스템을 개조함으로써 새로운 성질을 가진 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 단백질 내로 계획적, 부위-특이적 및 생화학적으로 도입하기 위한 시스템을 제공한다. 본 발명은 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입된 이 비천연 아미노산 잔기들의 후속적 표적화 변형 방법을 제공한다. 본 발명자들은 본원에서 신규 조성물(예를 들어, 다양한 번역후 변형을 포함하는 파지) 및 번역후 변형된 파지의 신규 제조 방법을 기술한다.
본 발명에 의해 제공된 파지-제조 시스템은 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 선별적으로 도입한 후 비천연 아미노산 잔기의 선별적 변형을 이용하여 상기 폴리펩티드를 변형시키기 위해 이. 콜라이 숙주 세포를 사용하는 오르소고날 번역 시스템의 장점을 가진다. [3 + 2] 시클로부가 반응 및 슈타우딩거 결찰을 비롯하여, 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산 잔기를 변형시키기 위한 다양한 화학반응이 본원에서 고려되고 설명된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 오르소고날 번역 시스템은 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA, 및 이. 콜라이 숙주 세포에서 상기 오르소고날 tRNA를 비천연 아미노산으로 특이적으로 충전시키는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소를 포함한다. 원하는 파지-디스플레이된 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입은 원하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 소정의 부위에서 셀렉터 코돈을 함유하여 비천연 아미노산의 도입을 신호하도록 개조함으로써 임의의 원하는 부위에서 일어나도록 계획될 수 있다.
본 개시내용은 다수의 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입시키는 것을 기술한다. 이 아미노산들에는 O-메틸-티로신, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌 및 3-(2-나프틸)알라닌이 포함된다. 아릴-아지드 아미노산, 예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알라닌이 특이적 및 위치선별적 번역후 변형에 대한 흥미로운 표적을 제공한다. 알키닐 기를 포함하는 비천연 아미노산, 예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌 또한 번역후 변형에 대한 표적으로서의 파지-디스플레이된 폴리펩티드에서 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산의 번역후 변형은 파지 생존력을 보존하는, 비교적 온화하고 생리학적으로-상용가능한 시험관내 또는 생체내 반응 조건을 이용하여 수행한다.
아릴-아지드 및 알키닐 비천연 아미노산의 독특한 화학반응 때문에, 이들이 도입되는 파지-디스플레이된 단백질은 고도로 선별적으로 변형될 수 있다. 일부 경우, 비천연 아미노산 반응성 기는 생체내 시스템과 완전히 무관하여 반응 선택성을 개선한다는 장점을 가진다.
비천연 아미노산 표적을 통해 파지-디스플레이된 단백질에 접합되는 물질의 성질은 특별히 한정되지 않고 임의의 원하는 물질, 예를 들어, 염료, 형광단, 가교결합제, 사카라이드 유도체, 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 바이오틴의 유도체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들)(예컨대, DNA, RNA 등), 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등일 수 있다. 본원의 개시내용은 접합 물질로서 유도체화된 플루오레세인 또는 댄실 형광단 염료를 실험적으로 사용하는 것을 기술한다. 그러나, 광범위한 범위의 접합가능한 물질이 고려되기 때문에, 본 발명은 이 접합 물질, 예를 들어, 상기 나열된 것들의 사용으로 한정되지 않는다.
파지 디스플레이
파지 디스플레이 기술은 다양한 생물학적 분야에서 널리 사용되는 기법이 되었다. 파지 디스플레이는 특히, 펩티드(즉, 폴리펩티드) 라이브러리 검색 프로토콜에서 사용된다. 다양한 적용에는 친화성 선별(예를 들어, 표적 수용체 선별), 에피토프 맵핑 및 모방, 신규 수용체 및 천연 리간드의 확인, 약물 발견, 백신 개발 및 진단을 위한 에피토프 발견, 및 DNA-결합 단백질의 연구가 포함된다. 파지-디스플레이 기술에서 사용될 수 있는 많은 프로토콜, 시약 및 변이체 파지 게놈 (및 변이체 파지 유전자)를 기술하는 다양한 문헌이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌(Smith and Petrenko, Chem. Rev., 97:391-410 (1997); Sidhu, Bimolecular Engineering 18:57-63 (2001); Rodi and Makowski, Current Opinion in Biotechnology 10:87-93 (1999); and Willats, Plant Molecular Biology 50:837- 854 (2002))을 참조한다.
본 개시내용에 기재된 실험은 섬유상 M13KE 파지 시스템(New England BioLabs, Inc.)을 사용한다. M13KE는 파지 디스플레이 적용에 있어서 N-말단 pIII 융합체로서의 펩티드의 발현을 위해 고안된 M13mp19의 유도체이다(Zwick et al., (1998) Anal. Biochem., 264:87-97). M13KE로 구축한 라이브러리는 5가이다(즉, 성숙 비리온 내의 pIII의 5개 카피 모두가 융합된 펩티드를 보유한다). 모 M13mp19에 비해, pIII 리더 펩티다제 절단 부위를 플랭킹하는 Acc65I/KpnI 및 EagI 부위들이 도입되었고, 다중 클로닝 부위(MSC) 내의 Acc65I/KpnI 부위가 결실되었다. 파지-디스플레이된 랜덤 펩티드 라이브러리는 랜덤 펩티드 라이브러리 및 pIII 리더 서열의 일부를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드에 연장 프라이머를 어닐링하고 DNA 중합효소로 연장하고 Acc65I 및 EagI으로 절단함으로써 구축된다(Noren and Noren (2001) Methods 23:169-178). 생성된 절단된 이중체(duplex)는 동일한 효소로 절단된 M13KE 내로 삽입된다.
본원에 제공된 실시예가 M13KE 파지 시스템을 사용하지만, 본 발명이 이 특정 시스템으로 한정되는 것은 아니다. 사실상, 당업자는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 입수가능한 대체 파지 디스플레이 시약 및 프로토콜을 인식할 것이다. 이 대체 시약 및 프로토콜은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 청구된 본 발명에 포함된다.
일반적으로, 원하는 폴리펩티드의 디스플레이는 그 폴리펩티드를 파지 캡시드(코트) 단백질 또는 캡시드 단백질의 단편, 돌연변이체 또는 다른 변이체와 융합시킴으로써 달성된다. 이 캡시드 단백질에는 pIII, pVI, pVII, pVIII 및 pIX가 포함될 수 있다. 본 발명을 설명하기 위한 (한정하기 위한 것은 아님) 목적으로, 본원의 실시예는 파지 pIII 코트 단백질 아미노산 서열을 포함하는 파지-디스플레이된 융합 폴리펩티드의 발생을 기술한다. 본 발명이 원하는 융합 단백질의 디스플레이를 위한 pIII 폴리펩티드 서열의 사용으로 한정되는 것은 아니다.
일부 파지 시스템에서, 링커 단백질분해효소 인식 신호 서열은 캡시드 융합 폴리펩티드 내로 도입되어 융합 단백질 잔기의 절단 및/또는 방출을 용이하게 할 수 있다. 인자 Xa, 인자 XIa, 칼리크베인, 트롬빈, 인자 XIIa, 콜라게나제 및 엔테로키나제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 단백질분해효소 신호 서열이 공지되어 있다. 임의의 적절한 단백질분해효소 인식 신호 및 상응하는 단백질분해효소가 본 발명에서 사용될 수 있다.
유사하게, 본 발명을 설명하기 위해(한정하기 위한 것은 아님), 본원의 개시내용은 비천연 아미노산 잔기가 번역후 변형되는, 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP)를 포함하는 모델 파지-디스플레이된 융합 단백질 내로 도입될 수 있다는 것을 입증한다. 비천연 아미노산의 도입은 이러한 모델 단백질로 한정되는 것은 아니다. 본 개시내용으로부터, 비천연 아미노산을 원하는 임의의 소정의 파지-디스플레이된 단백질 내로 도입시키는 것이 치료 및 연구 목적으로 사용하기 위한 매우 다양한 단백질에 유리하다는 것은 분명하다.
또한, 본 발명은 번역후 변형되는 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 파지를 제공하는데, 이때 상기 파지는 정제되거나 단리된다. 예를 들어, 상기 파지는 PEG 침전 및/또는 원심분리에 의해 정제되고/되거나 단리될 수 있다. 실시예 3을 참조한다. 다른 파지 침전 및 정제/단리 기법, 예를 들어, 면역-친화성과 같은 친화성 정제 기법의 이용 또한 당업계에 공지되어 있다.
파지 디스플레이 라이브러리 및 어레이
번역후 변형되는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 파지 디스플레이는 다양한 용도로 사용된다. 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 사용에 대한 논의는 다양한 문헌, 예를 들어, 문헌(Smith and Petrenko, Chem. Rev., 97:391-410 (1997))에서 발견된다.
일부 실시양태에서, 번역후 변형되는 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드는 동일한 또는 상이한 코딩된 폴리펩티드 또는 이들 폴리펩티드의 변이체(이들 모두 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함함)를 보유하는 복수개의 파지의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 파지가 상이한 폴리펩티드 서열을 디스플레이하는 경우, 디스플레이된 폴리펩티드는 라이브러리, 예를 들어, 원하는 코딩 서열의 랜덤 돌연변이체 라이브러리를 포함한다.
번역후 변형되는 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드가 라이브러리를 구성하는 경우, 디스플레이된 폴리펩티드 후보들로 이루어진 풀(pool)로부터 원하는 폴리펩티드 종 (또는 이 폴리펩티드 종을 코딩하는 핵산)을 선별하는 데 적용되는 선별 단계가 일반적으로 존재한다. 선별은 일부 사용자-정의 기준에 따라 증가된 "적합성(fitness)"을 가진 하위집단을 제공하기 위해 파지로부터 유래된 폴리펩티드로 이루어진 초기 집단을 추려내는 단계로 구성될 수 있다. 대부분의 경우, 선별의 제1 순환(round)에의 라이브러리 투입(input)은 매우 큰 초기 수이고, 선별된 하위집단은 초기 집단의 일부이며, 이때 더 적합한 클론이 과다 표시된다. 이 집단은 하위집단 내의 각 개별 파지가 새로이 증폭된 원액(stock) 중에서 증폭되도록 신선한 박테리아 숙주 세포를 감염시킴으로써 "증폭될" 수 있다. 그 다음, 증폭된 집단을 추가 선별 순환으로 선별하여 출발 펩티드로 이루어진 훨씬 더 적합한 하위세트를 수득할 수 있다.
일반적으로, 선별 효능을 증가시키기 위해 종종 어느 정도까지 개조될 수 있는 2개의 중추적인 선별 파라미터가 있다. 첫째, 엄격도는 보다 높은 적합성을 가진 폴리펩티드가 보다 낮은 적합성을 가진 펩티드에 비해 유리한 정도이고, 둘째, 수율은 선별에서 생존하는, 소정의 적합성을 가진 입자의 비율이다. 선별의 궁극적인 목적은 통상적으로 가장 우수한 적합성을 가진 펩티드를 단리하는 것이다. 그러나, 가장 적합한 폴리펩티드에 대한 선별은 적당한 수율을 허용하기에 적합한 엄격도와 균형을 이루어야 한다. 엄격도가 너무 높게 설정된 경우, 특이적으로 선별된 파지의 수율은 비특이적으로 단리된 파지의 배경(backgroud) 미만으로 떨어질 것이고, 높은 적합성에 대한 식별력이 상실된다.
파지-디스플레이된 폴리펩티드 집단에 가해지는 가장 일반적인 선별 압력 중 하나는 표적 수용체에 대한 친화성이다. 친화성 선별은 생화학 분야에서 통상적으로 사용되는 표준 친화성 정제 기법들을 약간 변형시킴으로써 통상적으로 달성된다. 따라서, 예를 들어, 수용체는 고체 지지체에 고정화되고, 파지 혼합물은 고정화된 수용체 위를 통과한다. 라이브러리에서 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 소수만이 상기 수용체에 결합하고, 표면 또는 매트릭스 위에 포획되어, 결합되지 않은 파지가 세척되어 제거되게 한다. 최종적으로, 결합된 파지는 수용체-펩티드 상호작용을 느슨하게 하는 용액으로 용출되어, 수용체-결합 클론이 풍부한 파지 "용출물" 집단을 제공한다. 용출된 파지는 여전히 감염성을 나타내며 단순히 새로운 박테리아 숙주 세포를 감염시킴으로써 증식되어, 친화성 선별의 또 다른 순환에의 투입물로서 작용할 수 있는 "증폭된" 용출물을 제공한다. 최종 용출물로부터의 파지 클론들은 증식되어 그들의 특징이 개별적으로 규명된다. 표적 수용체와의 결합을 책임지는 펩티드들의 아미노산 서열은 단순히 바이러스 DNA에서 상응하는 코딩 서열을 확인함으로써 결정된다.
파지-유래의 폴리펩티드는 표적 수용체에 대한 친화성 외의 적합성 기준에 기초하여 선별될 수 있다. 예를 들어, 디스플레이된 폴리펩티드 라이브러리를 보유하는 파지는 원하는 생물학적 활성(예를 들어, 효소 활성, 개선된 효소 활성, 또는 특정한 물질 또는 억제제에 대한 내성을 나타내는 활성)에 기초하여 선별될 수 있다.
이 파지-선별 기법의 변법은 많으며 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 다수의 문헌이 파지 라이브러리 검색 방법을 주제로 다루고 있다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지는 적절한 지지체 상에 고정화될 수 있다. 이 측면에서, 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되는 비천연 아미노산은 경우에 따라, 예를 들어, [3 + 2] 시클로부가 반응 또는 슈타우딩거 결찰 반응을 이용하여 고정화된 상(phase)과의 커플링을 형성하기 위한 반응성 잔기로서 사용될 수 있다.
파지 (또는 파지 라이브러리)가 고정화될 수 있는 고체 지지체의 성질은 한정되지 않는다. 예를 들어, 파지는 폴리스티렌 접시, 불투과성 플라스틱 비드, 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 상자성 비드 및 투과성 비드 아가로스 겔을 포함하는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고정화된 파지는 일부 특정한 관계로 배열된다. 즉, 고정화된 파지는 어레이를 형성한다. 고체 지지체 포맷 및 어레이뿐만 아니라 고체 지지체와의 연결을 형성하기 위한 비천연 아미노산의 사용에 대한 논의는 예를 들어, 국제특허공개공보 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS")에서 발견될 수 있다.
오르소고날 번역 시스템 성분
본 발명의 일부 측면에서, 비천연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌(도 3, 화학식 2 참조)을 원하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입시킨다. 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되는 경우, 이 비천연 아미노산은 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 번역후 변형을 위한 [3 + 2] 시클로부가 반응 및 슈타우딩거 변형 반응에서 화학적 표적으로서 작용할 수 있다.
이 비천연 아미노산의 도입을 위한 오르소고날 성분은 본원에 제공되어 있다. 도 1은 오르소고날 억제자 tRNA를 p-아지도-L-페닐알라닌으로 충전시킨 후 셀렉터 코돈에 반응하여 번역과정 동안에 p-아지도-L-페닐알라닌을 도입시키는 7종의 돌연변이체 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소 종(서열 번호 4 내지 10 참조)을 제공한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 오르소고날 억제자 tRNA는 서열 번호 1에 제공되어 있다.
p-아지도-L-페닐알라닌의 도입에 적합한 오르소고날 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소는 문헌(Chin et al., J. Am. Chem. Soc., (2002) 124:9026-9027), 및국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS") 및 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")에도 기재되어 있고, 이들 문헌은 모든 목적을 위해 본원에 완전히 참고로 도입된다. 추가로, 선행 기술 및 본 개시내용도 서열에 의해 특정되지 않은 추가 오르소고날 tRNA 및 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소의 합성을 위한 지침을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 비천연 알키닐 아미노산 또한 원하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되어 번역후 변형을 위한 표적으로 작용한다. 예를 들어, 비천연 알키닐 아미노산 파라-프로파르길옥시페닐알라닌(pPRO-Phe; 도 15에서 화학식 9 참조)은 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 알키닐 아미노산은 [3 + 2] 시클로부가 반응을 위한 표적으로 작용할 수 있다. 이 천연 아미노산의 도입을 위한 오르소고날 성분은 예를 들어, 문헌(Deiters et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005)) 및 2005년 9월 20일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2006/034332호에 제공되어 있다.
[3 + 2] 시클로부가 반응
(예를 들어, 아릴-아지드 아미노산 또는 알키닐 아미노산에 존재하는) 비천연 아미노산 측쇄는 원하는 파지-디스플레이된 단백질 내로 도입된 후, 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응(문헌(Padwa, In Comprehensive Organic Synthesis; [Trost, B. M., Ed.] Pergamon: Oxford, 1991, Vol. 4, p 1069-1109; Huisgen, In 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, [Padwa, A., Ed.] Wiley: New York, 1984; p 1-176) 참조)에 의해 특이적 및 위치선별적으로 변형될 수 있다. [3 + 2] 시클로부가 반응의 일반적인 화학반응은 도 15에 나타나 있는데, 이때 아지드 잔기는 알키닐 잔기와 반응한다. 이 반응은 비가역적이며 트리아졸 결합을 형성시킨다.
도 15에 나타낸 바와 같이, [3 + 2] 시클로부가 반응에서 아지도 또는 알키닐 치환기와 결합되는 R 기는 특별히 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 아지도 기는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되는 아릴-아지드 비천연 아미노산, 예를 들어, p-아지도-L-페닐알라닌의 일부를 형성한다(실시예 4 참조). 이 구성에 있어서, 알키닐 잔기는 시약에 부착되고(예를 들어, 도 5에 나타낸 알키닐-유도체화 플루오레세인 염료, 화학식 6), 그 후 상기 시약은 파지-디스플레이된 폴리펩티드와 반응하여 번역후 변형된 파지를 생성시킬 수 있다. 알키닐 기와 결합되는 R 기의 성질은 특별히 한정되지 않는다.
[3 + 2] 시클로부가 반응에 대한 역 구성 또한 사용될 수 있다. 이 시나리오에서, 알키닐 기는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되는 알키닐 비천연 아미노산, 예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌(도 15, 화학식 9 참조)의 일부이다. 이 구성에 있어서, 아지도 잔기는 시약에 부착되고(예를 들어, 도 16에 나타낸 아지도-유도체화 댄실 및 플루오레세인 염료, 화학식 10 및 11), 그 후 상기 시약은 파지-디스플레이된 폴리펩티드와 반응하여 번역후 변형된 파지를 생성시킬 수 있다. 아지도 기와 결합되는 R 기의 성질은 특별히 한정되지 않는다.
알키닐 및 아지도 기의 화학반응은 생체내의 단백질에 존재하는 내재성 작용기의 화학반응과 완전히 무관하다는 장점을 가진다. [3 + 2] 시클로부가 반응이 실온의 수성 매질 중에서 구리(I)의 존재 하에 (생물학적 샘플을 변형시키기에 충분히 온화한 조건 하에) 수행되는 경우, 상기 반응은 완전히 위치선별적 방식으로 진행되며(Rostovtsev et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed., 41:2596), 알키닐 또는 아지도 작용기가 예를 들어, 오르소고날 번역 시스템(Deiters et al., (2003) J. Am. Chem. Soc., 125: 11782; Wang et al., (2003) J. Am. Chem. Soc., 125:3192; Link and Tirrell (2003) J. Am. Chem. Soc., 125: 11164)의 사용에 의해 도입된 파지-디스플레이된 단백질을 선별적으로 변형시키는 데 사용될 수 있다. 이 방법이 친핵성 치환보다는 오히려 시클로부가 반응을 이용하기 때문에, 단백질은 고도로 선별적으로 변형될 수 있다. 이 반응은 반응 혼합물에의 촉매량의 Cu(I) 염의 첨가에 의해 뛰어난 위치선별성을 나타내면서 (1,4 > 1,5) 수성 조건 하에 실온에서 수행될 수 있다는 장점을 가진다(Tornoe et al., (2002) J. Org. Chem., 67:3057-3064; Rostovtsev et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed., 41:2596-2599).
본 발명을 설명하기 위한(한정하기 위한 것은 아님) 목적으로, 본원의 실시예는 아지도 또는 알키닐 잔기로 유도체화되어 있고 [3 + 2] 시클로부가 반응에서 사용될 수 있는 댄실 및 플루오레세인 염료의 사용을 기술한다. 그러나, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명은 [3 + 2] 시클로부가 반응에서의 이들 유도체화된 염료의 사용으로 한정되는 것은 아니다. 사실상, 이 화학반응은 아지도 또는 알키닐 잔기로 유도체화될 수 있는 임의의 분자를 사용한 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 번역후 변형 (및 그 결과로서 파지의 번역후 변형)을 허용한다. 원하는 임의의 특정한 분자의 아지도 또는 알키닐 유도체를 합성하는 것은 당업자의 수단 내에 있다. 예를 들어, 아지도 화합물을 합성하는 방법을 기술하고 있는 많은 교재 및 프로토콜이 입수가능하다. 일반적인 참조를 위해서는 문헌(Patai, Saul, "The chemistry of the azido group" in The Chemistry of Functional Groups, London, New York, Interscience Publishers, 1971)을 참조한다.
다른 측면에서, 본 발명은 알키닐-함유 파지-디스플레이된 폴리펩티드와의 [3 + 2] 시클로부가 반응에서 사용하기 위한 폴리에틸렌 글리콜의 아지도 유도체(아지도-PEG)를 사용함으로써 PEG화된 파지-디스플레이된 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 아지도 폴리에틸렌 글리콜의 일반화된 화학식은 다음과 같다:
N3-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2OR
상기 식에서, R은 H 또는 CH3이고, n은 예를 들어, 50 내지 10,000, 75 내지 5,000, 100 내지 2,000, 100 내지 1,000 사이의 정수이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 아지도 폴리에틸렌 글리콜은 예를 들어, 약 5,000 내지 약 100,000 Da(즉, 약 5 kDa 내지 약 100 kDa), 약 20,000 내지 약 50,000 Da, 약 20,000 내지 약 10,000 Da(예를 들어, 20,000 Da)의 분자량을 가진다. 아지도 폴리에틸렌 글리콜의 합성 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 친전자성 기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 분자(예를 들어, 브롬화물 또는 N-히드록시석신이미드 에스테르)는 아지도 기를 함유하는 친핵성 분자(예를 들어, 소듐 아지드 또는 3-아지도프로필아민)와 반응하여 아지도 폴리에틸렌 글리콜을 발생시킬 수 있다.
아지도-PEG는 트리아졸 결합을 통해 알키닐-함유 파지-디스플레이된 단백질에 생체접합된 경우 본 발명에서 사용될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 단백질계 치료제의 유도체화(PEG화)는 단백질의 약동학적 및 약력학적 성질을 개선시킴으로써, 효능을 개선하고 투약 빈도를 최소화할 수 있다. 단백질 치료제의 PEG화의 다양한 장점은 예를 들어, 문헌(Deiters et al., "Site-specific PEGylation of proteins containing unnatural amino acids," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14:5743-5745 (2004))에 논의 및 설명되어 있다.
추가로, 에스테르 결합 또한 함유하는 비천연 알키닐 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 생성과 관련된 다른 장점도 고려된다. 예를 들어, 에스테르 결합을 가진 알키닐 아미노산을 사용하여 생성시킨 PEG화된 폴리펩티드는 생체내 또는 시험관내에서 에스테르 결합의 비누화에 의한 폴리펩티드의 서방출을 허용할 수 있다. 또한, 아지도-PEG 분자 대신에 중합체성 지지체(아지도 수지)의 사용은 단백질 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 트리아졸 공유결합은 매우 강한 세척 단계를 허용하고, 에스테르 알키닐 아미노산의 사용은 염기를 사용한 처리에 의한 파지-디스플레이된 단백질의 방출을 허용한다. 유의하게는, 이러한 친화성 정제 기법은 정제할 원하는 단백질 상에 인공 태그(예를 들어, 헥사히스티딘) 또는 에피토프가 존재할 것을 더 이상 요구하지 않는다. 사용된 비천연 아미노산에 따라, 본질적으로 야생형(천연) 폴리펩티드는 절단 단계 후 친화성 수지로부터 방출될 수 있다.
에스테르 결합을 가진 비천연 알키닐 아미노산은 합성되어 단백질 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 2005년 9월 20일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2006/034332호에서의 에스테르 결합 알키닐 아미노산을 참조한다. [3 + 2] 시클로부가를 통한 생체접합 후, 에스테르 결합은 생체내 또는 시험관내에서의 비누화에 의해 절단될 수 있고, 그 결과는 예를 들어, PEG화된 파지-디스플레이된 단백질로부터의 펩티드 부분의 서방출일 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입되는 아지도-함유 비천연 아미노산과의 [3 + 2] 시클로부가 접합 반응에 사용하기 위한 폴리에틸렌 글리콜의 알키닐 유도체(알키닐-PEG)를 사용함으로써 PEG화된 파지-디스플레이된 폴리펩티드를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
슈타우딩거 반응
슈타우딩거 결찰은 세포 및 생체내 시스템 둘다에서 세포 표면 탄수화물을 선별적으로 변형시키는 데 이미 사용되어 왔다(Saxon and Bertozzi, Science 2000, 287, 2007-2010; Prescher et al., Nature 2004, 430, 873-877). 이 반응은 수성 조건 하에서 현저한 수율로 진행되며 아지드 잔기에 대해 매우 선별적이다. 또한, 슈타우딩거 결찰은 메티오닌 잔기 대신에 치환된 아지도호모알라닌을 함유하는 단백질을 선별적으로 변형시키는 데 사용되어 왔다(Kiick et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2002, 101, 7566-7571). 그러나, 이 슈타우딩거 결찰 방법의 선별성은 전체 프로테옴(proteome)뿐만 아니라 단백질 내의 각각의 메티오닌 잔기가 종종 천연 아미노산과 경쟁적으로 아지도호모알라닌으로 치환되어 있기 때문에 본질적으로 한정된다.
본 발명은 번역후 변형된 파지를 제조하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 파지는 아릴-아지드 비천연 아미노산, 예를 들어, p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드를 포함한다. 그 다음, 상기 비천연 아미노산은 슈타우딩거 결찰 반응의 이용에 의해 효율적 및 특이적으로 변형되어 번역후 변형된 파지를 생성시킨다. 도 10은 2개의 상이한 분광학적 프로브인 포스핀 분자(화학식 7 및 8)와 함께 (파지 Ph-Az로부터의) p-아지도-L-페닐알라닌 잔기를 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 슈타우딩거 결찰 반응을 개략적으로 보여준다. 이 방법은 실시예 6에 상세히 설명되어 있다.
본 발명을 설명하기 (한정하기 위한 것은 아님) 목적으로, 본원의 실시예는 슈타우딩거 결찰 반응에서 사용하기에 적합하게 유도체화된 2개의 분광학적 프로브의 사용을 기술한다. 그러나, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명은 슈타우딩거 반응에서의 이들 유도체화된 포스핀 분자의 사용으로 한정되는 것은 아니다. 슈타우딩거 화학반응은 적절하게 유도체화될 수 있는 임의의 분자를 사용한 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 번역후 변형 (및 그 결과로서 파지의 번역후 변형)을 허용한다. 이 접합에 사용하기 위한 원하는 임의의 특정한 분자의 적합한 유도체를 합성하는 것은 당업자의 수단 내에 있다.
오르소고날 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 기술
본 발명의 신규 조성물 및 방법은 오르소고날 tRNA 및 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소 쌍과 관련된 활성을 이해함으로써 용이하게 이해될 수 있다. 오르소고날 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소 기법에 대한 논의는 예를 들어, 국제특허공개공보 제WO 2002/085923호, 제WO 2002/086075호, 제WO 2004/09459호, 제WO 2005/019415호, 제WO 2005/007870호 및 제WO 2005/007624호에서 찾을 수 있다. 또한, 그 내용이 완전히 참고로 도입되는 문헌(Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(l):34-66 (2005))을 참조한다.
추가의 반응성 비천연 아미노산을 유전 코드에 부가하기 위해, 숙주 번역 기구에서 효율적으로 작용할 수 있되, 사용될 번역 시스템에 대한 내재성 합성효소 및 tRNA와 무관하게 작용한다는 의미에서 상기 번역 시스템에 대해 "오르소고날"한 아미노아실-tRNA 합성효소 및 적절한 tRNA를 포함하는 신규 오르소고날 쌍이 필요하다. 이 오르소고날 쌍의 원하는 특징은 임의의 내재성 tRNA에 의해 해독되지 않는 특정한 코돈, 예를 들어, 셀렉터 코돈만을 해독하거나 인식하는 tRNA, 및 그의 동족체 tRNA를 1개의 특정한 비천연 아미노산으로만 우선적으로 아미노아실화시키는 (또는 "충전시키는") 아미노아실-tRNA 합성효소를 포함한다. 또한, O-tRNA는 전형적으로 내재성 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않는다. 예를 들어, 이. 콜라이에서, 오르소고날 쌍은 예를 들어, 이. 콜라이에서 40종이 존재하는 임의의 내재성 tRNA와 교차-반응하지 않는 아미노아실-tRNA 합성효소, 및 예를 들어, 이. 콜라이에서 21종이 존재하는 임의의 내재성 합성효소에 의해 아미노아실화되지 않는 오르소고날 tRNA를 포함할 것이다.
본 발명은 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 상기 비천연 아미노산(및 그 결과로서 파지)은 번역후 변형된다. 파지-디스플레이된 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입은 이. 콜라이에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 유전적으로 코딩하는 데 오르소고날 쌍을 적용함으로써 달성되는데, 이때 오르소고날 성분은 숙주 세포의 번역 기구의 내재성 이. 콜라이 성분과 교차-반응하지 않지만, 원하는 비천연 아미노산을 인식하여 이를 셀렉터 코돈(예를 들어, 앰버 넌센스 코돈, TAG)에 반응하여 단백질 내로 도입시킨다. 본 발명에 의해 제공되는 오르소고날 성분은 진정세균 숙주 세포 내에서 오르소고날 쌍으로서 작용하는, 메타노코커스 잔나스키이 티로실 tRNA-합성효소로부터 유도된 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소 및 돌연변이체 티로실 tRNACUA 앰버 억제자를 포함한다. 이 시스템에서, 돌연변이체 아미노아실-tRNA 합성효소는 상기 억제자 tRNA를 그의 개개의 비천연 아미노산으로 아미노아실화시키지만 공통된 20종의 아미노산 중 어느 아미노산으로는 아미노아실화시키지 못한다.
본 발명은 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 및 이의 제조 방법을 제공하는데, 이때 상기 비천연 아미노산 (및 그 결과로서 상기 파지)는 번역후 변형된다. 상기 방법은 오르소고날 tRNA-아미노아실-tRNA 합성효소 쌍, 예를 들어, 파지-디스플레이된 단백질 내로 비천연 아미노산을 도입시키는 데 사용될 수 있는 O-tRNA/O-RS 쌍을 사용한다. O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연 아미노산, 예를 들어, 도 3 또는 도 15에 나타낸 비천연 아미노산이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 내로 도입되는 것을 매개할 수 있는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 생체내에서 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. O-tRNA의 안티코돈 루프는 mRNA 상의 셀렉터 코돈을 인식하고 폴리펩티드 내의 이 부위에서 그의 비천연 아미노산을 도입시킨다. 일반적으로, 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소는 그의 O-tRNA를 1개의 특정한 비천연 아미노산으로만 우선적으로 아미노아실화시킨다(또는 충전시킨다).
비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 단백질 내로 부위-특이적으로 도입시키는 능력은 단백질이 새로운 성질을 가지도록 개조되는 것을 허용할 뿐만 아니라 상기 단백질의 번역후 변형을 허용함으로써 단백질 연구를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 단백질의 발현은 특정한 표지 부착에 의한 단백질의 연구를 촉진할 수 있고, 효소의 촉매 기능을 변경시킬 수 있으며, 생물학적 활성을 개선하거나 기질에 대한 가교-반응성을 감소시킬 수 있고, 한 단백질과 다른 단백질, 소분자 또는 생체분자를 가교결합시킬 수 있고, 단백질 분해를 감소시키거나 없앨 수 있고, (예를 들어, 도입된 반응성 부위의 PEG화 또는 다른 변형에 의해) 생체내 단백질의 반감기를 개선할 수 있다.
오르소고날 tRNA/오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소 및 이의 쌍
1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 제조에 적합한 오르소고날 번역 시스템은 예를 들어, 국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL- tRNA SYNTHETASE PAIRS"), 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"), 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"), 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/019415호, 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007870호 및 004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007624호에 일반적으로 기재되어 있다. 이 출원들 각각은 완전히 참고로 본원에 도입된다. 또한, 그 각각의 내용이 완전히 참고로 도입되는 문헌(Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Deiters et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005); Chin et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9026-9027) 및 2005년 9월 20일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2006/034332호를 참조한다.
일반적으로, 이러한 번역 시스템은 오르소고날 tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS) 및 비천연 아미노산을 포함하는 세포(이. 콜라이와 같은 비-진핵세포 또는 효모와 같은 진핵세포일 수 있음)를 포함하는데, 이때 상기 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 아미노아실화시킨다. 본 발명의 오르소고날 쌍은 O-tRNA, 예를 들어, 억제자 tRNA, 프레임변동(frameshift) tRNA 등, 및 O-RS를 포함한다. 개개의 성분들도 본 발명에서 제공된다.
일반적으로, 오르소고날 쌍이 셀렉터 코돈을 인식하고 이 셀렉터 코돈에 반응하여 아미노산을 적재하는 경우, 상기 오르소고날 쌍은 상기 셀렉터 코돈을 "억제"한다고 언급된다. 즉, 번역 시스템의 (예를 들어, 세포의) 내재성 기구에 의해 인식되지 않는 셀렉터 코돈은 통상적으로 번역되지 않고, 이는 핵산으로부터 번역될 폴리펩티드의 생성을 차단할 수 있다. 본 발명의 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 본원의 서열목록에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열에 의해 코딩되는 O-tRNA의 억제 효율과 비교할 때 셀렉터 코돈에 반응하여 동족체 합성효소의 존재 하에 예를 들어, 약 45%, 50%, 60%, 75%, 80% 또는 90% 이상의 억제 효율을 나타낸다. O-RS는 O-tRNA를 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화시킨다. 세포는 예를 들어, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 통해 성장 폴리펩티드 쇄 내로 비천연 아미노산을 도입시키기 위해 O-tRNA/O-RS 쌍을 사용하는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. 일부 바람직한 측면에서, 세포는 추가 O-tRNA/O-RS 쌍을 포함할 수 있는데, 상기 추가 O-tRNA는 상기 추가 O-RS에 의해 상이한 비천연 아미노산으로 충전된다. 예를 들어, O-tRNA들 중 하나는 4 염기 코돈을 인식할 수 있고, 나머지는 정지 코돈을 인식할 수 있다. 별법으로, 다수의 상이한 정지 코돈 또는 다수의 상이한 4 염기 코돈은 상이한 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포와 같은 세포는 오르소고날 tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS), 비천연 아미노산, 및 원하는 폴리펩티드(예를 들어, 파지-디스플레이된 융합 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는데, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함한다. 번역 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 O-tRNA/O-RS 쌍 및 비천연 아미노산과 조합된 무세포 시스템, 예를 들어, 다양한 시판되는 "시험관내" 전사/번역 시스템 중 임의의 시스템일 수도 있다.
한 실시양태에서, O-RS 및 O-tRNA가 함께 있는 경우의 억제 효율은 O-RS가 없는 경우 O-tRNA의 억제 효율보다 예를 들어, 약 5배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 이상 더 높다. 일부 측면에서, O-RS 및 O-tRNA가 함께 있는 경우의 억제 효율은 본원의 서열목록에 기재된 바와 같은 오르소고날 합성효소 쌍의 억제 효율의 예를 들어, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% 또는 90% 이상이다.
전술된 바와 같이, 본 발명은 경우에 따라 1개 이상의 비천연 아미노산을 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입시키는 다수의 0-tRNA/O-RS 쌍을 세포 또는 다른 번역 시스템 내에 포함한다. 예를 들어, 세포는 추가의 상이한 O-tRNA/O-RS 쌍 및 제2 비천연 아미노산을 추가로 포함할 수 있는데, 이때 이 추가 O-tRNA는 제2 셀렉터 코돈을 인식하고, 이 추가 O-RS는 O-tRNA를 제2 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시킨다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포(이때, O-tRNA는 예를 들어, 앰버 셀렉터 코돈을 인식함)는 제2 오르소고날 쌍을 추가로 포함할 수 있는데, 이때 상기 제2 O-tRNA는 상이한 셀렉터 코돈, 예를 들어, 오팔 코돈, 4 염기 코돈 등을 인식한다. 바람직하게는, 상이한 셀렉터 코돈의 인식을 용이하게 할 수 있는 상이한 오르소고날 쌍은 상이한 공급원으로부터 유래된다.
O-tRNA 및/또는 O-RS는 천연적으로 발생될 수 있거나, 예를 들어, 다양한 유기체 중 임의의 유기체로부터 유래된 tRNA의 라이브러리 및/또는 RS의 라이브러리를 발생시키고/시키거나 다양한 이용가능한 돌연변이유발 기법 중 임의의 기법을 이용하여 천연 발생 tRNA 및/또는 RS를 돌연변이시킴으로써 유도될 수 있다. 예를 들어, 오르소고날 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 제조하기 위한 한 기법은 예를 들어, 숙주 세포 외의 한 공급원 또는 다수의 공급원으로부터 유래된 (숙주 세포에 대한) 이종성 tRNA/합성효소 쌍을 숙주 세포 내로 이입시키는 단계를 포함한다. 상기 이종성 합성효소 후보의 성질은 예를 들어, 임의의 숙주 세포 tRNA를 충전시키지 못하는 성질을 포함하며, 이종성 tRNA 후보의 성질은 예를 들어, 임의의 숙주 세포 합성효소에 의해 아미노아실화되지 못하는 성질을 포함한다. 또한, 이종성 tRNA는 모든 숙주 세포 합성효소에 대해 오르소고날하다.
오르소고날 쌍을 생성하기 위한 제2 기법은 O-tRNA 또는 O-RS를 검색하고/하거나 선별할 돌연변이체 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다. 이 기법들은 조합될 수도 있다.
오르소고날 tRNA(O-tRNA)
바람직하게는, 오르소고날 tRNA(O-tRNA)는 생체내 또는 시험관내에서 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입을 매개한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 O-tRNA는 본원의 서열목록에서 O-tRNA 서열에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이 서열에 의해 코딩되는 O-tRNA와 비교할 때 셀렉터 코돈에 반응하여 동족체 합성효소의 존재 하에 예를 들어, 약 45%, 50%, 60%, 75%, 80% 또는 90% 이상의 억제 효율을 나타낸다.
억제 효율은 당업계에 공지된 다수의 분석법 중 임의의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제 리포터 분석법을 이용할 수 있는데, 예를 들어, (구축물이 lacZ 핵산 서열 내에 셀렉터 코돈을 가지는 경우) 유도체화된 lacZ 플라스미드가 본 발명의 O-tRNA를 포함하는 플라스미드와 함께 적절한 유기체(예를 들어, 오르소고날 성분들이 사용될 수 있는 유기체)로부터의 세포 내로 도입된다. 동족체 합성효소도 (발현된 경우 상기 동족체 합성효소를 코딩하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서) 도입될 수 있다. 세포 배지 중에서 원하는 밀도, 예를 들어, 약 0.5의 OD600까지 생장되고, β-갈락토시다제 분석법은 예컨대, BetaFluor™ β-갈락토시다제 분석 키트(Novagen)를 사용하여 수행한다. 억제율(%)은 비교 대조군에 대한 상대적인 샘플 활성율로서, 예를 들어, 셀렉터 코돈보다 오히려 원하는 위치에서 상응하는 센스 코돈을 가진 유도체화된 lacZ 구축물로부터 관찰된 값으로서 계산될 수 있다.
본 발명의 O-tRNA의 예는 본원의 서열목록에 기재되어 있다. 예시적 O-tRNA 및 O-RS 분자의 서열에 대한 본원의 표, 실시예 및 도면 또한 참조한다. 또한, 본원의 "핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체"라는 표제 하의 단락을 참조한다. O-RS mRNA 또는 O-tRNA 분자와 같은 RNA 분자에서, 티민(T)은 소정의 서열 또는 이의 상보체에 대해 우라실(U)로 치환된다(코딩 DNA의 경우 이와 반대로 우라실(U)이 티민으로 치환된다). 염기에 대한 추가 변형이 존재할 수도 있다.
또한, 본 발명은 본원의 특정한 O-tRNA에 상응하는 O-tRNA의 보존적 변이체를 포함한다. 예를 들어, O-tRNA의 보존적 변이체에는 예를 들어, 본원의 서열목록에 기재된 바와 같은 특정한 O-tRNA와 유사하게 작용하며 적절한 자가-상보성에 의해 tRNA L-형태의 구조를 유지하지만 예를 들어, 본원의 서열목록, 도면 또는 실시예에 기재된 것들과 동일한 서열을 갖지 않는 (그리고, 바람직하게는 야생형 tRNA 분자 외의 분자인) 분자들이 포함된다. 본원의 "핵산 및 폴리펩티드 및 변이체"라는 표제 하의 단락도 참조한다.
O-tRNA를 포함하는 조성물은 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시킨다. 일부 실시양태에서, O-tRNA를 포함하는 조성물은 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내) 번역 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 코딩하며 O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 또는 1개 이상의 이들 핵산의 조합물이 세포 내에 존재할 수도 있다. 본원의 "오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소"라는 표제 하의 단락도 참조한다.
오르소고날 tRNA(O-tRNA)의 제조 방법은 공지되어 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, O-tRNA는 돌연변이체의 라이브러리를 발생시킴으로써 제조될 수 있다. 돌연변이체 tRNA의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 돌연변이유발 기법을 이용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 tRNA는 예를 들어, 서열 번호 1의 예시적 O-tRNA의 부위-특이적 돌연변이유발, 랜덤 점 돌연변이유발, 상동성 재조합, DNA 셔플링(shuffling) 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구축 또는 이들의 임의의 조합에 의해 발생될 수 있다.
추가 돌연변이는 tRNA의 원하는 루프 또는 영역, 예를 들어, 안티코돈 루프, 수용체 줄기(stem), D 아암(arm) 또는 루프, 가변성 루프, TΦC 아암 또는 루프, tRNA 분자의 다른 영역 또는 이들의 조합에서 특정한 위치(들), 예를 들어, 비보존적 위치(들), 보존적 위치, 무작위 위치(들), 또는 이들의 조합 위치에서 도입될 수 있다. 전형적으로, tRNA 내의 돌연변이는 셀렉터 코돈의 인식을 허용하도록 돌연변이체 tRNA의 라이브러리의 각 구성원의 안티코돈 루프를 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 추가 서열을 O-tRNA에 부가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, O-tRNA는 원하는 RS에 대한 그의 친화성을 보존하면서 출발 물질 예를 들어, 복수개의 tRNA 서열에 비해 원하는 유기체에 대한 개선된 오르소고날성을 보유한다.
상기 방법은 경우에 따라 특정한 유기체에 대해 오르소고날인 것으로 보이는 tRNA 및/또는 아미노아실-tRNA 합성효소의 서열의 유사성 (및/또는 추정된 상동성)을 분석하여 O-tRNA, O-RS 및/또는 이들의 쌍에 대한 잠재적 후보를 결정하는 단계를 포함한다. 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있는 컴퓨터 프로그램이 상기 분석에 사용될 수 있는데, 예를 들어, BLAST 및 파일업(pileup) 프로그램이 사용될 수 있다. 한 예에서, 이. 콜라이에서 사용하기 위한 잠재적인 오르소고날 번역 성분들을 선택하기 위해, 진정세균 유기체와의 높은 서열 유사성을 나타내지 않는 합성효소 및/또는 tRNA를 선택한다.
전형적으로, O-tRNA는 제1 종의 세포로 이루어진 집단을 예를 들어, 음성 선별함으로써 수득되는데, 이때 상기 세포는 복수개의 잠재적 O-tRNA의 구성원을 포함한다. 상기 음성 선별은 세포에 내재하는 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화되는 잠재적인 O-tRNA로 이루어진 라이브러리의 구성원을 포함하는 세포를 제거한다. 이는 상기 제1 종의 세포에 대해 오르소고날 tRNA로 이루어진 풀을 제공한다.
일부 실시양태에서, 음성 선별에서, 셀렉터 코돈(들)은 음성 선별 마커, 예를 들어, 항생제 내성을 부여하는 효소 예컨대, β-락타마제, 검출가능한 생성물을 부여하는 효소 예컨대, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 예를 들어, 비필수 위치(예를 들어, 여전히 기능성 바르나제(barnase)를 생산하는 위치)에 있는 바르나제와 같은 독성 물질 등을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된다. 검색/선별은 경우에 따라 선별제(예를 들어, 앰피실린과 같은 항생제)의 존재 하에 세포 집단을 생장시킴으로써 수행된다. 한 실시양태에서, 선별제의 농도는 다양하다.
예를 들어, 억제자 tRNA의 활성을 측정하기 위해, 셀렉터 코돈의 생체내 억제에 기초한, 예를 들어, 음성 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, β-락타마제(bla)에 대한 유전자 내로 도입된 넌센스 (예컨대, 정지) 또는 프레임변동 돌연변이에 기초한 선별 시스템이 사용된다. 예를 들어, 특정한 위치(예를 들어, A184)에서 셀렉터 코돈을 가진 폴리뉴클레오티드 변이체, 예를 들어, bla 변이체가 구축된다. 세포, 예컨대, 박테리아는 이 폴리뉴클레오티드로 형질전환된다. 내재성 이. 콜라이 합성효소에 의해 효율적으로 충전될 수 없는 오르소고날 tRNA의 경우, 항생제 내성, 예컨대, 앰피실린 내성은 플라스미드로 형질전환되지 않은 박테리아에 대한 항생제 내성과 비슷하거나 이보다 더 낮아야 한다. 상기 tRNA가 오르소고날 tRNA가 아닌 경우, 또는 tRNA를 충전시킬 수 있는 이종 합성효소가 상기 시스템 내에서 동시-발현되는 경우, 보다 높은 수준의 항생제, 예컨대, 앰피실린 내성이 관찰된다. 플라스미드로 형질전환되지 않은 세포와 거의 동등한 항생제 농도를 가진 LB 아가 플레이트 상에서 생장할 수 없는 세포, 예를 들어, 박테리아가 선택된다.
독성 물질(예컨대, 리보뉴클레아제 또는 바르나제)의 경우, 복수개의 잠재적 tRNA의 구성원이 내재성 숙주, 예컨대, 이. 콜라이 합성효소에 의해 아미노아실화되는 경우(즉, 상기 숙주, 예컨대, 이. 콜라이 합성효소에 대한 오르소고날 tRNA가 아닌 경우), 셀렉터 코돈은 억제되고 생성된 독성 폴리뉴클레오티드 생성물은 세포 사멸을 초래한다. 오르소고날 tRNA 또는 비-기능성 tRNA를 보유하는 세포는 생존한다.
한 실시양태에서, 원하는 유기체에 대해 오르소고날 tRNA로 이루어진 풀은 셀렉터 코돈이 예를 들어, β-락타마제 유전자와 같은 약물 내성 유전자에 의해 코딩되는 양성 선별 마커에 위치되어 있는 양성 선별에 의해 더 선별된다. 상기 양성 선별은 세포에 대해 오르소고날 tRNA로 이루어진 풀의 구성원을 코딩하거나 포함하는 폴리뉴클레오티드, 양성 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 동족체 RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 제2 세포 집단은 음성 선별에 의해 제거되지 않은 세포를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 발현되고, 세포는 선별제, 예컨대, 앰피실린의 존재 하에 생장된다. 그 다음, tRNA는 동시 발현된 동족체 합성효소에 의해 아미노아실화되며 이 셀렉터 코돈에 반응하여 아미노산을 삽입하는 그들의 능력에 대해 선별된다. 전형적으로, 이 세포들은 비-기능성 tRNA(들), 또는 원하는 합성효소에 의해 효율적으로 인식될 수 없는 tRNA를 보유하는 세포에 비해 억제 효율에서의 상승을 보인다. 비-기능성 tRNA, 또는 원하는 합성효소에 의해 효율적으로 인식되지 않는 tRNA를 보유하는 세포는 항생제에 대한 감수성을 보인다. 그러므로, (i) 내재성 숙주, 예를 들어, 이. 콜라이 합성효소에 대한 기질이 아니고; (ii) 원하는 합성효소에 의해 아미노아실화될 수 있으며; (iii) 번역에 있어서 기능성을 나타내는 tRNA는 상기 두 선별에서 생존한다.
따라서, 동일한 마커가 그 자신이 검색되는 환경에 따라 양성 마커 또는 음성 마커일 수 있다. 즉, 마커는 그 자신에 대해 검색되는 경우에는 양성 마커이지만, 그 자신에 반하여 검색되는 경우에는 음성 마커이다.
전술된 방법에서 선별, 예를 들어, 양성 선별, 음성 선별 또는 양성 선별 및 음성 선별 둘다의 엄격도는 경우에 따라 선별 엄격도를 달리하는 것을 포함한다. 예를 들어, 바르나제는 매우 독성이 강한 단백질이기 때문에, 음성 선별의 엄격도는 상이한 수의 셀렉터 코돈을 바르나제 유전자 내로 도입하고/하거나 유도가능한 프로모터를 사용함으로써 조절될 수 있다. 또 다른 예에서, 선별제 또는 검색제의 농도(예를 들어, 앰피실린 농도)는 다양하다. 본 발명의 일부 측면에서, 엄격도는 원하는 활성이 초기 순환 동안 낮을 수 있기 때문에 다양하다. 그러므로, 엄격도가 보다 낮은 선별 기준이 초기 순환에서 적용되고, 엄격도가 보다 높은 기준이 선별의 후기 순환에서 적용된다. 일부 실시양태에서, 음성 선별, 양성 선별 또는 음성 선별 및 양성 선별 둘다가 수회 반복될 수 있다. 다수의 상이한 음성 선별 마커, 양성 선별 마커 또는 음성 선별 마커 및 양성 선별 마커 둘다가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 양성 선별 마커와 음성 선별 마커는 동일할 수 있다.
다른 종류의 선별/검색이 본 발명에서 오르소고날 번역 성분, 예를 들어, O-tRNA, O-RS, 및 셀렉터 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 적재하는 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별 마커, 양성 선별 마커 또는 음성 선별 마커 및 양성 선별 마커 둘다가 적절한 반응물의 존재 하에 형광을 나타내거나 발광 반응을 촉진하는 마커를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 마커의 생성물은 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 발광에 의해 검출된다. 경우에 따라, 상기 마커는 친화성에 기초한 검색 마커를 포함한다. 문헌(Francisco et al., (1993) "Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface," Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90:10444-8) 또한 참조한다.
재조합 오르소고날 tRNA를 제조하는 추가 방법은 예를 들어, 국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"), 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE") 및 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/019415호에서 찾을 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌(Forster et al., (2003) "Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo," PNAS 100(11):6353-6357; and, Feng et al., (2003), "Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change," PNAS 100(10): 5676-5681)을 참조한다.
오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)
본 발명에서 사용될 수 있는 O-RS는 시험관내 또는 생체내에서 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시킨다. O-RS는 O-RS를 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 O-RS 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 번역 시스템, 예를 들어, 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, O-RS는 본원의 서열목록 및 실시예에 기재된 바와 같은 아미노산 서열(예를 들어, 도 2 및 서열 번호 4 내지 7 참조), 또는 이들의 보존적 변이체를 포함한다. 또 다른 예에서, O-RS 또는 이의 일부는 본원의 서열목록 또는 실시예에 기재된 서열을 포함하는, 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이들의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 예를 들어, 유용한 O-RS 분자의 서열에 대해서는 본원의 표 및 실시예를 참조한다. 또한, 본원의 "핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체"라는 표제 하의 단락을 참조한다.
O-tRNA와 함께 사용할 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS), 예를 들어, O-RS를 확인하기 위한 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 방법은 제1 종의 세포로 이루어진 집단을 선별 예를 들어, 양성 선별 단계 포함하는데, 이때 상기 세포는 1) 복수개의 아미노아실-tNA 합성효소(RS)의 구성원(예를 들어, 복수개의 RS에는 돌연변이체 RS, 상기 제1 종 외의 종으로부터 유래된 RS, 또는 돌연변이체 RS 및 상기 제1 종 외의 종으로부터 유래된 RS 둘다가 포함될 수 있다); 2) 오르소고날 tRNA(O-tRNA)(예를 들어, 종마다 상이함); 및 3) (예를 들어, 양성) 선별 마커를 코딩하며 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 개별적으로 포함한다. 세포는 복수개의 RS 구성원을 갖지 않거나 감소된 양의 복수개의 RS 구성원을 가진 세포에 비해 억제 효율의 상승을 보여주는 세포에 대해 선별되거나 검색된다. 억제 효율은 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재된 바와 같은 기법에 의해 측정될 수 있다. 억제 효율이 상승된 세포는 O-tRNA를 아미노아실화시키는 활성 RS를 포함한다. 제1 종으로부터의 tRNA로 이루어진 제1 세트의 활성 RS에 의한 (시험관내 또는 생체내) 아미노아실화 수준은 제2 종으로부터의 tRNA로 이루어진 제2 세트의 활성 RS에 의한 (시험관내 또는 생체내) 아미노아실화 수준과 비교된다. 아미노아실화 수준은 검출가능한 물질(예를 들어, 표지된 비천연 아미노산)에 의해 측정될 수 있다. 전형적으로, 제1 tRNA 세트에 비해 제2 tRNA 세트를 더 효율적으로 아미노아실화시키는 활성 RS를 선별함으로써, O-tRNA와 함께 사용할 효율적인 (최적화된) 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소를 제공한다. 이 방법에 의해 확인된 O-RS도 본 발명의 한 특징이다.
다수의 분석법 중 임의의 분석법이 아미노아실화를 측정하는 데 이용될 수 있다. 이 분석법들은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 아미노아실화 분석법은 예를 들어, 문헌(Hoben and Soil (1985) Methods Enzymol. 113:55-59)에 기재되어 있다. 아미노아실화는 리포터를 오르소고날 번역 성분들과 함께 사용하고 단백질을 코딩하는, 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포 내에서 상기 리포터를 검출함으로써 측정될 수도 있다. 국제특허공개공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS") 및 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE") 또한 참조한다.
확인된 O-RS는 원하는 비천연 아미노산만이 O-tRNA에 충전되고 공통된 20종의 아미노산들 중 임의의 아미노산은 O-tRNA에 충전되지 않도록 합성효소의 기질 특이성이 변경되게끔 더 개조될 수 있다. 비천연 아미노산에 대한 기질 특이성을 가진 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소를 생성시키는 방법은 예를 들어, 상기 합성효소 내의 활성 부위, 상기 합성효소 내의 편집(editing) 기작 부위, 합성효소의 상이한 도메인들의 조합에 의한 상이한 부위 등에서 상기 합성효소를 돌연변이시키는 단계, 및 선별 과정을 적용하는 단계를 포함한다. 양성 선별 후 음성 선별의 조합에 기초한 방법이 이용된다. 양성 선별에서, 양성 마커의 비필수 위치(들)에 도입된 셀렉터 코돈의 억제는 세포가 양성 선별 압력 하에서 생존할 수 있게 한다. 따라서, 생존 세포는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 둘다의 존재 하에서 오르소고날 억제자 tRNA를 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 충전시키는 활성 합성효소를 코딩한다. 음성 선별에서, 음성 마커의 비필수 위치(들)에 도입된 셀렉터 코돈의 억제는 비천연 아미노산 특이성을 가진 합성효소를 제거한다. 음성 선별 및 양성 선별 둘다에서의 생존 세포는 오르소고날 억제자 tRNA를 비천연 아미노산으로만 아미노아실화시키는(충전시키는) 합성효소를 코딩한다. 이어서, 이 합성효소는 추가 돌연변이유발, 예를 들어, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법으로 돌연변시킬 수 있다.
돌연변이체 O-RS로 이루어진 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 돌연변이유발 기법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위-특이적 돌연변이유발, 랜덤 점 돌연변이유발, 상동성 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구축 또는 이의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS로 이루어진 라이브러리는 2개 이상의 다른, 예컨대, 보다 작고 보다 덜 다양한 "하위-라이브러리"로부터 생성될 수 있다. RS의 키메라 라이브러리도 본 발명에 포함된다. 다양한 유기체(예를 들어, 진정세균 또는 고세균과 같은 미생물)로부터의 tRNA 합성효소로 이루어진 라이브러리, 예컨대, 천연 다양성을 포함하는 라이브러리(예를 들어, 미국특허 제6,238,884호(Short et al.); 미국특허 제5,756,316호(Schallenberger et al.); 미국특허 제5,783,431호(Petersen et al.); 미국특허 제5,824,485호(Thompson et al.); 및 미국특허 제5,958,672호(Short et al.) 참조)가 경우에 따라 구축되어 오르소고날 쌍에 대해 검색된다는 것을 이해해야 한다.
일단 상기 합성효소가 양성 및 음성 선별/검색 기법으로 선별/검색되면, 이 합성효소를 더 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, O-RS를 코딩하는 핵산을 단리하할 수 있고; (예를 들어, 랜덤 돌연변이유발, 부위-특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 이들의 임의의 조합에 의해) 돌연변이된 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세트를 상기 핵산으로부터 생성시킬 수 있고; 이 개개의 단계들 또는 이 단계들의 조합을, O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시키는 돌연변이 O-RS가 수득될 때까지 반복할 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 단계들은 수회, 예를 들어, 2회 이상 수행된다.
다른 선별/검색 엄격도 수준 또한 O-tRNA, O-RS 또는 이들의 쌍을 제조하기 위한 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. O-RS를 제조하기 위한 본 방법의 한 단계 또는 두 단계에 대한 선별 또는 검색 엄격도는 달라질 수 있다. 이것은 예를 들어, 사용된 선별제/검색제의 양을 변화시키는 것 등을 포함할 수 있다. 추가 양성 및/또는 음성 선별 순환을 수행할 수도 있다. 선별 또는 검색은 아미노산 투과성에서의 1개 이상의 변화, 번역 효율에서의 변화, 번역 신뢰도에서의 변화 등을 포함할 수도 있다. 전형적으로, 1개 이상의 변화는 단백질을 생성하기 위해 오르소고날 tRNA-tRNA 합성효소를 사용하는 유기체 내에서 1개 이상의 유전자 내의 돌연변이에 기초한 것이다.
O-RS의 제조 및 합성효소의 기질 특이성의 변경에 대한 일반적인 상세한 추가 설명은 국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS") 및 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")에서 찾을 수 있다. 그 내용이 완전히 참고로 도입되는 문헌(Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005)) 또한 참조한다.
공급원 및 숙주 유기체
임의의 다른 종으로부터의 숙주 번역 시스템에서 사용하기 위한, 본 발명에서 사용될 수 있는 오르소고날 번역 성분(O-tRNA 및 O-RS)은 임의의 유기체 (또는 유기체의 조합물)로부터 유래될 수 있되, 상기 O-tRNA/O-RS 성분들과 숙주 시스템은 오르소고날 방식으로 작동한다. 오르소고날 쌍으로부터의 O-tRNA 및 O-RS는 동일한 유기체로부터 유래될 필요는 없다. 일부 측면에서, 진정세균 숙주 시스템에서 사용하기 위한 상기 오르소고날 성분들은 고세균 유전자(즉, 원시세균)로부터 유래된다.
예를 들어, 오르소고날 O-tRNA는 고세균 유기체, 예를 들어, 원시세균, 예컨대, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피컴, 할로박테리움 예컨대, 할로페락스 볼케이니이 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 풀기더스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 애우로파이럼 페르닉스, 메타노코커스 마리팔루디스, 메타노파이러스 칸들레리, 메타노사르시나 메이제이(Mm), 파이로바큘럼 애로필럼, 파이로코커스 애비스시, 설폴로버스 솔파타리커스(Ss), 설폴로버스 토코다이이, 써모플라스마 애시도필럼, 써모플라스마 볼케이늄 등, 또는 진정세균 예컨대, 이. 콜라이, 써머스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로부터 유래될 수 있는 반면, 오르소고날 O-RS는 유기체 또는 유기체의 조합물, 예를 들어, 원시세균, 예컨대, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피컴, 할로박테리움 예컨대, 할로페락스 볼케이니이 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 풀기더스, 파이로코커스 푸리오서스, 파이로코커스 호리코쉬이, 애우로파이럼 페르닉스, 메타노코커스 마리팔루디스, 메타노파이러스 칸들레리, 메타노사르시나 메이제이, 파이로바큘럼 애로필럼, 파이로코커스 애비스시, 설폴로버스 솔파타리커스, 설폴로버스 토코다이이, 써모플라스마 애시도필럼, 써모플라스마 볼케이늄 등, 또는 진정세균 예컨대, 이. 콜라이, 써머스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 진핵 공급원, 예를 들어, 식물, 해조류, 원생동물, 진균, 효모, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충, 절지동물 등) 등도 O-tRNA 및 O-RS의 공급원으로서 사용될 수 있다.
O-tRNA/O-RS 쌍의 개개의 성분들은 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, O-tRNA/O-RS 쌍은 동일한 유기체로부터 유래된다. 별법으로, O-tRNA/O-RS 쌍의 O-tRNA 및 O-RS는 상이한 유기체로부터 유래된다.
O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체내 또는 시험관내에서 선별되거나 검색되고/되거나 세포 예를 들어, 진정세균 세포 내에서 비천연 아미노산을 가진 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 진정세균 세포는 예를 들어, 이. 콜라이, 써머스 써모필러스, 바실러스 스테아로써모필러스 등으로 한정되지 않는다. 본 발명의 번역 성분들을 포함하는 진정세균 세포의 조성물도 본 발명의 한 특징이다.
또 다른 종에서 사용하기 위한 O-tRNA 및/또는 O-RS를 한 종에서 검색하는 것에 대해서는 2004년 4월 16일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")를 참조한다.
일부 측면에서, O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체내 또는 시험관내에서 선별되거나 검색되고/되거나, 세포 예를 들어, 진핵세포 내에서 비천연 아미노산을 가진 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 진핵세포는 한정되지 않는데, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 등과 같은 임의의 적절한 효모 세포가 사용될 수 있다. 본 발명의 번역 성분들을 포함하는 진핵세포의 조성물도 본 발명의 한 특징이다.
오르소고날 번역 시스템(예를 들어, O-RS, O-tRNA 및 비천연 아미노산을 포함함)이 배양된 숙주 세포를 사용하여 비천연 아미노산을 가진 단백질을 생성시킬 수 있다 하더라도, 본 발명의 오르소고날 번역 시스템이 온전한 생존가능한 숙주 세포를 필요로 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 오르소고날 번역 시스템은 세포 추출물의 존재 하에 무세포 시스템을 사용할 수 있다. 사실상, 단백질의 제조를 위한 무세포 시험관내 전사/번역 시스템의 사용은 잘 확립된 기법이다. 본원에 기재된 오르소고날 번역 시스템 성분들을 사용하여 비천연 아미노산을 가진 단백질을 제조하기 위한 이들 시험관내 시스템의 적용은 본 발명의 범위 내에 있다.
셀렉터 코돈
오르소고날 번역 시스템에서의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 예를 들어, 유니크(unique) 3 염기 코돈, 넌센스 코돈 예컨대, 정지 코돈, 예를 들어, 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA), 비천연 코돈, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 다수의 셀렉터 코돈, 예를 들어, 하나 이상, 두 개 이상, 세 개 이상 등의 셀렉터 코돈이 원하는 유전자 내로 도입될 수 있다. 상이한 셀렉터 코돈을 사용함으로써, 이들 상이한 셀렉터 코돈을 사용하는 다수의 비천연 아미노산, 예를 들어, 1개 이상의 비천연 아미노산의 동시적인 부위-특이적 도입을 허용하는 다수의 오르소고날 tRNA/합성효소 쌍을 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 생체내 세포에서 비천연 아미노산을 번역후 변형의 표적인 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 수반한다. 예를 들어, 정지 코돈을 인식하며 O-RS에 의해 비천연 아미노산으로 아미노아실화되는 O-tRNA가 제조된다. 이 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되지 않는다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내의 원하는 부위에 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Sayers, J.R., et al., (1988), "5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis," Nucleic Acids Res., 791-802)을 참조한다. O-RS, O-tRNA, 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 예를 들어, 생체내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 정지 코돈에 반응하여 도입됨으로써 특정한 부위에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 셀렉터 코돈으로서 사용된 정지 코돈은 앰버 코돈 UAG 및/또는 오팔코돈 UGA이다. UAG 및 UGA 둘다가 셀렉터 코돈으로서 사용되는 유전 코드는 가장 풍부한 종결 신호인 오커 넌센스 코돈 UAA를 보존하면서 22개의 아미노산을 코딩할 수 있다.
생체내에서의 비천연 아미노산의 도입은 숙주 세포에게 유의한 악영향을 주지 않으면서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이와 같은 비-진핵세포에서, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA, 예를 들어, 앰버 억제자 tRNA와 방출 인자 1(RF1)(이것은 UAG 코돈에 결합하고 리보좀으로부터의 성장하는 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 달려 있기 때문에, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 예컨대, 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시키거나 RF1 결핍 균주를 사용함으로써 조절할 수 있다. 진핵세포에서, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA, 예를 들어, 앰버 억제자 tRNA와 진핵생물 방출 인자(예를 들어, eRF)(이것은 정지 코돈에 결합하고 리보좀으로부터의 성장하는 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 달려 있기 때문에, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 예컨대, 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시킴으로써 조절할 수 있다. 또한, 추가 화합물 예를 들어, 디티오쓰레이톨(DTT)과 같은 환원제도 존재할 수 있다.
비천연 아미노산도 희귀 코돈으로 코딩될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소된 경우, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌(Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993))을 참조한다. 이 경우, 합성 tRNA는 이. 콜라이에서 소수의 종으로서 존재하는 천연 발생 tRNAArg와 경쟁한다. 추가로, 몇몇 유기체는 모든 3 염기 코돈을 사용하지는 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 사용되지 않는 코돈인 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물 중에서의 아미노산의 삽입을 위해 사용되고 있다. 예를 들어, 문헌(Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997))을 참조한다. 본 발명의 성분들은 생체내에서 이 희귀 코돈들을 사용하도록 제조될 수 있다.
셀렉터 코돈은 확장된 코돈, 예를 들어, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 예컨대, 4개, 5개 또는 6개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 포함할 수도 있다. 4 염기 코돈의 예에는 예를 들어, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등이 포함된다. 5 염기 코돈의 예에는 예를 들어, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등이 포함된다. 본 발명의 방법은 프레임변동 억제에 기초한 확장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈은 예를 들어, 하나 또는 다수의 비천연 아미노산을 동일한 단백질 내로 삽입시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 안티코돈 루프는 예를 들어, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 5개 이상의 염기로 이루어진 코돈 또는 6개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 해독할 수 있다. 256개의 가능한 4 염기 코돈이 존재하기 때문에, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 사용하여 다수의 비천연 아미노산을 동일한 세포 내에서 코딩할 수 있다. 문헌(Anderson et al., (2002) "Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size," Chemistry and Biology. 9:237-244; and Magliery (2001) "Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli" J. Mol. Biol. 307: 755-769)을 참조한다.
예를 들어, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입시키는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌(Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:34)을 참조한다. CGGG 및 AGGU는 화학적으로 아실화된 2개의 프레임변동 억제자 tRNA를 사용하여 시험관내에서 2-나프틸알라닌 및 라이신의 NBD 유도체를 스트렙타비딘 내로 동시에 도입시키는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌(Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194)을 참조한다. 생체내 연구에서, 무어와 그의 동료들(Moore et al.)은 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 가진 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하여, 4 염기 코돈인 UAGA가 0 또는 -1 프레임으로 거의 해독되지 않으면서 UCUA 안티코돈을 가진 tRNALeu에 의해 13 내지 26%의 효율로 해독될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌(Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195)을 참조한다. 한 실시양태에서, 다른 원치 않는 부위에서 미스센스(missense) 판독 및 프레임변동 억제를 감소시킬 수 있는, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈에 기초한 확장된 코돈이 본 발명에서 사용될 수 있다. 4 염기 코돈이 다양한 오르소고날 시스템에서 셀렉터 코돈으로서 사용되어 왔다. 예를 들어, 국제특허공개공보 제WO 2005/019415호; 제WO 2005/007870호; 및 제WO 2005/07624호를 참조한다. 그 내용이 완전히 참고로 도입되는 문헌(Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(l):34-66 (2005)) 또한 참조한다. 하기 실시예는 앰버 셀렉터 코돈을 사용하지만, 다양한 비천연 아미노산 O-RS에 대해 전술된 돌연변이와 유사한 돌연변이를 포함하도록 개질된 4 염기 O-tRNA 및 합성효소를 포함하도록 본원의 실시예를 변형시킴으로써 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈도 사용할 수 있다.
소정의 시스템에 있어서, 셀렉터 코돈은 천연 3 염기 코돈들 중 하나를 포함할 수도 있는데, 이때 내재성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 (또는 거의 사용하지) 않는다. 예를 들어, 이는 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA를 갖지 않은 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.
경우에 따라, 셀렉터 코돈은 비천연 염기 쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기 쌍은 기존 유전자 알파벳을 더 확장시킨다. 한 여분의 염기 쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기 쌍의 성질은 안정한 선택적 염기페어링(paring), 신뢰도가 높은 중합효소에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기(nascent) 비천연 염기 쌍의 합성 후 효율적인 연속적 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 비천연 염기 쌍의 설명은 예를 들면, 문헌(Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20:177-182)을 포함한다. 다른 관련 문헌은 하기에 나열되어 있다.
생체내에서 사용하는 경우, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 나타내며, 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고 세포내 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너(Benner) 및 다른 사람들에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 와슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌(Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602)을 참조한다. 일반적으로, 이들 염기는 천연 염기와 어는 정도 미스페어링(mispairing)하며, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨(Kool) 및 그의 동료들은 염기들 사이의 소수성 팩킹(packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기 쌍의 형성을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌(Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825)을 참조할 수 있다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비천연 염기 쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가-쌍(self-pair)은 천연 염기 쌍보다 안정한 것으로 밝혀졌고, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌(McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274)을 참조한다. 3MN:3MN 자가-쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선별성을 갖는 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803)을 참조한다. 그러나, 양쪽 염기 둘다 추가 복제를 위한 사슬 종결서열로 작용한다. 최근, 돌연변이 DNA 중합효소는 PICS 자가-쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가-쌍도 복제될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439)을 참조한다. 또한, 새로운 메탈로염기 쌍인 Dipic:Py도 개발되었으며, 상기 염기 쌍은 Cu(II)와의 결합 시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌(Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714)을 참조할 수 있다. 확장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 대해 오르소고날하기 때문에, 본 발명의 방법은 이 성질을 이용하여 이들에 대한 오르소고날 tRNA를 생성시킬 수 있다.
또한, 번역 우회(translational bypassing) 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열은 유전자 내로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보좀이 서열 상에서 호핑하여(hopping), 삽입 부위의 다운스트림(downstream)에서 번역을 재개하도록 유도하는 신호(cue)로서 작용하는 구조를 포함한다.
비천연 아미노산
본원에서 사용된 바와 같이, 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 및/또는 피롤라이신, 및 하기 20종의 유전적으로 코딩된 알파-아미노산을 제외한 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 지칭한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린. 알파-아미노산의 일반 구조는 하기 화학식 I로 표시된다:
Figure 112008033191515-PCT00001
전형적으로, 비천연 아미노산은 화학식 I을 갖는 임의의 구조이며, 상기 식 중, R기는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 치환기 이외의 임의의 치환기이다. 20종의 천연 아미노산의 구조에 대해서는 예를 들어, 문헌(Biochemistry by L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York)을 참조한다. 본 발명의 비천연 아미노산이 20종의 알파-아미노산 외의 천연 발생 화합물일 수 있다는 것을 주목해야 한다.
본 발명의 비천연 아미노산은 전형적으로 측쇄에서 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 비천연 아미노산은 천연 발생 단백질에서 형성되는 방식과 동일한 방식으로 다른 아미노산, 예를 들어, 천연 또는 비천연 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연 아미노산은 이들을 천연 아미노산으로부터 구별시켜 주는 측쇄 기를 갖는다.
본원에서 특히 관심을 끄는 것은 도 3 및 15에 나타낸 비천연 아미노산이다. 예를 들어, 이 비천연 아미노산들은 아릴-아지드 아미노산, 예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알리닌 및 알키닐-아미노산, 예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 이 비천연 아미노산들의 L 및 D-거울상이성질체 둘다가 본 발명에서 사용될 수 있다.
이 아릴-아지드 및 알키닐 비천연 아미노산들 외에, 다른 비천연 아미노산은 예를 들어, 아릴-아지드 또는 알키닐 비천연 아미노산을 도입하는 오르소고날 쌍과 함께 적절한 제2 O-RS/O-tRNA 쌍을 사용하여 원하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 동시에 도입시킬 수 있다. 이러한 많은 추가 비천연 아미노산 및 적절한 오르소고날 쌍 시스템은 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 인용된 참고문헌을 참조한다.
다른 비천연 아미노산에 있어서, 예를 들어, 화학식 I에서 R은 경우에 따라 알킬-, 아릴-, 아실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 에논(enone), 이민, 에스테르, 히드록실아민, 아민 등 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 원하는 다른 비천연 아미노산은 광활성화가능한 가교 결합제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 새로운 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징되고/되거나 광이성질체화가능한 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 케토 함유 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 아미노산 측쇄에 부착된 사카라이드 잔기, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단될 수 있고/있거나 광절단될 수 있는 아미노산, 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 약 5개 이상, 약 10개 이상 등의 탄소를 포함하는 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소), 탄소-결합 당 함유 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 1개 이상의 독성 잔기를 포함하는 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 IV로 표시되는 일반 구조를 가진 비천연 아미노산을 제공한다:
Figure 112008033191515-PCT00002
이 구조를 갖는 비천연 아미노산은 전형적으로 R1이 20종의 천연 아미노산 중 하나(예를 들어, 티로신 또는 페닐알라닌)에서 사용된 치환기이고 R2가 치환기인 임의의 구조이다. 따라서, 이러한 유형의 비천연 아미노산은 천연 아미노산 유도체로서 간주될 수 있다.
새로운 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산, 예컨대, 도 3 및 15에 나타낸 아미노산 외에, 비천연 아미노산은 경우에 따라 예를 들어, 하기 화학식 II 및 화학식 III으로 표시되는 변형된 골격 구조를 포함할 수도 있다:
Figure 112008033191515-PCT00003
Figure 112008033191515-PCT00004
상기 식에서,
Z는 전형적으로 OH, NH2, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있으며 전형적으로 S 또는 O를 포함하고, R 및 R'는 경우에 따라 동일하거나 상이할 수 있으며 전형적으로 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해 전술한 R 기에 대한 치환기들의 동일한 목록 및 수소로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명의 비천연 아미노산은 경우에 따라 화학식 II 및 화학식 III으로 표시되는 아미노 또는 카르복실 기에서의 치환을 포함한다. 이러한 종류의 비천연 아미노산은 예컨대, 20종의 공통된 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 갖는 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 경우에 따라 L, D 또는 α-α-이치환 아미노산, 예를 들면 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함한다. 다른 구조적 대체물은 시클릭 아미노산, 예를 들면 프롤린 유사체 뿐만 아니라, 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산 예를 들면, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 L-구조의 비천연 아미노산을 사용한다. 그러나, 본 발명이 L-구조의 비천연 아미노산의 사용으로 한정되는 것은 아니다. 이 비천연 아미노산들의 D-거울상이성질체도 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 고려해야 한다.
티로신 유사체에는 파라-치환 티로신, 오르토-치환 티로신 및 메타-치환 티 로신이 포함되고, 이때 상기 치환 티로신은 알키닐 기, 아세틸 기, 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C6-C20 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기 등을 포함한다. 또한, 다-치환 아릴 고리도 고려된다. 본 발명의 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환 글루타민 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 페닐알라닌 유사체는 파라-치환 페닐알라닌, 오르토-치환 페닐알라닌, 및 메타-치환 페닐알라닌을 포함하나, 이들로 한정되지 않으며, 이때 치환기는 알키닐 기, 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 니트로, 티올 기 또는 케토 기 등 등을 포함한다. 비천연 아미노산의 구체적인 예로는 p-에틸티오카르보닐-L-페닐알라닌, p-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌, 1,5-댄실-알라닌, 7-아미노-쿠마린 아미노산, 7-히드록시-쿠마린 아미노산, 니트로벤질-세린, O-(2-니트로벤질)-L-티로신, p-카르복시메틸-L-페닐알라닌, p-시아노-L-페닐알라닌, m-시아노-L-페닐알라닌, 비페닐알라닌, 3-아미노-L-티로신, 비피리딜 알라닌, p-(2-아미노-1-히드록시에틸)-L-페닐알라닌, p-이소프로필티오카르보닐-L-페닐알라닌, 3-니트로-L-티로신 및 p-니트로-L-페닐알라닌이 있다. 또한, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌(DHP), 3,4,6-트리히드록시-L-페닐알라닌, 3,4,5-트리히드록시-L-페닐알라닌, 4-니트로-페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 3-니 트로-티로신, 3-티올-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파(L-Dopa), 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 등도 있다. 오르소고날 번역 시스템을 사용하여 도입할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조는 공지되어 있다. 완전히 참고로 본원에 도입되는, 본원에서 인용된 참고문헌들을 참조한다.
비천연 아미노산의 화학적 합성
전술한 비천연 아미노산의 대다수는 예를 들어, 시그마(미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신 밀워키 소재)로부터 시판된다.. 시판되지 않는 비천연 아미노산은 경우에 따라 다양한 문헌에 기재된 바와 같이 합성하거나 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성한다. 유기 합성 기법의 경우, 예를 들면, 문헌(Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York))을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 기술하는 추가 문헌은 예를 들면, 국제특허공개공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"), 문헌(Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. & Kidd, (1949) "A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Internediates". J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman and Chatterrji (1959) "Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents". J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig et al., (1988) "Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine)". J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay et al., (1991) "Glutamine analogues as Potential Antimalarials",. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen and Rapoport (1989) "Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues". J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie and Rapoport (1985) "Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization". J. Org. Chem. 1989: 1859-1866; Barton et al., (1987) "Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-aminopinelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives". Tetrahedron Lett. 43: 4297-4308; and, Subasinghe et al., (1992) "Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site". J. Med. Chem. 35: 4602-7)을 포함한다. 또한, 2003년 12월 22일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS")를 참조한다.
비천연 아미노산의 세포내 흡수(cellular uptake)
세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 예를 들어, 단백질 내로 도입하기 위해 비천연 아미노산을 디자인하고 선택하는 경우 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이 화합물이 세포를 투과할 수 없을 수 있음을 암시한다. 천연 아미노산은 종종 다양한 아미노산 특이성 수준을 나타내는 일군의 단백질-기재 수송 시스템을 통해 세포 내로 흡수된다. 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수된다면 어떤 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지를 평가하는 신속한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들면, 2003년 12월 22일 출원된 국제특허공개공보 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS"); 및 문헌(Liu and Schultz (1999) "Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code". PNAS 96: 4780-4785)에 기재된 독성 분석을 참조한다. 흡수는 다양한 분석법으로 용이하게 분석되지만, 세포내 흡수 경로를 따라 흡수될 수 있는 비천연 아미노산의 디자인에 대한 대안은 생체내에서 아미노산을 생성시키는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
비천연 아미노산의 생합성
아미노산 및 다른 화합물들을 제조하기 위한 많은 생합성 경로들이 세포에 이미 존재한다. 특정한 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 자연계 예컨대, 세포에 존재하지 않을 수 있으나, 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 경우에 따라 새로운 효소를 첨가하거나 기존 숙주 세포 경로를 변경함으로써 숙주 세포에서 생성된다. 새로운 추가 효소로는 경 우에 따라 천연 발생 효소 또는 인공적으로 유도된 효소가 있다. 예를 들면, (상기 국제특허공개공보 제WO 2002/085923호의 실시예에서 제공된 바와 같은) p-아미노페닐알라닌의 생합성은 다른 유기체로부터의 공지된 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이 효소들에 대한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 원하는 화합물을 합성하는 효소적 경로를 제공한다. 경우에 따라 첨가되는 효소 종류의 예는 하기 실시예에서 제공된다. 추가 효소의 서열은 예를 들면, 진뱅크(Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 유도된 효소는 경우에 따라 동일한 방식으로 세포 내로 첨가된다. 이 방식으로, 세포내 기구 및 세포내 자원을 비천연 아미노산의 제조에 활용한다.
사실상, 시험관내 또는 생체내에서 생합성 경로, 기존 경로의 개발 또는 비천연 아미노산의 제조에 사용하기 위한 신규 효소를 제조하는 다양한 방법들 중 임의의 방법이 이용될 수 있다. 효소 및 다른 생합성 경로 성분들을 개발하기 위한 많은 이용가능한 방법들을 본 발명의 방법에 적용하여 비천연 아미노산을 제조할 수 있다(또는, 사실상 새로운 기질 특이성 또는 다른 원하는 활성을 가진 합성효소를 개발할 수 있다). 예를 들어, 경우에 따라 DNA 셔플링을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 비천연 아미노산의 제조 (또는 신규 합성효소의 제조)를 위한 신규 효소 및/또는 이 효소의 경로를 개발한다. 예를 들어, 문헌(Stemmer (1994), "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling," Nature 370(4):389-391; and, Stemmer (1994),"DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution," Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751)을 참조한다. 관련된 방법들이 관련된(예를 들어, 상동성) 유전자 족(familiy)을 셔플링하여 원하는 특징을 가진 효소들을 신속히 개발한다. 이러한 "족 유전자 셔플링" 방법의 예는 문헌(Crameri et al., (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature, 391(6664): 288-291)에서 찾을 수 있다. (생합성 경로 성분이든 아니면 합성효소이든) 신규 효소는 예를 들어, 문헌(Ostermeier et al., (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17: 1205)에 기재된 바와 같이 "혼성 효소의 생성을 위한 점진적 말단절단(truncation)"("ITCHY")으로서 공지된 DNA 재조합 방법을 이용하여 발생시킬 수도 있다. 이 방법은 1개 이상의 시험관내 또는 생체내 재조합 방법에 대한 기질로서 작용할 수 있는 효소 또는 다른 경로 변이체 라이브러리를 발생시키는 데 이용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌(Ostermeier et al., (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3562-67, and Ostermeier et al., (1999), "Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44) 또한 참조한다. 또 다른 방법은 예를 들어, 비천연 아미노산 (또는 신규 합성효소)의 제조에 대한 생합성 반응을 촉진하는 능력에 대해 선별된 효소 또는 다른 경로 변이체 라이브러리를 제조하기 위해 기하급수적이고 동시적인 돌연변이유발을 이용한다. 이 방법에서, 원하는 서 열 내의 잔기들로 이루어진 작은 군을 동시에 무작위화하여 각각의 변경된 위치에서 기능성 단백질을 생성시키는 아미노산들을 확인한다. 비천연 아미노산(또는 신규 합성효소)의 생성을 위한 신규 효소를 제조하기 위해 본 발명에 적용될 수 있는 이러한 방법들의 예는 문헌(Delegrave and Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548-1552)에서 찾을 수 있다. 또 다른 방법에서, 효소 및/또는 경로 성분 개조를 위한 도핑된(doped) 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 랜덤 또는 세미-랜덤 돌연변이유발, 예를 들어, 문헌(Arkin and Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300; or Reidhaar-Olson et al., (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes" Methods Enzymol. 208:564-86)의 일반적인 돌연변이유발 방법을 이용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 재조립(reassembly) 및 부위-포화 돌연변이유발을 이용하는, 종종 "비-확률적" 돌연변이유발로 지칭되는 또 다른 방법을 이용하여 효소 및/또는 경로 성분들을 제조할 수 있고, 이어서 상기 효소 및/또는 경로 성분들은 (예를 들어, 생체내에서 비천연 아미노산의 제조를 위한) 1개 이상의 합성효소 또는 생합성 경로 기능을 수행하는 능력에 대해 검색될 수 있다. 예를 들어, 쇼트(Short)의 국제특허공개공보 제WO 00/46344호(발명의 명칭: "NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES")를 참조한다.
이러한 돌연변이유발 방법에 대한 별법은 유기체의 전체 게놈을 재조합하는 단계 및 생성된 자손(progeny)을 특정한 경로 기능(종종 "전체 게놈 셔플링"으로 지칭됨)에 대한 선별하는 단계를 포함한다. 이 방법은 예를 들어, 비천연 아미노산(또는 이의 중간체)를 생성시키는 능력에 대한 유기체(예를 들어, 이. 콜라이 또는 다른 세포)의 게놈 재조합 및 선별에 의해 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Patnaik et al., (2002) "Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance" Nature Biotechnology, 20(7): 707-712; and Zhang et al., (2002) "Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria" Nature, February 7, 415(6872): 644-646)에 교시된 방법은 생체내에서 비천연 아미노산을 제조하기 위해 세포내의 기존 및/또는 신규 경로를 개발하기 위한 경로 디자인에 적용될 수 있다.
예를 들어, 원하는 화합물의 제조를 위한 유기체 및 대사 경로 개조를 위한 다른 기법도 이용가능하며 비천연 아미노산의 제조에 적용될 수도 있다. 유용한 경로 개조 방법을 교시하는 문헌의 예로는 문헌(Nakamura and White (2003) "Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol" Curr. Opin. Biotechnol. 14(5):454-9; Berry et al., (2002) "Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo" J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133; Banta et al., (2002) "Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis" Biochemistry. 41(20), 6226-36; Selivonova et al., (2001) "Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms" Applied and Environmental Microbiology, 67:3645) 및 많은 다른 문헌들이 있다.
이용된 방법과 관계없이, 전형적으로 본 발명의 개조된 생합성 경로를 이용하여 제조한 비천연 아미노산은 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도, 예를 들어, 세포내 본래 양으로 제조되나, 다른 세포내 아미노산의 농도에 유의한 영향을 미치거나 세포내 자원들을 고갈시킬 정도로 제조되는 것은 아니다. 이 방식으로 생체내에서 제조된 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 세포가 특정한 경로에 필요한 효소를 제조하도록 개조되고 비천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라 생체내 선별을 이용하여 리보좀에 의한 단백질 합성 및 세포 생장 둘다를 위한 비천연 아미노산의 제조를 더 최적화시킨다.
본 발명에서 사용될 수 있는 오르소고날 성분
본 발명은 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 제공하는데, 이때 상기 비천연 아미노산(및 그 결과로서 파지)은 번역후 변형된다. 또한, 본 발명은 변형된 파지를 제조하는 방법을 제공한다.
파지-디스플레이된 단백질 내로의 비천연 아미노산의 도입은 이. 콜라이에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 유전적으로 코딩하기 위해 오르소고날 쌍을 적용함으로써 달성되는데, 이때 오르소고날 성분들은 숙주 세포의 번역 기구의 내재성 이. 콜라이 성분들과 교차-반응하지 않지만, 원하는 비천연 아미노산을 인식하여 이를 셀렉터 코돈(예를 들어, 앰버 넌센스 코돈, TAG)에 반응하여 단백질 내로 도입시킨다. 본 발명에서 사용될 수 있는 오르소고날 성분들은 이. 콜라이와 같은 진정세균 숙주 세포 내에서 오르소고날 쌍으로서 작용하는, 메타노코커스 잔나스키이 티로실 tRNA-합성효소로부터 유도된 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소 및 돌연변이체 티로실 tRNACUA 앰버 억제자를 포함한다. 이 시스템에서, 돌연변이체 아미노아실-tRNA 합성효소는 상기 억제자 tRNA를 그의 개개의 비천연 아미노산으로 아미노아실화시키지만 공통된 20종의 아미노산 중 임의의 아미노산으로는 아미노아실화시키지 못한다.
오르소고날 성분들의 제조 방법은 본 발명에서 사용될 수 있는데, 이때 이 방법은 예를 들어, 생체내에서 셀렉터 코돈, 예를 들어, 앰버 정지 코돈, 넌센스 코돈, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈 등에 반응하여 비천연 아미노산, 예를 들어, 도 3 및 15에 나타낸 비천연 아미노산을 성장하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 쇄 내로 도입시킨다. 예를 들어, 오르소고날-tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS) 및 이들의 쌍이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이 쌍은 비천연 아미노산을 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입시키는 데 사용될 수 있고, 이때 상기 폴리펩티드는 파지-디스플레이 시스템 내로 도입된 후 번역후 변형된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)에는 O-tRNA를 파지-디스플레이 시스템에서 특이적 및 선별적으로 번역후 변형될 수 있는 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시키는 임의의 O-RS가 포함된다. 이 아미노산에는 아릴-아지도 아미노산, 예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알라닌, 및 알키닐-아미노산, 예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명은 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드를 가진 파지를 제공하는데, 이때 상기 아미노산 잔기는 선별적으로 변형될 수 있다. 이러한 아미노산에는 케토-잔기를 가진 아미노산, 예를 들어, 파라-아세틸-L-페닐알라닌, 메타-아세틸-L-페닐알라닌 및 파라-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2003, 100:56-61 and Liu et al., (2003) JACS 125(7): 1702-1703 참조). 반응성 화학 잔기를 가진 추가 비천연 아미노산도 오르소고날 번역 시스템을 사용하여 파지 내로 도입할 수 있는데, 이때 비천연 아미노산은 변형에 대한 선별적 표적이다. 이 시스템은 예를 들어, 파라-(2-아미노-1-히드록시에틸)-L-페닐알라닌, 파라-이소프로필티오카르보닐-L-페닐알라닌 및 파라-에틸티오카르보닐-L-페닐알라닌(2005년 10월 27일 출원된 국제특허출원 제PCT/US2005/039210호(Schultz et al.)(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS") 참조)을 도입시킬 수 있다.
번역후 변형될 수 있는 비천연 아미노산에 대한 추가 정보는 예를 들어, 완전히 참고로 본원에 각각 도입되는 문헌(Chin et al., Science (2003) 301:964-967; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2004, 101:7566-7571; Wang et al., (2001) Science 292:498-500; Chin et al., (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; Chin and Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin, et al., (2002) PNAS United States of America 99:11020-11024; Wang and Schultz, (2002) Chem. Comm., 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005); and Deiters et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005))에 기재된 비천연 아미노산 오르소고날 시스템을 참조한다.
국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/019415호; 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007870호; 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007624호; 2005년 9월 20일 출원된 제WO 2006/034332호; 및 2005년 10월 27일 출원된 국제특허출원 제PCT/US2005/039210호(Schultz et al.)(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS") 또한 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 O-RS는 임의의 내재성 tRNA보다 O-tRNA를 특정한 비천연 아미노산으로 우세하게 아미노아실화시키는데, 이때 O-RS는 O-tRNA를 선호하며, 비천연 아미노산으로 충전된 내재성 tRNA에 대한 동일한 비천연 아미노산으로 충전된 O-tRNA의 비율은 1:1 이상이고, 보다 바람직하게는 O-RS는 O-tRNA만을 충전시키거나 거의 O-tRNA만을 충전시킨다.
본 발명은 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 사용하는데, 이때 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식한다. 전형적으로, O-tRNA는 서열목록에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 번호 1)을 포함하거나 이 서열에 의해 코딩되는 O-tRNA의 억제 효율에 비해 셀렉터 코돈에 반응하여 동족체 합성효소의 존재 하에 예를 들어, 약 45%, 50%, 60%, 75%, 80% 또는 90% 이상의 억제 효율을 포함한다. 한 실시양태에서, O-RS 및 O-tRNA가 함께 있는 경우의 억제 효율은 O-RS가 없는 경우 O-tRNA의 억제 효율보다 예를 들어, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 25배 이상 더 높다. 일부 측면에서, O-RS 및 O-tRNA가 함께 있는 경우의 억제 효율은 메타노코커스 잔나스키이로부터 유래된 오르소고날 티로실-tRNA 합성효소의 억제 효율의 45% 이상이다.
본 발명은 파지를 생성시킬 수 있는 번역 시스템 및 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포(예를 들어, 이. 콜라이)를 사용하는데, 이때 상기 번역 시스템은 오르소고날-tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS), 및 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로 도입된 후 번역후 변형될 수 있는 비천연 아미노산을 포함한다. 전형적으로, O-RS는 임의의 내재성 tRNA보다 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우세하게 아미노아실화시키는데, 이때 O-RS는 O-tRNA를 선호하며, 비천연 아미노산으로 충전된 내재성 tRNA에 대한 비천연 아미노산으로 충전된 O-tRNA의 비율은 1:1 이상이고, 보다 바람직하게는 O-RS는 O-tRNA만을 충전시키거나 거의 O-tRNA만을 충전시킨다. O-tRNA는 제1 셀렉터 코돈을 인식하고, O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시킨다.
다양한 폴리뉴클레오티드도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이 폴리뉴클레오티드에는 O-RS를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공 (예를 들어, 수동-제조되고, 천연적으로 발생되지 않은, 예를 들어 재조합) 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드에는 고도로 엄격한 조건 하에 실질적으로 핵산의 전체 길이에 걸쳐 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 핵산이 포함될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 발현 벡터 등이 포함될 수 있다. 0-tRNA/O-RS 쌍의 성분들을 제조하는 방법은 공지되어 있고 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 개시내용 및 본원에서 인용된 참고문헌을 참조한다.
핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체
본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, O-tRNA 및 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 각각의 아미노산 서열과 마찬가지로 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 예를 제공하고 언급한다. 그러나, 본 발명의 용도가 본원에 개시된 서열로 한정되지 않는다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 본 발명이 본원에 기재된 기능을 가진 많은 관련 서열, 예를 들어, 본원에 개시된 O-RS의 보존적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다는 것을 인식할 것이다.
또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 tRNA의 서열과 예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 그 이상 동일한 (그러나, 천연 발생 tRNA가 아닌) 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 tRNA의 서열과 예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 그 이상 동일한 (그러나, 100% 동일하지는 않은) 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등)는 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
당업자는 개시된 서열들의 많은 변이체도 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 기능적으로 동일한 서열을 생성시키는 개시된 서열의 보존적 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 1개 이상의 개시된 서열에 혼성화되는, 핵산 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다.
보존적 변이체
유전 코드의 축퇴성 때문에, "침묵 치환"(즉, 코딩된 폴리펩티드에서의 변경을 초래하지 않는 핵산 서열에서의 치환)은 아미노산 서열을 코딩하는 모든 핵산 서열의 내포된 특징이다. 유사하게, 아미노산 서열 내의 하나 또는 한정된 수의 아미노산이 고도로 유사한 성질을 가진 상이한 아미노산으로 치환되는 "보존적 아미노산 치환"도 개시된 구축물과 매우 유사한 것으로서 용이하게 확인된다. 각 개시 된 서열의 이러한 보존적 변이체는 본 발명의 한 특징이다.
특정한 핵산 서열의 "보존적 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 당업자는 코딩된 서열 내에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산(전형적으로 5% 미만, 보다 더 전형적으로 4%, 2% 또는 1% 미만)을 변경시키거나, 부가하거나 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 부가가 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 초래하는 "보존적으로 변형된 변이"라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 나열된 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이"는 폴리펩티드 서열의 적은 비율, 전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 2% 또는 1% 미만을 동일한 보존적 치환 기의 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다. 마지막으로, 핵산 분자의 코딩된 활성을 변경시키지 않는 서열의 부가, 예를 들어, 비기능적 서열의 부가는 기본 핵산의 보존적 변이이다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학적 성질(예를 들어, 방향족 측쇄 또는 양으로 하전된 측쇄)을 가진 또 다른 아미노산 잔기로 치환되므로, 폴리펩티드 분자의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 하기 표에는 유사한 화학적 성질의 천연 아미노산을 함유하는 예시적 군이 기재되어 있는데, 이때 군 내의 치환은 "보존적 치환"이다.
보존적 아미노산 치환
비극성 및/또는 지방족 측쇄 극성, 비하전 측쇄 방향족 측쇄 양으로 하전된 측쇄 음으로 하전된 측쇄
글리신 알라닌 발린 류신 이소류신 프롤린 세린 쓰레오닌 시스테인 메티오닌 아스파라진 글루타민 페닐알라닌 티로신 트립토판 라이신 아르기닌 히스티딘 아스파르테이트 글루타메이트
핵산 혼성화
비교 혼성화를 이용하여, 본원에 제공된 핵산의 보존적 변이체를 포함하는, 본 발명에서 사용될 수 있는 핵산을 확인할 수 있고, 이 비교 혼성화 방법은 본 발명에서 사용될 수 있는 핵산을 구별하는 바람직한 방법이다. 높은, 매우 높은 및 극도로 매우 높은 엄격 조건 하에서 본원에 제공된 또는 언급된 핵산에 혼성화되는 표적 핵산도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 핵산의 예로는 소정의 핵산 서열에 비해 하나 또는 소수의 침묵 또는 보존적 핵산 치환을 가진 핵산이 있다.
시험 핵산은 그 자신이 완벽하게 매칭되는(matched) 상보적 표적에 대한 프로브에도 50% 이상 혼성화되는 경우, 즉 완벽하게 매칭되는 프로브가 매칭되지 않은 표적 핵산들 중 임의의 핵산과의 혼성화에 대해 관찰된 것보다 약 5x 내지 10x 이상 더 높은 신호 대 노이즈(noise) 비로 완벽하게 매칭되는 상보적 표적에 결합하는 조건 하에서 시험 핵산이 표적과 프로브의 혼성화보다 절반 이상 더 높은 신호 대 노이즈 비로 혼성화되는 경우 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화된다고 말한다.
핵산은 이들이 전형적으로 용액 중에서 결합될 때 "혼성화된다". 핵산은 특징이 잘 규명되어 있는 다양한 물리화학적 힘, 예컨대, 수소결합, 용매 배제, 염기 적층 등으로 인해 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌(Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York))뿐만 아니라 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2004) ("Ausubel"))에서도 찾을 수 있고, 문헌(Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1) and Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2))은 올리고뉴클레오티드를 비롯한 DNA 및 RNA의 합성, 표지, 검출 및 정량화에 대한 상세한 설명을 제공한다.
서던 또는 노던에서 필터 상에 100개 이상의 상보적 잔기를 가진 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 1 mg의 헤파린을 함유하는 42℃의 50% 포르말린이며, 이때 혼성화는 밤새 수행된다. 엄격한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2x SSC를 사용한 세척이다(SSC 완충제에 대한 설명에 대해서는 상기 샘브룩의 문헌 참조). 종종, 높은 엄격도 세척은 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 낮은 엄격도 세척 후에 행한다. 예시적인 낮은 엄격도 세척은 15분 동안 40℃에서 2xSSC를 사용한 세척이다. 일반적으로, 특정한 혼성화 분석법에서 관련없는 프로브에 대해 관찰된 신호 대 노이즈 비의 5배 (또는 더 높은) 신호 대 노이즈 비는 특이적 혼성화의 검출을 표시한다.
핵산 혼성화 실험(예컨대, 서던 혼성화 및 노던 혼성화)와 관련하여 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경 파라미터 하에 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위 지침은 상기 문헌(Tijssen (1993) 및 문헌(Hames and Higgins, 1 and 2)에서 찾을 수 있다. 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 임의의 시험 핵산에 대해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격한 혼성화 및 세척 조건의 결정에 있어서, 선택된 기준 세트를 충족시킬 때까지 (예컨대, 혼성화 또는 세척에서 온도 증가, 염 농도 감소, 세제 농도 증가 및/또는 유기 용매 예컨대, 포르말린 농도의 증가에 의해) 혼성화 및 세척 조건을 점점 강화시킨다. 예를 들어, 높은 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서, 매칭되지 않은 표적과 프로브의 혼성화에 대해 관찰되는 신호 대 노이즈 비보다 5배 이상 더 높은 신호 대 노이즈 비로 프로브가 완벽하게 매칭되는 상보적 표적에 결합할 때까지 혼성화 및 세척 조건을 점점 강화시킨다.
"매우 엄격한" 조건은 특정한 프로브에 대한 열적 융점(Tm)과 동등하도록 선택된다. Tm은 시험 서열의 50%가 (소정의 이온 강도 및 pH 하에) 완벽하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도이다. 본 발명의 목적을 위해, 일반적으로, "매우 엄격한" 혼성화 및 세척 조건은 소정의 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm보다 약 5℃ 정도 낮게 선택된다.
"매우 높은 엄격도" 혼성화 및 세척 조건은 완벽하게 매칭되는 상보적 표적 핵산과 프로브의 결합에 대한 신호 대 노이즈 비가 임의의 매칭되지 않은 표적 핵산과의 혼성화에 대해 관찰된 신호 대 노이즈 비보다 10배 이상 더 높아질 때까지 혼성화 및 세척 조건의 엄격도가 증가되는 조건이다. 이러한 조건 하에서 완벽하게 매칭되는 상보적 표적 핵산의 1/2 이상의 신호 대 노이즈 비로 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은 매우 높은 엄격도 조건 하에서 프로브에 결합한다고 말한다.
유사하게, 훨씬 더 높은 엄격도 수준은 관련 혼성화 분석법의 혼성화 및/또는 세척 조건을 점점 강화시킴으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 완벽하게 매칭되는 상보적 표적 핵산과 프로브의 결합에 대한 신호 대 노이즈 비가 임의의 매칭되지 않는 표적 핵산과의 혼성화에 대해 관찰된 신호 대 노이즈 비보다 적어도 lO배, 20배, 50배, 100배, 또는 500배 또는 그 이상 높아질 때까지 혼성화 및 세척 조건의 엄격도를 증가시킨다. 이러한 조건 하에서 완벽하게 매칭되는 상보적 표적 핵산에 대한 신호 대 노이즈 비의 1/2 이상인 신호 대 노이즈 비로 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은 극도로 높은 엄격도 조건 하에서 프로브에 결합한다고 말한다.
엄격한 조건 하에서 서로 혼성화하지 않는 핵산은 이들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우, 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 유전 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 핵산의 카피를 만들 때 일어난다.
독특한 하위서열(unique subsequence)
한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 또는 언급된 0-tRNA 및 O-RS의 서열로부터 선택된 핵산 내의 독특한 하위서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 독특한 하위서열은 공지된 임의의 O-tRNA 또는 O-RS 핵산 서열에 상응하는 핵산과 비교했을 때 독특하다. 정렬은 예를 들어, 디폴트 파라미터로 설정된 BLAST를 사용하여 수행할 수 있다. 임의의 독특한 하위서열은, 예를 들어 본 발명의 핵산을 확인하기 위한 프로브로서 유용하다.
유사하게, 본 발명은 본원에 개시된 또는 언급된 O-RS의 서열로부터 선택된 폴리펩티드 내의 독특한 하위서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서, 독특한 하위서열은 공지된 임의의 폴리펩티드 서열에 상응하는 폴리펩티드와 비교했을 때 독특하다.
또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 O-RS의 서열로부터 선택된 폴리펩티드 내의 독특한 하위서열을 코딩하는 독특한 코딩 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 표적 핵산을 제공하며, 이때 상기 독특한 하위서열은 임의의 대조군 폴리펩티드(예를 들어 돌연변이에 의해 유도된 본 발명의 합성효소의 모서열)에 상응하는 폴리펩티드와 비교했을 때 독특하다. 독특한 서열은 전술한 바와 같이 결정된다.
서열 비교, 동일성 및 상동성
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성(%)"은 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬된 경우 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당업자가 입수할 수 있는 다른 알고리즘) 중 하나 또는 육안 조사를 이용하여 측정한 때에 동일하거나 또는 일정 비율(%) 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가지는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드(예컨대, O-tRNA 또는 O-RS를 코딩하는 DNA, 또는 O-RS의 아미노산 서열)와 관련하여 "실질적으로 동일한"은 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬된 경우 서열 비교 알고리즘 또는 육안 조사를 이용하여 측정한 때에 약 60%, 약 80%, 약 90 내지 95%, 약 98% 또는 약 99% 이상 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가지는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 이러한 "실질적으로 동일한" 서열은 전형적으로 실제 모 서열에 대한 언급 없이 "상동성"을 갖는 것으로 간주된다. 바람직하게는, "실질적 동일성"은 길이가 약 50개 이상의 잔기로 이루어진 서열의 영역에 걸쳐, 더 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 존재하며, 가장 바람직하게는 서열은 약 150개 이상의 잔기 또는 비교될 2개 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
단백질 및/또는 단백질 서열은 공통된 모 단백질 또는 단백질 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유도되는 경우 "상동성"을 가진다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 공통된 모 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유도되는 경우 상동성을 가진다. 예를 들어, 임의의 천연 발생 핵산은 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 임의의 이용가능한 돌연변이유발 방법에 의해 변형될 수 있다. 발현되는 경우, 이 돌연변이 핵산은 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 물론 돌연변이 과정은 1개 이상의 표준 코돈을 추가로 변경하여, 생성된 돌연변이 단백질 내에서도 1개 이상의 표준 아미노산을 변경시킬 수 있다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질 (또는 이의 하위서열) 사이의 서열 유사성으로부터 추정된다. 상동성을 입증하는 데 유용한 서열 사이의 정확한 유사성(%)은 해당 핵산 및 단백질에 따라 다르지만, 관용적으로 25% 정도의 낮은 서열 유사성이 상동성을 확립하는 데 사용된다. 보다 높은 수준의 서열 유사성(예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상) 또한 상동성을 확립하는 데 사용될 수 있다. 서열 유사성(%)을 결정하기 위한 방법(예컨대, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTP 및 BLASTN)은 본원에 기재되어 있으며 일반적으로 입수가능하다.
서열 비교 및 상동성 결정을 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열과 비교되는 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터를 기초로 하여 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성(%)을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 문헌(Smith 뭉 Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국소적 상동성 알고리즘, 문헌(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 유사성 조사 방법, 이들 알고리즘의 자동화 실행(위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 지네틱스 컴퓨터 그룹, 위스콘신 지네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 육안 조사(일반적으로 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., Current Protocols, a joint venture between Breene Publishing Associates, In. and John Wiley & Sons, Inc., supplemented through 2004) 참조)로 수행할 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))에 기재되어 있는 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생명공학 정보센터(National Center fro Biotechnology Information) 웹사이트를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 정렬될 때 일정한 양성 값 역치 점수 T와 일치하거나 이를 만족시키는 길이 W의 짧은 워드를 검색(query) 서열에서 검색함으로써 높은 점수를 기록하는 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 수반한다. T는 인접 워드 점수 역치로서 언급된다(상기(Altschul et al.)의 문헌 참조). 이러한 초기 인접 워드 히트(hit)는 이들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 이어서, 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대한 누적 점수는 파라미터 M(1쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭된 잔기에 대한 벌점; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 점수화 매트릭스를 이용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서 워드 히트의 확장은, 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 떨어졌을 때; 음의 점수를 기록한 1개 이상의 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어졌을 때; 또는 어느 한 서열이 말단에 도달했을 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 워드 길이(W) 11, 기대 값(E) 10, 컷오프 100, M = 5, N = -4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이(W) 3, 기대 값(E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스를 사용한다(문헌(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 참조).
서열 동일성(%)을 계산하는 것 외에, BLAST 알고리즘은 2개 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석도 수행한다(예를 들어, 문헌(Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 매칭이 우연히 일어날 확률을 표시하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산과 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 때, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
돌연변이유발 및 다른 분자생물학 기법
본 발명에 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 분자생물학적 기법을 이용하여 개조할 수 있다. 분자생물학적 기법을 설명하는 일반 문헌은 문헌(Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 ("Sambrook")] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2004년 증보 개정판)("Ausubel"))을 포함한다. 상기 문헌에는 예를 들어, 다른 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 제조를 위한 셀렉터 코돈, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 합성효소 및 이들의 쌍을 포함하는 유전자의 발생, 관련 돌연변이유발 방법, 벡터의 사용, 프로모터 및 다른 다수의 관련 주제가 기재되어 있다.
예를 들어, tRNA 분자를 돌연변이시키기 위해, tRNA의 라이브러리를 제조하기 위해, 합성효소 라이브러리를 제조하기 위해, 원하는 단백질 또는 폴리펩티드 내에 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈을 삽입하기 위해, 본 발명에서 다양한 종류의 돌연변이유발 방법을 이용할 수 있다. 이 돌연변이유발 방법에는 부위 지정 돌연변이유발, 랜덤 점 돌연변이유발, 상동성 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구축, 우라실을 함유하는 주형을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 갭 이중 DNA를 사용한 돌연변이유발 등, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 다른 적절한 방법에는 점 미스매치 복구, 복구-결함 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발, 제한-선별 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중 가닥 절단 복구 등이 포함된다. 예를 들어, 키메라 구축물을 사용한 돌연변이유발 또한 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 돌연변이유발 방법은 천연 발생 분자 또는 변경되거나 돌연변이된 천연 발생 분자의 공지된 정보 예컨대, 서열, 서열 비교, 물성, 결정 구조 등에 의해 결정될 수 있다.
숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 벡터로 유전적으로 개조된다(예컨대, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된다). 예를 들어, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 합성효소, 및 유도체화될 단백질에 대한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포에서 기능성을 갖는 유전자 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결서열, 전사 및 번역 개시서열, 및 특정한 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 경우에 따라, 상기 벡터는 1개 이상의 독립적인 종결서열, 진핵생물 또는 원핵생물 또는 이들 둘다에서 카세트의 복제를 허용하는 서열(예컨대, 셔틀 벡터) 및 원핵세포 시스템 및 진핵세포 시스템 둘다를 위한 선별 마커를 포함하는 일반 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 바람직하게는 이들 둘다에서 복제 및/또는 삽입에 적합하다. 문헌(Giliman and Smith, Gene 8:81 (1979)]; [Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987)]; [Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995)]; [Ausubel, Sambrook, Berger (모두 상기 문헌 참조))을 참조한다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 네이키드(naked) 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(문헌(From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985))), 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자로 이루어진 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 가진 소립자에 의한 고속 탄도(ballistic) 침투(문헌(Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987))) 등을 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.
이. 콜라이 내에서 앰버 정지 코돈(UAG)에 반응하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 부위-특이적으로 도입하기 위한 매우 효율적인 다용도 단일 플라스미드 시스템이 개발되었다. 이 새로운 시스템에서, 메타노코커스 잔나스키이 억제자 tRNAtyr(CUA)와 티로실-tRNA 합성효소로 이루어진 쌍은 대부분의 이. 콜라이 발현 벡터와 상용가능한 단일 플라스미드 내에 코딩되어 있다. 최적 2차 구조 및 tRNA 프로세싱을 위해, proK 프로모터 및 종결서열의 조절 하에 놓인 단일시스트론(monocistronic) tRNA 오페론을 구축하였다. 상기 합성효소에 대한 glnS 프로모터의 돌연변이 형태의 도입은 억제 효율 및 신뢰도를 유의하게 증가시켰다. 억제 효율의 증가는 상기 합성효소 상의 특정한 돌연변이(D286R)에 의해서뿐만 아니라 tRNA 유전자의 다중 카피에 의해서도 수득되었다(Kobayashi et al., "Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion," Nat. Struct. Biol., 10(6):425-432 [2003]). 최적화된 시스템의 보편성은 단백질 기능 및 구조 연구에 있어서의 독특한 유용성이 이미 입증된 여러 상이한 비천연 아미노산의 매우 효율적이고 정확한 도입에 의해서도 입증되었다.
클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지의 카달로그는 예를 들어 ATCC, 예컨대 ATCC에 의해 공개된 문헌(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophag (1996) Gherna et al., (eds))에 의해 제공된다. 시퀀싱, 클로닝 및 분자생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 절차 및 기초적 이론 연구 또한 상기 문헌들(Sambrook and Ausubel) 및 문헌(Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY)에서 찾을 수 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산 (및 표준 핵산이든 아니면 비표준 핵산이든 사실상 임의의 표지된 핵산)은 다양한 상업적 공급처(예컨대, 미드랜드 서티파이드 컴퍼니(텍사스주 미드랜드 소재), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(캘리포니아주 라모나 소재), 익스프레스젠 인코포레이티드(일리노이주 시카고 소재), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 다른 많은 공급처) 중 임의의 공급처로부터 맞춤 주문받거나 또는 일반 주문받을 수 있다.
개조된 숙주 세포는 예를 들어, 검색 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체의 선별과 같은 공정에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양할 수 있다. 상기 세포는 경우에 따라 형질전환 유기체로 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포 단리 및 배양(예컨대, 후속 핵산 단리)에 유용한 다른 참고문헌에는 문헌(Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌((Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY); (Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture); (Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)) 및 (Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL))이 포함된다.
관심 단백질 및 폴리펩티드
번역후 변형되는 특정한 위치에서 비천연 아미노산(아릴-아지드 아미노산 또는 알키닐-아미노산)을 포함하는 디스플레이된 융합 단백질을 가진 파지를 제조하는 방법 또한 본 발명의 한 특징이다. 예를 들어, 방법은 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하며 단백질(캡시드 융합 단백질)을 코딩하는 핵산을 포함하는, 파지 구축물을 가진 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포)를 적절한 배지 중에서 생장시키는 단계; 및 비천연 아미노산을 제공하는 단계를 포함할 수 있는데. 이때 상기 세포는 세포 내에서 기능하며 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날-tRNA(O-tRNA), 및 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시키는 오르소고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 추가로 포함한다. 이. 콜라이에서 이렇게 제조된 파지는 셀렉터 코돈에 상응하는 위치에서 비천연 아미노산을 갖는 디스플레이된 융합 단백질을 포함한다. 이어서, 상기 파지는 비천연 아미노산이 공유 변형되는 조건 하에서 반응되어, 번역후 변형된 파지를 생성시킨다.
일부 실시양태에서, O-RS는 발현 시스템 내에서 임의의 내재성 tRNA에 비해 동족체 O-tRNA의 아미노아실화에 대한 선호성을 나타낸다. O-tRNA 및 O-RS가 동등한 몰 농도로 존재하는 경우 O-RS에 의해 충전되는 O-tRNA와 내재성 tRNA 사이의 상대적 비는 1:1 이상, 보다 바람직하게는 약 2:1 이상, 보다 더 바람직하게는 5:1, 훨씬 더 바람직하게는 10:1, 보다 더 바람직하게는 20:1, 훨씬 더 바람직하게는 50:1, 보다 더 바람직하게는 75:1, 훨씬 더 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.
일부 실시양태에서, 파지-디스플레이된 번역후 변형된 융합 단백질은 적절한 단백질분해효소, 및 파지-디스플레이된 융합 단백질 내로 도입된 단백질분해효소 인식 서열을 사용하여 절단할 수 있다. 이 절단은 파지 캡시드로부터 원하는 단백질 또는 이의 일부를 방출시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 단백질은 치료 단백질, 진단 단백질, 산업적으로 이용가능한 효소 또는 이들의 일부의 아미노산 서열과 75% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
번역후 변형되는 특정한 위치에서 비천연 아미노산(예를 들어, 아릴-아지드 아미노산 또는 알키닐-아미노산)을 포함하는 디스플레이된 융합 단백질을 가진 파지는 본 발명의 한 특징이다. 상기 파지는 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 세포에서 생성된다. O-tRNA/O-RS 쌍도 세포 내에 존재하고, 셀렉터 코돈에 반응하여 융합 단백질 내로 비천연 아미노산을 생체내 도입시키고 파지 상에 디스플레이시키는 숙주 세포 번역 기구를 사용한다. 번역후 변형될 수 있는 매우 다양한 비천연 아미노산을 도입하도록 숙주 세포에서 작용하는 O-tRNA/O-RS 시스템의 능력은 공지되어 있다. 예를 들어, 각각이 완전히 참고로 도입되는 문헌(Chin et al., Science (2003) 301:964-967; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:7566-7571; Wang et al., (2001) Science 292:498-500; Chin et al., (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; Chin and Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin, et al., (2002) PNAS United States of America 99:11020-11024; Wang and Schultz, (2002) Chem. Comm., 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005); and Deiters et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005))을 참조한다.
각각이 완전히 참고로 도입되는 국제특허공개공보 제WO 2002/086075호(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/019415호; 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007870호; 2004년 7월 7일 출원된 제WO 2005/007624호; 2005년 9월 20일 출원된 제WO 2006/034332호; 및 2005년 10월 27일 출원된 국제특허출원 제PCT/US2005/039210호(Schultz et al.)(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")에 기재된 비천연 아미노산 오르소고날 시스템 또한 참조한다.
비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하기 위해 예를 들어, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 단백질분해효소 표적 부위의 접근가능성, (예를 들어, 단백질 어레이의 경우) 잔기에 대한 표적, 표지 또는 반응성 기의 도입 등을 변화시키기 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 개선된 또는 심지어 완전히 새로운 촉매 활성 또는 물성을 가질 수 있다. 예를 들어, 독성, 생체분포, 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 성질 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(예컨대, 혈청 반감기), 예를 들어, 공유 Ehe는 비공유적으로 다른 분자와 반응하는 능력 등의 성질을, 경우에 따라 비천연 아미노산을 단백질 내에 포함시킴으로써 변형시킨다. 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들어, 새로운 치료, 진단, 촉매 효소, 산업상 이용가능한 효소, 결합 단백질(예컨대, 항체), 및 예를 들어, 단백질 구조 및 기능 연구에 유용하다. 예를 들어, 문헌(Dougherty, (2000) "Unnatural Amino Acids as Probe of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652)을 참조한다. (예를 들어, [3 + 2] 시클로부가 또는 슈타우딩거 변형에 의해) 번역 후 선별적으로 변형될 수 있는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 반응 파트너에 커플링될 수 있는 임의의 원하는 작용기를 포함하도록 개조될 수 있다. 상기 반응 파트너의 성질은 상기 반응 파트너가 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산 잔기와의 공유 부착을 일으키는 데 적합한 반응성 잔기를 포함한다는 점만을 제외하고 어떠한 방식으로든 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 조성물은 1개 이상, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 가진 1개 이상의 파지-디스플레이된 단백질을 포함한다. 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질에 존재하는 1개 이상의 (그러나, 전부는 아님) 특정한 아미노산이 비천연 아미노산인 파지-디스플레이된 단백질을 포함한다. 1개 이상의 비천연 아미노산을 가진 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(예컨대, 상기 단백질은 2개 이상의 상이한 종류의 비천연을 포함하거나, 2개 이상의 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있다). 2개 이상의 비천연 아미노산을 가진 소정의 단백질의 경우, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나, 1개 이상의 상이한 비천연 아미노산과 동일한 종류의 다수의 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
본질적으로 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 파지-디스플레이된 단백질 (또는 이의 일부) (및 예를 들어 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는, 임의의 상응하는 코딩 핵산)은 본원의 조성물 및 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 공지된 수많은 단백질을 확인하기 위해 어떠한 시도도 하지 않고, 예를 들어, 관련 번역 시스템 내에 1개 이상의 적절한 셀렉터 코돈이 포함되도록 임의의 이용가능한 돌연변이 방법을 조정함으로써 임의의 공지된 단백질이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 공지진 단백질에 대한 통상의 서열 저장 기관은 진뱅크, EMBL, DDBJ 및 NCBI를 포함한다. 다른 저장 기관은 인터넷을 검색하여 쉽게 찾을 수 있다.
전형적으로, 단백질은 임의의 이용가능한 단백질(예컨대, 치료 단백질, 진단 단백질, 산업상 이용가능한 효소, 또는 이의 일부 등)과 예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 그 이상 동일하며, 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료 단백질, 진단 단백질 및 다른 단백질의 예는 2004년 4월 16일 출원된 국제특허공개 공보 제WO 2004/094593호(발명의 명칭:Expanding the Eukaryotic Genetic Code"); 및 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")에서 찾을 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료 단백질, 진단 단백질 및 다른 단백질의 예에는 예를 들어, 알파-1 항트립신, 앤지오스타틴, 항용혈성 인자, 항체(항체에 대한 상세한 설명은 하기에서 제공), 아포지단백질, 아포단백질, 심방성 나트륨이뇨 인자, 심방성 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방성 펩티드, C-X-C 케모카인(예컨대, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), 칼시토닌, CC 케모카인(예컨대, 단핵세포 화학유인물질 단백질-1, 단핵세포 화학유인물질 단백질-2, 단핵세포 화학유인물질 단백질-3, 단핵세포 염증성 단백질-1 알파, 단핵세포 염증성 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), CD40 리간드, C-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인(예컨대, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, GROα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1), 상피 성장 인자(EGF), 에리쓰로포이에틴("EPO"), 익스폴리에이팅(Exfoliating) 독소 A 및 B, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 성선 자극 호르몬, 성장 인자, 헤지호그(Hedgehog) 단백질(예컨대, Sonic, Indian, Desert), 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(HGF), 히루딘, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인터페론(예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 인터루킨(예컨대, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 등), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제자, 루시퍼라제, 뉴르튜린(Neurturin), 호중구 억제자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬(예컨대, 인간 성장 호르몬), 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, 발열원성 외독소 A, B 및 C, 렐랙신(Relaxin), 레닌(Renin), SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체(IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘(Somatomedin), 소마토스타틴(Somatostatin), 소마토트로핀(Somatotropin), 스트렙토키나제, 수퍼항원, 즉, 스타필로코컬 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-1), 티모신(Thymosin) 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화자, 종양 괴사 인자 베타(TNF 베타), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 종양 괴사 인자-알파(TNF 알파), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGEF), 유로키나제 및 다른 많은 것들이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
비천연 아미노산을 생체내에서 파지-디스플레이된 단백질 내로 도입하고 변형시키기 위한, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 만들 수 있는 단백질의 한 부류는 전사 조절자 또는 이의 일부를 포함한다. 전사 조절자의 예에는 세포 성장, 분화, 조절 등을 조절하는 유전자 및 전사 조절자 단백질이 포함된다. 광범위한 치료 표적을 제공하는 전사 조절자는 원핵생물, 바이러스 및 진핵생물(진균, 식물, 효모, 곤충, 및 포유동물을 비롯한 동물을 포함한다)에서 발견된다. 발현 및 전사 활성화자는 많은 기작을 통해, 예를 들어, 수용체에 결합하고, 신호 전달도입 캐스케이드를 자극하고, 전사 인자의 발현을 조절하고, 프로모터 및 인핸서에 결합하고, 프로모터 및 인핸서에 결합하는 단백질에 결합하고, DNA를 풀고, pre-mRNA를 스플라이싱하고, RNA를 폴리아데닐화하고, RNA를 분해시켜 전사를 조절한다는 것은 인식되어 있을 것이다.
본 발명의 단백질의 한 부류(예컨대, 1개 이상의 비천연 아미노산을 가지는 단백질)는 생물학적 활성 단백질 예컨대, 사이토카인, 염증성 분자, 성장 인자, 이들의 수용체 및 종양유전자 생성물 예컨대, 인터루킨(예컨대, IL-1, IL-2, IL-8 등), 인터페론, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-키트, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1 및 히알루린/CD44; 신호 전달도입 분자 및 상응하는 종양유전자 생성물 예컨대, Mos, Ras, Raf 및 Met; 및 전사 활성화자 및 억제자 예컨대, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel; 및 스테로이드 호르몬 수용체 예컨대, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 알도스테론, LDL 수용체 리간드 및 코르티코스테론에 대한 수용체를 포함한다.
본 발명은 1개 이상의 비천연 아미노산을 가진 효소(예컨대, 산업상 이용가능한 효소) 또는 이의 일부를 제공한다. 효소의 예에는 예를 들어, 아미다제(amidases), 아미노산 라세마제(racemases), 아실라제(acylases), 데할로게나제(dehalogenases), 디옥시게나제(dioxygenases), 디아릴프로판 퍼옥시다제, 에피머라제(epimerases), 에폭시드 히드롤라제(hydrolases), 에스터라제, 이소머라제, 키나제, 글루코스 이소머라제, 글리코시다제, 글리코실 트랜스퍼라제, 할로퍼옥시다제, 모노옥시게나제(예컨대, p450), 리파제, 리그닌 퍼옥시다제, 니트릴 히드라타제(hydratases), 니트릴라제(nitrilases), 단백질분해효소, 포스파타제, 서브틸리신, 트랜스아미나제 및 뉴클레아제가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
이들 단백질의 대다수는 시판되고 있으며(예를 들어, 시그마 바이오사이언시스 카탈로그 참조), 상응하는 단백질 서열 및 유전자, 및 전형적으로 이들의 많은 변이체는 잘 공지되어 있다(예를 들어, 진뱅크 참조). 임의의 이들 단백질은 본 발명에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산의 삽입에 의해 변형되어, 예를 들어 그의 원하는 1개 이상의 치료적, 진단적 또는 효소적 성질이 변경될 수 있다. 치료적으로 관련된 성질의 예에는 혈청 반감기, 저장 수명 반감기, 안정성, 면역원성, 치료 활성, (예를 들어, 리포터 기(예컨대, 표지 또는 표지 결합 부위)를 비천연 아미노산에 포함시켜 얻는) 검출용이성, LD50의 감소 또는 다른 부작용, 위관을 통해 체내로 들어가는 능력(예컨대, 경구 이용가능성) 등을 포함한다. 관련된 진단적 성질의 예에는 저장 수명 반감기, 안정성, 진단 활성, 검출용이성 등이 포함된다. 관련된 효소적 특성의 예에는 저장 수명 반감기, 안정성, 효소적 활성, 생성 능력 등이 포함된다.
다양한 다른 단백질 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 비천연 아미노산을 갖는 1개 이상의 백신 단백질, 예컨대 감염성 진균 예컨대, 아스퍼길러스(Aspergillus), 칸디다(Candida) 종; 박테리아, 특히 병원성 박테리아에 대한 모델로 사용되는 이. 콜라이 뿐만 아니라, 스타필로코커스(Staphylococcus)(예컨대, 아루레우스(aureus)), 또는 스트렙토코커스(Streptococcus)(예컨대, 뉴모니아(pneumoniae))와 같이 의학적으로 중요한 박테리아; 포자류(예컨대, 플라스모디아(Plasmodia)), 근족충류(예컨대, 엔타모에바(Entamoeba)) 및 편모충(트리파노소마(Trypanosoma), 레이쉬마니아(Leishmania), 트리코모나스(Trichomonas), 지아르디아(Giardia) 등)과 같은 원생동물; (+) RNA 바이러스(예를 들어, 폭스바이러스 예컨대, 백시니아(vaccina); 피코르나바이러스 예컨대, 폴리오(polio); 토가바이러스 예컨대, 루벨라(rubella); 플라비바이러스 예컨대, HCV; 및 코로나바이러스를 포함한다), (-) RNA 바이러스(예컨대, 래브도바이러스 예컨대, VSV; 파라믹소빔세스 예컨대, RSV; 오소믹소빔세스 예컨대, 인플루엔자; 번야바이러스; 및 아레나바이러스), dsDNA 바이러스(예를 들어, 레오바이러스), RNA로부터 DNA를 합성하는 바이러스, 즉, 레트로바이러스 예컨대, HIV 및 HTLV, 및 DNA로부터 RNA를 합성하는 일부 바이러스 예컨대, 헤파티티스 B와 같은 바이러스로부터 유래된 단백질 내의 1개 이상의 천연 아미노산을 치환시키는 것을 포함할 수 있다.
곤충 내성 단백질(예컨대, Cry 단백질), 전분 및 지질 생성 효소, 식물 및 곤충 독소, 독소-내성 단백질, 미코톡신 해독 단백질, 식물 성장 효소(예컨대, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 "RUBISCO"), 리폭시게나제(LOX), 및 포스포에놀피루베이트(PEP) 카르복실라제와 같이 농업 관련 단백질 또한 케토 아미노산 변형에 적합한 표적이다.
특정 실시양태에서, 핵산은 원하는 파지-디스플레이된 단백질 또는 이의 일부를 코딩한다. 전형적으로, 상기 핵산은 1개 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 10개 또는 그 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업자에게 잘 공지되어 있고 본 명세서의 "돌연변이유발 및 다른 분자생물학 기법"에 기재된 방법을 사용하여, 비천연 아미노산의 도입을 위한 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질에 대한 핵산은 1개 이상의 비천연 아미노산의 삽입을 위해 제공된 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킨다. 본 발명은 예를 들어, 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 단백질의 임의의 이러한 변이체, 예를 들어, 돌연변이체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 상응하는 핵산, 즉, 1개 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 1개 이상의 셀렉터 코돈을 가진 임의의 핵산을 포함한다.
당업자는 번역후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 단백질을 제조하기 위해, 오르소고날 tRNA/RS 쌍을 통해 비천연 아미노산을 생체내에서 도입하기에 적합한 숙주 세포 및 유기체를 사용할 수 있다. 숙주 세포는 오르소고날 tRNA 및 오르소고날 tRNA 합성효소를 발현하는 1개 이상의 벡터, 및 유도체화될 단백질을 코딩하는 벡터로 유전자적으로 개조된다(예컨대, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된다). 이 성분들 각각은 동일한 벡터 상에 존재할 수 있거나, 별도의 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 2개의 성분은 한 벡터 상에 존재하고 제3 성분은 제2 벡터 상에 존재할 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 네이키드 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다.
면역반응성에 의한 폴리펩티드의 정의
본 발명의 폴리펩티드가 다양한 새로운 폴리펩티드 서열(예컨대, 본원의 번역 시스템에서 합성된 단백질의 경우 비천연 아미노산, 또는 예를 들어 신규 합성효소의 경우 표준 아미노산의 신규 서열을 포함하는 폴리펩티드)을 제공하기 때문에, 상기 폴리펩티드는 예를 들어, 면역학적 분석에서 인식될 수 있는 새로운 구조적 특성도 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항혈청의 생성뿐만 아니라, 상기 항혈청에 결합하는 폴리펩티드는 본 발명의 한 특징이다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 실질적으로 면역글로불린 유전자(들)에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 피분석물(analyte)(항원)에 특이적으로 결합하여 인식하는 상기 폴리펩티드의 단편을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예로는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체 및 단쇄 항체 등이 있다. Fab 단편, 및 파지 디스플레이를 비롯한 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 비롯한 면역글로불린 단편 또한 본원에서 사용된 용어 "항체"에 포함된다. 예를 들어, 항체 구조 및 용어에 대해서는 문헌(Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York)을 참조한다.
면역분석에서 사용하기 위한 항혈청을 생성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이 1개 이상의 면역원성 폴리펩티드를 제조하고 정제한다. 예를 들어, 재조합 단백질은 재조합 세포에서 제조될 수 있다. 근친교배 마우스 종(이 마우스는 사실상 유전적으로 동일하기 때문에 결과가 더 재현가능하므로 본 분석에서 사용된다)을 표준 면역보강제(adjuvant)(예컨대, 프로이드(Freund's) 면역보강제) 및 표준 마우스 면역화 프로토콜과 함께 사용된 면역원성 단백질(들)로 면역화시킨다(예를 들어, 항체 제조, 면역분석 포맷, 및 구체적인 면역반응성을 측정하는 데 이용될 수 있는 조건에 대한 표준 설명을 위해서는 문헌(Harlow and Lane (1988) Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York)을 참조한다). 단백질, 항체, 항혈청 등에 대한 추가 상세한 설명은 국제특허공개공보 제WO 2004/094593호(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 제2002/085923호(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); 제WO 2004/035605호(발명의 명칭: "GLYCOPROTEIN SYNTHESIS") 및 제WO 2004/058946호(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS")에서 찾을 수 있다.
광조절 및 광케이징(photoregulation and photocaging)
본 발명은 번역후 변형되는 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드를 가진 파지를 제공한다. 번역후 변형은 임의의 원하는 잔기를 캡시드 융합 폴리펩티드에 부착시킬 수 있다(그 결과 상기 잔기를 파지 상에 부착시킬 수 있다). 일부 실시양태에서, 비천연 아미노산에 커플링된 접합 잔기는 광조절됨으로써 광조절된 변형 비천연 아미노산을 생성시킨다.
광조절된 아미노산(예를 들어, 광발색성, 광절단성, 광이성질체화성 등)은 예를 들어, 효소, 수용체, 이온 채널 등의 활성을 직접 조절함에 의해 또는 다양한 신호전달 분자의 세포 내 농도를 조절함에 의해 다양한 생물학적 과정을 공간적 및 시간적으로 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Shigeri et al., Pharmacol. Therapeut., 2001, 91:85; Curley, et al., Pharmacol. Therapeut., 1999, 82:347; Curley, et al., Curr. Op. Chem. Bio., 1999, 3:84; "Caged Compounds" Methods in Enzymology, Marriott, G., Ed, Academic Press, NY, 1998, V. 291; Adams, et al., Annu. Rev. Physiol., 1993, 55:755+; and Bochet, et al., J. Chem. Soc., Perkin 1, 2002, 125)을 참조한다. 본원의 다양한 실시양태에서, 본 조성물 및 방법은 광조절된 아미노산을 포함한다.
"광조절된 아미노산"은 전형적으로, 예를 들어, 감광성 아미노산이다. 일반적으로, 광조절된 아미노산은 광(예를 들어, UV, IR 등)에 의해 일정한 방식으로 조절되는 아미노산이다. 따라서, 예를 들어, 광조절된 아미노산이 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드 내로 도입되는 경우, 조광이 아미노산을 변경시킴으로써 상기 펩티드의 생물학적 활성을 변화시킬 수 있다. 일부 광조절된 아미노산은 "광케이징된 아미노산", "감광성 아미노산", "광불안정성 아미노산", "광이성질체화성 아미노산" 등을 포함할 수 있다. 케이징된 아미노산 또는 케이징된 펩티드와 같은 "케이징된 종"은 특정한 조광 시 방출되는 보다 큰 물질(예를 들어, 분자) 내에 포획되는 것들이다. 예를 들어, 문헌(Adams, et al., Annu. Rev. Physiol., 1993, 55:755-784)을 참조한다. 아미노산의 "케이징" 기는 분자, 예를 들어, 이러한 아미노산을 포함하는 펩티드에서 (예를 들어, 통상적으로 표적 분자와의 상호작용을 안정화시키는 결합을 파괴함으로써, 특정한 측쇄의 소수성 또는 이온 특성을 변화시킴으로써, 또는 입체 장애 등을 통해) 생물학적 활성을 억제하거나 감출 수 있다. "광이성질체화성" 아미노산은 광 노출에 의해 이성질체 형태로 전환될 수 있다. 이러한 아미노산의 상이한 이성질체는 도입된 경우 결과적으로 단백질 내의 다른 측쇄와 상이한 상호작용을 가질 수 있다. 따라서, 광조절된 아미노산은 이들이 존재하는 펩티드의 생물학적 활성을 (활성화, 부분적 활성화, 불활성화, 부분적 불활성화, 변경된 활성화 등을 통해) 조절할 수 있다. 광조절된 아미노산 및 분자의 추가 정의 및 예에 대해서는 이 단락 내에 기재된 상기 아담스(Adams) 및 다른 참고문헌을 참조한다.
다수의 광조절된 아미노산이 당업자에게 공지되어 있고, 대다수가 시판되고 있다. 광조절 잔기를 아미노산에 부착시키고/시키거나 결합시키는 방법도 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 광조절된 아미노산은 본원의 다양한 실시양태에 적용될 수 있다. 다수의 광조절된 아미노산뿐만 아니라 다수의 가능한 광조절 잔기, 예를 들어, 광케이징 기 등도 본원에 언급되어 있지만, 이러한 언급은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 구체적으로 언급되어 있지 않은 광조절 잔기 및 광조절된 아미노산에도 적용가능하다.
전술한 바와 같이, 다수의 방법이 경우에 따라 광조절된 아미노산을 생성시키는 데 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 광조절된 아미노산, 예를 들어, 광케이징된 아미노산은 그의 α-아미노 기를 BOC(부틸옥시카르보닐)와 같은 화합물로 보호하고 α-카르복실 기를 t-부틸 에스테르와 같은 화합물로 보호함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 보호 후, 아미노산 측쇄를, 2-니트로벤질클로로포르메이트, α-카르복시 2-니트로벤질 브로마이드 메틸 에스테르 또는 2-니트로벤질 디아조에탄과 같은 반응성 형태의 2-니트로벤질과 같은 광불안정성 케이징 기와 반응시킬 수 있다. 광불안정성 케이징 기가 부가된 후, 보호기는 표준 절차를 통해 제거될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,998,580호를 참조한다.
또 다른 예로서, 2-니트로벤질클로로포르메이트를 사용하여 라이신 잔기를 케이징하여 ε-라이신 아미노 기를 유도체화시킴으로써, 양 전하를 제거할 수 있다. 별법으로, α-카르복시 2-니트로벤질옥시카르보닐 케이징 기를 사용하여 음 전하를 (라이신을 가진) 펩티드 내로 도입함으로써 상기 라이신을 케이징할 수 있다. 추가로, 포스포아미노산 또는 포스포펩티드를 1-(2-니트로페닐)디아조에탄으로 처리함으로써 포스포세린 및 포스포쓰레오닌을 케이징할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Walker et al., Meth Enzymol. 172:288-301, 1989)을 참조한다. 다수의 다른 아미노산, 예를 들어, 세린, 쓰레오닌, 히스티딘, 글루타민, 아스파라진, 아스파르트산 및 글루탐산을 표준 케이징 화학반응에 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Wilcox et al., J. Org. Chem. 55:1585-1589, 1990)을 참조한다. 또한, 특정한 광조절된 (아미노산 및/또는 광조절된 형태로 전환될 수 있는 아미노산)의 인용이 반드시 본 발명을 한정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다는 것을 인식할 것이다.
아미노산 잔기는 다른 방식으로 광조절될 수 있다(예를 들어, 감광성 또는 광불안정성 상태로 될 수 있다). 예를 들어, 특정한 아미노산 잔기를 가진 펩티드 골격을 조사(irradiation)로 절단하여 특정한 아미노산 잔기를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 광불안정성 글리신인 2-니트로페닐 글리신은 이러한 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Davis, et al., 1973, J. Med. Chem., 16:1043-1045)을 참조한다. 2-니트로페닐글리신을 함유하는 펩티드의 조사는 2-니트로페닐글리신의 알파 탄소와 알파 아미노 기 사이의 펩티드 골격을 절단할 것이다. 이러한 절단 방법은 2-니트로벤질 기가 알파 탄소와 알파 아미노 기 사이에 삽입되는 경우 글리신 외의 아미노산에 일반적으로 적용될 수 있다.
다수의 광조절 기, 예를 들어, 케이징 기, 및 이러한 기를 아미노산과 같은 다른 분자에 공유결합시키는 데 사용되는 다수의 반응성 화합물은 당업계에 잘 공지되어 있다. 광조절(예를 들어, 광불안정성 케이징) 기의 예로는 O-니트로벤질-세린, O-(2-니트로벤질)-L-티로신, 니트로인돌린; N-아실-7-니트로인돌린; 펜아실; 히드록시펜아실; 브로모화 7-히드록시쿠마린-4-일메틸(예를 들어, Bhc); 벤조인 에스테르; 디메톡시벤조인; 메타-페놀; 2-니트로벤질; 1-(4,5-디메톡시-2-니트로페닐)에틸(DMNPE); 4,5-디메톡시-2-니트로벤질(DMNB); 알파-카르복시-2-니트로벤질(CNB); 1-(2-니트로페닐)에틸(NPE); 5-카르복시메톡시-2-니트로벤질(CMNB); (5-카르복시메톡시-2-니트로벤질)옥시)카르보닐; (4,5-디메톡시-2-니트로벤질)옥시)카르보닐; 데스옥시벤조이닐 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 본원의 참고문헌뿐만 아니라 미국특허 제5,635,608호(Haugland and Gee; June 3, 1997; 발명의 명칭: "α-carboxy caged compounds," Neuro 19, 465 (1997)); 및 문헌(J Physiol 508.3, 801 (1998); Proc Natl Acad Sci USA 1988 Sep, 85(17):6571-5; J Biol Chem 1997 Feb 14, 272(7):4172-8; Neuron 20, 619-624, 1998; Nature Genetics, vol. 28:2001:317-325; Nature, vol. 392,1998:936-941; Pan, P., and Bayley, H. "Caged cysteine and thiophosphoryl peptides" FEBS Letters 405:81-85 (1997); Pettit et al., (1997) "Chemical two-photon uncaging: a novel approach to mapping glutamate receptors" Neuron 19:465-471; Furuta et al., (1999) "Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: novel photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis" Proc. Natl. Acad. Sci. 96(4): 1193-1200; Zou et al. "Catalytic subunit of protein kinase A caged at the activating phosphothreonine" J. Amer. Chem. Soc. (2002) 124:8220-8229; Zou et al. "Caged Thiophosphotyrosine Peptides" Angew. Chem. Int. Ed. (2001) 40:3049-3051; Conrad II et al. "p-Hydroxyphenacyl Phototriggers: The reactive Excited State of Phosphate Photorelease" J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:9346-9347; Conrad II et al. "New Phototriggers 10: Extending the π,π* Absorption to Release Peptides in Biological Media" Org. Lett. (2000) 2:1545-1547; Givens et al. "A New Phototriggers 9: p-Hydroxyphenacyl as a C-Terminus Photoremovable Protecting Group for Oligopeptides" J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:2687-2697; Bishop et al. "40-Aminomethyl-2,20-bipyridyl-4-carboxylic Acid (Abe) and Related Derivatives: Novel Bipyridine Amino Acids for the Solid-Phase Incorporation of a Metal Coordination Site Within a Peptide Backbone" Tetrahedron (2000) 56:4629-4638; Ching et al. "Polymers As Surface-Based Tethers with Photolytic triggers Enabling Laser-Induced Release/Desorption of Covalently Bound Molecules" Bioconjugate Chemistry (1996) 7:525-8; BioProbes Handbook, 2002 from Molecular Probes, Inc.; and Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition or Web Edition, from Molecular Probes, Inc)을 참조한다. 다양한 분자의 케이징에 사용될 많은 화합물, 키트 등은 예를 들어, 몰레큘라 프로브스 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)사로부터 시판된다. 추가 설명은 예를 들어, 문헌(Merrifield, Science 232:341 (1986) and Corrie, J. E. T. and Trentham, D. R. (1993) In: Biological Applications of Photochemical Switches, ed., Morrison, H., John Wiley and Sons, Inc. New York, pp. 243-305)에서 찾을 수 있다. 적합한 감광성 케이징 기의 예로는 2-니트로벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀 및 펜아실이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 광조절(예를 들어, 케이징) 기는 경우에 따라 제2 결합 잔기에 결합할 수 있는 제1 결합 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 케이징된 포스포르아미다이트 [1-N-(4,4'-디메톡시트리틸)-5-(6-바이오틴아미도카프로아미도메틸)-1-(2-니트로페닐)-에틸]-2-시아노에틸-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미다이트(PC Biotin Phosphoramadite, from Glen Research Corp.)는 광불안정성 기 및 바이오틴(제1 결합 잔기)을 포함한다. 따라서, 제2 결합 잔기, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘은 케이징 기에 결합하여, 그의 용적 및 케이징에서의 그의 효과를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 케이징된 성분은 각각이 제1 결합 잔기를 포함하는 2개 이상의 케이징 기를 포함하고, 제2 결합 잔기는 2개 이상의 제1 결합 잔기에 동시에 결합할 수 있다. 예를 들어, 케이징된 성분은 2개 이상의 바이오티닐화 케이징 기를 포함할 수 있는데, 다수의 케이징된 성분 분자 상의 다수의 바이오틴 잔기와 스트렙타비딘의 결합은 케이징된 성분을 큰 네트워크로 연결한다. 바이오틴을 상기 성분에 부착시키는 광불안정성 기의 절단은 상기 네트워크의 분리를 초래한다.
(예를 들어, 펩티드 기질 및 단백질, 예컨대, 항체 또는 전사 인자를 비롯한) 케이징된 폴리펩티드를 생성시키는 전통적인 방법에는 예를 들어, 폴리펩티드를 케이징 화합물과 반응시키는 방법 및 폴리펩티드의 합성 동안 케이징된 아미노산을 도입시키는 방법이 포함된다. 예를 들어, 미국특허 제5,998,580호(Fay et al., December 7, 1999, 발명의 명칭: "Photosensitive caged macromolecules"), 및 문헌(Kossel et al., (2001) PNAS 98:14702-14707; Trends Plant Sci (1999) 4:330-334; PNAS (1998) 95:1568-1573; J. Am. Chem. Soc. (2002) 124:8220-8229; Pharmacology & Therapeutics (2001) 91:85-92; and Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2001) 40:3049-3051)을 참조한다. (예를 들어, 단백질 신호도입 도메인과 센서를 연결시키기 위한) 광불안정성 폴리펩티드 링커는 예를 들어, 미국특허 제5,998,580호에 기재된 것과 같은 광불안정성 아미노산을 포함할 수 있다.
광을 사용한 조사는 예를 들어, 펩티드의 활성에 중요한 아미노산의 측쇄 잔기를 방출할 수 있다. 추가로, 일부 실시양태에서, 언케이징(uncaged) 아미노산은 그 아미노산을 포함하는 펩티드의 펩티드 골격을 절단하여, 예를 들어, 환형 펩티드를 상이한 생물학적 활성을 가진 선형 펩티드로 개방시킬 수 있다.
케이징된 펩티드의 활성화는 광조절된 아미노산 상의 감광성 케이징 기를 파괴시킴으로써 당업자에게 공지된 임의의 표준 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 감광성 아미노산은 적절한 통상적인 광원 예컨대, (UV 범위 또는 적외선 범위 내에서 방출하는) 레이저에의 노출에 의해 언케이징되거나 활성화될 수 있다. 당업자는 본원에서 사용된 것과 같은 광조절된 아미노산의 사용에 적용될 수 있는 적절한 적용 프로토콜(예를 들어, 노출 지속 등)뿐만 아니라 적절한 파장 및 에너지를 가진 다수의 추가 레이저를 잘 알 것이다. 광조절된 케이징된 아미노산의 방출은 이러한 아미노산을 포함하는 펩티드의 조절을 허용한다. 이러한 조절은 위치의 관점 및 시간의 관점 둘다에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 초점이 맞춰진 레이저 노출은 한 위치에서 아미노산을 언케이징할 수 있는 반면, 다른 위치에서는 아미노산은 언케이징할 수 없다.
당업자는 광조절된 아미노산의 활성을 평가하는 데 이용될 수 있는 다양한 분석법, 예를 들어, 본원의 실시예에 기재된 분석법을 인식할 것이다. 광조절된 분자의 방출 후뿐만 아니라, 광조절된 아미노산을 포함하는 펩티드를 세포 또는 조직 내로 도입하기 전 및 후에, 예를 들어, 광범위한 세포 기능, 조직 기능 등을 분석할 수 있다.
본원의 조성물 및 방법은 다수의 측면에서 활용될 수 있다. 예를 들어, 광조절된 아미노산(예를 들어, 펩티드 내의 광조절된 아미노산)은 광조절된 아미노산의 방출 또는 활성화/탈활성화 등이 표적화된 광 노출 등을 통해 편재될 수 있기 때문에 치료 조성물을 신체의 상이한 위치로 전달할 수 있다. 본 발명의 방법, 구조 및 조성물은 광조절된 천연 아미노산(예를 들어, 그 자신에 부착된/결합된 광조절 잔기를 가진 아미노산)의 도입/사용에 적용될 수 있다는 것도 인식될 것이다.
광발색성 및 광절단성 기는 효소(예를 들어, 문헌(Westmark, et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115:3416-19 and Hohsaka, et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116:413-4) 참조), 수용체(예를 들어, 문헌(Bartels, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1971, 68:1820-3; Lester, et al., Nature 1977, 266:373-4: Cruz, et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122:8777-8; and, Pollitt, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1998, 37:2104-7) 참조), 또는 이온 채널(예를 들어, 문헌( Lien, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118:12222-3; Borisenko, et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122:6364-70; and, Banghart, et al., Nat. Neurosci. 2004, 7:1381-6) 참조)의 활성을 직접 조절하거나, 다양한 신호전달 분자의 세포 내 농도를 조절함으로써(예를 들어, 문헌(Adams, et al., Annu. Rev. Physiol. 1993, 55:755-84) 참조) 다양한 생물학적 과정을 공간적 및 시간적으로 조절하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 이는 아조벤젠 또는 니트로벤질 기와 같은 광반응성 리간드를 사용한 단백질 또는 소분자의 화학적 변형을 요구한다. 광반응성 아미노산을 살아있는 유기체 내의 소정의 부위에 있는 단백질 내로 직접 유전적으로 도입시키는 능력은 이 기법의 범위를 유의하게 확장할 것이다. 예를 들어, 문헌(Wu, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126:14306-7)을 참조한다.
키트
키트 또한 본 발명의 한 특징이다. 예를 들어, 번역후 변형되는 1개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드를 가진 파지를 제조하기 위한 키트는 본 발명의 한 특징이다. 예를 들어, 이러한 키트는 키트 성분들을 보유하기 위한 용기, 변형된 파지의 생성을 위한 설명서, 파지 게놈 물질을 포함하는 핵산, O-tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 비천연 아미노산 예를 들어, 아릴-아지드 아미노산(예를 들어, 파라-아지도-L-페닐알라닌) 또는 알키닐-아미노산(예를 들어, 파라-프로파르길옥시페닐알라닌), 비천연 아미노산의 번역후 변형을 위한 시약(예를 들어, 슈타우딩거 결찰 또는 [3 + 2] 시클로부가 반응용 시약), 및 0-tRNA/O-RS의 발현 및 파지의 생성에 적합한 이. 콜라이 숙주 세포 균주로부터 선택된 다양한 성분들을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지 본 발명을 한정하기 위해 제공되는 것이 아니다. 당업자는 청구된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있는 다양한 비-임계적 파라미터를 인식할 것이다.
실시예 1: 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 생성
본 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 생성을 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 전술한 바와 같이, 오르소고날 번역 성분들은 적절한 숙주 세포 내에서 임의의 상당수의 비천연 아미노산을 우수한 효율 및 높은 신뢰도로 생체내 단백질 내로 선별적으로 도입시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이 오르소고날 번역 성분 및 방법은 비천연 아미노산 구축 블록을 함유하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드 라이브러리의 생성에 대한 일반적인 방법으로서 파지 디스플레이 시스템에서 사용되기에 적합하도록 개조될 수 있다.
2개의 플라스미드 pDULE/CM 및 M13KE를 사용하여, M13 섬유상 파지의 pIII 단백질과의 융합체로서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 생성하였다. p15A로부터 유도된 플라스미드 pDULE/CM은 이. 콜라이 내에서 메타노코커스 잔나스키이 앰버 억제자 tRNATyr(MjtRNA) 및 돌연변이체 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소(MjTyrRS; 문헌(Chin et al., J. Am. Chem. Soc., (2002) 224:9026-9027)에 기재된 바와 같은 합성효소 변이체 클론 제7번; 도 2 및 서열 번호 10 참조)를 기본적으로 발현한다. 이 돌연변이체 MjTyrRS는 원하는 비천연 아미노산(예를 들어, 도 3에 나타낸 아미노산)으로 앰버 억제자 tRNA(예를 들어, 도 1에 나타낸 오르소고날 tRNA; 서열 번호 1)를 아미노아실화시킨다. 상응하는 비천연 아미노산의 존재 하에서의 이. 콜라이 Top10F' 보유 pDULE/CM(균주 TTS로 명명됨)의 생장은 앰버 코돈 TAG에 의해 특정된 부위에서 비천연 아미노산을 도입시킨다. 제2 플라스미드인 M13KE는 5가 N-말단 pIII 디스플레이용으로 사용된 파지 벡터이고, pIII 융합 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP)인 AGXTLLAHPQ(서열 번호 11)를 디스플레이하는 유도체인 pM13KE-SBP가 본 연구에서 사용되었다. N-말단 AG 서열은 신호 펩티드의 절단을 용이하게 한다. 앰버 넌센스 코돈 TAG에 의해 코딩되는 제3 잔기인 X는 도입될 비천연 아미노산을 표시한다. 비천연 아미노산의 존재 하에서의 이. 콜라이 균주 TTS에서 pIII 융합 단백질을 발현시키는 것은 pIII 융합체로서 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드를 디스플레이하는 생존가능한 파지를 제공해야 한다. 초기 파지 원액을 제조하기 위해, 잔기 X에서 글루타민을 도입시키는 천연 앰버 억제 균주인 이. 콜라이 균주 XL1-Blue 내로 플라스미드 pM13KE-SBP를 형질도입하였다.
비천연 아미노산의 존재에 대한 파지 플라크 형성의 의존성을 조사하기 위해, M13KE-SBP 파지 및 M13KE 야생형 파지를 2 mM p-아세틸페닐알라닌(3)의 존재 및 부재 하에 이. 콜라이 균주 TTS/RS(3) 세포 층(이때, RS(3)는 도 3에서 화학식 3으로 나타내는 p-아세틸페닐알라닌에 특이적인 아미노아실 tRNA 합성효소를 나타낸다) 상에 도말하였다. 비천연 아미노산의 존재 하에, M13KE-SBP 파지 및 M13KE 야생형 파지는 37℃에서 밤새 항온처리한 후 정상적인 크기의 플라크를 형성하였다. 그러나, 비천연 아미노산의 부재 하에, M13KE 야생형 파지만이 플라크를 형성하였다. 플라크 형성은 p-아세틸-페닐알라닌의 부재 하에 M13KE-SBP 파지에 대해 관찰될 수 있었다. 천연 글루타미닐 앰버 억제자 균주인 XL1-블루에서의 M13KE-SBP 파지 수율은 배양액 1 ㎖ 당 2 x 1011 플라크-형성 유니트(PFU/㎖)이었다. 2 mM p-아세틸페닐알라닌(3)의 존재 하에 이. 콜라이 TTS/RS(3)에서의 M13KE-SBP 파지의 수율은 XL1-Blue에서 생성된 수율에 필적할만하고 p-아세틸페닐알라닌(3)의 존재에 의존한다. 이 비천연 아미노산의 존재 하에, 파지 수율은 1.8 x 1011 PFU/㎖이고, 비천연 아미노산의 부재 하에, 파지 수율은 81배까지 감소되었다(도 4 참조). 대규모 파지 제조에 있어서, 1000배 이상의 수율 차이가 관찰되었다. 파지 수율 실험은 5종의 상이한 비천연 아미노산을 도입시키는 5종의 이. 콜라이 TTS/RS 세포주를 사용하여 수행하였다. 이들은 O-메틸티로신(1), p-아지도페닐알라닌(2), p-아세틸페닐알라닌(3), p-벤조일페닐알라닌(4) 및 3-(2-나프틸)알라닌(5)이었다(도 3 참조). 파지 수율에 있어서 비천연 아미노산의 존재에 대한 유사한 의존성이 각각의 시스템에서 관찰되었는데(도 4 참조), 이는 이 파지-디스플레이 기법이 상당수의 비천연 아미노산에 대해 일반적일 것임을 나타낸다.
실시예 2: 플라스미드 구축
본 실시예는 이. 콜라이 숙주 세포에서 오르소고날 tRNA 및 오르소고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 발현하는 데 사용된 플라스미드의 구축을 기술한다.
플라스미드 pDULE/CM의 구축
앰피실린 내성 마커를 가진 플라스미드 pDULE를 BsmI으로 절단하고 멍 빈 뉴클레아제(Mung Bean nuclease)로 처리하여 블런트 말단을 생성하였다. 생성된 DNA를 ClaI으로 절단하고 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 하기 프라이머를 사용한 PCR로 플라스미드 pACYC184(NEB)로부터 증폭시켰다:
프라이머 서열 서열 번호
FT18 5'-GACAGCTTATCATCGATGAGACGTTGATCGGCACGTAAG 12
FT19 5'-GGTTGGTTTGCGCATTCAGCGCTAACCGTTTTTATCAGGC 13
PCR 생성물을 ClaI으로 절단하고 pDULE와 결찰시켜 pDULE/CM을 생성하였다. 플라스미드 pDULE/CM을 Top10F'(Invitrogen) 내로 형질전환시켜 TTS 세포주를 생성하였다.
pM13KE-SBP 플라스미드의 구축
연장 프라이머 FT121 (5'-CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTC (서열 번호 14)) 및 주형 FT126 (5'-CATGTTTCGGCCGAGCCCCCACCCTGCGGATGAGCCAGCAAAGTCTAGCCGGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG (서열 번호 15))을 사용하여 스트렙타비딘 결합 펩티드 pIII 융합체를 제조하고, EagI 및 Acc65I으로 절단하였다. T4 리가제를 사용하여 상기 단편을 플라스미드 pM13KE(New England BioLabs)의 EagI 부위와 Acc65I 부위 사이에 삽입함으로써 pM13KE-SBP를 생성시켰다. 결찰 생성물을 XL1-Blue 내로 형질전환시키고, 20 ㎍/㎖ IPTG 및 20 ㎍/㎖ XGal의 존재 하에 XL1-Blue 세포 층을 가진 LB 플레이트 상에 도말하여 청색 파지 플라크를 생성시켰다.
실시예 3: 파지 배양 및 파지 역가 측정 프로토콜
본 실시예는 본원에 사용된 파지 배양 및 역가 측정의 일반적 방법을 기술한다.
이. 콜라이 XL1-Blue에서의 일반적인 파지 제조 프로토콜
단일 파지 플라크를 미드-로그(mid-log) 이. 콜라이 균주 XL1-Blue 및 12 ㎍/㎖의 테트라시클린을 함유하는 10 ㎖의 2 x YT에 첨가하였다. 37℃에서 5시간 동안 항온처리한 후, 배양액을 4℃ 및 6000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 20% 부피의 PEG 완충제(20% PEG 8000, 2.5 M NaCl)를 사용하여 파지를 상청액으로부터 침전시켰다. 혼합물을 4℃에서 밤새 저장하고 4℃ 및 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 파지 펠릿을 500 ㎕의 1 x PBS(pH 7.4) 중에 용해시키고, 4℃ 및 20,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여, 남은 세포 데브리스(debris)를 제거하고, 4℃에서 저장하였다.
이. 콜라이 TTS에서의 일반적인 파지 제조 프로토콜
단일 파지 플라크를 미드-로그 TTS, 12 ㎍/㎖의 테트라시클린, 34 ㎍/㎖의 클로람페니콜 및 2 mM의 적절한 비천연 아미노산을 함유하는 10 ㎖의 2 x YT에 첨가하였다. 프로토콜의 나머지는 이. 콜라이 XL1-Blue에서의 일반적인 파지 제조 프로토콜과 동일하다.
일반적인 플라크 형성 및 파지 역가 실험
마이크로타이터 플레이트에서의 연속적인 10배 희석 후, 20 ㎍/㎖ IPTG, 20 ㎍/㎖ XGal, 12 ㎍/㎖ 테트라시클린, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜 및 2 mM의 상응하는 비천연 아미노산으로 보충된 TTS/RS(3) 세포 층을 가진 LB 아가 플레이트 상에 5 ㎕의 M13KE 야생형 및 M13KE-SBP 파지 둘다를 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다.
파지 역가
마이크로타이터 플레이트에서의 연속적인 10배 희석 후, 20 ㎍/㎖ IPTG, 20 ㎍/㎖ XGal 및 12 ㎍/㎖ 테트라시클린으로 보충된 XL1-Blue 세포 층을 가진 LB 아가 플레이트 상에 5 ㎕의 파지를 도말하였다.
실시예 4: [3 + 2] 시클로부가 반응을 사용한, p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지 디스플레이된 폴리펩티드의 공유 접합
본 실시예는 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 공유 변형을 기술한다. 이 공유 변형은 [3 + 2] 시클로부가 반응을 사용하여 알킨-함유 잔기를 p-아지도-L-페닐알라닌에 접합시킴으로써, 폴리펩티드와 알킨-함유 잔기 사이에 트리아졸 결합을 생성시킨다. 도 15는 [3 + 2] 시클로부가 반응의 일반적인 화학반응을 제공한다.
M13KE-SBP 파지는 2 mM p-아지도페닐알라닌(2)의 존재 하에 이. 콜라이 TTS/RS(2)에서 생성되었다. 그 후, 생성된 파지는 고도로 특이적인 아지드-알킨 [3 + 2] 시클로부가(Rostovtsev et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2002) 41:2596-2599)에 의해 도 5의 화학식 6(Deiters et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125:11782-11783)에 나타낸 알킨-유도체화 플루오레세인과 접합되었다. XL1-Blue에서 제조된 파지는 음성 대조군으로서 사용되었다.
구체적으로, 파지와 알킨-유도체화 플루오레세인 염료(6) 사이의 시클로부가 접합 반응은 다음과 같이 수행되었다. 원액(50 ㎕, 약 1011 PFU)으로부터의 파지를 PEG로 침전시키고, 90 ㎕의 100 μM 인산칼륨 완충제(PB, pH 8.0) 중에 용해시켰다. 파지 용액을 5 ㎕의 tert-부탄올, 2 mM의 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP), 2 mM의 트리스(트리아졸릴)아민 리간드, 2 mM의 플루오레세인 염료(6) 및 1 mM의 CuSO4로 보충시켰다. 최종 반응 부피는 100 ㎕이었다. 트리스(트리아졸릴)아민 리간드의 첨가 시, 파지가 침전되었다. 반응 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 항온처리하고 20,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 파지는 보고된 조건[보조용매로서 5% tert-부틸 알코올을 함유하는 인산칼륨 완충제(PB)(pH 8.0) 중의 2 mM 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP), 2 mM 트리스-(트리아졸릴)아민 리간드, 2 mM 플루오레세인 염료(6) 및 1 mM CuSO4] 하에서 완전히 침전되었다(문헌(Wang et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125:3192-3193) 참조). TCEP를 Cu 와이어로 대체하였을 경우 전혀 개선이 없었다. 희석된 시약(PB 완충제(pH 8.0) 중의 0.1 mM TCEP, 0.2 mM 리간드, 0.2 mM 플루오레세인 염료(6) 및 0.1 mM CuSO4)을 사용하였을 때 침전이 최소화되었다, 문헌(Link and Tirrell, J. Am. Chem. Soc. (2003) 125:11164-11165)을 참조한다.
접합 후, 반응 혼합물을 투석하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다(도 6 참조). 웨스턴 블롯 분석은 분리된 단백질 종의 본질을 확인하기 위해 항-플루오레세인(파트 I) 및 항-pIII(파트 II) 일차 항체 둘다를 사용하였다. 구체적으로, 전단계 시클로부가 반응으로부터의 침전물 및 농축된 상청액 둘다를 4 내지 20% SDS-PAGE 겔(Invitrogen)로 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다(반건 조 20 V, 20분). 상기 막을 4℃에서 1 x PBS 중의 5% 탈지유로 밤새 블로킹하고, 실온에서 항-플루오레세인 토끼 IgG(Molecular Probes)의 1/1000 희석물과 함께 2시간 동안 항온처리하였다. 막을 세척한 후, 항-토끼 마우스 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체(Sigma)의 1/10,000 희석물로 프로빙하였다. 막을 PBST(PBS, 0.5% Tween-20)로 6회 세척하고, ECF(Amersham Biosciences)로 현상하고 포스포르 이미저(phosphor imager)를 사용하여 스캐닝하였다. 항-pIII 웨스턴 분석도 수행하였는데, 이때 항-pIII 마우스 IgG(MoBiTec)가 일차 항체로서 사용되었다. 항-마우스 AP 접합체는 제2 항체로 사용되었다.
이 블롯의 현상(도 6, 파트 I 참조)은 플루오레세인 접합체가 XL-1 Blue 이. 콜라이에서 생성된 파지(레인 b)와 반대로 2 mM p-아지도페닐알라닌(2)으로 보충된 TTS/RS(2)에서 생성된 파지의 경우(레인 a)에서만 단일 밴드로서 검출된다는 것을 보여주었다. 이 밴드의 본질은 항-pIII 웨스턴 블롯 분석에 의해 pIII 소수 코트 단백질로서 추가로 확인되었다(파트 II). 이 결과는 비천연 아미노산이 비천연 파지의 pIII 코트 단백질 내로 특이적으로 도입된다는 것을 입증한다.
실시예 5: 비천연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 생물학적 활성의 보존
본 실시예는 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP) 융합체의 생물학적 활성의 보존을 기술한다. 스트렙타비딘 결합 활성은 파지 제제 중에서 분석되었다.
pIII 단백질의 N-말단 상에 제시되는 돌연변이체 스트렙타비딘 결합 펩티드 가 기능성을 가진다는 것을 입증하기 위해, 파지-결합 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하였다. 이 시스템은 2 mM p-아지도페닐알라닌(2) 또는 p-아세틸페닐알라닌(3) 각각으로 보충된 TTS/RS(2) 및 TTS/RS(3) 세포에서 제조된 M13KE-SBP 파지를 사용하였다(도 7에 나타낸 데이타, 및 도 8에 나타낸 상응하는 그래프 참조). XL1-Blue에서 제조된 M13KE-SBP 파지는 양성 대조군으로서 사용된 반면, 야생형 M13KE 파지는 음성 대조군으로서 사용되었다.
이 분석에서, 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(Pierce)를 4℃에서 1 x PBS 중의 4% BSA, 또는 10 ㎛ 바이오틴을 함유하는 1 x PBS 중의 4% BSA로 밤새 블로킹하였다. 세척 후, 100 ㎕의 M13KE 파지(1011 PFU), 이. 콜라이 XL1-Blue에서 제조한 M13KE-SBP 파지, 또는 2 mM의 상응하는 비천연 아미노산을 사용하여 TTS/RS(2) 또는 TTS/RS(3)에서 제조한 M13KE-SBP 파지를 4배 연속 희석하면서 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 항온처리한 후, 웰을 200 ㎕의 PBST로 3회 세척하고, 항-M13 HRP 접합체(mersham Biosciences)의 1/10,000 희석물과 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 200 ㎕의 PBST로 10회 세척한 후, 웰을 안정한 퍼록시다제 완충제(Pierce) 중의 100 ㎕ OPD 기질로 현상하였다. 100 ㎕의 2.5 N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결하였다. 각 웰의 OD492nm를 플레이트 판독기로 기록하였다(도 7 참조). 도 7에 나타낸 표에서 각 점의 값은 3회 실험의 평균이다. 오차는 10% 미만이다.
이 데이타는 도 8에 그래프로 나타나 있다. 이 도면은 TTS/p-아지도페닐알라 닌(2) 및 TTS/p-아세틸페닐알라닌(3)에서 제조된 M13KE-SBP 파지가 XL1-Blue에서 제조된 양성 대조군 파지보다 훨씬 더 강하게 스트렙타비딘에 결합한다는 것을 보여준다. 관찰된 친화성에서의 이러한 증가는 비천연 아미노산을 함유하는 디스플레이된 펩티드의 증가된 결합 친화성 또는 단백질분해 안정성으로부터 기인한 것일 수 있다.
모델 파지 선별 실험에서, 야생형 파지 및 p-아지도-L-페닐알라닌을 가진 돌연변이체 SBP를 수반하는 파지를 스트렙타비딘으로 코팅된 웰에 노출시킨 후, 결합된 파지를 회수하였다. 용출 후 회수된 농축 파지의 역가를 스트렙타비딘에 대한 파지의 결합 특이성의 척도로서 사용하였다.
구체적으로, 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(Pierce)로부터의 2개의 웰을 4℃에서 1 x PBS 중의 4% BSA 300 ㎕로 밤새 블로킹하였다. 세척 후, 스트렙타비딘으로 코팅된 개개의 웰을 유사한 수의 TTS/RS(3)에서 제조된 M13KE-SBP 또는 M13KE 야생형 파지(각각 100 ㎕)와 함께 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 200 ㎕ PBST로 10회 세척하였다. 결합된 파지를 10 μM 바이오틴 1 x PBS(pH 7.4)를 사용하여 플레이트 고체 지지체로부터 용출시켰다. 투입 및 수확 파지의 역가를 측정하였다(도 9 참조).
TTS/RS(3)에서 제조된 M13KE-SBP 파지의 회수율은 M13KE 야생형 파지의 회수율의 9 x 103배이다(도 9 참조). 이 실험 결과는 돌연변이체 SBP가 파지 상에 디스플레이되고 기능성을 가진다(즉, 스트렙타비딘에 특이적으로 결합하는 능력을 보유 한다)는 것을 보여준다.
비천연 아미노산을 포함하기 위한 파지 디스플레이의 일반화는 파지 디스플레이 기술의 범위를 유의하게 증가시킬 것이다. 예를 들어, 파지-디스플레이된 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입은 증가된 결합 친화성 및 특이성, 입체구조적으로 구속된 골격 및 측쇄, 및 상승된 단백질분해 안정성을 이끌어낼 수 있다. 비천연 아미노산은 오판(orphan) 리간드 또는 수용체의 확인을 위한 광친화성 표지뿐만 아니라 비펩티드성 분자의 접합에 대한 반응성 부위를 제공할 수 있다. 최종적으로, 이 방법은 리보좀 및 효소 디스플레이와 같은 다른 디스플레이 포맷에도 적용될 수 있다.
실시예 6: 슈타우딩거 결찰 반응을 사용한 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적 공유 변형
본 실시예는 슈타우딩거 결찰 반응을 사용한, p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적 공유 변형을 기술한다. 본 실시예는 도 10에 나타낸 바와 같이, 슈타우딩거 반응에 대한 기질로서 실시예 1에 기재된 파지-디스플레이된 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP)/pIII 융합 단백질을 사용하였다.
실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이, 스트렙타비딘 결합 펩티드(SBP)인 AGXTLLAHPQ(서열 번호 11)가 M13 섬유상 파지의 pIII 단백질과의 융합체로서 5가로 디스플레이되는 파지 디스플레이 시스템을 생성하였다. N-말단 AG 서열은 신호 펩티드의 절단을 용이하게 하고, 앰버 넌센스 코돈 TAG에 의해 코딩된 제3 잔기인 X 는 도입될 비천연 아미노산을 표시한다. 파지 Ph-Az(잔기 X에서 p-아지도-L-페닐알라닌(2)을 가진 SBP를 코딩함)는 우수한 효율 및 높은 신뢰도로 2 mM p-아지도-L-페닐알라닌(2)의 존재 하에 이. 콜라이 균주 TTS/RS에서 제조되었다. 이. 콜라이 TTS/RS는 메타노코커스 잔나스키이 돌연변이체 앰버 억제자 tRNATyr CUA(mutRNATyr CUA), 및 mutRNATyr CUA를 p-아지도-L-페닐알라닌(2)으로 특이적으로 충전시키는 돌연변이체 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소(MjTyrRS)를 기본적으로 발현시키는 플라스미드를 함유한다. 음성 대조군으로서, 또 다른 SBP-디스플레이된 파지(Ph-Q)는 잔기 X에서 글루타민을 도입시키는 천연 앰버 억제 균주인 이. 콜라이 XL1-Blue에서 제조되었다.
이 파지 시스템을 사용하여, 선별적 슈타우딩거 변형에 대한 기질로서 비천연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌(2)을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 사용가능성을 조사하였다. 플루오레세인-유도 포스핀(7 및 8)(도 10의 화학식 참조)을 슈타우딩거 결찰 반응에 사용하였는데, 이는 상기 포스핀이 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
화합물(7)은 공개된 절차에 따라 합성되었다(Saxon and Bertozzi, Science 2000, 287, 2007-2010; Wang et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 697-701). 화합물(8)은 주위 온도에서 무수 DMF(1 ㎖) 중의 디시클로헥실카르보디이미드(62 mg, 0.3 mmol)의 존재 하에 2-(디페닐포스피노)페놀(74 mg, 0.27 mmol)(문헌(Suarez et al., Organometallics 2002, 21, 4611-4621) 참조)을 5(6)-카르복시플루오레세인(100 mg, 0.27 mmol)과 12시간 동안 커플링 반응시켜 제조하고, 분취형 TLC를 이용하여 적색 분말(3 mg, 2%)로서 정제하였다; HRMS(ESI-TOF): C39H24O7P1[M-1]- 계산치: 635.1265; 실측치: 635.1248.
도 10에 나타낸 반응식에 따라, 포스핀(7)을 파지 Ph-Az와 반응시켜 아자-일리드 중간체를 형성한 후(Staudinger and Meyer, Helv. Chem. Acta 1919, 2, 635-646), 분자내 고리화를 수행하여(Saxon and Bertozzi, Science 2000, 287, 2007-2010), 궁극적으로 플루오레세인으로 표지된 파지 생성물을 수득하였다. 개재된 트리페닐포스핀 옥사이드 기가 없는 플루오레세인-표지 파지를 수득하기 위해서는, Ph-Az와 포스핀(8)을 유사한 반응 기작으로 무흔적(traceless) 슈타우딩거 결찰을 수행하여 접합시켜야 한다.
파지 분자와 포스핀(7 및 8) 사이의 접합 반응은 10 mM 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 중의 약 1011 파지 입자 및 0.01 mM 포스핀을 사용하여 파지 Ph-Az와 트리페닐포스핀(7 및 8) 사이에서 수행하였고; 유사한 반응을 음성 대조군으로서 파지 Ph-Q를 사용하여 수행하였다. 각 포스핀 반응물의 원액(0.5 mM)을 DMF 중에서 제조하고, 반응 완충제로 0.01 mM의 최종 농도 및 총 부피 50 ㎕까지 희석하였다. 결찰 반응은 주위 온도에서 16시간 동안 진탕하면서 수행하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 PBS에 대해 투석한 후 분석하였다.
결찰 반응 생성물을 실시예 4에 기재된 프로토콜을 이용하여 웨스턴 블롯팅 으로 분석하였다(도 11 참조). Ph-Az와 포스핀(7 또는 8)의 결찰로부터 얻은 플루오레세인 접합체는 항-플루오레세인 일차 항체를 사용한 경우에만 단일 밴드로서 관찰되었고(레인 1 내지 4), Ph-Q를 사용한 대조군 반응의 경우에는 관찰되지 않았다. 이 밴드는 분석(레인 5 내지 8)에서 항-pIII 항체를 사용함으로써 pIII 소수 코트 단백질로서 추가로 확인되었다. 이 결과는 포스핀(7 또는 8)과 아지드 함유 파지 펩티드 사이의 고도의 선별성을 분명히 보여준다.
실시예 7: 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적 슈타우딩거 변형 후 파지 생존력의 보존
본 실시예는 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 선별적 슈타우딩거 변형 후 파지 생존력의 보존을 기술한다.
슈타우딩거 커플링 반응이 감염성 파지 입자의 손실을 초래하지 않는다는 것을 보여주기 위해, 포스핀(7 또는 8)을 사용한 슈타우딩거 결찰 전 및 후에 파지 Ph-Az의 역가를 측정함으로써 파지 생존력을 측정하였다. 슈타우딩거 반응 혼합물로부터의 생존가능한 파지 입자의 관찰된 수는 포스핀(7 또는 8)을 함유하지 않은 대조군 용액으로부터 측정된 (2.5 ± 1) x 1011 플라크-형성 유니트/㎖(PFU/㎖)에 비해 (1.7 ± 1) x 1011 PFU/㎖이었다.
실시예 8: 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 슈타우딩거 변형 후 파지 선별
본 실시예는 파지-디스플레이된 폴리펩티드의 슈타우딩거 변형 후 파지의 선별을 기술한다. 이 선별은 슈타우딩거 변형이 성공적인 경우에만 존재하는, 접합된 포스핀(7)을 포함하는 파지를 보유하기 위해 고정화된 항-플루오레세인 항체를 사용하였다. 파지 역가 측정 또한 파지 생존력을 보여주었다.
모델 파지 선별/농축 실험에서, 포스핀(7)과 Ph-Az 및 Ph-Q의 상기 슈타우딩거 결찰로부터 제조된 유사한 수의 파지 입자를 항-플루오레세인 항체로 미리 코팅한 개개의 웰 내에서 항온처리하였다. 반복적인 세척 후, 결합된 파지를 0.05% BSA-FITC 접합체로 용출시키고 역가를 측정하였다.
보다 구체적으로, 수성 Na2CO3(0.1 M, pH 9.6) 중의 항-플루오레세인 항체(20 ㎍/㎖, 250 ㎕/웰)를 37℃에서 면역-플레이트(Fisher)의 8개 웰 상에 4시간 동안 코팅하였다. 웰을 세척하고(3 x 0.9% NaCl-0.05% Tween 20), 4℃에서 BSA(0.5%)로 밤새 블로킹한 후, 결찰 반응으로부터 얻은 파지(100 ㎕) 또는 대조군 용액과 함께 실온에서 5시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, BSA-FITC 접합체(0.05%)를 사용하여 파지를 플레이트로부터 용출하였다. 회수된 파지의 역가를 측정하였다.
투입 파지의 역가는 다음과 같다: Ph-Az: 1.0 x 109 PFU; 및 Ph-Q: 2.O x 1O9 PFU. 수확 파지의 역가는 다음과 같다: Ph-Az: 1.2 x 1O6 PFU; 및 Ph-Q: 1.O x 1O4 PFU. Ph-Az와 포스핀(7)의 결찰로부터 유도된 플루오레세인 표지 파지의 회수율(0.12%)은 Ph-Q로부터 유도된 대조군 파지의 회수율(0.001%)보다 120배 더 높다.
실시예 7 및 8로부터 얻은 결과는 슈타우딩거 결찰 반응이 파지 생존력에 유 의한 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 파지 Ph-Az가 말단 알킨 기 및 구리 촉매를 사용한 [3 + 2] 시클로부가에서 반응 조건에 노출된 후 생존불가능하다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 문헌(Rostovtsev et al., Angew. Chem. 2002, 114, 2708-2711; and Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596- 2599)을 참조한다. 구리 촉매가 생존력 손실의 주원인이라는 것이 밝혀졌으나, 투석 단계 동안 고농도의 EDTA의 첨가는 파지 생존력을 특별히 개선하지 못하였다.
실시예 9: 슈타우딩거 변형 반응 생성물의 특징규명
슈타우딩거 결찰 생성물의 특징을 더 규명하고 접합 효율을 측정하기 위해, 잔기 7에서 p-아지도-L-페닐알라닌(2)을 함유하는 대표적인 Z-도메인 단백질(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2003, 100, 56-61)을, mutRNATyr CUA(서열 번호 1), 및 tRNA를 p-아지도-L-페닐알라닌(2)으로 선별적으로 충전시키는 돌연변이체 MjTyrRS(도 1, 서열 번호 4 참조)를 사용하여 이. 콜라이 균주에서 발현시켰다(문헌(Wang et al., Science 2001, 292, 498-500; Wang and Schultz, Angew. Chem. 2005, 117, 34-68; Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34-66; and Chin et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9026-9027) 참조). Z-도메인 폴리펩티드의 발현에 대한 일반적인 추가 설명은 문헌(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 2003, 100, 56-61)에서 찾을 수 있다. 이 아지드-함유 Z-도메인을 정제하여 포스핀(7 또는 8)과 접합시켰다.
이 접합 반응을 위해, 각 포스핀 반응물의 원액(10 mM)을 DMF 중에서 제조하 고, 돌연변이체 Z-도메인 단백질(0.1 mM)을 함유하는 반응 완충제로 최종 농도 1 mM 및 총 부피 10 ㎕까지 희석하였다. 결찰 반응은 16시간 동안 진탕하면서 주위 온도에서 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 중에서 수행하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼에 통과시키고, 물로 용출하고, 투석하고 MALDI-TOF 분광계로 분석하였다.
접합된 잔기로서 포스핀(7)을 사용한 경우 관찰된 스펙트럼의 주요 피크는 예측된 슈타우딩거 결찰 생성물과 일치한다(도 12 참조). 피크 A는 슈타우딩거 결찰 생성물로 배정되었다: C386H556N107O119S1P1, 계산치: 8662; 실측치: 8664. 피크 B는 고전적 슈타우딩거 반응을 통한 환원 생성물로 배정된다: C344H529N105O110S1, 계산치: 7928; 실측치: 7928. A 및 B에 상응하는 소수 피크 a1 및 b1은 첫 번째 메티오닌이 없는 돌연변이체 Z-도메인 단백질로부터 유도된 생성물로 배정된다. A 및 B에 상응하는 소수 피크 a2 및 b2는 매트릭스 부가물로부터 유래된 것이다. 아지드-함유 Z-도메인은 전혀 관찰할 수 없었는데(<1%), 이는 반응이 고 수율로 진행된다는 것을 나타낸다. 포스핀(7)의 슈타우딩거 결찰의 경우, 접합 효율은 MALDI-TOF 스펙트럼에서 피크의 삽입 비를 기준으로 >90%인 것으로 평가된다.
도 13은 돌연변이체 Z-도메인 단백질과 포스핀(8)의 슈타우딩거 결찰로부터의 반응 생성물의 MALDI-TOF 분석을 보여준다. 피크 C는 무흔적 슈타우딩거 결찰 생성물로 배정된다: C365H539N105O116S1, 계산치: 8286; 실측치: 8286. 피크 D는 고전적 슈타우딩거 반응을 통한 환원 생성물로 배정된다: C344H529N105O110S1, 계산치: 7928; 실측치: 7928. 피크 E는 아자-일리드 중간체로 배정된다: C383H552N105O117S1P1, 계산치: 8562; 실측치: 8563. C, D 및 E에 상응하는 소수 피크 c1, d1 및 e1은 첫 번째 메티오닌이 없는 돌연변이체 Z-도메인 단백질로부터 유도된 생성물로 배정된다. C 및 D에 상응하는 소수 피크 c2 및 d2는 매트릭스 부가물로부터 유래된 것이다.
포스핀(7)의 슈타우딩거 결찰과 대조적으로, 포스핀(8)의 무흔적 슈타우딩거 결찰은 ~50%의 낮은 수율을 제공하였다. 포스핀(8)의 보다 낮은 접합 효율은 아마도 세포내 고리화 단계에서의 보다 느린 결찰 속도(Saxon and Bertozzi, Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143), 및 포스핀(8)에서의 페놀 에스테르의 가수분해의 용이성 때문일 수 있다. 이는 고전적 슈타우딩거 반응(Saxon and Bertozzi, Science 2000, 287, 2007-2010; and Staudinger and Meyer, Helv. Chem. Acta 1919, 2, 635-646)에서와 같이 아민 생성물을 초래할 것이다.
진정한 물질을 사용한 도핑 실험은 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 돌연변이체가 안정하다는 것을 입증하였다. 도 14는 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 단백질과 포스핀(7)의 슈타우딩거 결찰, 및 필적하는 양의 진정한 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 Z-도메인 돌연변이체를 사용한 도핑으로부터 얻은 반응 생성물의 MALDI-TOF 분석을 제공한다.
요약하건대, 본원은 플루오레세인-부착 포스핀과 p-아지도-L-페닐알라닌(2) 함유 파지-디스플레이된 펩티드 또는 돌연변이체 Z-도메인 단백질 사이의 모델 슈 타우딩거 결찰이 우수한 선별성 및 효율로 일어난다는 것을 밝혔다. 상기 슈타우딩거 결찰은 결찰이 완료된 후 농축이 어려움 없이 수행될 수 있도록 파지 생존력에 영향을 주지 않는다. 이 작업은 단백질의 기능을 변경시키지 않으면서 단백질을 선별적으로 변형시키기에 유용한 방법을 제공하고, 고도로 균질한 PEG화된 단백질, 표면에 고정화된 단백질, 또는 분광학적 또는 친화성 시약으로 변형시킨 단백질의 생성에 유용할 것이다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 설명을 위한 것일 뿐이고, 이들의 다양한 변형 및 변경은 당업자에게 시사될 것이고 본원의 기술적 사상 및 범위 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
상기 본 발명이 명료함 및 이해를 목적으로 다소 상세히 기재되어 있지만, 형태 및 세부사항에서의 다양한 변경이 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다는 것은 본 개시내용을 읽은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기법 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 모든 문헌, 특허, 특허출원, 및/또는 본원에서 인용된 다른 문헌은 마치 개개의 문헌, 특허, 특허출원 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참고로 도입되는 것으로 개별적으로 기재되는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 완전히 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Tsao, Meng-Lin Tian, Feng Schultz, Peter <120> SELECTIVE POSTTRANSLATIONAL MODIFICATION OF PHAGE-DISPLAYED POLYPEPTIDES <130> 54-001620US <140> US 11/580,223 <141> 2006-10-11 <150> US 60/726,137 <151> 2005-10-12 <150> US 60/737,622 <151> 2005-11-16 <160> 15 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant Methanococcus jannaschii suppressor tyrosyl-tRNA-CUA <400> 1 ccggcgguag uucagcaggg cagaacggcg gacucuaaau ccgcauggcg cugguucaaa 60 uccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 2 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr 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ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p-azido-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase clone-1 amino acid sequence (derived from wild-type Methanococcus jannaschii tyrosyl tRNA-synthetase) <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 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acid sequence (derived from wild-type Methanococcus jannaschii tyrosyl tRNA-synthetase) <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 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Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p-azido-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase clone-7 amino acid sequence (derived from wild-type Methanococcus jannaschii tyrosyl tRNA-synthetase) <400> 10 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gln Ile His 145 150 155 160 Ser Ser Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pIII fusion streptavidin binding peptide (SBP) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is an unnatural amino acid <400> 11 Ala Gly Xaa Thr Leu Leu Ala His Pro Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT18 PCR primer <400> 12 gacagcttat catcgatgag acgttgatcg gcacgtaag 39 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT19 PCR primer <400> 13 ggttggtttg cgcattcagc gctaaccgtt tttatcaggc 40 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT121 primer <400> 14 catgcccggg tacctttcta ttctc 25 <210> 15 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FT126 template <400> 15 catgtttcgg ccgagccccc accctgcgga tgagccagca aagtctagcc ggcagagtga 60 gaatagaaag gtacccggg 79

Claims (25)

1개 이상의 번역후 변형된 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 파지로서, 상기 번역후 변형된 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기가 슈타우딩거(Staudinger) 결찰 반응에 의해 생성된 것인 파지.
제1항에 있어서, 상기 파지는 생존가능한 것인 파지.
제1항에 있어서, 상기 파지는 섬유상(filamentous) 파지인 파지.
제1항에 있어서, 상기 파지는 M13-유래의 파지인 파지.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드인 파지.
제5항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 부위-특이적 단백질분해효소(site-specific protease)에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 링커 단백질분해효소 인식 서열을 포함하는 것인 파지.
제6항에 있어서, 상기 부위-특이적 단백질분해효소는 인자 Xa, 인자 XIa, 칼리크베인(Kallikvein), 트롬빈, 인자 XIIa, 콜라게나제 및 엔테로키나제로부터 선 택된 것인 파지.
제1항에 있어서, 상기 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기는 파라-아지도-L-페닐알라닌 잔기인 파지.
제1항에 있어서, 상기 파지는 고체 지지체에 고정화된 것인 파지.
복수개의 제1항의 파지.
복수개의 제1항의 파지로서, 상기 복수개의 파지는 복수개의 상이한 폴리펩티드를 디스플레이하는 것인 복수개의 파지.
제11항에 있어서, 상기 복수개의 파지는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것인 복수개의 파지.
제1항에 있어서, 상기 파지는 정제되거나 단리된 것인 파지.
(a) 1개 이상의 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 파지를 제공하는 단계; 및
(b) 슈타우딩거 결찰 반응을 포함하고, 상기 비천연 아미노산 잔기가 공유결 합 변형을 진행하는 조건 하에서 상기 파지를 반응시켜 번역후 변형된 파지를 생성시키는 단계
를 포함하는 번역후 변형된 파지의 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 상기 번역후 변형된 파지는 생존가능한 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 1개 이상의 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기는 파라-아지도-L-페닐알라닌 잔기인 방법.
제14항에 있어서, 상기 제공 단계는
(i) (A) 상기 파지를 코딩하는 핵산 분자로서, 상기 폴리펩티드를 코딩하며 1개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 하위서열(subsequence)을 포함하는 핵산 분자;
(B) 진정세균 숙주 세포에서 오르소고날(orthogonal) 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 코딩하는 핵산 분자;
(C) 상기 숙주 세포에서 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 코딩하는 핵산 분자로서, 이때 상기 O-RS가 상기 숙주 세포에서 상기 O-tRNA를 상기 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화시키고 상기 셀렉터 코돈이 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 것인 핵산 분자; 및
D) 아릴-아지드 비천연 아미노산
을 포함하는 진정세균 숙주 세포를 제공하는 것; 및
ii) 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리뉴클레오티드 하위서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 생성시키고(이때 상기 아릴-아지드 비천연 아미노산이 셀렉터 코돈에 반응하여 번역과정 동안에 상기 폴리펩티드 내로 도입됨), 상기 폴리뉴클레오티드 하위서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 파지를 생성시키는 것(이때 상기 아릴-아지드 비천연 아미노산이 상기 폴리펩티드 내로 도입됨)
을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제공 단계는 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포의 제공을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제공 단계는 O-RS를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 진정세균 숙주 세포의 제공을 포함하며, 이때 상기 O-RS는 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii) 아미노아실-tRNA 합성효소로부터 유도된 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제공 단계는 O-RS를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 진정세균 숙주 세포의 제공을 포함하며, 이때 O-RS는 메타노코커스 잔나스키이 티로실-tRNA 합성효소로부터 유도된 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 제공 단계는 O-tRNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 진정세균 숙주 세포의 제공을 포함하며, 이때 상기 O-tRNA가 앰버 억제자(amber suppressor) tRNA인 방법.
1개 이상의 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 생존가능한 파지.
제22항에 있어서, 상기 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기는 아릴-아지드 비천연 아미노산 잔기인 생존가능한 파지.
제22항에 있어서, 상기 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기는 파라-아지도-L-페닐알라닌 잔기인 생존가능한 파지.
제22항에 있어서, 상기 번역후 변형된 비천연 아미노산 잔기는 슈타우딩거 결찰 반응에 의해 생성된 것인 생존가능한 파지.
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