CH632927A5

CH632927A5 - Verfahren zur herstellung einer masse von in einer physiologischen loesung suspendierten beladenen zellen.

Info

Publication number: CH632927A5
Application number: CH1378677A
Authority: CH
Inventors: Ulrich Prof Dr Zimmermann; Guenter Dr Pilwat; Karin Bock; Hermann-Josef Buers
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich
Priority date: 1976-12-09
Filing date: 1977-11-11
Publication date: 1982-11-15
Also published as: JPS5372890A; DE2655801A1; DE2655801C2; GB1560165A; FR2373289A1; SE445294B; FR2373289B1; IL53594A; SE7713944L; US4224313A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellmembran befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisenden, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der so sich bildenden beladenden Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden.

Verfahren zur Herstellung einer Masse der eingangs bezeichneten Art sind aus der DE-PS 2 326 224, aus der DE-OS 2 326 161 und aus der DE-OS 2 405 119 bekannt. Dabei bezieht sich das aus der vorgenannten Patentschrift bekannte Verfahren auf den Einschluss von Komplexbildnern in aus lebenden Zellen von Lebewesen gebildeten beladenen Zellen und das aus der DE-OS 2 326 161 bekannte Verfahren auf den Einschluss von katalytisch wirkenden Stoffen wie Enzymen oder Pharmaka in beladenen Zellen, wobei bei beiden bekannten Verfahren die Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran durch Einwirkung osmotischen Druckes auf die Zellmembran erzielt wird. Bei dem aus der DE-OS 2 405 119 bekannten Verfahren wird dagegen die Erhöhung der Permeabilität durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erreicht.

Neben der Bezeichnung «beladene Zellen» oder «loaded cells» - die zum Ausdruck bringen soll, dass es sich um Zellen handelt, die mit solchen Substanzen «beladen» worden sind, die sich vom Zellinhalt unterscheiden - sind für die nach den bekannten Verfahren hergestellten Gebilde auch die Bezeichnungen «Membranvesikel», «Ghost-Zellen» oder «Geisterzellen» oder auch «membrane-envelope» bekanntgeworden.

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Für die bekannten Verfahren zur Herstellung der Masse aus beladenen Zellen sind sowohl Zellen, die als Einzelzellen in einer physiologischen Lösung vorkommen, wie beispielsweise Erythrozyten, Lymphozyten, Thrombozyten oder Leukozyten, als auch solche Zellen verwendbar, die - wie beispielsweise Leberzellen - in Geweben als Verbände von miteinander zusammenhängenden Zellen angeordnet sind. Denn der Zellverband eines Gewebes ist durch biochemische oder biophysikalische Massnahmen auflösbar, so dass auf diese Weise in einer Lösung suspendierbare Zellen erhalten werden. Dabei wird bei der Durchfürhung der bekannten Verfahren, insbesondere beim Einschluss der Stoffe in die beladenen Zellen, eine spezifische Eigenschaft der Membran lebender Zellen ausgenutzt, nämlich die, dass eine in Grenzen vorgenommene Permeabilitätserhöhung durch Regeneration der Zellen wieder ausheilbar ist. Die ausgeheilte Membran der beladenen Zellen erlangt daher wieder die semipermeablen Eigenschaften der Membran der ursprünglichen Zellen. Dadurch ist es - abgesehen von der Verwendung von Stoffen, die nach ihrem Einschluss in die beladenen Zellen die Membran zerstören und dadurch freigesetzt werden - möglich, die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit in einer physiologischen Lösung ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen in Wechselwirkung zu bringen, ohne dass die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe in die physiologische Lösung gelangen. Das geschieht dadurch, dass die beladenen Zellen in die die Substanzen enthaltende physiologische Lösung eingegeben werden und die Substanz durch Permeation durch die semipermeable Membran der beladenen Zellen gelangen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, durch das in beladenen Zellen eingeschlossene Enzym Invertase den in einer physiologischen Lösung befindlichen Rohrzucker zu Glucose und Fructose umzusetzen, da sowohl der Rohrzucker als auch Glucose und Fructose durch die Membran gelangen, während das Enzym Invertase in den beladenen Zellen eingeschlossen bleibt. Auch ist es beispielsweise möglich, Zellen mit Urease zu beladen, die gebildeten beladenen Zellen in die Blutbahn eines menschlichen Körpers zu injizieren und,

ohne dass die Urease aus den beladenen Zellen in das Blut freigesetzt wird, den im Blut befindlichen und in die beladenen Zellen eindringenden Harnstoff abzubauen.

Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine Vielzahl von in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffen in Wechselwirkung mit der Zellmembran tritt und diese Wechselwirkung eine Zerstörung der Zellmembran zur Folge hat. Da bei den nach den bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen auf den Fortgang der Zerstörung der Zellmembran kein Einfluss genommen werden kann, sind die nach den bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen in solchen Fällen entweder nur über eine sehr begrenzte Zeit, die je nach der Art der Wechselwirkung sehr kurz bemessen sein kann, oder überhaupt nicht einsetzbar.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ausgehend von den vorgenannten bekannten Verfahren, ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen der eingangs bezeichneten Art zu schaffen, mit der es möglich ist, die Stoffe für eine vorbestimmte Zeit in den beladenen Zellen einzuschliessen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäss der Erfindung dadurch gelöst, dass bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in die beladenen Zellen zur vorzeitigen Zerstörung der Zellmembranen führen, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, so dass die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt wird, in die zellver-trägliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach Einschluss der Stoffe und der weiteren Stoffe in den beladenen Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird.

Bei Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird somit beispielsweise der zur Tumorbehandlung vorgesehene, jedoch die Zellmembran angreifende Stoff Methotrexat zusammen mit einem Protein, beispielsweise Albumin, oder einem Zucker, beispielsweise Saccharose, in den beladenen Zellen eingeschlossen und dadurch erreicht, dass die Membranen der beladenen Zellen etwa doppelt so lange stabil bleiben. Durch Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird somit der Anwendungsbereich der bekannten Verfahren in vorteilhafter Weise erweitert.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäss der Erfindung ferner dadurch gelöst, dass bei Stoffen, die mit der Zellmembran verträglich sind und daher keine Zerstörung der Zellmembran bewirken, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembran und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembranen der beladenen Stoffe nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden.

Wird beispielsweise nach diesem Verfahren gemäss der Erfindung - ausgehend von Erythrozyten - eine Masse von Membranvesikeln hergestellt, in der beispielsweise das bei Enzym-Mangelkrankheiten verwendete Enzym Arginase zusammen mit einer vorbestimmten Dosis eines die Zerstörung der Zellmembran bewirkenden Stoffes, wie zum Beispiel proteolytische Enzyme und Lipid abbauende Substanzen (Pronase, Phospholiphase, Trypsin), eingeschlossen ist, so wird nach Injizieren der beladenen Zellen in die Blutbahn des tierischen oder menschlichen Körpers das Medikament im Körper nach einer vorbestimmten Zeit freigesetzt und zur Wirkung gebracht. Dabei ist es selbstverständlich möglich, eine Mischung von beladenen Zellen mit unterschiedlicher Dosis des die Zellmembran zerstörenden Wirkstoffes in die Blutbahn zu injizieren und so den Verlauf der Freisetzung des Medikaments im Körper in vorbestimmter Weise zu steuern.

Die Verwendbarkeit einer nach den Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Masse aus beladenen Zellen erstreckt sich somit weit über den Anwendungsbereich der nach den bisher bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen. Denn die nach den Verfahren gemäss der Erfindung gebildeten beladenen Zellen können nunmehr, je nach ihrer Zweckbestimmung, entweder als semipermeable Behältnisse für Stoffe, die mit ausserhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen in Wechselwirkung treten sollen oder aber als Transportbehältnisse für Stoffe eingesetzt werden, die nach einer vorbestimmten Zeit aus den Behältnissen freigesetzt werden sollen. Insbesondere der medizinischen Anwendung ist damit ein völlig neues Gebiet erschlossen worden.

Als besonders zweckmässig hat sich erwiesen, dass zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen zusätzlich zu den Stoffen, die die Zerstörung der Zellmembran durch Wasserstoffbrückenbildung oder durch Bildung von kovalenten

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Bindungen mit den zur Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen hemmen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembranen und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembranen der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden. Dadurch wird erreicht, dass die nicht gewünschte zerstörende Wirkung des lediglich für die Wechselwirkung mit ausserhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffes - beispielsweise des zur Krebsbekämpfung einsetzbaren Mittels 6-Fluorouracil - abgebaut wird und die vorgesehene Zerstörung der Zellmembran allein durch die Wirkung des hierfür vorgesehenen Wirkstoffes herbeigeführt wird, womit eine bessere zeitliche Steuerung der gewünschten Zerstörung der Zellmembran verbunden ist.

Bei der Durchführung der Verfahren gemäss der Erfindung kann die Permeabilitätserhöhung je nach den Erfordernissen wahlweise durch Einwirkung osmotischen Druckes oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen.

Für den Fall, dass gemäss der in der DE-PS 2 326 224 und in der DE-OS 2 326 191 gegebenen Lehre die Permeabilitätserhöhung durch Einwirkung osmotischen Druckes erfolgen soll, wird bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung folgendermassen verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zellverträgliche Lösung, die beispielsweise eine mindestens 0,5 mM/1 Magnesium-und/oder Kalzium- sowie Kaliumionen enthaltende wässrige Lösung sein kann, gegeben, deren Osmolarität gegenüber der Osmolarität des Zellinhaltes so niedrig ist, dass durch den in den Zellen dadurch entstehenden osmotischen Druck die Permeabilitätserhöhung der Zellmembran - ohne diese jedoch zu zerstören - bewirkt wird. Falls Erythrozyten zur Herstellung von beladenen Zellen verwendet werden, beträgt der zu wählende Osmolaritätsunterschied etwa einen Faktor 15. In der zellverträglichen Lösung sind ausserdem die in den beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe enthalten oder werden nunmehr eingegeben. Dabei werden die gemäss der durch die Erfindung gegebenen Lehre in die Zellen einzuschliessenden Stoffe in geeigneter Dosierung in die zellverträgliche Lösung eingegeben. Nachdem der Stoffaustausch zwischen den in der zellverträglichen Lösung befindlichen Stoffen und dem Zellinhalt durch die nunmehr eine erhöhte Permeabilität aufweisende Zellmembran erfolgt ist und der Inhalt der sich bildenden beladenen Zellen praktisch der zellverträglichen Lösung entspricht, wird im Anschluss daran die Osmolarität der zellverträglichen Lösung durch Zugabe osmotisch aktiver Stoffe, wie Kalzium-, Kalium- und Natriumionen, auf die Osmolarität des ursprünglichen Zellinhaltes erhöht. Unter osmotisch aktiven Stoffen werden hier Stoffe verstanden, die einen Reflexionskoeffizienten von etwa 0,8 aufweisen, dennoch aber, da sie im allgemeinen in einer zellverträglichen Lösung enthalten sind, einen hinreichenden osmotischen Druck aufbauen. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die so gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmässig, zur Ausheilung der bei der Permeabilitätserhöhung bewirkten Veränderungen der Zellmembran die Zellen etwa 5 Minuten bei 0 °C zu belassen und sodann für etwa 30 bis 60 Minuten auf Körpertemperatur aufzuwärmen.

Für den Fall, dass gemäss der in der DE-OS 2 405 119 gegebenen Lehre die Permeabilitätserhöhung durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen soll, wird bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wie folgt verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zweckmässigerweise zwischen 0 °C und 25 °C hegende Temperatur aufweisende, elektrischen Strom leitende, eine zellverträgliche Elektrolytlösung bildende Flüssigkeit eingegeben. Im Anschluss daran wird die die Zellen enthaltende Elektrolytlösung einem elektrischen Feld mit einer Stärke von 103 bis 105 V/cm solange ausgesetzt, bis die Permeabilität der Zellmembran soweit erhöht ist, dass Moleküle mit einem Radius von wenigstens 0,5 nm durch die Zellmembran gelangen. Dabei wird zweckmässigerweise die Elektrolytlösung durch den Fokus eines elektrischen Feldes geleitet. Die erfolgte Permeäbilitätser-höhung ist beispielsweise bei Anwendung des Verfahrens auf Erythrozyten an der Entfärbung der Elektrolytflüssigkeit infolge des aus dem Zellinneren austretenden Hämoglobins und an der Entfärbung der Erythrozyten zu erkennen. Für den Fall, dass in der zellverträglichen Elektrolytlösung bereits die in den beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe und Substanzen enthalten sind, findet nach der Permeabilitätserhöhung der Stoffaustausch statt. Es ist jedoch auch möglich, nach der Permeabilitätserhöhung die Zellen noch vor dem erfolgten Ausheilen der Zellmembran in eine zellverträgliche Lösung zu geben, deren Osmolarität der Osmolarität des Zellinhaltes der ursprünglichen Zellen entspricht. In dieser zellverträglichen Lösung, in der die in die beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe enthalten sind, findet der Stoffaustausch zwischen den Stoffen und dem Zellinhalt statt. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmässig, die beladenen Zellen in einer Kaliumchloridlösung herzustellen und die gebildeten beladenen Zellen sodann in eine isotone Natriumchloridlösung zu übertragen, die in ihrer Ionenkonzentration und Osmolarität dem Blutserum entspricht.

Ausführungsbeispiel 1

Erythrozyten, die aus Citratblut durch zweimaliges Zen-trifugieren gewonnen worden waren, wurden in einer Lösung im Verhältnis von etwa 1 Volumenteil Erythrozyten zu 10 Volumenteilen Lösung suspendiert, wobei die Lösung 105 mM KCl; 20 mM NaCl; 4 mM MgCl2; 7,6 mM Na2HP04; 2,4 mM NaH2P04. und 10 mM Glucose enthielt. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

Von der so gebildeten Suspension wurden 10 ml in einer hierfür geeigneten Apparatur für 40 jisec bei °C einer elektrischen Feldstärke von 12kV/cm ausgesetzt. Etwa 1 Minute nach Anwendung des elektrischen Feldes, auf die die Hämo-lyse erfolgte, wurden 5 mM pro Liter Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, und 0,1 Vol.-% Albumin der Lösung zugegeben. Nach der Hämolyse, die etwa 5 Minuten dauerte, wurde die Lösung für weitere 5 Minuten auf 0°C gehalten, um einen Ausgleich des Zellinneren mit der Aus-senlösung, die das Methotrexat enthielt, zu erreichen. Im Anschluss daran wurde die Temperatur der Lösung auf 37 °C erhöht, um das Ausheilen der in den Membranen durch das elektrische Feld bewirkten Veränderungen zu beschleunigen. Der Ausheilvorgang war dabei nach etwa 20 Minuten abgeschlossen. Die beladenen Zellen wurden sodann bei einer Beschleunigung, die dem 10 OOOfachen Werf der Erdbeschleunigung entspricht, 10 Minuten lang abzen-trifugiert und das so erhaltenen Sediment an beladenen Zel5

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len in einer physiologischen Lösung suspendiert, die wie folgt zusammengesetzt war:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na2HP04; 2,7 mM NaH2P04.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4, die Suspensionsdichte der Lösung 6%. Um die Wirkung des eingeschlossenen Albumins festzustellen, wurden nach 20 Stunden die beladenen Zellen von der Lösung abzentrifugiert und die Radioaktivität in der Lösung und in den noch intakten beladenen Zellen gemessen. Die gleichen Messungen wurden an beladenen Zellen durchgeführt, die auf gleiche Weise wie oben beschrieben, jedoch ohne Einschluss von Albumin, hergestellt worden waren. Ein Vergleich der Messwerte zeigte, dass nach 20 Stunden 33% mehr intakte Zellen mit eingeschlossenem Albumin vorhanden waren als solche ohne eingeschlossenes Albumin.

Ausführungsbeispiel 2 Die beladenen Zellen wurden, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt. Anstelle der Zugabe von Methotrexat und Albumin in die die Erythrozyten enthaltende Lösung wurde jedoch noch vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die die Erythrozyten enthaltende Lösung Saccharose, das mit dem Radionuklid C 14 markiert worden war, und Pronase P zugegeben. Der Anteil an Saccharose in der Lösung betrug 10 mM, der an Pronase P 0,01 mg pro 100 ml.

Die Wirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Pronase P wurde, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, durch Messung der Radioaktivität in den beladenen Zellen und Vergleich mit beladenen Zellen, in denen zwar Saccharose, nicht aber Pronase P eingeschlossen worden war, festgestellt. Nach 20 Stunden betrug die Menge an Pronase P enthaltenden intakten Zellen nur noch 11% der Menge an intakten beladenen Zellen, in denen keine Pronase P eingeschlossen war.

Ausführungsbeispiel 3 Die beladenen Zellen wurde, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt. Anstelle der Zugabe von Methotrexat und Albumin in die die Erythrozyten enthaltende Lö-

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sung wurden jedoch noch vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die Lösung Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, Albumin und Phospholiphase C zugegeben. Der Anteil an Methotrexat betrug 5 mM, der Anteil an Albumin 0,1 Vol.-% und der Anteil an Phospholiphase C 0,01 mg pro 100 ml.

Wie eine Vergleichsmessung, bei der keine Phospholiphase C eingeschlossen wurde, zeigte, waren nach 20 Stunden nur noch 17% der auf die Vergleichsmessung bezogenen Zahl der intakten beladenen Zellen vorhanden.

Ausführungsbeispiel 4

Zur Herstellung von beladenen Zellen durch Einwirkung osmotischen Druckes wurden Erythrozyten im Volumenverhältnis von 1 : 1 in isotoner, phosphat-gepufferter NaCl-Lö-sung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na2HP04; 2,7 mM NaH2P04.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4.

Von der so gebildeten Suspension wurde 1 ml zur Erhöhung der Permeabilität der Membran der Zellen zu 10 ml einer Lösung gegeben, die 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, 4 mM MgS04 und 50 mM Saccharose enthielt, unter Rühren zugegeben. Diese Lösung wurde 5 Minuten lang bei 0 °C belassen.

Im Anschluss daran wurde die Osmolarität der ursprünglichen Lösung wieder hergestellt, indem eine entsprechende Menge einer 2 molaren KCl-Lösung zugegeben wurde. Die Lösung wurde daraufhin weitere 5 Minuten bei 0 °C belassen und im Anschluss daran die Temperatur für 20 Minuten auf 37 °C erhöht, um das Ausheilen der Membranen zu beschleunigen. Nach Abzentrifugieren der so gebildeten beladenen Zellen aus der Lösung wurden die Zellen in eine isotone, phosphat-gepufferte Natriumchlorid-Lösung der obengenannten Zusammensetzung inkubiert.

Die so gebildeten beladenen Zellen enthielten praktisch die gleiche Konzentration an Methotrexat wie das Aussen-medium, nämlich 98%.

Eine Vergleichsmessung zur Überprüfung der Haltbarkeit der der gebildeten beladenen Zellen ergab etwa das gleiche Ergebnis wie in Ausführungsbeispiel 1.

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1. Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisenden, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der so sich bildenden beladenen Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in den beladenen Zellen zur vorzeitigen Zerstörung der Zellmembranen führen, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, so dass die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt wird, in die zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach Einschluss der Stoffe und der weiteren Stoffe in den beladenen Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird.

2. Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisenden, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der so sich bildenden beladenen Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass bei Stoffen, die mit der Zellmembran verträglich sind und daher keine Zerstörung der Zellmembran bewirken, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche

Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembran und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembranen der beladenen Stoffe nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen zusätzlich die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die physiologische Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembranen und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembranen der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden.

4. Masse nach Anspruch 1.

5. Masse nach Anspruch 2.

6. Masse nach Anspruch 3.