CA1221653A - Procede et dispositif pour l'encapsulation dans les erythrocytes d'au moins une substance a activite biologique, notamment des effecteurs allosteriques de l'hemoglobine et erythrocytes ainsi obtenus - Google Patents

Abstract

"Procédé et dispositif pour l'encapsulation dans les érythrocytes d'au moins une substance à activité biologique, notamment des effecteurs allostériques de l'hémoglobine et érythrocytes ainsi obtenus" Invention de : ROPARS Claude NICOLAU Yves Claude CHASSAIGNE Maurice CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) CENTRE HOSPITALIER REGIONAL DE TOURS STUDIENGESEILSCHAFT KOHLE MbH L'invention concerne un procédé d'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce que l'on alimente en continu le compartiment primaire d'au moins un élément de dialyse avec une suspension aqueuse d'érythrocytes, dont le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes, en ce que le lysat d'érythrocytes est alors en contact avec ladite substance présentant une activité biologique et en ce que, afin de resceller la membrane des érythrocytes, on augmente la pression osmotique et/ou oncotique du lysat érythrocytaire après sa mise en contact avec ladite substance à activité biologique.

Description

122~653 .
La présente lnvention, réalis~e en collaboration avec le CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTI~IQUE, le CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE repxésent~
par le CENTRE HOSPITALIER REGIONAL DE TOURS, et le STUDIENGESELLSCHAFT XOHLE mbH, concerne un procédé
d'encapsulation dans les ~rythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité bioIogique, un dispositif utile pour la mise en oeuvre de ce procedé et les érythrocytes obtenus.
Préalablement à l'exposé de la presente ~-invention, il peut etre interessant de rappeler certaines notions en la matiere.
Le sang est un melange complexe constitué
d'un liquide, le plasma, dans lequel sont en suspension des globules rouges (erythrocytes) transportant l'oxygene, des globules blancs (leucocytes) et les plaquettes. Le plasma contient en solution des sels, des proteines et des metabolites solubles qui s'echangent dans les differents tissus.
Dans le cadre de la presente invention, seuls les érythrocytes nous int~ressent.
De façon simplifiée, on peut considerer que les ~rythrocytes sont constitues d'une membrane qui entoure un cytoplasme rempli essentiellement ~ -d'h~moglobine. ~ ~
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2 1z2~653 Le rBle de l'h~moglobine est de se combiner l'oxyg~ne mol~culaire pendant le passage des ~rythrocytes travers les poum~ns et de transporter cet oxya~ne tous les tissus du corps pour qu'il y solt utills~.
Comme pour toutes les cellulcs, les ~rythrocytes peuvent être lysés dans certaines conditions, en particulier de pression osmotique, mais c'est en ~952 que Teorrel a introduit la notion de rescellement de la membrane ~rythrocytaire, c'est-~-dire de la reconstitution ~0 de la membrane ~rythrocytaire apr~s une lyse des ~rythrocytes.
Dans la mesure où il devenait ainsi possible d'ouvrir et de refermer les érvthrocytes, il devait donc être possible d'y introduire certains composants exog~nes.
Outre la technique de base qui consiste ~ mettre les érythrocytes dans une solution contenue dans un récipient dont on fait successivement chanqer la pression osmotique afin d'effectuer la lyse puis le rescellement, il faut citer certains procédés mettant en oeuvre une lyse en milieu iso-osmotique en appliquant aux érythrocytes un choc ~lectrique ou thermique. Dans certains cas il a également été utilisé des virus ou des prot~ines virales afin de réaliser cette encapsulation.
Il a également ~té r~alisé des encapsulations par dialyse dans un sac de cellophane. Tous les proc~d~s utilisés précédemment ont en commun de présenter des rendements d'encapsulation faibles, d'etre excessivement aléatoires quant à leur reproductibilité, et de ne permettre de traiter que des quantités faibles de suspensionsérythr~cytaires.
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' ' ' 3 lZ21653 Ainsi, bien que l~on ait rappor.te l'encapsu-lation de certaines enzymes, du facteur IX, de la desferrioxamine, des acides organiques, du glucose, du saccharose, du fragment A de l'anti-toxine diphtérique et du'methothrexate, ces procedes sont restes au stade du'laboratoire et n'ont pas permis jusqu'~ present leur utilisation chez l'homme.
SeuIe une publication récente de Green R. et al.
(The Lancet (1980?, 16~aout, 327-330) decrit l'encap-sulation de Desferal ~ (commercialise par CIBA-GEIGY) et l'utilisation des erythrocytes obtenus chez l'homme.
Cette encapsuIation ayant ete realisee parsimple dilution en milieu'hypo-osmotique montre toutefois des rendements très faibles d'incorporation du Desferal dans les erythrocytes.
C'est pourquoi la presente invention a pour but la mise au point d'un procede et d'un dispositif perm.ettant de realiser l'encapsulation dans les - :
erythrocytes de substances presentant une activite 20. biologique avec un rendement d'encapsulation très ~ eleve et permettant de traiter des grandes quantites de suspensions d'erythrocytes tout en assurant le maintien de bonnes conditions de sterili*e qui permettent d'utiliser les.erythrocytes ainsi obtenus chez l'homme ou l'animal. ' Bien que la presente invention ait ete developpee pour l'encapsuIation d'un grand nombre de composes'.a activite biologique, 'l'une des classes de composes à activite biologique paralt plus particuli~re- .
ment interessante, il s'agit des effecteurs allosteriques de .l'hemoglobine.
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4 ~Z21653 .
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L'h~mogloh~ne forme avec l'oxyg~ne au niveau des poumons un produit d'addition r~éverslhle :
l'oxyh~moglobine.
Ce prodult d'addition se d~compose au niveau du sy~t~me ca~illaire pour lib~rer l'oxyg~ne car la pression partielle de l'oxyg~ne dans le système capillaire est plus faible (de l'ordre de 70 mm de Hg) gue dans les poumons (de l'ordre de l~o mm de Hg).
Dans les conditions normales, seule une partie, environ 25 ~, de l'hémoglobine se dissocie, le reste retourne aux poumons par le système veineux.
In vitro, il a été possible de montrer le rôle de certaines substances comme l'inositol hexaphosphate (IHP), l'inositol pentaphosphate (IPP), le pyridoxal phosphate, par exemple, qui sont susceptibles de se combiner avec l'hémoglobine au niveau du site de fixation du 2,3-diphosphoglycérate.
Ces produits dénommés "effecteurs allostérigues de l'hem~lobine" (EAH) modifient la conformation allostérique ae l'hémoglobine, ce qui a pour effet de diminuer l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxyg~ne.
La diminution ~e l'affinit~ de l'hémoglobine pour l'oxygène rend plus facile la libération de l'oxygène à partir de l'oxyhémoglobine, même pour des pressions partielles d'oxygène relativement élevées.
Dans ces conditions, sans que le contenu global en oxygène du sang soit notablement modifié, il est possible d'envisager d'accroître le pouvoir oxvphorique du sang vis ~ vis des tissus en utilisant des globules rouges comportant une hémoglobine modifiée.
Ce type de traitement de l'hémoglobine permet une meilleure oxyaénation du tissu par amélioration de la lib~ration de l'oxya~ne.
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On con~oit que les applications de ces effecteur6 allost~rlques de l'h~moglob~ne puissent ~tre nombreuses, par exemple dans le traitemcnt de certaines affectionS
telles que les insuffisances respiratoires, les troubles circulatoires, ou bien ~our améliorer ou accélérer certains processus th~rapeutiques, par exemple dans la pr~vention ae l'infarctus ~u myocarde lié ~ certaines isch~mies, ou pour modifier la physiologie respiratoire ~ de ~randes altitudes ou profondeurs.
Le problème essentiel est, bien entendu, d'amener les effecteurs in situ afin gu'ils puissent se fixer sur l'hémoalobine intracellulaire.
Les tentatives de transformation de l'h~moglobine en solution par les effecteurs allost~riques de l'h~moglobine ont pu être réalis~es in vitro, mais les applications pratiques ne sont pas encore susceptibles d'une utilisation th~rapeutique du fait de la durée de vie insuffisante de l'h~moglobine en solution et des propriétés réduites qu'elle a alors aans le transport de l'oxygène.
Le brevet des Etats-~nis d'Amérique n~ 4 192 869 et le brevet européen n~ O 001 104 décrivent des proc~dés destinés à transformer les globules rouaes par interaction desdits globules avec des liposomes chargés en effecteurs allost~riques de l'hémoglobine, . :~:
en particulier chargés en ~HP.
Le proc~dé et le dispositif selon la pr~sente invention permettent, en utilisant comme compos~ à
activité biologique un effecteur allostérique de l'h~moglobine, la transformation de l'hémoglobine dans des conditions qui autorisent son utilisation au niveau th~rapeutique. .
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, :, , ~ . ~ . , 6 ~ Z1653 Pour ce falre, la présente inventlo~ propose un proc~d~ d'encapsulation dans les érythrocytes humAins ou animaux d'au moins une su~stance pr~sentant une actlvit~ biologlque, caract~ris~ en ce qu'on alimente en continu le compartiment primaire d'au moins un ~l~ment de dialyse avec une suspension aqueuse ~ d'~rythrocytes~ dont le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport ~ la suspension d'erythrocytes afin de lyser les erythrocytes, et en ce que le lysat d'érythrocytes est alors en contact avec ladite substance pr~ésentant une activité biologique, et en ce que,afin de resceller la membrane des érythrocytes, on augmente la pression osmotique et/ou oncotique du lysat érythro-cytaire apres sa mise en contact avec laditesubstance à activité biologique, et en ce que l'on recueille la suspension d'erythrocytes rescell~s.
Dans le cadre ae la pr~sente description, ~ on entendra par "element de dialyse" de façon generale un ~l~ment comportant deux compartiments sépar~s par une paroi de dialyse a travers laquelle peut se faire un ~change ionique qui permet de modifier de façon contrôl~e la pression osmotique d'une solution aqueuse situ~e dans l'un des compartiments en introduisant dans l'autre compartiment une solution aqueuse a ~ un sel.
Ce type d'~lément de dialyse est largement utilis~ tant dans le domaine medical pour la mise en oeuvre d'h~modialyse en flux continu, par exemple de dialyse p~ritonéale ou d'~change plasmatique avec separation des cellules et du plasma, que dans le domaine industriel dans des operations de purification, par exemple dans l'industrie pharmaceutique et alimentaire.
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'lZ;2~.653 ;
I1 dolt ~tre blen entendu gue 1' lnventlon ne portc pas sur la structure d'ur~ tel ~1~ment de d1a1y~e qu~ peut être que1conque et ~tre constltue, par exemple, par des membranes ou des fibre~ creuses avec aes S cheminements gue1ccn9ues a travers plusieurs chambres de dialyse, 1 'aspect essentiel du proc~dé ~tant que 1 'on puisse mrJdifier la tonicit~ de la solution aqueuse intrc>duite dans le compartiment primaire grace à
1 ' ad jonction dans le compart~ment secondaire d ' une solution aqueuse hypotonique par rapport ~ la suspenslon d ' érythrocytes, ceci bien entendu afin de lyser les ~rythrocytes.
Le lysat d'érythrocytes doit etre en contact avec la substance presentant une activite bic~1~9ique ql~e 1 ' on souhaite encapsuler, mais il est possible d'introduire cette substance soit avant, soit penaant la lyse, soit même eventuellement apres la lyse, toutefois, dans ce dernier cas les renaements d ' encap-sulation sont moins bons.
En iait, dans la m;se en oeuvre du procédé pour I 'encapsulation érythrocytaire de substances à activité biolo-gique, deux situations peuvent se présenter:
a) ILa taille de la substance à encapsuler est supé-rieure à la taille des pores de la membrane qui sépare compar-timents primaire et secondaire du dialyseur. Ce sera le cas d'une substance macromoléculaire. Dans ces condit;ons, iI n'y aura aucune perle de cette substance au cours de la dialyse conduisant à la phase d' introduction de la substance dans les hématies, le rendement final correspondra à la phase d'équi-I i bre ob tenu après l a I y se des héma t i es .
b) La substance à encapsuler a une taille réduite (inférieure à 10 OOO daltons), elle dialysera donc dans le com-part;ment secondaire du dispositif au cours de la phase de Iyse.
Ce qui conduira à une diminution du rendement d'encapsulation de la substance dans les hématies. Pour réduire cette perte de substanre qui peut être très préjudiciable dans le cas de lZZ~653 ~ .
-composés coûteux ou rares, il est possible de modifier le pro-cédé de la facon qui suit:
~n effet, les hématies sont initialement lavées dans un milieu contenant des solutés don~ la pression osmotique est d'environ ~20 à 300 mos. La Iyse de ces hématies ne se produit normalement qu'en dessous de 200 mos. C'est au cours de la phase d'abaissement de la pression osmotique jusqu'à 200 mos que se produit la perte principale de la substance à encapsuler, si elle a été introduite préalablement au début de I 'opération de dialyse. Pour obtenir une réduction de cette perte par diffusion, il suffit donc de réaliser l'introduction de la substance dans le milieu au moment où commence la Iyse des hématies, c'est-à-dire lorsque la tonicité de la suspension a été amenée entre 180 et Z20 mos.
Dans cette variante, avant d'introduire la suspension d'érythrocytes dans le premier élément de dialyse, on abaisse la pression osmotique de la suspension jusqu'à 180-220 mos et c'est seulement -lorsque la pression osmotique atteint cette valeur que I 'on injecte dans la suspension la substance à encapsuler.
La suspension ainsi obtenue est alors soumise aux différentes étapes décrites précédemment.
L'abaissement de la tonicité à 180-220 mos est réalisé
de préférence en utilisant un élément de dialyse supplémentaire placé en amont des éléments déjà décrits. Dans cet élément de dialyse, on fait - circuler la suspension érythrocytaire dans I 'un des compartiments et une solution hypotonique dans I 'autre, ceci a pour effet d'abaisser la tonicité de la suspension d 'érythrccytes.
Dans ce mode de réalisation, la substance à encapsuler est introduite dans I 'effluent de I 'élément de dialyse supplémen-taire et ensuite la suspension ainsi traitée est introduite dans I 'élément de dialyse dont les caractéristiques sont choisies de telle sorte que la Iyse soit optimale à la sortie de cet élément.
Il existe plusieurs possibilités afin d'augmenter la pression osmotique du Iysat d'érythrocytes lorsque I 'on désire rescel I er I a membrane des éry t hrocy tes .
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lZ2~653 Dans un premier mode de réalisation, on augmente la pression osmo~ique du Iysat d'érythrocytes en le faisant passer dans le circuit primaire d~un élément de dialyse dont le circuit secondaire contient une solution hypertonique par rapport au Iysat, la solution après rescellement étant recueillie en continu.
Dans un second mode de réalisation, on augmente la pression osmotique du Iysat en le mélangeant avec une solution hypertonique et/ou hyper-oncotique par rapport audit Iysat.
Dans ce qui précède, il convient de remarquer que le produit traité est une suspenion aqueuse d'érythrocytes, c'est-à-dire que dans la plupart des cas on préférera tra-vailler sur une suspension "synthétique" d'érytnrocytes et non sur le sang total, c'est-à-dire une sus?ension ne comportant principalement comme composant d'origine sanguine que les éry throcy tes .
C'est pourquoi, outre les phases de dialyse-rescellement, le procédé peut faire intervenir d'une maniere prépondérante des phases de: ~
- lavages et préparation des hématies, avant Iyse et rescel le- ~ ~' men t, - lavages et éventuel lement remise en suspension plasmatique ou de composition artificielle des hématies transformées.
De nombreux procédés et variantes actuel lement connus peuvent être ajoutés aux dispositifs permettant I 'encapsulation de substance dans les globuies rouges selon le procédé. I l s'agit essentiellement des méthodes de:
centrifugation pour la séparation cel lules-plasma et ?our les I avages, - séparation à l'aide de séparateurs de cellules en flux con t i n u ou sem i -con t i n u, - utilisation de dispositifs en flux continu et semi-continu pour la séparation des cellules sur membranes semi-perméables selon les méthodes actuel les de plasmaphor~se sur membrane ou sur f i bres creuses, - lavages selon les mêmes procédés.
En o~tre, il est bien connu en transfusion sanguine, S qu'il est parfois souhaitable d~éliminer les globules blancs ou les plaquettes avant transfusion pour des raisons soit immuno-logiques soit liées à la formation de microaggrégats.
Les mêmes situations peuvent se rencontrer pour l'utilisation de globules rouges Iysés et fescellés ayant encap-sulé une substance d' intérêt biologique. i I peut donc être envisagé l'introduction dans le procédé d'un dispositi~ de déleucocytation tel qu'un filtre à absorption conventionnel. Les autres procédés class;ques de déleucocytation peuvent évidem-ment être adaptés au dispositif.
L'utilisation d'une suspension ~synth~tique"
d'~rythrocytes permet de controler avec pr~cision la pression osmotique de ladite suspension aqueuse et donc assure une bonne reproductibilite des resultats obtenus.
Lorsque.l'on prepare cette s~spension agueuse d'~rythrocytes, il est possible d'eifectuer divers types de "conditionnement" de la suspension.
On peut tout d'abord placer les ~rythrocytes ~ dans un milieu iso-osmotique par rapport au sang, c'est-~-dire dans les conditions naturelles de pression osmotlque, dans ces conditions la lyse sera ef~ectu~e en pr~sence d'une solution aqueuse hypoton;que par rapport ~ la suspenslon d'erythrocytes. -Mais il est ~galement possible de conditionner les ~rythrocytes dans une solution aqueuse contenant des substances diffusibles ~ travers la membrane, dans ces conditions ces ~rythrocytes vont avoir tendance a gonfler et ~'' ' ~ ~' ''' ' ' , ~ ' , ~ ~ , ' - " 12Z~6S3 ll sera poss~ble d'e~fectuer la lyse en utilisant un milleu is~-osmotlque ou m~me, dans certains cas, hyper-osmotlque lces pressions étant évalu~es par rapp~rt ~ la pressi~n osmotique normale dans le sang).
Il peut être ~galement int~ressant lorsque l'on prepare la suspension synthetique d'érythrocytes destinee ~ etre traitee d'ajouter à cette suspension des composés macromoleculaires, en particulier des collo~des, de façon 3 creer dans cette solution une pression oncotique, cette pression oncotique aura pour effet lors de la lyse de limiter la perte des macromolécules intracytoplasmiques et en particulier la perte de l'hémoglobine.
Il est ~ien entendu possible d'envisager, au stade de la lyse ou du rescellement, d'utiliser non seulement des modifications de la pressio~
osmoti~ue de la solutio~, mais egalement des modifi-cations de la pression oncotique afin d'améliorer la lyse ou le rescellement.
L'un des avantages considerable du procéde selon la présente invention, outre les possibilités de controler la sterilite et la presence de pyrogènes ce qui permet l'utilisation des produits obtenus chez l'homme, est que ce procédé se pr~te particulièrement bien ~ un asservissement par contrOle des parametres tels que tcmps, volume, temperature, déblt, surface d'échange, conductivit~, force ~onique, notamment.
Les diff~rents paramètres de mlse en oeuvre du procéaé peuvent varier suivant la nature des ~l~ments traltés mais la lyse sera e~fectuee, de préférence, ~ une temp~rature comprise entre 0 et 10~C
et le rescellement ~ une temp~rature comprise entre 20 et 40~C.
1 2 ~2Z1653 -L'analyse du phénomène de resceilement des héma-ties permet de considérer comme possible I ' intervention de con-ditions dif~érenles de celles qui ont été décritesci-dessus:
- introduction de la substance à encapsuler à 2-4~C dans la suspension d'hématies Iysées et non avant l'entrée dans le cir-cuit de dialyse;
- étapes à des temperatures différentes, par palliers succes-sifs, conduisant généralement à un passage de la température de 2 à 6~C au départ à ~5 - 42~C entre la Iyse et le rescel le-men t - introduction de solut;ons ou substances de rescel lement à
différents points des palliers précedents;
- compositions variables des solutions ou tampons de rescelle-men t .
Enfin, I 'encapsulation de substances très actives à
des concentrations faibles qui possèdent un caractère protéique ou facilement adsorbables sur les surfaces plastiques utilisées dans le procédé conduit à envisager dans certains cas un pré-traitement du circuit de dialyse. Ces phénomènes d'absorption sont bien connus et peuvent conduire, compte tenu des grandes surfaces utilisées, à la perte dans le procédé d'une quantité
très importante de la substance à encapsuler. Ceci pourralt être par exemple le cas de substances comme les cytokines ou les enzymes. Diverses méthodes peuvent être util;sées paur modi-fier les surfaces des circuits de transformation, comme par exemple l'utilisation préalable d'un recouvrement par une protéine comme I 'albumine.
Ces précautions méthodologiques ne sont pas directe-ment liées au procéde mais peuvent jouer un rôle majeur dans son utilisation.
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~221653 . :
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Comme cela a éte ind~qué pr~c~demment, il a ~t~ constat~ que bien que le proc~de selon la presente invention soit un procedé en continu, on obtenait des rendements tr~s supérieurs aux rendements observés par la technique dite en "sac de dialyse". En outre, les volumes de sang traites peuvent etre tr~s imp~rtants, le traitement s'effectuant avec une grande rapidité.
Les différences observées entre ces résultats peuvent s'expliquer en partie car les deux proc~dés sur le plan fondamental sont tr~s diff~rents. En effet, l'un des procédés est une méthode cin~tique alors que l'autre est une méthode d'équilibre. Dans ces conditions, ;~
le raccourcissement considérable de la dur~e durant laquelle les hématies sont maintenues lysées limite les ~changes p~ysicochimiques membrane-milieu s'accompagnant d'une perte de constituants de la membrane érythrocytaire, ce qui réduit fortement la proportion d'hématies pour lesquelles la lyse est devenue irréversible.
Bien entendu, outre les avantages liés à la rapidit~ de traitement qui peut ~tre obtenue par la mise en oeuvre du procédé, il faut mentionner le fait qu'il est p~ssible, pour la phase de dialyse, de traiter des volumes importants, par exemple ~1 est possible de tralter 20~ ml de culot globulalre lav~ en 10 mlnutes au lieu de 10 ~ 20 ml en 2 heures et demie par la méthode en sac ae dialyse.
Le procédé selon la pr~sente invention peut être mis en oeuvre pour encapsuler un grand nombre de substance prksentant une activité biologique. Il s'agit en particulier :
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14 122~6S3 - des prot~l~es, - des enzymes, - des hormone~, - des substances ~ activit~ pharmacologique de facon g~nérale, - des substances modifiant le m~tabolisme des érythrocytes, telles que, par exemple, les effecteurs allostériques de l'hémorglobine, et - des substances protectrices, notamment cryoprotectxiceS, ae l'h~moglobine et des ~rythrocytes.
- les acides nucléiques.
Comme cela a été d~veloppé pr~écédemment, parmi les substances pr~sentant une activité biologique qui peuvent être mises en ~euvre dans le procéd~ de l'invention, il faut citer les effecteurs allostériques de l'h~moglobine.
Parmi les effecteurs allostériq~es de l'hémoglobine, il faut mentionner l'inositol hexaphosphate ~s (IHP), mais d'autres effecteurs sont utilisables, par exemple les sucres phosphates tels que l'inositol pentaphosphate, l'inositol tétraphosphate, l'inositol triphosphate, l'inositol diphosphate et le diphosphatidynil-inositol diphosphate.
Il est possible d'utiliser également des polyphosphates tels que des nucl~otides triphosphates, nucl~otides diphosphates, nucléotides monophosphates, des esters phosphate-alcools et le phosphate de pyridoxal.
Toute une série de substances naturelles ou synthé-tiques présentant un intérêt croissant en thérapeutique cellu-laire ou moléculaire peuvent être encapsulées :- les prostaglandines - les leukotriènes - les cytokines ou immunomodulateurs de synthèse (immuno-act;vateurs ou ;mmunosuppresseurs) ; dans cette dernière catégor;e, ;I peut être ut;le d'env;sager d'util;ser le procédé
pour moduler le système de défense immun;taire de l'organisme à l'aide de substances naturelles ou synthétiques que le pro~
cédé permet de cibler :
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1 5 ~22~653 - sur le système réticuloendo~hélial, lieu privilégié de dispari-tion des érythrocytes au cours du vie;llissement;
- sur certaines cellules comme les monocytes, destinés à se transformer en macrophages tissulaires, en particuiier à I 'aide d'une réaction de cytolyse anticorps dépendante (ADCC);
- sur le système Iymphatique qui représente le lieu privilégié
d'élimination d'érythrocytes transfusés, par exemple par voie intrapérilonéale.
Les composés les plus intéressants sont actuellement:
~o - les interférons ~, ~ ou ~5 ou de recombinaison génét i que;
- I ' interleukine I I
- les immunomodulateurs de synthèse, en particulier les dérivés du muramyldipept;de (MDP) Pour les mêmes raisons qui permettent d'envisager le ciblage sélectif et efficace des immunomodulateurs naturels ou synthétiques, outre un effet retard et la limitation de la toxicité, il peut être très utile et efficace d'utiliser le procédé
pour I 'encapsulation, le ciblage et la mise en action de substances douées de propriétés anticancéreuses.
Parmi les nombreuses autres substances naturel les, en particulier les enzymes, que le procédé permet d'encapsuler, il est possible de donner de nombreux exemples.
I l faut en mentionner trois plus particulièrement intéressantes:
a) Encapsulation d'enzymes du métabolisme du glucose Le glucose est un substrat qui diffuse rapidement et librement à travers la membrane du globule rouge.
L'encapsulation d'enzymes du métabolisme du glucose, particulièrement des hexokinases, pourrait permettre d'agir sur le métabolisme extraérythrocytaire du glucose, et donc de moduler la concentration sanguine du glucose, en dehors de l'action d'hormones comme l'insuline.
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16 ~2;~653 La stabilité in~raéry~hrocytaire pourralt éventuelle-ment nécessiter l'addition d~inhibileurs de protéases comrne dans le cas de I 'insuline ou d~autres inhibiteurs enzymatiqUeS.
b) Encapsulation d'anhydrase carbonique S Le métabol isme du C02 pose de graves problèmes dans la réanimation de certains malades présentant une forle surcharge, mal maîtrisée jusqu'à présent, du C02 sanguin.
L'encapsulation d'anhydrase carbonique, en plus des concentrations naturellement importantes dans le globule rouge, pourrait permettre de déplacer I 'équilibre:
C~2 ~ C03H
ce dernier composé pouvant être éliminé par dialyse du sang du malade.
c) cncapsulation d'enzymes du métabolisme de I 'histamine 11 a été vérîfié que I 'histamine diffuse à travers la membrane érylhrocytaire d'une manière analogue à celle du glucose, mais avec une cinétique plus lente.
Ce point fondamental permet d'utiliser le procédé
pour I 'encapsulation d'enzyrnes du métabolisme de I 'histamine, en particulier: la diamino-oxidase (histaminase) et la méthyl-. histamine transférase, qui sont les deux enzymes privilégiées du catabolisme de I 'histamine.
Ce point permet d'étudier une éventuelle adaptation du procédé pour le traitement de surcharges en histamine, en particulier chroniques, chez les sujets allergiques.
Ces exemples illustrent, sans être limitatifs, I'encapsulation d'enzymes permettant de modifier le métabolisme de certains sujets présentant des anomalies acquises ou congé-nitales, ou pour I 'encapsulation d'enzymes de détoxification.
Conformément à ce qui a été indiqué plus haut sur la ~ -possibilité, grâce au produit de l'invention, de cibler vers le macrophage une substance active, il est particulièrement avanta-geux d'utiliser comme substance active à inclure dans les héma-ties un dérivé ou analogue du MDP puisque I 'on sait que ces substances exercent leur activité notamment par I ' intermédiaire :: ' , ~.: : : - :'~: ,':: :,, ' .: - ' ' ~ ~ ' ' :':: . , :
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des macrophages tC. Leclerc et L. Chedid "Macrophage activation by synthetic muramyl peptides In Lymphokines, E.Pick ~d.
Academ;c Press Inc. 7,1-21,1982). Parm; ces dérivés et analogues du MDP c;tons no~amment ceux qui ont fait l'objet des demandes de brevet ~rancais suivantes :
- 74 22909 du 1.07.74 N~ publication 2 292 486 publi~ le 25.06.76 - 75 28705 du 18.09.75 N~ publication 2 324 884 publi~ le 15.04.77 - 75 29624 du 26.09.75 n~ publication 2 288 527 publié le 21.05.76 - 76 06820 du 10.03.76 N~ publication 2 343 483 publié le 07.10.77 - 77 02646 du 31.01.77 N~ publication 2 369 292 publié le 26.05.78 - 76 19236 du 16.07.76 N~ publication 2 355 505 publié le 20.01.78 - 78 16793 du 5.06.78. N~ publication 2 428 051 publié le 04.01.80.
2n Parmi ces produits citons particulièrement les MDP dont la chaîne peptidique a été mono- ou di-estérifiée sur les groupe-ments carboxyliques de l'acide D-glutamique par des chaînes alkyls de 1 à 10 carbones, de préférence de 1 à 6 carbones, en particulier l'ester butylique de la D-glutamine. Parmi les déri-vés du MDP particulièrement avantageux citons également les mono- et di-esters comportant en position alpha une chaîne alkyl de 4 à 10 carbones, de préférence 4 carbones et en position gamma une chaîne alkyl inférieure de 1 à 3 carbones.
Bien entendu, il est possible, si cela est nécessaire et/ou utile, d'encapsuler plusieurs composés à activité bio-logique.
L'encapsulation de ces produits permet pour certains d'entre eux un ciblage sélectif sur certains organes ou bien I'induction d'un effet retard prolongé qui peut atteindre 15 à , 25 jours ou plus selon les données actuelles recueillies chez I'animal.
~2Z1653 17a I l est également important de noter que I 'encapsulation peut induire un effet protecteur pour certa;ns médicaments qui son~ toxiques à I 'égard de la plupart des tissus et des organes non visés par le médicament. Une activité de même type est observée dans 1 ' induction d'un effet protecteur à I 'égard du médicament ou de I 'hormone transportée qui, dans certains cas, sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire~ ou bien :: : ~ - ,: : .
~2;i~i6S3 Iorsqu'elles son~ injec~ées à des individus qui possèdent un anticorps dirigé contre ces substances dans la circulation san-guine, par exemple un anticorps anti-insuline. Cet effet protec-teur peut aussi s'exercer à I ~égard d~une dégradation métabo-S I ique du médicament ou d ' hormone.
La stabilité intraérythrocytaire pourrait éventuelle-ment nécessi~er I 'addition d'inhibiteurs de protéases comme dans le cas de l'insuline ou d'autres inhibiteurs enzymatiques.
Enfin, le procédé permet d'introduire des composés protecteurs de l'hémoglobine et de la membrane pertnettant, notamment, de protéger l'intégrité des érythrocytes.
I I peut s'agir de cryoprotecteurs ou de Iyoprotecteurs; ces derniers intervenant en particulier pour la cryodessication que le procédé permet d'envisager.
I I faut enfin noter que les hématies peuvent être congelées Iysées et être rescellées à la decongélation, ou en cas de Iyophilisation, au cours des phases de réhydratation.
~ Cette dernière situation permet de résoudre théoriql~ement le passage transmembranaire de I 'eau lors de la réhydratation après Iyophi lisation.
La présente invent1on concerne egalement un dispositif destin~ à l ' encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d ' au moins une substance présentant une activité biologique, caractéris~ en ce qu'il comporte en combinaison au moins:
-- un ~lément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et lln compartiment secondaire s~pares par une paroi de dialyse, -- un dispositif d'alimentation en continu de la suspension d'~rythrocytes dans le compartiment primaire dudit el~ment de dialyse, -- un moyen permettant d ~ amener une solution aqueuse dans le compartiment secondaire de 1 ' elément de dialyse, - ::- : . : , :
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.: ~ : ,: . :: ~, lZ2~653 !
~ - un moyen assurant l'introduction de la sub~tance ~ activite biologique dans le compartiment primaire de l'el~ment de dialyse, - un m~yen assurant le transfert de la solution effluente du compartiment primaire dans un ensemble de rescellement comportant au moins un moyen pour au~menter la pression osmotique et/ou o~cotique de la solution .
effluente.
En ce qui concerne l'~lement de dialyse, sa structure ne constitue pas en soi une caract~ristigue au dispositif selon la présente invention et il est possible d'utiliser tout type d'~lement de dialyse comme cela a ~t~ indiqu~ précéaemment aans le cadre du proc~de.
Comme dlspositlf d'allmentation en continu, on peut envlsagex un dispositif quelcongue,notamment un syst~me de pompe, en particuller les pompes péris~t~ues couramment utilisées~dans le domaine des dialyses.
Le dispositif selon la pr~sente invention peut comporter diff~rents modes ae réalisation, en particu- .
lier au niveau de 1'ensemble de rescellement.
Le premier mode de réalisation de l'ensemble de rescellement peut ~tre constitu~ par un element de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire s~pares par une paroi de dialyse, la solution effluente ~tant amenée dans le . -, compartiment primaire par le moyen de transfert et le :
moyen pour au~menter la pression osmotique ~tant constitué par une solution hypertonigue par rapport la solution effluente, ladite solution hypertonique ~tant contenue dans le compartiment secondaire de ment de dialyse.
Mais il est ~galement possible de prevoir d'autres modes de realisation de cet ensemble de rescellement qui peut ~être constitu~ par une enceinte comportant un moyen d'amenee d'une solution hypertonique - par rapport à la solution effluente.
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12;~16~3 ( Comme la lyse est effectuée de préférence ~
temp~rature assez basse, comprise entre 0 et 10~C, et de preférence aux environs de 4~C, et comme le rescelle-ment est effectue de préference à une temperature plus elevée, par exemple entre 20 et 40~C, le dispositif selon l'inyention comportera, de pr~f~rence, un moyen de chauffage de la suspension à traiter, le moyen de c~auf~age pouvant ~tre ~ltu~ entre l'el~ment de dialyse et l'ensem~le de rescellemen~ ou bien d~rectement l'int~rieur de l'ensemble de xescellement. -Dans un autre moae de réalisation, 11 est posslble de prévolr apres le premier ~lément de dialyse un réclpient permettant de recueillir l'ensemble du volume de suspension ~ traiter, puis après avoir chang~
la tonicit~ de la solution agueuse circulant aans le compartiment secondalre de l'elément de dialyse, ae recycler le lysat d'érythrocytes ainsi obtenu dansle même él~ment de dialyse, dans ce cas cet element de dialyse est utilisé dans un premier temps pour la lyse de la suspension d'érythrocytes, aans un deuxi~me temps comme ensemble de rescellement.
Le dispositif selon la présente invention peut egalement comporter des circuits d'asservissement qui, en r~ponse à des modifications de caracteristiques de la suspension trait~e, agiront sur 1'ensemble des paramètres de la réaction afin de ramener les caract~- ;
ristiques de la suspension au niveau d'un seuil ~e consigne détermine.
D'autres caractéristiques et avantages du procede et dispositif selon la presente invention pourront ~tre dégages dans la description aes figures ci-apres sur lesquelles :
- la figure 1 represente un premier mode de réalisation du dispositif selon la presente invention, ., , . : .
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: : .
122~653 .
- la figure 2 repr~sente un second mode de r~alisation du dispositif selon la pr~sente invention~ '.
- la figure 3 représente un troisième mode de réalisation du dispositif selon la présen~e invention, - la figure 4 représente un quatrième mode de réalisation du dispositif selon la présente invention, - la figure 5 représente la pression partielle d'oxygène en fonc~ion du pr,urcen~age de saturation des érythrocytes après encapsulation d' IHP, - la figure 6 est une photographie au microscope électronique d'une suspension érythrocytaire rescellée, - la figure ? représente le pourcentage d'hémolyse en fonction de la pression osmot;que pour divers prélavages, - la figure 8 représente les rendements bruts et nets en fonction d'un débit de sang pour divers prélavages selon la fig~7, - la figure 9 représente la quantité de Desferal encapsulée en fonction de la concentration initiale du produit, - la figure 10 représente l'influence de la tempéra- ~;
ture de rescellement sur la fragilité osmotique des hématies rescellées7 - la figure 11 représente la variation de la p50 pour diverses concentrations en IHP, - la figure 12 représente les variations des diverses pressions d'oxygène sanguin, - la figure 13 représente l'évolution du débit cardiaque 25 du mini-porc 'en fonction de la variation de la p50,du sang transfusé, - la figure 14 est une microphotographie de culots témoin et rescel lé, - la figure 15 représente une analyse comparative des histogrammes des volumes érythrocytaires.
,''' ~
.. . .... . .. .
~ 22 12Z1653 ~ . .
Le dlsposltif de la figure 1 est constltu~
d'un ~lement de dlalyse 1 comportant un compartiment primaire 2 et un compartlment secondaire 3 s~par~ ;
par une paroi de dialyse 4.
Le compartiment primaire 2 est alimente par une suspension d'érythrocytes contenue dans le r~servolr 5 plac~ dans l'incubateur 6.
Le sang avant d'etre introdult dans le dialyseur 1 est amené a la temp~rature de lyse, en g~néral 4 DC~ :
par l'interm~diaire d'un échangeur de température 7. :~ ;
La suspension d'érythrocytesest mise en circulation par l'intermédiaire de pompes pêristaltiques telles que 8.
Dans le mode de realisation décrit, le compose ~ activité biologique est introduit dans le circuit par 1'intermédiaire de la pompe peristaltique 9 avant que la suspension d'érythrocytes ne pénetre dans l'échangeur ~ :
de temperature 7.
Le compartiment secondaire 3 de l'élément de dialyse est alimente en une solution hypotonique :
contenue dans le recipient 10 plac~e dans l'incubateur 11. ~:
Cette solution hypotonique est amenee dans le comparti- ' ment secondaire de l'element de dialyse par l'inter-mediaire d'une pompe peristaltique 12 et à travers un échangeur de température 13. Après son passage dans le compartiment secondaire de l'~lement de dialyse, la solution hypotonique retourne au récipient 10 ; elle peut : :
aussi être ~liminée~ :;
Afin de s'assurer que la l~se des ~rythrocytes . est complète, il est possible, comme cela est represente ~ la figure 1, de placer à la sortie de l'element de dialyse 1 une ligne retard 14, c'est-a-dire le plus souvent une simple tuyauterie de grande longueur par exemple.
.. . . . . . . ..
~ ~ : - . .
. .

Dans le cas le plus frequent o~ l~operation de rescellement doit etre effectuee à une temperature superieure à la temperature de lyse, on introduit apres la ligne retard un echangeur de temperature tel que 15 qui permettra d'amener la suspension d'erythro-cytes lysee a -la tempexature, par exemple, de 37~C.
Le lysat est place en continu dans un recipient 16 contenu dans un incubateur 17, c'est dans ce recipient 16 que l'on ajoute en continu, ou bien en une seuIe fois, la solution de rescellement placee dans le recipient 18 contenu dans l'incubateur 19 par l'intermediaire de la pompe peristaltique 20.
Lorsque le rescellement est complet, la suspension d'erythrocytes dans laquelle se trouve encapsuIe le compose a activite biologique est prelevee directement a partir du recipient 16.
L'un des avantages du dispositif selon la presente invention est qu'il est possible de controler en permanence tous les paramètres de la reaction. -'~
Bien entendu, il est possible de contrôler la temperature des differents fluides circulant à l'aide -~, de dispositifs qui n'ont pas ete figures car ils sont bien connus de l'etat de la technique.
Mais il est, en outre, tr~s interessant de pouvoir contrôler la pression des fluides et egalement leur pression osmotique afin de s'assurer que les echanges S2 feront dans les conditions optimum.
Il n'est bien entendu pas necessaire de rentrer dans le detail de ces dispositifs de controle qui sont de type connu. On prevoiera, de preference, au moins un manometre tel que 21 pour controler la pression des ~.~
'.~
. ~ : :: : , 24 1Z2~653 fluides dans le circuit primaire et un élément de mesure de la pression osmotique, par exemple par mesure de la conductivite à l'aide d'un dispositi~ tel que 22, ces eléments permettant d~agir pour modifier les autres paramètres de la rêaction tels que le debit d'alimenta-tion, afin de ramener les valeurs de la pression et de la pression osmotique à des valeurs de consigne.
Il en ira de meme sur le circuit secondaire :
où un dispositif schematise 23 permettra de mesurer la pression du fluide ainsi que la pression osmotique afin de maintenir les caracteristiques des fluides a certaines valeurs de consigne.
~ st represente.egalement d'autres dispositifs de contrôle tels que 24 et 25 assurant des fonctions identiques a celles definies precedemment.
La figure 2 represente un dispositif qui est ~:
identique à celui de la figure 1 jusqu'au niveau du second.echangeur thermigue reference 15 sur la figure 1, ~ .
c'est pourquoi cette partie du dispositif ne sera pas ~ ::
redecrite puisqu'elle est absolument identique a celle de la figure 1.
Par contre, pour ce qui concerne l'étape de rescellement, celle-ci est effectuee par l'intermediaire d'un second element de dialyse 30 comportant un compartiment primaire 31 et un compartiment secondaire 32 ,separes par une membrane de dialyse 34.
Une solution de rescellement hypertonique circule dans le compartiment secondaire 32 par l'inter-media.ire d'une pompe peristaltique 35 qui prelave 30. cette.solution hypertonique dans le recipient 36 et la conduit par l'intermediaire de l.'echangeur de temperature 37 dans le compartiment secondaire de .l'element de dialyse. Cette solution hypertonique peut ::
. ~
: ' ' ' ' lZ21653 .
~ : .
~tre recycl~e dan~ le r~cipient 36.
La suspension de ly~e provenant du premier ~l~ment de dlalyse,et après son passage dans la l~gne retard et dans l'~changeur de température, est amen~e 5 dans le compartiment primalre de l'elément de dialyse 30 dans lequel les érythrocytes sont rescell~s, la suspension après rescellement ~tant recueillie dans un récipient 38 contenu dans un lncubateur.
Là encore, tout comme cela a et~ mentionné
précédemment, on prévolt différents dispositifs de controle tels gue 40, 41 et 42 permettant de contr~ler en continu les paramètres de mise en oeuvre du procédé.
De façon gén~rale, le d~bit du circuit primaire contenant les érythrocytes est compris entre 20 et 80 ml/min. alors que les debits des solutions hypertoniques ou hypotoniques du circuit secondaire -sont de l'ordre de 100 à 1 000 ml/min.
Dans les essais qui seront rapport~s ci-après, ~ ;
les surfaces de dialyseurs mis en oeuvre sont en général de l'ordre de 0,41 m .
~ es pressions aans les circuits sont voisines de 100 mm de mercure selon les débits utilisés.
Les forces ioniques des solutions de lyse sont d'environ 40 mosmoles et les forces ioniques des solutions de rescellement sont d'environ 300 mosmoles.
Le schéma de la figure 2 qui est sym~trique pour les deux operations de lyse et de rescellement montre qu'il est possible a'envisager l'utilisation d'un dispositif ne co~portant qu'un seul él~ment de dialyse et de le faire fonctionner dans un premier temps pour lyser la suspension d'érythrocy~es puis, apr~s avoir recueilli l'ensemble de la solution .. . . . . . . . . , , _ ..
.. . . . . . . . .
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26 ~Z21653 lys~e, de falre ~onctlonner cette bobine de dialy~e pour le rescellement en changeant uniquement la tonic~tk de la solution alimentant le compartiment seconda~re.
Le schéma de I a f i gure 3 permet d ' amener I a pres-sion osmotique de la suspension d'érythrocytes à 200 mos afin de limiter la perte de la substance à encapsuler comme cela a été indiqué précédemment.
La taille de l'élément de dialyse 1 est choisie pour que, compte tenu des débits et des volumes, I 'abaissement de la force ionique dans la suspension érythrocytaire amène celle-ci à environ 200 mos. - La substance à encapsuler contenue dans le récipient 50 est introduite à I 'aide la pompe 51 dans le cir-cuit de sorlie du dialyseur 1. Ceci peut être simplement réalisé
à l 'aide d'un pousse-seringue à débit continu classique.
La suspension érythrocytaire issue du dialyseur 1 , reçoit alors en continu la substance à encapsuler et pénètre dans le circuit primaire 27 d'un élément de dialyse 28 dont la membrane 26 possède une surface choisie, de tel le sorte que soit alors effective la Iyse des hématies passant dans le circuit primaire selon le procédé initial.
Les circuits secondaires 3 et 29 peuvent être ali- '~
mentés en série par la même soluticn hypotonique telle qu'elle est indiquée sur la figure 1.
Le rapport des surfaces des membranes 1 et 26 est choisi pour optimiser les échanges moléculaires dans les deux phases de dialyse.
Les éléments de dialyse 1 et 28 peuvent être soit séparés pour utiliser des éléments commerciaux existants, soit intégrés dans un d;alyseur à deux compartiments spécialement adapté au procédé, ce qui est facitement réalisable selon la méthodologie actuel le.
La sortie du dialyseur 28 reprend les éléments du schéma de principe de la figure 1.
., : I ~:
.
27 ~Z;z~.653 Le schéma de la figure 4 représente un mode de réa-lisation particulier du proc~dé selon l'lnvention.
Les conditions décrites jusqu'à présent sont particu-lièrement adaptées à I 'encapsulation d~une substance dans un volume globulaire d'environ 200 à 400 ml ou à I 'utilisation d'une transformation en flux continu. En modifiant surfaces des dialyseurs et débits, des volumes variables peuvent être traités.
Il est cependant utile de détailler un circuit de reçyclage cont;nu pour les conditions extrêmes:
a) La transformation d'un volume d'une suspension érythrocytaire de plusieurs iitres, si le rescellement n'est pas effectué en continu, introduit une différence importante dans la cinétique du phénomène pour les hématies qu; sont passées les premières dans les phases de dialyse par rapport à cel les qui passeront les dernières.
b) De la même fason, la manipulation à I 'aide d'un minidialyseur de faibles quantités de sang (quelques ml ) pour I 'encapsulation de substances très actives qui ne nécessitent pas des volu mes importants de sang pour les doses à adminis-trer, introduit un paramètre supplémentaire En effet, I'effica-cité d'un dialyseur dépend de sa surface, donc permet un équi-libre de dialyse déterminé, mais cet équilibre n'est atteint que selon une cinétique d'autant plus lente que la surface est réduite~ Une simple adaptation débit/surface est donc insuffisante pour réaliser une encapsulation dans des conditions convenab I es.
Dans ce mode de réalisation, la surface du dialy-seur 1 est réduite et le débit du sang dans le circu;t primaire augmenté de sorte qu'à la sortie du dialyseur 1 la pression osmotique n'est réduite que pour une fraction de ce qui serait nécessaire pour provoquer la Iyse des globules rouges. Ia sus-pension érythrocytaire est recyclée en continu dans le réservoir _,, _, , , ., _ . _, . . . . . . . ... .. . . . _ _ ,- :. : : ~ . ,,, - , , :: .
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28 ~Z~ 53 - ini~ial 5. L'échangeur de température 15 peut être programrné uniquement en fin de transformation, de même pour la pompe 20 .
Ce disposilif permet d'effect~ler la mise en oeuvre du procédé par modifications successives et progressives des forces ioniques des milieux, ce qui permet de négliger la ciné-tique propre du dialyseur 1, en faisant intervenir une cinétique complémentaire liée au volume de sang à traiter et au débit dans le circuit.
Cette modification perme~ d'adapter facilement le procédé à une gamme très large de volumes de sang traités, compte tenu des caractéristiques techniques des dialyseurs actuellement utilisables et donc, en principe, de rechercher les conditions optimales d'encapsulation pour des conditions très variées. On peut, ainsi, transformer aussi bien de grands volumes que quelques ml de sang destinés à une expérimenta-tion anirnale ou pour I 'encapsulation d'une substanc~ rare et -onéreuse.
Les dispositlfs ~;chématis~s aux figures 1 et 2 ont ~té utilisés afin de mettre en oeuvre le proc~d~
revendiqué . - - -Incorporation de desferrioxamine (Desféral) Dans cet exemple, on utilise le dispositif sch~matisé à la figure 1.
Le dialyseur 1 présente une surface de 0, 41 m2 et est alimente par une suspension d ' érythrocytes avec un d~bit de 60 ml/min dans le compartiment primaire alors que dans le compartiment secondaire on fait passer, avec un débit de 500 mlJmin., une solution de lyse comportant NaH2P04--Na2HP04, pH 7, 4, 10 mM, CaC12 O, 5 mM et 2mM de glucose .
La suspension d ' érythrocytes a ét~ obtenue de la facon suivante : A 200 ml de culot globulaire lavés, à
70 ~ d 'h~matocrite, on a joute 5 ml de solution contenant .~ . :
~ ~Z2~653 25~ mg de ~esféral. La lyse est effectu~e ~ 4~C en maintenant la suspension de lyse dans un r~cipient 16 cette temp~rature pendant 10 min. On intrcauit ensu~te 20 ml de NaCl 1,5 M, contenant 10 ~ de PEG 4000. La suspension est maintenue en contact avec cette s~lution de rescellement pendant 30 min ~ 37~C. Ensuite, on pr~lève l'ensemble et on effectue 3 lavages par NaCl à 9 g/l.
Il est utile d'effectuer un lavage interm~diaire par une solution a 200 mos. ou 250 mos. environ pour IO ~liminer certaines populations érythrocytaires fragilis~es.
De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans des solutions de régénération peut se r~véler n~cessaire p~ur une bonne conservation des hématies.
Après dosage, on constate que l'on ~ ~ncorp~r~
dans le culot globula~re 148 mg de Desferal (solt un rendement brut de 59 ~), mai~ il conv~ent de remarquer que l2 mg de Desféral ont et~ elimlnes dans la solut~on de dialy~e, ce qui condu~t en fait ~ un rendement net d'incorporation du Desféral dans les erythrocytes de 63,5 ~
Si l'on m~difie le deb~t d'alimentation en suspension d'erythrocytes pour l'amener ~ 80 ml/min., le rendement brut d'incorp~ration e~st de 47,3 ~ et le rendement net est de 57,9 %.
Pour un débit de 40 mljmin~ le rendement brut est de 49,4 ~ et le rendement net de 59,l %.
Pour un debit de 20 ml/min. le rendement brut est de 46,l ~ et le rendement net de 64,2 ~.
Le rendement brut est-c~lculé par rapport au produit total mis en réaction et le rendement net est caIculé par rap-porl au produit restant après la phase de Iyse.
Ces résultats démontrent qu'il existe un optimum de débit de suspension érythrocytaire pour une surface de dialy-seur donnée, lorsque la substance qui doit être incorporée est une substance susceptible de diffuser à travers la membrane de dialyseur.
- . . ~ ~ .
1~1653 EXE~LE 2 Inc~rp~ration de desfernDxamine (Desferal) Dans cet exemple, on met en oeuvre le disp~sitif d~crit ~ la figure 2, c'est-3-dire que l'on effectue 5 le rescellement à l'aide d'une deuxième dialyse 3 22~C .

3 l'aide d'un él~ment de dialyse tel que 30.
Dans ce cas, on utilise le tampon de rescellement suivant NaH2P04-Na2HPo4 10 m~ p~ 7~4~ CaC120,5 mM, glucose 2 mM, NaCl 144 mM.
Les autres paramètres restant identiques, le d~bit de suspension erythrocytaire est de 50-ml/min.
Dans ce cas, on observe un rendement net d'incorp~rati~n de 46,7 ~ alors que le rendement brut ~ est de 32,5 ~
Ces r~sultats 6'expliguent ais~ment p~isque ~:
le Desféral est une substance aiffusible et que l'on tend ~ perdre encore une nouvelle quantité de Desf~ral lors de la sec~nde dialyse.

Incor~Dration d'insuline . .
. Dans cet exemple on encapsule de l'insuline dans les ~ry~hrocytes en mettant en oeuvre le aispositif schématis~ 3 la figure 1. Dans ce qui suit il ne sera mentionne que les parametres qui diffèrent de ceux indiqués à l'e~emple 1.
Afin de permettre le dosage de l'insuline, le produit utilisé est maryu~ avec I125 par la methoae de la chloramine T.
On ajoute 10 ml d'insuline.(4 U/ml-432~80~ cpm/ml) : .
a 20~ ml de culot globulaire laves trois fois avec NaCl 9 g/l. -Le debit de suspension.~érythrocytaire utilis~
est de 60 ml/min. ~près la lyse, 1'incubation se p~ursuit 10 min. à 4~C.
Le rescellement est effectu~ ~ 37~C a l'aide de 20 ml de NaCl 1,5 M contenant 10 ~ de PEG 4 00~. :
. . .
~. . ..
. .
31 lZZ1~3 L'incubation est poursui~ie 30 min. ~ 37~C et les globules ro~ges sont ensuite laves trois fois par NaCl ~ ~ g/l.
Dans ces conditions, le rendement d'incorp~ration de la radioactivite est de 48 ~ (~ 4 ~). Bien ente~du, cette incorp~ration ne saurait prejuger de l'activit~
biologique de l'insuline encapsul~e dans les globules ~ -rouges. Il est bien connu que cette hormone est modifiée en pr~sence d'h~molysat de glo~ule rouge.
Toutefols, ce resultat confirme les posslbl-lit~s d'incorporer dans les ~rythrocytes une protéine de 7 OOO daltons.
Afin de conserver l'int~gr~té fonctionnelle de l'insuline, il peut etre n~cessaire de prevolr d'incorporer des substances protectrices de l'insuline au milieu erythrocytaire , ceci peut bien entendu etre réalise très aisément 3 l'aide du dispositif selon la pr~sente invention.

zo Incorporation d'albumine On opere comme cela est decrit dans 1'exemple 3 en utilisant de l'albumine marquee ~ Il25 Dans ces conditions, on observe un rendement qui est de l'ordre de 3~ ~, ce resultat m~ntre l'influence de la masse mol~culaire sur le rendement d'incorporation a'une proteine.
.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'encapsulation d'effecteurs allost~riques de l'h~mo-globine, notamment l'inositol ~exaphosphate (IHP~ grâce au procéd~ de la présente invention.

. . _ Encapsulation d' IHP
122~653 ~ Pour r~aliser une transformation plus ou moins importante des globules rouges à l'aide de l'inositol hexaphosphate, on utilise par exemple deux types de solution permettant de faire varier le rapport IHP/Na.
Solution A
15 g d'lHP 12 Na (12 ~ H20) dans 55 ml d'eau distillée so~t passés sur une colonne de DOWE ~50 W-400 mesh ~quilibrée en ions H . On obtient 63 ml d'IHP
acide (14,2 . 10 3 mole1.
Cet IHP acide est utilisé pour neutraliser une autre solution d'IHP 12 Na jusgu'~ pH 7,4. 33,1 . 10 mole d'IHP 12 Na dans 153 ml sont neutralisés par 97 ml d'IHP aclde contenant 17 . 10 3 mole d'IHP.
Au total on obtient une solution contenant 55 . 10 mole IHP et 457 . 10 mole sodium aans 250 ml. Cette solution est diluée pour obtenir un mllieu à 250 mosmoles/l.
Solution B
11 9 d'IHP 12 Na (12 % H20) sont neutralisés par 40 ml d'HCl N dans 750 ml d'H20 à pH 7,4. On obtient un milieu à 230 mosmoles/l.
Dans cet exemple, on utilise le dispositif schématisé à la figure 1.
Le dialyseur 1 présente~une surface de 0,41 m et est alimenté par une suspensi~n d'érythrocytes avec un débit qui varie selon les expériences de 20 à 60 ml/min.
Le circuit secondaire est aliment~ à 500 ml/min par un tampon de lyse ayant la composition suivante :
- C03HNa 10 mM
-- P04H2K/P04HK2 10 mM, - glucose 2 mM, pH 7,4.
La suspension d'érythrocytes utilis~e a été
obtenue de la facon suivante :
_;
,. : -. ~ , , ~ .: , ~
lZ21653 A 200 ml d'un culot ylobulaire d'~rythrocytes lav~s 3 fois par une solution de NaCl ~ 9 g/l (70 ~ d'h~matocrite), on ajoute un volume ~quivalent de l'une des solutions A ou B.
Apr~s centrifugation, le surnageant l~yèrement h~molysé est ~liminé.
La lyse est effectu~e ~ ~C. La suspension de lyse est maintenue dans un récipient 16 pendant 10 minutes à 37~C en pr~sence d'I~P.
La suspension de lyse est rescellée par aadition de 1~ ~ en volume d'une solution contenant NaCl 1,5 M, PEG 4000 ~ 10 ~
Après incubation de 30 minutes à 37~C, les culots globulaires sont lav~s 3 fois par une solution de NaCl à 9 y~l et remis en suspension dans le plasma d'origine.
Il est utile d'effectuer un lavage intermédiaire par une solution ~ 220 mos environ afin d'éliminer certaines populations érythrocytaires fragilisées.
De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans des solutions de rég~n~ration peut se révéler nécessaire pour une bonne conservation des h~maties.
Les r~sultats de ces expériences sont rassemblés dans le tableau ci-apr~s :
.: . ~ ; -, ,:, :. . :- :, .......... .
~' lZ~ 653 r J ~ :
~~ 1~
~ ~ ~~
~' )~ ~o~ E ~ C~
t-' C~-- ~ --~ ,_,_ ,.,......... ~ ::
lZ%1653 Le~ courbe~ de liai60n de i'oxygène repr~ent~e~
~ la f~yure 5 ~ont mesur~e6 ~ 25~C par la m~thode de dlffusion raplae à l'alde de l'apparell de Duvelleroy 5J. Appl. Physsiol. 2~, 227-233 (~970) et ~esseirre S et al. (Bull. Physiopath. Resp. 11, 837-851 (1975).
La courbe de la figure 5 représente pour divers débits de suspension ~rythrocytaires et suivant la nature de la solution utilisée, A ou B, la pression partielle d'oxygène en mm de mercure en fonction au p~urcentage de saturation des ~rythrocytes.
La pression de demi-saturation notée dans le tableau P50 est une indication de l'affinité de l'oxygène pour l'hémoglobine. La pente de la courbe au voisinage de la demi-saturation, c'est-3-dire entre 40 et 60 ~, représente le degré de coopération des quatre sites de fixation de l'oxyyène dans l'hémoglobine, cette pente permet de calculer le coefficient de HILL.
On d~tecte une amélioration de la lib~ration de l'oxygène, c'est-à-dire une diminution de l'affinit~
de l'hémoglobine pour l'oxygène, soit par une diminution-du coefficient de HILL, c'est-à-dire une diminution ae la pente ae la courbe de la figure Sau voisina~e ae 5~ ~ de la saturation, ou bien par un déplacement global de la courbe vers la droite qui correspond ~
une augmentation de la pression partielle d'oxyg~ne au voisinage de 50 ~ de la saturation.
Pour les ~rythrocytes t~moins de la courbe T
dont la P50 est ae 19,3 mm ae mercure, on observe que les memes ~rythrocytes traités par le procédé de l'exemple en présence initiale de sérum physiologique ont une p50 de 18,5 mm de Hg alors qu'après incorpo-ration d'IHP par le proc~dé selon la pr~sente invention .. . . ., ., .. . ... .. .. . , .,, .. , . . , . . .. . . ~ . . . .. . ... .
- ~ I, . . : .
~~ : : :, ,. :: . : , : :.
lZ21653 les P50 observ~es var~ent entre 36;8 et 77 mm de ~g suivant les d~bits utilis~s ainsi que la nature de la ~olution d'IHP utllls~e.
EXE~PLE 6 En utillsant la solution A diluée pour obtenir - 210 mosmoles/l on effectue une lyse à 4~C avec un d~bit de 20 ml/min puis un rescellement de 30 min en faisant varier la temp~rature. Le tableau ci-apr~s montre l'influence de la temp~rature de rescellement ~0 sur la valeur de la P50 obtenue mais aussi sur le rendement en globules rouges reconstitués exprimé en faisant le rapport des hématocrites des suspensions de globules rouges reconstitués à l'hématocrite de la suspension initiale pour un volume total équivalent.
. _ _ . ' :'' 15Temp~rature de p Rendement rescellement -S0 ( Hg) (hématocrite) 25~C 42 27 %
30~C 48 36 35~C S0,5 45 %
40~C 54,5 Après rescellement et maintien en milieu plasmatique, la plus grande partie de globules rouges retrouve une forme discocytaire bien que faiblement microcytaire. Les formes plus ou moins vésiculaires ne sont pas significativement plus nombreuses ~ue dans la population native. Ceci est confirm~ par la figure 6 correspondant ~ une photographie au microscope ~lectronique à balayaue d'une suspension érythrocytaire rescellée dont la P50 est de 68 mm de ~g.
. ~ . ... ~
37 ~6~ :
Les cond1tlons exp~rimentales décrites d~m~ntrent les grandes posslb1lit~s d'utilisati~n de la dialyse en flux continu p~ur r~aliser dans des c~nditions variables l'incorpora~ion d'lHP ou d'autres ef~ecteurs allost~riques de l'h~mogloblne afin de r~aliser une modification des propriétés oxyphorique~
du sang.
Le contrôle des paramètres de la r~action de lyse-rescellement, volumes, d~bits, températures, comp~sitions des milieux, est aisément réalisable à l'aide du aispcsitif expérimental utilisé.
Ce dispositif permet la transformation rapide de quantités importantes de globules rouges. Il pourrait éventuellement être incorporé dans un circuit de circulation extracorporelle_ Les conaitions d'utilisat~on permettent une application thérapeutique chez 1'homme.
La méthode d'incorporation d'effecteurs allostériques ae l'hémoglobine dans les globules rouges décrite dans ce brevet présente une série d'avantages évidents par rapport à la méthode liposomale décrite ~-dans le brevet aes Etats-Unis d'Amérique n~ 4 192 869 :
1) Elle n'utiIise pas de phospholipides et du cholestérol exogènes et en cela simplifie consiaé-rablement les problèmes de toxicité ainsi que d'activités immunologiques acquises par les globules rouges.
2) Elle permet une quantification très précise de la concentration d'effecteurs allostériques de l'hémoglobine inc~rporée et par conséquent permet l'obtention de la p~0 souhaitée.
3) Le processus d'incorporation est plus rapide et largement automatisable.

4) La reproductibilité de cette méth~de est sup~rieure ~ celle de la méthode liposomale - . . -- ............. ............. . . . ..... . .. ..
, : :. , ,, ~ . ,........ : , .
. .. . .. ... ~ . . . :.
~;2;i~1653 4 ~ ~
Les exemples suivants réalisés avec le Desféral selon le processus de I 'exemple 1 met~ent en év;dence I ' influence de divers paramètres du procédé.
EXEMPLc 7 Influence d'un prélavage sur la courbe Iyse _ Comme cela a é~é décrit précédemment, on peut envisager de faire gonfler les hématies, avant d'effectuer la Iyse, en effectuant un prélavage à I 'aide d'une solution conte-nant une substance diffusible à travers la membrane du globule rouge comme par exemple le glucose. -~
La figure 7 représente les courbes de Iyse obtenues ~
après lavages dans des solutions contenant des proportions ~ ~-variables de glucose et de cl~lorure de sodium.
Solution de prélavage (mos) 1 - 130 glucose 130 NaCI
2 - 150 glucose 100 NaCI
3 - 210 glucose 50 NaCI
T - 300 NaC I
Les courbes de la figure 7 démontrent clairement I'intérêt de faire gonfler les hématies afin d'améliorer la Iyse, mais il faut tenir compte du fait que parallèlement le volume des hématies augmènte. Pour un hématocrite de départ de 70 ~0, le volume extracellulaire après rescellement sera d'autant plus important que le volume globulaire moyen aura été artificielle-ment augmenté. Ces deux effets sont donc antagonistes sur le plan du rendement d'encapsulation final.
I l existe donc un optimum entre les conditions de prélavage et les conditions de Iyse comme cela est illustré sur la figure 8.
La figure 8 représente, en effet, les rendements nets et les rende~nents bru:s d'encapsulation pour divers débits de sang et pour les diverses solutions de prélavage et I 'on constate que pour un débit de sang donné il existe, en général, au moins un prélavage qui permet d'augmenter les rendements.
.. . ~ . . .. .
. : : ,. .: . .
-~Z21653 -Les résultats initiaux donnés pour l'encapsulation du Desféral dans les exemples 1 et 2 ont éte obtenus à l'aide d'une méthode de dosage chimique colorimétrique. Ces résultats sont majorés par rapport à ceux obtenus à l'aide de la méthode de S dosage radioactif utilisant le complexe 59Fe-Desferrioxamine utilisée pour l'obtention des résultats de la figure 8. Cette méthode est utilisée dans les exemples suivants :
Cet exemple montre qu'il est possible en aJustant les conditions expérimentales d'obtenir des résultats compris entre 40 et 50 % pour les rendements bruts.

Influence de la quantité de Desféral ajoutée Dans cet exemple, on mesure la quantité de Desféral encapsulée pour diverses concentrations de Desféral dans le culot globulaire.
Les conditions expérimentales sont déterminées pour donner un rendement brut d'environ 40 ~.
La figure g rassemble les résultats obtenus et montre l'existence d'une relation linéaire pour une large zone de concentration de Desféral.
De cette figure il ressort que la dose maximale de Desféral encapsulable n'est pas atteinte. En utilisant les condi-tions optimales de la figure, 8 ou celtes correspondant à l'utili-sation de deux dialyseurs mentionnées ci-après (rendement d'environ 50 ~), on voit qu'il est possible d'encapsuler 800 mg à 1 q, au moins, de Desféral pour 100 ml de culot rescellé.

Influence de l'hématocrite Le tableau suivant monlre l'influence de l'hémato-crite du culot globulaire lavé sur le rendement d'encapsulation~
' iS3 . ~.. .
Hématocrite % Rendement 35 ,3 :
35,7 :
40,4 .
. 80 . 42 :

Influence de la température de rescellement Le tableau de l'exemple 6 indique l'influence de la température sur le rendement de rescellement et d'encapsulation pour l'IHP.
Des essais complémentaires effectués avec le Desféral ont montré qu'enlre 37 et 42~C l'influence de la température su r I e ren demen t f i n a I es t re I a t i v emen t modé rée ma i s q u e, p a r contre, les courbes de Iyse des hématies rescel lées sont considé-ra b I emen t mod i f i ées .
La figure 1C représente I ' influence de la température de rescel lement sur la Iyse bactérienne en fonction de la tonicité du milieu.
Les formes les plus stables sont obtenues vers 40 à 42~C (déplacement des courbes vers la gauche). A partir de 45~C, une fragilisation des globules rouges apparaît (déplace-ment des courbes vers la droite).
:: . ~ ~ . : ,: - ... . .
41 ~ ~i6~
-EXEMPLE ll L a compos i t i on de I a so l u t i on de resce I I emen t utilisée selon l'exemple 1 joue un rôle imporlant, comme indiqué dans le tableau ci-dessous pour deux hématies 5diférentes:
s Composition de la solution Rendement brut % Rendement net %
NaCI 1 M 42,7-40 70,7-63,1 . ;~!aCI .1,2 M 38,3-39,4 69,1-62,9 -:
NaCI 1,5 M 38,8-37,3 66,6-57,3 10NaCI 1 M + PEG 4000 10 ~o 42,1-41,6 66,9-63,4 NaC I 1, 2 M+PEG 4000 10 % 39,7-37,8 69,9-62,6 NaC I 1, 5 M+PEG 4000 10 % 38,3-37,3 68,3-61,2 Les dosages sont e~fectués selon la rr;étho~e' isot'o;7ique Comme cela a été décrit précédemment, afin de respecter la durée de vie maximale des hémat;es in vivo, il est lS bien connu que certains constituants sont essentiels. Ce sera le cas de l'ATP, de l'équilibre Na/K, des ions Ca et Mg , du glucose ou d'autres composés comme 1 ' Inosine ou le 2--~ DPG par exemp I e .
Il peut, en conséquence, être nécessaire de modifier la composition de la solution de rescel lement ou des solutions de lavages pour respecter au maximum 1 ' intégrité biologique des hématies rescel lées.
EXEMPLc 12 ' ~ : .
Cet exemple a été mis en oeuvre en utilisant un dispo-sitif conforme à celui de la figure 3, c'est-à-dire dans lequel la substance active est introduite entre deux phases de la Iyse des 91 obu I es rou ges .
::': , '. : '' '' . ' ' ':-.~', '-~"- , ..... . .
~22~6S3 1.2 Les tableaux cl-dessous résumen~ les résultats moyens correspondant à I 'u~llisation de ce dispositif pour I 'encapsulation de Des~éra 1.
Les paramètres sont:
- S1 = surface du dialyseur 1 - 52 = surface du dialyseur 28 - Débit du sang = 20, 40, 60 ou 80 ml/min ~ :
pour différentes solutions de prélavage des hématies:
at solution de NaCI 0,15 M (300 mos) b) solution de NaCI 130 mos + glucose 130 mos.
a) --Prélavage Par NzCl 300 MOg S
-- ~ ~1 00 28 m ~ S2 ~ ~~ 28 M
débit ml/Min rat net ~ ~lt brut %
51,9 ' 3~4 38,8 31 ,6 ~:
. 27,7 24~7 ~ 80 19,3 17,7 --S1 --0~28 ~In ~ S2 ' 0~41 n~
d~bit m~,/mi~ rdt ne'c % rdt brut ;t 51, 6 32 , 3 40 . 39,6 28~7 36,6 28,3 38,~ 27,5 ~- S1 - 0~41 m2 ~ S2 ~ 0~28 m debit m~min rtlt net ~ r~lt b~ut %
50,75 46,2 50~57 39~5 42,4 39,2 . 80 34,4 32~6 .~
:.: . .: . - ~: .~ : . . :
: : :: .. ,: : : :, : ., . ., . ,.. ,", , ~ , . . ..
~,.: - :: - . : .

~ b) - Prelavages NaCl 130 mos + glucose 13Q.mos :
- Sl = 0,28 m2 S2 = 0,28 m2 débit ml/min rdt net ~rdt brut %
51,8 46,8 52 45,75 48,5 42,1 51,5 45,7 - Sl = 0,28 m2 S2 = 0,41 m2 débit ml/min rdt net %rdt brut 43,1 34,2 50,4 46,2 45,4 45,1 46,6 3g,7 - Sl = 0,41 m2 S2 = 0,28 m2 débit mllmin rdt net %rdt brut %
3?~45 27,4 38,7 37,7 38 37,8 38 37,15 Les résuItats ainsi obtenus et compares à ceux de la figure 8 indiquent que.selon certaines conditions .
expérimentales optimales il est possible d'ameliorer le rendement d'encapsulation d'une substance dialysable et que ces valeurs:sont proches de 45 a 50 % en rendement final, selon le globule rouge utilise. De:meme, les valeurs des rendements net et brut se rapprochent, ce qui traduit la diminution de la perte de substance dialysable. Des conditions optimales peuvent etre recherchees pour des :
valeurs dif.ferentes de Sl et S2.
~7 .
~, ~ . ~ . . ! . . . ' ~22~653 ~ 44 Influence de I 'âge du globule rouge Les essais effec~ués ont montré qu'il n'y a pas de variation signif;cative du rendement d~encapsulation lorsque les hématies utilisées ont été prélevées depuis moins de 5 jours. Une diminution progressive et lente du rescel lement se produit après cet te da te .
Les exemples suivants donnent les principaux résultats expérimentaux obtenus avec les globules rouges contenant de 1 ' IHP encapsulé par le procédé de I 'exemple 5.

La figure 11 indique la relation obtenue entre la P50 de la courbe de saturation et la concentration en IHP incorporé
dans les globules rouges humains. Le coefficient de corrélation est de 0,916.
Les courbes de la figure 12 indiquent les modifications de la saturation de I 'hémoglobine en fonction de la pression d 'oxygène.
L'étude des courbes de la figure 12 indique que mal-gré une baisse de la saturation de I 'hémoglobine pour une pres-sion artérielle de 100 mm de Hg, la différence artério-veineuse obtenue à 30 et 40 mm est très significativement augmentée. Ces différences sont déjà très importantes pour un déplacement de 10 à 20 min des P50 des courbes de saturation.

Des globules de porc transformés dans des conditions équivalentes aux globules humains de I 'exemple 14 ont été trans-fusés à des animaux (mini-porc) par exanguino-transfus;on. Des volumes de 300 à 500 ml reconstitués à I 'hématocrile de I 'hémato-crile de I 'animal ont été utilisés dans chaque essai~
s' : :
::: : : :
~2Z16S3 L'équilibre acldo-basique et les paramè~res de l'oxygé-nation son~ donnés avan~ e~ après transfusion dans le ~ableau ci -dessous:
Av~e trzsnsPusi on ADr~S tr~ns~usion . . ~

5~50mm~g 30.7 ~ 1.041.2 ~ 4,0~ ' p~a 7.36! 0.057.34~ 0.04 pE~v 7.33~ 0.057.28~ 0.05 O2 mnI3g 39.0 + 3.235.8 ~ 5.4 ~vC02 ~Hg 48.1 ~ 6~ 545.3 l10.5 10co2~a mn/l 2i.3 -- 3.519.0--4.8 C02~v ~l 25.9 ~ 3.621,3 + 5.8 D g/l~D ml 11.1 ~ 2,,011.2 + 1.5 ~,~0.0~ ' ~
~
Le transport de I 'oxygène et la cession tissulaire de 15 1 'oxygène sont donnés avant et après transfusion dans le tableau ci -dessous:
46 ~Z21653 Avant transfusion Apres transfusion __ . ... ~ _ _ PaO2 mmHg 82.5 - 10.3 97.5 - 10.6 Pv02 mmHg 36.7 - 5.3 35.1 - 3.7 CaO2 ml/100 ml13.9 + 2.5 14.1 + 1.5 Cv ~2 ml/100 ml 9.2 + 2.9 5.6 + 1.7 +++
DAV ml/100 ml 4.8 - 1.1 7.6 - 0.3 +++
Q Q/mn/Kg 0.210- 0.029 0.144- 0.054+++
V~2 ml/mn/Kg 10.3 - 1.6 10.6 - 3.6 Part mnHg 91.5 - 10.2 87.2 - 22.8 + P<0.05 +++ P<O.001 Ces resultats indiquent que, pour une diminution de - l'affinité de l'hemoglobine pour l'oxygene, l'animal entier repond par une diminution du debit cardiaque et un elargisse-ment de sa différence artério-veineuse. La cession d'oxygène tissulaire est ainsi favorisée par rapport au transport de l'oxygene. La figure 13 indique l'evolution du débit cardiaque en fonction de la P50 chez six porcs exanguino-- transfuses avec des globules de porc ayant incorpore des quantites variables d'IHP.

Caracterisation des hematies rescellees 1~) Microscopie electronique Comme pour la figure 6 avec l'IHP, la figure 14 montre, en microscopie electronique à balayage, la morphologie comparee des globuIes rouges temoins, leg~rement echynocytaires, par rapport aux globuIes lyses et rescelles ayant encapsule du Desferal. Ces derniers sont de taille comparable. La tendance echynocytaire est reduite. Il s'agit essentiellement de stomatocytes de type 1 ou 11 - 5 a lo % de la population est constituee de formes sphero-echynocytaires ou de vesicules.
,~ .
.
.
~: :
:lZ21653 2~ ) Caractéristiques hématologiques La figure 15 compare la distrlbution érythrocytaire obtenue au Coulter S d'un culot globulalre lavé (courbe a3 à
cel le qui est obtenue après rescel lement (courbe b) . Un léger gl is- ' S sement de la dislribution vers les formes microcytaires est ob servé .
Le tableau ci-dessous regroupe les principales caracté-ristiques de ces globules rouges.
_ .
a~~e (4) Posc (2) t~no~n . tr~sfor~t ~mointr~~sfo Volume globulaire mo~ (10~ 3? 9~,~4 84 ~3,1 5j 52,2 _ Conc. h~snoglobinc . .
globl21aire mr~ne 32,3~;1,9 30 ~,5 31 32,2 (G/100 ml) . .
. _ . .
~ndice ~e ~istri~ 15,4~2,823,1+7~2 21,3 29,2 ff~n globulaire . . :
. . ~
. . .
I l apparalt d'après ces résultats que les hématies Iysées et rescel lées selon le procédé sont faiblement microcytaires et normochromes, avec un élargissement de la distr;bution volu-mique vers les valeurs faibles.
3~) Caractéristiques ;mmunologiques Les hémat;es Iysées et rescel lées ont été examinées pour des modifications qualitatives et quantitatives des antigènes de groupes sanguins. Les méthodes conventionnelles de l'immuno-hématologie ont été uti I isées y compris les tests de Coombs et le traitement aux enzymes protéolytiques.
--'~
12Z~6~;3 Les aggrégats obtenus ont une taille un peu réduite mais sont complets et parfaitement v;siblcs. De tel les hématies peuvent donc, après leur transformation, ê~re compatibilisées par rapport à un receveur potentiel.
Aucune modification significative1 quantitative ou qua-litative, n'a été observée, pour des hématies ayant encapsulé du Desféral, dans les systèmes antigéniques suivants:
ABO - Rh - CcDEe - Kk kpa kpb - M~Ss - Pl - lea - leb - Fya -Fyb _ JKa _ ~Kb l ua Ainsi que pour les an~igènes:
Ku - Gerbich - Fy3 - JK3, Ies antigènes du système P - les antigènes Cartwright et Vel.
Aucune anomal;e des antigènes de polyagglutinabilité
l S n ' est observée en sérum AB .
Ces résultats indiquent ciairement la non modification des antigènes publics, privés ou de polyagglutinabilité pour les hématies transformées. Ce résultat est essentiel pour l'utilisation in vivo de ces hématies comme transporteurs de substances d'inté-rêt biologique en particulier immunomodulateurs susceptibles d'agir sur la réponse immunitaire du receveur.

~ncapsulation de MDP et de ses dérivés Parmi les nombreux immunomodulateurs de synthèse ou d'hémi-synthèse la famille au muramyldipeptide semble très prometteuse .
On a vérifié qu'il est possible d'encapsuler certaines de ces substances à I 'aide du procédé.
On a étudié la stabilité dans le temps, à l'intérieur des érythrocytes stockés à 4~C. ~
100 mg de Murabutide Ibutyl MDP~ (Choay) dans 10 ml de sérum physiologique sont mélangés à 200 ml de culot globu-laire lavé, à 70 % d'hématocrite. Après Iyse et rescellement selon le procédé de I 'exemple 1, 23 mg (23 %) sont retrouvés dans 96 ml de culot globulaire rescellé et lavé~ ayant un hématocrite de 64%.
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~ . :: : ~ . .
49 ~lG~
Durant une durée de 8 jours, à l'aide d'un dosage ef~ectué par HPLC, aucune modification significative de la concen-tration de cette substance dans les erythrocytes cons~rvés à 4~C
n'est observée, ce qui signifie que ce type de composé peptidique n'est pas dégradé à l'intérieur des érythrocytes duranl la conser-vation, à la différence de ce qui est observé avec l'insuline, en l'absence d'inhibiteurs de protéase.
Durant le même laps de temps, aucune concentration significative de ce dérivé du MDP n'est observé à l'extérieur des globules rouges, ce qui indique qu'il n'existe pas une fuite signi-ficative transmembranaire de ce composé. Le rendement d'encapsu-lation (23 %) est relativement faible~ mais peut être attribué au caractère hydrophobe du composé et à son interaction avec la membrane érythrocytaire.
Une dose thérapeutique normale de S mg telle qu'elle est estimée actue11ement ne nécessiterait qu'environ 20 ml de sang transformé, ce qui indique l'extrême efficacité de ce mode de transport ; une telle opération permet de disposer très aisément, pour le même malade, de 5 doses utiles échelonnées dans le temps. En outre, cet exemple n'est pas limitatif de la dose encapsulable (environ t 9/100 ml pour le Desféral).

Encapsulation d'interféron cy D'une manière identique à celle de l'exemple 17, une solution d'interféron ~ purifié contenant 2,1.10 unités dans 1 ml est mélangée à 220 ml de culot globulaire. Au préalable, compte tenu de la très faible concentration protéique, le circuit de dialyse est incubé durant 30 min par une solution à 1 d'albumine humaine pour limiter les pertes par absorption non speci~ique dans le circuit de dialyse. Après Iyse et rescellement, 840 000 unités d'interféron (Rdt = 38 ~) sont retrouvées dans les 125 ml de culot globulaire rescellés et lavés. Il est à remarquer que ce rendement est proche de celui qui a été obtenu pour l'album;ne (exemple 4). ~ '~
7' ~Z21653 Dans les limites du tltrage biologique effectué, il n'y a pas de diminution nette du titre de I ' interféron , durant une période de ~3 jours à 4~C, après son encapsulation dans les globules rouges, ce qui indique une excel lente conservation in vitro de ce composé après son encapsulation.
Des rendements d'encapsulation équivalents sont obtenus pour 1 ' interféron 2S et I ' interleukine 11.
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.: : ~
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Claims (10)

Revendications:

1. Dispositif destiné à l'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce qu'il comporte au moins:
- un premier élément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, - un dispositif d'alimentation en continu d'une suspension d'érythrocytes dans le compartiment primaire dudit élément de dialyse, - un moyen permettant d'amener une solution aqueuse dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse, - un moyen assurant l'introduction de la substance à activité biologique dans le compartiment primaire de l'élément de dialyse, - un moyen assurant le transfert de la solution effluente du compartiment primarie dans un ensemble de rescellement comportant au moins un moyen pour augmen-ter la pression osmotique et/ou oncotique de la solution effluente.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'ensemble de rescellement est constitué par un second élément de dialyse comportant au moins un comparti-ment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, la solution effluente étant amenée dans le compartiment primaire par le moyen de transfert et le moyen pour augmenter la pression osmotique étant constitué par une solution hypertonique par rapport à la solution effluente, ladite solution hypertonique étant contenue dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse.

3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'ensemble de rescellement est constitué par une enceinte comportant un moyen d'amenée d'une solution hypertonique par rapport à la solution effluente.

4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que le dispositif comporte entre l'élément de dialyse et l'ensemble de rescellement un moyen de chauffage.

5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que l'ensemble de rescellement est muni d'un moyen de chauffage.

6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est muni d'un moyen de contrôle de la pression osmotique des suspensions érythrocytaires.

7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est muni de moyen de contrôle de la pression des fluides circulant dans le dispositif.

8. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé
en ce qu'il comporte un élément de dialyise supplémentaire comportant au moins un compartiment primaire et un compar-timent secondaire séparés par une paroi de dialyse, ledit compartiment primaire étant alimente par le dispositif d'alimentation en continu et l'effluent de co comparti-ment primaire alimentant ledit premier élément de dialyse.

9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé
en ce qu'il comporte un moyen d'amenée d'une substance à activité biologique dans le circuit entre l'élément de dialyse supplémentaire et ledit premier élément de dialyse.

10. Dispositif selon las revendication 1, caractérisé
en ce qu'il comporte un moyen de recyclage de l'effluent de l'ensemble de rescellement dans le premier élément de dialyse.