JP2809736B2 - 赤血球細胞の凍結乾燥法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生化学、及び医科学の広範な分野、及び特
に赤血球細胞の保存、貯蔵、及び再形成方法に関する。

血液は人間体の主要な組織であり、かつ肺から末梢組
織へ酸素を供給するための支配的な役割を有している。
前記の役割は、赤血球すなわち、赤血球細胞（RBC）に
よって遂行される。酸素は、肺からヘモグロビンと呼ば
れる赤く、鉄を含有するタンパク質により遂行される交
換−拡散系により供給される。ヘモグロビンが酸素と結
合してオキシヘモグロビンが形成され、酸素が組織に渡
された後オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンに
還元される。

赤血球細胞膜は、膜二重層及び細胞骨格という２つの
主要な構造単位を含む。脂質二重層及び膜内在タンパク
質は、膜二重層を形成し、ほとんど構造的な強度を有せ
ず、また小胞形成によって即時に細片化する。他の主要
な成分である膜骨格は膜二重層を安定化し、かつ変形に
対する抵抗力を提供する。前記した細胞骨格は、おそら
くタンパク質−タンパク質の結合ばかりではなく脂質タ
ンパク質の結合によっても赤血球膜中の二重層に連結さ
れる。前記したヘモグロビン、及び他のRBC成分が赤血
球細胞膜に含有されている。

成人では、骨髄に新鮮な赤血球細胞の形成作用があ
る。赤血球が血液に混入されれば、該細胞は約120日の
平均寿命を有する。平均的な人間では、毎日約0.83％の
赤血球が食作用、溶血若しくは機械的な損傷によって破
壊され、また除去された分の細胞が骨髄により補充され
る。

広い種類の外傷及び医療上の処置において全血液若し
くは種々の血液成分の輸血が必要とされている。全ての
患者が全血液を必要とするわけではなく、かつ実際的に
は、全血液成分の存在によって医療上の問題が生ずる。
個々の血液分画を輸血時にその生物学的活性を保証する
のに最適な特定の条件下で貯蔵することができる。例え
ば、処理センターで供血者の血液が提供される場合、赤
血球が分離されかつ種々の方法で貯蔵される。前記の細
胞は、通常200から300mlの容量及びヘマトクリット値
（血球容量％として）70から90を有する封入された単位
としてクエン酸−リン酸−デキストロース中で４℃で５
週間に至るまで貯蔵可能である。また、赤血球をグリセ
リンで処理し、その後−30゜から−196℃で冷凍してグ
リセリン溶液中で７年に至るまで貯蔵することも可能だ
が、輸血のために充分に生存させるため、低温で冷凍さ
せておかなければならない。前記の双方の方法は、赤血
球の望ましい生物学活性の崩壊を避けるために貯蔵温度
を注意深く維持することが必要であり、また輸血された
細胞の少なくとも70％が24時間の生存時間を与えるが、
それはアメリカ血液銀行規格に従い、輸血業務における
使用に対して許容可能であると考えられる。

前述した様に、赤血球細胞の特定の貯蔵温度、若しく
は他の貯蔵条件の維持に依存しない貯蔵方法が必要とさ
れている。前記の方法によって医療用赤血球の利用が容
易となる。

前述した所望の方法の１つとしては、細胞が長期間に
わたり室温で貯蔵でき、かつ哺乳動物に対する使用にあ
たって容易に再形成できるということから、赤血球細胞
の凍結乾燥法（冷凍乾燥法）が挙げられる。しかしなが
ら、本発明以前には、完全な細胞骨格及び生物学的に活
性なヘモグロビン、すなわち生存可能な赤血球細胞を形
成するように細胞を再形成することが可能な方法で赤血
球を冷凍乾燥することは不可能であった。従来技術に従
ってRBCを凍結乾燥する場合には、例えば水溶液若しく
はリン酸緩衝生理的食塩水溶液のいずれか中で再形成さ
れた細胞は代謝を営めなくなる程破壊されてしまい、そ
の細胞のヘモグロビンは酸素を運搬することはできな
い。凍結乾燥されかつ再形成されたグルタルアルデヒド
固定赤血球は、主に凝集反応分析に使用できることが見
出されている。

本発明の方法によれば、細胞の構造及びヘモグロビン
の生物学的な活性を維持する条件下で赤血球を凍結乾燥
でき、かつ医療水準で使用されうる凍結乾燥された赤血
球の再形成が可能となる。簡潔には本方法は、炭水化
物、好ましくは両親媒性の生物学的に適合する高分子、
及び多数のアニオン基を有する生物学的に適合する化合
物、すなわちポリアニオンを含有する生理学的に緩衝さ
れた水溶液に多数の赤血球を浸すことを含む。用語“両
親媒性”とは、単一の分子に、疎水性及び親水性部分を
有するものを意味する。前記した浸漬の後前記の溶液を
冷凍し、かつ冷凍した溶液を乾燥させて、再形成後に著
しい割合で生存可能な赤血球を製造する凍結乾燥された
赤血球が得られる。

本発明の炭水化物としては、細胞に対して生物学的に
適合するもの、すなわち、細胞を破壊しないものが挙げ
られ、また細胞膜を透過若しくは透過可能なものが好ま
しい。前記した炭水化物は、二糖類では有意な程度で膜
を透過しないことから、単糖類から成る群から選択する
ことができる。ペントース及びヘキソースで約7.0から3
7.5％、好適には約23％の濃度であるものが好ましい。
キシロース、グルコース、リボース、マンノース及びフ
ルクトースが特に効果的に利用される。

前記の高分子は、溶液中に3.5％から飽和に至る濃度
で添加することができ、約1,000から約360,000の範囲の
分子量を有する。前記高分子の分子量は、好ましくは約
5,000から約80,000の範囲のものであり、約5,000から約
50,000の分子量のものが最も好ましく、また溶液中に約
3.6％から前記高分子の溶解度の上限に至る濃度で添加
される。ポリビニルピロリドン（PVP）、及びポリビニ
ルピロリドン誘導体とデキストラン及びデキストラン誘
導体からなる群から選択される高分子が著しく効果を与
える。例えばポロキザマー（poloxamers）の様な他の両
親媒性の高分子をそれらの種々の形態のいかなるものに
おいても使用することができる。アミノ酸による高分子
（すなわち、タンパク質）若しくは、ヒドロキシエチル
スターチもまた、利用可能である。赤血球細胞の凍結乾
燥において、炭水化物−高分子溶液を使用することによ
って、生物学的に活性なヘモグロビンを含む完全な細胞
が著るしい割合で再生される。いかなる理論へ関係づけ
ることを意図するものではないが、前記の高分子の両親
媒特性によって、水性の環境へ親水性の部分を進展させ
ることによって膜表面を保護すると同時に細胞膜に固着
させるのである。これによって例えば細胞の凝集といっ
た他の問題を生じる細胞膜の損傷が軽減されるのであ
る。以下、ここで使用する高分子の分子量1000を「Ｋ」
として記載する。例えば分子量10,000の場合は、10Kと
記す。

ポリアニオンとしては、赤血球の細胞膜を破壊しない
ものが挙げられ、多価のリン酸基、硫酸基若しくはカル
ボン酸基が好ましく、前記溶液中に0.01重量％から飽和
に至る量で添加することができるが、約0.1から約1.0％
の最少濃度が効果的である。前記のポリアニオンがリン
酸基、硫酸基、若しくはカルボン酸基であるアニオン基
を有することがより好適である。特に、ピロリン酸、三
リン酸、リン酸化したイノシトール（三リン酸イノシト
ール及び６リン酸化イノシトールを含む）、2,3−ジホ
スホグリセリン酸、アデノシン三リン酸、及びヘパリン
が著しく効果的に利用できる。

前記した多数のアニオン基が高分子及びポリアニオン
の双方のに存在する、前述した様な高分子性化合物を使
用することから付加的な利点が生ずる。デキストラン誘
導体、例えばリン酸化したデキストランの使用は、高分
子であることの利点及びまた、前記した溶液中でポリア
ニオンを提供することから効果的である。それ故にリン
酸化したデキストランの様な化合物は、高分子及びポリ
アニオンと同様に機能する。

後述するデータにより示される様に、前記した溶液に
よって赤血球細胞が、冷凍、水分昇華、及び再形成など
のストレスにさらされることを可能とし、かつ哺乳動物
中で赤血球として機能することのできる細胞が得られる
ように再形成し得る媒質が提供される。

専門用語、若しくは文脈により他の指示がなされない
限り、本明細書中で前記した全ての割合は重量パーセン
ト（すなわち、溶液全重量に対する溶質の重量）を示
す。

前述した様に、本発明の方法によって凍結乾燥及び完
全かつ生物学的に活性な赤血球の再形成に使用される媒
質が提供される。本発明の媒質は新規であるが、装置及
び関連する技術については、種々の材料の凍結乾燥法で
当業者に周知であることが了解されるので、ここでは具
体的な生物学的試料、及び特有の温度のみ、及び本実施
例で利用した装置について記載する。この記載によって
当業者は、冷凍乾燥及び完全でかつ生存可能な赤血球細
胞の再形成方法についての本発明の媒質が利用可能とな
る。

用語“凍結乾燥”とは広く、物質を冷凍し、及びその
後、ある成分、すなわち水の濃度を生物学的若しくは化
学的反応を維持しない水準にまで昇華若しくは放出によ
って減少させることとして定義される。通常、乾燥工程
は高真空中で達せられる。しかし細胞、具体的には赤血
球の貯蔵に関しては、乾燥の度合い（残留水分量）が細
胞の室温における長期の貯蔵に耐える能力に対して決定
的に重要である。本発明の方法においては、残留水分量
が10％未満、好ましくは５％未満、及び最も好ましくは
３％未満にまで凍結乾燥される。

例１ 封入した生存可能血液の赤血球細胞を病院の血液提供
センターから得るか、若しくはヘパリンを抗凝固剤とし
て健康なボランティアから採血した。

前記血液細胞を再生した試料をリン酸で緩衝した生理
的食塩水（10mMの１−及び２−塩基リン酸ナトリウム、
150mMの塩化ナトリウム、5mMのデキストロース、及び10
mMのアデノシン、pH7.2）を使用し14,000rpmでの６から
10秒の遠心分離を３回行なって洗浄し、プラズマ及び／
若しくは赤血球細胞に由来する他の型の細胞を分離し
た。

前記した封入された赤血球細胞の試料をその後、pH7.
2のPBS若しくは脱イオン水中に21.7から26.3％のグルコ
ース、18.1％10K若しくは12.8％24Kのポリビニルピロリ
ドン、及び2.3％の６リン酸化イノシトール（IHP）を含
有する凍結乾燥用緩衝液中に懸濁させた。

前記した懸濁液をその後フラスコへ移し、続いて試料
が冷凍するまで液体窒素（196℃）中に浸した。前記し
たフラスコ液体窒素中でむらなく回転し、フラスコ壁上
に溶液を均等に分散させた。

冷凍した試料を内室が−56℃で100μm Hg未満で作動
している卓上凍結乾燥器（bench top lyophilizer）、
ラブコンコモデル4.5（Labconcomodel4.5）へ移した。
試料を結晶化してもろくなるまで完全に乾燥させてから
（６−24時間）、前記のフラスコを室温に戻した。

前記の試料を、リン酸で緩衝した生理的食塩水中に2
5.5％のスクロースを含有する溶液を使用して、37℃で
再水和させた。再水和させる溶液を、乾燥前の試料の初
期容量と同等な容量まで加えた。

前記の試料をエッペンドルフ（Eppendorf）型の小型
遠心分離機中で14,000rpmで遠心分離し、懸濁液中の再
水和赤血球細胞をペレット化した。

結果を次の様に示す。

PBS単独で凍結乾燥した赤血球細胞では、０％の細胞
再生及び０％のヘモグロビン再生という結果であった。

例２ 凍結乾燥用緩衝液中のグルコースを他の炭水化物に置
換えて例１に記載した方法をくり返し実施した。示した
ものを除き、他成分及び条件は、例１に記載したものと
同等である。結果を次の様にまとめる。

凍結乾燥用溶液中のトレハロース、スクロースが細胞
再生の上限を示したが、ヘモグロビンは再生されなかっ
た。マルトースは、細胞若しくはヘモグロビンの再生は
見られなかった。

例３ 例１に記載の方法を前述の実施例の凍結乾燥に使用し
たものと異る分子量及び濃度のポリビニルピロリドンに
置換えてくり返し実施した。示したものを除き、他の全
ての条件は、例１に記載した通りである。結果を次の様
にまとめる。

本例での1.4％360KのPVPの使用によれば、完全に細胞
が溶解し、かつヘモグロビンは再生されなかった。

例４ 例１に記載した実験を、凍結乾燥用緩衝液中でポリビ
ニルピロリドン以外のポリマーを使用して実施した。そ
の結果を次の様にまとめる。

例５ 例１に記載した実験を18.1％10KのPVPのもとで、６リ
ン酸化イノシトール及びピロリン酸の濃度を変更してく
り返し実施した。他の条件は例１に記載した通りであ
る。結果を次の様にまとめる。

例６ 凍結乾燥用緩衝液中のポリアニオンとして６リン酸化
イノシトール若しくはピロリン酸以外のものを使用し
て、例１に記載した実験をくり返し実施した。他の条件
は例１で記載したものと同一である。結果を次の様に記
載する。

前述したことから、当業者は本発明の本質的な特徴を
容易に確認することができ、また本発明の精神及び範囲
から脱することなしに種々の用法及び条件に対して本発
明を適用することができる。形態の形更及び均等物によ
る置換が、環境に応じ若しくは環境に応じて手段が講じ
られる様になされても良くまた、本明細書ては特定の用
語を利用したが、それらは記述のうえで使用したもので
あり本発明の目的を制限するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エス フランコ アメリカ合衆国 オハイオ州 45230 シンシナチ サンドクリフ ドライヴ 1825 (72)発明者 マーリイ ウェイナー アメリカ合衆国 オハイオ州 45242 シンシナチ スポーキイ リッジ レー ン 8915 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A01N 1/02

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】約7.0から37.5％の濃度で溶液に添加され
   る単糖類；約3.5％から飽和に至る濃度で溶液中に添加
   される約1,000から約360,000の分子量を有する高分子;
   0.01重量％から飽和に至る濃度で溶液中に添加されるポ
   リアニオンを含有する緩衝溶液に多数の赤血球を浸し；
   前記溶液を冷凍し；及び水分を昇華させて赤血球を乾燥
   させることを含む、赤血球の凍結乾燥法。
2. 【請求項２】前記した高分子が両親媒性である、請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】ａ）約7.0から37.5％の濃度で溶液に添加
   される、キシロース、グルコース、リボース、マンノー
   ス、及びフルクトースからなる群より選択される単糖
   類； ｂ）少なくとも0.01重量％の濃度で溶液に添加される、
   ピロリン酸、三リン酸、リン酸化したイノシトール、2,
   3−ジホスホグリセリン酸、アデノシン酸リン酸、リン
   酸化したデキストラン、ヘパリン及びポリカルボン酸か
   らなる群から選択される生物学的適合性ポリアニオン； ｃ）少なくとも3.5％の濃度で溶液中に添加される、ポ
   リビニルピロリドン及びデキストランからなる群より選
   択される高分子； を含む緩衝溶液中に多数の赤血球を浸し；前記の溶液を
   冷凍し；水分を昇華させて赤血球を乾燥させることを含
   む、細胞膜を有する赤血球の凍結乾燥法。
4. 【請求項４】約7.0から37.5％の濃度で溶液に添加され
   る単糖類；少なくとも3.5％の濃度で添加される約1,000
   から約360,000の分子量を有する高分子;0.01重量％以上
   の濃度で添加されるポリアニオンを含有する溶液を含
   む、赤血球の凍結乾燥媒質。
5. 【請求項５】前記の高分子が両親媒性である、請求項４
   に記載の媒質。
6. 【請求項６】約3.5から約20重量％に至る濃度の約1,000
   から約360,000の分子量を有する高分子を含有する水溶
   液に、凍結乾燥した細胞を接触させる工程を含む、凍結
   乾燥した細胞の再形成方法。
7. 【請求項７】前記の高分子が両親媒性である、請求項６
   に記載の方法。