CN1163511C - 鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种鸡卵黄抗白细胞介素(IL-8)抗体IgY，是用下蛋母鸡作为生物反应器，用基因工程重组的白细胞介素-8免疫下蛋鸡，取出鸡卵黄，用重蒸馏水制备鸡卵黄匀浆，通过盐析方法沉淀鸡卵黄中的抗体，经离子交换层析，获得纯化的鸡卵黄抗IL-8抗体，该抗体具有中和IL-8活性的能力。鸡卵黄抗IL-8抗体可应用于制备治疗牛皮癣外用冷霜制剂，临床使用结果显效和有效率达76%，见效快，无副作用，使用方便。

Description

鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体、制备方法及其应用

本发明涉及抗体及抗体药物，特别是涉及鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体及由其制造的抗体药物。

所谓免疫是指外源抗原刺激引起动物个体状态改变的过程。动物对抗原刺激产生特异性反应称之为免疫应答，免疫应答的主要形式和结果之一是产生能与该免疫原(抗原)特异反应的抗体(林飞卿等，医学基础免疫学，1989，上海医科大学出版社)。

抗体分子是称作免疫球蛋白(Ig)的蛋白质分子。传统上，哺乳类动物是产生抗体的主要来源。然而，大多数哺乳动物的免疫球蛋白除了能和产生该抗体的免疫原反应之外，还都能和细菌或哺乳动物的Fc受体相结合，并与链球菌蛋白A和链球菌蛋白G相结合，特别是哺乳动物IgG能与人体类风湿因子发生反应。鉴于上述诸多非特异性结合和反应的存在，哺乳类动物抗体在临床诊断和治疗方面的应用均存在着各种干扰作用。

鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异。鸡的免疫球蛋白与哺乳动物的免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子所产生的抗体有更高的效价和亲和能力。此外，鸡的免疫球蛋白不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，链球菌蛋白A和链球菌蛋白G也不与鸡抗体(IgY)的Fc部份结合。在鸡中产生的抗体是对蛋白A或蛋白G专一性的，不是针对蛋白A/IgG或蛋白G/IgG的复合物。IgY也不与哺乳动物血液中的类风湿因子发生反应。因此，鸡免疫系统所产生的IgY对产生该抗体的免疫原具有较特异的反应，而较少与其他非特异分子的反应(Antal Rot et al.，J.Leukocyte Biology，59，1996January；Daniela Bruch-Gerharg et al.，J Exp.Med，184，2007 1996)。

母鸡抵御外界病原体的能力以抗体的形式转输到鸡蛋中。在鸡蛋中，抗体免疫球蛋白分子主要贮存在鸡卵黄中，鸡蛋清中抗体含量很低，(Anders Larsson et al.，Poultry Science，72，1807，1993)。因此，利用下蛋母鸡作为一个免疫反应器，将外源抗原蛋白注射给母鸡，所产生的特异针对外源蛋白抗原的抗体将被大量地输送到鸡卵黄中储存。鸡蛋是众所周知的人类常用食品和化妆品原料，无论内服或外用对人体没有任何生物毒性和不良作用。

因此，利用母鸡和外源抗原免疫的方法，可以从鸡卵黄中生产制备大量具有临床应用价值的抗体药物。

牛皮癣是一种皮肤的常见病多发病。在世界各国人群中的发病率约为1-2％，中国的牛皮癣病人约1千2百万以上。其发病的细胞和分子机理已在近几年中得到阐明。由于机体内在的遗传和外界的环境等综合因素，引起表皮角质化细胞过度增生而发生的皮肤疾病(Akita E.M.et al.，J.Food Science，57，629，1992)。

表皮角质化细胞在各种因素刺激下可诱导和产生多种细胞因子，特别是白细胞介素-8(IL-8)，IL-8是一种强烈的嗜中性白细胞化学趋向因子，能强力地募集和激活嗜中性白细胞。在外源或内源性的刺激下，多种细胞(包括单核细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞，嗜中性粒细胞，成纤维细胞，角质化细胞等)会分泌过量的白细胞介素-8，使IL-8在皮肤局部的浓度高于正常水平。IL-8就会和携带IL-8受体的细胞表面受体结合，激活这些细胞，引起过度地增生。同时，被激活的细胞又大量分泌IL-8，募集全身的嗜中性细胞汇集到皮肤病灶部位，浸润和损伤正常皮肤，产生大量皮屑脱落，故又称之为银屑病。

应用具有高特异性和中和活性的抗IL-8抗体，可以有效地中和及消除表皮中过量的IL-8，从而阻断或减少嗜中性白细胞的募集和浸润，达到治疗牛皮癣病灶，使表皮得以恢复正常的目的。

如前所述，由于鸡的免疫系统对于来自哺乳动物的蛋白或生物分子比哺乳动物本身的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子所产生的抗体有更高的效价和亲和能力。

因此，如何制得鸡卵黄抗IL-8抗体，并应用该抗体制造治疗牛皮癣的药物是个很有意义的工作。

本发明目的是提供一种鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体IgY。

本发明另一目的是提供鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体IgY的制备方法，是用基因工程重组白细胞介素-8免疫下蛋鸡，从鸡卵黄分离纯化制得。

本发明又一目的是提供鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体IgY的应用，用于制造治疗牛皮癣的药物。

本发明鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体是用下蛋鸡为生物反应器，以基因工程重组IL-8为免疫原，免疫下蛋鸡后，从鸡卵黄中分离纯化制得的抗体。

本发明鸡卵黄抗白细胞介素-8抗体IgY的制备方法如下：

1、用下蛋鸡为生物反应器，以基因工程重组IL-8为免疫原，多次免疫鸡，产生抗IL-8抗体。

基因工程重组IL-8是加拿大YES生物技术公司产品，纯度＞98％。用福氏佐剂配制的IL-8溶液多点皮下注射免疫下蛋鸡，每两周免疫一次，共五次，末次免疫后两天可收集鸡蛋，一个月后，再用IL-8作回忆刺激，加强鸡对外源免疫原的反应，继续收集鸡蛋。

2、从鸡卵黄分离纯化抗IL-8抗体IgY

从鸡蛋获取的卵黄，可冻存于-80℃冰箱中，长期备用，以供分批制备鸡卵黄抗IL-8抗体IgY。

卵黄用适量重蒸水搅成匀浆，4℃放置几小时后，离心分离获得上清液，上清液含包括鸡抗体的可溶性蛋白质。用盐析(19％硫酸钠)方法，沉淀鸡免疫球蛋白，沉淀重溶于重蒸水中，再用盐析(14％硫酸钠)方法沉淀鸡免疫球蛋白，溶于重蒸水后，用离子交换层析分离纯化得鸡卵黄抗IL-8抗体IgY。

纯化的抗IL-8抗体，在SDS-PAGE中显示符合IgY特征的59.5kd的重链分子和26kd的轻链分子条带。用免疫印迹方法证实，本发明抗IL-8抗体，只和IL-8分子显示免疫反应，和其他生长因子，细胞因子无免疫反应，说明鸡卵黄抗IL-8抗体的专一性和特异性。用细胞学方法测定其对IL-8的中和作用。在IL-8作用下，嗜中性白细胞被诱导产生明显迁移运动，而当加入纯化的鸡卵黄抗IL-8抗体后，因为其对IL-8的中和活性，而阻断了IL-8对嗜中性白细胞的化学趋向作用。因此鸡卵黄抗IL-8抗体可应用于制造治疗牛皮癣的抗IL-8抗体外用冷霜制剂。

冷霜制剂中治疗牛皮癣的有效药物成分是鸡卵黄抗IL-8抗体，辅助成份是冷霜原剂。两者的含量配比是每50克冷霜制剂中含有有效药物抗IL-8抗体量20mg。一般外用药物常用的各种冷霜原剂都能适用于本发明，下面的冷霜原剂的组成是本发明的一个实例，

冷霜原剂的成分为：三乙醇胺/甘油/硬脂酸/白凡士林/液体石蜡/单硬脂酸甘油酯/月桂醇硫酸钠/尼泊金乙酯/重蒸水。

在预先制备好的冷霜原剂中，按每500g冷霜制剂中加入200mg抗IL-8抗体的比例加入纯化的抗体，充分搅拌混匀，即成冷霜制剂，分装保存于4℃，长期备用。

应用本发明制备的鸡卵黄抗IL-8抗体配制成的治疗牛皮癣的外用冷霜制剂进行临床治疗效果观察，将抗IL-8抗体外用冷霜每天三次涂于牛皮癣患处皮肤，以药物使用一月内明显止痒，渗出液减少，皮屑减少，三个月后皮肤无皮屑，干燥光滑，无症状为显效。以药物使用一月后明显止痒，渗出液减少，三个月后皮肤不痒，皮屑明显减少，皮肤逐渐光滑，基本无明显症状为有效：在治疗牛皮癣患者25例中，显效为8例，有效为11例，无显著改变为6例，治疗结果显示有效率达76％。因此本发明抗IL-8抗体外用冷霜制剂具有见效快，无副作用，使用方便等特点。

本发明优点：

1、本发明鸡卵黄抗IL-8抗体是用下蛋鸡作为生物反应器制备抗体，比应用家兔、羊、马、牛等动物制备抗体具有明显的优越性。首先，鸡的饲养比上述动物简便，省力，经济。第二，鸡的抗体，大量贮存在鸡蛋内，用鸡蛋获取抗体比上述动物放血获取抗体更为安全，省力，易于保存。上述动物放血过多，造成动物死亡，放血过少，回收抗体量少。而且，上述动物放血次数也不能超过三次。第三，从鸡卵黄制备抗体产量高，纯度好。每只鸡蛋大约有蛋黄15ml，一只鸡在一星期内所产鸡蛋的卵黄内所含抗体量就相当于上述动物90-100ml血清或180-200ml全血所含的抗体量。免疫10只下蛋鸡可收集鸡蛋卵黄约6000ml，其抗体含量相当于从120只兔子免疫后从血清所得的抗体。因此，用下蛋鸡作为生物反应器制备鸡卵黄抗IL-8抗体是一个技术上科学、简便、成熟、有效，经济上十分有利的新途径。

2、鸡蛋是具有十分重要应用价值的食品和化妆品原料，已广泛添加于各类营养食品，保健或辅助治疗药物，美容或皮肤营养制剂和化妆品中，对人体和皮肤没有任何毒性和不良作用。所以从鸡卵黄中分离的抗IL-8抗体制备的冷霜制剂在有效地应用于牛皮癣治疗时，不会产生任何毒副作用或不良反应，具有特殊的有效性和安全性。

3、鸡免疫系统对哺乳动物蛋白或生物分子所产生的抗体，有更高的效价和亲和能力，同时又不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，不和链球菌蛋白A和蛋白G结合，也不和哺乳动物血液中的类风温因子发生反应。因此，鸡抗IL-8抗体对IL-8有更高的效价和特异性，对牛皮癣治疗具有更好疗效。

4、本发明从鸡卵黄分离纯化的方法是采用纯水稀释后，二步硫酸钠盐折，沉淀免疫球蛋白，最后作DEAE-纤维素离子交换层析，获得纯化的抗IL-8抗体，该方法简便，有效，经济。纯化的抗体保持高活性。

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1，用鸡作为生物反应器，免疫产生抗IL-8抗体

用下蛋鸡作为反应器，总共用7mg基因工程重组白细胞介素-8(是加拿大YES生物技术公司产品)作为免疫原，对10只鸡进行免疫。每只鸡用600微克IL-8分五次免疫，100微克IL-8作回忆刺激，以下是对一只下蛋鸡进行免疫的用量和操作：

第1天：200微克IL-8配在2ml福氏完全佐剂(CFA)中作皮下多点注射免疫；

第14天：100微克IL-8配在2ml不完全福氏佐剂(IFA)中作皮下多点注射；

第28天：同第14天；

第32天：同第14天；

第48天：同第14天；

第50-80天：每天收集鸡蛋，存放于4℃冰箱，备用；

第81天：100微克IL-8配在2ml不完全福氏佐剂(IFA)中，皮下多点注射作回忆刺激；

第81-100天：每天收集鸡蛋，总共收集鸡蛋418只，存放于4℃冰箱，备用。

实施例2.鸡卵黄抗IL-8抗体的纯化

每只鸡蛋大约有卵黄15ml，从实施例1中收集得的418只鸡蛋共得卵黄6000ml。将收集的6000ml卵黄分装，冻存于-80℃冰箱中，长期备用。以供分批制备鸡卵黄抗IL-8抗体IgY用。

取用卵黄400ml，用10倍体积的重蒸水搅成匀浆，置4℃冰箱6个小时，冷冻离心机10,000g离心30分钟，弃沉淀，上清液中缓慢加入硫酸钠使最终浓度达19％，混匀后离心收集沉淀，沉淀溶于重蒸水中，10,000g离心回收上清液，再缓缓加入硫酸钠到最终浓度14％，混匀后离心收集沉淀，沉淀溶于重蒸水中，作DEAE-纤维素离子交换分离和收集免疫球蛋白。从鸡卵黄分离纯化得免疫球蛋白IgY的产量为约10mg/ml卵黄，纯度可达～95％。

将纯化的鸡卵黄抗IL-8抗体2微克用变性样品缓冲液制成电泳样品作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，用考马斯亮兰染色，显示符合IgY特征的59.5kd免疫球蛋白的重链分子和26kd免疫球蛋白的轻链分子条带。

实施例3  鸡卵黄抗IL-8抗体免疫活性的鉴定

对多种细胞生长因子，细胞因子作下列免疫印迹测定：将白介素-8(IL-8)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGFα)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，颗粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-2(IL-2)，白介素-16(IL-16)作SDS-PAGE分离后，转移到硝纤薄膜上，常规封闭后和生物素标记的抗IL-8抗体反应，用ABC试剂显色，结果只有IL-8样品显示染色带，说明鸡卵黄抗IL-8抗体免疫反应的专一性和特异性。

实施例4  鸡卵黄抗IL-8抗体对IL-8的中和活性鉴定

IL-8是强烈的化学趋向因子，能有效地诱导嗜中性白细胞上IL-8受体介导的细胞迁移运动。本例是在细胞培养中加入IL-8 10ng/ml的同时，加入不同量的鸡卵黄抗IL-8抗体，结果证明鸡卵黄抗IL-8抗体具有明显阻断IL-8诱导靶细胞迁移的活性，如表1所示。作为对照，加入其他非相关抗体，不显示任何中和IL-8活性的作用。

      表1 鸡卵黄抗IL-8抗体中和阻断IL-8的化学趋向活性

IL-8	鸡卵黄抗IL-8抗体	细胞迁移运动相对值(％)
					实验1	实验2	实验3
		10ng/ml	0	100				100	100
10ng/ml	5μg/ml				49.9	40.3	47.1
		10ng/ml	50μg/ml	35.7				42.7	31.6
10ng/ml	500μg/ml				-4	11	2.8

实施例5  用鸡卵黄抗IL-8抗体配制治疗牛皮癣的外用冷霜制剂

(1)将实施例2所得的4000mg纯化的鸡卵黄抗IL-8抗体用PBS(磷酸盐缓冲的生理溶液)稀释到浓度为20mg/ml，得共约200ml，并加入0.1％体积的防腐防霉剂Cy-1(江苏太仓第一医药助剂厂产品)。

(2)冷霜原剂制备

三乙醇胺                      0.03kg

甘油                          1kg

硬脂酸                        1.2kg

白凡士林                      0.5kg

液体石腊                      1.5kg

单硬脂酸甘油酯                0.6kg

月桂醇硫酸钠                  0.01kg

尼泊金乙酯                    0.005kg

重蒸馏水                      9.8kg

将上述组份搅拌混匀，成冷霜原剂；

(3)抗IL-8抗体冷霜制剂制备

将上述约200ml的抗IL-8抗体加入9.8kg的冷缩原剂中，搅拌均匀制成10kg的抗IL-8抗体外用冷霜制剂，以20g装成一盒，可制造500盒治疗牛皮癣用抗IL-8抗体外用冷霜。

实施例6  鸡卵黄抗IL-8抗体外用冷霜制剂治疗牛皮癣临床病例

一女姓病人，48岁，患牛皮癣三十几年，全身皮肤广布性多处病灶，呈浸润漫延趋势，奇痒，多种方法治疗无效。使用鸡卵黄抗IL-8抗体制造的冷霜涂搽一周后，止痒，渗出液逐渐停止，皮肤色彩变淡，渐渐干燥，光滑，一月后患处皮肤光滑，无皮屑。

实施例7  鸡卵黄抗IL-8抗体外用冷霜制剂治疗牛皮癣临床病例

一男姓病人，52岁，头面部、颈部和上肢臂部多处牛皮癣病灶十几年，病灶部位和面积逐渐增多，扩大，服用中西药多年未见好转。使用鸡卵黄抗IL-8抗体制造的冷霜后，症状明显改善，皮肤不痒，皮屑减少，继续使用两个月症状消失，皮肤不痒也没有皮屑，皮肤逐渐变为光滑。

Claims (6)

1、一种抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体，其特征在于它是用基因工程重组制备的白细胞介素-8免疫下蛋鸡，然后从鸡卵黄中分离纯化得到的，该抗体能够中和白细胞介素-8的趋化活性。

2、如权利要求1所述的抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体，其特征在于，在抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体与白细胞介素-8比例为50000∶1-500∶1时能有效地抑制白细胞介素-8对靶细胞的趋化活性。

3、权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体在制备用于治疗与白细胞介素-8过量表达有关的炎症性皮肤疾病药物中的用途。

4、如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的炎症性皮肤疾病为银屑病。

5、一种包括权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体和医用基质的外用药剂。

6、如权利要求5所述的外用药剂，其特征在于每50g所述医用基质中含有20mg所述的抗白细胞介素-8鸡卵黄抗体。