KR100355961B1

KR100355961B1 - 그람염색음성구균의전체막으로부터지방과당류-결핍된외부막제조방법

Info

Publication number: KR100355961B1
Application number: KR1019940010539A
Authority: KR
Inventors: 게리다불류즈롯니크
Original assignee: 아메리칸사이아나미드컴파니
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2002-12-26
Also published as: CA2123355C; DE69423383D1; EP0624376B1; DE69423383T2; EP0624376A1; ES2145072T3; CA2123355A1; ATE190502T1; JP3711289B2; US6355253B1; PT624376E; US6921537B2; GR3033469T3; US20020136741A1; DK0624376T3; JPH0819396A

Abstract

수막염균같은 그람염색음성 구균의 외부막으로부터 독성 지방과당류(LOS)를 제거하는 방법이 여기서 서술된다. 세균의 상동성 균주에 대한 살균 항체를 유발시킬 수 있는 LOS-결핍된 외부 막 및 LOS-결핍된 가용성 외부 막 단백질이 제조될 수 있다. 백신 및 제제의 다른 사용이 또한 서술된다.

Description

그람염색음성 구균의 전체 막으로 부터 지방과당류-결핍된 외부막 제조 방법

본 발명은 특정 세정제로 연속 추출함으로써 그람염색음성 구균의 외부막으로 부터 지방과당류 (LOS)를 효과적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.

세균성 수막염은 연수막내 및 연수막에 인접한 세균의 성장에 의해 발생되는 중추신경계의 염증 질병이다. 그것은 소아 및 젊은 어른에 영향을 미치는 급성, 및 종종 치사의 전염병이다. 전 세계에 세균성 수막염의 가장 일반적인 원인중 하나는 수막염균(Neisseria meningitidis)으로의 감염이다. 많은 사람이 이상 상태를 보이지 않고 전이증식되기 때문에, 이 세균으로의 감염의 발생은 예측불가능하다. 몇몇 사람은 일시적 보균자인 한편, 다른 사람은 다소 연속적으로 또는 산재적 유형으로 수막염균을 배출하는 만성 보균자이다. 감염의 경로중에, 연속 감염에 대해 사람을 명백하게 면역시키는 살균항체는 감염된 사람내에서 생성된다 (Goldschneider 일행, 1969). 이 관찰은 세균성 항원을 기재로 한 백신이 수막염에 대해 효과적일 수 있다는 기대로 이끌었다.

수막염균은 그람염색음성구균이다. 특징적으로, 그것은 내부 플라즈마 막, 페리플라즈믹 공간 및 외부막 또는 세포벽으로 구성된 세포 엔벨로프에 의해 둘러싸여 있다. 외부막은 지방 과당류 (LOS)분자, 지질, 단백질 및 다당류로 구성된다. 감염된 사람내에서 생성된 보호 항체는 피막 다당류 및 외부막 단백질 모두에 대하여 지적되는 것으로 알려졌다 (Frasch, 1983).

수막염균의 균주는 캡슐의 유형 (항원성으로 및 생화학적으로)에 따라 혈청 그룹 (serogroup)으로 분류되어 왔다. 현재 인정된 혈청그룹은 A, B, C, D W135, X, Y, Z 및 29E 를 포함한다. 그룹 A, B, C, X, W135 및 Y 의 혈청 그룹 특이성의 원인이 되는 다당류가 정제되었다. 혈청그룹 A, C, Y 및 W135 로 부터 정제된 캡슐형 다당류를 기재로한 4가 백신이 개발되었다 (Hankins 일행, 1982). 그러나, 수막염균 감염으로 부터 가장 위험스러운 나이 그룹인 2살 이하의 그룹에서 면역성의 결핍은 이 백신의 유용성을 제한했다. 그룹 B 수막염균의 캡슐은, 심지어 운반 단백질에 접속될때조차 모든 나이 그룹에서 불량하게 면역성이다. 이 캡슐에 대한 항체는 태아 및 신생아의 뇌 조직과 교차 반응할 수 있다.

수막염균의 주요 외부막 단백질 (omp)는 SDS-폴리아크릴아미드 겔상 이동 (Mr) 및 펩티드 지도 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 구조적 유사점을 기준으로 다섯 부류로 나뉘었다 (Tsai 일행, 1981). 이들 단백질 부류중, 부류 1 단백질은 백신 생성에 대해 가장 흥미로운 것으로 나타났다. 이 항원은 인간에 있어서 주요면역결정인자인 것으로 보인다. 그것은 수막염균의 대부분의 단리물에서 발현되고, 균주의 하위유형 특이성에 대한 기준이다.

외부 막 단백질을 기재로한 백신을 생성하기위해 여러가지 시도가 이루어졌다. 캡슐형 다당류 및 외부막 단백질, 또는 폐포성 복합체내 외부막 단백질만으로 구성된 백신이 테스트되었다. 이들 백신중 단지 하나만이 57% 이상 효과적인 것으로 보고되었다 (Sierra 일행, 1991).

외부 막 및 캡슐 모두를 기재로 한 백신의 개발에 있어서 또 다른 유의한 문제점은 인간에 있어서 독성 부작용을 생성하는 세균성 지방과당류 (LOS)의 존재이다. LOS 는 또한 세균성 내독소로서 언급된다. 소량의 LOS 는 열을 발생시킬 수 있고, 고 투여량의 LOS 는 환자의 일반적 수척 (악액질 (cachexis ))을 초래할 수 있다. 가장 최근의 외부 막 복합체 백신은 10 - 70μg/mg 단백질의 잔여의 LOS 수준을 가졌다 (재검토를 위해 Zollinger, 1990을 보라). 이리하여, 수막염균에 의해 발생된 세균성 수막염, 및 특별히 그룹 B 균주에 의해 발생된 질병에 대해 안정되고 효과적인 백신에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 특정 세정제로 연속 추출함으로써 그람염색음성 구균의 외부 막으로 부터 지방과당류 (LOS)를 효과적으로 제거하는 방법에 관한 것이다. 또한 세균성 내독소로서 언급되는 LOS 는 백신내에서 열같은 바람직하지 못한 부작용을 일으킬 수 있다. 여기서 서술될때, 방법은 매우 낮은 함량의 LOS 를 가지나, 면역성을 보유하는 가용성 외부막 단백질 및 외부 막을 생성한다. 또한 이들 LOS - 결핍된 외부 막 생성물은 세균성 항체를 유발시키는 것으로 보여진다. 이리하여, 수막염균및 그람염색음성 구균에 의해 발생되는 다른 질병에 대한 치료 및 예방에 유용한 것으로 예상되는, LOS-결핍된 외부 막 및 가용성 외부막 단백질로 구성되는 백신이 제공된다.

수막염균의 외부 막 생성물이 여기서 특별히 서술된다. 본 방법에 의해 수막염균으로 부터 제조된 외부막 생성물은 약 0.01% (wt./wt. 총 단백질) 이하의 LOS 함량을 가지고, 동물에 있어서 살균 항체를 유발시키는 것으로 보여진다. 결과로서, 면역적으로 효과적이고 비교적 세균성 LOS 가 없는 수막염균에 대한 백신이 제공된다. 현재 효과적인 백신이 없는 수막염균의 혈청그룹 B 균주에 대한 백신이 특히 흥미롭다.

본 방법은 이들 세균이 구조적으로 유사한 외부막을 가지기 때문에 다른 그람염색음성 구균에 또한 적용가능한 것으로 기대된다. 예컨대, 임질같은 다른 나이세리아속, 및 모락셀라같은 다른 그람염색음성 구균의 LOS-결핍된 외부막이 제조될 수 있다. 이리하여, 수막염균은 하기 서술된 절차 및 생성물에서 다른 그람염색음성 구균의 대표이다.

이 방법은 또한 그람염색음색 구균의 여러가지 천연 균주 뿐만 아니라, 하나 이상의 하부유형-특이성 에피토프, 예컨대 수막염의 하나 이상의 부류 1 단백질을 생성하기 위해 유전학적으로 처리된 재조합 균주에 적용가능하다. 다가 백신은 여러가지 혈청그룹, 혈청유형 또는 하부유형의 표면 에피토프를 발현시키는 재조합 균주 또는 균주의 혼합물을 사용하여 제조될 수 있다.

방법은 다른 종류의 세정제로의 연속 추출을 포함한다. 먼저, 구균의 전체막을 폴리옥시에틸렌 세정제 (예컨대, TRITON X - 100^TM, BRIJ35^TM, 또는 TWEEN 80^TM)으로 추출하고, 이는 내부 막 및 약간의 LOS 가 결핍된 외부 막을 초래한다. 이후에, ZWITTERGENT^TM시리즈 (예컨대, 3-12 또는 3-14) 또는 EMPIGEN BB^TM중 하나 같은 쌍성이온 베타인 세정제로 외부 막을 추출한다. 이들 세정제는 특정적으로 매우 적은 단백질을 추출하면서 남아있는 LOS 모두를 본질적으로 제거한다.

결과된 LOS-결핍된 외부막 제제는 세포벽 성분으로 복합된 외부막 단백질 (omps)로 구성된다. 이 제제는 직접 백신 목적을 위해 사용될 수 있거나, 또는 omps 는 가용화되고, 약 0.1 - 약 0.5M NaCl 내, 예컨대 ZWITTERGENT 3-14^TM과 함께 염 완충액내 쌍성이온 베타인 세정제를 사용하여 다른 세포벽 성분으로 부터 추출될 수 있다. 가용화 단계는, 하나는 가용성 외부 막 단백질을 함유하고, 다른 하나는 다른 세포벽 성분과 복합된 불용성 외부 막 단백질을 함유하는 LOS-결핍된 분획들을 초래한다. LOS-결핍된 외부 막 및 LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질 모두는 생쥐에 있어서 살균 항체를 유발하는 것으로 보여진다.

수막염균에 의해 예증되는 바와 같이, 그람염색음성 구균의 외부 막 제제로 부터 독성 지방과당류 (LOS)를 제거하는데 효과적인 방법이 여기서 서술된다. 방법은 간단하고, 외부막 제제를 해독하는 선행 방법으로 성취된 것보다 더 적은 함량의 LOS 를 초래한다. 게다가, LOS 는 면역성의 유의한 손실없이 제거된다.

본 방법은 다른 유형의 세정제로의 연속 추출을 포함한다. 먼저, 구균의 전체 막을 폴리옥시에틸렌 세정제, 예컨대 TRITON X-100^TM, BRIJ35^TM또는 TWEEN 80^TM으로 추출했다. 이는 내부 막 및 약간의 LOS 를 제거한다. 그리고나서, 외부막을 쌍성이온 베타인 세정제, 예컨대 ZWITTERGENT^TM시리즈 (예컨대, 3-12 또는 3-14) 또는 EMPIGENBB^TM으로 추출시킨다. 이 단계는 본질적으로 모든 남아 있는 LOS 를 제거하고, 이는 LOS-결핍된, 단백질-풍부한 외부막 복합체 (LOS-결핍된 외부막으로 언급되는)를 초래한다. 사용된 특정 쌍성이온 세정제에 의존하여 흔적량의 LOS 가 남아있을 수 있으나; 이들 양은 적고, 인간에 있어서 독성 부작용을 유발하지 않는 것으로 예상된다.

바람직한 절차는 TRITON X-100^TM으로 여러번 추출하고나서, ZWITTERGENT 3-14^TM(Zw 3-14)로 여러번 추출하는 것이다. 예컨대, LOS-결핍된 외부막이 혈청그룹 B 균주, 예컨대 H44/76,2996 또는 H13 으로 부터 제조된다. 세균성 막을 TRITON X-100^TM으로 두번, 이어서 ZWITTERGENT 3-14^TM으로 적어도 두번 추출한다 (도면을 참조). 동결건조된 세균세포 1g 으로 부터 결과 얻어진 수율은 LOS-결핍되고, 단백질-풍부한 외부막 약 32 mg 이다. 이 생성물은 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 은 착색에 의해 검출가능한 남아있는 LOS를 함유하지 않는다.

이 방법의 LOS-결핍된 외부 막 생성물은 외부 막 단백질 및 세포벽 성분의 복합체이다. 항원 제제를 한층 더 정제하기 위해, 외부 막 단백질 (omps)는 바람직하게 염 완충액내 쌍성이온 베타인 세정제로 추출함으로써 LOS-결핍된 세포벽으로 부터 가용화된다.

약 0.1-약 0.5M 염화나트륨내 ZWITTERGENT 3-14^TM은 이 목적을 위해 바람직하다. 다른 쌍성이온 세정제 및 염 완충액, 예컨대 염화칼륨이 또한 사용될 수 있다. 가용화 단계는 LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질, 및 다른 세포벽 성분과 복합된 불용성 omps 를 함유하는 개별 분획을 얻는다. 동결건조된 세포 g 당 약 16 mg 가용화된 omps 의 수율은 0.5M 염화나트륨내 1.0% ZWITTERGENT 3-14^TM으로 LOS-결핍된 세포벽을 추출함으로써 얻어진다. 보다 많은 단백질이 이 추출 단계를 반복함으로써 얻어질 수 있다.

가용성 외부 막 단백질은 단백질 농축을 위한 여러가지 표준 방법, 예컨대 에탄올 침전, 여과 및 흡수에 의해 한층 더 농축된다. 가용성 omps 의 농도는 백신 또는 약제 조성물내 항원의 최종 농도를 조정하는 것을 허용한다.

도면은 LOS-결핍된 가용성 외부 막 단백질을 제조하고, 전체 수막염균 세포로 시작하고, 가용성 외부 막 단백질의 농축을 진행하는 방법의 한 실시양태를 설명한다. 표 1(발명의 상세한 설명의 말단에서)은 LOS-결핍된 외부막의 LOS 및 단백질 함량 및 출발 물질과 비교되는 가용성 omps 를 보인다.

사용된 세정제의 유형 및 그들이 사용되는 순서는 이 방법에서 중요하다. 예컨대, TRITON X-100^TM은 단백질을 조금 손실하면서 외부막으로 부터 LOS 의 대부분을 효능적으로 제거한다. 그러나, 잔여의 LOS 의 제거에 중요한 것은 ZWITTERGENT3-14^TM이다. 사용된 세정제의 순서는 단백질 또는 다른 세포벽 성분이 추출되거나 불용성인 채로 남아있는 지를 결정하는데 중요하다. 각 세정제는 연속적인 세정제로 가용화되는 것에 직접 영향을 끼친다. 예컨대, TRITON X-100^TM대신에 사르코실 ( sarcosyl )이 내부막을 추출하는데 사용된다면, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정되는 바와 같이, 결과로 얻어진 외부막의 단백질 프로필이 다르다. 부류 1 외부막 단백질의 양이 또한 감소된다.

상기 서술된 방법의 여러가지 최적화는 LOS 제거를 최대화하고 단백질 손실을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대, Zw 3-14 의 최적 농도 범위는 약 0.5% - 약 1.0% (중량/부피)이다. 0.5% 이하의 양은 내독소 양을 감소시키는데 효과적이지 않다. 각 추출 단계는 또한 한번 이상 수행될 수 있다. 그러나, 폴리옥시에틸렌 세정제로의 추출은 쌍성이온 세정제로의 추출에 선행되어야 한다. 많은 횟수의 추출은 보다 깨끗한 제조를 초래할 수 있으나, 또한 보다 낮은 수율을 초래할 수 있다. 세정제의 농도를 증가시킴으로써 보다 저온 추출로 같은 결과를 생성할 수 있다. 다른 폴리옥시에틸렌 세정제 및 쌍성이온 세정제의 배합물이 또한 각각 제 1 및 제 2 추출 단계에서 사용될 수 있다. 예컨대, TRITON^TM추출 후에, 외부 막은 Zw 3-12 로 두번 및 Zw 3-14 로 두번 추출될 수 있다.

전체 막은 세균 세포를 용해시키고 막 및 세포질 분획을 분리하기 위한 표준 방법에 의해 구균으로 부터 제조된다. 예컨대, 세균을 용해시키기 위한 프렌치 압력 셀, 파괴되지 않은 세포를 제거하기 위한 저속 원심분리 및 전체 막을 회수하기위한 초원심분리가 이용된다. 각 추출후에 바람직하지 못한 분획으로 부터 바람직한 분획의 분리는 또한 원심분리, 여과, 투석 및 흡수를 포함하는 여러가지 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

세정제 치환

여러가지 세정제 치환은 테스트된 외부 막의 면역성을 보유하면서 LOS 를 제거하는 데 있어서 그들의 효과 및 방법에서 사용될 수 있다.

BRIJ^TM, TRITON X-100^TM, 및 TWEEN 80^TM은 폴리옥시에틸렌 세정제이다. BRIJ35^TM및 TWEEN80^TM은 TRITON^TM과 매우 유사하게 수행한다. TRITON X-100^TM만큼 효과적으로 내독소 함량을 감소시키지 않으나, 그들은 ZWITTERGEN 3-14^TM에 의해 LOS 의 연속 제거에 영향을 미치지도 않는다. 결과 얻어진 LOS-결핍된 외부 막 생성물의 총 단백질 함량은 유사하다. 사르코실로의 TRITON X-100^TM의 치환은 낮은 내독소 함량 (1.8 ng/mg 훨씬 이하의 단백질)을 초래하나, 총 단백질에 의한 LOS-결핍된 외부막의 수율은 TRITON^TM으로 얻어진 것보다 훨씬 더 낮다.

쌍성이온 베타인 세정제는 하기 일반 구조식에 의해 요약된다:

이때, R₁은 10 이상 내지 16 이하의 탄소를 가진 알킬 쇄이고, R₂는 설포닐기 또는 카르복실기이고, n 은 1이상이고 바람직하게 2-3 이다. 예컨대, ZWITTERGENT^TM시리즈는 R₂= 설포닐기 ( -SO₃-), n=3, 및 R₁= 여러 길이의 알킬기를 가진다. ZWITTERGENT^TM들은 알킬쇄의 길이에 따라 명명된다. 예컨대 Zw3-12 는 12 탄소를 가진 알킬기를 가지고, Zw3-14 는 R₁에서 14 탄소를 가진다. EMPIGEN BB^TM은 R₂= 카르복실기 (-COO^-), R₁내 12 탄소, 및 n = 2 를 가진다.

ZWITTERGENTS^TM3-08, 3-10, 3-12 및 3-14 중, 3-14 가 과량의 단백질 추출없이 내독소를 제거하는데 가장 효과적이다. 보다 짧은 쇄 세정제 (3-08 및 3-10)는 LOS 제거에서 유의하게 덜 효과적이고, 또한 더 적은 단백질을 생성한다. 이들 결과는, R₁알킬기의 쇄 길이가 LOS 제거에서 세정제의 효과에 영향을 미친다는 것을 암시한다. Zw3-12 및 Zw3-14 의 알킬 쇄가 LOS 분자의 지방족 쇄와 거의 같은 길이이기때문에 그들이 효과적이라는 것이 가능하다. 그러나, 16 탄소 보다 더 긴 알킬기를 가진 세정제는 불용성이 될 수 있다.

EMPIGEN BB^TM은 실질적으로 Zw3-14 와 동일하게 기능한다. 그것은 내독소의 함량을 감소시키는데 효과적이고, 같은 단백질을 추출한다. 그것은 외부 막 생성물에서 증가된 총 단백질을 초래하면서, 보다 적은 단백질을 추출하는 것 처럼 보인다는 이점을 제공할 수 있다.

여기서 특별히 언급된 것들과 구조에 있어서 유사한 다른 세정제는 여기서서술되는 바와 같이 LOS-결핍된 외부 막 및 외부 막 단백질을 제조하는데 있어서의 효과에 대해 테스트될 수 있다. 상기 세정제는 제 1 추출 단계에서 폴리옥시에틸렌 세정제의, 또는 제 2 추출 단계에서 또는 가용화 단계에서 사용되는 쌍성이온 세정제의 관능 당량이 고려될 것이다.

외부막 생성물의 면역성

이 방법의 외부 막 생성물의 면역성을 테스트하기 위해, 외부막 (TRITON X-100^TM으로의 추출후의 생성물), 및 LOS-결핍된 외부막 (지시된 바와 같이 Zw3-14 또는 Zw3-12 로의 추출후의 생성물), 및 LOS-결핍된 가용성 omps (가용화 단계의 생성물)를 수막염균의 재조합 균주 (H13)으로 부터 제조한다. 균주 H13 (B:-:p1.7, 16: p1.5, 2) 는 야생형 균주 H44/76 (B:15:p1.7, 16)으로 부터 유도된 이중 돌연변이 세포 라인이다. H13 에는 부류 3 및 부류 5 외부막 단백질이 없고, 그의 천연 p1.7, 16 부류 1 단백질외에 p1.5, 2 부류 1 단백질을 발현시키기 위해 유전학적으로 처리 된다. 야생형 균주 2996 (B:2B:p1.5, 2)는 p1.5, 2 부류 1 단백질을 발현한다. 이리하여, H13 은 H44/76 및 2996 모두의 부류 1 하부유형을 가진다.

LOS-결핍된 외부막 제제는 그들을 생쥐내로 주사하여 결과 얻어진 혈청을 분석함으로써 면역성에 대해 테스트된다. 주요 면역 0, 4 및 8 주후, 및 사혈(瀉血) 10주에 혈청을 수집한다. 그리고나서, 혈청을 균주 H44/76 또는 2996 으로 부터 전체 세포와 반응하는 항체의 존재에 대해서 뿐만 아니라 정제는 p1.7, 16 부류 1 omp 를 인식하는 항체에 대해, 면역 블롯 ( immunoblot ) 분석 및 효소-결합된 면역 소르벤트 ( immunosorbent) 검정 (ELISA)에 의해 테스트한다.

표 2 는 정제된 p1.7, 16 에 대한 혈청의 끝점 ELISA 역가를 보인다. 이 표에서 보여지는 바와 같이, LOS-결핍된 가용성 omps (SOMP-LOS)는 정제된 p1.7, 16 에 대해 최고 항체 역가를 유발하는 한편, 외부막 및 LOS-결핍된 외부 막(OM-LOS)에 이해 유발된 혈청의 역가는 보다 낮거나 거의 같다. H44/76 및 2996 세포 및 정제된 p1.7, 16 모두로 부터의 외부 막에 대한 혈청으로의 웨스턴 (Western) 면역블롯 분석은, 혈청이 외부 막 단백질에 대해 항체만을 함유하고 LOS 에 대해 항체를 함유하지 않는다는 것을 지적한다.

표 3 및 4는 각각 H44/76 및 2996 전체 세포에 대해 혈청의 끝점 ELISA 역가를 보인다. Zw3-12 뿐만 아니라 Zw 3-14 를 사용하여 제조된 LOS-결핍된 외부 막으로 부터 혈청의 역가가 보여진다. 모두 세 항혈청의 ELISA 역가는 H44/76 총 세포에 대해 유사하다(표 3). 가용성 omps 에 의해 유발된 혈청 및 LOS-결핍된 외부 막에 의해 유발된 혈청은 사혈에서 플래토우 단계에 접근하는 것으로 보인다. 조 외부막에 의해 유발된 혈청내 항체의 양이 1차적으로 증가하는 것으로 나타난다. 2996 총 세포에 대한 ELISA 에서 (표 4), 조 외부 막에 의해 유발된 혈청의 역가 및 LOS-결핍된 외부 막에 의해 유발된 혈청의 역가는 거의 같고, 양쪽 모두는 LOS-결핍된 가용성 omps 에 의해 유발된 혈청의 역가보다 더 낮다. 이들 결과는, 이 방법의 LOS-결핍된 외부 막 및 가용성 omp 생성물이 면역성의 유의한 손실없이 내독소 함량에 있어서 매우 낮다는 것을 보인다. 게다가, 이들 결과는, 다른 혈청유형 및 하부유형 (H44/76 및 2996)을 가진 두 균주에 대한 항체는 양 균주의 부류 1 하부유형을 발현시키는 재조합 균주(H13)으로 부터 제조된 외부 막 생성물에 의해 유발된다는 것을 보인다.

살균 활성

기능 항체 (즉, 수막염균 세포의 보체-중재 파괴를 유발할 수 있는 항체)를 유발시키는 LOS-결핍된 외부막 및 가용성 omp 제제의 능력이 혈청의 살균 활성을 결정함으로써 테스트된다. 살균 활성에 대한 검정은 실시예에서 서술된다. 표 5 는 균주 2996 (하부유형 p1.5, 2) 또는 재조합 균주 H13 (하부유형 p1.5, 2 및 p1.7, 16)으로부터 제조된 외부막을 사용하여 얻어진 결과를 보인다. LOS-결핍된 외부 막 및 가용성 외부막 단백질 2996 은 수막염균의 상동성 균주, 그러나 이형 균주, H44/76 를 사멸할 수 있는 항체를 생성한다. H44/76 및 2996 모두의 부류 1 하부유형을 발현하는, H13 으로 부터 제조된 LOS-결핍된 외부막 제제는 H44/76 총 세포에 대한 살균 항체를 유발하나, 2996 총 세포에 대한 살균 항체는 유발하지 않는다. 그러나, 2996 에 대한 살균 활성의 이 부족은, 조 외부막이 또한 기능 항체를 유발하지 않기때문에 LOS 의 제거중 손실에 기인하지 않는다. 상기 보이는 바와 같이, H13 으로 부터 제조된 LOS-결핍된 외부막 생성물은 2996 세포에 대해 항체를 유발한다 (표 4). 이들 조건하에 2996 세포에 대한 살균 활성의 부족은 H13 균주내 p1.5, 2 부류 1 단백질의 약한 발현에 기인한다는 것이 가능하다. 이는, H13 균주가 고유 p1.7, 16 부류 1 단백질 보다 p1.5, 2 단백질을 유의하게 덜 발현시키는 웨스턴 블롯으로 부터의 관찰과 일치된다. 이 문제는 고유 부류 1 단백질의 수준과 비교할만한 수준에서 재조합 부류 1 단백질을 발현시키는 재조합 균주로 부터 LOS-결핍된 외부막을 제조함으로써 극복될 수 있다. p1.5, 2 의 보다 강한 발현을 가진 H13 의 클론은 또한 항-p1.5, 2 항체에 대한 반응성에 대해 H13 군체를 함유하는 여과기를 스크리닝함으로써 선택될 수 있다. 대안적으로, 살균 항체는 LOS-결핍된 외부막 또는 가용성 omps 의 면역투여량을 증가시킴으로써 유발될 수 있다.

발명의 유용성

상기 서술된 방법은 수막염균 및 다른 그람염색음성 구균에 대한 백신을 제조하는데 유용하다. 이들 구균에 의해 발생된 질병 (예컨대, 수막염)에 대한 치료 또는 예방 방법이 이렇게 제공된다. 백신 제조의 앞선 방법은 세포벽으로 부터 외부 막 단백질 (omp)를 먼저 추출하고나서, 가능한한 많은 LOS 를 제거하는 계획을 따른다. 본 방법은 그것이 외부막 단백질의 추출전에 LOS 를 제거한다는 점에서 앞선 방법과 다르다. 결과로서, LOS 함량은 외부 막 단백질로 부터 면역성의 유의한 손실없이 크게 감소된다.

본 방법은 omp 의 가용화전에 0.01% (wt./wt. 총 단백질)이하 만큼 적을때까지 LOS 를 제거할 수 있다. 가용성 omp 제제는 μg 단백질 당 약 3.0 ng 이하의 LOS 를 함유한다. 이는 1978 년에 Zollinger 일행에 의해 그들의 백신에 대해 보고된 (Zollinger, 미합중국 특허 제 4,707,543호)것보다 40배 적은 내독소 함량을 가지고, 쿠바 및 브라질에서 현재 테스트된 (Sierra 일행, 1991)것보다 100 배 적은 내독소 함량을 가진다.

부가의 이점은, 면역성이고 LOS 함량이 낮은 외부막 복합체 및 가용성 외부막 단백질인 두 유형의 LOS-결핍된 제제가 생성된다는 것이다. 가용성 항원 제제는백신의 보다 용이한 투여 및 보조약 선택에 있어서 보다 큰 융통성을 허용한다. 가용성 외부막 단백질의 제제는 수포성 구조물의 부재하에 기능 항체 반응을 유발시킬 수 있다는 것이 주목가능하다. 모든 앞선 백신 시험은 외부막 복합체 또는 수포 형태를 이용한다 (Sierra 일행, 1991). 게다가, 이들 앞선 백신은 낮지만 측정가능한 수준의 LOS 를 가진다. 사실, 혈청 그룹 B 수막염균에 대한 앞선 백신은 총 단백질에 비해 1 중량% LOS 를 함유한다.

본 방법은 다가 백신을 제조하는데 유용하다. 예컨대, 한 실시양태에서, LOS-결핍된 외부 막 또는 가용성 omps 는 수막염균의 여러가지 혈청그룹, 혈청유형, 및 하부유형의 균주 혼합물을 사용하여 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 여러가지 부류 1 단백질 하부유형같은 균주-특이성 외부 막 에피토프의 혼합물을 발현시키는 재조합 균주는 보다 넓은 보호값을 가진 백신을 위해 출발 물질로서 사용된다.

실시예

수막염균 균주

수막염균(Neisseria meningitidis) H44/76 (B:15:p1.7, 16), 299(B:2B:p1.5, 2), 및 H13((B:-:p1.7, 16; p1.5, 2) 세포는 네덜란드 J.T. Poolman에 의해 쉽게 공급받는다. H44/76은 부다페스트 조약의 협정하에 네덜란드 바안 Centraal Bureau Voor Schimmelculturen (CBS)에 1989. 12. 11에 기탁되었으며 CBS G35-89로 언급된다. 2996 및 H13은 네덜란드 RIVM으로부터 구입가능하다. 균주 형(型)은 Frasch에 의해 제안된 안을 기준으로 한다.

수막염 균주는 덱스트로스(4g/L), 글루타민(0.1g/L), 코카르복실라제(0.2mg/L), 및 질산 제이철(5mg/L)가 보충된 GC 한천 배지(미시간주 디트로이트시 Difco Laboratories)의 냉동 원료로부터 성장한다. 평판을 5% CO₂내에서 35℃에서 6시간동안 항온 처리한다. 6시간 성장 후, 한 평판으로부터의 집락을 사용하여, 0.2% 투석된 효모 추출물, L-글루탐산(1.3g/L), L-시스테인-HCl (0.02g/L), 나트륨 포스페이트 이수화물, 이염기(10g/L), 염화 칼륨(0.09g/L), 염화 암모늄(1.25g/L), 마그네슘 설페이트 철수화물(0.6g/L), 덱스트로스(5g/L), 및 질산 제이철(100μM)로 구성되는 액체 배양 배지 100mL를 접종시킨다. 이 액체 배양물을 37℃에서 18시간동안 성장시킨다. 18시간 배양물의 분취량을 20-30 Klett 단위로 또는 650nm에서 광학 밀도 0.1로 희석시키고 배양물을 레이트(late) 지수 상으로 성장시킨다. 일단 세포가 레이트 지수 상에 이르면, 이들을 가열 생성하고 침전시키고 냉동시키고 동결건조시킨다.

LOS - 결핍된 수막염균 외부막 및 가용성 외부막 단백질의 제조

TRITON X-100^TM, BRIJ^TM, EMPIGEN BB^TM및 ZWITTERGENTS^TM은 캘리포오니아주 산디에고시 Calbiochem으로부터 구입가능하다. TWEEN 80^TM은 오하이오주 클리블랜드시 ICN Nutritional Biochemicals로부터 구입가능하다.

동결 건조된 열살생된 세포 1.5g을 10mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 1mM EDTA의 저장 용액 75ml에 재현탁시키고 SLM/AMINCO French Pressure Cell에 용해시킨다. 세균을 원심 분리(5분, 8000×g, 10℃)에 의해 펠릿화한다. 세포 용해물을 0.5M 염화나트륨으로 세척하고 세포질 추출물을 원심 분리(20,000×g, 1시간, 10℃)에 의해 제거한다. 내부막은 용해시키고 10℃에서 1시간동안 400,000×g에서 원심분리시키고 Hepes-NaOH, pH 7.4, 1mM 염화 마그네슘내 1% TRITON X-100^TM으로 추출함으로써 제거한다. 이 추출을 1번 반복한다. 외부막은 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 5mM EDTA내 재현탁액에 의해 세척하고 원심분리(200,000×g, 1시간, 10℃)한다. 그리고나서, 이들을 각각 같은 완충액내 1%TWITTERGENT 3-14^TM(W/V)로써 1시간동안 2회 추출하고 10℃에서 1시간동안 400,000×g 에서 원심분리한다. 외부막 단백질은 단백질-함유 세포벽을 1% TWITTERGENT 3-14^TM(W/V) 및 0.5M 염화 나트륨으로써 추출하여 용해시키고 80% 에탄올(v/v) 침전화에 의해 농축시킨다. 농축된 외부막 단백질을 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 5mM EDTA, 1% TWITTERGENT 3-14^TM, 0.5M NaCl 내에 용해시킨다.

SDS - PAGE 및 면역 블롯팅

외부막 소포(OMW) 및 용해된 단백질의 단백질 프로파일 및 LOS 함량은 Laemmli의 완충 시스템(1970)을 갖는 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 내에서 분석한다. 사용된 장치는 BIO-RAD (캘리포오니아주 리치몬드시)외 Mini Protean II Dual Slab Gel 시스템이다. 샘플을 0.1M Tris-HCl, pH 7.0, 25mM 디티오트레이톨, 2% 나트륨 도데실 설페 이트(SDS)를 함유하고 그리고나서 6% 수크로스에 맞춰진 샘플 완충액내에서 100℃에서 5분간 가열한다. 겔을 150V에서 45-60분간 수행시키고Morriaey (1981)의 방법에 의해 착색된 은, 또는 단백질을 상기된 바와 같은 면역 블롯팅을 위해 니트로셀룰로스 상에 옮긴다(Towbin 일동, 1979: Johnson 일동, 1984), 블롯을 BLOTTO (5% 건조 우유, 0.05M Tris-HCl, pH 8.0, 0.15M, NaCl)내에서 37℃에서 15분간 블록킹하고, BLOTTO내 혈청의 1:500 희석액으로 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 종류 1외부막 단백질(OMPs) p1.5, 2 및 p1.7, 16의 존재는 모노클로날 항체(J.T. Poolman에 의해 공급됨)를 사용하여 확인한다. 반응성 단백질은 서양 매운 냉이 과산화 효소에 접합된 염소 항-생쥐 IgG 및 IgM (캘리포오니아주 버링검시 TAGO Inc.)으로써 가시화되고 4-클로로-1-나프톨을 지지체로서 사용하여 전개가 후속된다.

단백질 정량

총 단백질 함량은 소 혈청 알부민을 대조표준으로 사용하는 Pierce (일리노이주 로코포드시)의 BCA 단백질 검정 킷트에 의해 측정한다.

동물 연구

8주된 10마리 Swiss Webster 생쥐군 각각을 0.2ml 부피의 3-0-데아실 모노포스포릴지질 A (Ribi Immuno Chem Research Inc. Hamilton, MT) 25μg을 갖는 살린내 외부막, LOS- 결핍된 외부막 또는 LOS- 결핍된 용해가능 외부막 단백질 25μg으로써 피하로 면역화한다. 0, 4 및 8주에서 백신 주사를 시행한다. 생쥐를 같은 간격으로 출혈시키고 10주에서 피를 뽑는다. 각 군으로부터 울혈된 혈청을 면역블롯 및 효소-결합 면역 소르벤트 검정(ELISA)에 의해 분석한다. 면역 블롯팅을 상기와 같이 수행하고 혈청을 H44/76 및 2996 세포, 및 정제된 p1.7, 16 외부막 단백질로부터의 외부막 복합체에 대해 1:500 희석도로 시험한다. ELISA 검정은 균주 H44/76 또는 2996의 전체 세포 또는 정제된 종류 1 omp를 사용한다. 세균은 56℃에서 1시간동안 불활성화되고 멸균 인산염 완충 살린(PBS: 27mM KCl, 43mM NA₂HPO₄·7H₂O, 15mM KH₂PO₄, 5mM MgCl₂6H₂O 1.4M NaCl)내에서 OD₈₂₀0.01-01로 희석시킨다. 96-웰 편평한 바닥의 미소역가평판(Nunc)를 세포 100μl로 피복하고 건조 항온기내에서 37℃에서 밤새 건조시킨다. 평판을 PBS 내 0.05% TWEEN 20^TM(wash buffer)으로 3회 세척한 후 블록킹을 위해 PBS내 0.1% 젤라틴 100μl와 1시간동안 항온처리한다. 평판을 Wash buffer로 3회 세척한다.

PBS내 0.05%TWEEN 20^TM및 0.1% 젤라틴을 사용하여 대조표준 및 시험 혈청을 희석하고 이들 희석액 100μl를 평판에 첨가하고 실온에서 90분간 항온처리한다. 평판을 다시 3회 세척하고, 알칼리성 인산 분해 효소(TAGO)에 접합된 염소 항-생쥐 IgG 및 IgM 1:1000 희석액 100μl를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리한다. 평판을 3회 세척한 후 1M 디에탄올아민/0.5mM 염화 마그네슘내 1.0mg/ml의 기질 니트로페닐 포스페이트(Sigma) 100μl와 1시간 항온 처리한다. 2N NaOH 100μl를 첨가하여 반응을 중단하고 410nm에서의 흡광도를 읽는다.

종류 1 외부막 단백질 p1.7, 16에 대한 항체를 감지하기 위한 ELISA를 또한 수행한다. 96-웰 편평한 바닥의 미소역가 평탄을 14mM 탄산 나트륨/36mM 중탄산 나트륨, pH 9.6, 0.02% 나트륨 아지드 완충액내 5μg/ml의 정제된 p1.7, 16 100μl로 37℃에서 90분간 피복한다. 평탄을 PBS/0.1% TWEEN 20^TM(Wash buffer)로써 6회 세척한다. 쥐 혈청의 계열 희석액을 PBS/0.05% TWEEN 20^TM에서 제조하고, 100μl를 각각의 세척된 평판에 첨가하고, 각각의 평판을 37℃에서 1시간동안 항온 처리한다. 평탄을 다시 Wash Buffer로 6회 세척한다. 알칼리성 인산 분해 효소에 접합된 염소 항-생쥐 IgG 및 IgM의 1:2000 희석액 100μl를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 평판을 상기와 같이 세척하고, 디에탄올 아민내 니트로페닐 포스페이트 1mg/ml 용액 100μl를 첨가하고, 평판을 실온에서 1시간동안 항온처리되도록 한다. 3N 수산화 나트륨 50μl로써 반응을 중지하고, 405nm에서의 흡광도를 읽는다.

살균 검정

검정 절차를 Hoiby 일동 (1991)으로부터 변화시킨다. 수막염 균주를 덱스트로스(4g/L), 글루타민(0.1g/L), 코카르복실라제(0.2mg/L), 및 질산 제이철(5mg/L)이 보충된 GC 한천 배지의 냉동 원료(미시간주 디트로이트시 Difco Laboratories)로부터 성장시킨다. 평판을 5% CO₂내에서 35℃에서 6시간동안 항온 처리한다. 6시간 성장시킨 후, 한 평판으로부터의 집락을 사용하여, 0.2% 투석된 효모 추출물, L-글루탐산(1.3g/L), L-시스테인-HCl (0.02g/L), 나트륨 포스페이트 이수화물, 이염기(10g/L), 염화 칼륨(9.09g/L), 염화 암모늄(1.25g/L)로 구성되는 액체 배양 배지 100mL를 접종시킨다. 이 액체 배양물을 37℃에서 18시간동안 성장시킨다. 18시간 배양물의 분취량을 20-30 Klett 단위로 또는 650nm에서 광학 밀도 0.1로 희석시키고 배양물을 레이트지수상으로 성장시킨다. 일단 세포가 레이트 지수 상에 이르면, 이들을 살균 검정에 사용한다.

살균 검정은 수막염균 세포(약 2-4,000개 세균) 10μL, 보체(20% 보통 사람 혈청) 10μL, 0.015mM CaCl₂및 0.05mM MgCl₂(PCM)을 갖는 PBS 25μL, 및 희석된 혈청(희석제로서 PCM을 사용) 5μL를 혼합시킴으로써 실시된다. 보체의 원을 그 자체의 살균 활성의 부족에 대해 예비시험한다. 혼합물을 36℃에서 45분간 항온처리하고 그 시간에 PCM 200μL로서 희석시키고 50μL를 GC 한천 평판 상에 플레이팅한다. 배양 평판을 35-36℃에서 5% CO₂와 함께 24시간동안 항온처리한다. 그리고나서 집락을 세고 살균활성을 대조표준% (혈청 첨가 없음)으로써 표현한다. 역가는 검정에서 세균 50%가 죽는 희석도의 역으로 기록하며 살생% 대 희석도의 플롯으로부터 외삽된다. 모든 혈청은 정기적으로 10주에 시험된다. 시험된 혈청의 최고 농도는 1/50이며 1/50에서 죽지않는 혈청은 역가 <50을 갖는 것으로 보고된다. 전체 2996 세포에 대하여 제조된 양성 대조표준 항혈청은 이러한 조건하에 균주 2996을 죽이기 위해 보체원을 이용할 수 있다.

표 1

이들 제제에 대한 출발 물질은 H13 세포 건조 중량 1.5g이다.

내독소 단위(Eu)는 이. 콜리 지방 다당류(LPS)를 기준으로 사용하여 비탁법 검정에 의해 측정한다. 이때 1Eu = 이. 콜리 LPS 0.1ng.

표 2

OM-LOS, LOS-결핍된 외부막.

SOMP-LOS, LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질.

표 3

Zw3-12 OM-LOS, Zw3-12로써 제조된 LOS-결핍된 외부막.

Zw3-14 OM-LOS, Zw3-14로써 제조된 LOS-결핍된 외부막.

SOMP-LOS, LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질.

표 4

Zw3-12 OM-LOS, Zw3-12로써 제조된 LOS-결핍된 외부막.

Zw3-14 OM-LOS, Zw3-14로써 제조된 LOS-결핍된 외부막.

SOMP-LOS, LOS--결핍된 가용성 외부막 단백질.

표 5

OM+부분 LOS, Zw 3-14로 1번 또는 Zw3-12로 2번 추출된 외부막.

OM-LOS, LOS-결핍된 외부막.

SOMP-LOS, LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질.

역가는 50% 살생을 제공하는 희석도의 역이다.

시험된 혈청의 최고 농도는 1/50이며; 1/50에서 죽지 않는 혈청은 역가 <50을 갖는 것으로 보고된다.

관계 서적 목록

동등물

당 분야의 업자는 본원에 상세히 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 여러가지 동등물을 관례적 실험만을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 하기 특허 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

도면은 수막염균으로 부터 LOS-결핍된 가용성 외부막 단백질을 제조하는 방법의 흐름도이다.

Claims

그람염색음성 구균의 전체 막으로부터 지방과당류-결핍된 외부막을 제조하는 방법으로서,

a) 구균의 전체막을 폴리옥시에틸렌 세정제로 추출하여 내부 막이 결핍된 외부 막을 생성하고;

b) 단계 a)에 의해 생성된 외부 막을 쌍성이온 베타인 세정제로 추출하여 지방과당류-결핍된 외부막을 생성하는 것으로 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 구균이 나이세리아 및 모락셀라로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 구균이 수막염균, 임균, 및 모락셀라 카타르할리스(catarrhalis)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)에서의 폴리옥시에틸렌 세정제가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법:

a) TRITON X-100^TM;

b) BRIJ 35^TM; 및

c) TWEEN 80^TM
제1항에 있어서, 쌍성이온 베타인 세정제가 하기 일반식을 가지는 방법:

이때, R₁은 10 이상 내지 16 이하의 탄소를 가지는 알킬 쇄이고, R₂는 카르복실기 또는 설포닐기이며, n은 1 이상이다.
제5항에 있어서, 쌍성이온 베타인 세정제가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법:

a) ZWITTERGENT 3-12^TM;

b) ZWITTERGENT 3-14^TM; 및

c) EMPIGEN BB^TM
제1항에 있어서, 단계 a)가 단계 b)로 진행되기 전에 한번 이상 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)가 한번 이상 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)에 의해 생성된 외부 막을 염 완충액내 쌍성이온 베타인 세정제로 추출하여 가용성 외부 막 단백질을 함유하는 분획 및 불용성 외부 막 단백질 및 세포벽 성분을 함유하는 분획을 생성하는 것을 또한 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 쌍성이온 베타인 세정제는 ZWITTERGENT 3-14^TM이고, 염 완충액은 0.1 - 0.5M NaCl이며, 가용성 외부 막 단백질을 농축하는 것을 또한 포함하는 방법.
제1항, 제4항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 단리된 지방과당류-결핍된 외부 막.
제9항의 방법에 의해 생성된 지방과당류-결핍된 불용성 외부막 단백질 및 세포벽 성분.
제10항의 방법에 의해 생성된 농축된 지방과당류-결핍된 가용성 외부막 단백질.
그람염색음성 구균에 대해 살균 항체를 유발할 수 있는 조성물을 제조하는 방법으로서,

a) 그람염색음성 구균의 전체 막을 얻고;

b) 폴리옥시에틸렌 세정제로 전체 막을 추출하여 내부 막이 결집된 외부막을 생성하고;

c) 단계 b)에 의해 생성된 외부 막을 쌍성이온 베타인 세정제로 추출하여 지방 과당류-결핍된 외부 막을 생성하며;

생리적으로 허용가능한 부형액과 합함으로써, 그람염색 음성 구균에 대해 살균 항체를 유발할 수 있는 조성물을 제조하는 것으로 구성되는 방법.
제14항에 있어서, 구균이 나이세리아 및 모락셀라로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제15항에 있어서, 구균이 수막염균, 임균 및 모락셀라 카타르할리스로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제16항에 있어서, 수막염균이 혈청 그룹 B에 속하는 방법.
제14항에 있어서, 그람염색음성 구균의 하나 이상의 균주가 단계 a)에서 사용되고, 상기 균주가 세균의 하나 이상의 혈청그룹, 혈청유형, 또는 하부유형에 속하는 방법.
제14항에 있어서, 그람염색음성 구균이 재조합물이고, 재조합 구균이 하나 이상의 하부 유형의 부류 1 외부 막 단백질을 발현시키는 방법.
제14항에 있어서, 단계 b)에서의 폴리옥시에틸렌 세정제가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법:

a) TRITON X-100;

b) BRIJ 35^TM; 및

c) TWEEN 80^TM;

이때, 단계 c)에서의 쌍성이온 베타인 세정제는 하기 일반 구조식을 가진다:

이때, R₁은 10 이상 내지 16 이하의 탄소를 가지는 알킬 쇄이고, R₂는 카르복실기 또는 설포닐기이며, n은 1 이상이다.
제20항에 있어서, 쌍성이온 베타인 세정제가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법:

a) ZWITTERGENT 3-12^TM;

b) ZWITTERGENT 3-14^TM; 및

c) EMPIGEN BB^TM
제 14항에 있어서,

d) 단계 c)에 의해 생성된 외부 막 단백질을 염 완충액내 쌍성이온 베타인 세정제로 추출하여 가용성 외부막 단백질을 얻는 것을 또한 포함하고; 이때, 쌍성이온 베타인 세정제가 ZWITTERGENT 3-14^TM이고, 염 완충액이 0.1- 0.5 M NaCl인 방법.
제14항, 제16항, 제17항, 제18항, 제19항, 제20항, 제21항, 및 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조성물로 구성되는 백신.
그람염색음성 구균의 외부 막을 인식하고, 상기 유기체의 지방과당류와 교차 반응하지 않는 폴리클로날 항체를 제조하는 방법으로서, 인체를 제외한 동물 내 단리된 지방과당류-결핍된 외부막에 항체를 유발시키기에 적당한 환경하에, 상기 인체를 제외한 동물에 제11항의 상기 단리된 지방과당류-결핍된 외부막을 투여하는 것으로 구성되는 방법.
제24항에 있어서, 구균이 나이세리아 및 모락셀라로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제25항에 있어서, 구균이 수막염균, 임균, 및 모락셀라 카타르할리스로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제24항의 방법에 의해 생성된 폴리클로날 항체.