CN104640878B - 交叉反应的金黄色葡萄球菌抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了涉及交叉中和抗体的主题，该抗体包含至少一个结合到α‑毒素(Hla)的多特异性结合位点，以及至少一种金黄色葡萄球菌的双组分毒素，其医学及诊断用途，产生该抗体的方法，包括在产生抗体中使用的分离的核苷酸序列、质粒和宿主细胞；以及进一步地，由特异性交叉中和抗体识别的分离的构形表位。

Description

交叉反应的金黄色葡萄球菌抗体

背景技术

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要的病原体，其表达大量可以杀死多种不同类型细胞的分泌毒素(外毒素)，包括红细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞，以及肺或皮肤的上皮细胞。此外，大多数这些毒素激活免疫细胞，并充当强效的促炎信号。

金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞毒素的一个突出的成员是α-溶血素(Hla)，其在人体肺的上皮和内皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞中发挥细胞溶解的功能。其还能裂解兔的红血球(RBCs)，但对人RBCs的毒性很小。Hla被认为是金黄色葡萄球菌引起的肺炎发病机理的关键毒力因子，并且是肺上皮细胞裂解和募集大量免疫细胞引起组织损伤的原因。在疾病当中，募集到的吞噬细胞主要是中性粒细胞，它们都成为了金黄色葡萄球菌生成的其他细胞毒素的目标。最强效的毒素是双组分细胞溶解素或杀白细胞素，由一个S组分(慢速洗脱的)和一个F组分(快速洗脱的)组成。所有金黄色葡萄球菌中普遍表达的γ-溶血素(Hlg)基因产物可以形成两类毒素：HlgAB和HlgCB(B亚基是F-组分)，它们都是能高效杀死人类免疫细胞：PMNs、淋巴细胞和巨噬细胞的。前者对人RBCs来说也是强效的溶血素。

Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)也称为LukSF，它是最有特征性的双组分毒素。其由噬菌体源的遗传因子携带，并由患者中分离的大约5-10％的金黄色葡萄球菌种生成，但是，报道称，表达PVL的菌种在皮肤和软组织感染中的比率是50-93％，这依赖于疾病的类型(Lina,Clin Infect Dis,1999:1128)。LukED(LukD是F组分)是一种低效力的杀白细胞素，但被证明存在于大多数的金黄色葡萄球菌临床分离株中(Shukla,J ClinMicrobiol,2010:3582)。起初，它的功能仅牵涉在皮肤感染中，但是，作为最少被表征的双组分毒素，它对其他类型的金黄色葡萄球菌感染的贡献是不能排除的。最近，LukED被报道涉及金黄色葡萄球菌感染的小鼠动物模型中的血流感染(Alonzo,Mol Microbiol,2012:423)。这两个基因对彼此具有明显的同源性(68％-82％的氨基酸相同)，而最近鉴定的杀白细胞素LukGH(LukG是F组分)具有较低的同源性，具有33-40％相同(Ventura,PloS ONE,2010:e11634；DuMont,Mol Microbiol,2011:814)。

尽管Hla和双组分毒素亚基间的低水平氨基酸同源性仅有16-28％的氨基酸相同(Galdiero,Protein Sci,2004:1503；Pedelacq,Structure,1999:277；Menestrina,FEBSLetters,2003:54)，但Hla、LukS、LukF、HlgA和HlgB的晶体结构已经确定，并发现一些结构的同源性。所有这些毒素形成由亚基寡聚化形成的环状结构，导致在细胞膜中形成孔，并随后细胞溶解。在Hla的例子中，该孔展示为七聚体，但对于双组分毒素，已经报道有六聚体(Comai,Mol Microbiol,2002:1251)、七聚体和八聚体(Yamashita,PNAS,2011:17314)异聚体，在学界中引起了争论(详细参考Kaneko,Biosci Biotechnol Biochem,2004:981)。

这一毒素族不同的F和S组分不仅可以形成同源配对(它们是：LukS-LukF、LukE-LukD、HlgC-HlgB、HlgA-HlgB和LukH-LukG)，而且可以形成非同源配对，Gravet等人(Gravet,FEBSLetters,1998:202)报道了许多这些配对，并且Dalla Serra等人报道了γ-溶血素和LukS(DallaSerra,J Chem Inf Model,2005:1539)的配对。由于这一毒素族的丰余性(redundancy)和混杂性(promiscuous)，使单个组分失活不太可能有效对抗金黄色葡萄球菌的感染。在中和单个双组分毒素时，仅能部分影响其表型，这些报道在文献中的观点支持了这一看法(例如，Ventura,PloS ONE,2010:e11634；Malachowa,PloS ONE,2011:e18617)动物实验表明，不同的双组分毒素对生存具有不同的影响，取决于采用的模型或体内试验采用的种群。当去除多种毒素后可以观察到最突出的疾病严重度下降，例如，在采用金黄色葡萄球菌的敲除菌株(其中，agr密度感应系统，一毒素表达的全局调节子失活)感染的兔子模型中(Kobayashi,J Infect Dis,2011:204)。因此，中和更多毒素的抗体混合物比对抗单个毒素的单克隆抗体(mAbs)具有重大的优势。然而，研发包含超过三个组分的单克隆抗体(mAb)混合物具有一定的挑战性。

基于Hla和双组分毒素之间的低序列同源性(＜30％)，在α-溶血素和其他双组分毒素间寻找交叉反应的单个抗体的可能性被认为是很低的。在S组分和F组分之间能找到交叉反应的单个抗体的几率反而更高，这是因为除了LukGH外，具有更高的序列同源性。已知的是，用LukS免疫的动物超免疫血清可以识别HlgC，然而，这是因为在多克隆血清中存在不同的特异性。Laventie等人(Laventie,PNAS,2011:16404)报道了双特异性中和抗体识别LukS和HlgC。但是，由于在同源抗原上的单个结合位点，这类抗体不能形成剧烈的反应。这种双特异性单克隆抗体的交叉反应性通常限制在两种特异性，即，它不能提供广泛的交叉中和反应的可能性。综上所述，至今为止，没有报道过交叉反应的单克隆抗体，其抵抗不同的双组分金黄色葡萄球菌毒素，或抵抗α-溶血素以及任何双组分毒素。

发明内容

本发明的一个目的是提供一抗体，其通过改进的交叉反应和交叉中和效力直接抵抗不同的金黄色葡萄球菌细胞毒素。

可通过本发明的主题来实现这个目标。

根据本发明，提供了一交叉中和的抗体，其包含至少一个结合到α-毒素(Hla)的多特异性结合位点，以及至少一个金黄色葡萄球菌的双组分毒素。

具体地，双组分毒素选自γ-溶血素(HlgABC)的F组分和S组分的同源和非同源配对、PVL(LukSF)和类似PVL的毒素，优选HlgAB、HlgCB、LukSF、LukED、LukGH、LukS-HlgB、LukSD、HlgA-LukD、HlgA-LukF、LukG-HlgA、LukEF、LukE-HlgB、HlgC-LukD和HlgC-LukF中的任意种。

优选地，该结合位点结合到至少两个或至少三个双组分毒素，优选地，结合HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED中的任意两个或三个，优选地，结合HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED中的全部。

根据具体的实施例，该结合位点是CDR结合位点，优选地，包含VH和/或VL结合位点的CDR序列。

具体地，该抗体是一全长的单克隆抗体，或其抗体片段，其中包含至少一个具有该结合位点的抗体结构域，优选地，抗体选自由小鼠抗体、嵌合抗体、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和如VH、VHH或VL的单结构域抗体组成的组，优选人IgG1抗体。

优选地，该抗体结合到每种毒素的亲和力Kd小于10^-8M，优选小于10^-9M。

根据一具体的方案，该抗体在基于细胞的分析中展现出体外中和的效力，IC50小于50:1的mAb:毒素比(mol/mol)，优选地，小于10:1，更优选地，小于1:1。

根据进一步的具体方案，该抗体中和动物中的目标毒素，包括人和非人动物，并且在体内抑制金黄色葡萄球菌的致病性，优选地，任何类型的肺炎、菌血症或败血症、腹膜炎和骨髓炎。

根据一具体的方案，该抗体与指定为#AB-24的抗体结合到相同的表位。

根据进一步的具体实施例，该抗体包含与指定为#AB-24的抗体一样的结合位点。

根据进一步的具体实施例，该抗体与指定为#AB-24的抗体结合到相同的表位。

具体地，该抗体是来自或衍生自宿主细胞产生的抗体，所述宿主细胞保藏号为DSM26747和/或DSM 26748，或它们的功能活化变型中。

具体地，该抗体包含

a)由保藏号为DSM 26748中的宿主细胞产生的抗体轻链；和/或

b)由保藏号为DSM 26747中的宿主细胞产生的抗体重链；

c)或(a)和/或(b)的功能活化变型。

根据进一步的方案，本发明提供包含核苷酸序列的质粒

-编码包含在宿主细胞中的指定为#AB-24-LC的抗体轻链，所述宿主细胞保藏号为DSM26748中；和/或

-编码包含在宿主细胞中的指定为#AB-24-HC的抗体重链，所述宿主细胞保藏号为DSM26747中。

根据进一步的方案，本发明提供一表达盒，包括表达根据本发明所述的抗体的编码序列，其中，表达盒或编码序列衍生自本发明的质粒。

根据进一步的方案，本发明提供产生本发明抗体的方法，其中，采用本发明的质粒或本发明的表达盒转化宿主细胞。

具体优选的宿主细胞和产生方法是采用这样的宿主细胞，其包含

-本发明的质粒或表达盒，其中包含有表达抗体轻链的编码序列；以及

-本发明的质粒或表达盒，其中包含有表达抗体重链的编码序列。

根据进一步的方案，本发明提供一宿主细胞，其包含本发明的质粒或本发明的表达盒。

具体地，本发明涉及有宿主细胞，其保藏号为DSM 26747或DSM 26748。这类宿主细胞是用本发明的质粒转化的E.coli宿主细胞。具体地，保藏号为DSM 26748中的宿主细胞用质粒转化，该质粒包含编码指定为#AB-24-LC的抗体轻链的核苷酸序列；以及保藏号为DSM26747中的宿主细胞用质粒转化，该质粒包含编码指定为#AB-24-HC的抗体重链的核苷酸序列。

根据进一步的方案，本发明提供产生本发明抗体的方法，其中，本发明的宿主细胞在产生所述抗体的条件下培育或保存。

根据进一步的方案，本发明提供鉴定保护性候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与指定为#AB-24的抗体识别的表位结合进行评估，其中，在抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体。

根据进一步的方案，本发明提供鉴定保护性候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素的结合进行评估，其中，在抗体和毒素之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体。

根据进一步的方案，本发明提供产生本发明抗体的方法，包括：

(a)提供一根据本发明的鉴定方法确定的保护性候选抗体；以及

(b)产生一单克隆抗体，或人源化或人的保护性候选抗体，或它们的衍生物，该衍生物与保护性候选抗体具有相同的表位结合特异性。

根据进一步的方案，本发明提供产生本发明抗体的方法，包括：

(a)采用被指定为#AB-24的抗体识别的表位对非人动物进行免疫；

(b)从分离的B-细胞形成永生化的细胞系；

(c)筛选在(b)中获得的细胞系以确定产生结合该表位的单克隆抗体的细胞系；以及

(d)产生单克隆抗体，或人源化或人的抗体，或它们的衍生物，该衍生物与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性。

根据进一步的方案，本发明提供产生本发明抗体的方法，包括：

(a)采用α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素对非人动物进行免疫，并分离产生抗体的B-细胞；

(b)从分离的B-细胞形成永生化的细胞系；

(c)筛选细胞系以鉴定产生单克隆抗体的细胞系，该单克隆抗体与α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素结合；以及

(d)产生单克隆抗体，或人源化或人的抗体，或它们的衍生物，该衍生物与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性。

根据进一步的方案，本发明提供本发明的抗体用于医疗用途，包括人类医疗用途和兽用。具体地，提供该抗体治疗有金黄色葡萄球菌感染危险或患有金黄色葡萄球菌感染的对象的用途，包括给予对象一治疗有效量的该抗体以限制在对象中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病机理。

具体地，该抗体用于防止金黄色葡萄球菌感染。

根据一具体的方案，进一步提供一治疗的方法，其中，有金黄色葡萄球菌感染危险或患有金黄色葡萄球菌感染的对象得到治疗，该方法包括给予对象一治疗有效量的该抗体以限制在对象中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病机理。

具体地，该治疗方法用于阻止致病的金黄色葡萄球菌。

根据一具体的实施例，该抗体通过胃肠外的或黏膜的剂型给药。

根据进一步的方案，本发明提供本发明抗体的医药制剂，优选地，包括胃肠外的或黏膜的剂型，可选地，包含药学上可接受的载体或赋形剂。

根据进一步的方案，本发明提供本发明的抗体用于诊断用途，用于检测任何的金黄色葡萄球菌感染，包括产生高毒的MRSA感染，例如，坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。

具体地，根据本发明的用途提供一抗体，其中在体外通过将系统性感染金黄色葡萄球菌的对象的体液样品与该抗体接触，以确定所述对象系统性感染金黄色葡萄球菌，其中，该抗体的特异性免疫反应确定了该感染。

根据进一步的方案，进一步提供诊断对象感染金黄色葡萄球菌的方法，包括产生高毒的MRSA感染，例如，坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。

具体地，提供一诊断的方法，其中在体外通过将系统性感染金黄色葡萄球菌的对象的体液样品与该抗体接触，以确定所述对象系统性感染金黄色葡萄球菌，其中，该抗体的特异性免疫反应确定了该感染。

根据进一步的方案，本发明提供用于本发明抗体的诊断制品，可选地包含具有标记的抗体和/或具有标记的诊断试剂。

根据进一步的方案，本发明提供由指定为#AB-24的抗体所识别的分离的构象表位。这种表位可由单个表位或混合表位组成，混合表位包含表位变体，每个表位变体由指定为#AB-24的抗体所识别。

根据进一步的方案，本发明提供免疫原，其包含：

(a)本发明的表位；

(b)可选地，与(a)所述的表位非天然相关的表位；以及

(c)一载体。

特别地，所述载体是药学上可接受的载体，优选地包括缓冲剂和/或佐剂。

优选地，本发明的免疫原以疫苗剂型提供，优选地，用于胃肠外使用。

特别地，本发明的免疫原用于医疗用途，特别地，通过给予有效量的所述免疫原来治疗对象，以保护对象免于S.aureus的感染，防止由所述感染引起的疾病状况或抑制S.aureus肺炎发生。

特别地，提供本发明的免疫原以诱发保护性的免疫应答。

根据一具体的方案，进一步提供一治疗的方法，其中，有金黄色葡萄球菌感染危险的对象得到治疗，该方法包括给予对象一治疗有效量的免疫原以防止对象的感染，特别是保护以抵抗致病的金黄色葡萄球菌。

根据进一步的方案，本发明提供一编码本发明抗体，或编码本发明表位的分离核酸。

附图说明

图1：示出了用于mAb筛选的以重组型产生的毒素组分的示意图；

图2：如实施例3中描述，对单克隆抗体的体外Hla中和效力的测定；

A：采用兔子红血球B：采用人的肺上皮细胞(A549细胞系(来自ATCC))

图3：如实施例3中描述，具有中和效力的Hla特异性mAbs的初始和成熟亲和力(Kd)；

图4：如实施例3中描述，亲和力成熟的Hla mAbs的体外中和效力，包括交叉中和Hla mAb#AB-24(命名为#9028)；

图5：如实施例3中描述，广泛交叉中和Hla mAb#AB-24(命名为#9028)对杀白细胞素的F-组分的亲和力；

图6：#7667谱系的体外中和效力。如实施例4中描述，α-溶血素在A549细胞(A)上的中和试验，LukS-LukF(B)、HlgC-HlgB(C)和LukE-LukD(D)在人嗜中性粒细胞上的中和试验；请注意：#AB-24在这里命名为#9028；

图7：如实施例5中描述，采用单克隆抗体治疗来应对来自致死毒素的攻击，保护小鼠；请注意：#AB-24在这里命名为#9028；A：鼻内Hla攻击B：静脉内HlgAB攻击；

图8：如实施例6中描述，在Forte-Bio中测定Hla mAbs之间的竞争；

图9：如实施例1中描述，获得的S.aureus毒素序列。

SEQ ID 1：菌种USA300TCH1516(GenBank登录号CP000730)的Hla核苷酸序列

SEQ ID 2：菌种USA300TCH1516的Hla氨基酸序列

SEQ ID 3：菌种USA300TCH1516的LukS核苷酸序列

SEQ ID 4：菌种USA300TCH1516的LukS氨基酸序列

SEQ ID 5：菌种USA300TCH1516的LukF核苷酸序列

SEQ ID 6：菌种USA300TCH1516的LukF氨基酸序列

SEQ ID 7：菌种USA300TCH1516的LukE核苷酸序列

SEQ ID 8：菌种USA300TCH1516的LukE氨基酸序列

SEQ ID 9：菌种USA300TCH1516的LukD核苷酸序列

SEQ ID 10：菌种USA300TCH1516的LukD氨基酸序列

SEQ ID 11：菌种USA300TCH1516的HlgA核苷酸序列

SEQ ID 12：菌种USA300TCH1516的HlgA氨基酸序列

SEQ ID 13：菌种USA300TCH1516的HlgC核苷酸序列

SEQ ID 14：菌种USA300TCH1516的HlgC氨基酸序列

SEQ ID 15：菌种USA300TCH1516的HlgB核苷酸序列

SEQ ID 16：菌种USA300TCH1516的HlgB氨基酸序列

SEQ ID 17：菌种USA300TCH1516的LukH核苷酸序列

SEQ ID 18：菌种USA300TCH1516的LukH氨基酸序列

SEQ ID 19：菌种USA300TCH1516的LukG核苷酸序列

SEQ ID 20：菌种USA300TCH1516的LukG氨基酸序列

SEQ ID 21：菌种MRSA252(GenBank登录号BX571856)的LukH核苷酸序列

SEQ ID 22：菌种MRSA252的LukH氨基酸序列

SEQ ID 23：菌种MRSA252的LukG核苷酸序列

SEQ ID 24：菌种MRSA252的LukG氨基酸序列

SEQ ID 25：菌种MSHR1132(GenBank登录号FR821777)的LukH核苷酸序列

SEQ ID 26：菌种MSHR1132的LukH氨基酸序列

SEQ ID 27：菌种MSHR1132的LukG核苷酸序列

SEQ ID 28：菌种MSHR1132的LukG氨基酸序列

具体实施方式

本文使用的术语“抗体”指的是由抗体域组成或包含抗体域的多肽或蛋白，其中，抗体域理解为免疫球蛋白重链和/或轻链的恒定域和/或可变域，具有或不具有连接序列。如果包含β-桶状结构，其由环(loop)序列连接的至少两条抗体域结构β-链组成，多肽则理解为抗体域。抗体域可以是初始的结构，或通过突变或衍生化修饰，例如，修饰抗原结合特征或任何其他特征，如稳定性或功能性特征，如，结合到Fc受体FcRn和/或Fcγ受体。

本文使用的抗体具有结合一种或多种抗原，或一种或多种这类抗原表位的特异性结合位点，特别地，包括单可变抗体域的CDR结合位点，如VH、VL或VHH，或者可变抗体域对的结合位点，如VL/VH对，包含VL/VH区域对和抗体恒定域的抗体，如Fab、F(ab’)、(Fab)₂、scFv、Fv或全长抗体。

本文使用的属于“抗体”尤其指的是包含或由单可变抗体域，如VH、VL或VHH，或具有或不具有连接序列或绞链区的可变和/或恒定抗体域的结合组成的抗体形式，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含或由VL/VH区域对和抗体恒定域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)₂、scFv、Fd、Fv或全长抗体，如IgG型(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)抗体、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。术语“全长抗体”能用于指代任意抗体分子，其包含至少大多数Fc域和其他在天然抗体单体中普遍找到的区域。本文使用这一短语来强调具体的抗体分子并非抗体片段。

特别地，术语“抗体”包括分离形式的抗体，其大体上不包含针对不同目标抗原的其他抗体，或包含不同结构排列的抗体域。然而，分离的抗体可包含在结合的剂型中，该剂型包含分离抗体的结合，如包含至少一种其他抗体，如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段。

术语“抗体”应当应用于动物来源的抗体，包括人类，如哺乳动物，包括人、小鼠、兔子、山羊、羊驼(lama)、牛和马、或鸟类，如母鸡。

术语“抗体”进一步应用于嵌合抗体，其具有不同种属来源的序列，如小鼠和人来源的序列。

术语“嵌合”的使用与抗体相关，指的是那些重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与来源于具体种或属于具体纲的抗体中相应的序列同源，而链中的剩余部分与另一种或纲的相应序列是同源的抗体。通常，轻链和重链的可变区域模仿来源于一种哺乳动物的抗体可变区域，而恒定域则与来源于另一种哺乳动物的抗体片段同源。例如，可变区域可以来源于目前已知的来源，其使用容易从非人宿主生物中获得的B-细胞或杂交瘤，并与来源于如人细胞制剂的恒定区域组合。

术语“抗体”进一步应用于人源化抗体。

相对于抗体使用的术语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点大体上来源于非人类种属的免疫球蛋白，其中，该分子剩余的免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。该抗原结合位点包含完整的融合在恒定域上的可变域，或仅仅是接枝在可变域中合适的构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的，如，一个或多个氨基酸替换，优选地，修饰成更接近于人免疫球蛋白。一些类型的人源化抗体保留着所有的CDR序列(例如，包含来自老鼠抗体中所有6个CDRs的人源化老鼠抗体)。其他类型则具有一个或多个相对于原始抗体改变了的CDRs。

术语“抗体”进一步应用于人抗体。

相对于抗体使用的术语“人”，理解为包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变域和恒定域的抗体。本发明的人抗体可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，体外随机突变或定点突变，或体内体细胞突变引入突变)，例如，在CDRs上。人抗体包括从人免疫球蛋白库中分离，或从动物中分离，其通过转基因用于生产一种或多种人免疫球蛋白的抗体。

该术语特别地应用于任何类或子类的抗体。基于它们重链中恒定域的氨基酸序列，可以将抗体分为以下主要的分类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而这些里面的一些抗体可进一步划分为子类(同种型(isotype))，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

该术语进一步应用于单克隆或多克隆抗体，特别地，重组抗体，包括由重组手段制备、表达、创造或分离的所有抗体或抗体结构，如源自动物的抗体，如哺乳动物(包括人)，其包含不同来源的基因或序列，如嵌合抗体、人源化抗体或杂种瘤来源的抗体。另一些例子中，指的是从转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，或从重组体、抗体或抗体域组合文库中分离的抗体，或通过任何其他手段制备、表达、创造或分离的抗体，这些手段涉及将抗体基因序列剪接成其他DNA序列。

应该理解的是，术语“抗体”也可指抗体的衍生物，特别是功能活化的衍生物。抗体的衍生物理解为一个或多个抗体域或抗体和/或融合蛋白的任意组合，其中，任意的抗体域可融合在一个或多个其他蛋白(如，其他抗体)的任何位置上，如包含CDR环的结合结构、受体多肽，但也可以是配体、支架蛋白、酶、毒素等。可以通过多种化学技术联合或结合到其他物质来获得抗体的衍生物，例如通过共价交联、静电交互作用、二硫键等。结合到抗体的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或它们的任意组合(例如，聚乙二醇、前体药物或药物)。在一具体的实施例中，抗体是一衍生物，其包含一附加标签，以允许与生物学可接受的化合物进行特异性反应。对于可用于本发明的标签没有具体的限制，只要在抗体结合到其靶标时不会产生或者产生可容许的负面影响。合适的标签的例子包括His标签、Myc标签、FLAG标签、Strep标签、钙调蛋白标签、GST标签，MBP标签和S标签。在另一具体的实施例中，该抗体是包含标签的衍生物。本文使用的术语“标签”指的是可检测的化合物或组合物，其直接或间接结合到抗体，从而形成“标记的”抗体。该标签本身可被检测到，如放射性同位素标签或荧光标签，或，在酶标签的例子中，可催化可被检测到的底物化合物或组合物的化学改变。

本发明优选的衍生物是关于抗原结合的功能性活化，优选地，其具有中和S.aureus的效力，和/或其为保护性抗体。

应该理解的是，术语“抗体”也可指抗体的变异体。

术语“变异体”应当具体指的是抗体，如变异抗体或抗体片段，如通过变异方法获得的，具体指删除、替换、引入插入序列至特异性的抗体氨基酸序列或区域或化学衍生化的氨基酸序列，例如，通过本领域可用的亲和力成熟技术，如在恒定域操纵抗体的稳定性、效应子的功能或半衰期，或在可变域改进抗原结合性能。可使用任何已知的突变方法，例如包括通过随机技术在所需位置获得的点突变。在一些情况下，位置是随机挑选的，例如，可选择任意氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。术语“突变(mutagenesis)”指的是用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域已知的技术。优选的突变技术包括易错PCR突变、饱和突变或其他定向突变。

术语“变异体”应当特别包含功能活化的变异体。

本文中使用的抗体的“功能活化的变异体”指的是通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，或通过化学衍生化氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列中的核苷酸，或序列的一个或两个远端来修饰这一序列所得到的序列，其中，修饰不会影响(特别是不会损失)这一序列的活性。在结合位点对选择的靶抗原具有特异性的情况下，功能活化的抗体变异体仍然具有预定的结合特性，尽管这一点可能会改变，如改变对特定抗原表位的精细特异性、亲和性、亲合力、Kon或Koff率等。具体地，如本文进一步描述，本发明的功能活化的抗体变异体具有结合到Hla以及S.aureus的双组分毒素中至少一个的多特异性结合位点。

功能活化的变异体可通过，例如，改变母源抗体的序列，如包含与指定为#AB-24的抗体相同的结合位点的抗体，但在该结合位点旁的抗体区域进行修饰，或者来源于母源抗体是指定为#AB-24的抗体，其修改没有损失其抗原结合，并优选地具有与母源抗体相似的生物活性，包括能结合S.aureus的毒素和/或以特定的效力中和S.aureus，如通过特异性结合试验或靶向S.aureus或S.aureus毒素的功能性测试来确定是具有大体上相同的生物活性的。本文使用的术语“大体上相同的生物活性”指的是大体上相同的生物活性显示为测定的母源抗体活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％或至少110％、或至少120％、或至少130％、或至少140％、或至少150％、或至少160％、或至少170％、或至少180％、或至少190％，如达到200％。

在一个优选实施例中，母源抗体的功能活化变异体

a)是抗体的生物活性片段，所述片段包括至少50％分子序列，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％及最优选至少97％、98％或99％；

b)是来自至少进行一个氨基酸替代、添加和/或删除的抗体，其中所述功能活跃变异体与所述分子序列或者其一部分相同，例如具有至少50％序列相同的抗体，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，以及最优选至少97％、98％或者99％；和/或

c)由抗体或抗体的功能活化变异体，以及与多肽或核苷酸序列异源的至少一种氨基酸或核苷酸组成。

在本发明一个优选实施例中，本发明抗体的功能活跃的变异体本质上与上述变异体相同，但与变异体的多肽或核苷酸序列分别不同，因为其来源于不同种的同源序列。这些都指的是自然产生的变异体或类似物。

术语“功能活化的变异体”还包括自然产生的等位基因变异体，以及突变体或者任何其他非自然产生的变异体。在现有技术中众所周知的是，等位基因变异体是一种(多)肽的替代形式，其特征是具有一个或多个氨基酸的替换、删除、添加，其本质上不会改变多肽的生物功能。

功能活化的变异体可通过改变多肽或核苷酸序列获得，例如通过一个或多个点突变，其中在结合本发明使用时，序列改变保持了没被改变的多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于，(保守)替换、添加、删除、突变和插入。

具体的功能活化的变异体是CDR变异体。CDR变异体包括在CDR区域中由至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中，所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变，该修改使得变异体保留未修饰序列的生物特性。CDR氨基酸序列的部分改变可通过删除或替换一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过增加或插入一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生化一个到多个氨基酸序列，如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过它们的组合来实现。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，将一个疏水性氨基酸替换成替代的疏水性氨基酸。

保守替换是那些在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族内发生的替换。这些氨基酸家族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香族铡链的氨基酸、具有不带电极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。

特别地，点突变理解为对多核苷酸的工程设计，获得与非工程设计的氨基酸序列不同的氨基酸序列的表达，其中，工程设计的氨基酸序列是通过替换或交换、删除或插入一个或多个单氨基酸(不连续的)或氨基酸双联体得到的不同的氨基酸。

优选的点突变指的是相同极性和/或电荷的氨基酸的替换。在这一点上，氨基酸指的是由64个三联体密码子编码的20种自然氨基酸。这20中氨基酸可以划分成具有中性电荷、正电荷和负电荷：

“中性”氨基酸如下所示，连同它们对应的三字母码和单字母代码，以及极性：

丙氨酸：(ALa，A)非极性，中性；

天门冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；

半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；

谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；

甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；

异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；

亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；

蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；

苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；

脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；

丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；

苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；

色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；

酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；

缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；以及

组氨酸：(His，H)极性，正电荷(10％)中性(90％)。

“正”电荷的氨基酸是：

精氨酸：(Arg，R)极性，正电荷；以及

赖氨酸：(Lys，K)极性，正电荷。

“负”电荷的氨基酸是：

天冬氨酸：(Asp，D)极性，负电荷；以及

谷氨酸：(Glu，E)极性，负电荷。

关于在本文描述的抗体序列和同源物(homologs)的"百分比(％)氨基酸序列同源性”定义为候选序列中的氨基酸残基百分比，该氨基酸残基与特定多肽序列中的氨基酸残基相同，为了实现最大百分比序列同源度，而不考虑任何保守替换作为部分序列同源性，如果有必要，可在序列比对和引入缺口后计算氨基酸残基百分比。本领域技术人员可确定测定比对的适当参数，包括为了实现与待比对的全长序列的最大对准度的任何算法。

具体地，抗体变异体理解为包括同源物、类似物、片段、具有特定糖基化模式的变型或变异体(如，由糖基化工程产生，具有功能并充当功能等同物，例如，结合到特异性靶标并具有功能特性)。本发明优选的变异体是关于抗原结合的功能性活化，优选地，其具有中和S.aureus的效力，和/或其为保护性抗体。

本发明的抗体能或不能发挥Fc效应子的功能。虽然作用方式主要是由缺乏Fc效应子功能的中和抗体来介导，但是Fc能募集补体，并通过形成免疫复合物来帮助消除循环中的靶标抗原，如毒素。

具体的抗体可缺乏活性Fc部分，因此，其由不包含抗体Fc部分的抗体域，或者不包含Fcγ受体的结合位点的抗体域组成，或者其包含缺乏Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰来降低Fc效应子功能，特别是废除或降低ADCC和/或CDC活性。替代的抗体可以是通过设计引入修饰，从而增加Fc效应子功能，特别是增强ADCC和/或CDC活性。

这些修饰可以通过突变来实现，例如，在Fcγ受体的结合位点中突变或衍生化，或者通过试剂干扰抗体形式的ADCC和/或CDC活性，从而实现降低或增加Fc效应子功能。

Fc效应子功能显著的降低应理解为，通过测定ADCC和/或CDC活性，Fc效应子功能少于未修饰(野生型)形式的10％，优选地，少于5％。

Fc效应子功能显著的增加应理解为，通过测定ADCC和/或CDC活性，Fc效应子功能比未修饰(野生型)形式至少增加10％，优选地，至少20％、30％、40％或50％。

关于抗体序列的术语“糖基化的”是指由于糖基化工程而具有经过修饰的免疫原性、ADCC和/或CDC的糖基化变异体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有碳水化合物结构，每个同型都拥有不同排列的N连接的碳水化合物结构，这种结构影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是糖蛋白，其在每一个CH2域里有一保守的N联糖基化位点，Asn297。连接在Asn297的两个复合物双触角寡糖被埋在两个CH2域之间，形成与多肽骨架的广泛接触，并且他们的存在对于抗体调节效应子功能是必要的，如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。将在N297的N多糖移除，通常会产生具有减少ADCC的无糖基化的抗体形式，如通过N297突变，例如转变为A或T299。

抗体糖基化的主要区别产生于细胞株之间，在不同培养条件下，给定细胞株的即使很微小的差异也能被看到。通常在细菌细胞中表达糖基化的抗体。报导称，拥有四环素调控表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(一种催化产生等分GlcNAc的糖基转移酶)的CHO细胞具有增强的ADCC活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。在重组产生抗体的过程中，影响糖基化的因素除了宿主细胞的选择外，还包括生长模式、培养基成分、培养密度、氧合作用(oxygenation)、pH、纯化方案等等。

术语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是参与抗原结合的抗体部分。抗原结合位点是由重(“H”)链和/或轻(“L”)链的N端可变(“V”)区或它们的可变域的氨基酸残基形成的。重链和轻链的V区内三个高度差异段(divergent stretch)称为“超变区”，其插入在较为保守的称为“框架区”的侧翼段之间。抗原结合位点提供了一个与结合表位或抗原的三维表面互补的表面，而该超变区被称为“互补决定区”或“CDRs”。此处并入在CDRs中的结合位点也被称为“CDR结合位点”。

本文术语“抗原”与术语“靶标”或“靶标抗原”可交换使用，指的是通过抗体结合位点识别的整个靶标分子或该分子的片段。具体地，抗原的底层结构，如多肽或糖结构，通常称为“表位”，例如，B细胞表位或T细胞表位，这些都是免疫相关的，是由结合位点识别的。

本文使用的术语“表位”特别指的是可完整地形成抗体结合位点的特异性结合配体或特异性结合配体的部分。一表位可由糖、肽结构、脂肪酸、有机、生化或无机物质组成，或它们的衍生物和任意组合组成。如果表位包含在肽结构如肽、多肽或蛋白中，其通常包括至少3个氨基酸，优选地，5-40个氨基酸，以及更优选地，在大约10-20个氨基酸之间。表位可以是线性的，或构象表位。线性表位有多肽或糖链一级序列的单个节段组成。线性表位可以是连续的，或者是重叠的。构象表位由氨基酸或糖类组成，通过折叠多肽组合在一起形成三级结构，而这些氨基酸是不需要在线性序列中彼此相邻的。特别地，对于多肽抗原，构象或不连续的表位的特征在于，存在两个或多个离散的氨基酸残基在一级序列中被分离开，但是，当多肽折叠成天然蛋白/抗原时，则在分子的表面组装成一致的结构(consistentstructure)。

本文的术语“表位”特别指的是由抗体识别的单个表位，或包含抗体变异体的表位混合，其中每个由交叉反应的抗体识别。

术语“表达”应当如下理解。包括表达产物(如本文描述的抗体)的所需编码序列的核酸分子，以及控制序列，如可操作性连锁的启动子，可用于表达目的。以这些序列转化或转染的宿主能产生编码的蛋白。为了有效转化，表达系统可包含在一载体上，然而，相关DNA也可整合到宿主染色体上。特别地，该术语指的是在合适的条件下，宿主细胞和相容的载体表达蛋白，例如，通过载体携带的或引入宿主细胞中的外源DNA表达编码的蛋白。

编码DNA是为具体多肽或蛋白，如抗体编码具体氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或以其他方式介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以是来自相同的基因或不同基因，可以是来自相同或不同的生物。重组克隆载体通常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个用于筛选宿主的标记物，如抗生素抗性，以及一个或多个表达盒。

本文使用的“载体”定义为转录克隆重组核苷酸序列所需的DNA序列，即，在合适的宿主生物中，重组基因及它们的mRNA的翻译所需的DNA序列。

“表达盒”指的是编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段，其能在确定的限制位点插入到载体中。该盒限制位点的目的在于确保该盒插入到适当的阅读框中。一般来说，外源DNA是插入在载体DNA的一个或多个限制位点上，然后由载体携带，随可传输的载体DNA进入宿主细胞。具有插入的或增加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也被称为“DNA构建体”。

表达载体包含表达盒以及通常包含一宿主细胞中用于自主复制的复制起始点(origin)或一基因整合位点、一个或多个可选择的标记(例如，氨基酸合成基因或赋予抗生素抵抗性的基因，如Zeocin、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、适当的启动子序列以及转录终止子，这些组件是可操作连锁在一起的。本文使用的术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因整合核苷酸序列。载体的一种常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的独立分子，能容易地接收额外的(外源)DNA，并能容易地引入到合适的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合用于插入外源DNA的限制位点。特别地，术语“载体”或“质粒”指的是一运载工具，通过它能将DNA或RNA序列(如，外源基因)引入宿主细胞中，从而改变宿主，并促进引入的序列的表达(如，转录和翻译)。

本文使用的术语“宿主细胞”应当指的是转化以产生具体重组蛋白(例如，本文描述的抗体)的原代细胞，及其任何子代。应当理解的是，并非所有的子代都是完全与母细胞相同的(由于有意或非故意的突变，或环境条件的不同)，然而，只要子代保留与原始转化细胞相同的功能，则这种改变的子代也包括在这些术语中。术语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因，产生重组多肽，如重组抗体的宿主细胞的细胞系。本文使用的术语“细胞系”指的是一具体类型的细胞构建的克隆，其获得在一长时间段内增殖的能力。这种宿主细胞或宿主细胞系可保存在细胞培养基中，和/或培养以产生重组多肽。

对组合物(composition)如免疫原性组合物或本文描述的疫苗的“免疫应答”是在宿主或对象中的细胞和/或抗体介导的响应于该组合物或目标疫苗的免疫应答的发展。在本文中，免疫原性组合物也记为“免疫原”，其包括抗原或表位。这类反应由对象组成，该对象产生特异性针对包含在组合物的一种或多种抗原或目标疫苗的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞。

“保护性免疫应答”理解为对于诱导的或自然的感染或毒素攻击，与非免疫的群体相比，能提供明显更好结果的免疫应答。对抗毒素的保护性免疫应答主要通过具有高亲和力的中和抗体介导，例如，具有Kd少于10^-8M。毒素中和的好处是保护了目标细胞，防止了发炎。Fc介导形成的免疫复合物也可通过从循环中(由RES细胞)清除毒素来发挥作用。

免疫原或免疫原性组合物通常包含抗原或表位，以及一载体，具体地，包括一佐剂。术语“佐剂”指的是当与抗原一同给药时，针对抗原增加和/或重定向免疫应答的化合物，但是，当单独给药时，针对抗原不会产生免疫应答。佐剂通过多种机制能增加免疫应答，包括募集淋巴细胞、刺激B和/或T细胞以及刺激巨噬细胞。示例性的载体是脂质体或阳离子肽；示例性的佐剂是磷酸铝或氢氧化铝、MF59或CpG寡核苷酸。

本文对于核苷酸、抗体或其他化合物使用的术语“分离的”或“分离”指的是这些化合物已从其自然联系的环境中充分分离，从而以“基本上纯化”的形式存在。“分离的”的意思并不必然地排除混合有其他化合物或材料的人工或合成的混合物，或存在不会干扰基本活性的杂质，并且这些是可以存在的，例如，由于不完全纯化。特别地，本发明分离的核酸分子也指包括那些化学合成的。

参考本发明的核苷酸，有时会使用术语“分离的核酸”。这一术语，当应用在DNA上时，指的是从序列中分离的DNA分子，它在其源生物的自然基因中是直接连续的。例如，一“分离的核酸”可包含插入在载体(如质粒或病毒载体中，或整合在原核细胞或真核细胞或宿主生物的基因组DNA中)的DNA分子。当应用在RNA上时，术语“分离的核酸”主要指由上面定义的分离的DNA所编码的RNA分子。或者，该术语指的是已从其自然状态下(即，在细胞或组织中)联系的其他核苷酸中充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可进一步表示由生物或合成手段直接产生，并从它产生过程中存在的其他成分中分离的分子。

关于多肽或蛋白，如本发明的抗体或表位，术语“分离的”具体指的是不存在或基本上不存在特定材料的化合物，该材料是与化合物自然相关联的，如在它们的自然环境中找到的其他化合物，或者是当在体内或体外通过重组DNA技术制备它们时，在制备环境(如，细胞培养基)中找到的其他化合物。分离的化合物可以与稀释剂或佐剂一起配制，以及还为实际用途而分离的--例如，当用于诊断或治疗用途时，多肽或多核苷酸可与药学上可接受的载体或赋形剂混合。

本文的术语“中和(neutralizing)”或“中和(neutralization)”从最广泛的意义上使用，并指的是不考虑实现中和的机制，任何抑制病原体如金黄色葡萄球菌侵染对象的分子，或任何抑制病原体通过产生有力的蛋白毒素来促进感染的分子，或任何抑制毒素破坏对象中目标细胞的分子。例如，可以通过抑制金黄色葡萄球菌毒素和它在目标细胞上的同源受体的结合和/或相互作用的抗体来实现中和。在某些实施例中，本文描述的抗体能中和毒素活性，其中，体内或体外毒素和目标细胞(如血红细胞)的相互作用效果减少或消除。通过抑制活性毒素形成能使中和进一步发生，例如，在金黄色葡萄球菌双组分细胞溶解素的情况下，通过抑制S-组分和F-组分的结合，或在细胞膜中形成低聚孔。

抗体抵抗溶细胞毒素的中和能力通常在标准检测中确定，通过测量对给定毒素敏感的细胞增加的生存能力或功能性。中和可由携带或不携带抗体的活细胞百分数来表示。对于高效抗体，优选表示中和能力的方式是抗体:毒素的摩尔比，其中，较低值对应于较高的效力。低于1的值设定为非常高的效力。

本文使用的术语“交叉中和”指的是中和多种毒素，如整合一交叉反应的表位的毒素，该表位由交叉反应或多特异性抗体识别。

术语“金黄色葡萄球菌”和“S.aureus”或“致病的金黄色葡萄球菌”是如下理解的。正常地，金黄色葡萄球菌可在人们或动物的皮肤和鼻子上找到。一般来说，这些细菌是无害的，除非通过切口或其他伤口进入体内。通常，感染是健康人群中次要的皮肤问题。历史上，感染是由广效抗生素来治疗的，如甲氧西林。然而，如今出现的某些菌株是抵抗甲氧西林和其他β-内酰胺抗生素的，如盘尼西林和头孢菌素。它们被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(也被称为多重耐药金黄色葡萄球菌，或“MRSA”)。

金黄色葡萄球菌，一种重要的人类病原体，表达大量的分泌毒素(外毒素)。这些毒素能攻击多种类型的宿主细胞，包括红细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞，以及肺或皮肤的上皮细胞。金黄色葡萄球菌(S.aureus)毒素的一个突出的成员是α-溶血素(Hla)，其在淋巴细胞、巨噬细胞、肺的上皮和内皮细胞中发挥细胞溶解的功能。

金黄色葡萄球菌感染，包括MRSA，通常以小红肿块发作，其类似丘疹、疖或蜘蛛咬伤。这些肿块或疤会迅速变成深处的、疼痛的脓肿，这需要手术引流。有时候，细菌仍然限制在皮肤上。有时，它们会藏身在体内深处，可能造成威胁生命的大范围人组织感染，包括皮肤、软组织、骨骼、关节、手术伤口、血流、心脏瓣膜、肺或其他器官。因此，金黄色葡萄球菌感染能导致与之相关的疾病状况，其可能是致命的疾病，如坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合症和多种形式的肺炎，包括坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。在医院或养老院，MRSA感染是特别使人苦恼的，这些地方的病人处于或易于处于开放性创伤、侵入性装置和变弱的免疫系统的风险中，并因此比公众处于更高的感染危险中。

抗体中和金黄色葡萄球菌毒素是干扰病原体和致病反应，从而能限制或防止感染，和/或能减弱这种感染造成的疾病状况，或抑制金黄色葡萄球菌的发病机理，特别是肺炎发病。在这一方面，本文的“保护性抗体”可以理解是在主动免疫或被动免疫中观察到的针对感染源负责免疫的中和抗体。特别地，本文描述的保护性抗体能中和分泌的毒力因子的毒素效果(如细胞溶解、由目标细胞诱发的促炎性细胞因子表达)，并因此干扰金黄色葡萄球菌的致病潜能。

本文使用的术语“重组”意思是“由基因工程制备或是基因工程的结果”。重组宿主尤其包括表达载体或克隆载体，或者其被通过基因工程改造而包含重组核苷酸序列，特别包含对于宿主来说是外源的核苷酸序列。重组蛋白是通过在宿主中表达各自的重组核苷酸来产生的。本文使用的“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的抗体，如(a)从动物(如，老鼠)分离的抗体，该动物是基因改造或转染色体用于制备人免疫球蛋白基因或杂种细胞；(b)从转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离；(c)从重组、组合人类抗体文库中分离的抗体；以及(d)通过其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的手段所制备、表达、创建或分离的抗体。这种重组抗体包括工程改造以包含重新排列和突变的抗体，例如，这些重新排列和突变发生在抗体成熟过程中。

此处所使用的“特异性”或“特异性结合”是指在异源群体分子中对目标同源配体起决定作用的结合反应。因此，在指定条件(例如，免疫分析条件)下，抗体特异性结合到特定目标，而不会大量结合到样本中其他分子上面。特异性结合是指根据选择的目标识别度，高、中或低结合亲和力或亲合力进行的选择性结合。如果结合常数或者结合动力学至少10倍不同，优选是100倍不同，更优选是1000倍不同，则通常可实现选择性结合。

该术语也适用于，如抗体对与多个抗原交叉反应的特定表位是有特异性的，其中，特异性的抗体能结合携带交叉反应表位的多种抗原。这种抗体的结合位点和/或具有特异性结合交叉反应表位的抗体，分别也被称为多特异性或交叉特异性结合位点和抗体。例如，抗体可具有与多个不同抗原交叉反应的表位特异性结合的多特异性结合位点，所述抗原与所述表位和/或结构相似物中的序列同源，以提供本质上结构相同的构象表位，例如，至少与金黄色葡萄球菌的Hla和双组分毒素交叉反应。

抗体所表现的对交叉反应结合序列的抗体免疫特异性、结合能力以及伴随亲和力(attendant affinity)，是由与抗体发生免疫反应(结合)的交叉反应结合序列决定。交叉反应结合序列特异性可以，至少部分由抗体免疫球蛋白重链可变区的氨基酸残基定义，和/或由轻链可变区的氨基酸残基序列定义。

术语“具有相同特异性”、“具有相同结合位点”或“结合相同的表位”的使用，表示展示相同或本质相同的等价单克隆抗体，即类似的免疫反应(结合)特性以及竞争结合到预选的目标结合序列。抗体分子对特定靶标的相对特异性可以通过竞争试验相对地测定得到，例如，如Harlow等人在ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)中描述的。

本文使用的术语“对象”指的是温血哺乳动物，特别地，指人类或非人类动物。MRSA是人类一非常重要的病原体，也是兽医中的正在关注的一个问题。它在非人类动物种类中广泛地存在。因此，术语“对象”也可特别地指代动物，包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽。尤其是本发明的医疗用途，或者各自治疗方法应用到需要预防的对象或应用到与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病状况的治疗的对象中。该对象可以是处于金黄色葡萄球菌感染的危险下，或患有疾病，包括早期或晚期的疾病。术语“患者”包括接受预防或治疗处理的人和其他哺乳动物对象。术语“治疗(treatment)”因而指包括预防和治疗处理。

例如，为预防目的对对象进行处理，或进行金黄色葡萄球菌疾病状况治疗。特别是，进行处理的对象处于感染或如疾病或疾病复发的发展危险中，或者是对象患有这类感染和/或这类感染相关的疾病。

具体地，术语“预防”指的是防护性措施，其目的在于包含预防发病机理的开始阶段，或减少发病机理的预防措施。

具体地，本文描述的治疗、预防或延迟对象疾病状况的方法，是通过干扰作为该状况的病因的金黄色葡萄球菌的发病机理，其中，该发病机理包括在对象细胞膜上形成孔的步骤，例如，通过特定的毒力因子或毒素。

本文术语“毒素”应指的是金黄色葡萄球菌的α毒素(Hla)和双组分毒素。

金黄色葡萄球菌的毒性是由于多个毒力因子的结合，其包括允许细菌粘附在真核生物的细胞膜上的表面相关蛋白、保护细菌免于调理吞噬的荚膜多糖，以及多种外毒素。金黄色葡萄球菌引起的疾病主要通过产生分泌的毒力因子，如溶血素、肠毒素和中毒性休克毒素。这些分泌的毒力因子通过使宿主中多个免疫学机制钝化来抑制免疫应答，并引起组织破坏，并帮助建立感染。后者通过一组孔形成毒素来完成，其中最突出的是Hla，金黄色葡萄球菌肺炎的关键毒力因子。

金黄色葡萄球菌产生大量不同的其他毒力因子和毒素，使得这种细菌能中和并抵挡不同类型的免疫细胞的攻击，特别是组成体内一级防御系统的白细胞亚群。这些毒力因子和毒素的产生使得金黄色葡萄球菌能保持传染的状态。这些毒力因子当中，金黄色葡萄球菌产生的多种双组分白细胞毒素，通过两种非缔合的蛋白或亚基的协同作用破坏宿主防御细胞和红细胞的细胞膜。这些双组分毒素当中，γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)以及Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)是最具有特色的。

杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两种组分的作用。第一个亚基称为S类组分，而第二个亚基称为F类组分。S和F亚基协同作用以在白细胞上形成孔，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞(共同地被称为吞噬细胞)。已知由金黄色葡萄球菌产生的双组分杀白细胞素的全部组成成分包括F和S组分的同源和非同源对，例如，γ溶血素、PVL毒素和类似PVL的毒素，包括本文描述的优选目标HlgAB、HlgCB、LukSF、LukED、LukGH、LukS-HlgB、LukSD,HlgA-LukD、HlgA-LukF、LukG-HlgA、LukEF、LukE-HlgB、HlgC-LukD或HlgC-LukF。图1提供了一些突出双组分毒素的概述。

本文使用的术语“基本上纯化”或“纯化的”指的是制备包含至少50％(w/w)，优选地至少60％、70％、80％、90％或95％的一化合物，如核苷酸分子或抗体。通过适当的方法来测量该化合物的纯度(例如层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等等)。

化合物，如本发明的抗体和免疫原的术语“治疗有效量”在本文与“有效量”或“足够量”的任意一个可交换地使用，是指当给药给对象时，能足够获得有益或期望的结果包括临床效果的量或活性，并且，就这点而论，有效量或其同义词取决于其应用的背景。

有效量是目的在表示化合物足够治疗、预防或抑制这些疾病或紊乱的量。在疾病的背景下，本文描述的抗体的治疗有效量是有益于对金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌发病机理的抑制，特别地用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或状况。

对于这一有效量的化合物的量根据不同的因素而不同，如给定的药物或化合物、药物剂型、给药的方式、疾病或紊乱的类型、治疗的对象或宿主的特性等等，虽然如此，但是通常能由本领域技术人员确定。

本发明免疫原的抗体可以在预防上使用来抑制金黄色葡萄球菌感染的开始阶段，或在治疗上处理金黄色葡萄球菌的感染，特别是如MRSA的金黄色葡萄球菌感染，其已知是难治的，或者在具体对象的情况下，被证明采用传统的抗生素治疗的处理是难治的。

具体地，本文使用的抗体的治疗有效量在0.5-500mg的范围，优选1-400mg，更优选高达300mg，高达200mg，高达100mg或高达10mg，但可能需要更高剂量的治疗，如用于治疗急性疾病的状况。

此外，对象采用治疗有效量的本发明抗体的治疗或预防方案可包括单次给药，或者包含一系列的应用。例如，可以至少一年给予抗体一次、至少半年一次或至少一个月一次。然而，在另一实施例中，对于给定的治疗方案，可以从大约每周一次到大约每日给予对象抗体。治疗期的长短取决于多个因素，如疾病的严重性，急性还是慢性疾病，患者的年龄，抗体形式的浓度和活性。也应当理解的是，用于治疗或预防的有效剂量可在具体的治疗或预防方案过程中增加或降低。剂量的改变结果通过本领域一直的标准诊断试验是变得明显的。在一些例子中，是需要长期给药的。

本文描述的免疫原，如提供给处于金黄色葡萄球菌感染相关疾病状况发展危险中的患者，有效量具体地是在每剂量1-15mg/kg的范围中。

例如，可以这样来给予免疫原，根据加强免疫方案，在某个时间框架内，第一剂量后接着一次或多次的加强剂量来诱导金黄色葡萄球菌感染的持久有效免疫应答。优选的接种方案是包含三次剂量的给药，例如，在0天第一剂，5-40天第二剂，以及10-100天第三剂，优选地，在0、28和90天给药。根据优选的加快方案，给药可以在0、7和14天。加快方案可适用于预防，如适用于面临选择性外科手术的患者。通常使用明矾作为佐剂，如磷酸盐或氢氧化物。

因此，特别地，本发明涉及序列同源性为20-28％的单克隆抗体交叉中和金黄色葡萄球菌的α溶血素和双组分毒素。这是让人感到意外的，因为如此低水平的序列同源性。预期产生交叉中和Hla和至少一个双组分毒素的单克隆抗体的几率是很低的。

虽然详细的作用方式尚未明确，但是获得的关于#AB-24(#9028)的数据具有巨大的潜在价值，并提到第一个单个抗体中和α溶血素和多个双组分毒素的概念验证。

唯一描述多个双组分特异性抗体的文献(Laventie,PNAS,2011:16404)被认为是与本发明无关的，因为LukS和HlgC的双重特异性是通过采用两个不同的结合位点来设计产生双特异性抗体。相比之下，本发明涉及的是相同的结合位点能结合不同的毒素，如四种不同的毒素：α-毒素和γ-溶血素的F-组分、Panton-Valentine杀白细胞素(PVL、LukSF)以及LukED。基于与LukED和LukSF的高氨基酸同源性，该四重反应的mAb也能结合到牛LukM杀白细胞素，这是可行的。

在一些实施例中，本发明识别Hla上表位并与HlgA交叉反应的抗体，可额外地具有与其他葡萄球菌的杀白细胞素S化合物的交叉反应性，如HlgC、LukS-PVL、LukHLukS-I、LukE、LukEv和LukM。同样地，在一些实施例中，本发明识别Hla上表位并与HlgB交叉反应的抗体，可额外地具有与其他葡萄球菌的杀白细胞素F化合物的交叉反应性，如LukF'-PV、LukF-PV、LukDv、LukD、LukF-I和LukG。本发明交叉反应的抗HlgA和/或抗HlgB抗体可分别抑制或降低HlgA活性和HlgB活性。在一些实施例中，交叉反应的抗HlgA和/或抗HlgB抗体分别中和，如基本上消除HlgA和HlgB的活性。

根据一具体的方案，提供了结合相同表位的抗体，该术语包括变异体，其本质上结合到与指定为#AB-24的抗体一样的表位；或包含相同的结合位点，该术语包括变异体，其本质上包含与指定为#AB-24的抗体相同的结合位点。指定为#AB-24的抗体与功能活性变异体特别地包括一结合位点，其有效中和Hla以及交叉中和同源毒素对LukS-LukF、LukE-LukD和HlgB-HlgC中的至少一个、至少两个或至少三个，并可能进一步包括双组分毒素。

如果抗体交叉竞争，则抗体为所述“结合到相同表位”或“包含相同结合位点”或具有“本质上相同的结合”特性，这样，在给定的时间点，只有一个抗体能结合到表位，即，一个抗体防止其他抗体的结合或调节作用。

本文对于抗体所使用的术语“竞争”或“交叉竞争”指的是第一抗体或其抗原结合部分结合到表位的方式，与第二抗体或其抗原结合部分的结合方式足够相似，这样，在第二抗体存在的情况下，第一抗体结合其同源表位的结果比不存在第二抗体时第一抗体的结合可检测地下降。或者，当第一抗体存在的情况下，第二抗体结合到其表位也是可检测地下降，但可能不是这样。就是说，第一抗体能抑制第二抗体结合到其表位，而第二抗体不会抑制第一抗体结合到其各自的表位。然而，当每个抗体可检测地抑制其他抗体结合到期同源表位时，不论是抑制到相同、更大或更低程度，这些抗体都被称为是，为了结合到各自的表位而彼此“交叉竞争”的。竞争和交叉竞争抗体都包含在本发明中。

本文的静止指的是通过竞争ELISA分析，如在具体实施例部分中描述的，相对抑制大于大约30％。希望的是设定更高的相对抑制阀值，作为在特定背景下合适竞争水平的标准，例如，当竞争分析是用于选择或筛选新抗体时，而该新抗体设计具有结合金黄色葡萄球菌额外的或其他的毒素的预期功能。因此，可以为竞争性结合设定标准，例如，其中在抗体被认为具有足够的竞争性前，检测到至少40％的相对抑制，或至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少100％的相对抑制。

具体地，提供的一抗体包含指定为#AB-24抗体的可变区，尤其是至少一个CDR序列，优选地，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个CDR序列，或其功能活性的CDR变异体。更具体地说，提供的抗体是指定为#AB-24。

具体地，#AB-24抗体或其任意功能活性变异体可采用保藏的(deposited)材料产生，如一种或都是(one of or both of)保藏的质粒和/或一种或都是保藏的宿主细胞。

根据一具体的方案，该抗体可以是来源于由本发明的质粒编码的抗体，例如，采用保藏材料的部分序列来工程改造#AB-24抗体或其任意功能活性变异体。

根据另一具体的方案，#AB-24抗体或其任意功能活性变异体可以是来源于由保藏在DSM26747和/或DSM 26748中的宿主细胞产生的抗体，例如，采用保藏材料的部分序列来工程改造#AB-24抗体或其任意功能活性变异体。

具体地，#AB-24变异体是功能活性的CDR变异体，例如，在至少一个CDR序列中具有部分改变。

在某些方案中，本发明提供了这类变异体抗体，优选地，单克隆抗体，更优选地，人类抗体，其包含重链和轻链，其中重链或VH可变区或各自的CDRs中任何一个包含来源于各自保藏质粒和/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方案中，本发明提供了这类变异体抗体，优选地，单克隆抗体，更优选地，人类抗体，其包含重链和轻链，其中轻链或VL可变区或各自的CDRs中任何一个包含来源于各自保藏质粒和/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方案中，本发明提供了这类变异体抗体，优选地，单克隆抗体，更优选地，人类抗体，其包含重链和轻链，其中重链和轻链，或VH/VL可变区，或各自的CDRs中任何一个包含来源于各自保藏质粒和/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方案中，本发明还提供了这类变异体抗体，包含来源于保藏材料的各自的结合序列，如可变的序列和/或CDR序列，其中，该结合序列包含的序列与来源于保藏材料的氨基酸序列至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少99％的相同，并且，其中的变异体是功能活性的变异体。

如本文描述的，例如，在本发明的一个方案中，提供的抗体分子的特征在于，能与单克隆抗体#AB-24竞争结合到Hla、LukSF、LukED和HlgCB。#AB-24是发明人分离并表征的人类IgG1抗体。#AB-24的成熟可变重链是，例如，采用DSM 26747的宿主细胞产生。#AB-24的成熟可变轻链是，例如，采用DSM 26748的宿主细胞产生。

本发明优选的抗体是以高亲和力结合所述单独的抗原，特别是以高的结合速率和/或低的解离速度，或高的结合亲和力。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度来表征，在这一浓度下，一半的抗原结合位点被占用，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，结合剂(binder)被认为是高亲和力的结合剂，具有Kd＜10^-8M，优选地，Kd＜10^-9M，甚至更优选地，Kd＜10^-10M。

但是，在一具体优选的实施例中，单独抗原的结合亲和力是具有中等亲和力，如，当结合到至少两个抗原时，例如，Kd小于10^-6M而大于10^-8M。

可以根据本发明提供中等亲和力的结合剂，优选地，如果需要，连同亲和力成熟过程。

亲和力成熟是产生对目标抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。为了根据本发明公开的不同实施例而产生亲和力成熟的抗体，可以采用一种或多种方法来制备和/或使用本领域可用的亲和力成熟文库。根据本发明公开的不同实施例，这类亲和力成熟的方法和用途，例如随机突变、细菌增变株(bacterial mutator strains)传代培养、定点突变、突变热点靶标、限定性突变、抗体替换、轻链替换、重链替换、CDR1和/或CDR1突变，以及遵守实施方法和用途的产生和使用亲和力成熟文库的方法，包括例如在以下文献中公开的：Prassler et al.(2009),Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedy et al.(2007),Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679。

随着抗体结构变化，包括氨基酸突变，或由于体细胞在免疫球蛋白基因片段的突变的结果，产生或选择抗原结合位点变异体用于更大的亲和力。亲和力成熟的抗体可展示出比亲本抗体高出几个对数倍。单个亲本抗体可经历亲和力成熟过程。替代地，抗体池(pool)具有相似的与目标抗原结合的亲和力，可被认为是亲本结构，其获得不同的亲和力成熟的单个抗体，或这类抗体的亲和力成熟的抗体池。

根据本发明，优选的亲和力成熟的抗体变异体展示出增加至少10倍的结合亲和力，优选地，增加至少100倍。在采用各自亲本分子文库的竞争性筛选(selectioncampaign)的过程中，可采用亲和力成熟，采用具有中等结合亲和力的抗体来获得本发明的抗体，该抗体具有特定的特异性目标结合特性，结合亲和力Kd小于10^-8M。或者，通过本发明的抗体亲和力成熟，亲和力甚至增加更多以获得高值，其相应于Kd小于10^-9M，优选地，小于10^-10M，或更优选地，小于10^-11M，最优选的是在皮摩尔范围内。

可通过利用补体激活的另一途径来激活噬菌作用的效应细胞。结合到微生物表面抗原的抗体吸引补体的第一组分，与它们的Fc区域发生级联反应，并启动激活“经典的”补体系统。这导致刺激了噬菌作用的效应细胞，最终通过补体依赖细胞毒性(CDC)杀死目标。

根据具体的实施例，在标准ADCC或CDC试验中测试，本发明的抗体在免疫效应细胞存在时具有细胞毒性。如果与对照相比，由ADCC或CDC实验测定的细胞溶解显著增加，那么，本发明的抗体则显示为细胞毒性。关于ADCC或CDC的细胞毒性，优选地记为绝对的增加百分数，优选地，高于5％，更优选地，高于10％，甚至更优选地，高于20％。

具体地，本发明的交叉反应抗体通过鉴别中和具有多重特异性的抗体过程获得的，例如，通过交叉反应发现选择方案(cross-reactive discovery selection scheme)。因此，抗体文库包括能与两个目标(目标A和B)反应的抗体，其首先选择的可以是与目标中的一个(如，目标A)反应，然后选择的是与其他其他目标(如，目标B)反应。每个连续选择的回合加强了所得池对两个目标的反应强度。因此，这个方法对鉴别具有针对两个不同目标的交叉反应性，并且具有交叉中和病原体潜能的抗体来说是特别有用的。通过包括对额外目标的额外富集回合，这个方法能延伸至鉴别对进一步目标反应性的抗体。

在一些情况下，交叉反应抗体通过针对单个抗原的筛选浮现。为了增加分离出交叉反应性克隆的可能性，人们会通过针对多个抗原的持续筛选来采用多个选择压力。具体的mAb选择策略是以交替的方式采用不同的毒素组分。例如，最有效力的中和抗Hla单克隆抗体随后会进行结合人类嗜中性粒细胞PVL或类似PVL毒素的测试，人类嗜中性粒细胞PVL或类似PVL毒素代表了金黄色葡萄球菌感染过程中双组分毒素的主要目标。

该重组毒素可用于筛选抗体文库中的抗体，如，酵母展示抗体文库。

在任一情况下，本领域已知的抗体优化方法都可以进一步改进交叉反应性。例如，本文描述的免疫球蛋白链可变区的某个区域可经受一种或多种优化策略，包括轻链替换、目的诱变(destinational mutagenesis)、CDR融合以及选择CDR和/或框区域的定向突变。

鉴别具有预期中和特性的抗体的筛选方法可以是抑制毒素结合到目标细胞、抑制二聚体或寡聚物的形成。抑制孔的形成、抑制细胞溶解、抑制细胞激素、淋巴因子和任何促炎信号的诱发，和/或抑制动物上的体内反应(死亡、溶血、过度炎症、器官功能障碍)。可基于直接结合所需的毒素来评估反应性，例如，采用标准试验。

一旦确定交叉中和抗体具有所需的特性，就可确定通过抗体识别的优势表位或表位。表位作图的方法在本领域中是已知的，并且公开在，如Westwood and Hay编辑的Epitope Mapping:A Practical Approach，Oxford University Press(牛津大学出版社)，2001年。

表位作图涉及抗体结合的表位的确定。本领域技术人员已知许多用于确定蛋白上表位位置的方法，包括抗体-抗原复合物的晶体学分析、竞争分析、基因片段表达分析和基于合成肽的分析。“结合相同表位”的抗体作为参考抗体在本文中应以如下方式理解。当两个抗体识别的表位是相同的或空间上重叠的表位，这些抗体被称为结合相同的或本质上相同的或基本上相同的表位。确定两个抗体是否结合到相同的或空间上重叠的表位，通常使用的方法是竞争分析，其可以配置成所有不同的形式，或采用标记的抗原或标记的抗体。通常，抗原是固定在96-孔板上的，并且采用放射性标记或酶标记来测量未标记抗体阻止标记抗体结合的能力。

一旦确定抗体具有所需的交叉中和特性，这个抗体，包括抗体片段都可通过本领域已知的方法产生，包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术。

在杂交瘤技术中，将老鼠免疫，或其他合适的宿主动物，如仓鼠，以诱发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，该抗体能特异性结合到用于免疫反应的蛋白。或者，在体外对淋巴细胞进行免疫。然后，采用合适的融合技术，例如，聚乙二醇将淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

分析杂交瘤细胞生长的培养基中抵抗抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性是通过免疫沉淀法，或通过体外结合分析法如放射免疫检定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。

例如，重组单克隆抗体可以通过这样的方法产生：分离编码该所需抗体链的DNA，并采用已知的重组表达载体如，包含编码该抗体序列的核苷酸序列的本发明质粒或表达盒，将该编码序列转染到重组宿主细胞中以表达。重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如以上描述的那些。

根据一具体的方案，该核苷酸序列可用于基因操作来人源化抗体，或增强其亲和力，或抗体的其他特征。例如，如果该抗体是用在人的临床试验和治疗的话，可对恒定域进行工程改造，以更类似人恒定域，从而避免免疫反应。期望的是，对抗体序列进行基因操作，以获得针对目标毒素更高的亲和力，以及针对金黄色葡萄球菌更大的效力。对抗体进行一个或多个多核苷酸的改变，而它仍然保持结合到目标毒素的能力，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

一般地，通过多种手段产生抗体分子是容易理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)描述了用于重组产生抗体的方法，其中，在单个细胞中，从单个载体或两个单独的载体上同时表达重链和轻链。Wibbenmeyer等人(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee和Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了在分开培养的E.coli中，采用质粒表达分别产生重链和轻链，以产生单克隆抗体。例如，在Harlow等人的ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1988)中，提供了产生抗体的其他不同技术。

如果需要，可测序本发明的抗体，如#AB-24抗体，然后，将多核苷酸序列克隆到载体中表达或增殖。编码抗体的序列可保存在宿主细胞的载体内，然后扩增宿主细胞并冷冻起来以后使用。通过本领域已知的手段，可以通过将B细胞的抗体基因克隆，在细胞培养基中产生重组单克隆抗体。

在另一个方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含产生本发明重组抗体的编码序列。

在另一个方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含产生本发明重组表位的编码序列，或包含本发明这一表位的分子。然而，本发明的表位也可以合成产生，例如，通过任何本领域熟知的合成方法。

编码抗体或表位的核苷酸可具有任何合适的特征，并包含任何合适的特性，或它们的组合。因此，例如，编码抗体或表位的核酸可以是DNA、RNA或它们的混合物的形式，并可包含非自然产生的碱基、修饰过的骨架(例如，增加核酸稳定性的硫代磷酸骨架)或二者。有利地，核酸可整合到本发明的表达盒、载体或质粒中，其特征在于，在目标宿主细胞中促进期望的表达、复制和/或筛选。这些特征的例子包括复制组件的起点、筛选基因组件、启动子组件、增强子组件、聚腺苷酸化序列组件、终止组件等已知的许多合适例子。

本发明公开内容进一步提供了包含一个或多个本文描述的核苷酸序列的重组DNA构造。这些重组构造与载体一同使用，如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，其中插入了编码任何公开抗体的DNA分子。

通过在培养基中的连续细胞系来产生抗体分子的任何方法来产生单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法例子，包括Kohler等人(1975,Nature 256:495-497)的杂交瘤方法，和人体B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001)；以及Brodeur等人1987年的,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术和应用)，Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.51-63。

此外，本发明还提供了药物组合物，其包括本文提供的抗体或免疫原，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以根据本发明通过一次性注射(bolusinjection)或输注或连续输注的方式给药。适于促进这种注射方式的药物载体在本领域中是熟知的。

通常，药学上可接受的载体抗体任何或所有合适的溶剂、分散剂、涂层、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等等，它们是在生理上与本发明提供的抗体或相关成分或组合物兼容的。药学上可接受的载体的进一步例子包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的任意组合。

在这一方案中，抗体可以与适合期望的给药方式的一种或多种载体组合，抗体可以是，例如，与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的任何混合，以及可选地，进一步制成小片或封入胶囊，用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉花籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或不同的缓冲液中。其他载体、佐剂和给药方式是本药学领域所熟知的。载体可包括控制的释放材料或延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或仅仅是甘油二硬脂酸酯或与蜡或其他本领域已知的材料一起。

其他药学上可接受的载体是本领域已知的，并记载在，如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES中。液体剂型可以是溶液、乳液或悬浮液，并且可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。

考虑到药物组合物，其中按配方制造本发明抗体或免疫原和一种或多种治疗活性剂。通过混合所述具有所需纯度、具有可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂的免疫球蛋白，以冻干剂型或水溶液的形式配制本发明抗体或免疫原的稳定配方用于存储。特别地，该用于体内给药的剂型是无菌的，优选地，以无菌水溶液的形式给药。这通过无菌滤膜或其他方法过滤可以很容易实现。在此揭露的抗体和其他治疗活性剂也可形成免疫脂质体和/或包被在微胶囊中。

药物组合物包括本发明的抗体或免疫原，其可通过不同的方式进行给药，包括口服、皮下给药、静脉注射、鼻内给药、耳内给药(intraotically)、经皮注射、粘膜给药、局部给药如凝胶、药膏、洗剂、乳膏等，腹膜内给药、肌肉给药、肺内给药如采用可吸入技术或肺输送系统，阴道给药、胃肠外给药、直肠给药或眼内给药。

用于胃肠外给药的剂型的例子包括那些适用于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的，如无菌溶液、乳液或悬浮液。

在一个实施例中，本发明的抗体或免疫原是唯一给药到对象的治疗活性剂，例如，作为疾病缓解或防止的单药疗法。

或者，本发明的抗体或免疫原与一种或多种其他治疗或预防试剂组合给药，其中，一种或多种其他治疗或预防试剂包括，但不限于标准疗法，如，抗生素、类固醇或非类固醇炎症抑制剂，和/或其他基于抗体的治疗，如采用抗细菌剂或抗炎剂。

组合疗法尤其采用标准治疗方案，如，用于治疗MRSA感染。这可包括抗生素，如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧西林和/或万古霉素。

在组合疗法中，抗体以混合物给药，或伴随一种或多种治疗方案，如在伴随治疗之前、同时或之后。

在一些情形下，预防性免疫原给药可采用疫苗，其包含本发明的免疫原，即单价疫苗。然而，可采用包含不同免疫原的多价疫苗来诱导对抗相同或不同目标病原体的免疫应答。

本发明抗体、免疫原或各自的药物剂型的生物特性，在细胞、组织和整个生物的离体实验中表征。如本领域已知的，为了测试药物对抗疾病或疾病模型的治疗效果，或测试药物的药物动力学药物、药效动力学、毒性或其他特性，通常在动物中进行体内测试，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子。动物可指的是疾病模型。疗法通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠或转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验可提供有意义的数据，用于确定抗体用于治疗或预防的效力，其具有合适的半衰期、效应物功能、(交叉)中和活性和/或主动或被动免疫治疗的免疫应答。任何生物，优选哺乳动物，都可用于测试。例如，由于与人类的基因相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，因此可用于测试对象试剂或组合物的效力、毒性、药物动力学、药效动力学、半衰期或其他性质。最终是要求在人类上测试以批准为药物的，因此，这些实验当然是在计划中的。因此，本发明的抗体、免疫原和各自的药物组合物可在人类中测试，以确定它们的治疗或预防效力、毒性、免疫原性、药效动力学和/或其他临床性质。

本发明还提供用于治疗目的的本发明目标抗体，例如，用于检测和定量确定生物流体样本中作为免疫原或靶标的毒素或抗体的浓度的方法中。

本发明还提供用于检测生物样本(如，体液)中毒素或金黄色葡萄球菌感染的水平，包括将样本与本发明抗体接触的步骤。本发明的抗体可应用于任何已知的分析方法中，如，竞争性结合分析、直接和间接夹心法分析、免疫沉淀分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

根据本发明使用的体液包括对象的生物样本，如组织提取液、尿液、血液、血清、粪便和痰。

在一个实施例中，该方法包括，将过量的某种类型的抗体片段与固相支持体接触，其中抗体片段与靶标形成复合物，例如，至少一种由本发明抗体靶向的毒素，置于合适的条件使抗体附着在固相支持体的表面。所得的附着有抗体的固相支持体随后与生物流体样本接触，这样，生物流体中的靶标与抗体结合，形成靶标-抗体复合体。该复合体可以用可检测的标记物标记。或者，在复合物形成之前对靶标或抗体进行标记。例如，将一可检测的标记物(标签)与抗体连接。然后，通过检测和定量测定生物流体样本中的靶标浓度，可以检测到定量地确定复合物。

对于具体的应用，本发明抗体是结合到一标签或报告分子上，选自由有机分子、酶标签、放射性标记、彩色标签，荧光标记、显色标签、发光标签、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物组成的组。连接到标签或报告分子的抗体可以使用在，例如，分析系统或诊断方法中，如，诊断金黄色葡萄球菌感染或与之相关的疾病状况。

例如，本发明抗体可结合到其他分子上，从而允许在结合分析(如ELISA)和结合研究中对所述结合物进行简单的测定。

本发明的另一个方案提供了一包括抗体试剂盒，除了一个或多个抗体外，可包括多种不同的诊断或治疗试剂。试剂盒也可包括用于诊断或治疗方法的说明书。例如，该说明书可在试剂盒中提供的设备上，例如，以诊断目的用于准备生物样本的工具或设备，例如，在确定各自毒素以诊断疾病前，分离细胞和/或包含片段的蛋白。有利地，这种试剂盒包括抗体和诊断剂或试剂，其可用于本文中一种或多种不同诊断方法。在另一优选的实施例中，该试剂盒包括抗体，如，与药学上可接受的载体组合，以冻干的形式存在，其在给药近期，形成可注射组合物使用前混合。

指定为#AB-24的抗体(本文也称为#9028)，具体地，抗体轻链和/或重链的进一步特征在于，保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Mascheroder Weg 1b/Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig(DE))中的生物材料，保藏号为本文所指出的。

DSM 26747是由包含编码#AB-24重链(AB-24-HC)的质粒转化的E.coli宿主细胞：Escherichia coli DH5alpha AB-24-HC＝DSM 26747，保藏时间：2013年1月8日；保藏人：阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司(Arsanis Biosciences GmbH)，维也纳，奥地利。

DSM 26748是由包含编码#AB-24轻链(AB-24-LC)的质粒转化的E.coli宿主细胞：Escherichia coli DH5alpha AB-24-LC＝DSM 26748，保藏时间：2013年1月8日；保藏人：阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司(Arsanis Biosciences GmbH)，维也纳，奥地利。

以下定义的主题认为是本发明的实施例：

1.一种交叉中和的抗体，其包含至少一个结合到α-毒素(Hla)的多特异性结合位点，以及金黄色葡萄球菌的至少一种双组分毒素。

2.根据限定1所述的抗体，其中，所述双组分毒素选自由γ-溶血素、PVL和类似PVL的毒素的F组分和S组分的同源和非同源配对组成的组,优选HlgAB、HlgCB、LukSF、LukED、LukGH、LukS-HlgB、LukSD、HlgA-LukD、HlgA-LukF、LukG-HlgA、LukEF、LukE-HlgB、HlgC-LukD和HlgC-LukF中的任意种。

3.根据限定1或2所述的抗体，其中，所述结合位点结合到至少两种或至少三种双组分毒素，优选地，结合HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED中的任意两种或三种，优选地，结合HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED。

4.根据限定1到3中任一项所述的抗体，其中，所述结合位点是CDR结合位点，优选地，包含VH和/或VL结合位点的CDR序列。

5.根据限定1到4中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是一全长的单克隆抗体，或其抗体片段，其中包含至少一个具有该结合位点的抗体结构域，优选地，抗体选自由小鼠抗体、嵌合抗体、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和如VH、VHH或VL的单结构域抗体组成的组，优选人IgG1抗体。

6.根据限定1到5中任一项所述的抗体，其中，所述抗体结合到每种毒素的亲和力Kd小于10^-8M，优选小于10^-9M。

7.根据限定1到6中任一项所述的抗体，其中，所述抗体在基于细胞的分析中展现出体外中和的效力，IC50小于50:1的mAb:毒素比(mol/mol)，优选地，小于10:1，更优选地，小于1:1。

8.根据限定1到7中任一项所述的抗体，其中，所述抗体中和动物中的目标毒素，并在体内抑制金黄色葡萄球菌的发病机理，优选地，肺炎、菌血症或败血症、腹膜炎和骨髓炎中的任意种。

9.根据限定1到8中任一项所述的抗体，其中，所述抗体与指定为#AB-24的抗体结合到相同的表位。

10.根据限定1到9中任一项所述的抗体，其中，所述抗体包含与指定为#AB-24的抗体相同的结合位点。

11.根据限定到10中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是来自或衍生自宿主细胞产生的抗体，所述宿主细胞保藏号为DSM 26747和/或DSM 26748，或它们的功能活化变型中。

12.根据限定11所述的抗体，其包括：

a)由保藏号为DSM 26748中的宿主细胞产生的抗体轻链；和/或

b)由保藏号为DSM 26747中的宿主细胞产生的抗体重链；

c)或(a)和/或(b)的功能活化变型。

13.包含核苷酸序列的质粒，其包括

-编码包含在宿主细胞中的指定为#AB-24-LC的抗体轻链，所述宿主细胞保藏号为DSM26748中；和/或

-编码包含在宿主细胞中的指定为#AB-24-HC的抗体重链，所述宿主细胞保藏号为DSM26747中。

14.一种包含编码序列的表达盒，用于表达限定1-12中任一项所述的抗体的轻链和/或重链，其中，所述表达盒或编码序列来源于限定13所述的质粒。

15.产生根据限定1-12中任一项所述的抗体的方法，其中，将限定13的所述质粒和限定14的所述表达盒转化宿主细胞。

16.一种包含限定13所述的质粒或限定14所述的表达盒的宿主细胞。

17.根据限定16所述的宿主细胞，其保藏号为DSM 26747或DSM 26748。

18.产生限定1-12中任一项所述抗体的方法，其中，在产生所述抗体的条件下培养或保持根据限定16或17的宿主细胞。

19.一种鉴别候选保护性抗体的方法，其包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与指定为#AB-24的抗体识别的表位结合进行评估，其中，在抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体。

20.一种鉴别候选保护性抗体的方法，其包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素的结合进行评估，其中，在抗体和毒性之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体。

21.一种产生根据限定1-12中任一项所述的抗体的方法，其包括：

(a)提供一根据限定19或20的鉴定方法确定的保护性候选抗体；以及

(b)产生一单克隆抗体，或人源化或人的保护性候选抗体，或它们的衍生物，该衍生物与保护性候选抗体具有相同的表位结合特异性。

22.一种产生根据限定1-12中任一项所述的抗体的方法，其包括：

(a)采用被指定为#AB-24的抗体识别的表位对非人动物进行免疫；

(b)从分离的B-细胞形成永生化的细胞系；

(c)筛选在(b)中获得的细胞系以确定产生结合该表位的单克隆抗体的细胞系；以及

(d)产生单克隆抗体，或人源化或人的抗体，或它们的衍生物，该衍生物与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性。

23.一种产生根据限定1-12中任一项所述的抗体的方法，其包括：

(a)采用α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素对非人动物进行免疫，并分离产生抗体的B-细胞；

(b)从分离的B-细胞形成永生化的细胞系；

(c)筛选细胞系以获得产生单克隆抗体的细胞系，该单克隆抗体与α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素结合；以及

(d)产生单克隆抗体，或人源化或人的抗体，或它们的衍生物，该衍生物与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性。

24.根据限定1-12中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗有金黄色葡萄球菌感染危险或患有金黄色葡萄球菌感染的对象，包括给予对象一治疗有效量的该抗体以限制在对象中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病机理。

25.根据限定25所述的抗体用途，其用于防止金黄色葡萄球菌感染。

26.根据限定24或25所述的抗体用途，其中，所述抗体以胃肠外或黏膜剂型给药。

27.根据限定1-12中任一项所述的抗体的药物剂型，优选地包含胃肠外或黏膜剂型，可选地包含一药学上可接受的载体或赋形剂。

28.根据限定1-12中任一项所述的抗体用于诊断用途，用于检测任何的金黄色葡萄球菌感染，包括产生高毒的MRSA感染，例如，坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。

29.根据限定28所述的抗体用途，其中，在体外通过将系统性感染金黄色葡萄球菌的对象的体液样品与该抗体接触，以确定所述该对象系统性感染金黄色葡萄球菌，其中，该抗体的特异性免疫反应确定了该感染。

30.根据限定1-12中任一项所述的抗体的诊断制品，可选地包括具有标记的所述抗体，和/或具有标记的进一步诊断试剂。

31.由指定为#AB-24抗体识别的分离的构象表位。

32.一种免疫原，包括：

(a)根据限定31的表位；

(b)可选地，与(a)所述的表位非天然相关的表位；以及

(c)一载体。

33.根据限定32所述的免疫原，其中，所述载体是药学上可接受的载体，优选地包括缓冲剂和/或佐剂。

34.根据限定32或33所述的免疫原，为疫苗剂型，优选地，用于胃肠外用途。

35.根据限定32-34中任一项所述的免疫原用于医疗用途，通过给予有效量的所述免疫原来治疗对象，以保护对象免于S.aureus的感染，防止由所述感染引起的疾病状况或抑制S.aureus肺炎发生。

36.根据限定35所述的免疫原，其用于诱发保护性免疫应答。

37.编码限定1-12中任一项所述的抗体或限定求31所述的表位的分离的核酸。

通过参考下述实例能够得到更充分的理解上述说明。但是，这些的例子仅仅是代表本发明的一个或更多的实施例方法，而不应被理解为限制本发明范围。

实施例

实施例1重组毒素的产生

10种金黄色葡萄球菌毒素(Hla、LukF、LukD、LukS、LukE、HlgA、HlgC、HlgB、LukG和LukH)在E.coli(BL21,Rosetta或Tuner DE3)中重组产生(图1)。成熟蛋白的毒素基因(使用SignalP 4.1服务端确定；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)是为E.coli表达所优化的密码子，并基于公开的金黄色葡萄球菌菌株USA300_TCH1516、MRSA252和MSHR1314(SeqIDs 1-28，图9)的基因组序列通过基因合成产生。除了LukG和LukH外，所有毒素都以溶解的形式表达出来，其通过酶解作用(proteolitically)去除了N-端NusA/His₆标签。纯化通常包括三个层析步骤：1)IMAC(金属螯合层析)；2)阳离子交换或IMAC；以及3)体积排阻色谱。LukG和LukH以不带有标签的不可溶形式表达，这些蛋白从包涵体复性，并纯化；纯化由对LukH进行两步分子排阻层析，以及在pH 10.2-11.1时，对LukG进行一步阳离子交换和一步阴离子交换组成。

这些蛋白(通过SDS-PAGE)分析其纯度，(通过分子排阻)分析其单体状态，以及(通过圆二色光谱确定)分析它们的二级结构，如果有的话，与文献数据进行对照。所有蛋白都采用氨基反应试剂Sulfo-NHS-LC生物素来标记。

实施例2：筛选结合人类单克隆抗体的毒素

通过酵母菌表面展示文库筛选出结合抗体的毒素，酵母菌表面文库根据WO2009/036379A2、WO2012009568和WO2010105256建立。毒素分子以重组E.coli产生的蛋白表达，并用生物素标记。对所有毒素的高纯度和完整性进行测试，以及如实施例3所描述，通过对小鼠的毒素攻击，在体内和体外分析中进行功能性测试。

将工程改造以表达分异度(diversity)接近10^9-10的全长人IgG1抗体的酵母细胞库与不同浓度的生物素标记的毒素一起孵育。表达能结合到毒素的抗体的酵母细胞通过磁珠分选法，以及在多个连续的(不多于5个)筛选循环中采用链霉亲和素二级试剂的荧光活化细胞分选法来分离。随后，通过筛选的酵母克隆产生抗体，并由蛋白A亲和层析法纯化。单个可溶的mAbs与不同毒素的结合通过干涉法测量确定，其采用ForteBio Octet Red仪器(颇尔生命科学(Pall Life Sciences))；生物素化的抗原或抗体固定在传感器上，并分别(通常200nM)在溶液中测量抗体Fab片段或抗原的吸附和解离。基于测定的动力学参数(kon和koff)计算亲和力(Kd值)。

实施例3：鉴定能中和多种葡萄球菌外毒素的人mAbs。

首先，对12种具有独特CDR序列的结合mAbs的Hla在两种不同的体外分析中测试Hla的中和作用，其采用的是兔子血红细胞或人肺上皮细胞系A549。对于采用人肺上皮细胞(A549，HPACC#86012804)的毒素抑制分析试验，在试验前一天，将细胞胰蛋白酶化，并以每孔20000个细胞的密度铺在F12K培养基(Gibco，美国)的孔(96-孔半区荧光板，Greiner，奥地利)中，培养基中补充有10％的胎牛血清(FCS)和盘尼西林/链霉素。在分开的稀释板中，用补充有10％的胎牛血清(FCS)和盘尼西林/链霉素的F12K培养基(＝A549细胞分析培养基)将抗体进行梯度稀释，并与α-溶血素(Hla)混合，α-溶血素是从细菌培养基上清液纯化的，固定浓度3.03nM。在室温下预孵育1小时后，丢弃在附着A549细胞上的种子培养基，并替换成mAb-毒素混合物。使细胞在37℃+5％CO₂下中毒6小时，然后采用商业购买的试剂盒(Cell发光法细胞活力检测试剂盒；Promega，美国)，根据生产厂家的说明测定生存力。相对于空白对照计算生存力％。采用以下公式计算毒素活性的抑制％。抑制％＝[(仅毒素的生存力-抑制的活性)/(仅毒素的生存力)]×100。

对于兔子血红细胞溶血抑制作用，从新西兰白兔(Preclinics GmbH，德国)获得兔子EDTA-全血。用PBS w/o钙/镁(PAA Laboratories，奥地利)以1:1稀释血液，并在50ml的聚丙烯管中，通过使15ml稀释的血液在15ml LSM 1077(PAA Laboratories，奥地利)上分层来制备梯度。然后，在680×g下(室温，不制动)离心，通过抽吸移除血小板、血浆、PBMCs和聚蔗糖，并丢弃。在40ml PBS w/o钙/镁中洗涤剩余的RBC团(680×g下，室温，不制动离心)，最后在20ml PBS w/o钙/镁中重悬。在标准血细胞计数器中测定红细胞的完整性和细胞数。对于采用单克隆抗体的中和分析，在PBS中连续稀释抗体，并与α-溶血素混合，固定浓度为[12.12nM]。溶血分析在1小时的预孵育步骤后开始，以使抗体-毒素结合。将稀释在PBS w/o钙/镁中的5×10E7兔子血红细胞加入到每个孔中。采用以下公式计算毒素活性的抑制％。

抑制％＝[(仅毒素的溶血作用-抑制的活性)/(仅毒素的溶血作用)]×100。

在测试的浓度中，12个mAbs中的7个显示出中和活性，从强效力到弱中和效力(图2)。这7个抗体具有的亲和力Kd＝9到300nM(通过ForteBio测定[Pall Life Sciences])，而中和效力与亲和力高度相关。

这7个抗体的CDR序列用于产生亲和力成熟文库的第一系列，其再次采用Hla(较低浓度的随后用于天然文库筛选)审核，以选择更高亲和力的后代抗体。每一谱系中最高亲和力的后代进一步通过亲和力成熟的第二系列进行亲和力成熟。从7个谱系获得的42个mAbs具有不大于10000倍的亲和力和中和效力提升。达到亲和力测定极限的许多mAbs甚至具有高灵敏度，MSD方法采用Sector Imager 2400instrument(Meso Scale Discovery)。通常，将20pM的生物素化抗原与不同浓度的Fab或IgG在室温下孵育16小时，而未结合的抗原捕获在固定的IgG上；未结合的抗原与Fab或IgG的浓度曲线图给出了解离常数，Kd(Kd 4pM，图3)，它们中的大多数也达到了体外中和分析的理论极限，IC50为0.25，表达为mAb对毒素的比(1:4)(图4)。

实施例4确定Hla毒素选择mAbs的交叉中和效力的分析

对7个谱系的42个Hla mAbs针对双组分毒素的交叉反应性进行测试，显示了源自最弱的中和天然克隆的一个单独后代与Hla、HlgB和LukF的结合亲和力为皮摩尔，与LukD为个位数nM。图5。结合到了这些远亲毒素，得到的是对应双组分毒素HlgB-HlgC、HlgB-HlgA、LukSF(PVL)和LukED的高中和效力(图6)。

同样广泛交叉中和的mAb(#AB-24)采用Hla和F-组分交替筛选从酵母菌文库中鉴别出来。

如实施例3所描述，#7667谱系针对Hla的中和效力在A549细胞(图6A)和兔子血红细胞上测定。这一谱系的所有mAbs都能抑制α-溶血素活性。效力与成熟状态很好地相关。观察到天然克隆#7667具有最弱的中和活性，而克隆#9024、#AB-24、#9029和#9030具有最强的保护作用，它们采用亲和力成熟文库的第二系列产生。mAb#8268克隆是采用第一系列亲和力成熟文库成熟产生，其展示出中等的中和活性。

在生存力分析试验中，采用人类嗜中性粒细胞评估针对双组分毒素LukE-LukD、HlgB-HlgC和LukS-LukF的交叉中和活性(图6B-D)。为了这一目的，从新鲜的人全血分离出嗜中性粒细胞，或从红十字会(肝素化)获得，或通过静脉穿刺从正常的健康自愿者获得，保存在真空采血管(BD，美国)中。为了聚集红细胞，1份HetaSep溶液(Stem CellTechnologies，法国)加入到5份血液中，混合并在37℃中孵育，直至血浆/红细胞界面在总体积的大约50％处。小心地使富集白血球的血浆层在在两步Percoll梯度溶液(73％和63％的Percoll Plus在HBss中稀释，GE Healthcare)中分层，并在680×g下，室温离心30分钟，没有制动。通过抽吸移除后旋转形成的梯度的第一和第二层(主要是血清和单核细胞)。从第二浑浊层中收获嗜中性粒细胞，并在50ml HBSS(Gibco，美国)+10mM葡萄糖中洗涤两次。活细胞的数目用台盼蓝染色排除法在血细胞计数器中计数。描述的分离方法通常得到1-5×10E8个嗜中性粒细胞，生存率为50ml全血中≥95％。对于生存力分析试验，将细胞重悬在补充有10％胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺和盘尼西林/链霉素的RPMI 1640(PAALaboratories，奥地利)(＝嗜中性粒细胞培养基)中。在嗜中性粒细胞培养基中连续稀释单克隆抗体，并与固定浓度的毒素混合，其降低细胞的生存率≥95％[对于LukS-LukF和HlgC-HlgB，2.94nM；对于LukE-LukD，7.35nM]。生存力分析在1小时的预孵育步骤后开始，以使抗体-毒素结合。每孔中加入25000个细胞，在37℃孵育+5％CO₂下孵育4小时反应。随后，采用商业购买的试剂盒(Cell发光法细胞活力检测试剂盒；Promega，美国)，根据生产厂商的说明书来检测PMNs的生存力。相对于空白对照计算生存力％。采用以下公式计算毒素活性的抑制％：

抑制％＝[(仅毒素的生存力-抑制的活性)/(仅毒素的生存力)]×100。以下对照mAbs，包括：#8247(源自另外谱系(#7660)的Hla单特异性mAb)，#8207(LukE-LukD分析试验中的单特异性LukD mAb)，#8210(LukS-LukF分析试验中的单特异性LukF mAb)，#8182(HlgC-HlgB分析试验中的单特异性HlgB mAb)，以及#7335(所有分析试验中抵抗鸡卵溶菌酶产生的阴性对照mAb)。

虽然天然mAb#7667和采用第一系列亲和力成熟文库通过成熟产生的后代mAb#8268没有展示出针对任何同源双组分毒素的可检测到的中和活性，但是，采用第二系列亲和力成熟文库通过成熟产生的相应后代mAb#AB-24被发现是人嗜中性粒细胞上LukE-LukD、HlgC-HlgB和LukS-LukF的有效抑制剂(图6B-D)。虽然比得上在Hla中的中和活性，但是，采用第二系列亲和力成熟文库通过成熟产生的相同谱系的其他成熟的mAbs不能在这一分析试验中交叉中和所有三种双组分毒素。然而，发现#9029比#AB-24在LukE-LukD中和作用中，具有可比的效力。体外中和分析试验的结果与ForteBio kD测定相一致，其中，#AB-24展示出结合Hla×HlgB×LukD×LukF，以及发现#9029是Hla×LukD的结合剂。

实施例5：确定生物活性的分析试验

体外效力被证明是用于预测体内效力的。采用#AB-24mAbs治疗小鼠，非常好地保护而免于Hla或HlgAB毒素攻击的死亡。mAbs#AB-24的体内交叉中和效力在不同的老鼠模型中测试。在预备试验中，通过给予连续的稀度，并接着监控生存14天来确定纯目标毒素的最小致死浓度。在鼻内滴注Hla的情况下，发现最少致死浓度是0.32μg/鼠。接着，静脉注射不同剂量的HlgAB，确定(两种组分的)最少致死剂量为0.375μg。

基于这些结果，目的在于测试mAbs被动免疫的保护能力的攻击试验中，使用以下的攻击剂量：鼻内应用0.4μg Hla，以及对于HlgAB的每个组分，0.5μg静脉注射.

在毒素的致死攻击前，腹膜内采用mAb#AB-24进行被动免疫4小时(Hla攻击)或24小时(HlgAB攻击)。5只小鼠的组接受不同剂量的单独溶解在PBS中的mAbs。对照组仅接受PBS或接受最高剂量的同型匹配的非特异性mAb。用纯化的毒素攻击后，每天监控小鼠的致死率，监控7天。

图7A中，描述了Hla攻击试验的结果。在24小时内，对照小鼠死在毒素攻击下，然而，mAb#AB-24在100μg mAb/鼠的剂量下，反复地提供显著的保护作用(60-100％)。相同的抗体也保护小鼠免于致死HlaAB的攻击(图7B)，并在200和50μg/鼠剂量下分别救活80％和40％的小鼠。

这些实验证明了#AB-24对两种最重要的葡萄球菌细胞毒素的交叉保护效力，它们是结构上相关的，但是，仅在一级氨基酸序列水平相似程度不大(27％的氨基酸相同)。

实施例6：确定Hla mAbs的竞争性的分析试验

Hla mAbs之间的竞争性通过干扰量度法(Forte-Bio)进行研究。在通常的组合中，将Hla[5μg/ml在缓冲液中(PBS加0.1％BSA)]固定在链霉亲和素传感器上(Pall LifeSciences).然后，用一级抗体(或仅仅是缓冲液)处理传感器，随后用第二抗体(每个10μg/ml)处理，通常每个处理10分钟；(仅用缓冲液的情况下，结果是相当于第二抗体100％结合到Hla)。对于每个一级抗体，计算第二抗体结合的抑制百分数(图8)。

对于图8中展示的三种抗体，自抑制不同，从81％到91％，而不同抗体之间的抑制也不同，从30％到76％。为了在不同抗体之间细分，以及基于具有额外Hla抗体的数据，在本研究中设定抑制限值为80％。因此，认为能抑制80％的第二抗体的结合的任何抗体，是与所述第二抗体竞争的，然而，如果抑制降低到低于80％，该抗体则是不足以竞争的。

PCT

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仅供接收局使用

仅供国际局使用

Claims (21)

1.一种交叉中和的抗体，其包含至少一个结合到α-毒素(Hla)以及金黄色葡萄球菌的至少一种双组分毒素的多特异性结合位点，所述双组分毒素选自由HlgAB、LukSF、LukED和HlgCB组成的组合。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述结合位点结合到至少两种或至少三种双组分毒素。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体是全长单克隆抗体或其抗体片段，其包含至少一个整合所述结合位点的抗体域。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含指定为#AB-24的抗体的6个CDR序列，所述指定为#AB-24的抗体包括

(a)指定为#AB-24-LC的抗体轻链，编码序列包含在保藏号为DSM 26748的宿主细胞中；和

(b)指定为#AB-24-HC的抗体重链，编码序列包含在保藏号为DSM 26747的宿主细胞中。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包括

a)保藏号为DSM 26748中的宿主细胞产生的抗体轻链；和

b)保藏号为DSM 26747中的宿主细胞产生的抗体重链。

6.一种宿主细胞包括

(a)编码指定为#AB-24-LC的抗体轻链的表达盒，所述编码序列包含在保藏号为DSM26748的宿主细胞中；和

(b)编码指定为#AB-24-HC的抗体重链的表达盒，所述编码序列包含在保藏号为DSM26747的宿主细胞中。

7.产生权利要求1-5中任一项所述抗体的方法，其中，在产生所述抗体的条件下培养或保持根据权利要求6所述的宿主细胞。

8.一种鉴别候选保护性抗体的方法，其包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与表位结合进行评估，从而抑制指定为#AB-24的抗体与其表位结合，其中，在抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体，所述指定为#AB-24的抗体包括

(i)指定为#AB-24-LC的抗体轻链，编码序列包含在保藏号为DSM 26748的宿主细胞中；和

(ii)指定为#AB-24-HC的抗体重链，编码序列包含在保藏号为DSM 26747的宿主细胞中。

9.一种鉴别候选保护性抗体的方法，其包括：

(a)提供包含抗体或产生抗体的细胞的样品；以及

(b)对样品中的或样品产生的抗体与α-毒素和至少一种金黄色葡萄球菌双组分毒素的结合进行评估，其中，在抗体和毒素之间的阳性反应鉴定该抗体为保护性候选抗体。

10.一种产生根据权利要求1-5中任一项所述的抗体的方法，其包括：

(a)提供一根据权利要求8或9所述的鉴定方法确定的保护性候选抗体；以及

(b)产生一单克隆抗体，或人源化或人的保护性候选抗体，或它们的衍生物，其抑制保护性候选抗体与其表位结合。

11.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体在药物制备中的应用，所述药物用于治疗有金黄色葡萄球菌感染危险或患有金黄色葡萄球菌感染的对象，其中给予患者的有效量的该抗体以限制在对象中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病机理。

12.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体的药物制剂，所述药物制剂的剂型包括胃肠外或黏膜剂型。

13.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体在制备成诊断试剂盒的应用，所述诊断试剂盒用于体外检测任何的金黄色葡萄球菌感染。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述诊断试剂盒用于体外检测产生高毒的MRSA感染。

15.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体的诊断制品，包括具有标记的所述抗体，和/或具有标记的进一步诊断试剂。

16.根据权利要求2所述的抗体，其中所述结合位点结合到HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED中的任意两种或三种。

17.根据权利要求16所述的抗体，其中所述结合位点结合到HlgAB、HlgCB、LukSF和LukED。

18.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体结合到每种毒素的亲和力Kd小于10^-8M。

19.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体结合到每种毒素的亲和力Kd小于10^-9M。

20.根据权利要求12所述的抗体的药物制剂，包含一药学上可接受的载体或赋形剂。

21.根据权利要求13所述的抗体在制备成诊断试剂盒的应用，所述诊断试剂盒用于检测坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。