JPH0819396A - グラム−陰性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜蛋白質の製造および使用 - Google Patents
グラム−陰性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜蛋白質の製造および使用Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 グラム−陰性球菌の全膜からリポオリゴ糖が
除去された外膜を製造する方法であって、該方法が ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出
して内膜が除去された外膜を製造し、そして ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造する ことを特徴とする方法。 【効果】 リポオリゴ糖が除去された外膜およびリポオ
リゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造することが
でき、それらはバクテリアの同種菌株に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発させるのに有用である。
除去された外膜を製造する方法であって、該方法が ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出
して内膜が除去された外膜を製造し、そして ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造する ことを特徴とする方法。 【効果】 リポオリゴ糖が除去された外膜およびリポオ
リゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造することが
でき、それらはバクテリアの同種菌株に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発させるのに有用である。
Description
【０００１】
【背景】バクテリア性髄膜炎は、軟膜中およびそれの隣
接部分でバクテリアの成長により引き起こされる中枢神
経系の炎症性疾病である。それは子供および若年成人に
影響を与える急性であり且つしばしば致死性である感染
性疾病である。ほとんどの世界的なバクテリア性髄膜炎
の共通原因の一つは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)
の感染である。多くの人間は疾病を示さずに集落化され
ているため、このバクテリア感染の発生は予期できな
い。一部の人間は一時的保菌者であるが、他の人間は慢
性保菌者であり、髄膜炎菌を多かれ少なかれ連続的にま
たは散発的に放出する。感染過程中に、殺バクテリア性
抗体が感染人間の中で製造され、それがその人間をその
後の感染に対してはっきり免疫化させる（ゴールドシュ
ナイダー(Goldschneider)他、１９６９）。この観察が
バクテリア性抗体を基にしたワクチンが髄膜炎に対して
有効であるかもしれないという期待を生じた。
接部分でバクテリアの成長により引き起こされる中枢神
経系の炎症性疾病である。それは子供および若年成人に
影響を与える急性であり且つしばしば致死性である感染
性疾病である。ほとんどの世界的なバクテリア性髄膜炎
の共通原因の一つは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)
の感染である。多くの人間は疾病を示さずに集落化され
ているため、このバクテリア感染の発生は予期できな
い。一部の人間は一時的保菌者であるが、他の人間は慢
性保菌者であり、髄膜炎菌を多かれ少なかれ連続的にま
たは散発的に放出する。感染過程中に、殺バクテリア性
抗体が感染人間の中で製造され、それがその人間をその
後の感染に対してはっきり免疫化させる（ゴールドシュ
ナイダー(Goldschneider)他、１９６９）。この観察が
バクテリア性抗体を基にしたワクチンが髄膜炎に対して
有効であるかもしれないという期待を生じた。
【０００２】髄膜炎菌はグラム−陰性球菌(Gram-negati
ve coccus)である。特徴的には、それは内側の血漿膜、
血漿周辺空間(periplasmic space)、および外膜または
細胞壁からなっている細胞膜により取り囲まれている。
外膜はリポオリゴ糖（ＬＯＳ）分子、脂質、蛋白質およ
び多糖からなっている。感染人間中で製造される保護抗
体は被膜性多糖および外膜蛋白質の両者に対して向けら
れることが見いだされた（フラッシュ(Frasch)、１９８
３）。
ve coccus)である。特徴的には、それは内側の血漿膜、
血漿周辺空間(periplasmic space)、および外膜または
細胞壁からなっている細胞膜により取り囲まれている。
外膜はリポオリゴ糖（ＬＯＳ）分子、脂質、蛋白質およ
び多糖からなっている。感染人間中で製造される保護抗
体は被膜性多糖および外膜蛋白質の両者に対して向けら
れることが見いだされた（フラッシュ(Frasch)、１９８
３）。
【０００３】髄膜炎菌の菌株は被膜の型（抗原的および
生化学的）に従い血清群に分類される。最近認識された
血清群には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚお
よび２８Ｅが包含される。群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｗ１３５
およびＹの血清群特異性に関与する多糖が精製されてい
る。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５からの精製された
被膜性多糖を基にした４価のワクチンが開発されている
（ハンキンズ(Hankins)他、１９８２）。しかしなが
ら、２才以下群すなわち髄膜炎菌感染の危険の最も多い
年令群の免疫原性の欠如のために、このワクチンの使用
は限定される。群Ｂ髄膜炎菌の被膜は、担体蛋白質と結
合されている時でさえ、全ての年令群において免疫原性
が劣っている。この被膜に対する抗体が胎児および新生
児の脳組織と交差反応するかもしれないという証拠があ
る。
生化学的）に従い血清群に分類される。最近認識された
血清群には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚお
よび２８Ｅが包含される。群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｗ１３５
およびＹの血清群特異性に関与する多糖が精製されてい
る。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５からの精製された
被膜性多糖を基にした４価のワクチンが開発されている
（ハンキンズ(Hankins)他、１９８２）。しかしなが
ら、２才以下群すなわち髄膜炎菌感染の危険の最も多い
年令群の免疫原性の欠如のために、このワクチンの使用
は限定される。群Ｂ髄膜炎菌の被膜は、担体蛋白質と結
合されている時でさえ、全ての年令群において免疫原性
が劣っている。この被膜に対する抗体が胎児および新生
児の脳組織と交差反応するかもしれないという証拠があ
る。
【０００４】髄膜炎菌の主要な外膜蛋白質（ｏｍｐ）
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびペプチドマ
ップ分析（ツサイ(Tsai)他、１９８１）上での泳動（Ｍ
ｒ）により測定されて、構造的同様性を基にして５種の
綱に分けられている。これらの蛋白質綱の中では、綱１
蛋白質がワクチン製造に最も有利であるようである。そ
れは髄膜炎菌のほとんどの単離物の中で発現されそして
菌株の亜型特異性を基にしている。
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびペプチドマ
ップ分析（ツサイ(Tsai)他、１９８１）上での泳動（Ｍ
ｒ）により測定されて、構造的同様性を基にして５種の
綱に分けられている。これらの蛋白質綱の中では、綱１
蛋白質がワクチン製造に最も有利であるようである。そ
れは髄膜炎菌のほとんどの単離物の中で発現されそして
菌株の亜型特異性を基にしている。
【０００５】外膜蛋白質を基にしたワクチンを製造する
ためのいくつかの試みがなされている。被膜性多糖およ
び外膜蛋白質または小胞複合体中の外膜蛋白質だけから
なるワクチンが試験されている。これらのワクチンの中
の１種だけが５７％以上有効性であると報告されている
（シエラ(Sierra)他、１９９１）。
ためのいくつかの試みがなされている。被膜性多糖およ
び外膜蛋白質または小胞複合体中の外膜蛋白質だけから
なるワクチンが試験されている。これらのワクチンの中
の１種だけが５７％以上有効性であると報告されている
（シエラ(Sierra)他、１９９１）。
【０００６】外膜および被膜の両者を基にしたワクチン
の開発における他の意義ある問題はバクテリア性リポオ
リゴ糖（ＬＯＳ）の存在であり、それが人間の中で毒性
副作用を生ずる。リポオリゴ糖はバクテリア性内毒素と
も称される。低量のリポオリゴ糖は発熱を引き起こす可
能性があり、そして高いリポオリゴ糖量は患者の全身的
瘠痩（悪液質）を生じる可能性がある。多くの最近の外
膜複合体ワクチンは１０−７０μｇ／ｍｇ蛋白質の残存
リポオリゴ糖水準を有する（ゾリンガー(Zollinger)、
再調査に関する１９９０）。従って、髄膜炎菌により引
き起こされるバクテリア性髄膜炎用の、そして特に群Ｂ
菌株により引き起こされる疾病用の安全で且つ有効なワ
クチンに対する要望が存在する。
の開発における他の意義ある問題はバクテリア性リポオ
リゴ糖（ＬＯＳ）の存在であり、それが人間の中で毒性
副作用を生ずる。リポオリゴ糖はバクテリア性内毒素と
も称される。低量のリポオリゴ糖は発熱を引き起こす可
能性があり、そして高いリポオリゴ糖量は患者の全身的
瘠痩（悪液質）を生じる可能性がある。多くの最近の外
膜複合体ワクチンは１０−７０μｇ／ｍｇ蛋白質の残存
リポオリゴ糖水準を有する（ゾリンガー(Zollinger)、
再調査に関する１９９０）。従って、髄膜炎菌により引
き起こされるバクテリア性髄膜炎用の、そして特に群Ｂ
菌株により引き起こされる疾病用の安全で且つ有効なワ
クチンに対する要望が存在する。
【０００７】
【発明の要旨】本発明は、ある種の界面活性剤を用いる
連続的抽出によるグラム−陰性球菌の外膜からのリポオ
リゴ糖（ＬＯＳ）の効果的な除去方法に関するものであ
る。バクテリア性内毒素とも称されるリポオリゴ糖はワ
クチン中での例えば発熱の如き望ましくない副作用を引
き起こす可能性がある。ここに記載されている如く、該
方法は極端に低いリポオリゴ糖含有量を有するが免疫原
性を保有する外膜および可溶性外膜蛋白質を製造する。
これらのリポオリゴ糖が除去された外膜生成物はさらに
殺バクテリア性抗体を誘発することも示されている。従
って、リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜
蛋白質を含んでなるワクチンが提供され、それらは髄膜
炎およびグラム−陰性球菌により引き起こされる他の疾
病に対する治療および予防において有用であると期待さ
れる。
連続的抽出によるグラム−陰性球菌の外膜からのリポオ
リゴ糖（ＬＯＳ）の効果的な除去方法に関するものであ
る。バクテリア性内毒素とも称されるリポオリゴ糖はワ
クチン中での例えば発熱の如き望ましくない副作用を引
き起こす可能性がある。ここに記載されている如く、該
方法は極端に低いリポオリゴ糖含有量を有するが免疫原
性を保有する外膜および可溶性外膜蛋白質を製造する。
これらのリポオリゴ糖が除去された外膜生成物はさらに
殺バクテリア性抗体を誘発することも示されている。従
って、リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜
蛋白質を含んでなるワクチンが提供され、それらは髄膜
炎およびグラム−陰性球菌により引き起こされる他の疾
病に対する治療および予防において有用であると期待さ
れる。
【０００８】ここで特記載されるものは髄膜炎菌の外膜
生成物である。本方法により髄膜炎菌から製造される外
膜生成物は約０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少
ないリポオリゴ糖含有量を有しそして動物中で殺バクテ
リア性抗体を誘発することが示される。その結果、髄膜
炎菌に対するワクチンが提供され、それらは免疫学的に
有効でありそして相対的にバクテリア性リポオリゴ糖を
含んでいない。特に興味のあるものは、現在有効なワク
チンがない髄膜炎菌の血清群Ｂ菌株に対するワクチンで
ある。
生成物である。本方法により髄膜炎菌から製造される外
膜生成物は約０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少
ないリポオリゴ糖含有量を有しそして動物中で殺バクテ
リア性抗体を誘発することが示される。その結果、髄膜
炎菌に対するワクチンが提供され、それらは免疫学的に
有効でありそして相対的にバクテリア性リポオリゴ糖を
含んでいない。特に興味のあるものは、現在有効なワク
チンがない髄膜炎菌の血清群Ｂ菌株に対するワクチンで
ある。
【０００９】本方法は他のグラム−陰性球菌にも適用で
きると期待されており、その理由はこれらのバクテリア
が構造的に同様な外膜を有するからである。例えば、淋
菌(N.gonorrhoeae)の如き他のナイセリア(Neisseria)種
および例えばモラクセラ(Moraxella)の如きグラム−陰
性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜を製造すること
ができる。従って、下記の工程および生成物中では髄膜
炎菌が他のグラム−陰性球菌の代表である。
きると期待されており、その理由はこれらのバクテリア
が構造的に同様な外膜を有するからである。例えば、淋
菌(N.gonorrhoeae)の如き他のナイセリア(Neisseria)種
および例えばモラクセラ(Moraxella)の如きグラム−陰
性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜を製造すること
ができる。従って、下記の工程および生成物中では髄膜
炎菌が他のグラム−陰性球菌の代表である。
【００１０】この方法はさらにグラム−陰性球菌の種々
の天然菌株並びに１種より多い亜型−特異的エピトー
プ、例えば１種より多い一亜型−特異的エピトープ、例
えば１種より多い髄膜炎菌の綱１蛋白質、を製造するた
めに遺伝子的に操作される組み換え体菌株にも適用でき
る。数種の血清群、血清型または亜型の表面エピトープ
を発現する菌株または組み換え体菌株の混合物を使用し
て多価ワクチンを製造することができる。
の天然菌株並びに１種より多い亜型−特異的エピトー
プ、例えば１種より多い一亜型−特異的エピトープ、例
えば１種より多い髄膜炎菌の綱１蛋白質、を製造するた
めに遺伝子的に操作される組み換え体菌株にも適用でき
る。数種の血清群、血清型または亜型の表面エピトープ
を発現する菌株または組み換え体菌株の混合物を使用し
て多価ワクチンを製造することができる。
【００１１】該方法は種々の界面活性剤を用いる連続的
抽出を含んでなるものである。最初に、球菌の全膜をポ
リオキシエチレン界面活性剤（例えば、トリトン(TRITO
N)Ｘ−１００TM、ＢＲＩＪ３５TM、またはツイーン(TWE
EN)８０TM）で抽出して、内膜および一部のリポオリゴ
糖が除去された外膜を生ずる。この次に、例えばツイッ
タージェント(ZWITTERGENT)TMシリーズの１種（例えば
３−１２または３−１４）またはエンピゲン(EMPIGEN)
ＢＢTMの如き両性イオン系(zwitterionic)ベタイン界面
活性剤で抽出する。これらの界面活性剤は蛋白質はほと
んど抽出しないが残存リポオリゴ糖の本質的に全てを特
異的に除去する。
抽出を含んでなるものである。最初に、球菌の全膜をポ
リオキシエチレン界面活性剤（例えば、トリトン(TRITO
N)Ｘ−１００TM、ＢＲＩＪ３５TM、またはツイーン(TWE
EN)８０TM）で抽出して、内膜および一部のリポオリゴ
糖が除去された外膜を生ずる。この次に、例えばツイッ
タージェント(ZWITTERGENT)TMシリーズの１種（例えば
３−１２または３−１４）またはエンピゲン(EMPIGEN)
ＢＢTMの如き両性イオン系(zwitterionic)ベタイン界面
活性剤で抽出する。これらの界面活性剤は蛋白質はほと
んど抽出しないが残存リポオリゴ糖の本質的に全てを特
異的に除去する。
【００１２】生成したリポオリゴ糖が除去された外膜製
剤は細胞壁成分と結合されている外膜蛋白質類（ｏｍ
ｐ）からなっている。この製剤はワクチン目的用に直接
使用することもでき、または外膜蛋白質を可溶化させそ
して塩緩衝液中で両性イオン系ベタイン界面活性剤を使
用して、例えば約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌ中でのツ
イッタージェント３−１４TMを用いて、他の細胞壁成分
から抽出することができる。可溶化段階により、リポオ
リゴ糖が除去された留分が生成し、それらの一方は可溶
性外膜蛋白質を含有しそして他方は他の細胞壁成分と結
合されている不溶性外膜蛋白質を含有する。リポオリゴ
糖が除去された外膜およびリポオリゴ糖が除去された可
溶性外膜蛋白質の両者はハツカネズミ中で殺バクテリア
性抗体を誘発することが示されている。
剤は細胞壁成分と結合されている外膜蛋白質類（ｏｍ
ｐ）からなっている。この製剤はワクチン目的用に直接
使用することもでき、または外膜蛋白質を可溶化させそ
して塩緩衝液中で両性イオン系ベタイン界面活性剤を使
用して、例えば約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌ中でのツ
イッタージェント３−１４TMを用いて、他の細胞壁成分
から抽出することができる。可溶化段階により、リポオ
リゴ糖が除去された留分が生成し、それらの一方は可溶
性外膜蛋白質を含有しそして他方は他の細胞壁成分と結
合されている不溶性外膜蛋白質を含有する。リポオリゴ
糖が除去された外膜およびリポオリゴ糖が除去された可
溶性外膜蛋白質の両者はハツカネズミ中で殺バクテリア
性抗体を誘発することが示されている。
【００１３】
【発明の詳細な記述】髄膜炎菌により例示されているよ
うなグラム−陰性球菌の外膜製剤から有毒なリポオリゴ
糖（ＬＯＳ）を除去するために有効な方法がここに記載
されている。該方法は簡単でありそして外膜製剤を無毒
化するためのこれまでの方法で得られるものより低いリ
ポオリゴ糖含有量を生ずる。さらに、免疫原性の意義あ
るほどの損失を伴わずにリポオリゴ糖が除去される。
うなグラム−陰性球菌の外膜製剤から有毒なリポオリゴ
糖（ＬＯＳ）を除去するために有効な方法がここに記載
されている。該方法は簡単でありそして外膜製剤を無毒
化するためのこれまでの方法で得られるものより低いリ
ポオリゴ糖含有量を生ずる。さらに、免疫原性の意義あ
るほどの損失を伴わずにリポオリゴ糖が除去される。
【００１４】該方法は異なる型の界面活性剤を用いる連
続的抽出を含んでいる。最初に、球菌の全膜をポリオキ
シエチレン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００TM、
ＢＲＩＪ３５TMまたはツイーン８０TM、で抽出する。こ
れは内膜および一部のリポオリゴ糖を除去する。次に、
外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤、例えばツイッ
タージェントTMシリーズの１種（例えば３−１２または
３−１４）またはエンピゲンＢＢTM、で抽出する。この
段階により、残存リポオリゴ糖の本質的に全てが除去さ
れて、リポオリゴ糖が除去された蛋白質に富んだ外膜複
合体（リポオリゴ糖が除去された外膜と称される）を生
ずる。使用される特定の両性イオン系界面活性剤によっ
ては痕跡量のリポオリゴ糖が残るかもしれないが、これ
らの水準は低くそして人間中で有毒な副作用を誘発する
とは予測されない。
続的抽出を含んでいる。最初に、球菌の全膜をポリオキ
シエチレン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００TM、
ＢＲＩＪ３５TMまたはツイーン８０TM、で抽出する。こ
れは内膜および一部のリポオリゴ糖を除去する。次に、
外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤、例えばツイッ
タージェントTMシリーズの１種（例えば３−１２または
３−１４）またはエンピゲンＢＢTM、で抽出する。この
段階により、残存リポオリゴ糖の本質的に全てが除去さ
れて、リポオリゴ糖が除去された蛋白質に富んだ外膜複
合体（リポオリゴ糖が除去された外膜と称される）を生
ずる。使用される特定の両性イオン系界面活性剤によっ
ては痕跡量のリポオリゴ糖が残るかもしれないが、これ
らの水準は低くそして人間中で有毒な副作用を誘発する
とは予測されない。
【００１５】好適な工程はトリトンＸ−１００TMで数回
抽出しその後にツイッタージェント３−１４TM（Ｚｗ３
−１４）で数回抽出することである。例えば、リポオリ
ゴ糖が除去された外膜は血清群Ｂ菌株、例えばＨ４４／
７６、２９９６またはＨ１３、から製造される。バクテ
リア膜はトリトンＸ−１００TMで２回抽出され、次にツ
イッタージェント３−１４TMで少なくとも２回抽出され
る（図面参照）。１グラムの凍結乾燥されたバクテリア
からの生ずる収量は約３２ｍｇのリポオリゴ糖が除去さ
れた蛋白質に富んだ外膜である。この生成物はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルの銀染色法により検出可能な残
存リポオリゴ糖を含有しない。
抽出しその後にツイッタージェント３−１４TM（Ｚｗ３
−１４）で数回抽出することである。例えば、リポオリ
ゴ糖が除去された外膜は血清群Ｂ菌株、例えばＨ４４／
７６、２９９６またはＨ１３、から製造される。バクテ
リア膜はトリトンＸ−１００TMで２回抽出され、次にツ
イッタージェント３−１４TMで少なくとも２回抽出され
る（図面参照）。１グラムの凍結乾燥されたバクテリア
からの生ずる収量は約３２ｍｇのリポオリゴ糖が除去さ
れた蛋白質に富んだ外膜である。この生成物はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルの銀染色法により検出可能な残
存リポオリゴ糖を含有しない。
【００１６】この方法のリポオリゴ糖が除去された外膜
生成物は外膜蛋白質および細胞壁成分の複合体である。
抗原製剤をさらに精製するために、外膜蛋白質（ｏｍ
ｐ）をリポオリゴ糖が除去された細胞壁から、好適には
塩緩衝液中での両性イオン系ベタイン界面活性剤を用い
る抽出により、可溶化させる。約０.１〜約０.５Ｍの塩
化ナトリウム中でのツイッタージェント３−１４TMがこ
の目的用に好適である。他の両性イオン系界面活性剤お
よび塩緩衝液、例えば塩化カリウム、も使用できる。可
溶化段階により、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜
蛋白質および他の細胞壁成分と結合された不溶性外膜蛋
白質を含有する別の留分が生成する。リポオリゴ糖が除
去された細胞壁を０.５Ｍ塩化ナトリウム中の１.０％ツ
イッタージェント３−１４TMで抽出することにより、１
グラムの凍結乾燥された細胞当たり約１６ｍｇの可溶化
された外膜蛋白質の収量が得られる。この抽出段階を繰
り返すことにより、さらに多い蛋白質が得られる。
生成物は外膜蛋白質および細胞壁成分の複合体である。
抗原製剤をさらに精製するために、外膜蛋白質（ｏｍ
ｐ）をリポオリゴ糖が除去された細胞壁から、好適には
塩緩衝液中での両性イオン系ベタイン界面活性剤を用い
る抽出により、可溶化させる。約０.１〜約０.５Ｍの塩
化ナトリウム中でのツイッタージェント３−１４TMがこ
の目的用に好適である。他の両性イオン系界面活性剤お
よび塩緩衝液、例えば塩化カリウム、も使用できる。可
溶化段階により、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜
蛋白質および他の細胞壁成分と結合された不溶性外膜蛋
白質を含有する別の留分が生成する。リポオリゴ糖が除
去された細胞壁を０.５Ｍ塩化ナトリウム中の１.０％ツ
イッタージェント３−１４TMで抽出することにより、１
グラムの凍結乾燥された細胞当たり約１６ｍｇの可溶化
された外膜蛋白質の収量が得られる。この抽出段階を繰
り返すことにより、さらに多い蛋白質が得られる。
【００１７】可溶性外膜蛋白質を、例えばエタノール沈
澱、濾過、および吸収の如き蛋白質濃縮用の種々の標準
的方法により、さらに濃縮することができる。可溶性外
膜蛋白質の濃縮により、ワクチンまたは試薬組成物中の
抗原の最終的濃度を調節することができる。
澱、濾過、および吸収の如き蛋白質濃縮用の種々の標準
的方法により、さらに濃縮することができる。可溶性外
膜蛋白質の濃縮により、ワクチンまたは試薬組成物中の
抗原の最終的濃度を調節することができる。
【００１８】図面は、髄膜炎菌の全細胞を用いて開始さ
れそして可溶性外膜蛋白質の濃縮に進行するようなリポ
オリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造するため
の方法の一態様を示している。表１（詳細な記載の最
後）は出発物質と比較されているリポオリゴ糖が除去さ
れた外膜および可溶性外膜蛋白質のリポオリゴ糖および
蛋白質含有量を示している。
れそして可溶性外膜蛋白質の濃縮に進行するようなリポ
オリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造するため
の方法の一態様を示している。表１（詳細な記載の最
後）は出発物質と比較されているリポオリゴ糖が除去さ
れた外膜および可溶性外膜蛋白質のリポオリゴ糖および
蛋白質含有量を示している。
【００１９】使用される界面活性剤の型およびそれらの
使用順序がこの方法にとって重要である。例えば、トリ
トンＸ−１００TMは外膜から最少の蛋白質損失でリポオ
リゴ糖の大部分を除去する。しかしながら、リポオリゴ
糖の残部の除去用に重要なのはツイッタージェント３−
１４TMである。界面活性剤の使用順序は蛋白質または他
の細胞壁成分が抽出されるかまたは不溶性のままにする
かを決めるのに重要である。それぞれの界面活性剤は、
次の界面活性剤でどれが可溶化されるかに直接影響す
る。例えば、トリトンＸ−１００TMの代わりにサルコシ
ルを使用して内膜を抽出するなら、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定される生じた外膜の蛋
白質特徴が異なる。綱１外膜蛋白質の水準も減じられ
る。
使用順序がこの方法にとって重要である。例えば、トリ
トンＸ−１００TMは外膜から最少の蛋白質損失でリポオ
リゴ糖の大部分を除去する。しかしながら、リポオリゴ
糖の残部の除去用に重要なのはツイッタージェント３−
１４TMである。界面活性剤の使用順序は蛋白質または他
の細胞壁成分が抽出されるかまたは不溶性のままにする
かを決めるのに重要である。それぞれの界面活性剤は、
次の界面活性剤でどれが可溶化されるかに直接影響す
る。例えば、トリトンＸ−１００TMの代わりにサルコシ
ルを使用して内膜を抽出するなら、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定される生じた外膜の蛋
白質特徴が異なる。綱１外膜蛋白質の水準も減じられ
る。
【００２０】上記の方法を種々に最適化してリポオリゴ
糖の除去を最大にしそして蛋白質の損失を最少にでき
る。例えば、Ｚｗ３−１４の最適濃度範囲は約０.５％
〜約１.０％（重量／容量）であると見いだされてい
る。０.５％より低い水準は内毒素水準の減少において
は有効ではない。それぞれの抽出段階は１回より多く行
うこともできる。しかしながら、ポリオキシエチレン界
面活性剤を用いる抽出は両性イオン系界面活性剤を用い
る抽出に先立つべきである。多数回の抽出はさらに清浄
な製剤を生ずるが、比較的低い収率ももたらす。界面活
性剤の濃度が増加すると比較的少ない抽出で同じ結果を
生ずることができる。異なるポリオキシエチレン界面活
性剤および両性イオン系界面活性剤の組み合わせをそれ
ぞれ第一および第二の抽出段階で使用することもでき
る。例えば、トリトンTM抽出後に、外膜をＺｗ３−１２
で２回そしてＺｗ３−１４で２回抽出することができ
る。
糖の除去を最大にしそして蛋白質の損失を最少にでき
る。例えば、Ｚｗ３−１４の最適濃度範囲は約０.５％
〜約１.０％（重量／容量）であると見いだされてい
る。０.５％より低い水準は内毒素水準の減少において
は有効ではない。それぞれの抽出段階は１回より多く行
うこともできる。しかしながら、ポリオキシエチレン界
面活性剤を用いる抽出は両性イオン系界面活性剤を用い
る抽出に先立つべきである。多数回の抽出はさらに清浄
な製剤を生ずるが、比較的低い収率ももたらす。界面活
性剤の濃度が増加すると比較的少ない抽出で同じ結果を
生ずることができる。異なるポリオキシエチレン界面活
性剤および両性イオン系界面活性剤の組み合わせをそれ
ぞれ第一および第二の抽出段階で使用することもでき
る。例えば、トリトンTM抽出後に、外膜をＺｗ３−１２
で２回そしてＺｗ３−１４で２回抽出することができ
る。
【００２１】バクテリア細胞を溶解させそして膜および
細胞質留分を分離するための標準的方法により、全膜が
球菌から製造される。例えば、フレンチ圧力セルを使用
してバクテリアを溶解させ、低速遠心分離を使用して破
壊されていない細胞を除去し、そして超遠心分離を使用
して全膜を回収する。それぞれの抽出後に希望しない留
分からの希望留分の分離を遠心分離、濾過、透析、およ
び吸収を含む種々の既知の方法により行うこともでき
る。
細胞質留分を分離するための標準的方法により、全膜が
球菌から製造される。例えば、フレンチ圧力セルを使用
してバクテリアを溶解させ、低速遠心分離を使用して破
壊されていない細胞を除去し、そして超遠心分離を使用
して全膜を回収する。それぞれの抽出後に希望しない留
分からの希望留分の分離を遠心分離、濾過、透析、およ
び吸収を含む種々の既知の方法により行うこともでき
る。
【００２２】界面活性剤置換 種々の界面活性剤置換物を該方法で使用することがで
き、そして外膜の免疫原性を保有しながらのリポオリゴ
糖の除去におけるそれらの有効性を試験できる。
き、そして外膜の免疫原性を保有しながらのリポオリゴ
糖の除去におけるそれらの有効性を試験できる。
【００２３】ＢＲＩＪTM、トリトンＸ−１００TM、およ
びツイーン８０TMはポリオキシエチレン界面活性剤であ
る。ＢＲＩＪTMおよびツイーン８０TMはトリトンTMと非
常に同様に作用する。どちらも内毒素水準をトリトンＸ
−１００TMと同様に効果的には減少させるものではない
が、それらはツイッタージェント３−１４TMによるその
後のリポオリゴ糖の除去に影響しない。生成したリポオ
リゴ糖が除去された外膜の全蛋白質含有量は同様であ
る。サルコシルによるトリトンＸ−１００TMの置換は低
い内毒素含有量（１.８ｎｇ／ｍｇの蛋白質よりはるか
に少ない）を生ずるが、全蛋白質に関するリポオリゴ糖
が除去された外膜の収量はトリトンTMで得られるものよ
りはるかに少ない。
びツイーン８０TMはポリオキシエチレン界面活性剤であ
る。ＢＲＩＪTMおよびツイーン８０TMはトリトンTMと非
常に同様に作用する。どちらも内毒素水準をトリトンＸ
−１００TMと同様に効果的には減少させるものではない
が、それらはツイッタージェント３−１４TMによるその
後のリポオリゴ糖の除去に影響しない。生成したリポオ
リゴ糖が除去された外膜の全蛋白質含有量は同様であ
る。サルコシルによるトリトンＸ−１００TMの置換は低
い内毒素含有量（１.８ｎｇ／ｍｇの蛋白質よりはるか
に少ない）を生ずるが、全蛋白質に関するリポオリゴ糖
が除去された外膜の収量はトリトンTMで得られるものよ
りはるかに少ない。
【００２４】両性イオン系ベタイン界面活性剤は下記の
式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、Ｒ2はカ
ルボキシル基またはスルホニル基であり、そしてｎは１
より大きく、そして好適には２−３である］によりまと
められる。例えば、ツイッタージェントTMシリーズはＲ
2＝スルホニル基（−ＳＯ3 -）、ｎ＝３、およびＲ1＝種
々の長さのアルキル基を有する。ツイッタージェントTM
はアルキル鎖の長さが後記されており、例えば、Ｚｗ３
−１２は炭素数１２のアルキルを有し、そしてＺｗ３−
１４はＲ1中に１４個の炭素を有する。エンピゲンＢＢ
TMはＲ2＝カルボニル基（−ＣＯＯ-）、Ｒ1中の１２個
の炭素原子、およびｎ＝２を有する。
式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、Ｒ2はカ
ルボキシル基またはスルホニル基であり、そしてｎは１
より大きく、そして好適には２−３である］によりまと
められる。例えば、ツイッタージェントTMシリーズはＲ
2＝スルホニル基（−ＳＯ3 -）、ｎ＝３、およびＲ1＝種
々の長さのアルキル基を有する。ツイッタージェントTM
はアルキル鎖の長さが後記されており、例えば、Ｚｗ３
−１２は炭素数１２のアルキルを有し、そしてＺｗ３−
１４はＲ1中に１４個の炭素を有する。エンピゲンＢＢ
TMはＲ2＝カルボニル基（−ＣＯＯ-）、Ｒ1中の１２個
の炭素原子、およびｎ＝２を有する。
【００２５】ツイッタージェントTM３−０８、３−１２
および３−１４の中では、３−１４が過剰の蛋白質を抽
出せずに内毒素を除去する点で最も有効である。比較的
小さい鎖の界面活性剤（３−０８および３−１０）はリ
ポオリゴ糖の除去において有効性が粗糖少なくそして比
較的少ない蛋白質を生ずる。これらの結果は、Ｒ1アル
キル基の鎖長がリポオリゴ糖の除去における界面活性剤
の有効性に影響を与えることを示唆している。Ｚｗ３−
１２およびＺｗ３−１４はそれらの鎖がリポオリゴ糖分
子の脂肪族鎖と大体同じ長さであるため有効である可能
性がある。しかしながら、１６個より多い炭素数のアル
キル基を有する界面活性剤は不溶性となるかもしれな
い。
および３−１４の中では、３−１４が過剰の蛋白質を抽
出せずに内毒素を除去する点で最も有効である。比較的
小さい鎖の界面活性剤（３−０８および３−１０）はリ
ポオリゴ糖の除去において有効性が粗糖少なくそして比
較的少ない蛋白質を生ずる。これらの結果は、Ｒ1アル
キル基の鎖長がリポオリゴ糖の除去における界面活性剤
の有効性に影響を与えることを示唆している。Ｚｗ３−
１２およびＺｗ３−１４はそれらの鎖がリポオリゴ糖分
子の脂肪族鎖と大体同じ長さであるため有効である可能
性がある。しかしながら、１６個より多い炭素数のアル
キル基を有する界面活性剤は不溶性となるかもしれな
い。
【００２６】エンピゲンＢＢTMはＺｗ３−１４と実質的
に同一に機能する。それは内毒素の水準の減少において
有効でありそして同じ蛋白質を抽出する。それにより、
それは比較的少ない蛋白質を抽出するようであり、その
結果外膜生成物中での増加された全蛋白質を生ずるとい
う利点が得られる。
に同一に機能する。それは内毒素の水準の減少において
有効でありそして同じ蛋白質を抽出する。それにより、
それは比較的少ない蛋白質を抽出するようであり、その
結果外膜生成物中での増加された全蛋白質を生ずるとい
う利点が得られる。
【００２７】ここで特に挙げられているものと構造的に
同様である他の生成物を、ここに記載されているように
して、リポオリゴ糖が除去された外膜および外膜蛋白質
の製造における有効性に関して試験することができる。
そのような界面活性剤は第一抽出段階におけるポリオキ
シエチレン界面活性剤または第二抽出段階もしくは可溶
化段階で使用される両性イオン系界面活性剤の機能的同
等物であると考えられる。
同様である他の生成物を、ここに記載されているように
して、リポオリゴ糖が除去された外膜および外膜蛋白質
の製造における有効性に関して試験することができる。
そのような界面活性剤は第一抽出段階におけるポリオキ
シエチレン界面活性剤または第二抽出段階もしくは可溶
化段階で使用される両性イオン系界面活性剤の機能的同
等物であると考えられる。
【００２８】外膜生成物の免疫原性 この方法の外膜生成物の免疫原性を試験するために、外
膜（トリトンＸ−１００TMを用いる抽出後の生成物）、
リポオリゴ糖が除去された外膜（示されているようなＺ
ｗ３−１４およびＺｗ３−１２を用いる抽出後の生成
物）、並びにリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白
質（可溶化段階後の生成物）を髄膜炎菌の組み換え体菌
株（Ｈ１３）から製造する。菌株Ｈ１３（Ｂ：−：ｐ
１.７,１６；ｐ１.５,２）は野生型菌株Ｈ４４／７６
（Ｂ：１５：ｐ１.７,１６）から誘導される二重変異体
細胞系である。Ｈ１３は綱３および綱５外膜蛋白質が欠
けており、そして遺伝子的に操作されてそれの天然ｐ
１.７,１６綱１蛋白質の他にｐ１.５,２綱１蛋白質を発
現する。野生型菌株２９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）
はｐ１.５,２綱１蛋白質を発現する。従って、Ｈ１３は
Ｈ４４／７６および２９９６の両者の綱１亜型を有す
る。
膜（トリトンＸ−１００TMを用いる抽出後の生成物）、
リポオリゴ糖が除去された外膜（示されているようなＺ
ｗ３−１４およびＺｗ３−１２を用いる抽出後の生成
物）、並びにリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白
質（可溶化段階後の生成物）を髄膜炎菌の組み換え体菌
株（Ｈ１３）から製造する。菌株Ｈ１３（Ｂ：−：ｐ
１.７,１６；ｐ１.５,２）は野生型菌株Ｈ４４／７６
（Ｂ：１５：ｐ１.７,１６）から誘導される二重変異体
細胞系である。Ｈ１３は綱３および綱５外膜蛋白質が欠
けており、そして遺伝子的に操作されてそれの天然ｐ
１.７,１６綱１蛋白質の他にｐ１.５,２綱１蛋白質を発
現する。野生型菌株２９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）
はｐ１.５,２綱１蛋白質を発現する。従って、Ｈ１３は
Ｈ４４／７６および２９９６の両者の綱１亜型を有す
る。
【００２９】リポオリゴ糖が除去された外膜製剤をハツ
カネズミ中に注射しそして生じた血清を分析することに
よりそれらを免疫原性に関して試験する。血清を最初の
免疫化から０、４、および８週間後に集め、そして１０
週間で放血させる（実施例参照）。血清を次にイムノブ
ロット分析および酵素−結合されたイムノソルベント検
定（ＥＬＩＳＡ）により、菌株Ｈ４４／７６または２９
９６からの完全細胞と反応する抗体の存在に関して並び
に精製されたｐ１.７,１６綱１外膜蛋白質を認識する抗
体に関して試験する。
カネズミ中に注射しそして生じた血清を分析することに
よりそれらを免疫原性に関して試験する。血清を最初の
免疫化から０、４、および８週間後に集め、そして１０
週間で放血させる（実施例参照）。血清を次にイムノブ
ロット分析および酵素−結合されたイムノソルベント検
定（ＥＬＩＳＡ）により、菌株Ｈ４４／７６または２９
９６からの完全細胞と反応する抗体の存在に関して並び
に精製されたｐ１.７,１６綱１外膜蛋白質を認識する抗
体に関して試験する。
【００３０】表２は精製されたｐ１.７,１６の終点ＥＬ
ＩＳＡ滴定量を示している。この表からわかるように、
リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質（ＳＯＭＰ
−リポオリゴ糖）は精製されたｐ１.７,１６に対する最
高の抗体滴定量を誘発するが、外膜およびリポオリゴ糖
が除去された外膜（ＯＭ−リポオリゴ糖）により誘発さ
れる血清の滴定量はそれより低いものであるがほぼ等し
い。Ｈ４４／７６および２９９６細胞の両者並びに精製
されたｐ１.７,１６からの外膜に対する血清を用いるウ
ェスタン・イムノブロット分析は、血清が外膜蛋白質に
対する抗体だけを含有しておりそしてリポオリゴ糖に対
する抗体を含有していないことを示している。
ＩＳＡ滴定量を示している。この表からわかるように、
リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質（ＳＯＭＰ
−リポオリゴ糖）は精製されたｐ１.７,１６に対する最
高の抗体滴定量を誘発するが、外膜およびリポオリゴ糖
が除去された外膜（ＯＭ−リポオリゴ糖）により誘発さ
れる血清の滴定量はそれより低いものであるがほぼ等し
い。Ｈ４４／７６および２９９６細胞の両者並びに精製
されたｐ１.７,１６からの外膜に対する血清を用いるウ
ェスタン・イムノブロット分析は、血清が外膜蛋白質に
対する抗体だけを含有しておりそしてリポオリゴ糖に対
する抗体を含有していないことを示している。
【００３１】表３および４は、それぞれＨ４４／７６お
よび２９９６全細胞に対する血清の終点ＥＬＩＳＡ滴定
量を示している。Ｚｗ３−１２並びにＺｗ３−１４を使
用して製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜からの
血清の滴定量が示されている。３種全ての抗血清のＥＬ
ＩＳＡ滴定量はＨ４４／７６全細胞に対しても同様であ
る（表３）。可溶性外膜蛋白質により誘発される血清お
よびリポオリゴ糖が除去された外膜により誘発される血
清は放血における平らな段階に達するようである。粗製
外膜により誘発される血清中の抗体水準は線状で増加す
るようである。２９９６全細胞に対するＥＬＩＳＡ（表
４）では、粗製外膜により誘発される血清の滴定量とリ
ポオリゴ糖が除去された外膜により誘発されるものはほ
ぼ等しく、そして両者はリポオリゴ糖が除去された可溶
性外膜蛋白質により誘発される血清の滴定量より低い。
これらの結果は、この方法のリポオリゴ糖が除去された
外膜および可溶性外膜蛋白質生成物では内毒素含有量が
極端に低く免疫原性の意義ある損失を伴わないことを示
している。さらに、これらの結果は異なる血清型および
亜型（Ｈ４４／７６および２９９６）を有する２種の菌
株に対する抗体が両者の菌株の綱１亜型を発現する組み
換え体菌株（Ｈ１３）から製造される外膜生成物により
誘発されることも示している。
よび２９９６全細胞に対する血清の終点ＥＬＩＳＡ滴定
量を示している。Ｚｗ３−１２並びにＺｗ３−１４を使
用して製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜からの
血清の滴定量が示されている。３種全ての抗血清のＥＬ
ＩＳＡ滴定量はＨ４４／７６全細胞に対しても同様であ
る（表３）。可溶性外膜蛋白質により誘発される血清お
よびリポオリゴ糖が除去された外膜により誘発される血
清は放血における平らな段階に達するようである。粗製
外膜により誘発される血清中の抗体水準は線状で増加す
るようである。２９９６全細胞に対するＥＬＩＳＡ（表
４）では、粗製外膜により誘発される血清の滴定量とリ
ポオリゴ糖が除去された外膜により誘発されるものはほ
ぼ等しく、そして両者はリポオリゴ糖が除去された可溶
性外膜蛋白質により誘発される血清の滴定量より低い。
これらの結果は、この方法のリポオリゴ糖が除去された
外膜および可溶性外膜蛋白質生成物では内毒素含有量が
極端に低く免疫原性の意義ある損失を伴わないことを示
している。さらに、これらの結果は異なる血清型および
亜型（Ｈ４４／７６および２９９６）を有する２種の菌
株に対する抗体が両者の菌株の綱１亜型を発現する組み
換え体菌株（Ｈ１３）から製造される外膜生成物により
誘発されることも示している。
【００３２】殺バクテリア活性 リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質
製剤が機能的抗体（すなわち、髄膜炎菌細胞の補体−介
在性破壊を誘発可能な抗体）を誘発する能力を、血清の
殺バクテリア活性を測定することにより、試験する。殺
バクテリア活性に関する検定は実施例に記載されてい
る。表５は菌株２９９６（亜型ｐ１.５,２）または組み
換え体菌株Ｈ１３（亜型ｐ１.５,２およびｐ１.７,１
６）を使用して得られた結果を示している。２９９６の
リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質
は髄膜炎菌の同種菌株を死滅させることができるが異種
菌株であるＨ４４／７６は死滅させることができない抗
体を製造する。Ｈ４４／７６および２９９６の両者の綱
１亜型を発現するＨ１３から製造されるリポオリゴ糖が
除去された外膜製剤はＨ４４／７６全細胞に対する殺バ
クテリア性抗体を誘発するが２９９６全細胞に対するも
のは誘発しない。この２９９６に対する殺バクテリア活
性の欠如は、粗製外膜も機能性抗体を誘発しないため、
リポオリゴ糖の除去中の損失によるものではない。以上
で示されている如く、Ｈ１３から製造されるリポオリゴ
糖が除去された外膜生成物は２９９６細胞に対する抗体
を誘発する（表４）。これらの条件下での２９９６細胞
に対する殺バクテリア活性の欠如はＨ１３菌株中のｐ
１.５,２綱１蛋白質の弱い発現によるものかもしれな
い。これは、Ｈ１３菌株が天然ｐ１.７,１６綱１蛋白質
より相当少ないｐ１.５,２蛋白質を発現するというウエ
スタン・ブロットからの観察と一致する。この問題は、
天然綱１蛋白質のものと匹敵する水準において組み換え
体綱１蛋白質を発現する組み換え体菌株からリポオリゴ
糖が除去された外膜を製造することにより、克服でき
る。Ｈ１３コロニーをが含有するフィルターを抗ｐ１.
５,２抗体に関する反応性に関してスクリーニングする
ことにより、ｐ１.５,２のさらに強い発現を有するＨ１
３のクローンを選択することもできる。或いは、リポオ
リゴ糖が除去された外膜または可溶性外膜蛋白質の免疫
化投与量を増加することにより殺バクテリア性抗体を誘
発することもできる。
製剤が機能的抗体（すなわち、髄膜炎菌細胞の補体−介
在性破壊を誘発可能な抗体）を誘発する能力を、血清の
殺バクテリア活性を測定することにより、試験する。殺
バクテリア活性に関する検定は実施例に記載されてい
る。表５は菌株２９９６（亜型ｐ１.５,２）または組み
換え体菌株Ｈ１３（亜型ｐ１.５,２およびｐ１.７,１
６）を使用して得られた結果を示している。２９９６の
リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質
は髄膜炎菌の同種菌株を死滅させることができるが異種
菌株であるＨ４４／７６は死滅させることができない抗
体を製造する。Ｈ４４／７６および２９９６の両者の綱
１亜型を発現するＨ１３から製造されるリポオリゴ糖が
除去された外膜製剤はＨ４４／７６全細胞に対する殺バ
クテリア性抗体を誘発するが２９９６全細胞に対するも
のは誘発しない。この２９９６に対する殺バクテリア活
性の欠如は、粗製外膜も機能性抗体を誘発しないため、
リポオリゴ糖の除去中の損失によるものではない。以上
で示されている如く、Ｈ１３から製造されるリポオリゴ
糖が除去された外膜生成物は２９９６細胞に対する抗体
を誘発する（表４）。これらの条件下での２９９６細胞
に対する殺バクテリア活性の欠如はＨ１３菌株中のｐ
１.５,２綱１蛋白質の弱い発現によるものかもしれな
い。これは、Ｈ１３菌株が天然ｐ１.７,１６綱１蛋白質
より相当少ないｐ１.５,２蛋白質を発現するというウエ
スタン・ブロットからの観察と一致する。この問題は、
天然綱１蛋白質のものと匹敵する水準において組み換え
体綱１蛋白質を発現する組み換え体菌株からリポオリゴ
糖が除去された外膜を製造することにより、克服でき
る。Ｈ１３コロニーをが含有するフィルターを抗ｐ１.
５,２抗体に関する反応性に関してスクリーニングする
ことにより、ｐ１.５,２のさらに強い発現を有するＨ１
３のクローンを選択することもできる。或いは、リポオ
リゴ糖が除去された外膜または可溶性外膜蛋白質の免疫
化投与量を増加することにより殺バクテリア性抗体を誘
発することもできる。
【００３３】
【発明の用途】上記の方法は髄膜炎菌および他のグラム
−陰性球菌に対するワクチンの製造用に有用である。従
って、これらの球菌により引き起こされる疾病（例えば
髄膜炎）に対する治療または予防方法が提供される。こ
れまでのワクチン製造方法は、最初に外膜蛋白質（ｏｍ
ｐ）を細胞壁から抽出しそして次にできるだけ多くリポ
オリゴ糖を除去するという方法に従っている。外膜蛋白
質の抽出前にリポオリゴ糖を除去するという点で、本方
法はこれまでの方法と異なる。その結果、外膜蛋白質か
らの免疫原性の意義ある損失を伴わずにリポオリゴ糖含
有量が非常に減じられる。
−陰性球菌に対するワクチンの製造用に有用である。従
って、これらの球菌により引き起こされる疾病（例えば
髄膜炎）に対する治療または予防方法が提供される。こ
れまでのワクチン製造方法は、最初に外膜蛋白質（ｏｍ
ｐ）を細胞壁から抽出しそして次にできるだけ多くリポ
オリゴ糖を除去するという方法に従っている。外膜蛋白
質の抽出前にリポオリゴ糖を除去するという点で、本方
法はこれまでの方法と異なる。その結果、外膜蛋白質か
らの免疫原性の意義ある損失を伴わずにリポオリゴ糖含
有量が非常に減じられる。
【００３４】本方法はリポオリゴ糖を外膜蛋白質の可溶
化段階の前に０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少
なくまで除去することができる。可溶性外膜蛋白質製剤
は１μｇの蛋白質当たり約３.０ｎｇより少ないリポオ
リゴ糖を含有する。これはゾリンガー他によりそれらの
ワクチンに関して１９７８年に報告されたもの（ゾリン
ガー(Zollinger)、米国特許番号第４,７０７,５４３
号）より４０倍少ない内毒素でありそしてキューバおよ
びブラジルで最近試験されたもの（シエラ(Sierra)他、
１９９１）より１０倍少ない内毒素である。
化段階の前に０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少
なくまで除去することができる。可溶性外膜蛋白質製剤
は１μｇの蛋白質当たり約３.０ｎｇより少ないリポオ
リゴ糖を含有する。これはゾリンガー他によりそれらの
ワクチンに関して１９７８年に報告されたもの（ゾリン
ガー(Zollinger)、米国特許番号第４,７０７,５４３
号）より４０倍少ない内毒素でありそしてキューバおよ
びブラジルで最近試験されたもの（シエラ(Sierra)他、
１９９１）より１０倍少ない内毒素である。
【００３５】他の利点は、２種の型のリポオリゴ糖が除
去された製剤すなわち外膜複合体および可溶性外膜蛋白
質が製造され、それらの両者は免疫原性でありそしてリ
ポオリゴ糖含有量が低いことである。可溶性の抗原製剤
は佐薬の選択における比較的大きい柔軟性およびワクチ
ンの比較的容易な投与を可能にする。可溶性外膜蛋白質
の製剤は小胞構造の不存在下における機能的抗体応答を
誘発可能であることが注目される。全てのこれまでのワ
クチン試みは外膜複合体または小胞形を使用する（シエ
ラ他、１９９１）。さらに、これらのこれまでのワクチ
ンは低いが測定可能な水準のリポオリゴ糖を有する。実
際に、血清型Ｂ髄膜炎菌に対するこれまでのワクチンは
全蛋白質に関して１重量％のリポオリゴ糖を含有する。
去された製剤すなわち外膜複合体および可溶性外膜蛋白
質が製造され、それらの両者は免疫原性でありそしてリ
ポオリゴ糖含有量が低いことである。可溶性の抗原製剤
は佐薬の選択における比較的大きい柔軟性およびワクチ
ンの比較的容易な投与を可能にする。可溶性外膜蛋白質
の製剤は小胞構造の不存在下における機能的抗体応答を
誘発可能であることが注目される。全てのこれまでのワ
クチン試みは外膜複合体または小胞形を使用する（シエ
ラ他、１９９１）。さらに、これらのこれまでのワクチ
ンは低いが測定可能な水準のリポオリゴ糖を有する。実
際に、血清型Ｂ髄膜炎菌に対するこれまでのワクチンは
全蛋白質に関して１重量％のリポオリゴ糖を含有する。
【００３６】本方法は多価ワクチンの製造用に有用であ
る。例えば、一態様では、リポオリゴ糖が除去された外
膜または可溶性外膜蛋白質が髄膜炎菌の種々の血清群、
血清型および亜型の混合物を使用して製造される。他の
態様では、種々の綱１蛋白質亜型の如き菌株−特異的外
膜エピトープの混合物を発現する組み換え体菌株が比較
的広い保護値を有するワクチン用の出発物質として使用
される。多数の髄膜炎菌の綱１外膜蛋白質のクローニン
グ（バルロウ(Barlow)他、１９８７）および配列並びに
組み換え体バクテリア菌株の構造はこれまでに記載され
ている（セイド(Seid)他、ＷＯ９０／０６６９６）。
る。例えば、一態様では、リポオリゴ糖が除去された外
膜または可溶性外膜蛋白質が髄膜炎菌の種々の血清群、
血清型および亜型の混合物を使用して製造される。他の
態様では、種々の綱１蛋白質亜型の如き菌株−特異的外
膜エピトープの混合物を発現する組み換え体菌株が比較
的広い保護値を有するワクチン用の出発物質として使用
される。多数の髄膜炎菌の綱１外膜蛋白質のクローニン
グ（バルロウ(Barlow)他、１９８７）および配列並びに
組み換え体バクテリア菌株の構造はこれまでに記載され
ている（セイド(Seid)他、ＷＯ９０／０６６９６）。
【００３７】可溶性外膜蛋白質を含むリポオリゴ糖が除
去された外膜製剤は、例えば細胞壁または外膜蛋白質に
対する抗体を球菌被膜またはリポオリゴ糖に対する抗体
から区別するための、透析試薬としても有用である。さ
らに、免疫原性製剤は外膜蛋白質または細胞膜を認識す
るが被膜性の糖は認識しない抗体を増加させるためにも
有用である。
去された外膜製剤は、例えば細胞壁または外膜蛋白質に
対する抗体を球菌被膜またはリポオリゴ糖に対する抗体
から区別するための、透析試薬としても有用である。さ
らに、免疫原性製剤は外膜蛋白質または細胞膜を認識す
るが被膜性の糖は認識しない抗体を増加させるためにも
有用である。
【００３８】リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶
性外膜蛋白質を製造するためのこの方法は種々のグラム
−陰性球菌上で有効であると予測され、その理由はこれ
らのバクテリアが構造的に同様な外膜を有するからであ
る。例えば、リポオリゴ糖が除去された外膜生成物およ
びワクチンは、この方法により他のナイセリア、例えば
淋菌、並びに他のグラム−陰性球菌、例えばモラクセラ
および特にＭ.カタルハリス(M. catarrhatis)、から製
造できる。
性外膜蛋白質を製造するためのこの方法は種々のグラム
−陰性球菌上で有効であると予測され、その理由はこれ
らのバクテリアが構造的に同様な外膜を有するからであ
る。例えば、リポオリゴ糖が除去された外膜生成物およ
びワクチンは、この方法により他のナイセリア、例えば
淋菌、並びに他のグラム−陰性球菌、例えばモラクセラ
および特にＭ.カタルハリス(M. catarrhatis)、から製
造できる。
【００３９】下記の実施例は本発明を特に説明するもの
である。
である。
【００４０】
【実施例】髄膜炎菌菌株 髄膜炎菌Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：ｐｌ.７,１６）、２
９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）、およびＨ１３（Ｂ：
−：ｐ１.７,１６；ｐ１.５,２）細胞はオランダのＪ.
Ｔ.プールマン(Poolman)の好意により提供された。Ｈ４
４／７６は１９８９年１２月１１日にオランダ、バーン
のセントラル・ビューロー・ヴール・シンメルカルツレ
ン(Centraal Bureau Voor Schimmelculturen(CBS))にブ
ダペスト・トリーティー(Budapest Treaty)として預託
されており、そしてＣＢＳ Ｇ３５−８９と照合され
る。２９９６およびＨ１３はオランダのＲＩＶＭから入
手可能である。菌株の型分類はフラッシュ(Frasch)によ
り提案されている方式に基づいている（１９８３）。
９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）、およびＨ１３（Ｂ：
−：ｐ１.７,１６；ｐ１.５,２）細胞はオランダのＪ.
Ｔ.プールマン(Poolman)の好意により提供された。Ｈ４
４／７６は１９８９年１２月１１日にオランダ、バーン
のセントラル・ビューロー・ヴール・シンメルカルツレ
ン(Centraal Bureau Voor Schimmelculturen(CBS))にブ
ダペスト・トリーティー(Budapest Treaty)として預託
されており、そしてＣＢＳ Ｇ３５−８９と照合され
る。２９９６およびＨ１３はオランダのＲＩＶＭから入
手可能である。菌株の型分類はフラッシュ(Frasch)によ
り提案されている方式に基づいている（１９８３）。
【００４１】髄膜炎菌菌株を、デキストロース（４ｇ／
Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラー
ゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／
Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州、デト
ロイトのディフコ・ラボラトリーズ）の凍結原料から成
長させた。板を５％ＣＯ2中で３５℃において６時間培
養した。６時間成長させた後に、１個の板からのコロニ
ーを使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グ
ルタミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ
（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸水素二水塩（１０ｇ
／Ｌ）、塩化カリウム（０.０９ｇ／Ｌ）、塩化アンモ
ニウム（１.２５ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム六水塩
（０.６ｇ／Ｌ）、デキストロース（５ｇ／Ｌ）、およ
び酢酸第二鉄（１００μＭ）からなる１００ｍＬの液体
培養媒体に接種した。この液体培養物を３７℃において
１８時間成長させた。１８時間培養物の部分試料を２０
−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおける０.１の
光学的密度に希釈し、そして培養物を成長させて後期指
数期とした。細胞が後期指数期に達したら、それらを熱
で死滅させ、分割し、凍結し、そして凍結乾燥した。
Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラー
ゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／
Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州、デト
ロイトのディフコ・ラボラトリーズ）の凍結原料から成
長させた。板を５％ＣＯ2中で３５℃において６時間培
養した。６時間成長させた後に、１個の板からのコロニ
ーを使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グ
ルタミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ
（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸水素二水塩（１０ｇ
／Ｌ）、塩化カリウム（０.０９ｇ／Ｌ）、塩化アンモ
ニウム（１.２５ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム六水塩
（０.６ｇ／Ｌ）、デキストロース（５ｇ／Ｌ）、およ
び酢酸第二鉄（１００μＭ）からなる１００ｍＬの液体
培養媒体に接種した。この液体培養物を３７℃において
１８時間成長させた。１８時間培養物の部分試料を２０
−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおける０.１の
光学的密度に希釈し、そして培養物を成長させて後期指
数期とした。細胞が後期指数期に達したら、それらを熱
で死滅させ、分割し、凍結し、そして凍結乾燥した。
【００４２】リポオリゴ糖が除去された髄膜炎菌外膜お
よび可溶性外膜蛋白質の製造 トリトンＸ−１００TM、ＢＲＩＪTM、エンピゲンＢＢTM
およびツイッタージェントTMはカリフォルニア州サンデ
ィエゴのカルビオケムから入手できる。ツイーン８０TM
はオハイオ州クイーブランドのＩＣＮヌートリショナル
・バイオケミカルズから入手できる。
よび可溶性外膜蛋白質の製造 トリトンＸ−１００TM、ＢＲＩＪTM、エンピゲンＢＢTM
およびツイッタージェントTMはカリフォルニア州サンデ
ィエゴのカルビオケムから入手できる。ツイーン８０TM
はオハイオ州クイーブランドのＩＣＮヌートリショナル
・バイオケミカルズから入手できる。
【００４３】１.５グラムの凍結乾燥された熱で死滅し
た細胞を、１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス(Hepes)−Ｎａ
ＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡの７５ミリリットルの低張性溶
液の中に懸濁させ、そしてＳＬＭ／アミンコ・フレンチ
・プレッシャー・セル(AMINCO French Pressure Cell)
の中に溶解させた。バクテリアを遠心分離（５分間、８
０００×ｇ、１０℃）によりペレット状にした。細胞溶
解物を０.５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、細胞質抽出物
を遠心分離（２００,０００×ｇ、１時間、１０℃）に
より除去した。内膜を可溶化しそして４００,０００×
ｇでの１０℃における１時間の遠心分離およびその後の
１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス−ＮａＯＨ、１ｍＭの塩
化マグネシウム中１％トリトンＸ−１００TMを用いる抽
出により除去した。この抽出は１回繰り返された。それ
らを次に同一緩衝液中の１％ツイッタージェンツ３−１
４TM（重量／容量）でそれぞれ１時間にわたり２回抽出
し、そして４００,０００×ｇで１０℃において１時間
遠心分離した。蛋白質−含有細胞壁を１％ツイッタージ
ェンツ３−１４TM（重量／容量）および０.５Ｍ塩化ナ
トリウムで室温において１時間抽出することにより外膜
蛋白質を可溶化し、そして８０％エタノール（容量／容
量）沈澱により濃縮した。濃縮された外膜蛋白質をｐＨ
８.０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、
１％ツイッタージェント３−１４TM、０.５ＭのＮａＣ
ｌの中で可溶化させた。
た細胞を、１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス(Hepes)−Ｎａ
ＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡの７５ミリリットルの低張性溶
液の中に懸濁させ、そしてＳＬＭ／アミンコ・フレンチ
・プレッシャー・セル(AMINCO French Pressure Cell)
の中に溶解させた。バクテリアを遠心分離（５分間、８
０００×ｇ、１０℃）によりペレット状にした。細胞溶
解物を０.５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、細胞質抽出物
を遠心分離（２００,０００×ｇ、１時間、１０℃）に
より除去した。内膜を可溶化しそして４００,０００×
ｇでの１０℃における１時間の遠心分離およびその後の
１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス−ＮａＯＨ、１ｍＭの塩
化マグネシウム中１％トリトンＸ−１００TMを用いる抽
出により除去した。この抽出は１回繰り返された。それ
らを次に同一緩衝液中の１％ツイッタージェンツ３−１
４TM（重量／容量）でそれぞれ１時間にわたり２回抽出
し、そして４００,０００×ｇで１０℃において１時間
遠心分離した。蛋白質−含有細胞壁を１％ツイッタージ
ェンツ３−１４TM（重量／容量）および０.５Ｍ塩化ナ
トリウムで室温において１時間抽出することにより外膜
蛋白質を可溶化し、そして８０％エタノール（容量／容
量）沈澱により濃縮した。濃縮された外膜蛋白質をｐＨ
８.０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、
１％ツイッタージェント３−１４TM、０.５ＭのＮａＣ
ｌの中で可溶化させた。
【００４４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット法 外膜小胞（ＯＭＶ）および可溶化された蛋白質の蛋白質
特徴およびリポオリゴ糖含有量を１５％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル中でラエンムリ(Laemmli)（１９７
０）の緩衝液システムを用いて分析した。使用された装
置はバイオラッド（カリフォルニア州リッチモンド）の
ミニ・プロテアンIIデュアル・スラブ・ゲル・システム
であった。試料をｐＨ７.０の０.１Ｍトリス−ＨＣｌ、
２５ｍＭのジチオスレイトール、２％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を含有する試料緩衝液の中で１００
℃に５分間加熱し、次に６％スクロースとなるようにに
調節した。ゲルを１５０Ｖにおいて４５−６０分間実験
し、そしてモリッセイ(Morrisey)の方法（１９８１）に
より銀染色するか、または蛋白質を記載されているよう
なイムノブロット法（トウビン(Towbin)他、１９７９；
ジョンソン(Johnson)他、１９８４）用のニトロセルロ
ースの上に移した。ブロットをBLOTTO（５％乾燥牛乳、
ｐＨ８.０の０.０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.１５Ｍの
ＮａＣｌ）の中で３７℃において１５分間遮断し、そし
てBLOTTO中で３７℃において１時間にわたり１：５００
希釈度の血清と共に培養した。綱１の外膜蛋白質（ＯＭ
Ｐ）であるｐ１.５,２およびｐ１.７,１６の存在をモノ
クローン抗体（Ｊ.Ｔ.プールマン(Poolman)を使用して
確認した。反応性蛋白質をホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼ（カリフォルニア州バーリンガムのＴＡＧＯ
インコーポレーテッド）と結合されている山羊の抗−ハ
ツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを用いて視覚化し、そし
て４−クロロ−１−ナフトールを基質として用いる現像
を行った。
特徴およびリポオリゴ糖含有量を１５％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル中でラエンムリ(Laemmli)（１９７
０）の緩衝液システムを用いて分析した。使用された装
置はバイオラッド（カリフォルニア州リッチモンド）の
ミニ・プロテアンIIデュアル・スラブ・ゲル・システム
であった。試料をｐＨ７.０の０.１Ｍトリス−ＨＣｌ、
２５ｍＭのジチオスレイトール、２％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を含有する試料緩衝液の中で１００
℃に５分間加熱し、次に６％スクロースとなるようにに
調節した。ゲルを１５０Ｖにおいて４５−６０分間実験
し、そしてモリッセイ(Morrisey)の方法（１９８１）に
より銀染色するか、または蛋白質を記載されているよう
なイムノブロット法（トウビン(Towbin)他、１９７９；
ジョンソン(Johnson)他、１９８４）用のニトロセルロ
ースの上に移した。ブロットをBLOTTO（５％乾燥牛乳、
ｐＨ８.０の０.０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.１５Ｍの
ＮａＣｌ）の中で３７℃において１５分間遮断し、そし
てBLOTTO中で３７℃において１時間にわたり１：５００
希釈度の血清と共に培養した。綱１の外膜蛋白質（ＯＭ
Ｐ）であるｐ１.５,２およびｐ１.７,１６の存在をモノ
クローン抗体（Ｊ.Ｔ.プールマン(Poolman)を使用して
確認した。反応性蛋白質をホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼ（カリフォルニア州バーリンガムのＴＡＧＯ
インコーポレーテッド）と結合されている山羊の抗−ハ
ツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを用いて視覚化し、そし
て４−クロロ−１−ナフトールを基質として用いる現像
を行った。
【００４５】蛋白質定量化 全蛋白質含有量をピエルス(Pierce's)（イリノイ州ロッ
クフォード）ＢＣＡプロテイン・アセイ・キットにより
牛血清アルブミンを標準として用いて測定した。
クフォード）ＢＣＡプロテイン・アセイ・キットにより
牛血清アルブミンを標準として用いて測定した。
【００４６】動物研究 生後８週間のスイス・ウエブスターハツカネズミの各群
を、２５μｇの３−Ｏ−デアシルモノホスホリル脂質Ａ
（マサチュセッツ州ハミリトンのリビ・イムノケム・リ
サーチ・インコーポレーテッド）が含まれている０.２
ｍｌ量の食塩水中の２５μｇの外膜、リポオリゴ糖が除
去された外膜またはリポオリゴ糖が除去された可溶性外
膜蛋白質を用いて皮下的に免疫感作させた。３回の予防
接種を０、４、および８週間投与した。ハツカネズミを
同じ間隔で出血させ、そして１０週間において放血させ
た。各群からの一緒にした血清をイムノブロットおよび
酵素−結合されたイムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）
により分析した。イムノブロット法は上記の如くして行
われそして血清をＨ４４／７６および２９９６細胞並び
に精製されたｐ１.７,１６外膜蛋白質からの外膜複合体
に対して１：５００希釈度で試験した。ＥＬＩＳＡ検定
は菌株Ｈ４４／７６もしくは２９９６または精製された
綱１外膜蛋白質の全細胞を利用した。バクテリアを５６
℃において１時間にわたり不活性化し、そして殺菌性燐
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：２７ｍＭのＫＣｌ、４３ｍＭ
のＮＡ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、５
ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１.４ＭのＮａＣｌ）中で
希釈した。９６−ウェルの平らな底の微量滴定板（ヌン
ク(Nunc)）に１００μｌの細胞をコーテイングし、そし
て乾燥培養器中で一夜３７℃において乾燥した。板をＰ
ＢＳ（洗浄緩衝液）中の０.０５％ツイーン２０TMで３
回洗浄し、その後に遮断用に１００μｌのＰＢＳ中０.
１％ゼラチンで培養した。板を洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。ＰＢＳ中０.１％ゼラチンおよび０.０５％ツイーン
２０TMを使用して対照血清および試験血清を希釈し、そ
して１００μｌのこれらの希釈物を板に加えそして室温
で９０分間培養した。板を再び３回洗浄し、１００μｌ
の１：１０００希釈度のアルカリ性ホスファターゼ（Ｔ
ＡＧＯ）と結合されている山羊の抗−ハツカネズミＩｇ
ＧおよびＩｇＭを加え、そして混合物を室温で１時間培
養した。板を３回洗浄し、その後１００μｌの基質であ
る燐酸ニトロフェニル（シグマ）と共に１.０ｍｇ／ｍ
ｌにおいて１Ｍのジエタノールアミン／０.５ｍＭの塩
化マグネシウムの中で１時間培養し、そして４２０ｎｍ
における吸収を読み取った。
を、２５μｇの３−Ｏ−デアシルモノホスホリル脂質Ａ
（マサチュセッツ州ハミリトンのリビ・イムノケム・リ
サーチ・インコーポレーテッド）が含まれている０.２
ｍｌ量の食塩水中の２５μｇの外膜、リポオリゴ糖が除
去された外膜またはリポオリゴ糖が除去された可溶性外
膜蛋白質を用いて皮下的に免疫感作させた。３回の予防
接種を０、４、および８週間投与した。ハツカネズミを
同じ間隔で出血させ、そして１０週間において放血させ
た。各群からの一緒にした血清をイムノブロットおよび
酵素−結合されたイムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）
により分析した。イムノブロット法は上記の如くして行
われそして血清をＨ４４／７６および２９９６細胞並び
に精製されたｐ１.７,１６外膜蛋白質からの外膜複合体
に対して１：５００希釈度で試験した。ＥＬＩＳＡ検定
は菌株Ｈ４４／７６もしくは２９９６または精製された
綱１外膜蛋白質の全細胞を利用した。バクテリアを５６
℃において１時間にわたり不活性化し、そして殺菌性燐
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：２７ｍＭのＫＣｌ、４３ｍＭ
のＮＡ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、５
ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１.４ＭのＮａＣｌ）中で
希釈した。９６−ウェルの平らな底の微量滴定板（ヌン
ク(Nunc)）に１００μｌの細胞をコーテイングし、そし
て乾燥培養器中で一夜３７℃において乾燥した。板をＰ
ＢＳ（洗浄緩衝液）中の０.０５％ツイーン２０TMで３
回洗浄し、その後に遮断用に１００μｌのＰＢＳ中０.
１％ゼラチンで培養した。板を洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。ＰＢＳ中０.１％ゼラチンおよび０.０５％ツイーン
２０TMを使用して対照血清および試験血清を希釈し、そ
して１００μｌのこれらの希釈物を板に加えそして室温
で９０分間培養した。板を再び３回洗浄し、１００μｌ
の１：１０００希釈度のアルカリ性ホスファターゼ（Ｔ
ＡＧＯ）と結合されている山羊の抗−ハツカネズミＩｇ
ＧおよびＩｇＭを加え、そして混合物を室温で１時間培
養した。板を３回洗浄し、その後１００μｌの基質であ
る燐酸ニトロフェニル（シグマ）と共に１.０ｍｇ／ｍ
ｌにおいて１Ｍのジエタノールアミン／０.５ｍＭの塩
化マグネシウムの中で１時間培養し、そして４２０ｎｍ
における吸収を読み取った。
【００４７】綱１外膜蛋白質ｐ１.７,１６に対する抗体
を検出するためのＥＬＩＳＡ法も行われた。９６−ウェ
ルの平らな底の微量滴定板をｐＨ９.６の１４ｍＭの炭
酸ナトリウム／３６ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０.０
２％ナトリウムアジド緩衝液中の１００μｌの精製され
たｐ１.７,１６で５μｇ／ｍｌで３７℃において９０分
間にわたりコーテイングした。板をＰＢＳ／０.１％ツ
イーン２０TM（洗浄緩衝液）で６回洗浄した。ネズミ血
清をＰＢＳ／０.０５％ツイーン２０TM中で順次希釈
し、１００μｌをそれぞれの洗浄された板に加え、そし
てそれぞれの板を３７℃において１時間培養した。板を
再び洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの１：２０
００希釈度のアルカリ性ホスファターゼと結合されてい
る山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを加え、
そして混合物を３７℃において１時間培養した。板を前
記の如く洗浄し、１００μｌの燐酸ニトロフェニルのジ
エタノールアミン中１ｍｇ／ｍｌ溶液を加え、そして板
をそのまま室温で１時間培養した。反応を５０μｌの３
Ｎ水酸化ナトリウムを用いて停止し、そして４０５ｎｍ
における吸収を読み取った。
を検出するためのＥＬＩＳＡ法も行われた。９６−ウェ
ルの平らな底の微量滴定板をｐＨ９.６の１４ｍＭの炭
酸ナトリウム／３６ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０.０
２％ナトリウムアジド緩衝液中の１００μｌの精製され
たｐ１.７,１６で５μｇ／ｍｌで３７℃において９０分
間にわたりコーテイングした。板をＰＢＳ／０.１％ツ
イーン２０TM（洗浄緩衝液）で６回洗浄した。ネズミ血
清をＰＢＳ／０.０５％ツイーン２０TM中で順次希釈
し、１００μｌをそれぞれの洗浄された板に加え、そし
てそれぞれの板を３７℃において１時間培養した。板を
再び洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの１：２０
００希釈度のアルカリ性ホスファターゼと結合されてい
る山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを加え、
そして混合物を３７℃において１時間培養した。板を前
記の如く洗浄し、１００μｌの燐酸ニトロフェニルのジ
エタノールアミン中１ｍｇ／ｍｌ溶液を加え、そして板
をそのまま室温で１時間培養した。反応を５０μｌの３
Ｎ水酸化ナトリウムを用いて停止し、そして４０５ｎｍ
における吸収を読み取った。
【００４８】殺バクテリア性検定 検定工程はホイビー(Hφiby)他（１９９１）から変更さ
れていた。髄膜炎菌菌株をデキストロース（４ｇ／
Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラー
ゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／
Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州デトロ
イトのディフコ・ラボラトリース）の凍結原料から成長
させた。板を５％ＣＯ2中で３５℃において６時間培養
した。６時間成長させた後に、１枚の板からのコロニー
を使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グル
タミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−スステイン−ＨＣｌ
（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸ナトリウム二水塩
（１０ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（９.０９ｇ／Ｌ）、お
よび塩化アンモニウム（１.２５ｇ／Ｌ）からなる１０
０ｍＬの液体培養媒体を接種した。この液体培養物を３
７℃において１８時間成長させた。１８時間培養の部分
試料を２０−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおけ
る０.１の光学的密度に希釈し、そして培養物を成長さ
せて後期指数期とした。細胞が後期指数期に達した時
に、それらを殺バクテリア性検定で使用した。
れていた。髄膜炎菌菌株をデキストロース（４ｇ／
Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラー
ゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／
Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州デトロ
イトのディフコ・ラボラトリース）の凍結原料から成長
させた。板を５％ＣＯ2中で３５℃において６時間培養
した。６時間成長させた後に、１枚の板からのコロニー
を使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グル
タミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−スステイン−ＨＣｌ
（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸ナトリウム二水塩
（１０ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（９.０９ｇ／Ｌ）、お
よび塩化アンモニウム（１.２５ｇ／Ｌ）からなる１０
０ｍＬの液体培養媒体を接種した。この液体培養物を３
７℃において１８時間成長させた。１８時間培養の部分
試料を２０−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおけ
る０.１の光学的密度に希釈し、そして培養物を成長さ
せて後期指数期とした。細胞が後期指数期に達した時
に、それらを殺バクテリア性検定で使用した。
【００４９】殺バクテリア性検定は、１０μＬの髄膜炎
菌細胞（約２−４,０００個のバクテリア）、１０μＬ
の補体（２０％正常人間血清）、０.０１５ｍＭのＣａ
Ｃｌ2および０.５ｍＭのＭｇＣｌ2（ＰＣＭ）を含む２
５μＬのＰＢＳ、並びに５μＬの希釈された血清（希釈
剤としてＰＣＭ）を混合することにより、殺バクテリア
性検定を行った。補体源をそれ自身の殺バクテリア活性
の欠如に関して予備試験した。混合物を３６℃において
４５分間培養し、その時点で２００μＬのＰＣＭで希釈
し、そして５０μＬをＧＣ寒天板の上に一度に延ばし
た。培養板を２４時間にわたり３５−３６℃において５
％ＣＯ2と共に培養した。コロニーを次に計数しそして
殺バクテリア活性を％対照（血清が加えられていない）
として表示した。滴定量は、％死滅対希釈度のプロット
から外挿されて、検定中でバクテリアの５０％が死滅し
た希釈度の逆数として表示されている。全ての血清を１
０週間において通常試験をした。試験した血清の最高濃
度は１／５０であり、１／５０において死滅させない血
清は＜５０の滴定量を有すると報告された。全２９９６
細胞に対して製造された正の対照用抗血清はこれらの条
件下で菌株２９９６を死滅させるための補体源を使用す
ることができる。
菌細胞（約２−４,０００個のバクテリア）、１０μＬ
の補体（２０％正常人間血清）、０.０１５ｍＭのＣａ
Ｃｌ2および０.５ｍＭのＭｇＣｌ2（ＰＣＭ）を含む２
５μＬのＰＢＳ、並びに５μＬの希釈された血清（希釈
剤としてＰＣＭ）を混合することにより、殺バクテリア
性検定を行った。補体源をそれ自身の殺バクテリア活性
の欠如に関して予備試験した。混合物を３６℃において
４５分間培養し、その時点で２００μＬのＰＣＭで希釈
し、そして５０μＬをＧＣ寒天板の上に一度に延ばし
た。培養板を２４時間にわたり３５−３６℃において５
％ＣＯ2と共に培養した。コロニーを次に計数しそして
殺バクテリア活性を％対照（血清が加えられていない）
として表示した。滴定量は、％死滅対希釈度のプロット
から外挿されて、検定中でバクテリアの５０％が死滅し
た希釈度の逆数として表示されている。全ての血清を１
０週間において通常試験をした。試験した血清の最高濃
度は１／５０であり、１／５０において死滅させない血
清は＜５０の滴定量を有すると報告された。全２９９６
細胞に対して製造された正の対照用抗血清はこれらの条
件下で菌株２９９６を死滅させるための補体源を使用す
ることができる。
【００５０】 表１ 外膜製剤の内毒素および蛋白質含有量 製剤 内毒素(Ｅｕ) 蛋白質(Ｍｇ) 外膜 22,360 448 リポオリゴ糖が除去された外膜 8 175リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質 7 30 これらの製剤用の出発物質は１.５ｇ乾燥重量のＨ１３
細胞である。
細胞である。
【００５１】内毒素単位(Ｅｕ)は懸濁計検定により大腸
菌リポ多糖(ＬＰＳ)を標準として使用して測定され、こ
こで１Ｅｕ＝０.１ｎｇ大腸菌ＬＰＳである。
菌リポ多糖(ＬＰＳ)を標準として使用して測定され、こ
こで１Ｅｕ＝０.１ｎｇ大腸菌ＬＰＳである。
【００５２】 表２ 精製されたｐ１.７,１６に対する終点滴定量 最初の免疫化後の下記の週における終点滴定量 免疫原 ０ ４ ８ １０ 外膜 <100 6,287 63,946 142,416 ＯＭ−ＬＯＳ <100 2,234 70,835 129,159ＳＯＭＰ−ＬＯＳ <100 20,355 192,939 199,068 ＯＭ−ＬＯＳ、リポオリゴ糖が除去された外膜 ＳＯＭＰ−ＬＯＳ、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質 表３ Ｈ４４／７６全細胞に対する終点ＥＬＩＳＡ滴定量 最初の免疫化後の下記の週における終点滴定量 免疫原 ０ ４ ８ １０ 外膜 248 21,726 122,674 388,553 Zw3-12 OM-LOS 0 30,345 297,971 90,546 Zw3-14 OM-LOS 6070 10,877 298,854 346,163SOMP-LOS 0 30,728 270,977 320,328 Zw3−12 OM-LOS、Zw3−12を用いて製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜 Zw3−14 OM-LOS、Zw3−14を用いて製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜 SOMP-LOS、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質 表４ ２９９６全細胞に対する終点ＥＬＩＳＡ滴定量 最初の免疫化後の下記の週における終点滴定量 免疫原 ０ ４ ８ １０ 外膜 0 7,120 71,166 137,506 Zw3-12 OM-LOS 0 9,437 130,823 79,852 Zw3-14 OM-LOS 0 6,970 231,942 118,969SOMP-LOS 0 14,149 128,629 202,402 Zw3−12 OM-LOS、Zw3−12を用いて製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜 Zw3−14 OM-LOS、Zw3−14を用いて製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜 SOMP-LOS、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質 表５ リポオリゴ糖が除去された外膜製剤に対する抗血清の殺バクテリア活性 菌株の殺バクテリア滴定量免疫原 Ｈ４４／７６ ２９９６ 負の対照（０週間） <50 <50 Ｈ１３ 外膜 1,100 <50 Ｈ１３ ＯＭ＋部分的ＬＯＳ 800 <50 Ｈ１３ ＯＭ−ＬＯＳ 900 <50 Ｈ１３ ＳＯＭＰ−ＬＯＳ 1,000 <50 ２９９６ 外膜 <50 650 ２９９６ ＯＭ−ＬＯＳ <50 225２９９６ ＳＯＭＰ−ＬＯＳ <50 150 ＯＭ＋部分的ＬＯＳ、Ｚｗ３−１４で１回またはＺｗ３−１２で２回抽出された 外膜 ＯＭ−ＬＯＳ、リポオリゴ糖が除去された外膜 ＳＯＭＰ−ＬＯＳ、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質 滴定量は５０％死滅を与える希釈度の逆数である。
【００５３】試験した血清の最高濃度は１／５０であ
る。１／５０で死滅しない血清は＜５０の滴定量を有す
ると報告されている。
る。１／５０で死滅しない血清は＜５０の滴定量を有す
ると報告されている。
【００５４】文献目録 バルロウ(Barlow),Ａ.Ｋ.他（１９８７）、「大腸菌Ｋ
−１２中の髄膜炎菌綱１外膜蛋白質の分子クローニング
および発現(Molecular cloning and expressionof Neis
seria meningitidis Class 1 outer membrane protein
in Escherichiacoli K-12)」、インフェクション・アン
ド・イミュニティ(Infection and Immunity)、５５(１
１)：２７３４−２７４０。
−１２中の髄膜炎菌綱１外膜蛋白質の分子クローニング
および発現(Molecular cloning and expressionof Neis
seria meningitidis Class 1 outer membrane protein
in Escherichiacoli K-12)」、インフェクション・アン
ド・イミュニティ(Infection and Immunity)、５５(１
１)：２７３４−２７４０。
【００５５】フラッシュ(Frasch),Ｃ.Ｅ.（１９８３）、
「髄膜炎菌に対する免疫化(Immunization against Neiss
eria meningitidis)」、メディカル・マイクロバイオロ
ジー(Medical Microbiology)（Ｃ.Ｓ.Ｆ.イーストマン
(Eastman)およびＪ.ジェルジャスゼヴィツ(Jeljaszewic
z)編集）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、２
巻、１１５−１４４頁。
「髄膜炎菌に対する免疫化(Immunization against Neiss
eria meningitidis)」、メディカル・マイクロバイオロ
ジー(Medical Microbiology)（Ｃ.Ｓ.Ｆ.イーストマン
(Eastman)およびＪ.ジェルジャスゼヴィツ(Jeljaszewic
z)編集）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、２
巻、１１５−１４４頁。
【００５６】ゴールドシュナイダー(Goldschneider),
Ｉ.他（１９６９）、「髄膜炎菌に対する人間免疫(Huma
n immunity to the meningococcus)、II.自然免疫の発
育(Development of natural immunity)」、J. Exp. Me
d.、１２９：１３２７−１３４８。
Ｉ.他（１９６９）、「髄膜炎菌に対する人間免疫(Huma
n immunity to the meningococcus)、II.自然免疫の発
育(Development of natural immunity)」、J. Exp. Me
d.、１２９：１３２７−１３４８。
【００５７】ハンキンズ(Hankins),Ｗ.Ａ.他（１９８
２）、「髄膜炎菌多糖ワクチン群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１
３５の臨床的および血清学的評価(Clinical and serolo
gical evaluation of a meningococcal polysaccharide
vaccine groups A, C, Y and W135)」、Proc. Soc. Ex
p. Biol. Med.、１６９：５４−５７。
２）、「髄膜炎菌多糖ワクチン群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１
３５の臨床的および血清学的評価(Clinical and serolo
gical evaluation of a meningococcal polysaccharide
vaccine groups A, C, Y and W135)」、Proc. Soc. Ex
p. Biol. Med.、１６９：５４−５７。
【００５８】ホイビー(Hφiby),Ｅ.Ａ.他（１９９
１）、NIPH Annals、１４(２)：１４７−１５５。
１）、NIPH Annals、１４(２)：１４７−１５５。
【００５９】ジョンソン(Johnson),Ｄ.Ａ.他（１９８
４）、Gene Anal. Technol.、１：３−８。
４）、Gene Anal. Technol.、１：３−８。
【００６０】ラエンムリ(Laemmli),Ｕ.Ｋ.（１９７
０）、ネーチャー(Nature)、２２７：６８０−６８５。
０）、ネーチャー(Nature)、２２７：６８０−６８５。
【００６１】モリッセイ(Morrissey),Ｊ.Ｈ.（１９８
１）、Anal. Biochem.、１１７：３０７−３１０。
１）、Anal. Biochem.、１１７：３０７−３１０。
【００６２】セイド(Seid),Ｒ.Ｃ.他、ＷＯ９０／０６
６９６、「髄膜炎菌綱１外膜蛋白質ワクチン(Meningocc
al Class 1 Outer-Membrane Protein Vaccine)」、１９
９０年６月２８日。
６９６、「髄膜炎菌綱１外膜蛋白質ワクチン(Meningocc
al Class 1 Outer-Membrane Protein Vaccine)」、１９
９０年６月２８日。
【００６３】シエラ(Sierra),Ｇ.Ｖ.Ｇ.他（１９９
１）、「群Ｂ髄膜炎菌に対するワクチン：キューバにお
ける保護試験および大量ワクチン処置結果(Vaccine aga
inst groupB Neisseria meningitidis: protection tra
ial and mass vaccination results in Cuba)」、NIPH
Annals、１４(２)：１９５−２１０。
１）、「群Ｂ髄膜炎菌に対するワクチン：キューバにお
ける保護試験および大量ワクチン処置結果(Vaccine aga
inst groupB Neisseria meningitidis: protection tra
ial and mass vaccination results in Cuba)」、NIPH
Annals、１４(２)：１９５−２１０。
【００６４】トウビン(Towbin),Ｈ.他（１９７９）、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA、７６：４３５０−４３５
５。
oc. Natl. Acad. Sci. USA、７６：４３５０−４３５
５。
【００６５】ツサイ(Tsai),Ｃ.Ｍ.他（１９８１）、
「髄膜炎菌中の主要な外膜蛋白質の５種の構造的綱(Fiv
e Structural classes of major outer membrane prote
ins in Neisseria meningitidis)」、J. Bacteriol.、
１４６：６９−７８。
「髄膜炎菌中の主要な外膜蛋白質の５種の構造的綱(Fiv
e Structural classes of major outer membrane prote
ins in Neisseria meningitidis)」、J. Bacteriol.、
１４６：６９−７８。
【００６６】ゾリンガー(Zollinger),Ｗ.Ｄ.（１９９
０）、「髄膜炎菌疾病に対する新規および改良ワクチン
(New and improved vaccines against meningococcal d
isease)」。新世代ワクチン(New Generation Vaccines)
（Ｇ.Ｃ.ウッドロウ(Woodrow)およびＭ.Ｍ.リヴィン(Le
vine)編集）中、マルセル・デッカー・インコーポレー
テッド、ニューヨーク、３２５−３４８頁。
０）、「髄膜炎菌疾病に対する新規および改良ワクチン
(New and improved vaccines against meningococcal d
isease)」。新世代ワクチン(New Generation Vaccines)
（Ｇ.Ｃ.ウッドロウ(Woodrow)およびＭ.Ｍ.リヴィン(Le
vine)編集）中、マルセル・デッカー・インコーポレー
テッド、ニューヨーク、３２５−３４８頁。
【００６７】ゾリンガー(Zollinger),Ｗ.Ｄ.他、米国特
許番号第４,７０７,５４３号、「無毒化された多糖−外
膜蛋白質複合体の製造方法、および抗バクテリアワクチ
ンとしてのそれらの使用(Process for the Preparation
of Detoxified Polysaccharide-Outer Membrane Prote
in Complexes, and Their Use As Antibacterial Vacci
nes)」、１９８７年１１月１７日。
許番号第４,７０７,５４３号、「無毒化された多糖−外
膜蛋白質複合体の製造方法、および抗バクテリアワクチ
ンとしてのそれらの使用(Process for the Preparation
of Detoxified Polysaccharide-Outer Membrane Prote
in Complexes, and Their Use As Antibacterial Vacci
nes)」、１９８７年１１月１７日。
【００６８】同等物 当技術の専門家はここに特に記載されている本発明の特
定態様の多くの同等物をわかったりまたは単に日常的実
験を用いて確認したりするであろう。そのような同等物
も請求の範囲に包括されることを意図する。
定態様の多くの同等物をわかったりまたは単に日常的実
験を用いて確認したりするであろう。そのような同等物
も請求の範囲に包括されることを意図する。
【００６９】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。
おりである。
【００７０】１．グラム−陰性球菌の全膜からリポオリ
ゴ糖が除去された外膜を製造する方法であって、該方法
が ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出
して内膜が除去された外膜を製造し、そして ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系(zwi
tterionic)ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖
が除去された外膜を製造する ことを含んでなる方法。
ゴ糖が除去された外膜を製造する方法であって、該方法
が ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出
して内膜が除去された外膜を製造し、そして ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系(zwi
tterionic)ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖
が除去された外膜を製造する ことを含んでなる方法。
【００７１】２．球菌がナイセリアおよびモラクセラか
らなる群から選択される、上記１の方法。
らなる群から選択される、上記１の方法。
【００７２】３．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラクセ
ラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２の
方法。
ラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２の
方法。
【００７３】４．段階ａ）中のポリオキシエチレン界面
活性剤が ａ）トリトンＸ−１００TM、 ｂ）ＢＲＩＪ３５TM、および ｃ）ツイーン８０TM からなる群から選択される、上記１の方法。
活性剤が ａ）トリトンＸ−１００TM、 ｂ）ＢＲＩＪ３５TM、および ｃ）ツイーン８０TM からなる群から選択される、上記１の方法。
【００７４】５．両性イオン系ベタイン界面活性剤が
式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、Ｒ2はカ
ルボキシル基またはスルホニル基であり、そしてｎは１
より大きい］を有する、上記１の方法。
式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、Ｒ2はカ
ルボキシル基またはスルホニル基であり、そしてｎは１
より大きい］を有する、上記１の方法。
【００７５】６．両性イオン系ベタイン界面活性剤が ａ）ツイッタージェント３−１２TM、 ｂ）ツイッタージェント３−１４TM、および ｃ）エンピゲンＢＢTM からなる群から選択される、上記５の方法。
【００７６】７．段階ａ）が段階ｂ）に進む前に１回よ
り多く行われる、上記１の方法。
り多く行われる、上記１の方法。
【００７７】８．段階ｂ）が１回より多く行われる、上
記１の方法。
記１の方法。
【００７８】９．段階ｂ）により製造された外膜を塩緩
衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して
可溶性外膜蛋白質を含有する留分並びに不溶性外膜蛋白
質および細胞壁成分を含有する留分を製造することをさ
らに含んでなる、上記１の方法。
衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して
可溶性外膜蛋白質を含有する留分並びに不溶性外膜蛋白
質および細胞壁成分を含有する留分を製造することをさ
らに含んでなる、上記１の方法。
【００７９】１０．両性イオン系ベタイン界面活性剤が
ツイッタージェント３−１４TMであり、そして塩緩衝液
が約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌであり、そしてさらに
可溶性外膜蛋白質を濃縮することを含んでなる、上記９
の方法。
ツイッタージェント３−１４TMであり、そして塩緩衝液
が約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌであり、そしてさらに
可溶性外膜蛋白質を濃縮することを含んでなる、上記９
の方法。
【００８０】１１．上記１、上記４、上記６、上記９お
よび上記１０の方法により製造される、単離されたリポ
オリゴ糖が除去された外膜。
よび上記１０の方法により製造される、単離されたリポ
オリゴ糖が除去された外膜。
【００８１】１２．上記９の方法により製造される、リ
ポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁
成分。
ポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁
成分。
【００８２】１３．上記１０の方法により製造される、
濃縮されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白
質。
濃縮されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白
質。
【００８３】１４．グラム−陰性球菌に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発可能な組成物を製造する方法であっ
て、該方法が ａ）グラム−陰性球菌の全膜を得、 ｂ）該全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して
内膜が除去された外膜を製造し、そして ｃ）段階ｂ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造し、そして生理学的に許容可能な賦形薬と組み
合わせ、それによりグラム−陰性球菌に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発可能な組成物を製造する ことを含んでなる方法。
リア性抗体を誘発可能な組成物を製造する方法であっ
て、該方法が ａ）グラム−陰性球菌の全膜を得、 ｂ）該全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して
内膜が除去された外膜を製造し、そして ｃ）段階ｂ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造し、そして生理学的に許容可能な賦形薬と組み
合わせ、それによりグラム−陰性球菌に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発可能な組成物を製造する ことを含んでなる方法。
【００８４】１５．球菌がナイセリアおよびモラクセラ
からなる群から選択される、上記１４の方法。
からなる群から選択される、上記１４の方法。
【００８５】１６．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラク
セラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記１
５の方法。
セラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記１
５の方法。
【００８６】１７．髄膜炎菌が血清群Ｂに属する、上記
１６の方法。
１６の方法。
【００８７】１８．１種より多いグラム−陰性球菌の菌
株を段階ａ）で使用し、該菌株がバクテリアの１種より
多い血清群(serogroup)、血清型(serotype)または亜型
(subtype)に属する、上記１４の方法。
株を段階ａ）で使用し、該菌株がバクテリアの１種より
多い血清群(serogroup)、血清型(serotype)または亜型
(subtype)に属する、上記１４の方法。
【００８８】１９．グラム−陰性球菌が組み換え体であ
りそして組み換え体球菌が綱１(class１)外膜蛋白質の
１種より多い亜型を発現する、上記１４の方法。
りそして組み換え体球菌が綱１(class１)外膜蛋白質の
１種より多い亜型を発現する、上記１４の方法。
【００８９】２０．段階ｂ）中のポリオキシエチレン界
面活性剤が ａ）トリトンＸ−１００TM、 ｂ）ＢＲＩＪ３５TM、および ｃ）ツイーン８０TM からなる群から選択され、ここで両性イオン系ベタイン
界面活性剤が式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、そしてＲ
2はカルボキシル基またはスルホニル基であり、そして
ｎは１より大きい］を有する、上記１４の方法。
面活性剤が ａ）トリトンＸ−１００TM、 ｂ）ＢＲＩＪ３５TM、および ｃ）ツイーン８０TM からなる群から選択され、ここで両性イオン系ベタイン
界面活性剤が式： ［式中、Ｒ1は炭素数が１０より大きく且つ１６より小
さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、そしてＲ
2はカルボキシル基またはスルホニル基であり、そして
ｎは１より大きい］を有する、上記１４の方法。
【００９０】２１．両性イオン系ベタイン界面活性剤が ａ）ツイッタージェント３−１２TM、 ｂ）ツイッタージェント３−１４TM、および ｃ）エンピゲンＢＢTM からなる群から選択される、上記２０の方法。
【００９１】２２．ｄ）段階ｃ）により製造された外膜
蛋白質を塩緩衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性
剤で抽出して可溶性外膜蛋白質を得ることをさらに含ん
でなり、ここで両性イオン系ベタイン界面活性剤がツイ
ッタージェント３−１４TMでありそして塩緩衝液が約
０.１−約０.５ＭのＮａＣｌである、上記１４の方法。
蛋白質を塩緩衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性
剤で抽出して可溶性外膜蛋白質を得ることをさらに含ん
でなり、ここで両性イオン系ベタイン界面活性剤がツイ
ッタージェント３−１４TMでありそして塩緩衝液が約
０.１−約０.５ＭのＮａＣｌである、上記１４の方法。
【００９２】２３．上記１４、上記１６、上記１７、上
記１８、上記１９、上記２０、上記２１および上記２２
の方法により製造される組成物を含んでなるワクチン。
記１８、上記１９、上記２０、上記２１および上記２２
の方法により製造される組成物を含んでなるワクチン。
【００９３】２４．上記２３のワクチンを投与すること
を含んでなる、グラム−陰性球菌により引き起こされる
疾病に対する予防または治療方法。
を含んでなる、グラム−陰性球菌により引き起こされる
疾病に対する予防または治療方法。
【００９４】２５．疾病が髄膜炎である、上記２４の方
法。
法。
【００９５】２６．上記１１の単離されたリポオリゴ糖
が除去された外膜を動物中でこの単離された外膜に対す
る抗体を誘発するのに適する環境下で動物に投与するこ
とを含んでなる、グラム−陰性球菌の外膜を認識しそし
て該有機体のリポオリゴ糖と交差反応しない抗体を製造
する方法。
が除去された外膜を動物中でこの単離された外膜に対す
る抗体を誘発するのに適する環境下で動物に投与するこ
とを含んでなる、グラム−陰性球菌の外膜を認識しそし
て該有機体のリポオリゴ糖と交差反応しない抗体を製造
する方法。
【００９６】２７．球菌がナイセリアおよびモラクセラ
からなる群から選択される、上記２６の方法。
からなる群から選択される、上記２６の方法。
【００９７】２８．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラク
セラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２
７の方法。
セラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２
７の方法。
【００９８】２９．上記２６の方法により製造される抗
体。
体。
【図１】髄膜炎菌からリポオリゴ糖が除去された可溶性
外膜蛋白質を製造する方法の工程図である。
外膜蛋白質を製造する方法の工程図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:36）
Claims (11)
- 【請求項１】 グラム−陰性球菌の全膜からリポオリゴ
糖が除去された外膜を製造する方法であって、該方法が ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出
して内膜が除去された外膜を製造し、そして ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造する ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 段階ｂ）により製造された外膜を塩緩衝
液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して可
溶性外膜蛋白質を含有する留分並びに不溶性外膜蛋白質
および細胞壁成分を含有する留分を製造することをさら
に含んでなる請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１および請求項２の方法により製
造される、単離されたリポオリゴ糖が除去された外膜。 - 【請求項４】 請求項２の方法により製造される、リポ
オリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁成
分。 - 【請求項５】 請求項２の方法により製造される、濃縮
されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質。 - 【請求項６】 グラム−陰性球菌に対する殺バクテリア
性抗体を誘発可能な組成物を製造する方法であって、該
方法が ａ）グラム−陰性球菌の全膜を得、 ｂ）該全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して
内膜が除去された外膜を製造し、そして ｃ）段階ｂ）により製造された外膜を両性イオン系ベタ
イン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外
膜を製造し、そして生理学的に許容可能な賦形薬と組み
合わせ、それによりグラム−陰性球菌に対する殺バクテ
リア性抗体を誘発可能な組成物を製造する ことを特徴とする方法。 - 【請求項７】 ｄ）段階ｃ）により製造された外膜蛋白
質を塩緩衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で
抽出して可溶性外膜蛋白質を得ることをさらに含んでな
り、ここで両性イオン系ベタイン界面活性剤がツイッタ
ージェント(ZWITTERGENT)３−１４TMでありそして塩緩
衝液が約０.１−約０.５ＭのＮａＣｌである請求項６に
記載の方法。 - 【請求項８】 請求項６および請求項７に記載の方法に
より製造される組成物を含んでなるワクチン。 - 【請求項９】 請求項８に記載のワクチンを投与するこ
とを特徴とする、グラム−陰性球菌により引き起こされ
る疾病に対する予防または治療方法。 - 【請求項１０】 請求項３に記載の単離されたリポオリ
ゴ糖が除去された外膜を動物中でこの単離された外膜に
対する抗体を誘発するのに適する環境下で動物に投与す
ることを特徴とする、グラム−陰性球菌の外膜を認識し
そして該有機体のリポオリゴ糖と交差反応しない抗体を
製造する方法。 - 【請求項１１】 請求項１０の方法により製造される抗
体。
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