JP5419045B2 - 脊髄損傷治療薬剤 - Google Patents

Description

本発明は脊髄損傷治療剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）蛋白質を有効成分とする脊髄損傷治療剤に関する。更に、本発明はＨＧＦ蛋白質を有効成分とする脱髄性疾患治療剤に関する。

脊髄損傷（spinal cord injury：ＳＣＩ）とは、交通事故や高所転落に伴う脊脱臼骨折等の外傷で、脊髄実質が損傷されることにより、損傷部以下の末梢の運動・感覚・自律神経系の麻痺を呈する病態のことである。
現在、脊髄損傷の患者は、日本では約１０万人、米国では２５万人に及ぶとされており、年間日本では５千人、米国では１万人以上の患者が増加している。

近年医療の進歩に伴い受傷後の生存率は上昇し、障害の進行を抑えるべく脊椎骨損傷の再建手術の方法も飛躍的に進歩してきた。したがって、２次的な神経症状の増悪を抑えることも成功しはじめている。更に、リハビリテーションによる機能回復訓練技術の向上や補助器具（電動車いす等）の開発等により、患者の日常生活動作（ＡＤＬ）が向上してきてはいる。しかし、根本的な脊髄損傷自体への有効な治療法（神経損傷からの神経保護・再生）がないために、自立した排尿・排便・手作業や歩行が不能な患者が大量に存在しているのが現状である。

一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトジェンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献１、２）。ＨＧＦは肝細胞増殖因子として発見されたが、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献３、４）。

そして、特許文献１には、パーキンソン病モデルラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子のモデルラットへの作用効果を行動学的及び組織学的に検討した実施例が示されており、ＨＧＦ遺伝子の前投与により中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）から保護し、パーキンソン病モデルラットの症状を抑えたとの実験結果が示されている。また、この特許文献１では、前記実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がパーキンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症（ＳＮＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、後縦靭帯骨化症、広範性脊管柱狭窄症、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）などの神経疾患の治療にも適用できるとし、かかる神経疾患の１つとして脊髄損傷も挙げられている。

しかしながら、６−ＯＨＤＡはカテコールアミンを合成する神経細胞（具体的にはノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン産生神経細胞）に特異的に効果をもつ特殊な人工毒で、列記されているほとんどの疾患で変性死滅するといわれる神経細胞に対して６−ＯＨＤＡはそもそも毒性を示さない。したがって、６−ＯＨＤＡによる神経細胞死抑制効果をもって脊髄損傷を含む上記疾患に対して効果を予測することは到底できない。また、前記特許文献１には、ＨＧＦ蛋白質投与による治療効果に関する記載もない。

更に、非特許文献５には、ラット第１０胸髄部に、ＨＧＦ遺伝子を繰み込んだウイルスベクター（ＨＧＦ発現ウイルスベクター）を注入したのち、同部位に胸椎圧挫損傷を作製し、その後運動機能を評価したところ、下肢運動機能の回復が認められたことが記載されている。

しかしながら、通常脊髄損傷は事故等の外傷によって起きるにもかかわらず、非特許文献５では、胸椎圧挫損傷の３日前にＨＧＦ発現ウイルスベクターを注入している。このように事故の発生及び損傷部位を予測して、事前に局所的にＨＧＦ発現ウイルスベクターを投与することは不可能である。
また、脊髄損傷の患者は、受傷後７２時間は容体が安定せず、髄腔内投与のためのカテーテル挿入等が非常に困難となる可能性があり、投与時期の決定が重要になる。
更に、通常のＨＧＦ遺伝子治療は蛋白質の発現量の調節が困難である、一部の遺伝子発現ベクターでは繰り返し投与の際に免疫反応を惹起する危惧がある、一部の遺伝子発現ベクターではゲノムに遺伝子を導入することになる等の問題点が想定される。

ところで、脊髄神経を含む有髄神経の神経線維はミエリンと呼ばれるリポ蛋白の層から成る髄鞘で覆われている。髄鞘は神経線維の絶縁体のような働きをしており、有髄神経の跳躍伝導を可能にしている。この髄鞘が破壊される現象を脱髄と称するが、脱髄が生じると神経伝達の著しい遅延によって多彩な神経症状を引き起こす。これら脱髄を伴う疾患を脱髄性疾患と総称し、代表的なものとしては多発性硬化症が挙げられ、脊髄損傷の場合も通常脱髄を伴う。

多発性硬化症は脳及び脊髄の播種性脱髄斑の形成を特徴とする遅進性の中枢神経疾患で、欧米人に多く人口１０万人当たり約５０〜１００人、日本では人口１０万人当たり１〜５人に発症する。症状は個人差が大きく、視覚喪失，複視，眼振，構音障害，脱力，異常感覚，膀胱異常，気分変化等、様々な症状を発現し、寛解と再燃を繰り返しながら進行していく。病因として免疫学的異常が疑われているものの、いまだ解明されていない。そのため、他の脱髄性疾患と同様に根本的治療法もないのが現状である。
なお、前述の通り、ＨＧＦ遺伝子を組み込んだウイルスベクター（ＨＧＦ発現ウイルスベクター）を注入する方法が知られているが、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）やアデノウイルスなどのウイルスを脳内に注入すると、脳における濃度依存的炎症反応をもたらし、脱髄を招くことが知られている（特許文献２）。したがって、この点からも、ＨＧＦ遺伝子を繰み込んだウイルスベクターを用いる治療方法は、脱髄性疾患の根本的治療法にならないことは明らかであり、脱髄を招かない治療方法の確立が求められていた。
ＷＯ２００３／０４５４３９号パンフレット ＷＯ２００５／１００５７７号パンフレット Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，１４５０−１４５９（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３（１９８９） Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２，２１３−２１７（１９９９） Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，３２７，１−２３（２００３） 日本整形外科学会雑誌、２００５．０８．２５、Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．８，ｐＳ７６４

本発明の目的は、遺伝子を用いることなく、簡便な方法により脊髄損傷及び脱髄性疾患を治療することができる薬剤を提供するものである。

本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質が、脱髄抑制効果や５ＨＴ神経再生効果等脊髄損傷治療で最も望まれている機能再生効果を有し、ＨＧＦ蛋白質が脊髄損傷の治療薬剤として有用であるのみならず、脱髄性疾患の治療薬剤としても有用であることを見出し、更に検討を重ねて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）ＨＧＦ蛋白質を有効成分とする脊髄損傷治療剤、
（２）ＨＧＦ蛋白質が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである前記（１）記載の治療剤、
（３）ＨＧＦ蛋白質が、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質である前記（１）記載の治療剤、
（４）脊髄損傷部位に局所適用するための前記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤、
（５）髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（４）記載の治療剤、
（６）徐放性ポンプによる髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（４）記載の治療剤、
（７）脊髄神経の脱髄抑制剤である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の治療剤、
（８）ＨＧＦ蛋白質を有効成分として含有し、かつ脊髄損傷直後から２週以内に投与されることを特徴とする脊髄損傷治療剤、
（９）ＨＧＦ蛋白質を有効成分として含有し、かつ脊髄損傷直後から４日以内に投与されることを特徴とする脊髄損傷治療剤、
（１０）脊髄損傷患者に有効量のＨＧＦ蛋白質を投与することを特徴とする脊髄損傷治療方法、
（１１）脊髄損傷治療剤を製造するためのＨＧＦ蛋白質の使用、
（１２）脊髄損傷治療用ＨＧＦ蛋白質、
（１３）ＨＧＦ蛋白質を有効成分とする脱髄性疾患治療剤、
（１４）脱髄性疾患が多発性硬化症、デビック（Devic）病、バロー同心性硬化症、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、シルダー（Schilder）病、亜急性硬化性汎脳炎（ＳＳＰＥ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、ビンスワンガー病、低酸素脳症、橋中心髄鞘破壊症、ギラン・バレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）から選ばれる前記（１３）記載の治療剤、
（１５）ＨＧＦ蛋白質が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである前記（１３）又は（１４）記載の治療剤、
（１６）ＨＧＦ蛋白質が、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白質である前記（１３）又は（１４）記載の治療剤、
（１７）疾患部位に局所適用するための前記（１３）〜（１６）のいずれかに記載の治療剤、
（１８）髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（１７）記載の治療剤、
（１９）徐放性ポンプによる髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（１７）記載の治療剤、
（２０）脱髄性疾患の患者に有効量のＨＧＦ蛋白質を投与することを特徴とする脱髄性疾患治療方法、
（２１）脱髄性疾患治療剤を製造するためのＨＧＦ蛋白質の使用、及び
（２２）脱髄性疾患治療用ＨＧＦ蛋白質、
に関する。

本発明の治療剤は、脊髄損傷及び脱髄性疾患に対して極めて優れた治療効果を発揮するものである。また、本発明の治療剤は、遺伝子治療のもつ問題点がないという特長を有する。更に、本発明の治療剤は、脊髄損傷や脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症等）などで見られる有髄神経での脱髄を効果的に抑制、治療することができるという特長を有する。更にまた、本発明の治療剤はＨＳＶやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いる必要がないため、脱髄を招くことがないという特徴を有する。更に加えて、本発明の治療剤は、遺伝子治療と異なり有効成分であるＨＧＦの供給量もしくは投与量を容易に調節することが可能であり、かつ投与時期の調節が可能であり、更に繰り返しもしくは持続的に投与が可能であるという特長を有する。

脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後の脊髄組織のＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン：Hematoxylin-Eosin）染色像である。 脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後の脊髄組織のＬＦＢ（ルクソール・ファスト・ブルー：Luxol Fast Blue）染色像である。 脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後の脊髄組織の５ＨＴ（5-Hydroxytryptamine）免疫染色像である。 脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群の脊髄損傷後の脊髄組織の５ＨＴ及びＧＡＰ４３（Growth associated protein-43）の免疫染色像である。 脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後のＢＢＢ（Basso-Beattie-Bresnahan）スコアを示す線図である。図中、矢印は、ＨＧＦ蛋白質またはＰＢＳ投与期間を表す。 脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を４００μｇ／４週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。図中、矢印は、ＨＧＦ蛋白質またはＰＢＳ投与期間を表す。 脊髄損傷４日後からＨＧＦ蛋白質を４００μｇ／４週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。図中、矢印は、ＨＧＦ蛋白質またはＰＢＳ投与期間を表す。 脊髄損傷２週間後からＨＧＦ蛋白質を４００μｇ／４週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。図中、矢印は、ＨＧＦ蛋白質またはＰＢＳ投与期間を表す。 脊髄損傷８週間後からＨＧＦ蛋白質を４００μｇ／４週間投与したＨＧＦ蛋白質投与群と対照群の脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。図中、矢印は、ＨＧＦ蛋白質またはＰＢＳ投与期間を表す。

本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦ蛋白質の製造方法としては、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９年、第１６３巻，ｐ．９６７等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個〔例えば、数個（例えば１〜８個；以下同様である。）〕のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数（１〜数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。

更に、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦとして作用する蛋白質も含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。

上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。配列番号２で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン（mitogen）活性、モートゲン（motogen）活性等を有する。
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベース（NCBI-GenBank Flat File Release 164.0）に登録されているAccession No．ＢＡＡ１４３４８又はＡＡＣ７１６５５等のヒト由来ＨＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。

なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質であってもよい。このようなＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＡＡＢ３１８５５、ＮＰ＿０３４５５７、ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ［例えばAccession No．ＮＰ＿５８７１３（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）等］、ウシ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１０２６９２１、ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）又はチンパンジー由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＸＰ＿５１９１７４等）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基等のＣ_７−１４アラルキル基のほか、ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。更に、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ_２−６アルカノイル基等のＣ_１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の官能基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ_２−６アルカノイル基等のＣ_１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。

本発明で用いるＨＧＦ蛋白質は、その部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。）の形態であってもよく、そのような部分ペプチドとしては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦと実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号１で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチドや、配列番号１で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２８８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。本発明の部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。更に、部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の官能基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。

本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質（部分ペプチドの形態を含む）の塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。

本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質が部分ペプチドの形態である場合、該部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）等に記載された方法が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。

なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物に由来するＨＧＦ蛋白質であってもよい。例えば、ラット由来のＨＧＦ蛋白質は配列番号３で表される。

本発明の治療剤、すなわち脊髄損傷治療剤及び脱髄性疾患治療剤は、脊髄損傷及び脱髄を伴う神経疾患全般に用いることができる。具体的には、多発性硬化症（ＭＳ）、デビック（Devic）病、バロー同心性硬化症、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、シルダー（Schilder）病、亜急性硬化性汎脳炎（ＳＳＰＥ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、ビンスワンガー（Binswanger）病、低酸素脳症、橋中心髄鞘破壊症、ギラン・バレー（Guillain-Barre）症候群、フィッシャー（Fisher）症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）等が挙げられ、脱髄を伴う脊髄損傷も包含される。

本発明の治療剤（脊髄損傷治療剤及び脱髄性疾患治療剤）は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）にも適用できる。

本発明の治療剤（脊髄損傷治療剤又は脱髄性疾患治療剤）を患者又は患畜に投与する場合、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等とされる。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）などを使用してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を使用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜２．０ｗ／ｖ％程度、好ましくは約０．００１〜１．０ｗ／ｖ％程度、さらに好ましくは約０．０１〜０．５ｗ／ｖ％程度に調整される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。

噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等が用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。

また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）もしくはその塩又はキトサン等の多糖類、アテロコラーゲン、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等である。好ましくはポリエステル、更に好ましくは乳酸・グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０ないし５０／５０である。該乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００ないし２０，０００である。乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％程度である。

投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接脊髄損傷あるいは脱髄性疾患のある組織に直接注射（例えば、髄腔内（intrathecal）投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脊髄損傷あるいは脱髄性疾患のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、１回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇである。また、投与方法も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回単回投与とするか、１回３０分〜数週間程度（好ましくは１回２４時間〜２週間程度）の持続投与とするか、あるいは前記単回投与または持続投与を、間隔をおいて連続投与とすることもできる。連続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプ（例えば、浸透圧ポンプ）による局所（例えば髄腔内）持続投与の場合は、数週間〜数ヶ月に１回でもよい。この様な持続投与は、ＨＧＦ蛋白質が長期にわたり徐々に脊髄損傷又は脱髄性疾患の部位に放出されるため、ＨＧＦ作用が長期にわたり発揮されて、より良好な治療効果が得られるという利点がある他、投与回数が少ないため、患者への負担が軽減されるという利点もある。また、必要に応じて１度設置した皮下の浸透圧ポンプにＨＧＦ蛋白質を追加投与可能な点も利点といえる。なお、投与方法は、前記のとおり局所投与が望ましいが、筋肉内投与、皮下投与、点滴投与等でも可能である。また、投与時期も、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、例えば、脊髄損傷の場合では、好ましくは受傷直後から１４日以内、更に好ましくは受傷直後から７日以内、特に好ましくは受傷直後から４日以内である。特に、脊髄損傷の患者では、受傷後７２時間程度は容体が安定し難いことを考慮すると、受傷後約７２時間から４日以内に投与されることがとりわけ好ましい。上記投与時期は、持続投与または連続投与の場合の投与開始時または初回投与時も含まれる。

以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、以下の実施例において使用したＨＧＦ蛋白質は５残基欠失型リコンビナントヒトＨＧＦ蛋白質（配列番号２）を用いた。

［実施例１］
（脊髄損傷動物の作製及びＨＧＦ蛋白質の投与）
（１）脊髄損傷動物の作製
まず、無菌的に浸透圧ポンプ（Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｐｕｍｐ）を準備した。Ａｌｚｅｔミニオスモティックポンプ（ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、Ｍｏｄｅｌ２００２）にＨＧＦ蛋白質（濃度１ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳに溶解）又はＰＢＳ（対照）を注入した。ポンプ吐出部には、ＨＧＦ蛋白質又はＰＢＳで内腔を満たした内径０．３ｍｍ−外径０．７ｍｍのシリコンチューブ（株式会社イマムラ製；カテーテルチューブ）を連結し、連結部には更に内径１．０ｍｍ−外径２．０ｍｍのシリコンチューブ（株式会社イマムラ製）をかぶせ、３７℃で１２時間インキュベートした後、実験に供した。
成体雌性ＳＤラット（週齢約１０週から１２週：体重約２５０ｇ）を１４ｗ／ｖ％抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、第１０胸椎及び第１２胸椎の椎弓を除去した後、浸透圧ポンプ（ＨＧＦ蛋白質溶液を上記方法で予め充填したもの）を右側脊背側皮下に留置し、カテーテルチューブを皮下から筋層を通し、第１２胸椎椎弓まで誘導した。次いで第１０胸髄にＩＨインパクター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて２００ｋＤｙｎｅの圧挫損傷を作製し、その後第１２胸髄の硬膜とくも膜を頭尻側方向にスプリットし、カテーテルチューブをくも膜下腔に挿入し、カテーテルの先を損傷脊髄直上まで進めた。カテーテルは外科用接着剤アロンアルファＡ「三共」（三共株式会社製）を用い筋層の上下で癒着させ、十分乾燥した後に筋層と皮膚を縫合して手術を完了した。
（２）ＨＧＦ蛋白質の投与
術後（圧挫損傷後）、前記浸透圧ポンプによりＨＧＦ蛋白質溶液を２週間にわたり髄腔内投与した（ＨＧＦ蛋白質の投与量：２００μｇ／２週）。なお、対照群にはＰＢＳのみを投与した。

［実施例２］
（組織解析及び結果）
術後一定期間後、ラットを１４ｗ／ｖ％抱水クロラールの腹腔内投与により深麻酔し、次いでＰＢＳ、引き続き４ｗ／ｖ％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで左心室より灌流を行った。脊髄断片を取り出し、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで２４時間、４℃で後固定した。組織サンプルを１０ｗ／ｖ％シュクロース／ＰＢＳ溶液、次いで３０ｗ／ｖ％シュクロース／ＰＢＳ溶液にそれぞれ２４時間４℃で浸漬し、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテクニカル社）中に包埋した。包埋組織を液体窒素中で直ちに凍結し、２０μｍの凍結切片を作製した。次いで切片をヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色し、組織検査を行った。その結果、図１に示すように、ＨＧＦ蛋白質投与群は対照群に較べて、運動神経の変性・細胞死に起因する空洞形成が顕著に抑制されていることから、圧挫による脊髄変性が抑制されていることが示された。

［実施例３］
（髄鞘染色及び結果）
実施例２記載の方法で作製した切片を９５ｖ／ｖ％エタノール処理した後、ルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）溶液で６０℃、２時間インキュベートし、インキュベーターから取り出した後室温となるまで放置し、９５ｖ／ｖ％エタノール及び蒸留水で洗浄した。次に、炭酸リチウム溶液、７０ｖ／ｖ％エタノールによる分別及び蒸留水による洗浄の操作を適当なコントラストが得られるまで繰り返した後、切片を脱水・封入し、髄鞘の観察を行った。図２に示すように、ＨＧＦ蛋白質投与群は対照群に較べてＬＦＢ陽性の髄鞘面積が大きく、脊髄損傷による脱髄が抑制されていることが示された。

［実施例４］
（免疫組織化学解析及び結果）
実施例２記載の方法で作製した切片をポリクローナル抗５ＨＴ抗体（１：１００希釈）及びポリクローナル抗ＧＡＰ４３抗体（１：１０００希釈）で染色した。すなわち、５ｖ／ｖ％ヤギ血清及び０．１ｗ／ｖ％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで室温１時間ブロッキングを行った後、前記抗体溶液で４℃、一晩インキュベートした。この切片をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８（緑）及びＡｌｅｘａ５４６（赤）（１：１０００希釈）で蛍光標識した２次抗体で室温１時間インキュベートして、ＰＢＳで洗浄後、スライドに封入し、傾向顕微鏡にて５ＨＴ陽性神経線維及びＧＡＰ４３陽性神経線維を観察した。その結果、図３に示すように、ＨＧＦ蛋白質投与群は対照群に比べて、損傷部より４ｍｍ尾側において５ＨＴ陽性神経線維が有意に多く認められた。また、図４に示すように、５ＨＴ陽性シグナルとＧＡＰ４３陽性シグナルの局在が一致していた。５ＨＴ陽性神経線維は脊髄損傷後の運動機能を担っていること、ＧＡＰ４３は成体においては再生神経線維にのみ発現していることから、ＨＧＦ蛋白質の投与によって運動機能に直結する神経線維の再生が促進されることが示された。

［実施例５］
（運動機能評価及び結果）
実施例１に記載の方法で脊髄損傷直後からＨＧＦ蛋白質を２００μｇ／２週間投与した動物につき、オープンフィールドでの動物の動きを複数の観察者が目視で観察し、その機能を０［完全麻痺］〜２１［正常］の２１段階で測定、記録し評価するＢＢＢ（Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）スコアを用いて、後肢運動機能評価を術後６週まで行った。その結果は図５のとおりである。
図５から分かるように、ＨＧＦ蛋白質群は脊髄損傷４日後から機能回復が観察され、５週から対照群に比べて有意に機能回復効果が認められた（ｐ＜０．０５）。

［実施例６］
実施例１と同様に脊髄損傷動物を作製し、ＨＧＦ蛋白質（濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳに溶解）又はＰＢＳ（対照）を注入した浸透圧ポンプの留置とカテーテルの挿入を行った。術後（圧挫損傷後）、浸透圧ポンプによりＨＧＦ蛋白質溶液を４週間にわたり髄腔内投与した（ＨＧＦ蛋白質の投与量：４００μｇ／４週）。なお、対照群にはＰＢＳのみを投与した。実施例５に記載の方法で運動機能評価を術後９週まで行った。その結果は図６のとおりである。
図６から分かるように、ＨＧＦ蛋白質を投与した動物では、対照動物に比較して脊髄損傷４日後から機能回復が観察され、ＨＧＦ蛋白質投与後もＢＢＢスコアの上昇が認められた。

［実施例７］
成体雌性ＳＤラット（週齢約１０週から１２週：体重約２５０ｇ）を１４ｗ／ｖ％抱水クロラールの腹腔内投与により麻酔し、第１０胸髄にＩＨインパクター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて２００ｋＤｙｎｅの圧挫損傷を作製し脊髄損傷動物とした。圧挫損傷４日後、２週後、８週後に浸透圧ポンプを留置するために脊髄損傷動物に再手術を施した。再手術は、ＨＧＦ蛋白質（濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳに溶解）又はＰＢＳ（対照）を注入した浸透圧ポンプを、実施例１と同様の方法で留置し、カテーテルの先を損傷脊髄直上に挿入して固定した。圧挫損傷４日後、２週後および８週後から、ＨＧＦ蛋白質溶液を浸透圧ポンプにより４週間にわたり髄腔内投与した（ＨＧＦ蛋白質の投与量：４００μｇ／４週）。なお、対照群にはＰＢＳのみを投与した。経時的に実施例５に記載の方法で運動機能評価を行った。その結果は図７、８及び９に示すとおりである。
圧挫損傷４日後からＨＧＦ蛋白質を投与した動物では、図７から分かるように、対照動物に比較して早期の機能回復が観察された。
圧挫損傷２週後からＨＧＦ蛋白質を投与した動物では、図８から分かるように、ＨＧＦ蛋白質投与２週後（圧挫損傷４週後）から、対照動物に比較して機能回復が観察された。
圧挫損傷８週後からＨＧＦ蛋白質を投与した動物では、図９から分かるように、ＨＧＦ蛋白質投与動物と、対照動物との間に機能回復に差は認められなかった。

［製剤実施例１］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，重量平均分子量＝１０，０００；和光純薬工業株式会社製）１．９ｇをジクロロメタン３．０ｍＬに溶解する。この有機溶媒液にＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ蛋白質分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。更に残留溶媒除去のため、４０℃で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質含有徐放性マイクロカプセルを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：５．３ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例２］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，重量平均分子量＝１０，０００；和光純薬工業株式会社製）１．８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン３．０ｍＬに溶解する。この有機溶媒液にＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ蛋白質分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。更に残留溶媒除去のため、４０℃で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質含有徐放性マイクロカプセルを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：５．３ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例３］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５，重量平均分子量＝１５，０００；和光純薬工業株式会社製）１．７ｇをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解する。この有機溶媒液ＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末３００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ蛋白質分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。更に残留溶媒除去のため、４０℃で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質含有徐放性マイクロカプセルを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：１７．６ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例４］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５，重量平均分子量＝１５，０００；和光純薬工業株式会社製）１．６９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解する。この有機溶媒液にＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末３００ｍｇを添加し、ミキサーミル（株式会社レッチェ）を用いて微粒化し、ＨＧＦ蛋白質分散液を調製する。この分散液を０．１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化する。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取する。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥する。更に残留溶媒除去のため、４０℃で３日間真空乾燥してＨＧＦ蛋白質含有徐放性マイクロカプセルを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：１７．８ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例５］
ＤＬ−乳酸重合体（乳酸／グリコール酸＝１００／０，重量平均分子量＝５，０００；和光純薬工業株式会社製）５ｇを塩化メチレン５０ｍＬに溶解し、１０ｗ／ｖ％の溶液を調製する。次いで、この溶液にＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末２．５ｍｇを添加する。これを別に４０℃に加温しておいた０．５ｗ／ｖ％キトサン水溶液に加え、ホモミキサーを用いて１０００ｒｐｍの撹拌速度で撹拌し乳化する。得られる乳化液を室温で更に３時間撹拌して塩化メチレンを蒸散させ、次いで、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）して生成したマイクロスフィアを集め、予め４０℃に加温してある蒸溜水を用いて５回洗浄し、室温で減圧乾燥し、ＨＧＦ蛋白質含有マイクロスフィアを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：０．０５ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例６］
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５，重量平均分子量＝５，０００；和光純薬工業株式会社製）１０ｇを塩化メチレン：エタノール（４：１）２００ｍＬに溶解し、５ｗ／ｖ％の溶液を調製する。次いで、この溶液にＨＧＦ蛋白質凍結乾燥粉末２．５ｍｇを添加する。これを別に４０℃に加温しておいた１ｗ／ｖ％ゼラチン水溶液に上記混合溶液を５００ｒｐｍの速度でホモミキサーを用いて攪拌しながら少量ずつ加え乳化する。得られる乳化液を室温で更に３時間撹拌して塩化メチレンとエタノールを蒸散させ、次いで、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）して生成したマイクロスフィアを集め、予め４０℃に加温してある蒸溜水を用いて５回洗浄し、室温で減圧乾燥し、ＨＧＦ蛋白質含有マイクロスフィアを得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：０．０２５ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例７］
２ｗ／ｖ％ＨＧＦ蛋白質水溶液０．２ｍＬと２％アテロコラーゲンのリン酸緩衝液溶液２ｍＬを混合した後凍結乾燥を行う。これを、液体窒素を用いて低温で粉砕した後金型にいれて圧縮成型し円柱状のＨＧＦ含有徐放性製剤を得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：１０ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例８］
０．０１ｗ／ｖ％ＨＧＦ蛋白質水溶液１００ｍＬと２ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液５０ｇを均一に混合攪拌し、凍結乾燥する。その後液体窒素を用いて低温粉砕する。これを棒状に圧縮成型し、ＨＧＦ含有た徐放性製剤を得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：１ｗ／ｗ％）。

［製剤実施例９］
ＨＧＦ蛋白質１ｍｇを２ｗ／ｖ％アテロコラーゲン溶液２ｍＬに溶解した後、凍結乾燥を行う。得られた複合体を粉砕した後、円柱状に圧縮成型し、ＨＧＦ含有徐放性製剤を得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：２．５質量％）。

［製剤実施例１０］
ヒアルロナンのナトリウム塩（極限粘度数４５００ｃｃ／ｇ）０．５８ｇを２０ｍＬの水と混合し、膨潤させる。次にこの混合物に、の２Ｎ水酸化ナトリウム２ｍＬを加え、撹拌して均一な溶液とする。２．４ｍＬの水中の０．１０ｇのジビニルスルホンを加えて撹拌する。混合物を７０分放置し、得られるゲルをバイオトリス緩衝液（リン酸塩緩衝の０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ約７．２）の２２３ｍＬ中に入れ、３時間膨潤させる。次に混合物に１ｍＬの２Ｎ ＨＣｌを加える。１時間後に、０．６ｍＬの２Ｎ ＨＣｌを加え、１６時間放置した。０．３５ｍＬの２Ｎ ＨＣｌを加え、膨潤ゲルを緩衝液中３日間ゆっくり撹拌する。均一な粘弾性の柔らかなゲルが得られ、これを０．１５Ｍ ＮａＣｌで５日間透析する。このゲルを、緩衝食塩水中の１ｗ／ｖ％ＨＧＦ蛋白質と混合して、ＨＧＦ蛋白質の最終濃度を０．２５ｗ／ｖ％とし、ＨＧＦ含有製剤を得る（生体高分子に対するＨＧＦの配合比率：約２５ｗ／ｖ％）。

本発明により、脊髄損傷及び脱髄性疾患の治療に有用な薬剤が提供される。

Claims (16)

1. 有効成分がＨＧＦ蛋白質からなり、くも膜下腔内に投与される脊髄損傷治療剤。
2. ＨＧＦ蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であってマイトゲン活性及びモートゲン活性を有する蛋白質である請求項１に記載の治療剤。
3. ＨＧＦ蛋白質が、配列番号１又は２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１に記載の治療剤。
4. くも膜下腔内への投与が、1回単回投与または１回３０分〜２週間の持続投与として行われ、単回投与またはこの持続投与が間隔をおいて繰り返されるものである請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
5. くも膜下腔内への投与が、1回単回投与、または単回投与が間隔をおいて繰り返されるものである請求項４に記載の治療剤。
6. 1回当たり１０μｇ〜５０ｍｇ投与される請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
7. 脊髄損傷部位に局所適用するための請求項１〜６のいずれかに記載の治療剤。
8. くも膜下内投与用注射剤の剤型である請求項１〜７のいずれかに記載の治療剤。
9. 徐放性ポンプによるくも膜下内投与用注射剤の剤型である請求項８に記載の治療剤。
10. 注射剤中のＨＧＦ濃度が０．０１〜０．５ｗ／ｖ％である請求項８又は９に記載の治療剤。
11. 脊髄神経の脱髄抑制のために用いられる請求項１〜１０のいずれかに記載の治療剤。
12. 脊髄損傷が外傷による脊髄損傷である請求項１〜１１のいずれかに記載の治療剤。
13. 有効成分がＨＧＦ蛋白質からなり、かつ脊髄損傷直後から２週以内に、くも膜下腔内に投与されることを特徴とする脊髄損傷治療剤。
14. 脊髄損傷直後から４日以内に投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の脊髄損傷治療剤。
15. 脊髄損傷後７２時間以降に投与されることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の脊髄損傷治療剤。
16. 脊髄損傷が外傷による脊髄損傷である請求項１３〜１５のいずれかに記載の治療剤。

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