CH632412A5

CH632412A5 - Verfahren zur herstellung einer masse von in einer physiologischen loesung suspendierten beladenen zellen.

Info

Publication number: CH632412A5
Application number: CH1378777A
Authority: CH
Inventors: Ulrich Prof Dr Zimmermann; Guenter Dr Pilwat
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich
Priority date: 1976-12-11
Filing date: 1977-11-11
Publication date: 1982-10-15
Also published as: SE445423B; IL53595A; FR2373290B1; DE2656317C2; DE2656317A1; SE7713945L; JPS5396382A; US4269826A; GB1560166A; FR2373290A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffe, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisende, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der so sich bildenden beladenden Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirken des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden.

Verfahren zur Herstellung einer Masse der eingangs bezeichneten Art sind aus der DE-PS 2 326 224, aus der DE-OS 2 326 161 und aus der DE-OS 2 405 119 bekannt. Dabei bezieht sich das aus der vorgenannten Patentschrift bekannte Verfahren auf den Einschluss von Komplexbildnem in aus lebenden Zellen von Lebewesen gebildeten beladenen Zellen und das aus der DE-OS 2 326 161 bekannte Verfahren auf den Einschluss von katalytisch wirkenden Stoffen wie Enzymen oder Pharmaka in beladenen Zellen, wobei bei beiden bekannten Verfahren die Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran durch Einwirkung osmotischen Druckes auf die Zellmembran erzielt wird. Bei dem aus der DE-OS 2 405 119 bekannten Verfahren wird dagegen die Erhöhung der Permeabilität durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erreicht.

Neben der Bezeichnung «beladene Zellen» oder «loaded cells» - die zum Ausdruck bringen soll, dass es sich um Zellen handelt, die mit solchen Substanzen «beladen» worden sind, die sich vom Zellinhalt unterscheiden - sind für die nach den bekannten Verfahren hergestellten Gebilde auch die Bezeichnungen «Membranvesikel», «Ghost-Zellen» oder «Geister-Zellen» oder auch «membrane-envelope» bekannt geworden.

Für die bekannten Verfahren zur Herstellung der Masse aus beladenen Zellen sind sowohl Zellen, die als Einzelzellen

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in einer physiologischen Lösung vorkommen, wie beispielsweise Erythrozyten, Lymphozyten, Thrombozyten oder Leukozyten, als auch solche Zellen verwendbar, die - wie beispielsweise Leberzellen - in Geweben als Verbänden von miteinander zusammenhängenden Zellen angeordnet sind. Denn der Zellverband eines Gewebes ist durch biochemische oder biophysikalische Massnahmen auflösbar, so dass auf diese Weise in einer Lösung suspendierbare Zellen erhalten werden. Dabei wird bei der Durchführung der bekannten Verfahren, insbesondere beim Einschluss der Stoffe in die beladenen Zellen, eine spezifische Eigenschaft der Membran lebender Zellen ausgenutzt, nämlich die, dass eine in Grenzen vorgenommene Permeabilitätserhöhung durch Regeneration der Zellen wieder ausheilbar ist. Die ausgeheilte Membran der beladenen Zellen erlangt daher wieder die semipermeablen Eigenschaften der Membran der ursprünglichen Zellen. Dadurch ist es - abgesehen von der Verwendung von Stoffen, die nach ihrem Einschluss in die beladenen Zellen die Membran zerstören und dadurch freigesetzt werden - möglich, die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit in einer physiologischen Lösung ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen in Wechselwirkung zu bringen, ohne dass die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe in die physiologische Lösung gelangen. Das geschieht dadurch, dass die beladenen Zellen in die die Substanzen enthaltende physiologische Lösung eingegeben werden und die Substanz durch Permeation durch die semipermeable Membran der beladenen Zellen gelangen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, durch das in beladenen Zellen eingeschlossene Enzym Invertase den in einer physiologischen Lösung befindlichen Rohrzucker zu Glucose und Fructose umzusetzen, da sowohl der Rohrzucker als auch Glucose und Fructose durch die Membran gelangen, während das Enzym Invertase in den beladenen Zellen eingeschlossen bleibt. Auch ist es beispielsweise möglich, Zellen mit Urease zu beladen, die gebildeten beladenen Zellen in die Blutbahn eines menschlichen Körpers zu injizieren und,

ohne dass die Urease aus den beladenen Zellen in das Blut freigesetzt wird, den im Blut befindlichen und in die beladenen Zellen eindringenden Harnstoff abzubauen.

Von Nachteil ist bei der nach den bekannten Verfahren hergestellten Masse von beladenen Zellen jedoch, dass die Wechselwirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit den ausserhalb der Zeilmembran befindlichen Substanzen sich auf den gesamten Bereich der physiologischen Lösung erstreckt und somit die Wirkung des Stoffes nicht auf eine bevorzugte Stelle in der physiologischen Lösung konzentriert werden kann. Werden beispielsweise aus Erythrozyten gebildete beladene Zellen in die Blutbahn injiziert, so verteilen sich die nach den bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen über die gesamte Blutbahn, was zur Folge hat, dass sich auch die Wirkung des in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffes auf den gesamten Bereich der Blutbahn erstreckt. Eine Begrenzung der Wirkung, beispielsweise eines in den beladenen Zellen eingeschlossenen Medikamentes auf eine bestimmte Stelle innerhalb der Blutbahn des Körpers oder gar in einem Organ des Körpers, ist bei den nach den bekannten Verfahren gebildeten beladenen Zellen nicht möglich.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ausgehend von den aus den vorgenannten Druckschriften bekannten Verfahren, ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von beladenen Zellen zu schaffen, nach dem eine Masse herstellbar ist, mit der es möglich ist, die in einer physiologischen Lösung - die beispielsweise das in den Adern oder Venen des tierischen oder menschlichen Körpers fliessende Blut sein kann - durch die beladenen Zellen mitgeführten Stoffen an einer bevorzugten Stelle, im vorgenannten Falle beispielsweise an oder in einem bestimmten Organ des tierischen oder menschlichen Körpers, zur Wirkung zu bringen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäss der Erfindung dadurch gelöst, dass magnetische Substanzen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 20 nm liegt, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenen Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen in die für den Stoffaustausch vorgesehene Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass die beladenen Zellen durch ein auf die magnetischen Substanzen einwirkendes äusseres Magnetfeld an einer vorbestimmten Stelle in der physiologischen Lösung festgehalten werden.

Werden beispielsweise nach dem Verfahren gemäss der Erfindung ferri-, ferro- oder auch paramagnetische Verbindungen, wie beispielsweise Kobalt- oder Nickelferrit oder Magnetit oder Ferritin in die beladenen Zellen eingeschlossen, dann ist es auf einfache Weise möglich, die in der Blutbahn eines Körpers befindlichen beladenen Zellen durch ein an bevorzugter Stelle des menschlichen Körpers angelegtes magnetisches Feld an dieser Stelle festzuhalten und somit die Stoffe - die pharmakologische aber auch andere Stoffe, wie Radionuklide, sein können - an dieser Stelle bevorzugt zur Wirkung zu bringen, wobei zur Erzeugung eines hinreichenden Feldgradienten des magnetischen Feldes gegebenenfalls ein mit physiologischem Kunststoff überzogenes Metallstück an die betreffende Stelle gebracht wird.

Eine vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäss der Erfindung besteht darin, dass bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in die beladenen Zellen durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden - was eine vorzeitige unkontrollierte Freisetzung des Stoffes aus den Membranvesikeln und möglicherweise eine Verteilung des Stoffes in der physiologischen Lösung zur Folge hätte - zur Aufnahme in das Innere der beladenen Zellen zusammen mit den Stoffen, den magnetischen Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, so dass die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt wird, in die für den Stoffaustausch vorgesehene physiologische Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach Einschluss sämtlicher Stoffe in den beladenen Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird. Dadurch wird eine vorzeitige Zerstörung der beladenen Zellen auch bei Stoffen verhindert, die bei alleinigem Einschluss zur vorzeitigen Zerstörung der Membran führen würden, bei ihrer Verwendung in den an einer bevorzugten Stelle in der physiologischen Lösung festgehaltenen beladenen Zellen eingeschlossen bleiben sollen.

Bei Anwendung dieser Variante des Verfahrens gemäss der Erfindung wird beispielsweise zu dem als Mittel zur Krebsbekämpfung bekannten Stoff 6-Fluorouracil und den magnetischen Substanzen beispielsweise das Protein Albumin oder ein Zucker, beispielsweise Saccharose, in die beladenen Zellen eingeschlossen und dadurch erreicht, dass die Membrane der beladenen Zellen etwa doppelt so lange stabil bleiben. Selbstverständlich ist es durch entsprechende Dosierung der die Zerstörung verzögernden Stoffe auch möglich, zu erreichen, dass die beladenen Zellen nur über kurze Zeit intakt bleiben.

Eine besonders vorteilhafte Verwendung der nach der vorgenannten Verfahrensvariante gemäss der Erfindung her5

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gestellten beladenen Zellen besteht beispielsweise in ihrer Verwendung beim Einsatz zur Behandlung von Tumoren. Hierzu wird beispielsweise Methotrexat, das zu den Folsäureantagonisten gehört, die heute neben alkylierenden Wirkstoffen zu den wirksamsten Substanzen für die Behandlung von Neoplasien (Geschwulste) zählen, zusammen mit dem magnetischen Stoff und dem die Zerstörung der Zellmembran verzögernden Stoff in den beladenen Zellen eingeschlossen. Die beladenen Zellen werden sodann in die Blutbahn des Körpers injiziert und durch ein äusseres magnetisches Feld an der Stelle des Tumors festgehalten. Das nach vorbestimmter Zeit freiwerdende Methotrexat entfaltet sodann an der Stelle des Tumors seine Wirkung. Dadurch wird in vorteilhafter Weise verhindert, dass das Methotrexat im gesamten Blutkreislauf verteilt wird, überall im Körper seine Wirkung entfaltet und somit auch gesundes Gewebe angreift. Dieser Nachteil war bei der bisher üblichen Anwendung des Methotrexats, wobei Methotrexat direkt in die Blutbahn injiziert wird, nicht zu verhindern. Bei Verwendung der nach der vorgenannten Verfahrensvariante hergestellten beladenen Zellen wird zudem erreicht, dass eine geringere Dosis als bisher erforderlich für die Behandlung von Tumoren in den Körper eingebracht zu werden braucht oder dass eine geringere Zahl von Injektionen als bisher nötig ist, was dazu beiträgt, negative Nebenwirkungen beim Einsatz dieses Mittels zu vermeiden.

Eine weitere, sehr vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäss der Erfindung besteht darin, dass bei zur Freisetzung aus den beladenen Zellen vorbestimmten, jedoch mit der Zellmembran verträglichen Stoffen, die keine Zerstörung der Zellmembran bewirken, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen, den magnetischen Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene physiologische Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembran und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembran der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört wird. Bei Verwendung von solchen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkenden Stoffen, wie zum Beispiel proteolytische Enzyme und Lipid abbauende Substanzen, wie Pronase, Phospholiphase und Trypsin, ist es beispielsweise nach Injizieren von beladenen Zellen in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers möglich, bestimmte, in den beladenen Zellen eingeschlossene Stoffe, wie beispielsweise Tetrazyklin, dem Ferritin beigefügt ist, durch Festhalten der beladenen Zellen an einer bevorzugten Stelle in der Blutbahn zu sammeln und den Stoff nach einer vorbestimmten Zeit in die Blutbahn freizusetzen. Hierdurch wird eine besonders hohe Effektivität des verwendeten Stoffes erzielt. Dabei ist es selbstverständlich möglich, eine Mischung von beladenen Zellen mit unterschiedlicher Dosis des die Zellmembran zerstörenden Wirkstoffes in die Blutbahn zu injizieren, um so den Verlauf der Freisetzung des Stoffes im Körper in vorbestimmter Weise zu steuern.

Als zweckmässig hat sich ferner erwiesen, dass bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in die beladenen Zellen durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden, die jedoch erst nach einer vorbestimmten Zeit aus den beladenen Zellen freigesetzt werden sollen, zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen zusätzlich zu den Stoffen, die die Zerstörung der Zellmembran durch Wasserstoffbrückenbildung oder durch Bildung von kovalenten Bindungen mit den zur Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen hemmen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembran und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembran der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden. Ein unkontrolliertes Freisetzen des in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffes wird somit in vorteilhafter Weise verhindert.

Eine sehr vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäss der Erfindung besteht ferner darin, dass die zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffe mit einer aus Liposomen bestehenden Umhüllung eines Durchmessers im Bereich von 5 bis 20 nm in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung eingegeben werden.

Da die Liposomen nach ihrer Freisetzung aus den beladenen Zellen sofort in das die Blutbahn angrenzende Gewebe gelangen, ist es somit möglich, bestimmte Stoffe direkt in das Innere von Organen eines Körpers, das durch Blutkapillare nicht erreicht wird, zur Wirkung zu bringen. Dazu ist es lediglich erforderlich, die beladenen Zellen zunächst in der Blutbahn des Organs durch Einwirkung eines von aussen an den Körper angelegten magnetischen Feldes festzuhalten und danach den oder die mit Liposomen umhüllten Stoffe durch Zerstörung der Zellmembran freizusetzen.

Bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung kann die Permeabilitätserhöhung je nach den Erfordernissen wahlweise durch Einwirkung osmotischen Druckes oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen.

Für den Fall, dass gemäss der in der DE-PS 2 326 224 und in der DE-OS 2 326 191 gegebenen Lehre die Permeabilitätserhöhung durch Einwirkung osmotischen Druckes erfolgen soll, wird bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung folgendermassen verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zellverträgliche Lösung, die beispielsweise eine mindestens 0,5 mM/I Magnesium-und/oder Kalzium sowie Kalium-Ionen enthaltende wässrige Lösung sein kann, gegeben, deren Osmolarität gegenüber der Osmolarität des Zellinhaltes so niedrig ist, dass durch den in den Zellen dadurch entstehenden osmotischen Druck die Permeabilitätserhöhung der Zellmembran - ohne diese jedoch zu zerstören - bewirkt wird. Falls Erythrozyten zur Herstellung von beladenen Zellen verwendet werden, beträgt der zu wählende Osmolaritätsunterschied etwa einen Faktor 15. In der zellverträglichen Lösung sind ausserdem die in den beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe enthalten oder werden nunmehr eingegeben. Dabei werden die gemäss der durch die Erfindung gegebenen Lehre in die Zellen einzuschliessenden Stoffe in geeigneter Dosierung in die zellverträgliche Lösung eingegeben. Nachdem der Stoffaustausch zwischen den in der zellverträglichen Lösung befindlichen Stoffen und dem Zellinhalt durch die nunmehr eine erhöhte Permeabilität aufweisende Zellmembran erfolgt ist und der Inhalt der sich bildenden beladenen Zellen praktisch der zellverträglichen Lösung entspricht, wird im Anschluss daran die Osmolarität der zellverträglichen Lösung durch Zugabe osmotisch aktiver Stoffe, wie Kalzium-, Kalium- und Natriumionen, auf die Osmolarität des ursprünglichen Zellinhaltes erhöht. Unter osmotisch aktiven Stoffen werden hier Stoffe verstanden, die einen Reflexionskoeffizienten von etwa 0,8 aufweisen, dennoch aber, da sie im allgemeinen in einer zellverträglichen Lösung enthalten sind, daher einen hinreichenden osmotischen Druck aufbauen. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die so gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen

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Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone, physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmässig, zur Ausheilung der bei der Permeabilitätserhöhung bewirkten Veränderungen der Zellmembran die Zellen etwa 5 Minuten bei 0 °C zu belassen und sodann für etwa 30 bis 60 Minuten auf Körpertemperatur aufzuwärmen.

Für den Fall, dass gemäss der in der DE-OS 2 405 119 gegebenen Lehre die Permeabilitätserhöhung durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen soll, wird bei der Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wie folgt verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zweckmässigerweise zwischen 0 und 25 °C liegende Temperatur aufweisende, elektrischen Strom leitende, eine zellverträgliche Elektrolytlösung bildende Flüssigkeit eingegeben. Im Anschluss daran wird die die Zellen enthaltende Elektrolytlösung einem elektrischen Feld mit einer Stärke von 103 bis 105 V/cm solange ausgesetzt, bis die Permeabilität der Zellmembran soweit erhöht ist, dass Moleküle mit einem Radius von wenigstens 0,5 mm durch die Zellmembran gelangen. Dabei wird zweckmässigerweise die Elektrolytlösung durch den Fokus eines elektrischen Feldes geleitet. Die erfolgte Permeabilitätserhöhung ist beispielsweise bei Anwendung des Verfahrens auf Erythrozyten an der Verfärbung der Elektrolytflüssigkeit infolge des aus dem Zellinneren austretenden Hämoglobins und an der Entfärbung der Erythrozyten zu erkennen. Für den Fall, dass in der zellverträglichen Elektrolytlösung bereits die in den beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe und Substanzen enthalten sind, findet nach der Permea-bilitätserhöhung der StofFaustausch statt. Es ist jedoch auch möglich, nach der Permeabilitätserhöhung die Zellen noch vor dem erfolgten Ausheilen der Zellmembran in eine zellverträgliche Lösung zu geben, deren Osmolarität der Osmolarität des Zellinhaltes der ursprünglichen Zellen entspricht. In dieser zellverträglichen Lösung, in der die in die beladenen Zellen einzuschliessenden Stoffe enthalten sind, findet der Stoffaustausch zwischen den Stoffen und dem Zellinhalt statt. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmässig, die beladenen Zellen in einer Kaliumchloridlösung herzustellen und die gebildeten beladenen Zellen sodann in eine isotone Natriumchloridlösung zu übertragen, die in ihrer Ionenkonzentration und Osmolarität dem Blutserum entspricht.

Ausführungsbeispiel 1 Nach der von W. J. Schnehle und V.D. Deetschreak in J. appi. Phys. 32,2355 (1961) angegebenen Methode wurden zunächst Ferritpartikeln hergestellt, indem 1 Mol Kobaltchlorid und 2 Mole Eisen(III)-chlorid in 21 heissem, destilliertem Wasser gelöst und zu 11 einer siedenden 8 molaren Natronlaugenlösung unter Rühren hinzugegeben wurden. Das gebildete Kobalt-Ferrit wurde sodann mit Wasser bis zum Erreichen der Neutralität gewaschen und danach grosse Partikeln abfiltriert. Um nach dem Einschluss der Ferritteilchen in die beladenen Zellen eine nachträgliche Hämolyse oder die Zerstörung der beladenen Zellen zu vermeiden, wurden die Ferritpartikeln im Anschluss daran mit einem Silikonfilm überzogen, indem die die Ferritpartikeln enthaltende Suspension mit Silikonöl der Handelsbezeichnung AR5 geschüttelt wurden. Nach dem Abtrennen des Silikonöls durch Abzentrifugieren wurden die Ferritpartikeln in eine Lösung folgender Zusammensetzung im Gewichtsverhältnis von 1 : 10 suspensiert:

105 mM KCl; 20 mM NaCl; 4 mM MgCl2; 7,6 mM Na2HP04.; 2,4 mM NaH2P04 und 10 mM Glucose.

Zur Bildung der beladenen Zellen wurden Erythrozyten, unabhängig von der Herstellung der Ferritpartikeln, in einer Lösung der vorgenannten Zusammensetzung im Verhältnis von etwa 1 Volumenteil Erythrozyten zu 10 Volumenteilen der Lösung suspendiert. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

Von der so gebildeten, die Erythrozyten enthaltenden Suspension wurden 10 ml in einer hierfür geeigneten Apparatur für 40 (isek bei 0 °C einer elektrischen Feldstärke von 12 KV/cm ausgesetzt. Etwa 1 Minute nach Anwendung des elektrischen Feldes, auf die die Hämolyse erfolgte, wurden Methotrexat im Verhältnis von 5 mM pro Liter Lösung sowie 1 ml der die Ferritpartikeln enthaltenden Suspension zugegeben. Nach der Hämolyse, die etwa 5 Minuten dauerte, wurde die Lösung für weitere 5 Minuten auf 0 °C gehalten, um einen Ausgleich zwischen dem in dem Zellinnern befindlichen Medium mit der Aussenlösung, die das Methotrexat enthielt, zu erreichen. Im Anschluss daran wurde die Temperatur der Lösung auf 37 °C erhöht, um das Ausheilen der in den Membranen durch das elektrische Feld bewirkten Veränderungen zu beschleunigen. Der Ausheilvorgang war dabei nach etwa 20 Minuten abgeschlossen. Um die mit den Ferritpartikeln beladenen Zellen aus der Suspension zu gewinnen, wurde danach die Suspension mehrmals 2 Minuten lang bei einer Beschleunigung, die dem tausendfachen Wert der Erdbeschleunigung entspricht, zentrifugiert, wobei jeweils die auf den nichteingeschlossenen Partikeln liegende Zellschicht entnommen wurde.

Die erhaltenen beladenen Zellen wurden im Anschluss daran im Volumenverhältnis von 1: 10 in einer physiologischen Lösung suspendiert, die wie folgt zusammengesetzt war:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na2HP04; 2,7 mM NaH2P04.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4. Die so erhaltene Suspension wurde in ein Reagenzglas mit einem Durchmesser von 10 mm gefüllt und dieses zwischen die Polschuhe eines u-förmigen Permanentmagneten gebracht. Wie durch Untersuchung mittels eines Mikroskops nachgewiesen werden konnte, sammelten sich die beladenen Zellen an den an den Polsehuhen anliegenden Reagenzglaswänden.

Bei einer Lagerung der beladenen Zellen bei etwa 4 °C wurden nach etwa einem Tag noch 90%, nach 2 Tagen 87%, nach 4 Tagen noch 65% und nach 7 Tagen noch 53% der beladenen Zellen im Zellsediment nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 2

Die beladenen Zellen wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt, dabei jedoch anstelle der die Ferritpartikeln enthaltenden Lösung 1 ml einer 10%igen isotonen Ferritinlösung der die Erythrozyten enthaltenen Lösung zugegeben. Nach Präparation der gebildeten beladenen Zellen wurde das eingeschlossene Ferritin mittels eines Elektronenmikroskops nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 3

Die beladenen Zellen wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, gebildet, jedoch zusätzlich zu dem Methotrexat und den Ferritpartikeln noch 0,1 Vol.-% Albumin in die Lösung gegeben, in der die Erythrozyten dem elektrischen Feld zur Permeabilitätserhöhung und zum Ein-schliessen der Stoffe ausgesetzt wurden.

Die beladenen Zellen konnten bei einer Temperatur von etwa 4 °C über eine längere Zeit gelagert werden als die nach dem Ausführungsbeispiel 1 gebildeten beladenen Zellen.

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Nach 7 Tagen wurden noch 85% der beladenen Zellen im Zellsediment nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 4 Die beladenen Zellen wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 angegeben, hergestellt. Anstelle jedoch der die Erythrozyten enthaltenden Lösung nach der Applizierung des elektrischen Feldes die das Methotrexat und die die Ferritpartikeln enthaltenden Lösung zuzugeben, wurden schon vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die Lösung, in die die Erythrozyten eingegeben wurden, Saccharose und Pronase P in einer Dosierung eingegeben, so dass diese Lösung 10 mM Saccharose und 0,01 mg pro 100 ml Lösung Pronase P enthielt. Die Saccharose war mit dem Radionuklid C 14 markiert.

Um die Wirkung des in den beladenen Zellen eingeschlossenen Pronase P zu verfolgen, wurden die beladenen Zellen in einer physiologischen Lösung der in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Zusammensetzung aufbewahrt, nach 20 Stunden abzentrifugiert und durch Messung der in der Lösung und der in den noch intakten beladenen Zellen enthaltenen Radioaktivität die Menge der intakten beladenen Zellen festgestellt. Bezogen auf beladene Zellen, die ohne den Einschluss von Pronase P hergestellt worden waren, betrug die Zahl der noch intakten beladenen Zellen nach 20 Stunden nur noch 11%.

Ausführungsbeispiel 5 Die Zellen wurden, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt. Statt jedoch nach der Applizierung des elektrischen Feldes die das Methotrexat und die die Ferritpartikeln enthaltenden Lösungen zuzugeben, wurden schon vor der Applizierung des elektrischen Feldes Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, Albumin und Phos-pholiphase C zugegeben. Der Anteil an Methotrexat in der Lösung betrug 5 mM, der an Albumin 0,1 Vol.-% und der an Phospholiphase C 0,01 mg pro 100 ml Lösung.

Nach Bildung der beladenen Zellen wurde die Wirkung der in den Zellen eingeschlossenen Phospholiphase C durch Messung der Radioaktivität - wie in Ausführungsbeispiel 4

angegeben - festgestellt. Nach 20 Stunden waren noch - bezogen auf beladene Zellen, die ohne Einschluss von Phospholiphase C hergestellt worden waren - nur noch 17% an intakten beladenen Zellen vorhanden.

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Ausführungsbeispiel 6

Zur Herstellung von beladenen Zellen durch Einwirkung osmotischen Druckes wurden Erythrozyten im Volumenverhältnis von 1 :1 in isotoner, phosphat-gepufferter NaCl-Lö-io sung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na2HP04; 2,7 mM NaH2P04.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4.

Von der so gebildeten Suspension wurde 1 ml zur Erls höhung der Permeabilität der Membran der Zellen zu 10 ml einer Lösung unter Rühren zugegeben, die 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, 4 mM MgS04 und 50 mM Saccharose enthielt. Im Anschluss daran wurden weitere 1 ml einer Lösung zugegeben, die 4 mM MgS04, 50 2o mM Saccharose und Ferritpartikeln im Gewichtsverhältnis von 1:10 enthielt. Die so gebildete Lösung wurde 5 Minuten bei 0 °C belassen.

Im Anschluss daran wurde die Osmolarität der ursprünglichen Lösung wieder hergestellt, indem eine entsprechende 25 Menge einer 2 molaren KCl-Lösung zugegeben wurden. Die Lösung wurde darauf weitere 5 Minuten bei 0 °C belassen und sodann die Temperatur für 20 Minuten auf 37 °C erhöht, um das Ausheilen der Membranen zu beschleunigen. Nach Abzentrifugieren der so gebildeten beladenen Zellen 30 aus der Lösung wurden die Zellen in eine isotone, phosphatgepufferte NaCl-Lösung der vorgenannten Zusammensetzung inkubiert.

Die so gebildeten beladenen Zellen enthielten - bezogen auf die Volumeneinheit - praktisch die gleiche Menge an 35 Methotrexat Wie das Aussenmedium, nämlich 98% der in dem Aussenmedium vorhandenen Konzentration an Methotrexat.

Der Nachweis der Wirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Ferritpartikeln geschah wie in Ausfüh-40 rungsbeispiel 1 beschrieben.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffe, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisende, in einer zell verträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der so sich bildenden beladenen Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes gewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Substanzen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 20 nm liegt, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen in die für den Stoffaustausch vorgesehene Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass die beladenen Zellen durch ein auf die magnetischen Substanzen einwirkendes äusseres Magnetfeld an einer vorbestimmten Stelle in der physiologischen Lösung festgehalten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in die beladenen Zellen durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen, den magnetischen Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder ko-valente Bindungen eingehen, so dass die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt wird, in die für den Stoffaustausch vorgesehene zell verträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach Einschluss sämtlicher Stoffe in den beladenen Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei zur Freisetzung aus den beladenen Zellen vorbestimmten, jedoch mit der Zellmembran verträglichen Stoffen, die keine Zerstörung der Zellmembran bewirken, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen, den magnetischen Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembran und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembranen der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen zusätzlich die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, dass nach dem Ausheilen der Zellmembranen und dem Abtrennen der beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden Lösung die Zellmembran der beladenen Zellen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Wechselwirkung mit den ausserhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffe mit einer aus Liposomen bestehenden Umhüllung eines Durchmessers im Bereich von 5 bis 20 nm in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung eingegeben werden.

6. Masse, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.