PT2116255E

PT2116255E - Administração intratecal de hgf após lesão da medula espinal

Info

Publication number: PT2116255E
Application number: PT87210068T
Authority: PT
Inventors: Hideyuki Okano; Yoshiaki Toyama; Masaya Nakamura; Akio Iwanami; Kazuya Kitamura; Toshikazu Nakamura; Hiroshi Funakoshi; Keigo Hanada
Original assignee: Univ Keio; Univ Osaka; Kringle Pharma Inc
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2013-06-21
Also published as: EP2116255A4; CA2675953C; US20100081617A1; KR20150138413A; ES2412388T3; KR101670677B1; CN101610783A; US20120021040A9; US8518880B2; WO2008105507A1; CA2675953A1; KR20090118078A; EP2116255A1; CN105311620A; CN101610783B; HK1134445A1; WO2008105088A1; EP2116255B1; DK2116255T3

Description

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DESCRIÇÃO "ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE HGF APÓS LESÃO DA MEDULA ESPINAL"

CAMPO TÉCNICO A presente divulgação refere-se a um agente terapêutico para as lesões da medula espinal e, mais particularmente, a um agente terapêutico para as lesões da medula espinal em que a proteína fator de crescimento de hepatócitos (abreviado em seguida como "HGF") serve como o ingrediente ativo. A divulgação refere-se também a um agente terapêutico para doenças desmielinizantes, em que a proteína HGF serve como o ingrediente ativo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 termo "lesão da medula espinal" (SCI) refere-se a um estado clínico que apresenta paralisia do sistema nervoso periférico motor, sensorial e autónomo, abaixo do local da lesão do parênquima da medula espinal, resultando de trauma tal como deslocamento-fratura da coluna vertebral como resultado de, por exemplo, um acidente de trânsito ou de uma queda de um lugar alto. Atualmente, o número de pacientes com lesão da medula espinal é de cerca de 100.000 no Japão, e cerca de 250.000 nos Estados Unidos. Todos os anos, o número de tais pacientes aumenta, pelo menos, 5.000 no Japão e, pelo menos, 10.000 nos EUA.

Com os recentes avanços nos cuidados médicos aumentou a taxa de sobrevivência após a lesão, e também foram feitos avanços notáveis em métodos de cirurgia reconstrutiva para lesões da medula espinal, que se destinam a parar a progressão da incapacidade. Como consequência, também está a começar a ser alcançado sucesso no controlo da deterioração 2 neurológica secundária. Além disso, devido às melhorias na tecnologia de reabilitação e ao desenvolvimento de dispositivos de apoio (cadeiras de rodas movidas a energia elétrica, etc), melhoraram as atividades de vida diária (AVD) do paciente. No entanto, por causa da falta de métodos eficazes para o tratamento fundamental de lesões básicas da medula espinal (isto é, a proteção do nervo de lesão neurológica e a regeneração do nervo), existe hoje um grande número de tais pacientes que são incapazes de aliviar-se, de realizar trabalho manual ou de andar a pé, sem a ajuda dos outros. O HGF foi identificado inicialmente como um potente mitogénio para os hepatócitos maduros, e em 1989 foi clonado geneticamente (Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1450-1459 (1984) e Nature 342, 440-443 (1989)). Embora tenha sido descoberto como um fator de crescimento de hepatócitos, também se descobriu que HGF é um novo fator neurotrófico a partir de inúmeros estudos recentes em análise de expressão e funcional, que incluem técnicas de knockout/knockin em ratinhos (Nat. Neurosci. 2, 213-217 (1999) e Clin. Chim Acta., 327, 1-23 (2003)).

No documento WO 03/045439, são descritos exemplos de trabalho em que os efeitos do gene do HGF em ratos modelo da doença de Parkinson foram investigados comportamentalmente e histologicamente. Os resultados experimentais ai apresentados indicam que a administração prévia de gene do HGF teve o efeito de proteção dos neurónios dopaminérgicos na substância nigra do mesencéfalo da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) . O documento WO 03/045439 também indica que, com base nestes resultados experimentais, o gene do HGF pode ser utilizado no tratamento não só da doença de Parkinson, mas também de outras desordens neurológicas, incluindo a doença 3 de Alzheimer, a degeneração espinocerebelar, a esclerose múltipla, a degeneração estriatonigral (SND), a atrofia muscular espinal (SMA), a coreia de Huntington, a sindrome de Shy-Drager, a doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), a ataxia de Friedreich, a miastenia gravis, a doença moyamoya, a amiloidose, a doença de Pick, a neuropatia subaguda mielo-optica, a dermatomiosite/polimiosite, a doença de Creutzfeldt-Jacov, o sindrome de Behcet, o lúpus eritematoso sistémico (SLE), a sarcoidose, a periarterite nodosa (PN) , a ossificação do ligamento longitudinal posterior, a estenose difusa do canal espinal, a doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), a neurite diabética periférica e os distúrbios cerebrovasculares isquémicos (por exemplo, o enfarte cerebral, a hemorragia cerebral), e, além disso, menciona as lesões da medula espinal como um tipo de desordem neurológica.

No entanto, a 6-OHDA é uma toxina sintética especial, que tem um efeito especifico sobre os neurónios que sintetizam as catecolaminas (especificamente, os neurónios produtores de noradrenalina, de adrenalina e de dopamina), e não apresenta qualquer toxicidade contra os neurónios que são supostamente degenerados ou mortos, na maioria das doenças listadas anteriormente. Portanto, é impossível prever os efeitos nas desordens anteriores, incluindo as lesões da medula espinal, a partir dos efeitos de supressão de morte das células neuronais por 6-OHDA. Além disso, o documento WO 03/045439 não faz qualquer menção aos efeitos terapêuticos da administração de proteína de HGF. O The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, vol. 79, N° 8, pS764 (25 de agosto de 2005) refere que, quando um vetor de vírus contendo o gene do HGF (um vetor de vírus que expressa o HGF) foi injetado na medula espinal de 4 ratos na décima vértebra torácica e, foi então criada no mesmo local uma lesão de esmagamento vertebral, foi observada a recuperação da função motora dos membros inferiores em avaliações subsequentes da função motora.

No entanto, apesar do facto de que as lesões da medula espinal surgem geralmente a partir de trauma externo sofrido em acidentes e semelhantes, no The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, vol. 79, N° 8, pS764 (25 de agosto de 2005), o vetor de virus que expressa o HGF foi injetado 3 dias antes da lesão por esmagamento da vértebra torácica. É claramente impossível prever desta forma a ocorrência de um acidente e o local da lesão e, com antecedência administrar localmente o vetor de vírus que expressa o HGF.

Além disso, é provável que o estado de um paciente com uma lesão da medula espinal seja instável durante 72 horas após o trauma, o que pode tornar muito difícil a inserção de um cateter para a administração intratecal. É então importante a determinação do período adequado de administração.

Além disso, há um certo número de problemas possíveis, tais como a dificuldade de controlar a quantidade de proteína expressa em terapia genética convencional de HGF, o perigo de alguns vetores de expressão de genes de desencadearem uma resposta imunitária com administração repetida, e a possibilidade de alguns vetores de expressão de genes de introduzirem genes no genoma.

As fibras nervosas de nervos mielinizados, incluindo os nervos da medula espinal, são cobertas com um revestimento composto por uma camada de lipoproteína chamada mielina. Este revestimento de mielina funciona como um isolante para as fibras nervosas, permitindo a condução saltatória pelo nervo mielinizado. A destruição deste revestimento de mielina é referida como desmielinização. Quando ocorre a 5 desmielinização, surgem uma variedade de sintomas neurológicos devido a uma desaceleração dramática da neurotransmissão. As doenças acompanhadas por dita desmielinização são referidas geralmente como doenças desmielinizantes, e incluem tipicamente, por exemplo, a esclerose múltipla. As lesões da medula espinal também são geralmente acompanhadas por desmielinização. A esclerose múltipla é uma doença do sistema nervoso central, que progride lentamente, caracterizada pela formação de placas de desmielinização disseminadas. A incidência da esclerose múltipla é de cerca de 50 a 100 casos por 100.000 pessoas na Europa e nos Estados Unidos, e é de cerca de 1 a 5 casos por 100.000 pessoas no Japão. Os sintomas variam muito de indivíduo para indivíduo, e podem incluir a perda de visão, a visão dupla, o nistagmo, as desordens de articulação, a fraqueza, as sensações anormais, os problemas de bexiga e as alterações de humor. A doença progride com a repetição da remissão e retomada de tais sintomas. A causa, embora ainda não tenha sido determinada, é suspeita de ser uma anormalidade imunológica. Assim, tal como com outras doenças desmielinizantes, não existe atualmente tratamento básico. Tal como indicado anteriormente, embora sejam conhecidos métodos que envolvem a injeção de um vetor de vírus contendo o gene do HGF (vetor de vírus de expressão de HGF) , também é sabido que os vírus, tais como o vírus do herpes (HSV) ou um adenovírus, produzem no cérebro uma reação inflamatória dependente da concentração, quando tais vírus são introduzidos no cérebro, convidando à desmielinização (WO 05/100577).

Portanto, também a partir desta perspetiva, os métodos de tratamento que envolvem a utilização de um vetor de vírus contendo o gene do HGF não constituem claramente uma 6 abordagem fundamental para o tratamento de doenças desmielinizantes. Assim, existe um desejo para o estabelecimento de um método de tratamento que não convide a desmielinização. 0 documento WO 2006/077675 AI descreve a utilização de HGF como um supressor de um órgão transplantado, resultante da administração de imunossupressores, mas não ensina o tratamento de lesões da medula espinal.

Kitamura (2006) The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, vol. 80, N° 8, página S884, investiga o efeito de HGF sobre a lesão da medula espinal. Foi administrado antes da lesão um vetor de virus que expressa o HGF. Kitamura (2006) Journal of the Japan Spine Research Society, vol. 17, N° 1, página 557, investiga o efeito de HGF sobre a lesão da medula espinal. Foi administrado antes da lesão um vetor de virus que expressa o HGF.

Kato et al. (2005) Neuroscience Research, vol. 52, páginas 299-310, descreve a transferência de genes retrógrada de HGF mediada por lipossomas no sistema nervoso de rato. Esta referência não divulga o tratamento de lesões da medula espinal nem a administração intratecal de HGF.

Shi et al. (2006) J. Thoracic and Cardiovasc. Surgery, vol. 132, N° 4, páginas 941-947, investiga os efeitos da transferência de genes não virais do HGF na isquemia da medula espinal. Esta referência não divulga o tratamento de lesões da medula espinal, e muito menos a administração de proteína de HGF para o tratamento de lesões da medula espinal.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

Um objeto da invenção é proporcionar um agente que é capaz de tratar as lesões da medula espinal e as doenças 7 desmielinizantes, através de um método simples e conveniente, que não envolve a utilização de um gene.

MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS

Os inventores conduziram extensas investigações a fim de superar os problemas anteriores. Como resultado, eles descobriram que a proteina de HGF tem o resultado mais procurado após efeitos de regeneração funcionais no tratamento de lesões da medula espinal, incluindo um efeito inibidor da desmielinização e, um efeito de regeneração do nervo de 5HT, fazendo com que a proteina de HGF seja útil como um agente terapêutico para as lesões da medula espinal. Além disso, os inventores também descobriram que a proteina de HGF é útil como um agente terapêutico para as doenças desmielinizantes. Estas descobertas conduziram finalmente à presente invenção.

Consequentemente, a invenção refere-se à matéria definida nas reivindicações anexas. A presente divulgação também se refere a: (1) um agente terapêutico para o tratamento de lesões da medula espinal, que compreende a proteina de HGF como um ingrediente ativo, (2) o agente terapêutico de acordo com (1) acima, em que a proteina de HGF é uma proteina com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, uma proteina tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, e tendo substancialmente a mesma atividade que o HGF, ou um péptido que é um péptido parcial de uma das proteínas referidas e tem substancialmente a mesma atividade que o HGF, (3) o agente terapêutico de acordo com (1) acima, em que a proteína de HGF é uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (4) o agente terapêutico de acordo com qualquer uma das (1) a (3) acima, em que o agente é adaptado para o uso localizado no local de uma lesão da medula espinal, (5) o agente terapêutico de acordo com (4) acima, em que o agente está na forma de uma preparação inj etável para a administração intratecal, (6) o agente terapêutico de acordo com (4) acima, em que o agente está na forma de uma preparação injetável para a administração intratecal por uma bomba de libertação prolongada, (7) o agente terapêutico de acordo com qualquer uma das (1) a (6) acima, em que o agente é para inibir a desmielinização do nervo da medula espinal, (8) um agente terapêutico para o tratamento de lesões da medula espinal, que compreende a proteína de HGF como um ingrediente ativo, e que é administrado no espaço de 2 semanas após uma lesão da medula espinal, (9) um agente terapêutico para o tratamento de lesões da medula espinal, que compreende a proteína de HGF como um ingrediente ativo, e que é administrado no espaço de 4 dias após uma lesão da medula espinal, (10) um método para o tratamento de lesões da medula espinal, sendo o método composto pela administração de uma dose eficaz de proteína de HGF a um paciente com lesão da medula espinal, (11) a utilização de uma proteína de HGF para o fabrico de um agente para o tratamento de lesões da medula espinal, (12) uma proteína de HGF para o tratamento de lesões da medula espinal, (13) um agente terapêutico para o tratamento de uma doença desmielinizante, que compreende a proteína de HGF como um ingrediente ativo, (14) o agente terapêutico de acordo com (13) acima, em que a 9 doença desmielinizante é uma doença selecionada de entre a esclerose múltipla, a doença de Devic, a esclerose concêntrica de Balo, a encefalomielite aguda disseminada (ADEM), a doença de Schilder, a panencefalite esclerosante subaguda (SSPE), a leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), a doença de Binswanger, a encefalopatia hipóxica, a mielinólise pontina central, o sindrome de Guillain-Barre, o sindrome de Fischer e a polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP), (15) o agente terapêutico de acordo com (13) ou (14) acima, em que a proteína de HGF é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, uma proteína possuindo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 e tendo substancialmente a mesma atividade que o HGF, ou um péptido que é um péptido parcial de uma das proteínas referidas e tem substancialmente a mesma atividade que o HGF, (16) o agente terapêutico de acordo com (13) ou (14) acima, em que a proteína de HGF é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (17) o agente terapêutico de acordo com qualquer uma das (13) a (16) acima, em que o agente é adaptado para o uso localizado num local de doença, (18) o agente terapêutico de acordo com (17) acima, em que o agente está na forma de uma preparação injetável para a administração intratecal, (19) o agente terapêutico de acordo com (17) acima, em que o agente está na forma de uma preparação injetável para a administração intratecal por uma bomba de libertação prolongada, (20) um método para o tratamento de uma doença desmielinizante, sendo o método composto pela administração 10 de uma dose eficaz de proteína de HGF a um paciente com uma doença desmielinizante, (21) a utilização de proteína de HGF para o fabrico de um agente terapêutico para o tratamento de uma doença desmielinizante, e (22) uma proteína de HGF para o tratamento de uma doença desmielinizante.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO O agente terapêutico aqui descrito produz efeitos terapêuticos notáveis contra as lesões da medula espinal e as doenças desmielinizantes. O agente terapêutico aqui descrito também tem a vantagem de que está livre dos problemas associados com a terapia génica. Além disso, o agente terapêutico aqui descrito tem a vantagem de que inibe e trata eficazmente a desmielinização dos nervos mielinizados, que ocorre nas lesões da medula espinal e nas doenças desmielinizantes (por exemplo, na esclerose múltipla). Além disso, uma vez que o agente terapêutico aqui descrito não requer a utilização de um vetor de vírus, tal como o HSV ou um adenovírus, não convida à desmielinização. Uma outra vantagem do agente terapêutico aqui descrito é que, ao contrário da terapia génica, a quantidade fornecida ou dose do ingrediente ativo de HGF pode ser facilmente ajustada, para além de que o tempo de administração pode ser ajustado, e a administração pode ser efetuada quer repetidamente ou continuamente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 mostra imagens de marcação de hematoxilina-eosina (HE) de tecido da medula espinal após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 200 pg/2 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal, e de tecido da medula espinal de 11 um grupo controlo. A fig. 2 mostra imagens de marcação de azul rápido Luxol (LFB) de tecido da medula espinal após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 200 pg/2 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal, e de tecido da medula espinal de um grupo controlo. A fig. 3 mostra imagens de marcação de 5-hidroxitriptamina (5HT) de tecido da medula espinal após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 200 pg/2 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal, e de tecido da medula espinal de um grupo controlo. A fig. 4 mostra imagens de marcação de 5HT e de proteína associada a crescimento-43 (GAP43) de tecido da medula espinal após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 200 ug/2 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal. A fig. 5 é um gráfico de linhas que mostra a pontuação de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 200 pg/2 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal, e de um grupo controlo. No gráfico, a seta indica o período de dosagem de proteína de HGF ou de PBS. A fig. 6 é um gráfico de linhas que mostra a pontuação BBB após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 400 pg/4 semanas de proteína de HGF começando imediatamente após a lesão da medula espinal, e de um grupo controlo. No gráfico, a seta indica o período de dosagem de proteína de HGF ou de PBS. 12 A fig. 7 é um gráfico de linhas que mostra a pontuação BBB após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 400 pg/4 semanas de proteína de HGF começando 4 dias após a lesão da medula espinal, e de um grupo controlo. No gráfico, a seta indica o período de dosagem de proteína de HGF ou de PBS. A fig. 8 é um gráfico de linhas que mostra a pontuação BBB após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 400 pg/4 semanas de proteína de HGF começando 2 semanas após a lesão da medula espinal, e de um grupo controlo. No gráfico, a seta indica o período de dosagem de proteína de HGF ou de PBS. A fig. 9 é um gráfico de linhas que mostra a pontuação BBB após uma lesão da medula espinal de um grupo de proteína de HGF, ao qual foi dado 400 pg/4 semanas de proteína de HGF começando 8 semanas após a lesão da medula espinal, e de um grupo controlo. No gráfico, a seta indica o período de dosagem de proteína de HGF ou de PBS.

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS A proteína de HGF utilizada na presente invenção é uma substância conhecida. Pode ser utilizada proteína de HGF preparada por qualquer um de vários métodos, desde que tenha sido purificada a um grau que permita a sua utilização como um medicamento. A proteína de HGF pode ser preparada através de, por exemplo, crescimento de células de cultura primária ou de células de uma linha celular estabelecida que produzem a proteína de HGF, seguido pela separação e pela purificação da proteína de HGF a partir do sobrenadante da cultura. Alternativamente, pode ser feito uso de uma técnica de engenharia genética, que implica a integração de um gene que codifica a proteína de HGF num vetor adequado, a inserção do vetor numa célula hospedeira adequada para efetuar a 13 transformação, e a obtenção da proteína recombinante desejada de HGF a partir de um sobrenadante de cultura do transformante (por exemplo, veja-se o pedido aberto de patente Japonesa N° H5-111382, e Biochem. Biophvs. Res. Commun. Vol. 163, p. 967 (1989)). A célula hospedeira não está sujeita a qualquer limitação particular. Por exemplo, pode ser feita uma utilização adequada de qualquer um de vários tipos de células hospedeiras, até agora empregues em técnicas de engenharia genética, tais como Escherichia coli, leveduras ou células de animais. A proteína de HGF assim obtida, desde que tenha substancialmente a mesma atividade que a proteína de HGF de origem natural, pode ter na sequência de aminoácidos da mesma um ou mais (por exemplo, de 1 a 8, o mesmo se aplica em seguida) aminoácidos substituídos, eliminados ou adicionados, ou pode ter igualmente cadeias de açúcar substituídas, eliminadas ou adicionadas. Exemplos de tais proteínas de HGF incluem a proteína de HGF do tipo-cinco-aminoácidos-eliminados descrita em seguida. Aqui, no que diz respeito à sequência de aminoácidos, a frase "um ou mais aminoácidos substituídos, eliminados ou adicionados" significa que um certo número (de um a uma pluralidade) de aminoácidos foram substituídos, eliminados ou adicionados por um método técnico conhecido, tal como uma técnica de engenharia genética, ou mutagénese em local específico, ou naturalmente. A proteína de HGF com cadeias de açúcar substituídas, eliminadas ou adicionadas pode ser, por exemplo, uma proteína de HGF obtida por tratamento de uma cadeia de açúcar adicionada a uma proteína de HGF natural com uma enzima ou semelhante, uma proteína de HGF em que a sequência de aminoácidos no local de adição da cadeia de açúcar foi alterada de modo a que a adição da cadeia de açúcar não ocorre, ou uma proteína de HGF em que a 14 sequência de aminoácidos foi alterada de modo a que uma cadeia de açúcar é adicionada num local diferente do local de adição da cadeia de açúcar natural.

Além disso, podem ser incluídas as proteínas que possuem pelo menos cerca de 80% de homologia, de preferência pelo menos cerca de 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia, com a sequência de aminoácidos da proteína de HGF, e atuando essencialmente como o HGF. Em ligação com as sequências de aminoácidos referidas anteriormente, "homologia" refere-se ao grau de concordância entre os resíduos de aminoácidos que formam as sequências de aminoácidos respetivas em comparação com as estruturas primárias das proteínas.

Exemplos das proteínas de HGF anteriores incluem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e 2. A proteína de HGF de SEQ ID NO: 2 é uma proteína de HGF do tipo-cinco-aminoácidos-eliminados, em que os cinco resíduos de aminoácidos a partir dos aminoácidos 161 a 165 na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 são eliminados. A proteína que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 é uma proteína de HGF natural de origem humana, que tem as atividades de mitogénio e de motogénio de HGF.

As proteínas que contêm uma sequência de aminoácidos que é substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, são proteínas contendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80%, de preferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2. Os exemplos preferidos incluem proteínas que atuam como o HGF e têm, em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, uma sequência de aminoácidos em que tenham sido inseridos ou eliminados de um a uma pluralidade 15 de resíduos de aminoácidos, uma sequência de aminoácidos em que foram substituídos com outros resíduos de aminoácidos de um a uma pluralidade de resíduos de aminoácidos, ou uma sequência de aminoácidos em que tenham sido modificados de um a uma pluralidade de resíduos de aminoácidos. Os aminoácidos inseridos ou substituídos podem ser outros aminoácidos não naturais que não os 20 tipos de aminoácidos codificados por genes. Os aminoácidos não naturais podem ser qualquer composto tendo um grupo amino e um grupo carboxilo, tal como o ácido γ-aminobutírico. Estas proteínas podem ser utilizadas isoladamente ou como misturas das mesmas. Exemplos de proteínas que contêm uma sequência de aminoácidos que é substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, incluem, mas não estão limitadas a, o HGF humano depositado na base de dados do NCBI (NCBI-GenBank Fiat File Release 164.0) sob os nos de acesso BAA14348 e AAC71655.

As proteínas de HGF que podem ser utilizadas na presente invenção são preferencialmente as proteínas descritas anteriormente de origem humana para a aplicação em seres humanos, apesar de também poder ser feito uso de proteínas de HGF de mamíferos que não o homem (por exemplo, do macaco, da vaca, do cavalo, do porco, da ovelha, do cão, do gato, do rato, do ratinho , dc i coelho, do hamster, da cobaia, e do chimpanzé). Os exemplos ilustrativos de tais proteínas de HGF incluem, mas não estão limitados a, os seguintes depositados em, por exemplo, a base de dados do NCBI: o HGF de ratinho (por exemplo, nos de acesso AAB31855, NP_034557, BAA01065, BAA01064), o HGF de rato (por exemplo, n° de acesso NP_58713 (a proteína que possui a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3) ) , o HGF de vaca (por exemplo, nos de acesso NP_001026921, BAD02475) , o HGF de gato (por exemplo, nos de acesso NP_001009830, BAC10545, BAB21499), o HGF de cão (por 16 exemplo, nos de acesso NP_001002964, BAC57560) , e o HGF de chimpanzé (por exemplo, n° de acesso XP 519174) . A proteína de HGF utilizada na presente invenção pode ter um grupo carboxilo (-COOH), um grupo carboxilato (-C00-), um grupo amida (-CONH2) ou um grupo éster (-COOR) na extremidade C-terminal. Aqui, o R no éster é exemplificado por grupos alquilo Ci-6 tais como o metilo, o etilo, o n-propilo, o isopropilo e o n-butilo, por grupos cicloalquilo C3-8 tais como o ciclopentilo e o ciclo-hexilo, por grupos arilo C6-12 tais como o fenilo e o naftilo, por grupos aralquilo C7-14 incluindo os grupos alquilo fenil-Ci_2 tais como o benzilo e o fenetilo, e os grupos alquilo a-naftil-Ci_2 tais como o a-naftilmetilo, e por grupos pivaroiloximetilo. A proteína de HGF para utilização de acordo com a presente invenção também inclui uma proteína de HGF tendo um grupo carboxilo (ou carboxilato) num outro local que não a extremidade C-terminal, quando o grupo carboxilo foi amidado ou esterifiçado. Neste caso o éster pode ser, por exemplo, os ésteres C-terminais mencionados anteriormente. As proteínas de HGF que podem ser utilizadas na invenção também incluem qualquer uma das proteínas mencionadas anteriormente, em que o grupo amino no resíduo de metionina da extremidade N-terminal é protegido com um grupo protetor (por exemplo, os grupos acilo C1-6 incluindo o formilo e, os grupos alcanoílo C2-6 tais como o acetilo) , em que o grupo glutamilo formado pela clivagem in vivo da extremidade N-terminal é convertido em ácido piroglutâmico, ou em que os grupos funcionais (por exemplo, -OH, -SH, um grupo amino, um grupo imidazol, um grupo indol, um grupo guanidina) nas cadeias laterais de aminoácidos na molécula são protegidos com grupos protetores apropriados (por exemplo, os grupos acilo C1-6 incluindo o formilo e, os grupos alcanoílo C2_6 tal como o acetilo), e 17 também as proteínas complexas, tais como as glicoproteínas obtidas pela ligação de cadeias de açúcar. A proteína de HGF utilizada na invenção pode estar na forma de um péptido parcial da mesma (por vezes referido abaixo simplesmente como "péptido parcial"). Exemplos de tais péptidos parciais incluem qualquer proteína que é um péptido parcial das proteínas de HGF referidas anteriormente, e que tem substancialmente a mesma atividade que o HGF. Na presente invenção, os péptidos parciais preferidos incluem os péptidos que contêm uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 20, preferivelmente pelo menos cerca de 50, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 aminoácidos, da sequência de aminoácidos que compõem a proteína de HGF mencionada anteriormente. Exemplos preferidos específicos incluem o péptido possuindo a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 32 até ao aminoácido 210 a partir do lado N-terminal da sequência de aminoácidos de HGF humano de SEQ ID NO: 1 (a sequência do laço de gancho da extremidade N- terminal no HGF até ao primeiro domínio kringle), e o péptido possuindo a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 32 até ao aminoácido 288 a partir do lado N-terminal da sequência de aminoácidos de HGF humano de SEQ ID NO: 1 (a sequência do laço de gancho da extremidade N-terminal no HGF até ao segundo domínio kringle) . No péptido parcial aqui descrito, a extremidade C-terminal pode ser um grupo carboxilo (-COOH), um grupo carboxilato (-COO-) , um grupo amida (-CONH2) ou um grupo éster (-COOR). Além disso, o péptido parcial, tal como com a proteína de HGF mencionada anteriormente, compreende os péptidos parciais nos quais um grupo amino do resíduo de metionina na extremidade N-terminal está protegido com um grupo protetor, os péptidos parciais nos quais Gin formado mediante a clivagem in vivo da 18 extremidade N-terminal é convertido em ácido piroglutâmico, os péptidos parciais nos quais os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos na molécula estão protegidos com grupos protetores adequados, e também os péptidos complexos, tais como os glicopéptidos, obtidos pela ligação de cadeias de açúcar.

Os sais das proteínas de HGF (incluindo aqueles sob a forma de péptidos parciais) que podem ser utilizados na invenção são sais fisiologicamente admissíveis com um ácido ou uma base. São especialmente preferidos os sais de adição de ácido fisiologicamente admissíveis. Exemplos ilustrativos de tais sais incluem os sais com ácidos inorgânicos (por exemplo, o ácido clorídrico, o ácido fosfórico, o ácido bromídrico, o ácido sulfúrico), e sais com ácidos orgânicos (por exemplo, o ácido acético , o ácido fórmico, o ácido propiónico, o ácido fumárico, o ácido maleico, o ácido succínico, o ácido tartárico, o ácido cítrico, o ácido málico, o ácido oxálico, o ácido benzoico, o ácido metanossulfónico, o ácido benzenossulfónico).

Quando a proteína de HGF utilizada na invenção está na forma de um péptido parcial, este péptido parcial pode ser preparado em conformidade com um método de síntese de péptidos conhecido, ou por clivagem de uma proteína de HGF com uma peptidase adequada. Exemplos de métodos de síntese de péptidos adequados incluem a síntese em fase sólida e a síntese em fase líquida. Nos casos em que os péptidos parciais ou os aminoácidos suscetíveis de constituir a proteína de HGF são condensados com as porções restantes, e o produto resultante tem grupos de proteção, o péptido alvo pode ser preparado por remoção dos grupos protetores. Os métodos de condensação conhecidos e os métodos de remoção dos grupos protetores incluem os descritos por, por exemplo, M. 19

Bodansky e Μ. A. Ondetti em Peptide Synthesis (Interscience Publishers: Nova Iorque, 1966), e por Schroeder e Luebke em The Peptide (Academic Press: Nova York, 1965). Após a reação, um péptido parcial da proteína de HGF pode ser purificado e isolado por um método convencional de purificação, tal como uma combinação da extração de solvente, uma destilação, uma cromatografia em coluna, uma cromatografia líquida e uma recristalização. Quando o péptido parcial obtido pelo método descrito anteriormente é um ácido ou uma base livre, ele pode ser convertido num sal adequado por um método conhecido. Inversamente, quando é obtido como um sal, ele pode ser convertido num ácido ou numa base livre por um método conhecido. A proteína de HGF utilizada na invenção é preferivelmente uma de origem humana para a aplicação em seres humanos, embora também possam ser utilizadas as proteínas de HGF derivadas de outros mamíferos que não o homem. Um exemplo de uma proteína de HGF de origem de rato adequada é apresentada em SEQ ID NO: 3.

Os agentes terapêuticos aqui descritos, que são agentes para o tratamento de lesões da medula espinal e agentes para o tratamento de doenças desmielinizantes, podem ser utilizados em todas as desordens neurológicas acompanhadas por uma lesão da medula espinal ou desmielinização. Exemplos específicos incluem a esclerose múltipla (MS), a doença de Device, a esclerose concêntrica de Balo, a encefalomielite aguda disseminada (ADEM), a doença de Schilder, a panencefalite esclerosante subaguda (SSPE), a leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), a doença de Binswanger, a encefalopatia hipóxica, a mielinólise pontina central, o síndrome de Guillain-Barre, o síndrome de Fischer e a polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória 20 crónica (CIDP). São também estão aqui englobadas as lesões da medula espinal com desmielinização associada.

Os agentes terapêuticos aqui descritos (agentes para o tratamento de lesões da medula espinal, e agentes para o tratamento de doenças desmielinizantes) podem ser utilizados não apenas em seres humanos, mas também noutros mamíferos para além dos seres humanos (por exemplo, em macacos, em vacas, em cavalos, em porcos, em ovelhas, em cães e em gatos) .

Quando os agentes terapêuticos aqui descritos (agentes para o tratamento de lesões da medula espinal, e agentes para o tratamento de doenças desmielinizantes) são para serem administrados a pacientes humanos ou animais, podem ser preparados em qualquer uma de diversas formas de dosagem, tais como medicamentos líquidos e medicamentos sólidos. Em geral, a proteína de HGF por si só ou em conjunto com um transportador convencional, é preparada sob a forma de, por exemplo, um fármaco injetável, uma pulverização, ou uma preparação de libertação prolongada (por exemplo, preparações de depósito). O fármaco injetável pode ser um fármaco injetável aquoso ou um fármaco injetável solúvel em óleo. Se o fármaco injetável é um fármaco injetável aquoso, a preparação pode ser efetuada em conformidade com um método conhecido, tal como por dissolução da proteína de HGF numa solução obtida por adição opcional a um solvente aquoso (por exemplo, a água para injeção, a água purificada) , de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, agentes de tonicidade (por exemplo, o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, a glicerina, o manitol, o sorbitol, o ácido bórico, o borato de sódio, a glicose, o propilenoglicol), de tampões (por exemplo, o tampão fosfato, o tampão acetato, o tampão borato, o tampão carbonato, o 21 tampão citrato, o tampão Tris, o tampão glutamato, o tampão epsilon-aminocaproato), de conservantes (por exemplo, o paraoxibenzoato de metilo, o paraoxibenzoato de etilo, o paraoxibenzoato de propilo, o paraoxibenzoato de butilo, o clorobutanol, o álcool benzilico, o cloreto de benzalcónio, o dehidroacetato de sódio, o edetato de sódio, o ácido bórico, o borato de sódio), de agentes espessantes (por exemplo, a hidroxietil celulose, a hidroxipropil celulose, o álcool polivinilico, o polietilenoglicol) , de estabilizantes (por exemplo, o bissulfito de sódio, o tiossulfato de sódio, o edetato de sódio, o citrato de sódio, o ácido ascórbico, o dibutil-hidroxitolueno) e de ajustadores de pH (por exemplo, o ácido clorídrico, o hidróxido de sódio, o ácido fosfórico, o ácido acético), seguido por filtração com um filtro ou semelhante e de esterilização, e depois por enchimento de um recipiente estéril. Pode também ser usado um auxiliar de dissolução adequado, tal como um álcool (por exemplo, o etanol), um poliálcool (por exemplo, o propileno glicol, o polietileno glicol), ou um agente tensioativo não iónico (por exemplo, o polissorbato 80, o óleo de rícino endurecido com polioxietileno 50) . Se o fármaco injetável é um fármaco injetável solúvel em óleo, pode ser utilizado como solvente de oleaginosa o óleo de sésamo ou o óleo de soja, e pode ser usado como auxiliar de dissolução o benzoato de benzilo ou o álcool benzilico. 0 fármaco injetável que foi preparado é introduzido geralmente numa ampola ou num frasco. O teor de proteína de HGF no fármaco injetável é geralmente ajustado a partir de cerca de 0,0002 a cerca de 2,0 % p/v, preferivelmente de cerca de 0,001 a cerca de 1,0 % p/v, e mais preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 % p/v. Além disso, é desejável que as preparações líquidas, tais como os fármacos injetáveis, sejam preservadas por congelação 22 ou sejam preservadas após a remoção de humidade por liofilização ou semelhantes. No momento da utilização, é adicionada à preparação liofilizada a água destilada para injeção, ou semelhante, de modo a dissolver o fármaco e prepará-lo para ser utilizado.

As pulverizações também podem ser preparadas em conformidade com a prática convencional das preparações medicinais. No caso da produção de uma pulverização, podem ser empregues quaisquer aditivos comummente utilizados em preparações para serem inaladas. Por exemplo, para além de um agente propulsor, pode ser feito uso dos solventes mencionados anteriormente, conservantes, estabilizantes, agentes de tonicidade e ajustadores de pH. Os agentes propulsores que podem ser utilizados incluem os agentes propulsores de gás liquefeito e de gás comprimido. Exemplos de agentes propulsores de gás liquefeito incluem os hidrocarbonetos fluorados (por exemplo, substitutos para os CFC, tais como HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a e HCFC142), o petróleo liquefeito e o éter dimetilico. Os exemplos ilustrativos de gases comprimidos incluem os gases solúveis (por exemplo, o dióxido de carbono, o óxido nitroso) e os gases insolúveis (por exemplo, o azoto gasoso). A proteína de HGF utilizada na invenção pode ser preparada como uma preparação de libertação prolongada (por exemplo, uma preparação de depósito) , em conjunto com um polímero biodegradável. Ao preparar a proteína de HGF em particular como uma preparação de depósito, podem ser esperados uma série de efeitos desejáveis, tal como uma diminuição no número de vezes que é administrada, uma boa duração dos efeitos terapêuticos, e o alívio dos efeitos secundários. Podem ser produzidas por um método conhecido ditas preparações de libertação prolongada. 0 polímero 23 biodegradável utilizado nesta preparação de libertação prolongada pode ser adequadamente selecionado de entre os polímeros biodegradáveis conhecidos, tais como os polissacáridos incluindo o amido, o dextrano, o hialuronano (ácido hialurónico) e os sais dos mesmos, as proteínas tais como o atelocolagénio, o colagénio e a gelatina, os poliaminoácidos tais como o ácido poliglutâmico, a polilisina, a polileucina, a polialanina e a polimetionina, o ácido poliláctico, o ácido poliglicólico, os copolímeros de ácido láctico - ácido glicólico, a policaprolactona, o ácido ροΐί-β-hidroxibutírico e o ácido polimálico, os poliésteres e os poliortoésteres tais como os copolímeros de ácido fumárico polietileno glicol - vinilpirrolidona, os ácidos polialquilcianoacrílicos tais como o ácido polimetil-a-cianoacrílico, e os policarbonatos tais como o carbonato de polietileno e o carbonato de polipropileno. Os poliésteres são os preferidos, e são especialmente preferidos os copolímeros de ácido láctico - ácido glicólico. Quando é usado o copolímero de ácido láctico - ácido glicólico, a razão de composição (ácido láctico / ácido glicólico) do mesmo, em % de moles, varia de acordo com o período de libertação prolongada pretendido. Por exemplo, para um período de libertação prolongada a partir de cerca de 2 semanas a cerca de 3 meses, e de preferência de cerca de 2 semanas até cerca de 1 mês, a razão está na gama de cerca de 100/0 a cerca de 50/50. O peso molecular médio do copolímero de ácido láctico - ácido glicólico é geralmente de cerca de 5.000 a cerca de 20.000. O copolímero de ácido láctico -ácido glicólico pode ser produzido por um método de produção conhecido, tal como o descrito no pedido aberto de patente Japonesa n° 61-28521. A razão de composição do polímero biodegradável e da proteína de HGF não está sujeita a 24 qualquer limitação particular. Por exemplo, a razão de proteína de HGF para o polímero biodegradável é tipicamente de cerca de 0,01 a cerca de 30 % p/p. A administração intratecal é realizada de preferência por, no caso de uma preparação injetável, injeção intratecal direta ou administração intratecal contínua com uma bomba de libertação prolongada. A dose é selecionada adequadamente de acordo com fatores tais como a forma de dosagem, a severidade da desordem e a idade do paciente, e é geralmente de 1 pg a 500 mg e, de preferência de 10 pg a 50 mg, por administração. O método de administração pode também ser selecionado adequadamente de acordo com a forma de dosagem, a severidade da desordem, a idade do paciente e outros fatores. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser dado como uma administração simples de uma só vez, como uma administração única prolongada por um período que varia entre cerca de 30 minutos a várias semanas (de preferência durante um período que varia de cerca de 24 horas a cerca de 2 semanas) . Alternativamente, a administração de uma só vez anterior ou a administração prolongada anterior pode ser administrada repetidamente, a intervalos espaçados. No caso de administração repetida, o intervalo de dosagem pode ser de uma vez por dia a uma vez a cada alguns meses. Por exemplo, no caso de administração intratecal prolongada com uma bomba de libertação prolongada (por exemplo, uma bomba osmótica), o intervalo de dosagem pode ser de várias semanas a vários meses. Dita administração prolongada tem a vantagem de que, uma vez que a proteína de HGF é libertada gradualmente ao longo de um período prolongado de tempo no local de lesão da medula espinal ou doença desmielinizante, o HGF atua ao longo de um período prolongado, permitindo que sejam alcançados ainda melhores efeitos terapêuticos. Uma vantagem adicional é 25 que um menor número de administrações alivia a carga sobre o paciente. Ainda uma outra vantagem é que, se necessário, pode ser fornecida proteína de HGF adicional à bomba osmótica implantada subcutaneamente. Tal como mencionado anteriormente, a administração intratecal é o método de administração, embora também sejam possíveis outros métodos de administração, tal como a administração intramuscular, a administração subcutânea ou a infusão por gotejamento. O período de administração é selecionado adequadamente de acordo com fatores tais como as formas de dosagem, a severidade da desordem e a idade do paciente. No caso de uma lesão da medula espinal, a administração tem lugar dentro de 14 dias, de acordo com a presente invenção, de preferência dentro de 7 dias, e mais preferivelmente dentro de 4 dias após a lesão ter sido sustentada. Em particular, em pacientes com lesões da medula espinal, dada a dificuldade para estabilizar o estado do paciente dentro de 72 horas após o trauma, é especialmente preferível que a administração tenha lugar a partir de cerca de 72 horas, e dentro de 4 dias após a lesão ter sido sustentada. 0 período de administração anterior inclui o início da administração no caso da administração prolongada, ou a administração inicial no caso da administração repetida.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são utilizados para descrever a invenção, embora a invenção não esteja limitada por estes exemplos. A proteína de HGF utilizada nos exemplos que se seguem foi uma proteína de HGF recombinante do tipo-cinco-aminoácidos-eliminados (SEQ ID NO: 2).

Exemplo 1 (Preparação de animais com lesão da medula espinal e administração da proteína de HGF) 26 (1) Preparação de animais com lesão da medula espinal

Em primeiro lugar, foi esterilizada uma bomba osmótica, pronta para utilização. Foi vertida proteína de HGF (concentração: 1 mg/ml, dissolvida em PBS) ou PBS (controlo) numa bomba mini-osmótica Alzet (Modelo 2002, fabricada por ALZA Corporation) . Foi ligado à saída da bomda um tubo de silicone (tubo de cateter, fabricado por Imamura Co., Ltd.) com um diâmetro interno de 0,3 mm e um diâmetro externo de 0,7 mm, cujo lúmen foi preenchido com proteína de HGF ou PBS, e a junção foi coberta com outro tubo de silicone (Imamura Co., Ltd.) com um diâmetro interno de 1,0 mm e um diâmetro externo de 2,0 mm, após o que a bomba e o conjunto do tubo foram incubados a 37 °C durante 12 horas, em seguida, foram fornecidos para utilização na experiência. Foram anestesiados ratos adultos Sprague-Dawley do sexo feminino (com idades no intervalo de cerca de 10 a 12 semanas, e com um peso corporal de cerca de 250 g) por administração intraperitoneal de 14 % p/v de hidrato de cloral, e a décima e a décima segunda vértebras torácicas foram laminectomizadas. Foi em seguida implantada uma bomba osmótica (previamente cheia com uma solução de proteína de HGF através do método descrito anteriormente) por via subcutânea no lado dorsal direito, e o tubo de cateter foi passado através da camada muscular da região subcutânea. Depois disso, a ponta do tubo de cateter foi avançada para a posição do arco da décima segunda vértebra torácica. Em seguida foi criada uma lesão por esmagamento de 200 kDyne no décimo segmento torácico da medula espinal usando um pêndulo IH (fabricado por Precision Systems). Depois disso, foram divididas em conjunto na direção do eixo crânio-caudal a dura-máter e a membrana aracnoideia do décimo segundo segmento torácico da medula espinal, a partir do qual o tubo de cateter foi inserido no 27 espaço subaracnoide, e a ponta do cateter foi avançada até ao ponto danificado da medula espinal. 0 cateter foi imobilizado na superfície interna e externa da camada muscular, com o adesivo cirúrgico Aron Alpha Sankyo (disponível a partir de Sankyo Co., Ltd.). Depois de o adesivo ter secado totalmente, a camada muscular e a pele foram suturadas, respetivamente, completando a operação.

(2) Administração da proteína de HGF

Após a operação (no seguimento da lesão por esmagamento), foi administrada por via intratecal uma solução de proteína de HGF durante 2 semanas, por meio da bomba osmótica descrita anteriormente (dose de proteína de HGF, 200 pg/2 semanas) . A um grupo controlo foi dado apenas PBS.

Exemplo 2 (Análise de tecidos e resultados)

Após um período pós-operatório fixo, os ratos foram anestesiados profundamente pela administração intraperitoneal de 14 % p/v de hidrato de cloral, após o que foi realizada perfusão a partir do ventrículo esquerdo do coração, primeiro com PBS e, em seguida, com 4 % p/v de paraformaldeído/PBS.

Foi removido um pedaço da medula espinal e fixado posteriormente em 4 % p/v de paraformaldeído/PBS durante 24 horas a 4 °C. A amostra de tecido foi imersa numa solução de sacarose/PBS a 10 % p/v e, em seguida, numa solução de sacarose/PBS a 30 % p/v, cada uma a 4 °C e durante 24 horas, após o qual foi incorporada no composto OCT (Sakura Fine Technical). 0 tecido incorporado foi congelado imediatamente em nitrogénio líquido, e foram preparados cortes congelados de 20 pm. Os cortes de tecido foram então corados com hematoxilina e eosina (HE), e foi realizado um exame histológico. Como resultado, tal como mostrado na fig. 1, a formação de cavidade devido à degeneração de neurónios 28 motores e morte celular foi claramente reprimida no grupo de proteína de HGF, em comparação com o grupo controlo, indicando assim gue foi suprimida a degeneração da medula espinal por esmagamento. (Coloração do revestimento de mielina e resultados)

Exemplo 3

Os cortes preparados pelo método descrito no exemplo 2 foram tratados com etanol a 95 % v/v, após o gue foram incubados a 60 °C durante 2 horas numa solução de azul rápido Luxor (LFB) . Após a remoção da incubadora, os cortes foram deixados em repouso para arrefecerem até à temperatura ambiente e, lavados com 95 % v/v de etanol e água destilada. Em seguida, foram repetidamente realizados o fracionamento com uma solução de carbonato de lítio e 70 % v/v de etanol e a lavagem com água destilada, até ter sido obtido um contraste adequado, após o que os cortes foram desidratados e selados, e foi examinado o revestimento de mielina. Tal como mostrado na fig. 2, a área de superfície do revestimento de mielina positiva para LFB no grupo de proteína de HGF foi maior do que no grupo controlo, indicando que foi suprimida a desmielinização devido a lesão da medula espinal.

Exemplo 4 (Análise imuno-histoquímica e resultados)

Os cortes preparados pelo método descrito no exemplo 2 foram corados com o anticorpo 5HT policlonal (diluição de 1:100) e com o anticorpo anti-GAP43 policlonal (diluição de 1:1000) . Ou seja, foi realizada uma hora de bloqueio à temperatura ambiente com PBS contendo 5 % v/v de soro de cabra e 0,1 % p/v de Triton X-100, após o que os cortes foram incubados durante a noite em solução de anticorpo, a 4 °C.

Estes cortes foram lavados com PBS, em seguida foram incubados à temperatura ambiente durante uma hora num 29 anticorpo secundário, que foi marcado por fluorescência com Alexa 488 (verde) e com Alexa 546 (vermelho (diluição de 1:1000), e selados em lâminas, e foram examinadas sob um microscópio de fluorescência as fibras nervosas positivas para 5HT e as fibras nervosas positivas para GAP43. Como resultado, tal como mostrado na fig. 3, as fibras nervosas positivas para 5HT mostraram-se significativamente mais abundantes 4 mm caudal ao local da lesão no grupo de proteína de HGF, em comparação com o grupo controlo. Além disso, tal como mostrado na fig. 4, houve uma boa concordância entre as localizações dos sinais positivos para 5HT e os sinais positivos para GAP43. O facto de as fibras nervosas positivas para 5HT serem responsáveis pela função motora após a lesão da medula espinal e que, em adultos, a GAP43 é expressa apenas em fibras nervosas regeneradas, indicou que a regeneração das fibras nervosas ligadas à função motora foi facilitada pela administração da proteína de HGF.

Exemplo 5 (Avaliação da função motora e resultados)

A função motora dos animais tratados com a proteína de HGF (200 pg/2 semanas) começando imediatamente após a lesão da medula espinal, pelo método descrito no exemplo 1, foi examinada utilizando um teste de campo aberto. O comportamento dos animais foi observado visualmente por uma pluralidade de observadores, e avaliado utilizando o sistema de pontuação de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB), no qual a função motora é avaliada numa escala de 21 etapas que varia de 0 (completamente paralisado) a 21 (normal) . A função motora dos membros posteriores foi avaliada durante 6 semanas no pós-operatório. Os resultados são mostrados na fig. 5. É evidente a partir da fig. 5, que foi observada uma recuperação funcional a partir de 4 dias após a lesão da 30 medula espinal no grupo de proteína de HGF, e foram observados efeitos de recuperação funcional significativos em comparação com o grupo controlo a partir de 5 semanas (p < 0,05).

Exemplo 6

Os animais com lesão da medula espinal foram preparados da mesma maneira tal como no exemplo 1, após o que foram realizadas uma implantação de uma bomba osmótica, preenchida com proteína de HGF (2 mg/ml, dissolvida em PBS) ou PBS (controlo), e a inserção de cateter. No pós-operatório (após a lesão por esmagamento), foi administrada por via intratecal com a bomba osmótica uma solução de proteína de HGF (dose de proteína de HGF, 400 pg/4 semanas) durante um período de 4 semanas. O grupo controlo recebeu apenas PBS. Foi realizada uma avaliação motora funcional, pelo método descrito no exemplo 5, até 9 semanas após a operação.

Os resultados são mostrados na fig. 6.

Como resulta evidente a partir da fig. 6, a recuperação funcional em animais tratados com a proteína de HGF foi significativamente promovida em comparação com os animais controlo. A diferença foi evidente a partir dos 4 dias após a lesão da medula espinal. Além disso, continuou a haver um aumento da pontuação BBB mesmo após a conclusão da administração da proteína de HGF.

Exemplo 7

Foram anestesiados ratos adultos Sprague-Dawley do sexo feminino (com idades no intervalo de cerca de 10 a 12 semanas, e com um peso corporal de cerca de 250 g) por administração intraperitoneal de 14 % p/v de hidrato de cloral, e foi criada uma lesão por esmagamento de 200 kDyne no décimo segmento torácico da medula espinal usando um pêndulo IH (fabricado por Precision Systems), originando 31 assim um animal com uma lesão na medula espinal. 0 animal com uma lesão na medula espinal foi operado novamente aos 4 dias, às 2 semanas ou às 8 semanas após a lesão por esmagamento, a fim de implantar uma bomba osmótica. Foi realizada uma nova operação. Foi implantada por via subcutânea uma bomba osmótica preenchida com proteína de HGF (2 mg/ml, dissolvida em PBS) ou PBS (controlo) pelo mesmo método que no exemplo 1, e o tubo de cateter foi inserido no espaço subaracnoide, após o que a ponta do tubo de cateter foi avançada até ao ponto danificado da medula espinal, e finalmente o cateter foi imobilizado. Começando 4 dias, 2 semanas ou 8 semanas após a lesão por esmagamento, foi administrada por via intratecal a partir da bomba osmótica a solução de proteína de HGF, durante um período de 4 semanas (dose de proteína de HGF: 400 pg/4 semanas). No grupo controlo foi administrado apenas PBS. Foi realizada uma avaliação da função motora ao longo do tempo, pelo mesmo método que no exemplo 5. Os resultados são mostrados nas figuras 7, 8 e 9.

No grupo de animais em que o tratamento com HGF foi iniciado a partir dos 4 dias após a lesão por esmagamento, como resulta evidente a partir da fig. 7, foi observada uma recuperação funcional mais rápida do que nos animais controlo.

No grupo de animais em que o tratamento com HGF foi iniciado 2 semanas após a lesão por esmagamento, como resulta evidente a partir da fig. 8, foi observado o efeito de promoção da recuperação funcional 2 semanas após o início do tratamento de HGF (4 semanas após a lesão por esmagamento), em comparação com o grupo controlo.

No grupo de animais em que o tratamento com HGF foi iniciado 8 semanas após a lesão por esmagamento, como resulta evidente a partir da fig. 9, não foi observada nenhuma diferença na 32 recuperação funcional entre os animais que receberam a proteína de HGF e os animais controlo.

Exemplo de preparação 1

Foi dissolvido um copolímero de ácido láctico - ácido glicólico (1,9 g, ácido láctico / ácido glicólico = 50/50, peso molecular médio = 10.000, disponível a partir de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em 3,0 ml de diclorometano. Em seguida, foram adicionadas a esta solução de solvente orgânico 100 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF, e finamente moído utilizando um moinho misturador (Retsch Technology), preparando-se assim uma dispersão de proteína de HGF. A dispersão foi adicionada a 800 ml de uma solução aquosa de álcool polivinílico a 0,1 % p/v e, em seguida agitada e homogeneizada utilizando um homogeneizador. O diclorometano foi evaporado às 3 horas de agitação à temperatura ambiente, após o que foram recolhidas as microcápsulas por centrifugação a cerca de 2000 rpm. As microcápsulas foram então lavadas duas vezes com 400 ml de água destilada, após o que foram adicionadas 0,2 g de D-manitol e, foi realizada a liofilização. Para remover o solvente residual foi realizada secagem sob vácuo durante 3 dias a 40 °C, originando assim as microcápsulas de libertação prolongada contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 5,3 % p/p).

Exemplo de preparação 2

Um copolímero de ácido láctico - ácido glicólico (1,89 g, ácido láctico / ácido glicólico = 50/50, peso molecular médio = 10.000, disponível a partir de Wako Pure Chemical

Industries, Ltd.) e 10 mg de óxido de zinco foram dissolvidos em 3,0 ml de diclorometano. Em seguida, foram adicionadas a esta solução de solvente orgânico 100 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF, e finamente moído utilizando um moinho 33 misturador (Retsch Technology) , preparando-se assim uma dispersão de proteína de HGF. A dispersão foi adicionada a 800 ml de uma solução aquosa de álcool polivinílico a 0,1 % p/v e, em seguida agitada e homogeneizada utilizando um homogeneizador. O diclorometano foi evaporado às 3 horas de agitação à temperatura ambiente, após o que foram recolhidas as microcápsulas por centrifugação a cerca de 2000 rpm. As microcápsulas foram então lavadas duas vezes com 400 ml de água destilada, após o que foram adicionadas 0,2 g de D-manitol e, foi realizada a liofilização. Para remover o solvente residual foi realizada secagem sob vácuo durante 3 dias a 40 °C, originando assim as microcápsulas de libertação prolongada contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 5,3 % p/p).

Exemplo de preparação 3

Foi dissolvido um copolímero de ácido láctico - ácido glicólico (1,7 g, ácido láctico / ácido glicólico = 75/25, peso molecular médio = 15.000, disponível a partir de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em 2,7 ml de diclorometano. Em seguida, foram adicionadas a esta solução de solvente orgânico 300 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF, e finamente moído utilizando um moinho misturador (Retsch Technology), preparando-se assim uma dispersão de proteína de HGF. A dispersão foi adicionada a 800 ml de uma solução aquosa de álcool polivinílico a o, 1 % p/v e, em seguida agitada e homogeneizada utilizando um homogeneizador. 0 diclorometano foi evaporado às 3 horas de agitação à temperatura ambiente, após o que foram recolhidas as microcápsulas por centrifugação a cerca de 2000 rpm. As microcápsulas foram então lavadas duas vezes com 400 ml de água destilada, após o que foram adicionadas 0,2 g de D-manitol e, foi realizada a liofilização. Para remover o 34 solvente residual foi realizada secagem sob vácuo durante 3 dias a 40 °C, originando assim as microcápsulas de libertação prolongada contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 17,6 % p/p).

Exemplo de preparação 4

Um copolímero de ácido láctico - ácido glicólico (1, 69 g, ácido láctico / ácido glicólico = 75/25, peso molecular médio = 15.000, disponível a partir de Wako Pure Chemical

Industries, Ltd.) e 10 mg de óxido de zinco foram dissolvidos em 2,7 ml de diclorometano. Em seguida, foram adicionadas a esta solução de solvente orgânico 300 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF, e finamente moído utilizando um moinho misturador (Retsch Technology), preparando-se assim uma dispersão de proteína de HGF. A dispersão foi adicionada a 800 ml de uma solução aguosa de álcool polivinílico a 0,1 % p/v e, em seguida agitada e homogeneizada utilizando um homogeneizador. 0 diclorometano foi evaporado às 3 horas de agitação à temperatura ambiente, após o que foram recolhidas as microcápsulas por centrifugação a cerca de 2000 rpm. As microcápsulas foram então lavadas duas vezes com 400 ml de água destilada, após o que foram adicionadas 0,2 g de D-manitol e, foi realizada a liofilização. Para remover o solvente residual foi realizada secagem sob vácuo durante 3 dias a 40 °C, originando assim as microcápsulas de libertação prolongada contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 17,8 % p/p).

Exemplo de preparação 5

Foi dissolvido um polímero de ácido DL-láctico (5 g, ácido láctico / ácido glicólico = 100/0, peso molecular médio = 5000, disponível a partir de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em 50 ml de cloreto de metileno, preparando-se assim uma solução a 10 % p/v. Em seguida, foram adicionadas à 35 solução 2,5 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF. A mistura resultante foi então adicionada a uma solução aquosa de quitosano a 0,5 % p/v, que tinha sido aquecida separadamente a 40 °C, após o que foram realizadas agitação e emulsificação a uma velocidade de agitação de 1000 rpm utilizando um homogeneizador. A emulsão resultante foi agitada durante mais 3 horas à temperatura ambiente para evaporar o cloreto de metileno, após o que foram recolhidas por centrifugação a aproximadamente 2000 rpm as microesferas que se formaram. As microesferas foram lavadas cinco vezes com água destilada que tinha sido pré-aquecida a 40 °C, em seguida foram secas sob vácuo à temperatura ambiente, originando assim as microesferas contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 0,05 % p/p). Exemplo de preparação 6

Foi dissolvido um copolímero de ácido láctico - ácido glicólico (10 g, ácido láctico / ácido glicólico = 75/25, peso molecular médio = 5000, disponível a partir de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em 200 ml de cloreto de metileno / etanol (4:1), preparando-se assim uma solução a 5 % p/v.

Foram adicionadas a esta solução 2,5 mg de um pó liofilizado de proteína de HGF. A mistura resultante foi adicionada um pouco de cada vez, sob agitação com um homogeneizador a uma velocidade de 500 rpm, a uma solução aquosa de gelatina a 1 % p/v, que tinha sido aquecida separadamente a 40 °C, efetuando-se assim a emulsificação. A emulsão resultante foi agitada adicionalmente à temperatura ambiente durante 3 horas para evaporar o cloreto de metileno e o etanol, após o que foram recolhidas por centrifugação a aproximadamente 2000 rpm as microesferas que se formaram, foram lavadas cinco vezes com água destilada que tinha sido pré-aquecida a 40 °C, e foram secas sob vácuo à temperatura ambiente, originando 36 assim as microesferas contendo a proteína de HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 0,025 % p/p)

Exemplo de preparação 7

Uma solução aquosa de proteína de HGF a 2 % p/v (0,2 ml) foi misturada com 2 ml de uma solução de tampão fosfato de atelocolagénio a 2%, e liofilizada. O material liofilizado foi fraturado a baixa temperatura utilizando azoto líquido, e depois colocado num molde e, moldado por compressão para formar uma preparação cilíndrica de libertação prolongada contendo HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 10 % p/p) -

Exemplo de preparação 8

Uma solução aquosa de proteína de HGF a 0,01 % p/v (100 ml) e 50 g de uma solução aquosa de colagénio a 2 % p/v foram uniformemente misturadas em conjunto e agitadas, e depois liofilizadas. O material liofilizado foi fraturado a baixa temperatura utilizando azoto líquido, após o que o material fraturado foi moldado por compressão numa vara, originando assim uma preparação de libertação prolongada contendo HGF (proporção de HGF com base no biopolímero: 1 % p/p).

Exemplo de preparação 9

Foi dissolvida proteína de HGF (1 mg) em 2 ml de uma solução de atelocolagénio a 2 % p/v, após o que foi realizada a liofilização. O composto resultante foi fraturado, e em seguida moldado por compressão numa forma cilíndrica, dando uma preparação de libertação prolongada contendo HGF (proporção de HGF com base no biopolímero, 2,5 % em peso). Exemplo de preparação 10 O sal de sódio do ácido hialurónico (0,58 g, viscosidade intrínseca, 4500 cc/g) foi misturado com 20 ml de água e feito inchar. Em seguida foram adicionados a esta mistura 2 ml de hidróxido de sódio a 2 N e, realizou-se agitação para 37

dar uma solução uniforme. Foi então adicionada e agitada divinilsulfona (0,10 g) em 2,4 ml de água. A mistura resultante foi deixada em repouso durante 70 minutos, após o que o gel que se formou foi colocado em 223 ml de uma solução tampão de Biotris (um tampão fosfato contendo 0,15 M de NaCl e tendo um pH de cerca de 7,2), e foi induzido inchaço durante 3 horas. Em seguida foi adicionado a esta mistura 1 ml de HC1 a 2 N. Depois de 1 hora foram adicionados 0,6 ml de HC1 a 2 N e, a mistura foi deixada em repouso durante 16 horas. Isto foi seguido pela adição de 0,35 ml de HC1 a 2 N, após o que o gel inchado foi agitado lentamente na solução tampão durante 3 dias. Foi obtido um gel suave com propriedades viscoelásticas uniformes. O gel foi dializado com NaCl a 0,15 M, durante 5 dias. O gel foi então misturado com 1 % p/v de proteína de HGF em solução salina tamponada, de modo a ajustar a concentração final de proteína de HGF a 0,25 % p/v, dando assim uma preparação contendo HGF

(proporção de HGF com base no biopolímero: 25 % p/v). APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção proporciona um agente útil para o tratamento de lesões da medula espinal e de doenças desmielinizantes. 38

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> KE10 UNIVERSITY OSAKA UNIVERSITY KRINGLE PHARMA INC.

<120> AGENTE TERAPÊUTICO PARA LESÕES DA MEDULA ESPINAL <130> K12F2684 <150> PCT/JP2007/053804 <151> 28-02-2007 <160> 3

<210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 39

Met Trp Vai Thr Lys Leu Leu Pro AM Leu Leu Leu Gin His Vai Leu 1 5 10 15 Leu Hi s Leu Leu Leu Leu Pro Me Ala lie Pro Tyr Ala Glu Gly Gin 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr 1 le His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu 1 le Lys lie Asp Pro Ala Leu Lys lie Lys Thr Lys Lys Vai 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gin Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Uet Ser Ser Gly Vai Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr 1 le Arg Asn Cys 115 120 125 lie He Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Vai Ser 1 le Thr Lys 130 135 140 Ser Gly lie Lys Cys Gin Pro Trp Ser Ser Het 1 le Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Vai Arg Tyr Glu Vet Cys Asp 1 le Pro Gin Cys Ser Glu 195 200 205 Vat Gtu Cys Het Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Uet Asp 210 215 220 Hts Thr Glu Ser Gly Lys lie Cys Gin Arg Trp Asp Hts Gin Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala lie Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Uet Asn Asp Thr Asp Vai Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Me Gin Gly Gin Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Vai Asn Thr Me 305 310 315 320 40

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp «et Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Vai Gly Tyr Cys Ser Gin Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gin Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gin Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Het Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Uet Glu Asp Leu His Arg Hís Ile Phe Trp Glu Pro Asp A1 a 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro (le Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Vai Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Vai Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gin Leu Arg Vai Vai 455 490 495 As η Gly lie Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Uet Vai Ser Leu Arg 500 SOS 510 Tyr Are Asn Lys Hís Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Vai Leu Thr Ala Arg Gin Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Vai His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gin Vai Leu Asn Vai Ser Gin Leu Vai Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Vat Leu Het Lys Leu Ala Arg Pro Ala Vai Leu Asp Asp 550 585 590 Phe Vai Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Th r Ser Cys Ser Vai Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu He Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Vai Ala His Leu Tyr 1 le Uet Gly Asn Glu 525 630 635 640 Lys Cys Ser Gin His His Arg Gly Lys Vai Thr Leu Asn Glu Ser Glu 545 650 655 1 le Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Vai Cys Glu Gin His Lys Uet Arg Het Vai Leu 675 680 685 Gly Vai ile Vai Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 1 le Phe Vai Arg Vai Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Vai PrD Gtn Ser 725 41 <210> 2 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 42

Met Trp Vai Thr Lys Leu Leu Pro AU Leu Leu Leu Gin His Vai Leu 1 5 10 15 Leu Hi s Leu Leu Leu Leu Pro 11« AU lie Pro Tyr Ala Glu Gly Gin 20 25 30 Are Lys Are Arg Asn Thr lie His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu lie Lys lie Asp Pro AU Leu Lys lie Lys Thr Lys Lys Vai 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys AU Arg Lys Gin Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Mel Ser Ser Gly Vai Lys Lys Glu Phe too 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr 1 te Arg Asn Cys 115 120 125 lie lie Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Vai Ser 1le Thr Lys 110 135 140 Ser Gly lie Lys Cys Gin Pro Trp Ser Ser Uet lie Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Vai Arg 100 185 190 Tyr Glu Vai Cys Asp lie Pro Gin Cys Ser Glu Vai Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys 11e Cys Gtn Arg Trp Asp His Gin Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala lie Lys Thr Cys AU Asp Asn Thr Met 2T5 280 285 Asn Asp Thr Asp Vai Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys lie Gin Gly Gin 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Vai Asn Thr lie Trp Asn Gly 1le Pro 305 310 315 320 Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn 1 le Arg 355 360 365 Vai Gly Tyr Cys Ser Gin lie Pro Asn Cys Ase Met Ser His Gly Gin 3T0 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gin 38S 390 395 400 43

Tbr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Uet Trp Asp Lys Asn Uet Giu Asp 405 410 415 Leu His Arg His Me Phe Trp Glu Pro Asp AU Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu lie Pro Trp Asp Tyr Cys Pro 1 le Ser Arg Cys 450 455 460 Gíu Gly Asp Thr Thr Pro Thr 1 le Vai Asn Leu Asp His Pro Vai Ile 4S5 470 475 480 Ser Cys AU Lys Thr Lys Gin Leu Arg Vai Vai Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 Arg Thr Asn 1 le Gly Trp Uet Vai Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 Me Cys Gly Gly Ser Leu Me Lys Glu Ser Trp Vai Leu Thr Ala Arg 515 520 525 Gin Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu AU Trp Leu Gly 530 535 540 lie His Asp Vai His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gin Vai Leu 545 550 555 560 Asn Vai Ser Gin Leu Vai Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Vai Leu 565 570 575 Met Lys Leu Ala Arg Pro AU Vai Leu Asp Asp Phe Vai Ser Thr Me 580 585 590 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr 1 le Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 Vai Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu lie Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Vai Ala His Leu Tyr lie Uet Gfy Asn Glu Lys Cys Ser Gin His 625 630 635 640 His Arg Gly Lys Vai Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys AU Gly Ala 645 650 655 Glu Lys lie Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 Vai Cys Glu Gin His Lys Uet Arg Het Vai Leu Gly Vai Ile Vai Pro 675 680 685 Gly Arg Gly Cys Ata lie Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Vai Arg Vai 690 695 700 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp lie His Lys 1 le lie Leu Thr Tyr Lys Vai 705 710 7)5 720

Pro Gin Ser 44

<210> 3 <211> 728 <212 > PRT <213> Rattus norvegicus < 4 0 0 > 3

Met Uet Trp Gly Thr Lys Leu Leu Pro Vai Leu Leu Leu Gin His Vai 15 10 15

Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Vai Thr Me Pro Tyr Ala Glu Gly 20 25 30

Gin Lys Lys Arg Arg Asn Thr Leu His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 35 40 45

Thr Thr Leu Thr Lys Glu Asp Pro Leu Vai Lys lie Lys Thr Lys Lys 45 60 65 ¢0

Vai Asn Ser Ala Asp Glu Cys Ala Asn Arg Cys 1 le Arg Asn Lys Gly 66 70 75 80 Phe Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg 85 90 95 Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn Ser llet Ser Ser Gly Vai Lys Lys Gly 100 105 110 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr 1 le Arg Asn 115 120 125 Cys 11 a lie Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Lys Gly Thr Vai Ser 1 le Thr 130 135 140 Lys Ser Gly 1 la Lys Cys Gin Pro Trp Asn Ser Het 1 le Pro His Glu 145 150 155 ISO His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu ASn 165 170 175 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr ISO 185 190 Ser Asn Pro Glu Vai Arg Tyr Glu Vai Cys Asp 1 le Pro Gin Cys Ser 195 200 205 Glu Vai Glu Cys Het Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Pro Het 210 215 220 Asp His Thr Glu Sor Gly Ly» Thr Cys Gin Arg Trp Asp Gin Gin Thr 225 230 235 240 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 245 250 255 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro Arg Pro Trp Cys 260 265 270 Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys Ala lie Lys Net 275 2S0 285 Cys Ala His Ser Ala Vai Asn Glu Thr Asp Vai Pro Het Glu Thr Thr 290 295 300 Glu Cys lie Lys Gly Gin Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Thr Asn Thr 305 3T0 315 320 Ite Trp Asn Gly 1 le Pro Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His 325 330 335 Lys His Asp 1 le Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 340 345 350 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 355 360 365 Thr Asp Pro Asn 1 le Arg Vai Gly Tyr Cys Sar Ctn lie Pro Lys Cys 370 375 380 Asp Vai Ser Ser Gly Gin Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 385 390 395 400 Het Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 405 410 415 Asp Lys Asn Hat. Glu Asp Leu Hi s Arg His lie Phe Trp Glu Pro Asp 420 425 430 Ala Ser Lys Leu Thr Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 435 440 445 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Vai Pro Trp Asp Tyr 450 455 460 Cys Pro lie Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr lie Vai Asn 4(5 470 475 480 46

Leu Asp Hi s Pro Vai 1 le Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gin Leu Arg Vai 485 490 495 Vai Asn Gly lie Pro Thr Gin Thr Thr Vai Gly Trp Mel Vai Ser Leu 500 505 510 Lys Tyr Arg Asn Lys Kis 1 le Cys Gly Gly Ser Leu lie Lys Glu Ser 515 520 525 Trp Vai Leu Thr Ala Arg Gin Cys Phe Pro Ala Arg Asn Lys Asp Leu 530 535 540 Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 1 le Hís Asp Vai His Glu Arg Gly 545 550 555 560 Glu Glu Lys Arg Lys Gin 1 le Leu Asn lie Ser Gin Leu Vai Tyr Gly 565 570 575 Pro Glu Gly Ser Asp Leu Vai Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro Ala lie 560 585 590 Leu Asp Asn Phe Vai Ser Thr 1 le Asp Leu Pro Ser Tyr Gly Cys Thr 595 600 605 lie Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser 1 le Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly 610 615 620 Leu lie Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Vai Ala His Leu Tyr 1 le Met 625 630 635 640 Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gin Hís His Gin Gly Lys Vai Thr Leu Asn 645 650 655 Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gty Ala Glu Lys 1 le Gly Ser Gly Pro Cys 660 665 670 Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 1 le Cys Glu Gin His Lys Met Arg 675 680 685 lllet Vai Leu Gly Vai lie Vai Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ele Pro Asn 630 695 700 Arg Pro Gly lie Phe Vai Arg Vai Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp fie Hjs 705 710 715 720 Lys Vai lie Leu Thr Tyr Lys Leu

72S 47

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • WO 03045439 A [0005] [0006] • WO 05100577 A [0010] • WO 2006077675 AI [0010] • JP H5111382 B [0016] • JP 61028521 A [0029] • JP 2007053804 W [0051]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1984, vol. 122, 1450- 1459 [0004] • Nature, 1989, vol. 342, 440-443 [0004] • Nat. Neurosci., 1999, vol. 2, 213-217 [0004] • Clin. Chim Acta., 2003, vol. 327, 1-23 [0004] • The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, 25 August 2005, vol. 79 (8), pS764 [0007] • The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, 25 August 2005, vol. 79 (8), S764 [0008] • KITAMURA. The Journal of the Japanese Orthopaedic Association, 2006, vol. 80 (8), 884 [0010] • KITAMURA. Journal of the Japan Spine Research Society, 2006, vol. 17 (1), 557 [0010] • KATO et al. Neuroscience Research, 2005, vol. 52, 299- 310 [0010] 48 • SHI et al. J. Thoracic and Cardiovasc. Surgery, 2006, vol. 132 (4), 941-947 [0010] • Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, vol. 163, 967 [0016] • M. BODANSZKY ; M.A. ONDETTI. Peptide Synthesis.

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína HGF para utilização num método para o tratamento de lesões da medula espinal, o método compreendendo a administração por via intratecal de HGF a um paciente com lesão da medula espinal, no espaço de 2 semanas após a lesão da medula espinal.

2. Proteína HGF para utilização de acordo com a reivindicação 1, o método compreendendo a administração de HGF após 72 horas da lesão da medula espinal.

3. Proteína HGF para utilização de acordo com a reivindicação 1, o método compreendendo a administração de 10 pg a 50 mg de HGF, numa administração de uma só vez.

4. Proteína HGF para utilização de acordo com a reivindicação 1, o método compreendendo a administração de 10 pg a 50 mg de HGF, em administração prolongada durante um período que varia de 30 minutos a várias semanas.

5. Proteína HGF para utilização de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a administração de uma só vez ou a administração prolongada é repetida uma vez por dia a uma vez a cada vários meses.

6. Proteína HGF para utilização de acordo com a reivindicação 1, o método compreendendo a administração de HGF num fármaco injetável contendo de 0,0002 a 2,0% em p/v de HGF.