CN101965195A - 用于药物投送的组合物和方法 - Google Patents

用于药物投送的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101965195A
CN101965195A CN2009801078034A CN200980107803A CN101965195A CN 101965195 A CN101965195 A CN 101965195A CN 2009801078034 A CN2009801078034 A CN 2009801078034A CN 200980107803 A CN200980107803 A CN 200980107803A CN 101965195 A CN101965195 A CN 101965195A
Authority
CN
China
Prior art keywords
particle
cell
agent
aforementioned
igg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801078034A
Other languages
English (en)
Inventor
阿诺·贝迪诺
霍华德·根德尔曼
巴雷特·拉比诺
简·韦林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
University of Nebraska
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
University of Nebraska
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare SA, Baxter International Inc, University of Nebraska filed Critical Baxter Healthcare SA
Publication of CN101965195A publication Critical patent/CN101965195A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开涉及表面改性粒子及其制造和使用方法。所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。

Description

用于药物投送的组合物和方法
政府在本发明中的权利
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的资助号为R01NS036126-12的政府支持下做出。政府在本发明中具有一定权利。
发明背景
技术领域
总的来说，本公开涉及包含涂层粒子的组合物，以及制造和使用这样的组合物用于靶向药物投送的方法。
相关技术简述
在本文中合称为“粒子”的纳粒(包括纳球)和微粒(包括微球)，是直径从约1nm到约10,000nm(10微米)的固体或半固体粒子。这样的粒子可以从各种不同的材料形成，所述材料包括蛋白质、合成聚合物、多糖、核酸、小分子及其组合，并且已被用于许多不同应用中，主要是分离、诊断和药物投送。
已经发现，包含这种粒子的组合物可用于药物投送。例如，美国专利申请公开号No.2006/0073199公开了包含活性剂的粒子可以配制成水性悬液，并通过在粒子上或周围提供表面活性剂涂层而对聚集和粒子生长稳定。
对于开发包含粒子的组合物以及制造和使用它、特别是在目标药物的投送中使用它的方法，存在着持续的需求。
发明简述
本发明的一个方面涉及表面改性的粒子，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层。粒子核心包含活性剂，例如治疗剂或诊断剂(例如小的有机分子或生物大分子)。涂层包含调理素，例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白。也可以使用其他已知起到调理素作用的蛋白。本发明的表面改性粒子一般来说具有从约1nm到约10,000nm的平均粒度。
本发明的另一方面涉及增加活性剂的细胞摄取的方法。所述方法包含将细胞与表面改性粒子在足以增加表面改性粒子的细胞摄取的条件下相接触。粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。
本发明的另一方面涉及用于治疗患有炎性疾病或紊乱的对象的方法，所述方法包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗炎剂)，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述炎性疾病或紊乱相关的症状或病状。
本发明的另一方面涉及用于治疗患有增殖性疾病或紊乱的对象的方法，所述方法包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗增殖药剂例如抗肿瘤剂)，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述增殖性疾病或紊乱相关的症状或病状。
本发明的另一方面涉及用于治疗患有感染性疾病或紊乱的对象的方法，所述方法包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗感染药剂)，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防了与所述感染性疾病或紊乱相关的症状或病状。
另一方面，本发明涉及用于治疗患有神经变性疾病或紊乱的对象的方法，所述方法包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂(例如抗神经变性药剂)，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述神经变性疾病或紊乱相关的症状或病状。
附图简述
图1显示了各种不同的超顺磁性氧化铁(SPIO)纳粒(NP)从Sepharose 4B-CL柱上的洗脱图。显示的是将IgG与氧化的SPIO温育后(实心圆圈)IgG结合的SPIO NP(IgG-SPIO)；与未氧化的SPIO温育的IgG(实心正方形)；以及通过添加过量胺基而阻断的氧化的SPIO(空心圆圈)。
图2显示了结合后当在4℃下储存不同时间时IgG-SPIO的尺寸(单位为纳米)和多分散指数测量值。
图3显示了通过菲洛嗪比色测定法评估的各种不同时间长度后单核细胞摄取SPIO和IgG-SPIO。
图4显示了通过MRI测量弛豫(R2)所评估的各种不同时间长度后单核细胞摄取SPIO和IgG-SPIO。
图5提供的图显示了各种不同条件下单核细胞和巨噬细胞所摄取的SPIO和IgG-SPIO。(A)提供了单核细胞摄取与100kDa葡聚糖结合的不同尺寸的SPIO粒子(62nm、122nm、266nm和394nm)和与10kDa葡聚糖结合的130-170nm的SPIO粒子的图。(B)提供了单核细胞摄取使用具有各种不同浓度IgG的溶液制备的IgG-SPIO粒子的图。(C)提供了单核细胞摄取与游离IgG温育的天然SPIO的图。(D)提供了在4℃和37℃下单核细胞摄取IgG-SPIO粒子的图。(E)提供了单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)摄取IgG-SPIO粒子的图。(F)提供了单核细胞摄取与过量的游离IgG共温育的IgG-SPIO粒子的图。(G)提供了单核细胞摄取与人类血清白蛋白(HSA)结合的SPIO粒子的图。(H)提供的图显示了天然的、氧化的、IgG结合的和HSA结合的SPIO粒子的粒子表面电荷(ζ电位)和粒径。
图6提供的图显示了使用CPMG相循环T2作图MRI对体内SPIO和IgG-SPIO粒子的定量。(A)是显示了将12.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝6)之后脾脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。(B)是显示了将62.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝5)之后脾脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。(C)是显示了将12.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝6)之后肝脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。(D)是显示了将62.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝6)之后肝脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。(E)是显示了将12.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝6)之后肾脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。(F)是显示了将62.5μg SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中(n＝5)之后肾脏中弛豫率(R2＝1/T2)变化的图。
图7是显示了各种不同的IgG与紫杉醇比率下IgG涂层的紫杉醇粒子的ζ电位的图。
图8是显示了各种不同的IgG与利托那韦(ritonavir)比率下IgG涂层的利托那韦粒子的ζ电位的图。
图9是显示了未涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(未涂层)、IgG涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(IgG)和鱼精蛋白涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(鱼精蛋白)的摄取的图。
图10是显示了未涂层的紫杉醇粒子(未涂层)、IgG涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(IgG)和鱼精蛋白涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(鱼精蛋白)的摄取的图。
图11提供的图显示了未涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(未涂层)和IgG涂层的用俄勒冈绿标记的紫杉醇粒子(IgG)的摄取。
详细描述
本发明允许许多不同形式的实施方案。本文中公开的优选实施方案应该被当作是对本发明的原理的示例，因此不打算将要求保护本发明的广度范围限于所显示的实施方案。
本发明的一个方面提供了表面改性粒子，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层。粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。在某些实施方案中，具有包含补体蛋白的涂层的粒子可以与能够减弱组胺释放效应的物质组合使用，所述组胺释放可以被活化的补体蛋白诱导。
本发明的另一方面提供了通过将细胞吞噬性细胞或非细胞吞噬性细胞暴露于包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层的表面改性粒子，增加这些细胞对活性剂的摄取的方法。粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。同与不具有包含调理素的涂层的粒子相接触的细胞相比，观察到了细胞对活性剂的增加的摄取。
另一方面，本发明还提供了通过细胞运输将表面改性粒子投送到哺乳动物对象的靶组织的方法。本文中使用的“靶组织”或“组织靶”是指待治疗哺乳动物的特定组织。这样的靶组织的实例包括但不限于脑和中枢神经系统的其他部分、淋巴系统、肝脏以及任何感染、炎症或肿瘤的位点。
例如，一方面，本发明涉及用于治疗患有炎性疾病或紊乱的对象的方法和组合物，包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述炎性疾病或紊乱相关的症状或病状。一种情况下，活性剂是抗炎剂。
另一方面，本发明涉及用于治疗患有神经变性疾病或紊乱的对象的方法和组合物，包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防了与所述神经变性疾病或紊乱相关的症状或病状。一种情况下，活性剂是抗神经变性药剂。
另一方面，本发明涉及用于治疗患有增殖性疾病或紊乱的对象的方法和组合物，包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述增殖性疾病或紊乱相关的症状或病状。在一种情况下，治疗剂是抗增殖药剂例如抗肿瘤剂。
另一方面，本发明涉及用于治疗患有感染性疾病或紊乱的对象的方法和组合物，包括向所述对象给药大量表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度，并且所述给药有效缓解、治疗和/或预防与所述感染性疾病或紊乱相关的症状或病状。一种情况下，活性剂是抗感染药剂，例如抗真菌剂、抗病毒剂、抗细菌剂或抗寄生虫剂。
因此，本文公开的给药方法涉及给药治疗有效量的所述表面改性粒子。本文中使用的术语“治疗有效量”，是指足以缓解、改善、清除、治疗和/或预防与考虑按照本文公开的治疗方法治疗的疾病或紊乱相关的症状或病状的表面涂层粒子的量。
本文中使用的术语“调理素”是指与粒子或细胞结合的蛋白或肽类，由此增加所述粒子或细胞对吞噬细胞的易感性。当在本文中使用时，已知调理素的具有与相应的全长调理素可比的生物活性的片段，也被当作调理素。例如，IgG的片段典型情况下包括足以与吞噬细胞结合的片段。这样的片段可以进一步包括足够的疏水部分，以与本文描述的疏水粒子表面非共价结合。适合的IgG片段包括例如IgG-Fab片段和IgG-Fc片段。类似地，在本文中使用时，调理素模拟物也被当作调理素。本文中使用的“调理素模拟物”是指具有与调理素可比的生物活性或模拟调理素活性的化合物(包括肽类)。本领域技术人员可以容易地根据调理素的已知生物活性确定组成部分是否是调理素模拟物。
下面对表面改性粒子的描述典型地适用于本文公开的所有实施方案。表面改性粒子的活性剂可以是水溶性不良的或水溶性的。活性剂可以是治疗剂或诊断剂。用于本文公开的组合物和方法的活性剂表现出通常与这些活性剂有关的的药物活性，即使活性剂被细胞吞噬性或非细胞吞噬性细胞摄入并随后投送。
活性剂可以选自各种不同的已知药物化合物，例如但不限于：镇痛剂，麻醉剂，兴奋剂，肾上腺素能剂，肾上腺素能阻断剂，抗肾上腺素剂，肾上腺类皮质激素，拟肾上腺素剂，抗胆碱能剂，抗胆碱酯酶药物，抗惊厥药，烷化剂，生物碱类，变构抑制剂，促蛋白合成甾类，减食欲药，解酸剂，止泻剂，解毒剂，抗叶酸剂，退烧药，抗风湿药剂，精神治疗剂，神经阻断剂，抗炎剂，驱肠虫剂，抗凝剂，抗抑郁药，抗癫痫剂，抗感染药剂(例如抗真菌剂、抗病毒剂例如抗反转录病毒剂和抗生素)，抗组胺剂，抗毒蕈碱药剂，抗分枝杆菌药剂，抗肿瘤剂，抗原生动物剂，抗焦虑镇定剂，β-肾上腺素能受体阻断剂，皮质类固醇，止咳剂，多巴胺能药，止血剂，血液药剂，安眠药，免疫药剂，蕈毒碱药物，拟副交感神经剂，前列腺素，放射药物，镇静剂，刺激剂，拟交感神经剂，维生素，黄嘌呤，生长因子，激素和抗朊病毒剂。
抗肿瘤剂的实例包括但不限于紫杉醇、紫杉醇衍生的化合物、生物碱类、抗代谢物、酶抑制剂、烷化剂及其组合。
活性剂也可以是蛋白酶抑制剂，例如HIV蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于茚地那韦、利托那韦、沙奎那韦、奈非那韦及其组合。
活性剂可以是核苷反转录酶抑制剂。核苷反转录酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮胸苷、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、拉米夫定及其组合。
活性剂可以是非核苷反转录酶抑制剂。非核苷反转录酶抑制剂的实例包括但不限于依法韦仑、奈韦拉平、德拉维拉丁及其组合。
抗炎剂的实例包括但不限于非甾类抗炎剂、非选择性环加氧酶(COX)抑制剂、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、脂氧合酶抑制剂、皮质类固醇、抗氧化剂、肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂及其组合。COX-2抑制剂的实例包括但不限于塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞昔布、罗美昔布、依他昔布及其组合。
诊断剂包括x-射线显影剂和造影剂。x-射线显影剂的实例包括WIN-8883(3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸乙酯)，也被称为泛影酸(diatrazoic acid)乙基酯(EEDA)；WIN 67722，即(6-乙氧基-6-氧代己基-3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酸；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘-苯甲酰氧基)丁酸乙酯(WIN 16318)；ethyl diatrizoxyacetate(WIN12901)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙酸乙酯(WIN16923)；N-乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基乙酰胺(WIN 65312)；异丙基2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)乙酰胺(WIN 12855)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙二酸二乙酯(WIN 67721)；2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)苯乙酸乙酯(WIN 67585)；丙二酸，[[3，5-双(乙酰氨基)-2，4，5-三碘苯甲酰基]氧基]双(1-甲基)酯(WIN 68165)和苯甲酸，3，5-双(乙酰氨基)-2，4，6-三碘-4-(乙基-3-乙氧基-2-丁烯酸)酯(WIN 68209)。造影剂包括预计在生理条件下分解相对快速、从而使任何与粒子相关炎性反应最小化的造影剂。分解可以源自于酶水解、羧酸在生理pH下的增溶作用或其他机制。因此，包括了溶解性不好的碘代羧酸例如碘肥胺(iodipamide)、泛影酸和甲基泛影酸，以及不耐水解的碘代物质例如WIN67721、WIN 12901、WIN 68165和WIN 68209。
其他造影剂包括但不限于磁共振成像助剂的颗粒制备物例如钆螯合剂，或其他顺磁性造影剂。这样的化合物的实例是钆喷酸葡胺(MAGNEVIST
Figure BPA00001214184900091
)和钆特醇(PROHANCE)。
治疗剂和诊断剂类型和每类中物质列举的描述，可以在Martindale的《药学大全》(The Extra Pharmacopoeia)第31版(The PharmaceuticalPress，London，1996)中发现，该书在此引为参考并作为本文的一部分。列出的治疗剂和诊断剂是可商购的和/或可以通过已知技术制备。
在具体实施方案中，活性剂是水溶性不良的化合物。“水溶性不良”的含义是化合物在水中的溶解度低于约10mg/mL，优选低于约1mg/mL。这些水溶性不良的化合物特别适合于水性悬浮制备物，因为将这些化合物配制在水性介质中的可选方案有限。有利情况下，提供了本发明的涂层的调理素例如IgG，能够吸附到包含这些水溶性不良的活性剂的粒子的表面，在其上形成基本上均匀的涂层。例如，调理素例如IgG的疏水尾部能够与粒子表面的疏水区域结合。此外，当pH低于调理素的等电点时，调理素例如IgG带正电，因此调理素与疏水粒子(它可以带负电)之间的强的静电相互作用能够使包含调理素蛋白的涂层稳定。或者，当pH高于调理素的等电点时，调理素例如IgG带负电，因此调理素与疏水粒子(它可以带正电)之间的强的静电相互作用能够使包含调理素蛋白的涂层稳定。在一种优选情况下，水溶性不良的活性剂化合物是分子量低于2500克/mol、低于2000克/mol、最典型低于1000克/mol，例如在200克/mol到900克/mol之间的有机化合物。这样的有机化合物有时被称为“小分子”。
或者，本发明可以用水溶性化合物来实施。这些水溶性活性化合物可以捕集在固相载体基质(例如聚乳酸化物-聚乙醇酸化物共聚物、白蛋白、淀粉)中，或囊封基本上不透活性剂的外层囊中。这种用于囊封的囊可以是聚合包衣，例如聚丙烯酸化物。此外，从这些水溶性化合物制备的小粒子可以被改性以提高化学稳定性，并通过控制化合物从粒子的释放来控制化合物的药物动力学性质。水溶性化合物的实例包括但不限于简单的有机分子、蛋白、肽类、核苷酸、寡核苷酸和糖类。
下面对于粒子的描述也适用于本文公开的所有实施方案。粒子可以是无定形、半晶体、晶体或其组合，正如通过适合的分析方法例如差示扫描量热法(DSC)或X-射线衍射所测定的。在给药之前，可以通过均化过程将粒子均匀化。也可以通过微量沉淀/均化过程将粒子均匀化。
一般情况下，涂层粒子具有的平均有效粒径通常从约1nm到约2μm(或2000纳米)，正如通过动态光散射方法(例如光子相关光谱术、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)、中角激光光散射(MALLS))、光遮蔽方法(例如Coulter方法)、流变学或显微术(光学或电子)所测量的。优选的平均有效粒径取决于多种因素，例如化合物所打算的给药途径、剂型、溶解性、毒性和生物可利用性。其他适合的粒径包括但不限于约10nm到1μm、约50nm到约500nm和/或约100nm到约250nm。
粒子核心的制备
在本发明中使用的制备粒子的方法可以通过大量技术来实现。关于制备粒子的技术的代表性而非穷举的讨论如下。
I.用于形成小粒子分散体的能量添加技术
一般来说，使用能量添加技术制备小粒子分散体的方法，包括向适合的介质例如通常含有一种或多种下面提到的表面活性剂的水或水性溶液、或药物化合物不能显著溶解在其中的其他液体，以批量形式加入有时将被称为药物的活性剂或药物活性化合物，以形成第一悬液的步骤，所述第一悬液将被称为预悬液。向预悬液添加能力以形成在物理上比预悬液更稳定的粒子分散体。能量通过机械研磨(例如珍珠研磨、球磨研磨、锤磨研磨、流体能量研磨、喷射研磨或湿法研磨)来添加。这样的技术公开在美国专利No.5,145,684中，在此引为参考并作为本发明的一部分。
能量添加技术还包括使预悬液经历高剪切力条件，包括利用微型流化装置施加空化、剪切或冲击力。本发明还考虑到了使用活塞间隙匀浆机或反向流动匀浆机向预悬液添加能量，例如在美国专利No.5,091,188中公开的，在此引为参考并作为本发明的一部分。适合的活塞间隙匀浆机可以在产品名EMULSIFLEXTM(Avestin)和FRENCH
Figure BPA00001214184900111
压力器(Thermo Spectronic)下商购。适合的微型流化装置可以从Microfluidics Corp获得。
添加能量的步骤也可以使用超声技术实现。超声处理步骤可以使用任何适合的超声装置来进行。适合的装置包括Branson S-450A型和Cole-Parmer 500/750瓦型。这样的装置在工业中是公知的。典型情况下，超声装置具有超声处理声horn或探头，所述超声处理horn或探头插入到预悬液中，以将声能发射到溶液中。在本发明的优选形式中，超声装置的操作频率从约1kHz到约90kHz，更优选从约20kHz到约40kHz，或其中的任何范围或范围组合。探头的尺寸可以变化，优选具有独特的尺寸，例如1/2英寸或1/4英寸等。
小粒子的分散体在给药之前可以经杀菌。杀菌可以通过加热灭菌、γ辐照、过滤(直接作为粒径在200nm以下的分散体，或在形成固体分散体系之前通过对在沉淀方法中使用的溶液除菌过滤)、和通过施加非常高的压力(大于2000大气压)、或通过高压与高温的组合来实现。
II.用于制备亚微米尺寸粒子分散体的沉淀方法
小粒子分散体也可以通过沉淀技术来制备。下面是沉淀技术的实例的描述。
微量沉淀方法。微量沉淀方法的一个实例公开在美国专利No.5,780,062中，在此引为参考并作为本发明的一部分。′062号专利公开了有机化合物沉淀方法，包括：(i)将有机化合物溶解在与水混溶的第一溶剂中；(ii)在水性第二溶剂中制备聚合物和两亲物的溶液，在所述第二溶剂中有机化合物基本上不溶，由此形成了聚合物/两亲物复合物；以及(iii)混合来自步骤(i)和(ii)的溶液，以便导致有机化合物与聚合物/两亲物复合物的聚集体的沉淀。
其他适合的沉淀方法公开在美国专利Nos 6,607,784、7,037,528、6,869,617、6,884,436中，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。公开的方法包括下列步骤：(1)将有机化合物溶解在与水混溶的第一有机溶剂中以产生第一溶液；(2)将第一溶液与第二溶剂或水混合，使有机化合物沉淀，以产生预悬液；以及(3)以高剪切力混合或加热的形式向预悬液添加能量，以提供小粒子的分散体。任选地，通过任何适合的手段例如离心或过滤方法从混合物中除去第一有机溶剂。此外，可以通过使用例如离心和过滤的方法除去第一连续相并添加第二连续相，然后将固体物质重新分散在第二连续相中，任选地将分散体的连续相用另一种连续相代替。下面提出的一种或多种任选表面活性剂可以添加到第一有机溶剂或第二水性溶液中。
乳液沉淀方法。一种适合的乳液沉淀技术公开在美国专利公开号No.2005/0037083中，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。在该方法中，方法包括下列步骤：(1)提供具有有机相和水相的多相系统，有机相在其中具有药物活性化合物；以及(2)对系统进行超声处理以蒸发一部分有机相，导致化合物在水相中沉淀，形成小粒子的分散体。提供多相系统的步骤包括下列步骤：(1)将与水不混溶的溶剂与药物活性化合物混合以产生有机溶剂，(2)制备具有一种或多种表面活性化合物的水基溶液，以及(3)将有机溶液与水性溶液混合以形成多相系统。混合有机相与水相的步骤可以包括使用活塞间隙匀浆机、胶体磨机、高速搅拌设备、挤压设备、手动搅拌或摇动设备、微型流化装置或其他用于提供高剪切力条件的设备或技术。粗乳液将在水中具有尺寸为直径低于约1μl的油滴。将粗乳液进行超声处理以产生微乳液，并最终提供小粒子的分散体。
制备小粒子的分散体的另一种方法公开在美国专利No.6,835,396中，在此引为参考并作为本发明的一部分。方法包括下列步骤：(1)提供具有有机相和水相的多相系统的粗分散体，有机相在其中具有药物化合物；(2)向粗分散体提供能量以形成细分散体；(3)冷冻细分散体；以及(4)将细分散体冷冻干燥以获得药物化合物的小粒子。小粒子可以通过下面提到的技术除菌，或小粒子可以在水性介质中复溶并除菌。
提供多相系统的步骤包括下列步骤：(1)将与水不混溶的溶剂与药效化合物混合以产生有机溶剂，(2)制备具有一种或多种表面活性化合物的水基溶液，以及(3)将有机溶液与水性溶液混合以形成多相系统。混合有机相与水相的步骤包括使用活塞间隙匀浆机、胶体磨机、高速搅拌设备、挤压设备、手动搅拌或摇动设备、微型流化装置或其他用于提供高剪切力条件的设备或技术。
溶剂-抗溶剂沉淀。小粒子分散体系也可以使用溶剂-抗溶剂沉淀技术来制备，所述技术公开在Fessi等的美国专利No.5,118,528和Leclef等的美国专利No.5,100,591中，在此引为参考并作为本发明的一部分。两种方法都包括下列步骤：(1)制备生物活性物质在溶剂或溶剂混合物中的液体相，可以向溶剂中添加一种或多种表面活性剂；(2)制备非溶剂或非溶剂混合物的第二液体相，非溶剂与用于物质的溶剂或溶剂混合物可混溶；(3)一边搅拌一边将(1)和(2)的溶液添加到一起；以及(4)除去不想要的溶剂以产生小粒子的分散体。这些方法与前面的“微量沉淀方法”部分下描述的方法的区别在于它们不提供以高剪切力混合或加热的形式向悬液添加能量的最后一步。
相转化沉淀。小粒子分散体可以使用相转化沉淀来形成，该方法公开在美国专利Nos.6,235,224、6,143,211和6,616,869中，所述每个专利在此引为参考并作为本发明的一部分。相转化是用于描述溶解在连续相溶剂系统中的聚合物转变成聚合物作为连续相的固体大分子网络这一物理现象的术语。诱导相转化的一种方法是通过向连续相添加非溶剂。聚合物经历了从单一相向不稳定的两相混合物：富聚合物和贫聚合物部分的过渡。非溶剂在富聚合物相中的胶束液滴起到成核位点的作用，并被聚合物包层。′224专利公开了聚合物溶液在某些条件下的相转化能够导致离散微粒、包括纳粒的自发形成。′224专利公开了将聚合物溶解或分散在溶剂中。药剂也溶解或分散在溶剂中。在该方法中，为了使晶种形成步骤有效，希望将药剂溶解在溶剂中。聚合物、药剂和溶剂一起形成了具有连续相的混合物，其中溶剂是连续相。然后将混合物导入至少过量十倍的可混溶非溶剂中，导致自发形成微包胶的药剂微粒，其平均粒径在10nm到10μm之间。粒径受到溶剂∶非溶剂体积比、聚合物浓度、聚合物-溶剂溶液的粘度、聚合物的分子量以及溶剂-非溶剂对的特性的影响。
pH转变沉淀。小粒子分散体可以通过pH转变沉淀技术来形成。这样的技术典型地包括将药物溶解在具有药物可以在其中溶解的pH的溶液中的步骤，然后是将pH改变到药物不再能够在其中溶解的点的步骤。取决于具体的药物化合物，pH可以是酸性或碱性的。然后将溶液中和以形成小粒子的分散体。一种适合的pH转变沉淀方法公开在美国专利No.5,665,331中，在此引为参考并作为本发明的一部分。方法包括将药剂与晶体生长改性剂(CGM)一起溶解在碱性溶液中，然后在存在适合的表面改性的表面活性剂或多种表面改性的表面活性剂的情况下用酸中和溶液，以形成药物的小粒子分散体的步骤。沉淀步骤后可以进行分散体的透滤清理，然后将分散体的浓度调整到所需水平的步骤。
pH转变沉淀方法的其他实例公开在美国专利Nos.5,716,642、5,662,883、5,560,932和4,608,278中，在此引为参考并作为本发明的一部分。
灌注沉淀方法。形成小粒子分散体的适合的灌注沉淀技术公开在美国专利Nos.4,997,454和4,826,689中，在此引为参考并作为本发明的一部分。首先，将适合的固体化合物溶解在适合的有机溶剂中以形成溶剂混合物。然后，将与有机溶剂混溶的沉淀用非溶剂，在约-10℃到约100℃之间的温度下，以每50ml体积每分钟约0.01ml到每分钟约1000ml的灌注速度灌注到溶剂混合物中，以产生沉淀的非聚集化合物固体粒子的悬液，粒子具有基本上均匀的小于10μm的平均直径。优选情况下，对用沉淀用非溶剂灌注的溶液进行搅动(例如通过搅拌)。非溶剂可以包含表面活性剂，以使粒子稳定对抗聚集。然后从溶剂分离粒子。取决于固体化合物和所需粒径，温度、非溶剂与溶剂的比、灌注速度、搅拌速度和体积等参数可以按照本发明进行改变。粒径与非溶剂∶溶剂的体积比和灌注温度成正比，与灌注速度和搅拌速度成反比。沉淀用非溶剂可以是水性或非水性的，取决于化合物的相对溶解性和所需的悬浮介质。
温度转变沉淀。温度转变沉淀技术也可用于形成小粒子分散体。该技术公开在美国专利No.5,188,837中，在此引为参考并作为本发明的一部分。在本发明的实施方案中，通过下述步骤制备了脂质球(liposphere)：(1)将待投送的物质例如药物融化或溶解在熔化的介质中，以形成待投送物质的液体；(2)在高于物质或介质的熔点温度的温度下，向熔化的物质或介质中添加磷脂和水性介质；(3)在高于介质的熔点温度的温度下混合悬液，直到获得均匀的细小制备物；以及然后(4)将制备物快速冷却到室温或低于室温。
溶剂蒸发沉淀。溶剂蒸发沉淀技术公开在美国专利No.4,973,465中，在此引为参考并作为本发明的一部分。′465专利公开了用于制备微晶体的方法，包括下列步骤：(1)提供溶解在常用有机溶剂或溶剂组合中的药用组合物和磷脂的溶液，(2)蒸发溶剂或多种溶剂，以及(3)通过剧烈搅拌将通过溶剂或多种溶剂的蒸发获得的薄膜悬浮在水性溶液中，以形成小粒子的分散体。溶剂可以通过蒸发足够量的溶剂来除去，以引起化合物沉淀。溶剂也可以通过其他公知的技术来除去，例如向溶液施加真空或使氮气从溶液上吹过。
反应沉淀。反应沉淀包括将药物化合物和任选的其他赋形剂溶解在适合的溶剂中以形成溶液的步骤。化合物可以处于或低于化合物在溶剂中的饱和点的量添加。化合物或任何赋形剂通过与化学试剂反应而从溶液中沉淀，或通过对添加能量例如热或UV光等作出反应而改性，使得改性的化合物在溶剂中具有较低溶解度并从溶液中沉淀，以形成小粒子分散体。赋形剂的沉淀提供了药物吸附在其中的固体基质。
压缩流体沉淀。通过压缩流体沉淀的适合技术公开在Johnston的WO 97/14407中，在此引为参考并作为本发明的一部分。方法包括将水不溶性药物溶解在溶剂中以形成溶液的步骤。然后将溶液喷洒到压缩流体中，压缩流体可以是气体、液体或超临界流体。向溶质在溶剂中的溶液添加压缩流体，导致溶质获得或达到超临界状态并作为细小粒子沉淀出来。在这种情况下，压缩流体用作抗溶剂，它降低了药物溶解在其中的溶剂的内聚能密度。
或者，可以将药物溶解在压缩流体中，然后将其喷洒到水性相中。压缩流体的快速膨胀降低了流体的溶剂溶解能力，这反过来导致溶质作为小粒子在水性相中沉淀出来。在这种情况下，压缩流体用作溶剂。
为了使粒子对聚集稳定，在本技术中包括了表面改性剂，例如表面活性剂。
喷射到低温流体中。通过压缩流体沉淀的适合技术由Williams等公开在美国专利公开号No.2004/0022861中，在此引为参考并作为本发明的一部分。方法提供了用于生产小粒子的系统和方法，其中将活性成分与水、一种或多种溶剂或其组合混合，并将得到的混合物喷洒到低温流体表面处或下方。由此提供了冷冻的粒子。也可以加入用于囊封固体粒子的材料，以便产生包胶剂包围着活性剂的冷冻粒子。
蛋白纳球/微球沉淀。在本发明中使用的粒子也可以从涉及将大分子例如蛋白与水溶性聚合物混合或溶解的方法来产生。这种方法公开在美国专利Nos.5,849,884、5,981,719、6,090,925、6,268,053、6,458,387和美国专利公开号No.2004/0043077中，它们在此引为参考并作为本发明的一部分。在本发明的实施方案中，通过将溶液中的大分子与溶液中的聚合物或聚合物混合物在接近大分子的等电点的pH下混合，制备了粒子。将混合物在存在能量源例如热、辐射或电离作用的情况下温育预定量的时间。得到的粒子可以通过物理分离方法与溶液中存在的任何未掺入的成分分离开。
还有大量其他适合的方法可用于制备能够在本发明中使用的小粒子分散体。
III.制备药物组合物的粒子分散体的附加方法
下面的用于制备在本发明中使用的药物组合物(即活性剂或有机化合物)粒子的附加方法，可以分成四种通用类别。每种方法类别共有下列步骤：(1)将有机化合物溶解在与水混溶的第一溶剂中，以产生第一溶液，(2)将第一溶液与第二溶剂水混合，使有机化合物沉淀，以产生预悬液，以及(3)以高剪切力混合或加热或二者的组合的形式向预悬液添加能量，以提供具有上面定义的所需尺寸范围的有机化合物的稳定形式。混合步骤与添加能量步骤可以在相继的步骤中或同时进行。
方法的类别根据有机化合物的物理性质来区分，所述物理性质正如通过在能量添加步骤之前和能量添加步骤之后进行的x-射线衍射研究、差示扫描量热术(DSC)研究或其他适合的研究所确定的。在第一种方法类别中，在能量添加步骤之前，预悬液中的有机化合物采取无定形形式、半晶体形式或超冷却液体形式，并具有平均有效粒径。在能量添加步骤之后，有机化合物处于晶体形式中，其平均有效粒径与预悬液的基本上相同或小一些。
在第二种方法类别中，在能量添加步骤之前有机化合物处于晶体形式，并具有平均有效粒径。在能量添加步骤之后，有机化合物处于晶体形式，具有与能量添加步骤之前基本上相同的平均有效粒径，但能量添加步骤之后晶体聚集或形成大晶体的可能性较低。
有机化合物聚集或形成大晶体的较低的倾向性，通过激光动态光散射和光学显微术进行观察。
在第三种方法类别中，在能量添加步骤之前，有机化合物处于易碎的晶体形式，并具有平均有效粒径。术语“易碎”的意义是指粒子是脆的，更容易破碎成较小的粒子。在能量添加步骤之后，有机化合物处于晶体形式，其平均有效粒径小于预悬液的晶体。当与处于不太易碎的晶体形态的有机化合物相比时，通过采取使有机化合物处于易碎晶体形式所必需的步骤，随后的能量添加步骤可以进行得更快、更有效。
在第四种方法类别中，第一溶液和第二溶剂同时进行能量添加步骤。因此，没有测量能量添加步骤之前和之后有机化合物的物理性质。
能量添加步骤可以任何方式进行，其中预悬液或第一溶液和第二溶剂暴露于空化、剪切或冲击力。在一种形式中，能量添加步骤是退火步骤。在本发明中，退火被定义为通过单次或重复地施加能量(直接加热或机械应力)，然后进行热弛豫，以将热力学不稳定的物质转变成更稳定形式的过程。这种能量的降低可以通过将固体形式从不太有序转变成更有序的晶格结构来实现。或者，这种稳定作用可以通过表面活性剂分子在固-液界面处的重新排序来产生。
这四种方法类别在下面分别显示。但是，应该理解，可以对方法的条件例如表面活性剂或表面活性剂组合的选择、使用的表面活性剂的量、反应温度、溶液混合的速度、沉淀速度等进行选择，以允许任何药物将在下面讨论的任一类别下被加工。
第一种方法类别，以及第二、第三和第四种方法类别，可以进一步分成两个子类别，方法A和B。
根据下面的方法，第一溶剂是目标有机化合物在其中相对可溶并可与第二溶剂混溶的溶剂或溶剂混合物。这样的溶剂包括但不限于与水混溶的质子化合物，其中分子中的氢原子与电负性原子例如氧、氮或元素周期表中其他族VA、VIA和VII A的原子相结合。这样的溶剂的实例包括但不限于醇、胺(伯胺或仲胺)、肟、异羟肟酸、羧酸、磺酸、膦酸、磷酸、酰胺和脲。
第一溶剂的其他例子还包括非质子有机溶剂。某些这样的非质子溶剂能够与水形成氢键，但是只能作为质子受体，因为它们缺少有效的提供质子的基团。一类非质子溶剂是偶极非质子溶剂，如由国际理论和应用化学联合会(International Union of Pure and AppliedChemistry)(IUPAC Compendium of Chemical Terminology，2nd Ed.，1997)所定义的：
具有大于约15的相对高的相对电容率(或介电常数)和相当大的永久偶极矩，不能提供适合的不稳定的氢原子以形成强的氢键的溶剂，例如二甲亚砜。
偶极非质子溶剂可以选自：酰胺(完全取代的，氮缺少相连的氢原子)，脲(完全取代的，不具有与氮相连的氢原子)，醚，环醚，腈，酮，砜，亚砜，完全取代的磷酸，膦酸酯，磷酰胺，硝基化合物等。二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、2-吡咯烷酮、1，3-二甲基咪唑啉酮(DMI)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷、丙酮、四氢呋喃(THF)、四亚甲基砜(环丁砜)、乙腈和六甲基磷酰胺(HMPA)、硝基甲烷等，是该类的成员。
也可以选择总的来说不与水混溶、但在小体积(小于10％)下具有足够的水溶性的溶剂，以这些小体积用作与水混溶的第一溶剂。实例包括芳香族烃类、链烯烃、链烷烃和卤代芳族化合物、卤代链烯烃和卤代链烷烃。芳族化合物包括但不限于苯(取代或未取代的)和单环或多环芳烃。取代苯的实例包括但不限于二甲苯(邻位、间位或对位)和甲苯。链烷烃的实例包括但不限于己烷、新戊烷、庚烷、异辛烷和环己烷。卤代芳族化合物的实例包括但不限于氯苯、溴苯和氯代甲苯。卤代链烷烃和链烯烃的实例包括但不限于三氯乙烷、二氯甲烷、二氯乙烷(EDC)等。
适合用作第一溶剂的溶剂的其他具体实例包括但不限于：N-甲基-2-吡咯烷酮(也称为N-甲基-2-吡咯烷酮)，2-吡咯烷酮(也称为2-吡咯烷酮)，1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)，二甲亚砜，二甲基乙酰胺，乙酸，乳酸，甲醇，乙醇，异丙醇，3-戊醇，正丙醇，苯甲醇，甘油，丁二醇(丁二醇)，乙二醇，丙二醇，单酰化和二酰化的甘油单酯(例如辛酸甘油酯)，二甲基异山梨醇，丙酮，二甲砜，二甲基甲酰胺，1，4-二噁烷，四亚甲基砜(环丁砜)，乙腈，硝基甲烷，四甲基脲，六甲基磷酰胺(HMPA)，四氢呋喃(THF)，二噁烷，二乙醚，叔丁基甲基醚(TBME)，芳香族烃类，链烯烃，链烷烃，卤代芳族化合物，卤代链烯烃，卤代链烷烃，二甲苯，甲苯，苯，取代苯，乙酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸丁酯，氯苯，溴苯，氯代甲苯，三氯乙烷，二氯甲烷，二氯乙烷(EDC)，己烷，新戊烷，庚烷，异辛烷，环己烷，聚乙二醇(PEG，例如PEG-4、PEG-8、PEG-9、PEG-12、PEG-14、PEG-16、PEG-120、PEG-75、PEG-150)，聚乙二醇酯(实例例如PEG-4二月桂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-6异硬脂酸酯、PEG-8棕榈酰硬脂酸酯、PEG-150棕榈酰硬脂酸酯)，聚乙二醇失水山梨糖醇(例如PEG-20失水山梨糖醇异硬脂酸酯)，聚乙二醇单烷醚(实例例如PEG-3二甲基醚、PEG-4二甲基醚)，聚丙二醇(PPG)，聚藻酸亚丙酯，PPG-10丁二醇，PPG-10甲基葡萄糖醚，PPG-20甲基葡萄糖醚，PPG-15硬脂基醚，丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯，丙二醇月桂酸酯和四乙二醇醚(glycofurol)(四氢糠醇聚乙二醇醚)。优选的第一溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮。另一种优选的第一溶剂是乳酸。
第二溶剂是水性溶剂。这种水性溶剂可以是水本身。这种溶剂也可以包含缓冲剂、盐、表面活性剂、水溶性聚合物以及这些赋形剂的组合。
方法A。在方法A中，首先将有机化合物(“活性剂”或“药物”)溶解在第一溶剂中以产生第一溶液。取决于有机化合物在第一溶剂中的溶解度，有机化合物可以添加约0.1％(w/v)到约50％(w/v)。为了确保化合物在第一溶剂中的总溶解度，可能必需将浓缩物从约30℃加热到约100℃。
第二水性溶剂提供有添加到其中的一种或多种任选表面改性剂，例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂或生物表面活性分子。适合的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸化物、烷基磷酸化物、烷基膦酸化物、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、藻酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷酯酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸、甘脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠等)。
两性离子表面活性剂是电中性的，但是在同一个分子中具有局部正电荷和负电荷。适合的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。适合的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(例如二肉豆蔻酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用包含阴离子和两性离子磷脂的磷脂混合物。这样的混合物包括但不限于溶血磷脂、卵或大豆磷脂或其任何组合。磷脂、无论是阴离子、两性离子磷脂还是磷脂混合物，可以是含盐或脱盐的，加氢或部分加氢的，或天然、半合成或合成的。在本发明中，磷脂也可以与水溶性或亲水性聚合物结合，以将投送特异性靶向巨噬细胞。但是，在其他应用中，结合的磷脂可用于靶向其他细胞或组织。优选的聚合物是聚乙二醇(PEG)，也被称为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。PEG的分子量可以不同，例如从200到50,000。一些常用的可商购的PEG包括PEG 350、PEG 550、PEG 750、PEG 1000、PEG 2000、PEG 3000和PEG 5000。磷脂或PEG-磷脂结合物也可以包含能够与配体共价结合的官能团，所述配体包括但不限于蛋白、肽类、糖类、糖蛋白、抗体或药物活性剂。这些官能团可以通过例如酰胺键形成、二硫化物或硫醚形成或生物素/链亲和素结合与配体结合。配体结合官能团的实例包括但不限于己酰胺、十二酰胺、1，12-十二烷二羧酸化物、巯基乙醇、4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(MPB)、4-(对-马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺(MCC)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸化物(PDP)、琥珀酸化物、戊二酸化物、十二烷酸化物和生物素。
适合的阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲基铵、脱乙酰壳多糖、月桂基二甲基苯基氯化铵、酰基肉碱盐酸盐、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨甲酰基胆甾醇(DC-Chol)、1，2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶卤化物或长链烷基胺例如正辛胺和油胺。
适合的非离子表面活性剂包括：甘油酯，聚氧乙烯脂肪醇醚(MACROGOLTM和BRIJTM)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酸酯)，聚氧乙烯脂肪酸酯(MYRJTM)，失水山梨糖醇酯(SPANTM)，单硬脂酸甘油酯，聚乙二醇，聚丙二醇，鲸蜡醇，十六醇十八醇混合物，硬脂醇，芳基烷基聚醚醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)，poloxamine，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，非晶体纤维素，多糖包括淀粉和淀粉衍生物例如羟乙基淀粉(HES)，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在优选形式中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，优选为丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。这样的聚合物在商品名泊洛沙姆、有时也称为PLURONIC
Figure BPA00001214184900241
下销售，并由几家供应商包括Spectrum Chemical和Ruger销售。在聚氧乙烯脂肪酸酯中，包括了具有短烷基链的聚氧乙烯脂肪酸酯。这种表面活性剂的一个实例是SOLUTOL
Figure BPA00001214184900242
HS 15，聚氧乙烯-660-羟基硬脂酸化物，由BASF Aktiengesellschaft制造。
表面活性生物分子包括例如白蛋白、酪蛋白、水蛭素或其他适合的蛋白这样的分子。例如，也可以使用具有亲水和疏水结构域的蛋白。也包括多糖表面活性生物制品，它们包括但不限于淀粉、肝素和脱乙酰壳多糖。其他适合的表面活性剂包括任何氨基酸，例如亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，或这些氨基酸的衍生物例如酰胺或酯衍生物，以及由这些氨基酸形成的多肽。
向第二溶剂加入pH调节剂可能也是需要的。适合的pH调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、单羧酸(例如乙酸和乳酸)、二羧酸(例如琥珀酸)、三羧酸(例如柠檬酸)、THAM(三(羟甲基)氨基甲烷)、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)、氢氧化钠以及氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸和亮氨酸。第二溶剂应该具有从约3到约11范围内的pH。水性介质可以附加地包含渗透压调节剂，例如但不限于甘油、单糖例如葡萄糖、二糖例如蔗糖、三糖例如棉子糖和糖醇例如甘露糖醇、木糖醇和山梨糖醇。
对于口服剂型来说，可以使用一种或多种下列赋形剂：明胶，酪蛋白，卵磷脂(磷脂类)，阿拉伯树胶，胆固醇，黄蓍胶，硬脂酸，苯扎氯铵，硬脂酸钙，单硬脂酸甘油酯，十六醇十八醇混合物，cetomacrogol乳化蜡，失水山梨糖醇酯，聚氧乙烯烷基醚例如聚乙二醇醚例如cetomacrogol1000、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯例如可商购的TWEENSTM、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸化物、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸化物、非晶体纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。大多数这些赋形剂详细描述在由美国制药联合会(American Pharmaceutical Association)和英国制药学会(The Pharmaceutical Society of Great Britain)联合出版的《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(thePharmaceutical Press，1986)中。表面改性剂可商购，和/或可以通过本技术领域已知的技术制备。两种或以上表面改性剂可以组合使用。
在优选形式中，用于制备有机化合物小粒子的方法包括将第一溶液添加到第二溶剂中的步骤。添加速度取决于批量大小和有机化合物的沉淀动力学。典型情况下，对于小规模实验室工艺(制备1升)来说，添加速度从每分钟约0.05cc到每分钟约10cc。在添加过程中，溶液应该在恒定的搅拌下。使用光学显微术已经观察到形成了无定形粒子、半晶体固体或超冷却液体，以产生预悬液。方法还包括对预悬液进行能量添加步骤，以将无定形粒子、超冷却液体或半晶体固体转变成更稳定的晶体固态的步骤。得到的粒子将具有平均有效粒径，正如通过动态光散射方法(例如上面提到的范围内的光子相关光谱术、激光衍射、小角激光光散射(LALLS)、中角激光光散射(MALLS)、光遮蔽方法(例如Coulter方法)、流变学或显微术(光学或电子))所测量的。在第四种方法类别中，将第一溶液和第二溶剂合并，同时进行能量添加步骤。
能量添加步骤包括通过超声、均化、逆向流均化、微流化或提供冲击、剪切或空化力的其他方法来添加能量。在该阶段中，样品可以被冷却或加热。在一种形式中，能量添加步骤通过活塞间隙匀浆机执行，例如由Avestin Inc.公司在产品名EmulsiFlex-C160下销售的活塞间隙匀浆机。在另一种形式中，能量添加步骤通过超声完成，使用了超声处理器例如由Sonics and Materials，Inc.公司制造的Vibra-Cell超声处理器(600W)。在另一种形式中，能量添加步骤通过使用在美国专利No.5,720,551中描述的乳化装置来完成，所述专利在此引为参考并作为本发明的一部分。
取决于能量添加的速度，可能需要将被处理样品的温度调整到从约-30℃到30℃的范围内。或者，为了在被处理的固体中实现所需的相变，在能量添加步骤过程中将预悬液加热到从约30℃到约100℃范围内的温度，可能也是必需的。
方法B。方法B与方法A的区别在以下方面。第一个区别是表面活性剂或表面活性剂的组合添加到第一溶液中。表面活性剂可以选自上面提到的阴离子、非离子、阳离子表面活性剂和表面活性生物改性剂。
方法A和方法B与美国专利No.5,780,062的比较例。美国专利No.5,780,062公开了制备有机化合物小粒子的方法，所述方法为将化合物首先溶解在适合的与水混溶的第一溶剂中。通过将聚合物和两亲物溶解在水性溶剂中制备了第二溶液。然后将第一溶液添加到第二溶液中，以形成由有机化合物和聚合物-两亲物复合物构成的沉淀。′062专利没有公开在其方法中使用了方法A和方法B中的能量添加步骤。缺乏稳定性典型地通过快速聚集和粒子生长来证明。在某些情况下，无定形粒子重结晶成大的晶体。以本文公开的方式向预悬液添加能量所形成的粒子，典型情况下显示出粒子聚集和生长速度的降低，以及在产品储存后不发生重结晶。
方法A和方法B与′062专利方法的进一步区别在于在沉淀之前不存在形成聚合物-两亲物复合物的步骤。在方法A中，这样的复合物不能形成，因为稀释(水性)相中没有添加聚合物。在方法B中，也用作两亲物的表面活性剂或聚合物与有机化合物一起溶解在第一溶剂中。这预先排除了在沉淀之前任何两亲物-聚合物复合物的形成。在′062专利中，小粒子的成功沉淀依赖于沉淀之前两亲物-聚合物复合物的形成。′062专利公开了两亲物-聚合物复合物在水性第二溶液中形成聚集体。′062专利解释说，疏水有机化合物与两亲物-聚合物复合物相互作用，从而降低这些聚集体的溶解性并导致沉淀。在本发明的方法中，已经证明在第一溶剂中包含表面活性剂或聚合物(方法B)，在随后添加到第二溶剂中以后，导致形成了与′062专利描述的方法所产生的相比更均匀、细小的颗粒。
粒子的涂层
用于为通过本发明制备的粒子涂层的方法，可以通过本领域技术人员已知的各种不同技术来实现。涂层可以通过各种不同的结合作用与粒子结合，这些结合作用包括共价和/或非共价结合(例如共价键合、离子相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键形成、范德华力、疏水/疏水结构域相互作用、交联和/或任何其他相互作用)。
非共价结合的涂层可以通过例如将大量粒子与含有调理素例如免疫球蛋白G(IgG)或补体蛋白例如C3b或C5的溶液混合来制备。溶液可以在高剪切力条件下，使用例如微量流化装置、活塞间隙匀浆机、反向流匀浆机或超声处理器来混合。为了证实涂层成功吸附到粒子上，可以通过在涂层操作之前和之后测量ζ电位来确定粒子的表面电位。也可以使用其他用于测量涂层吸附的已知方法，例如调理素可以用荧光标记物修饰，荧光标记的调理素的吸收可以通过荧光显微术来检测。ELISA方法或其他基于抗体的检测系统也可用于检测调理素。有利情况下，调理素涂层能够容易地吸附到粒子表面，特别是正如上面解释的包含水溶性不良的活性剂的粒子。
涂层也可以与粒子核心共价结合。共价结合的涂层可以通过例如将大量粒子与包含调理素的溶液相混合来制备，所述粒子包含反应性官能团。反应性官能团包括能够与例如调理素的含有氨基、羟基和/或硫醇基的氨基酸反应的亲电官能团。适合的反应性官能团包括例如醛、N-羟基-琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺。由上述反应形成的不稳定的共价键可以通过其他反应步骤稳定化。例如，胺与醛的反应形成水解不稳定的亚胺，所述亚胺可以通过使用还原剂例如硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原亚胺键来稳定化。
另一方面，涂层可以包含共价结合到涂层的另一个分子例如多糖上的调理素。典型情况下，包含活性剂的粒子首先用多糖涂层，然后使用例如前面刚刚描述过的共价键合方法将多糖与调理素反应。多糖或其他适合与调理素结合的分子可用于对涂层的性质改性，例如通过增加涂层与粒子核心的结合亲和性。适合的多糖包括但不限于葡聚糖(dextran)、葡聚糖(glucan)、纤维素、淀粉、糖原、果聚糖、几丁质和肝素。多糖的分子量一般在约5,000道尔顿到约250,000道尔顿之间，例如在约8,000道尔顿到约200,000道尔顿之间，和/或约10,000道尔顿到约150,000道尔顿之间，但是也可以使用更高或更低分子量的多糖。
涂层还可以包括单一表面活性剂或表面活性剂的组合。表面活性剂可以选自各种不同的已知阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂和表面活性生物改性剂。适合的表面活性剂包括本文前面提到的表面活性剂。示例性的表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、磷脂、聚乙二醇结合的磷脂和聚山梨酸化物。示例性的表面活性剂组合包括但不限于泊洛沙姆和磷脂、泊洛沙姆和聚乙二醇结合的磷脂、以及泊洛沙姆和聚山梨酸化物。或者，涂层可以基本上不含表面活性剂(例如少于2wt.％的表面活性剂，少于1wt.％的表面活性剂或少于0.5wt.％的表面活性剂)。
涂层粒子的细胞摄取
本发明的一个实施方案涉及增加活性剂的细胞摄取的方法，所述方法包括将细胞与大量表面改性粒子相接触，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层。细胞可以是细胞吞噬性细胞、弱细胞吞噬性细胞或非细胞吞噬性细胞。粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素(例如具有IgG同种型的抗体或例如C3b和C5的补体蛋白)，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。由此，相对于使用不含上述涂层的粒子时活性剂的摄取，细胞对活性剂的摄取增加了。
细胞摄取允许将活性剂投送到需要治疗的靶组织，因为本公开的能够增加摄取涂层粒子的各种不同细胞类型，也运输到患病或发炎组织。例如，在感染或炎症早期嗜中性细胞占统治地位，随后是离开血管并进入被感染组织的单核细胞衍生的吞噬细胞占统治地位。固定的巨噬细胞(组织细胞)大量存在于肝脏、神经系统、肺、淋巴结、骨髓和几种其它组织中。大多数受细菌、病毒或真菌病原体感染并发炎的组织，可以通过投送具有通过趋化性而被导向这些炎症位点的倾向性的药物装载细胞(例如粒细胞)来定向。因此，通过促进细胞摄取，将药剂从这些细胞释放到治疗上最需要的区域中。因此，装载有涂层粒子的细胞促进了药剂向靶组织的投送以治疗疾病或紊乱。这样的疾病和紊乱包括但不限于感染性疾病或紊乱、炎性疾病或紊乱、神经变性疾病或紊乱和增殖性疾病或紊乱。
存在大量能够摄取涂层粒子的细胞吞噬性细胞。这些细胞包括但不限于巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、无粒细胞和嗜中性粒细胞。本发明还包含弱细胞吞噬性细胞和非细胞吞噬性细胞。因此，其他适合的细胞类型包括但不限于T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、裸细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、血红细胞、肌肉细胞、骨髓细胞、干细胞、骨细胞、血管细胞、器官组织细胞、神经细胞、嗜碱性细胞、嗜曙红细胞、树突状细胞和内皮细胞。还有其他细胞可用于向对象投送药物活性化合物。任何细胞类型，只要它能够摄取粒子，都可用于本发明中。细胞对粒子的摄取可以包括细胞吞噬作用或其他胞吞作用，或将粒子附着/吸附在细胞表面上。与细胞表面结合的粒子也可以通过胞饮作用摄入细胞内，胞饮作用是细胞膜的内陷形成了包围粒子的细胞内囊状物。在胞饮作用(“细胞饮用”)中，吞入的粒子相对较小(例如20nm)(Watts等，“胞吞作用：发生了什么以及如何发生？”(Endocytosis：what goes in and how？)，Journal of Cell Science，1992，volume 103(1)，1-8页)。胞饮作用在几乎所有真核细胞中连续发生。
正如在本文中解释的，在有利情况下，粒子包括促进细胞摄取的涂层。尤其是，涂层能够促进细胞例如单核细胞、巨噬细胞和T-淋巴细胞的摄取，这些细胞能够通过已知机制例如趋化性运输到炎症、感染和/或肿瘤的位点，并由此将粒子投送到特定靶组织
在本发明的一个方面，细胞与表面改性粒子的接触(以形成装载有活性剂的细胞)离体进行(即在哺乳动物对象体外)。可替选地或此外，细胞与表面改性粒子的接触可以在体内进行(即在哺乳动物内部)。在接触步骤过程中使用了能够有效治疗疾病或紊乱的量的表面改性粒子。本领域技术人员将会理解，一定量的粒子可能被不运输到目标靶组织的细胞类型所摄取，或者不被细胞在目标靶组织处释放。因此，本领域技术人员将会理解，给药的粒子量可以通过常规方案进行优化，只要这些量处于已建立的给药方案的范围内。
为了进行离体给药，可以使用细胞分离器或单采血液成分术装置从哺乳动物对象分离细胞。例如，可以使用CS-3000TM细胞分离器(Fenwal Inc.，Lake Zurich，Ill.)或ISOLEXTM细胞分离器(BaxterHealthcare Corp.，Deerfield，Ill.)分离各种不同细胞。也可以使用本领域技术人员已知的其他离体细胞分离方法来获得可用于本发明的细胞。这样的方法包括但不限于外周血单采血液成分书、通过例如G-CSF、M-CSF或GM-CSF迁移骨髓细胞、或通过脊椎、胸骨、腰或髂脊穿刺直接取出骨髓细胞。离体细胞可以维持在细胞培养基或本领域技术人员已知的其他分离系统中。这样的培养基的实例是Alserver′s溶液、Ames′培养基、Eagle′s基本培养基、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞培养基、Click′s培养基、Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲的葡萄糖或蔗糖、Earle′s平衡盐溶液、基因疗法培养基-3、Gey′s平衡盐溶液、Glasgow极限必须培养基、Hanks′平衡盐溶液、杂交瘤培养基、Iscove′s修改的Dulbecco′s培养基、含有糖的Krebs-Henseleit缓冲液、Leibovitz培养基(L-15)、M16培养基、McCoy′s培养基、MCDB、MDBK(Madin-Darby牛肾)、MDCK(Madin-Darby狗肾)、培养基199、NCTC、Ham′s培养基(例如营养混合物F-10)、Coon′s修改的Ham′s培养基、RPMI，以及其他例如在《用于生命科学研究的生物化学品和反应试剂》(Biochemicals&Reagents for LifeScience Research，Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，Mo.，USA))中列出的培养基。所描述的培养的目的，可以是为了简单地保存而不损失细胞，或通过适当添加促进细胞扩增的生长因子、细胞因子和营养物质用于细胞增殖或扩增的目的。这种扩增将使患者必须准备取出细胞样品的次数降到最低。
分离后，细胞可以与涂层粒子接触并温育一段短时间，以允许细胞摄取粒子。在离体步骤中使用的粒子浓度将随几种因素变化，包括但不限于所用细胞的类型、细胞的浓度、使用的活性剂、小粒子分散体的尺寸、待治疗的疾病等。但是，一般来说，细胞分离物与约1到约300mg/ml本发明的粒子相接触。在粒子与细胞接触的过程中，粒子的浓度高于热力学饱和溶解度，从而允许粒子在摄取和投送到哺乳动物对象的过程中保持在颗粒形式。细胞可以与粒子温育长达24小时或以上，以允许细胞摄取足够的药物粒子。
可以使用任何能够执行活性剂粒子被离体细胞摄取的方法，其必要条件是方法不破坏细胞或使细胞不能用于向对象给药。例如，可以使用通过生物识别分子对粒子的位点特异性投送。参见例如美国专利公开号No.2003/0092069，在此引为参考，它公开了通过中空纳粒将基因转移到特定细胞或组织中。其他装载离体细胞的方法包括电穿孔、超声穿孔，以及其他破坏细胞膜(例如超声)并能将固体颗粒插入细胞的机械手段。超声波已被Zarnitsyn等(Zarnitsyn等，“影响超声介导的DNA转染的优化的物理参数”(Physical parameters influencingoptimization of ultrasound-mediated DNA transfection)，Ultrasound Med.Biol.，2004，volume 30(4)，527-538页)成功地用于瞬时破坏细胞膜，由此促进了DNA装载于活细胞中。其他机械方法对于本技术领域有经验的人来说是公知的，这些方法被包含作为本公开的一部分。使细胞膜瞬时去稳定的化学方法也是众所周知的。转染试剂包含表面活性剂，并包括293FECTINTM转染试剂和LIPOFECTAMINETM，二者都是Invitrogen Corporation(Carlsbad，Calif.)的产品。用于将DNA转化到细胞中的表面活性剂的另一个实例是来自Synvolux Therapeutics B.V.L.J.(Groningen，荷兰)的SAINTTM试剂，该试剂是基于吡啶盐表面活性剂。
下面对粒子的描述也适用于本文公开的所有实施方案。对于溶解度较低的药物来说，可以使用细胞装载步骤，只要细胞能够以比竞争的溶解过程更快的速度摄取涂层活性剂粒子即可。粒子应该具有适合的尺寸，以允许细胞摄取涂层粒子并在粒子完全溶解前将它们投送到靶组织。因为已知运输到目标靶组织的细胞能够摄取粒子，因此活性剂最终从细胞释放到靶组织的附近。此外，活性剂组合物的浓度将保持高于组合物的饱和溶解度，以便粒子在摄取过程中能够保持在晶体状态。
下面对粒子的描述也适用于本文公开的所有实施方案。表面改性粒子的给药可以通过本技术领域已知的各种不同的用于给药粒子的技术来进行。给药包括将表面改性粒子给药于哺乳动物对象。适合的给药表面改性粒子的方法包括但不限于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、真皮内、关节内、鞘内、硬膜外、脑内、经颊、直肠、局部、透皮、经口、鼻内、经肺途径、腹膜内和/或眼内给药粒子。给药的步骤可以通过快速浓注、通过间歇灌注或通过连续灌注进行。表面改性粒子的量和投送方法可以由熟练的临床医师来决定。各种不同的因素将影响投送的量和方法，所述因素包括但不限于所用的细胞类型(对于离体给药方法来说)、待治疗的对象的性别、体重和年龄、待治疗的疾病或紊乱的类型和成熟度、被给药的活性剂，等等。一般来说，活性剂可以1pg化合物/kg体重到1000mg/kg、0.1mg/kg到100mg/kg、0.1mg/kg到50mg/kg和1到20mg/kg的剂量提供，以或长或短的时间间隔、例如每两天、每周两次、每周一次、或每日两或三次，以每日剂量或等价的剂量给药。
本发明的方法可以治疗各种不同疾病或紊乱，所述疾病或紊乱包括但不限于感染性疾病或紊乱、炎性疾病或紊乱、神经变性疾病或紊乱和增殖性疾病或紊乱。就此而言，这些疾病或紊乱的症状可以通过本发明的方法缓解。
本文使用的“感染性疾病或紊乱”是指由病原微生物例如细菌、病毒、寄生虫或真菌引起的病症。能够从本公开的方法获益的感染性疾病或紊乱包括但不限于病毒感染(包括反转录病毒感染)例如登革热、肠道病毒感染、HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和流感病毒，真菌感染，寄生虫感染例如非洲锥虫病和疟疾，以及细菌感染例如霍乱、脑膜炎和结核病。
本文使用的“炎性疾病或紊乱”是指其特征为发红、发热、肿胀和疼痛(即炎症)的病症，典型地涉及组织损伤或破坏。炎性疾病或紊乱与白细胞内流和/或白细胞趋化性显著相关。炎性病症可以由病原生物体或病毒的感染引起，或由非感染性事件引起，所述非感染性事件包括但不限于外伤或心肌梗塞或中风后的再灌注、对外来抗原的免疫应答和自身免疫应答。因此，可以用本发明的方法和化合物治疗的炎性病症包括与特异性防御系统的反应有关的病症、与非特异性防御系统的反应有关的病症以及与炎性细胞活化有关的病症。
本文中使用的术语“特异性防御系统”是指免疫系统对特定抗原的存在发生反应的成分。由特异性防御系统的应答所产生的炎性病症的实例包括但不限于对外来抗原的典型应答、自身免疫疾病和B-细胞和/或T-细胞(即B-淋巴细胞和/或T-淋巴细胞)介导的迟发型超敏反应。慢性炎性疾病、移植的实体组织和器官包括但不限于肾脏和骨髓移植物的排斥、以及移植物抗宿主疾病(GVHD)，是由特异性防御系统的应答所产生的炎性病症的其他实例。
本文中使用的术语“非特异性防御系统”是指由不能免疫记忆的白细胞(例如包括但不限于嗜中性细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性细胞的粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞)介导的炎性病症。至少部分由非特异性防御系统的反应所产生的炎性病症的实例包括但不限于成人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官损伤综合征、再灌注损伤、急性肾小球肾炎、反应性关节炎、具有急性炎性成分的皮炎、急性化脓性脑膜炎、其他中枢神经系统炎性病症，其包括但不限于中风、热损伤、炎性肠病、与粒细胞灌输相关的综合征以及细胞因子诱导的毒性。
本发明的治疗方法包括用于改善与炎性细胞活化有关的病症的方法。“炎性细胞活化”是指由刺激物(包括但不限于细胞因子、抗原和自身抗体)诱导的增殖性细胞应答、可溶性介导物(包括但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素类化合物和血管活性胺)的产生，或炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(包括嗜中性细胞、嗜碱性细胞和嗜曙红细胞的多形核淋巴细胞)、肥大细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞和内皮细胞)中新的或增加数量的介导物(包括但不限于主要组织相容性抗原和细胞黏附分子)的细胞表面表达。本领域技术人员将会认识到，这些细胞中这些表型的一种或其组合的活化，可能有助于炎性病症的引发、继续或加剧。
其他可以成功治疗的疾病或紊乱包括以炎症或感染为特征的疾病或紊乱，包括但不限于类风湿关节炎、甲状腺机能亢进(Graves′disease)、重症肌无力、甲状腺炎、糖尿病、炎性肠病、自体免疫性卵巢炎、系统性红斑狼疮和干燥综合征(
Figure BPA00001214184900351
syndrome)。
可以成功治疗的神经变性疾病或紊乱的实例包括但不限于帕金森氏症、阿茨海默氏病、多发性硬化、脑脊髓炎、脑炎(包括HIV脑炎)、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化(也称为Lou Gehrig′s病)、额颞痴呆、朊病毒疾病、克雅氏病和肾上腺脑白质营养不良。其他可以成功治疗的神经变性疾病或紊乱包括Pick′s病、额颞叶变性、进行性失语和语义性痴呆。朊病毒疾病、也称为传染性海绵状脑病(TSE)，包括克雅氏病、克雅氏病的新变体、Gerstmann-
Figure BPA00001214184900352
-Scheinker综合征、致死性家族性失眠症和库鲁病。神经变性疾病或紊乱也可以是亚历山大病、进行性脑灰质萎缩、共济失调毛细血管扩张症、Batten病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、Canavan病、Cockayne综合征、皮质基底节变性、HIV相关痴呆、肯尼迪病、Krabbe病、路易体痴呆、Machado-Joseph病(脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩、神经莱姆病、Pelizaeus-Merzbacher病、原发性侧索硬化、Refsum′s病、Sandhoff病、Schilder′s病、精神分裂症、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病和脊髓痨。
可以从本公开的方法获益的增殖性疾病或紊乱包括但不限于结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和成胶质细胞瘤。甲状腺炎包括桥本甲状腺炎、亚急性甲状腺炎(也称为de Quervain’s甲状腺炎)、无症状性甲状腺炎(也称为无痛性甲状腺炎)、产后甲状腺炎、药物诱导的甲状腺炎、辐射诱导的甲状腺炎和急性化脓性甲状腺炎。
参考下面的实施例将可以更好地理解本公开，这些实施例不打算是限制性的，而仅仅是提出了本公开的示例性实施方案。
实施例
实施例1
带有IgG涂层的超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子的制备
高碘酸钠、氰基硼氢钠、新亚铜试剂(neocuproine)、乙酸铵、抗坏血酸和高锰酸钾购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。鼠类和人类IgG F(ab′)2和Fc片段购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA。大鼠IgG2a抗MsCD 16/CD32抗体(FcgRIII/FcgRII)(2.4G2)、大鼠IgG2a抗三硝基苯酚(TNP)抗体同种型对照、IgG1抗-Hu CD16抗体(FcgRIII)(3G8)、IgG1抗Hu-CD32抗体(FcgRII)(3D3)、IgG1抗TNP抗体(107.3)购自BD Biosciences，San Jose，CA。IgG1抗-HuCD64抗体(FcgRI)(10.1)购自eBioscience，San Diego，CA。Alexa Fluor488羧酸、琥珀酰亚胺基酯和Alexa Fluor
Figure BPA00001214184900362
488羟胺购自Invitrogen。菲立磁(Ferumoxide)(Feridex IV，Bayer HealthcarePharmaceuticals，Wayne，NJ)是超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子，平均流体力学尺寸为150nm，铁浓度为11.2mg/mL。
SPIO纳粒(NP)使用Microcon YM-30离心过滤装置(Millipore，Billerica，MA)浓缩，并针对乙酸缓冲液(0.1M，pH 5.5)在4℃透析过夜。围绕SPIO的铁核心的葡聚糖T-10，通过与10mM偏高碘酸钠在暗处在室温下反应1小时而被氧化。为了除去过量的反应试剂，将氧化的SPIO针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)在4℃透析过夜。将人类IgG(Baxter Heathcare Corporation，Westlake Village，CA)或鼠类IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)加入到氧化的NP在PBS和50mM氰基硼氢钠在1M NaOH中的悬液中，终浓度为2mg/ml IgG和10mg/ml SPIO。温育在轻柔搅拌下在室温进行过夜，通过加入50mMTris-HCl淬灭反应。使用Sepharose CL-4B柱从NP中除去游离IgG。NP结合物反应的Sepharose CL-4B层析显示出NP在20ml到25ml之间洗脱，游离的IgG在45ml到60ml之间洗脱(图1)。
粒径通过动态光散射测量。与NP共价结合的IgG的存在和游离IgG的量使用微量二喹林甲酸(BCA)测定法(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)估算。结合产率据估算为约50％。
在平行制备物中，将Alexa Fluor
Figure BPA00001214184900371
488羟胺、小鼠IgG和小鼠与人类IgG F(ab′)2片段与醛SPIO在室温下在PBS缓冲液中反应，以获得用于Fc阻断研究的对照试剂并合成合并的荧光和抗体结合的SPIO制备物。对于荧光纳米制剂来说，将Alexa Fluor
Figure BPA00001214184900372
488羧酸琥珀酰亚胺基酯与IgG SPIO在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中结合2小时。使用PD-10柱将游离染料与结合物分离开。
在一个月期间，在4℃下，在选定的时间点，通过测量尺寸和多分散指数研究了IgG-SPIO的稳定性(图2)。在刚刚结合后，IgG-SPIO的尺寸为175nm，多分散指数为约0.2。在前两周，没有观察到流体动力学直径和尺寸分布的显著改变。但是，结合后30天时，IgG-SPIO增加到最高270nm，多分散指数约为0.3，表明了有限的NP聚集。
实施例2
单核细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)和骨髓衍生的巨噬 细胞(BMM)的分离和培养
人类单核细胞通过白细胞清除术从HIV-1和肝炎血清反应阴性的供体获得，并通过反向流离心淘洗进行纯化。制备了Wright染色的细胞离心涂片器(cytospin)，通过用抗CD68抗体(克隆KP-1)免疫标记来测定细胞纯度。为了产生单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)，将淘洗过的单核细胞在37℃和加湿大气环境下，以2×106个细胞/ml的浓度在添加了10％热失活的合并人血清、1％谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、10μg/ml环丙沙星和1000U/ml重组人类巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的Dulbecco’s修改的Eagles培养基(DMEM)(Wyeth Inc.，Cambridge，MA的慷慨礼物)中，培养多达7天。4-5周龄的雄性BALB/c小鼠(Charles River Laboratory，Inc.，MA)被用作骨髓衍生的巨噬细胞(BMM)供体。取下股骨，取出骨髓，将细胞解离成单细胞悬液，添加1000单位/ml MCSF(Wyeth，Inc.)培养10天。使用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)，通过流式细胞分析证明了培养的BMM是98％CD11b+的。
实施例3
涂层的SPIO被单核细胞和巨噬细胞摄取
将人类单核细胞或MDM转移到8孔Lab-Tek II腔室玻片中(0.5×106个细胞/孔)。添加SPIO到铁的终浓度为0.5mg/ml，并在37℃温育1小时。在清洗三次后，将细胞用4％聚甲醛在室温固定30分钟。对于Fc阻断研究来说，将人类IgG Fc片段或抗Fc受体抗体(克隆3G8、3D3和10.1)(10μg/ml)添加到MDM培养物中，在37℃温育20分钟，然后将铁的终浓度为0.5mg/ml的SPIO、IgG-SPIO或F(ab′)2-SPIO温育0.5、1、2和4小时。只具有培养基和具有抗TNP抗体同种型对照107.3的细胞被用作对照。对于鼠类BMM来说，步骤与人类细胞相同，但是使用小鼠IgG Fc片段和IgG FcgRIII/FcgRII作为Fc阻断物。在用2X PBS清洗细胞后，通过荧光显微术观察细胞。
铁含量通过菲洛嗪(ferrozine)进行估算(参见下文)。铁的存在通过使用5％亚铁氰化钾和5％盐酸的普鲁士蓝染色来观察。在清洗三次后，将细胞用核固红复染。使用IgG-SPIO时观察到了铁的高积累，然而天然SPIO被人类单核细胞的摄取是有限的。单核细胞和MDM的存活率通过活/死测定法估算(Axxora，LLC，San Diego，CA)。将铁标记的单核细胞与0.5μM溴乙锭均二聚体-1和1μM钙黄绿素AM的混合物，在37℃和加湿大气环境下温育25分钟。将细胞清洗三次，用4％聚甲醛在室温固定30分钟，并通过荧光显微术观察。钙黄绿素-AM积累和被胞质酯酶的切开将活细胞标记为绿色，溴乙锭均二聚体-1将死细胞的核标记为红色。人类单核细胞的存活率一致地高于90％。细胞存活率通过锥虫蓝排斥得到证实，其中将铁标记的人类单核细胞与锥虫蓝温育15分钟，并洗涤三次。大多数铁标记的单核细胞排斥锥虫蓝，证明了IgG-SPIO的内化不诱导毒性效应。未标记的细胞和使用70％甲醇溶液杀死的人类单核细胞用作对照。
透射电子显微术(TEM)被用于研究SPIO在人类单核细胞中的位置。为了进行TEM，将人类单核细胞和MDM培养在聚d-赖氨酸涂层的Thermanox盖玻片(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)上，与SPIO在37℃温育1小时，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将它们固定在含有2％戊二醛、2％低聚甲醛、0.5％丙烯醛的pH 7.2的0.1MSorensen′s磷酸盐缓冲液中，并在1％四氧化锇水溶液中后固定30分钟。在清洗后，将人类单核细胞在一系列逐级变化的乙醇溶液中脱水，每步5分钟，并通过一系列逐级变化的乙醇/araldite环氧树脂溶液用araldite环氧树脂包埋介质浸透。将盖玻片培养物一侧朝下包埋在空白araldite环氧树脂盘上，在烤箱中在65℃放置过夜进行聚合，并通过浸在液氮中取出。将单核细胞和MDM集落切下并正面固定，用于超薄切片。将切片放置在200目铜格网上，将格网用1％乙酸双氧铀和Reynold′s柠檬酸铅染色。使用以80Kv运行的Philips LS410TEM检测细胞。在人类单核细胞的核周缘中观察到染色质的积累。IgG-SPIO被摄取到细胞中的内吞囊泡中，其尺寸达到0.7-1μm。IgG-SPIO的分布是细胞质内的，NP的优选位置在小的膜皱褶上。载有铁的囊泡的数量和尺寸二者在IgG-SPIO剂型的情况下都增加了。
使用菲洛嗪比色测定法估算了铁含量。为了进行这种测定，将人类单核细胞和MDM的双份批样在24孔板中进行培养(1×106个细胞/孔)。将SPIO在4℃和37℃下，以0.5mg/ml的终浓度温育0.5、1、2、4和8小时。将铁标记的细胞用PBS清洗三次，用50mM NaOH在摇床上在室温裂解1小时。将细胞裂解液的等分试样以同样体积与10mM盐酸(HCl)混合，以便溶解SPIO。向裂解液中加入铁释放试剂，即1.4M HCl和4.5％(w/v)KMnO4在蒸馏水中的混合物，并将混合物在60℃温育2小时。菲洛嗪测定试剂从预先溶解在甲醇中的6mM菲洛嗪、2.5M乙酸铵、1M抗坏血酸和6.5mM新亚铜试剂制备在蒸馏水中。将样品转移到96孔板中，并在540nm处读数。在同样反应条件下使用0.2mg/m的铁储用溶液(Ricca Chemical Company，Arlington，TX)制备了铁标准品。将铁的浓度值归一化到通过微量BCA测定法(PierceBiotechnology)测定的蛋白浓度。
正如通过比色测定法所测定的，人类IgG的共价结合加速了SPIO的摄取(图3)。1小时后，细胞的铁浓度为～0.2μg铁/μg蛋白，达到了最大值的一半。与IgG-SPIO相比，SPIO随时间的内化在8小时的温育时间内是线性的，在4到8小时之间从～0.03变化到0.06μg铁/μg蛋白。对于大部分研究的时间来说，与用未涂层NP处理的细胞相比，NP含量高出接近一个数量级。
也通过对每个时间点的三份平行样的MRI分析，进行了铁标记的人类单核细胞的T2弛豫率测量。MRI被用于检测单核细胞的标记和确保结合步骤不改变NP的磁性性质。SPIO标记的细胞模型在200μl的塑料管中被制备成，将100μl 0.5×106个细胞/ml悬浮在100μl 2％琼脂糖中。根据菲洛嗪比色测定法的结果，当人类单核细胞暴露于IgG-SPIO时，铁的摄取急剧增加(图4)。SPIO的最高水平在温育4小时后达到。尽管存在氧化步骤，IgG-SPIO的弛豫性质仍被保留。
实施例4
粒子的细胞摄取
为了检测尺寸和葡聚糖涂层对细胞摄取的影响，将用100kDa葡聚糖涂层的尺寸为62到394nm的SPIO与人类单核细胞在37℃温育1小时(图5A)。对于具有同样的葡聚糖分子量的最大的NP来说，检测到了较大的铁摄取。用10kDa葡聚糖(Feridex
Figure BPA00001214184900401
)涂层的SPIO，与用100kDa葡聚糖涂层的其他NP相比，以较高的水平摄取到单核细胞中。在1小时的氧化后，SPIO与不同浓度的IgG(0.5、1、2和4mg/ml)结合，并将每种结合的IgG-SPIO复合物与人类单核细胞在37℃温育0.5和1小时。在不同IgG浓度下制备的IgG-SPIO，在与单核细胞温育0.5和1小时后，其细胞摄取没有很大差别(图5B)。这些结果表明或者细胞表面被SPIO饱和，或者内化作用不依赖于配体密度。对于这些特定实验来说，IgG的非共价结合没有诱导摄取的增加(图5C)。然而，由葡聚糖围绕着NP的铁核心所产生的空间阻挡，可能阻止了IgG的吸收。当温育在4℃下进行时，IgG-SPIO摄取被部分抑制(图5D)。接下来，比较了IgG-SPIO被单核细胞和MDM的摄取，并发现对于两种细胞类型来说事实上是相等的(图5E)。结果支持了下述想法，即在这两种细胞类型中起作用的是相似的铁摄取机制。为了研究内化的机制，将浓度为1mg/ml的IgG-SPIO和游离IgG与人类单核细胞共温育(图5F)。在用游离IgG阻断单核细胞Fc受体后，没有检测到明显的差异。这些结果表明IgG-SPIO以不依赖于Fc受体的机制进入细胞。为了测试这种可能性，使用与IgG结合相同的氧化/还原步骤，将人血清白蛋白(HSA)共价结合于SPIO。与IgG相似，HSA显著增加了SPIO的摄取(图5G)。为了证实粒子摄取不依赖于Fc受体这种想法，我们进行了阻断研究。在4小时的共培养中，被MDM摄取的IgG-SPIO和F(ab’)2-SPIO的细胞内铁的回归分析，在摄取动力学上没有显示出差异(P＝0.271)，表明IgG Fc部分的存在没有为IgG-SPIO摄取动力学提供显著益处。类似地，用人类Fc片段、抗Fc受体-γ抗体(CD16/CD32/CD64)或同种型对照抗体处理MDM，与未处理的MDM相比，在IgG-SPIO摄取动力学上没有可察觉的差别(P＝0.624)。此外，人类MDM中的结果在小鼠BMM中得到验证，其中用小鼠Fc片段、大鼠抗小鼠Fc受体-γ抗体(CD16/CD32)或大鼠同种型对照抗体处理的BMM，与未处理的BMM相比，在小鼠IgG-SPIO的摄取动力学上没有观察到差别(P＝0.988)。这些结果证实了IgG-SPIO的内化不是Fc受体介导的这一假说。尽管HSA-SPIO的内化与IgG-SPIO类似，但在与IgG-SPIO温育的单核细胞中，与HSA-SPIO的情况相比，人类单核细胞中的铁含量更高。这可能是由于HSA修饰了结合的SPIO自身这个事实。为了试验后一种可能性，在pH 7.4的HEPES缓冲液中进行了SPIO的物理化学性质研究，包括纳粒的ζ电位和尺寸测量。SPIO的HSA修饰不影响其尺寸(图5H)。此外，在配体连接后，NP的ζ电位没有明显变化；因此SPIO保持带负电荷。
实施例5
通过MRI对SPIO和IgG-SPIO在小鼠中的组织分布进行成像
5-8周龄的雄性BALB/c小鼠(Charles River Laboratory，Inc.，Wilmington，MA)用于所有实验。将动物饲养在无菌微型隔离饲养笼中，按照内布拉斯加大学医学中心(University of Nebraska Medical Center)和国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)关于实验动物护理的伦理规范进行维持。以12.5μg/0.2ml/小鼠或62.5μg/0.2ml/小鼠的量用SPIO或IgG-SPIO经尾静脉对小鼠进行静脉内注射。用于人类成人或年轻人的推荐剂量是560μg/kg。在体内分析中使用两组小鼠，每组3-5只动物。对SPIO和IgG-SPIO处理的组，在注射前、注射后连续4小时和注射后24小时进行成像。结合的SPIO制备后24小时内给小鼠注射。
SPIO粒子在组织中的积累导致场依赖性的组织水的磁自旋-自旋弛豫率(R2)的增加。使用两个7T MRI系统(Bruker 21cm Biospec/16cm Pharmascan systems operating Paravision 4.0)进行的自旋-自旋弛豫率测量，证明了在SPIO标记的细胞模型中，弛豫率与细胞密度直接相关。弛豫率的测量能够追踪细胞摄取，已被用于追踪注射后细胞向肝脏、肾脏和脾脏的迁移。使用25-mm鸟笼式容积线圈获取了小鼠身体的高分辨率、多层多回波CPMG相循环T2作图MRI扫描，覆盖了从颈部到髋部的区域，使用的获取参数为回波时间(TE)＝10、20、30、40、50、60、70、80ms，重复时间(TR)＝4650ms，平均次数(NA)＝4，视野＝40x40mm，分辨率为256x 128(三维象素尺寸＝156x 312μm)，重建到256x 256，50个隔行连续1mm厚断层，总获取时间＝39分钟。信号强度被归一化到外部标准，以阐述信号随时间的漂移。SPIO积累通过选定目标区域中R2(1/T2)的变化来测定。在注射SPIO或IgG-SPIO后，连续4小时每40分钟以及在24小时时获取T2图谱。脾脏、肝脏和肾脏中目标区域来自偶数回波(精确地重新聚焦在CPMG相循环回波列中)的强度，使用与图像中测量到的噪音水平匹配的最小值拟合到指数衰减。通过每组图像中外部标准的T2测定监控数据质量。
在将SPIO或IgG-SPIO注射到小鼠尾静脉中之后，测量了脾脏(图6A和7B)、肝脏(图6C和6D)和肾脏(图6E和6F)中弛豫率(R2＝1/T2)的变化。12.5μg(图6A、6C和6E)(n＝6)和62.5μg(图6B、6D和6F)(n＝5)的注射显示，到注射后0.5小时及以后的时间中，具有IgG涂层的循环单核细胞在较低浓度下显示出较高摄取(p＜0.05，双路重复测量ANOVA用于脾脏和肝脏的时间和SPIO类型的影响)。在较高的62.5μg剂量下，SPIO与IgG-SPIO的摄取相比，在任何时间点没有观察到差异。
实施例6
组织学评估
在SPIO或IgG-SPIO给药后4和24小时时收集脾脏和肝脏。在MRI后，通过用4％低聚甲醛灌注立即将组织固定，后固定24小时，包埋在石蜡中，并切成5μm厚的切片用于组织学分析。对于普鲁士蓝染色来说，将载玻片固定的切片脱石蜡、重新水合，并在2％亚铁氰化钾和3.7％盐酸中反应30分钟，以通过普鲁士蓝观察亚铁粒子。将染色的切片清洗并用核固红复染，以提供组织细胞分布。图像通过Optronics数字相机(Buffalo Grove，IL)使用MagnaFire 2.0软件(Goleta，CA)获得，并通过Adobe
Figure BPA00001214184900431
Photoshop 7.0软件处理。在0.5小时和24小时的图像中，观察到来自SPIO积累的信号损失。
通过分析来自MRI试验后用Alexa Fluor
Figure BPA00001214184900432
488羟胺IgG-SPIO纳米制剂注射的动物的脾脏和肝脏的组织样本，在循环血单核细胞和组织巨噬细胞中看到了SPIO的摄取。
实施例7
具有IgG涂层的紫杉醇粒子的制备
通过将药物从与水混溶的有机溶剂沉淀在含有表面活性剂的水性溶液中，然后使用活塞间隙匀浆机进行均化步骤，制备了晶体紫杉醇粒子。用于防止粒子聚集的表面活性剂以各种不同的组合使用，以产生纳米悬液制剂PTX-1、PTX-2和PTX-3。所有的紫杉醇纳米悬液都使用10mM磷酸缓冲液缓冲到pH 7.8-7.9。紫杉醇粒子的平均粒度在150-300nm的范围内，正如通过激光光散射(Horiba LA-920，相对折射率＝116A001I)所测量的。紫杉醇粒子的ζ电位的测量使用pH 7.4的10mM HEPES缓冲液作为稀释剂(Malvern Nano ZS)。IgG涂层前的紫杉醇悬液ζ电位值在表1中给出。
表1
Figure BPA00001214184900441
具有人类IgG涂层的紫杉醇粒子，通过将紫杉醇纳米悬液与IgG溶液以各种不同的IgG∶紫杉醇重量比在室温温育来制备。IgG溶液通过将可商购产品(GAMMAGARD LIQUID 10％，Baxter Healthcare)用pH 5的0.25M甘氨酸缓冲液稀释到终浓度为50、25、10、5和2.5mg/mLIgG来制备。为了证实在与IgG温育后观察到的ζ电位的变化是由于IgG吸附而不是由于IgG缓冲溶液的高离子强度，也在单独的甘氨酸缓冲液(无IgG)中进行了温育。
IgG吸附通过测量IgG纳米悬液混合物的ζ电位来探测。测量在pH 5和pH 7.4下，分别使用10mM甘氨酸和10mM HEPES缓冲液作为稀释液来进行。使用Smoluchowsky模型从测量的电泳迁移率计算ζ电位。
图7显示了紫杉醇制剂的吸附实验的结果。数据表明，对于所有三种制剂来说，ζ电位受到IgG存在的显著影响(线仅仅是对眼睛的指导)。在pH 5下，IgG具有净正电荷(等电点＝6.9-7.3)，而药物粒子带负电荷。所有三种悬液当在pH 7.4下测量时，显示出接近零的ζ电位，略微高于IgG的等电点。在该pH下，ζ电位仍然与未涂层的值有显著差异，表明IgG仍然吸附在表面上。
通过以400x放大倍数进行显微镜观察，确定了IgG吸附对悬液物理稳定性的影响。对于某些纳米悬液制剂来说，与IgG温育导致药物粒子的聚集。对于这些制剂来说，假定了IgG吸附导致粒子上的表面电荷水平不足以提供悬液的静电稳定作用。
实施例8
带有IgG涂层的利托那韦粒子的制备
通过将药物晶体在含有DSPE-MPEG(2000)的水性溶液的存在下均化，制备了晶体利托那韦粒子，所述水性溶液用10mM磷酸盐缓冲液缓冲到pH 7.7。平均粒径约为0.5微米，正如通过激光光散射(HoribaLA-920，相对折射率＝120A010I)所测定的。该悬液的ζ电位是-49.8mV，使用了pH 7.4的1mM HEPES缓冲液作为稀释液(Malvern NanoZS，Smoluchowsky模型)。
具有人类IgG涂层的利托那韦粒子，通过将利托那韦悬液与IgG溶液温育来制备。IgG∶利托那韦的重量比通过如实施例7中所述用甘氨酸缓冲液稀释IgG溶液来改变，或通过改变利托那韦悬液与净(100mg/mL)IgG溶液的体积比来改变。
ζ电位的测量在pH 5和pH 7.4下进行，分别使用了1mM甘氨酸和1mM HEPES缓冲液作为稀释液。测量了稀释样品在pH 7.4缓冲液中的pH，以证实添加悬液/IgG混合物不引起缓冲液pH的可察觉的变化。从两种途径获得的IgG涂层的ζ电位数据被发现一致性良好(图8)。IgG涂层的利托那韦粒子的聚集按照实施例7中描述的步骤进行评估。通过显微镜观察，在任何IgG∶利托那韦重量比下没有观察到聚集。
实施例9
带有IgG涂层的茚地那韦粒子的制备
通过将药物晶体在含有泊洛沙姆188和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚乙二醇(DSPE-MPEG2000)的水性溶液的存在下均化，制备了晶体茚地那韦粒子，所述水性溶液用10mM HEPES冲液缓冲到pH 7.8。平均粒径约为0.9微米，正如通过激光光散射(HoribaLA-920，相对折射率＝108A000I)所测定的。
具有人类IgG涂层的茚地那韦粒子，通过将茚地那韦悬液与净GAMMAGARD LIQUID 10％(Baxter Healthcare)温育来制备。步骤包括将0.5mL 2.22％(w/v)茚地那韦悬液(相当于11.1mg药物)与0.33mL 10％IgG溶液混合，获得了3∶1重量比的IgG∶茚地那韦。
与此平行地，通过将茚地那韦悬液与鼠类IgG(Sigma)温育，制备了具有鼠类IgG涂层的茚地那韦粒子。将冷冻干燥的鼠类IgG(10mg)用1mL 0.9％氯化钠溶液复溶。然后向小管中加入0.15mL茚地那韦悬液，以获得3∶1重量比的IgG∶茚地那韦。以400x放大倍数进行的显微镜检查，表明在存在人类或鼠类IgG的情况下粒子没有聚集。
ζ电位使用pH 7.4的1mM HEPES缓冲液作为稀释剂进行测量(Malvern Nano ZS，Smoluchowsky模型)。结果在表2中给出。与IgG溶液温育的悬液的表面负电荷的显著降低，表明IgG吸附在粒子表面。
表2
  制剂   pH 7.4的茚地那韦(IDV)悬液的ζ电位(mV)
  IDV悬液   -45.4
  IDV悬液+人类IgG   -1.78
  IDV悬液+鼠类IgG   -6.96
实施例10
带有IgG涂层的塞来昔布粒子的制备
通过药物晶体从有机溶剂沉淀然后均化(CXB-2)或通过直接均化(CXB-1，CXB-3)，制备了晶体塞来昔布粒子。粒子使用含有表面活性剂的水性溶液来制备，所述水性溶液用10mM磷酸盐缓冲液缓冲到pH 7.5-7.8。具有人类IgG涂层的塞来昔布粒子，使用10％的IgG溶液按照实施例7中描述的步骤来制备。
塞来昔布悬液的制剂成分、容重平均粒径测量值和ζ电位测量值提供在表3中。粒径通过激光光散射测量(Horiba LA-920，相对折射率＝119A001I)。ζ电位使用10mM(CXB-1、CXB-2)或1mM(CXB-3)pH 7.4的HEPES缓冲液作为稀释剂测量(Malvern Nano ZS，Smoluchowsky模型)。与IgG溶液温育的悬液的表面负电荷的减少，表明IgG吸附在粒子表面上。
表3
实施例11
IgG涂层的紫杉醇粒子的摄取
荧光标记的紫杉醇粒子使用0.5g紫杉醇和400μg俄勒冈绿标记的紫杉醇(可以从Invitrogen获得)制备。通过向0.1mL紫杉醇悬液添加0.2mL 10％静脉内免疫球蛋白(IVIG)溶液，对荧光标记的紫杉醇粒子(粒径为约160nm到170nm)进行涂层。也通过向0.1mL紫杉醇悬液添加0.8mL的25mg/mL鱼精蛋白溶液，将荧光标记的紫杉醇粒子用鱼精蛋白进行涂层。
紫杉醇纳米悬液的摄取动力学显示在图9和图10中(结果被显示为纳米悬液摄取后紫杉醇阳性细胞的百分率和细胞结合的/内化的粒子的MFI)。与未处理的粒子相比，IgG涂层改进了粒子的摄取。
图11显示了培养1、2或6天后单核细胞对IgG涂层的紫杉醇纳米悬液的摄取。结果表明，细胞培养时间越长，它们对IgG越具反应性。
尽管已经对具体实施方案进行了说明和描述，但可以想到大量修改而不背离本发明的精神，保护范围仅受限于随附的权利要求书的范围。

Claims (36)

1.一种表面改性粒子，所述表面改性粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。
2.权利要求1的粒子，其中调理素是抗体或补体蛋白。
3.前述权利要求任一项的粒子，其中调理素选自具有IgG同种型的抗体、补体蛋白C3b和补体蛋白C5。
4.前述权利要求任一项的粒子，所述涂层被吸附到粒子核心的表面。
5.前述权利要求任一项的粒子，所述涂层被吸附到粒子核心的表面并且还包含多糖，所述调理素与多糖共价连接。
6.前述权利要求任一项的粒子，其中多糖是葡聚糖。
7.前述权利要求任一项的粒子，其中多糖具有约5,000道尔顿到约250,000道尔顿之间的分子量。
8.前述权利要求任一项的粒子，其中涂层还包含表面活性剂。
9.前述权利要求任一项的粒子，其中表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂、表面活性生物改性剂及其组合。
10.前述权利要求任一项的粒子，其中表面活性剂包含泊洛沙姆和磷脂中的至少一种。
11.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是治疗剂。
12.前述权利要求任一项的粒子，其中治疗剂选自镇痛剂、麻醉剂、兴奋剂、肾上腺素能剂、肾上腺素能阻断剂、抗肾上腺素剂、肾上腺类皮质激素、拟肾上腺素剂、抗胆碱能剂、抗胆碱酯酶剂、抗惊厥药、烷化剂、生物碱类、变构抑制剂、促蛋白合成甾类、减食欲药、解酸剂、止泻剂、解毒剂、抗叶酸剂、退烧药、抗风湿药剂、精神治疗剂、神经阻断剂、抗炎剂、驱肠虫剂、抗生素、抗凝剂、抗抑郁药、抗癫痫剂、抗真菌剂、抗感染剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗肿瘤剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、抗焦虑镇定剂、β-肾上腺素能受体阻断剂、皮质类固醇、止咳剂、多巴胺能药、止血剂、血液药剂、安眠药、免疫药剂、蕈毒碱药物、拟副交感神经剂、前列腺素、放射药物、镇静剂、刺激剂、拟交感神经剂、维生素、黄嘌呤、生长因子、激素、抗朊病毒剂及其组合。
13.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是选自紫杉醇、紫杉醇衍生化合物、生物碱类、抗代谢物、酶抑制剂、烷化剂及其组合的抗肿瘤剂。
14.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是蛋白酶抑制剂。
15.前述权利要求任一项的粒子，其中蛋白酶抑制剂选自茚地那韦、利托那韦、沙奎那韦、奈非那韦及其组合。
16.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是核苷反转录酶抑制剂。
17.前述权利要求任一项的粒子，其中核苷反转录酶抑制剂选自叠氮胸苷、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、拉米夫定及其组合。
18.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是非核苷反转录酶抑制剂。
19.前述权利要求任一项的粒子，其中非核苷反转录酶抑制剂选自依法韦仑、奈韦拉平、德拉维拉丁及其组合。
20.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是抗炎剂。
21.前述权利要求任一项的粒子，其中抗炎剂选自非甾类抗炎剂、非选择性环加氧酶(COX)抑制剂、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、脂氧合酶抑制剂、皮质类固醇、抗氧化剂、肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂及其组合。
22.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂选自塞来昔布、罗非昔布、伐地考昔、帕瑞昔布、罗美昔布、依他昔布及其组合。
23.前述权利要求任一项的粒子，其中活性剂是生物制剂。
24.前述权利要求任一项的粒子，其中生物制剂选自蛋白、多肽、糖类、多核苷酸、核酸及其复合物、结合物和组合。
25.一种药物组合物，所述药物组合物包含大量前述权利要求任一项的粒子。
26.一种增加活性剂的细胞摄取的方法，所述方法包括：
将细胞与表面改性粒子在足以增加表面改性粒子的细胞摄取的条件下相接触，所述粒子包含粒子核心和与粒子核心结合的涂层，其中粒子核心包含活性剂，涂层包含调理素，并且表面改性粒子具有从约1nm到约2,000nm的平均粒度。
27.权利要求26的方法，其中细胞是细胞吞噬性细胞。
28.权利要求26-27的方法，其中所述接触离体进行。
29.权利要求26-28的方法，其中所述接触在体内进行。
30.权利要求26-29的方法，其中细胞是选自巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、无粒细胞、嗜中性细胞及其组合的细胞吞噬性细胞。
31.权利要求26-30的方法，其中所述接触通过向对象给药一定量的所述表面改性粒子进行，所述给药量有效治疗传染性疾病或紊乱、炎性疾病或紊乱、神经变性疾病或紊乱或增殖性疾病或紊乱。
32.权利要求26-31的方法，其中所述给药经静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、真皮内、关节内、鞘内、硬膜外、脑内、颊、直肠、局部、透皮、口、鼻内、经肺途径、腹膜内、眼内或通过它们的组合进行。
33.权利要求26-32的方法，其中对象是哺乳动物对象。
34.权利要求26-33的方法，其中对象患有神经变性疾病或紊乱，所述神经变性疾病或紊乱选自帕金森氏症、阿茨海默氏病、多发性硬化、脑脊髓炎、脑炎、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化、额颞痴呆、朊病毒疾病、克雅氏病和肾上腺脑白质营养不良。
35.权利要求26-34的方法，其中对象患有炎性疾病或紊乱，所述炎性疾病或紊乱选自类风湿关节炎、甲状腺机能亢进、重症肌无力、甲状腺炎、糖尿病、炎性肠病、自体免疫性卵巢炎、系统性红斑狼疮和干燥综合征。
36.权利要求26-35的方法，其中对象患有增殖性疾病或紊乱，所述增殖性疾病或紊乱选自结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和成胶质细胞瘤。
CN2009801078034A 2008-03-05 2009-03-05 用于药物投送的组合物和方法 Pending CN101965195A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6815108P 2008-03-05 2008-03-05
US61/068,151 2008-03-05
US20525909P 2009-01-20 2009-01-20
US61/205,259 2009-01-20
US14891709P 2009-01-30 2009-01-30
US61/148,917 2009-01-30
PCT/US2009/036185 WO2009111638A1 (en) 2008-03-05 2009-03-05 Compositions and methods for drug delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101965195A true CN101965195A (zh) 2011-02-02

Family

ID=40670948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801078034A Pending CN101965195A (zh) 2008-03-05 2009-03-05 用于药物投送的组合物和方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9364443B2 (zh)
EP (1) EP2259798B1 (zh)
CN (1) CN101965195A (zh)
BR (1) BRPI0909780B1 (zh)
ES (1) ES2447465T3 (zh)
IL (1) IL207569A (zh)
RU (1) RU2496482C2 (zh)
WO (1) WO2009111638A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105748073A (zh) * 2014-12-15 2016-07-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种小鼠清醒状态下的笼具及其应用
CN107638940A (zh) * 2017-07-31 2018-01-30 芜湖杨燕制药有限公司 一种中药注射剂渗漉提取前处理方法
WO2021179555A1 (zh) * 2020-03-09 2021-09-16 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种病毒性肺炎的标志物及其应用
CN114366724A (zh) * 2021-12-29 2022-04-19 中山大学附属第一医院 一种微环境巨噬细胞调控递送系统及其制备方法和应用

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2170283T3 (en) 2007-06-22 2019-04-15 Univ Texas CREATION OF STABLE SUBMICRON Peptide OR PROTEIN PARTICLES BY THIN FILM FREEZING
US8653131B2 (en) 2008-08-22 2014-02-18 Baxter Healthcare S.A. Polymeric benzyl carbonate-derivatives
US8779094B2 (en) 2008-11-16 2014-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Low viscosity highly concentrated suspensions
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
US8685458B2 (en) 2009-03-05 2014-04-01 Bend Research, Inc. Pharmaceutical compositions of dextran polymer derivatives
US8815294B2 (en) 2010-09-03 2014-08-26 Bend Research, Inc. Pharmaceutical compositions of dextran polymer derivatives and a carrier material
EP2704741B1 (en) 2011-05-03 2017-08-23 Immunovative Therapies, Ltd. Methods for handling biological drugs containing living cells
US9060938B2 (en) 2011-05-10 2015-06-23 Bend Research, Inc. Pharmaceutical compositions of active agents and cationic dextran polymer derivatives
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
AU2012314515B2 (en) 2011-09-26 2018-03-15 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
WO2014049022A1 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
US11525155B2 (en) 2013-03-18 2022-12-13 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
JP6407248B2 (ja) * 2013-03-18 2018-10-17 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
AU2014292926B2 (en) 2013-07-25 2020-03-05 Exicure Operating Company Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
TWI491881B (zh) * 2013-10-18 2015-07-11 國立臺灣大學 胜肽組織化學診斷法
US9474720B2 (en) 2013-11-04 2016-10-25 BioPharmX, Inc. Dosage form comprising an active ingredient and a plurality of solid porous microcarriers
EP3203995A4 (en) 2014-10-09 2019-05-15 Board of Regents of the University of Nebraska COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS
CA2968531A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
CN104655542B (zh) * 2015-01-05 2017-06-20 北京市医疗器械检验所 一种防护产品检测用合成血液及其配制方法
WO2016204896A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inorganic controlled release particles with fast drug loading
CN108291250B (zh) 2015-11-20 2022-05-27 凯杰有限公司 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法
WO2017124078A1 (en) * 2016-01-16 2017-07-20 Autotelic Llc Celcoxib binding antibodies and uses thereof
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
RU2663588C1 (ru) * 2017-08-07 2018-08-07 Александр Александрович Кролевец Способ получения нанокапсул биопага-Д в геллановой камеди
CA3126348A1 (en) 2018-01-12 2020-07-18 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Antiviral prodrugs and formulations thereof
WO2019199756A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Antiviral prodrugs and formulations thereof
RU2691954C1 (ru) * 2018-05-21 2019-06-19 Александр Александрович Кролевец Способ получения нанокапсул биопага-Д в каппа-каррагинане
WO2020160323A2 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Elektrofi, Inc. Particle formation and morphology
RU2725764C1 (ru) * 2019-07-25 2020-07-06 Частное образовательное учреждение высшего образования "Региональный открытый социальный институт" ЧОУ ВО "РОСИ" Способ получения нанокапсул сульфата железа(III) в гуаровой камеди
RU2724890C1 (ru) * 2019-08-20 2020-06-26 Частное образовательное учреждение высшего образования "Региональный открытый социальный институт" ЧОУ ВО "РОСИ" Способ получения нанокапсул сульфата железа (III)
CN114514035A (zh) * 2019-09-13 2022-05-17 伊勒卓菲公司 递送用于治疗疾病的治疗性生物制剂的组合物和方法
RU2724887C1 (ru) * 2019-10-28 2020-06-26 Частное образовательное учреждение высшего образования "Региональный открытый социальный институт" ЧОУ ВО "РОСИ" Способ получения нанокапсул сульфата железа (III)

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2655801C2 (de) 1976-12-09 1986-06-26 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Injizierbare Suspension von Membranvesikeln aus Erythrozyten und Verfahren zur Herstellung der Suspension
DE2656317C2 (de) 1976-12-11 1986-06-19 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Verfahren zur Herstellung einer Suspension von beladenen Erythrocyten
DE2656746C2 (de) 1976-12-15 1986-06-26 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Verwendung von beladenen Erythrozyten
JPS60150826A (ja) 1984-01-18 1985-08-08 Lion Corp 表面電荷をもつベシクル分散液
US4670185A (en) * 1982-07-19 1987-06-02 Lion Corporation Aqueous vesicle dispersion having surface charge
US4608278A (en) 1983-06-22 1986-08-26 The Ohio State University Research Foundation Small particule formation and encapsulation
US4826689A (en) 1984-05-21 1989-05-02 University Of Rochester Method for making uniformly sized particles from water-insoluble organic compounds
CA1338736C (fr) 1986-12-05 1996-11-26 Roger Baurain Microcristaux comportant une substance active presentant une affinite pour les phospholipides, et au moins un phospholipide, procede de preparation
FR2608988B1 (fr) 1986-12-31 1991-01-11 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation de systemes colloidaux dispersibles d'une substance, sous forme de nanoparticules
US5213788A (en) 1988-09-29 1993-05-25 Ranney David F Physically and chemically stabilized polyatomic clusters for magnetic resonance image and spectral enhancement
FR2651680B1 (fr) 1989-09-14 1991-12-27 Medgenix Group Sa Nouveau procede de preparation de microparticules lipidiques.
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5091188A (en) 1990-04-26 1992-02-25 Haynes Duncan H Phospholipid-coated microcrystals: injectable formulations of water-insoluble drugs
US5216130A (en) * 1990-05-17 1993-06-01 Albany Medical College Complex for in-vivo target localization
WO1992011846A1 (en) 1991-01-07 1992-07-23 St George's Enterprises Limited Particulates
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
ATE218614T1 (de) 1992-09-28 2002-06-15 Univ Brown Res Found Chitozanmatrizes für eingekapselte zellen
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5720551A (en) 1994-10-28 1998-02-24 Shechter; Tal Forming emulsions
SE9403846D0 (sv) 1994-11-09 1994-11-09 Univ Ohio State Res Found Small particle formation
US5662883A (en) 1995-01-10 1997-09-02 Nanosystems L.L.C. Microprecipitation of micro-nanoparticulate pharmaceutical agents
US5665331A (en) 1995-01-10 1997-09-09 Nanosystems L.L.C. Co-microprecipitation of nanoparticulate pharmaceutical agents with crystal growth modifiers
US5716642A (en) 1995-01-10 1998-02-10 Nano Systems L.L.C. Microprecipitation of nanoparticulate pharmaceutical agents using surface active material derived from similar pharmaceutical agents
US5560932A (en) 1995-01-10 1996-10-01 Nano Systems L.L.C. Microprecipitation of nanoparticulate pharmaceutical agents
US6902743B1 (en) * 1995-05-22 2005-06-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Therapeutic treatment and prevention of infections with a bioactive material(s) encapuslated within a biodegradable-bio-compatable polymeric matrix
US6143211A (en) 1995-07-21 2000-11-07 Brown University Foundation Process for preparing microparticles through phase inversion phenomena
US6331299B1 (en) 1995-08-18 2001-12-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for treatment of cancer and infectious disease and compositions useful in same
US20050054033A9 (en) 1995-08-30 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for treating and preventing infection using human interferon regulatory factor 3
DE69637441T2 (de) 1995-10-17 2009-03-05 Jagotec Ag Verabreichung unlöslicher arzneistoffe
EP0920339A2 (en) 1996-07-09 1999-06-09 The Johns Hopkins University Gene delivery system
US8137684B2 (en) * 1996-10-01 2012-03-20 Abraxis Bioscience, Llc Formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
WO1998047492A1 (en) 1997-04-18 1998-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Nanosized aspartyl protease inhibitors
BRPI9810945B8 (pt) 1997-06-27 2021-05-25 Abraxis Bioscience Inc formulações de agentes farmacológicos, métodos para sua preparação e métodos para uso das mesmas
US20020068048A1 (en) 1997-09-05 2002-06-06 Patrick A. Dreyfus Method for the treatment or diagnosis of human pathologies with disseminated or difficult to access cells or tissues
US6638621B2 (en) * 2000-08-16 2003-10-28 Lyotropic Therapeutics, Inc. Coated particles, methods of making and using
WO2000006244A2 (en) 1998-07-30 2000-02-10 Hainfeld James F Loading metal particles into cell membrane vesicles and metal particle use for imaging and therapy
WO2000064954A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Vanderbilt University Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis
US20050112141A1 (en) 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
MXPA02002579A (es) * 1999-09-09 2003-10-14 Univ California Entrega de liposomas cationicas de taxanos a vasos sanguineos angiogenicos.
US6458387B1 (en) 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
GB0002856D0 (en) 2000-02-08 2000-03-29 Gendel Limited Ultrasound sensitisation
AU4724401A (en) 2000-02-28 2001-09-12 Genesegues Inc Nanocapsule encapsulation system and method
JP4085231B2 (ja) 2000-02-28 2008-05-14 株式会社ビークル タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法
US7338657B2 (en) 2001-03-15 2008-03-04 Biosphere Medical, Inc. Injectable microspheres for tissue construction
HUP0301835A2 (hu) 2000-05-03 2003-09-29 Mbt Munich Biotechnology Ag Kationos diagnosztikai, képalkotó és terápiás ágensek, aktivált vaszkuláris helyekkel asszociálódva
US6455073B1 (en) 2000-07-10 2002-09-24 Enzrel, Inc. Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
ES2326209T3 (es) 2000-10-27 2009-10-05 Baxter Healthcare S.A. Produccion de microesferas.
US6884436B2 (en) 2000-12-22 2005-04-26 Baxter International Inc. Method for preparing submicron particle suspensions
US9700866B2 (en) 2000-12-22 2017-07-11 Baxter International Inc. Surfactant systems for delivery of organic compounds
US7037528B2 (en) 2000-12-22 2006-05-02 Baxter International Inc. Microprecipitation method for preparing submicron suspensions
AU2002249836B2 (en) 2000-12-22 2006-12-14 Baxter International Inc. Method for preparing submicron particle suspensions
US20040022861A1 (en) 2001-01-30 2004-02-05 Williams Robert O. Process for production of nanoparticles and microparticles by spray freezing into liquid
WO2002060416A1 (en) 2001-02-01 2002-08-08 Gendel Limited Polypeptide delivery system and method for their preparation
US20020169102A1 (en) 2001-04-03 2002-11-14 Frey William H. Intranasal delivery of agents for regulating development of implanted cells in the CNS
US6790455B2 (en) 2001-09-14 2004-09-14 The Research Foundation At State University Of New York Cell delivery system comprising a fibrous matrix and cells
US20060003012A9 (en) 2001-09-26 2006-01-05 Sean Brynjelsen Preparation of submicron solid particle suspensions by sonication of multiphase systems
CN1186445C (zh) * 2002-03-15 2005-01-26 陈志南 抗人肝癌单克隆抗体HAb18轻、重链可变区基因及其应用
GB0224442D0 (en) 2002-10-21 2002-11-27 Molmed Spa A delivery system
US20050058603A1 (en) * 2003-05-02 2005-03-17 Case Western Reserve University Drug delivery system based on polymer nanoshells
KR20060012628A (ko) * 2003-05-19 2006-02-08 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 하나 이상의 표면 변형제로 피복시킨 항경련제 또는면역억제제를 포함하는 고형 입자
EP1638460A4 (en) 2003-06-12 2010-05-05 Univ Minnesota RANGING CELLS ON TARGET TISSUE OR ORGANS
CA2529965C (en) 2003-06-20 2011-01-25 Lipid Sciences, Inc. Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content useful for treating and preventing infectious diseases
US9044381B2 (en) * 2003-06-24 2015-06-02 Baxter International Inc. Method for delivering drugs to the brain
US20050084456A1 (en) * 2003-10-21 2005-04-21 Liping Tang Functionalized particles
GB2407500A (en) * 2003-11-03 2005-05-04 Ist Superiore Sanita Use of microparticles for antigen delivery
GB0329310D0 (en) 2003-12-18 2004-01-21 Univ Keele Method
US20050202094A1 (en) 2004-01-29 2005-09-15 Werling Jane O. Nanosuspensions of anti-retroviral agents for increased central nervous system delivery
SG135174A1 (en) 2004-02-02 2007-09-28 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Compositions and methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells
BRPI0510271A (pt) 2004-06-15 2007-10-30 Baxter Int aplicações ex-vivo agentes terapêuticos microparticulados
US7541028B2 (en) * 2005-01-04 2009-06-02 Gp Medical, Inc. Nanoparticles for monoclonal antibody delivery
AU2006209654A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Pharmaceutical preparation containing magnetic vesicular particles, manufacturing method thereof and diagnostic therapeutic system
WO2006117220A2 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Medigene Ag Method of administering a cationic liposomal preparation comprising paclitaxel
CN1772303A (zh) 2005-10-25 2006-05-17 朱宏 恶性肿瘤磁热疗用纳米磁粉－抗体靶向药物
US20070098640A1 (en) 2005-11-02 2007-05-03 General Electric Company Nanoparticle-based imaging agents for X-ray/computed tomography

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105748073A (zh) * 2014-12-15 2016-07-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种小鼠清醒状态下的笼具及其应用
CN107638940A (zh) * 2017-07-31 2018-01-30 芜湖杨燕制药有限公司 一种中药注射剂渗漉提取前处理方法
WO2021179555A1 (zh) * 2020-03-09 2021-09-16 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种病毒性肺炎的标志物及其应用
CN114366724A (zh) * 2021-12-29 2022-04-19 中山大学附属第一医院 一种微环境巨噬细胞调控递送系统及其制备方法和应用
CN114366724B (zh) * 2021-12-29 2023-02-24 中山大学附属第一医院 一种微环境巨噬细胞调控递送系统及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010140621A (ru) 2012-04-10
US9364443B2 (en) 2016-06-14
IL207569A0 (en) 2010-12-30
BRPI0909780B1 (pt) 2022-05-03
EP2259798B1 (en) 2013-12-11
IL207569A (en) 2015-11-30
RU2496482C2 (ru) 2013-10-27
US20090274765A1 (en) 2009-11-05
BRPI0909780A2 (pt) 2015-08-11
ES2447465T3 (es) 2014-03-12
EP2259798A1 (en) 2010-12-15
WO2009111638A1 (en) 2009-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101965195A (zh) 用于药物投送的组合物和方法
US11964021B2 (en) Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors
Gaspar et al. Microencapsulated solid lipid nanoparticles as a hybrid platform for pulmonary antibiotic delivery
CN102458369B (zh) 用于药物递送的组合物和方法
JP5634009B2 (ja) タンパク質を含み、そして高濃度のタンパク質で注射性能を示すミクロスフェア
KR102541164B1 (ko) 하이브리도좀, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도
CN102202694B (zh) 包含抗-聚合物抗体的靶向构建体和结合它们的脂质体或微泡
Souto et al. Surface-tailored anti-HER2/neu-solid lipid nanoparticles for site-specific targeting MCF-7 and BT-474 breast cancer cells
US8333959B2 (en) Ex-vivo application of solid microparticulate therapeutic agents
KR20220085840A (ko) 화물 전달용 지질 2중층 코팅물을 가진 메조다공성 실리카 나노입자
CN1791386A (zh) 抗癫痫和抗痴呆药物以及免疫抑制剂的小－颗粒药物制剂
JP2010509243A (ja) 薬物動態学的および薬力学的特性を保持するタンパク質マイクロスフェア
JP2013209388A (ja) 活性物質の標的化送達用ナノ粒子
JP2010509243A5 (zh)
CN113365609A (zh) 颗粒形成和形态
EP2709590A1 (en) Enhanced growth inhibition of osteosarcoma by cytotoxic polymerized liposomal nanoparticles targeting the alcam cell surface receptor
BR112020003956A2 (pt) nanopartículas magnéticas para entrega direcionada, composição e método de uso
Shen et al. Helper T cell (CD4+) targeted tacrolimus delivery mediates precise suppression of allogeneic humoral immunity
Shen et al. Research Article Helper T Cell (CD4) Targeted Tacrolimus Delivery Mediates Precise Suppression of Allogeneic Humoral Immunity
JP2024514196A (ja) 改変型タンパク質分子を含む機能化された生体膜、並びにその作成方法及び使用
CN1972671A (zh) 含有蛋白并在高浓度蛋白下显示可注射性的微球体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1150965

Country of ref document: HK

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110202

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1150965

Country of ref document: HK