JP2018008949A - 新規モジュレーターと使用の方法 - Google Patents

新規モジュレーターと使用の方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2018008949A
JP2018008949A JP2017130334A JP2017130334A JP2018008949A JP 2018008949 A JP2018008949 A JP 2018008949A JP 2017130334 A JP2017130334 A JP 2017130334A JP 2017130334 A JP2017130334 A JP 2017130334A JP 2018008949 A JP2018008949 A JP 2018008949A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
efna
cells
tumor
modulator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017130334A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018008949A5 (ja
JP6491701B2 (ja
Inventor
ハンプル，ヨハネス
Hampl Johannes
ディラ，スコット・ジェイ
J Dylla Scott
フォード，オリット
Foord Orit
スタル，ロバート・エイ
A Stull Robert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AbbVie Stemcentrx LLC
Original Assignee
Stemcentrx inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2011/050451 external-priority patent/WO2012031280A2/en
Application filed by Stemcentrx inc filed Critical Stemcentrx inc
Publication of JP2018008949A publication Critical patent/JP2018008949A/ja
Publication of JP2018008949A5 publication Critical patent/JP2018008949A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6491701B2 publication Critical patent/JP6491701B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02022—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2) rRNA N-glycosylase (3.2.2.22)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

【課題】過剰増殖性障害とその拡張、再発（recurrence）、再燃（relapse）、又は転移を予防、治療、又は改善，新規組成物の提供。
【解決手段】新生物障害の治療又は予防のためのエフリンＡリガンド（ＥＦＮＡ）モジュレーター（抗ＥＦＮＡ抗体及び融合構築体が含まれる）。腫瘍始原細胞頻度の低下を含んでなる、悪性腫瘍の免疫療法的治療への、そのようなＥＦＮＡモジュレーターの使用。
【選択図】なし

Description

相互参照される特許出願
本出願は、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：６１／４２１，１５７（２０１０年１２月８日出願）及び特許協力条約（ＰＣＴ）番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５０４５１（２０１１年９月２日出願）に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂよりＡＳＣＩＩ形式で提出されて、その全体において参照により本明細書に組み込まれる「配列表」を含有する。２０１１年１１月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１２００ＰＣＴ．ｔｘｔと指定されて、サイズは８０，１０２バイトである。
技術分野
本出願は、新規組成物と、過剰増殖性障害とその拡張、再発（recurrence）、再燃（relapse）、又は転移を予防、治療、又は改善することにおけるそれらの使用の方法に概し
て関する。広い側面において、本発明は、新生物障害の治療又は予防のためのエフリンＡリガンド（ＥＦＮＡ）モジュレーター（抗ＥＦＮＡ抗体及び融合構築体が含まれる）の使用に関する。特に、本発明の好ましい態様は、腫瘍始原細胞頻度の低下を含んでなる、悪性腫瘍の免疫療法的治療への、そのようなＥＦＮＡモジュレーターの使用を提供する。
幹細胞及び前駆細胞の分化と細胞増殖は、器官形成の間の組織成長とすべての生存生物の生涯の間でのほとんどの組織の細胞の置換及び修復とを支援するように協奏的に作用する、正常な進行プロセスである。分化と増殖の決定は、多くの場合、細胞運命の決定と組織構造とを維持するように均衡している数多くの因子及びシグナルによって制御される。正常な組織構造は、通常、細胞分裂と組織成熟化とを調節する微小環境の合図へ応答する細胞によって維持される。従って、細胞の増殖及び分化が正常に起こるのは、損傷を受けた細胞又は瀕死の細胞の置換のために、又は成長のために必要な場合だけである。残念ながら、例えば、様々なシグナル伝達性化学物質の過少又は過剰、改変した微小環境の存在、遺伝子の突然変異、又はこれらの何らかの組合せが含まれる無数の要因より、細胞の増殖及び／又は分化の破綻が生じ得る。正常な細胞の増殖及び／又は分化が妨害されるか又は何らかの様式で破綻すると、それは、癌のような過剰増殖性障害が含まれる様々な疾患又は障害をもたらす可能性がある。
癌への従来の治療法には、化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法（例、生物学的応答調節物質、ワクチン、又は標的化治療剤）、又はこれらの組合せが含まれる。悲しむべきことに、このような従来の治療法に対して、ずっと多くの癌が非応答性であるか又はほとんど応答せず、患者には治療選択肢がほとんど残っていない。例えば、ある患者では、ある種の癌が遺伝子変異を示して、選択された療法が一般には有効であるにも拘らず、それらを非応答性にする。さらに、癌の種類によっては、外科手術のようないくつかの利用可能な療法が有効な代替法でない場合もある。現行の標準的な治療薬剤に内在する限界が特に明らかになるのは、すでにいくつかの治療法を経験してその後で癌が再燃した患者への治療を試みるときである。そのような症例では、失敗した療法レジメンとそれにより生じる患者の悪化が難治性の腫瘍の原因となる場合があり、その腫瘍は、最終的に治癒不能であることが明らかとなるより進行性の疾患として多くの場合現れる。ここ数年にわたって癌の診断及び治療には多大な改善があったものの、既存の療法では再燃、腫瘍の再発
及び転移を防ぐことができないために、多くの固形腫瘍で全生存率はほとんど変化していない。従って、より標的化されて強力な療法を開発することが依然として挑戦課題なのである。
１つの有望な研究領域は、多くの癌の根底にあるように思われる腫瘍原性の「種」細胞を狙撃する標的化治療剤の使用に関連する。そのために、ほとんどの固形組織は、その組織の大多数を含む分化細胞種を産生する、成体の組織常在性の幹細胞集団を含有することが今日知られている。これらの組織に生じる腫瘍は、同様に、幹細胞からも発生する細胞の異種集団からなるが、それらの全体的な増殖性及び組織化は著しく異なる。腫瘍細胞の大多数には限られた増殖能力しかないことがますます認知されているが、癌細胞の少数集団（通常、癌幹細胞（cancer stem cell）又はＣＳＣとして知られる）は、広汎に自己再生する独占的な能力を有しており、それにより固有の腫瘍再始動能を可能にしている。より具体的には、この癌幹細胞仮説は、それぞれの腫瘍の内部に、無限の自己再生が可能であって、腫瘍前駆細胞とその後の最終分化腫瘍細胞への分化の結果としてその複製能力が進行的に制限される腫瘍細胞を産生することが可能である別個の細胞（即ち、ＣＳＣ）の亜集団が（ほぼ０．１〜１０％）存在することを提唱する。
近年、これらのＣＳＣ（腫瘍永続化細胞（tumor perpetuating cell）又はＴＰＣとし
ても知られる）が従来の化学療法剤又は放射線に対してより抵抗性であって、それにより標準的な臨床治療法の後にも存続して、後に難治性腫瘍、続発性腫瘍の増殖を促して転移を助長する可能性があることがより明白になっている。さらに、ますます増える証拠は、器官形成及び／又は正常な組織常在型幹細胞の自己再生を調節する経路がＣＳＣでは調節解除又は改変されていて、自己再生する癌細胞の不断の拡張と腫瘍形成がもたらされることを示唆する。一般論としては、Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087；及びDalerba et. al, 2007, PMID: 17548814 を参照のこと（このそれぞれは、その全体において参照
により本明細書に組み込まれる）。このように、従来の治療法だけでなくより最近の標的化治療法の有効性も、これらの多様な治療法に直面しても癌を永続化することが可能である抵抗性癌細胞の存在及び／又は出現によって制限されているようである。Huff et. al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) 及び Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)（このそれぞれは、その全体において参照により
本明細書に組み込まれる）。このような観察事実は、従来の腫瘍減量剤（debulking agent）では、固形腫瘍に罹患している場合の患者生存を実質的に高めることが常にできない
ことによって、そして腫瘍が増殖、再発、及び転移する方法についてのますます洗練された理解が進展するにつれて確実になっている。従って、新生物障害を治療するための最新の戦略では、腫瘍再発、転移、又は患者再燃の可能性を減らすように、腫瘍永続化細胞を消失させる、枯渇する、沈静化する、又はその分化を促進することの重要性が認められてきた。
そのような戦略を開発するための努力では、ヒトの原発性固形腫瘍標本を免疫不全マウスに排他的に移植して継代する、非従来的異種移植片（ＮＴＸ）モデルに関連する最近の研究が取り込まれている。数多くの癌において、そのような技術により、異種な腫瘍を産生してその増殖を無限に促進する独自の能力がある細胞の亜集団の存在が確かめられている。先に仮定されたように、ＮＴＸモデルでの研究は、同定された腫瘍細胞のＣＳＣ亜集団が化学療法や放射線のような腫瘍減量レジメン（debulking regimen）に対してより抵
抗性であるらしいことが確認され、臨床応答率と全生存率の間の不一致を潜在的に説明している。さらに、ＣＳＣ研究におけるＮＴＸモデルの利用は、腫瘍の再発及び転移に重大な影響を及ぼすことによって患者生存率を改善するＣＳＣ標的化療法をもたらし得る医薬候補物質の医薬探索及び前臨床評価における根本的な変革の火付けになってきた。進展が見られた一方で、原発性及び／又は異種移植片腫瘍組織を取り扱うことに付随する固有の技術上の難題は、ＣＳＣの同一性及び分化能を特徴付けるための実験基盤の不足と相俟っ
て、重大な挑戦課題を提起する。それで、癌幹細胞に選択的に標的指向して、過剰増殖性障害の治療、予防、及び／又は管理に使用し得る、診断、予防、又は治療用の化合物又は方法を開発するという実質的なニーズが依然として存在するのである。
本発明は、上記及び他の目的のために、広義には、ＥＦＮＡ関連障害（例、過剰増殖性障害又は新生物障害）の治療に使用し得る方法、化合物、組成物、及び製造品へ向けられる。そのために、本発明は、腫瘍細胞又は癌幹細胞に効果的に標的指向して、多種多様な悪性腫瘍に罹患している患者を治療するために使用し得る、新規ＥＦＮＡ（又はエフリンＡリガンド）モジュレーターを提供する。本明細書においてより詳しく考察されるように、現在、６種のエフリンＡリガンド（即ち、ＥＦＮＡ１〜６）が知られていて、開示モジュレーターは、いずれか１種の、又は１種より多いエフリンＡリガンドを含むか又はそれと会合する可能性がある。さらに、ある態様において、開示されるＥＦＮＡモジュレーターは、ＥＦＮＡポリペプチド、その受容体又はその遺伝子を認識する、それと競合する、それに作動する、それと拮抗する、それと相互作用する、結合する、又は会合して、１以上の生理学的経路に対するＥＦＮＡタンパク質の影響を調節する、調整する、改変させる、変化させる、又は修飾するどの分子も含んでよい。このように、広義において、本発明は、単離（された）ＥＦＮＡモジュレーターへ向けられる。好ましい態様において、本発明は、より具体的には、単離ＥＦＮＡ１モジュレーター又は単離ＥＦＮＡ４モジュレーター（即ち、少なくともＥＦＮＡ１又はＥＦＮＡ４を含むか又はそれと会合するモジュレーター）へ向けられる。さらに、下記に広汎に考察されるように、そのようなモジュレーターは、医薬組成物を提供するために使用し得る。
本発明の選択された態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、エフリンＡリガンドそれ自体又はその断片を、単離型でも、他の部分との融合型又は会合型（例、Ｆｃ−ＥＦＮＡ、ＰＥＧ−ＥＦＮＡ、又は標的化部分と会合したＥＦＮＡ）でも含んでよい。他の選択された態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、ＥＦＮＡアンタゴニストを含んでよく、それは、本出願の目的のためには、ＥＦＮＡを認識する、それと競合する、相互作用する、結合する、又は会合して、腫瘍始原細胞が含まれる新生物細胞を中和する、消失させる、低下させる、増感させる、再プログラム化する、その増殖を阻害又は制御する如何なる構築体又は化合物も意味すると理解される。好ましい態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、新生物細胞を増やす、維持する、拡大する、増殖させる、又は他の方法でその生存、再発、再生、及び／又は転移を促進する腫瘍始原細胞の能力を沈静化する、中和する、低下させる、減少させる、枯渇する、緩和する、減衰させる、再プログラム化する、消失させる、又は他の方法で阻害することが意外にも見出された、抗ＥＦＮＡ抗体又はその断片若しくは誘導体を含む。特に好ましい態様において、この抗体又は免疫反応性断片は、１以上の抗癌剤と会合しても、それへコンジュゲートしてもよい。
１つの態様において、当該ＥＦＮＡモジュレーターは、ヒト化抗体を含んでよく、ここで前記抗体は、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、及び配列番号１６１からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、及び配列番号１６３からなる群より選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、本発明は、ｈＳＣ４．５、ｈＳＣ４．１５、ｈＳＣ４．２２、及びｈＳＣ４．４７からなる群より選択されるヒト化抗体と医薬的に許容される担体を含んでなる組成物の形態であろう。別の好ましい態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、図面７Ａ（配列番号８〜５９及び７０〜９５）由来の１以上のＣＤＲを含む抗体を含んでよい。好ましくは、図面７Ａ由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる抗体は、ヒト化抗体を含むであろう。
ある他の態様において、本発明は、被検者への投与時に腫瘍始原細胞の頻度を低下させ
るＥＦＮＡモジュレーターを含む。好ましくは、頻度の低下は、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される。特に好ましい態様において、そのような分析は、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を
使用して実施してよい。あるいは、限界希釈分析は、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件（colony supporting condition）中への限界希釈沈着（limiting dilution deposition）を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して実施してよい。いずれ
の場合でも、頻度の低下の分析、計算、又は定量は、好ましくは、正確な数的処理を提供するポアソン分布統計の使用を含むであろう。そのような定量法が好ましい一方で、望まれる数値を提供するには、フローサイトメトリー又は免疫組織化学のような、他のさほど労働集約的ではない方法論も使用してよく、従って、それも本発明の範囲内にあるものと明白に考慮されると理解されよう。そのような場合、頻度の低下は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析又は免疫組織化学検出を使用して決定してよい。
そのように、別の好ましい態様において、本発明は、治療有効量のＥＦＮＡモジュレーターをその必要な被検者へ投与することによって腫瘍始原細胞の頻度を低下させることを含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害を治療する方法を含む。ここでも、腫瘍始原細胞頻度の低下は、好ましくは、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定されるであろう。
この点に関して言えば、本発明は、少なくとも一部は、様々な新生物の病因に関与している腫瘍永続化細胞（即ち、癌幹細胞）とＥＦＮＡポリペプチド（そして特に、下記に考察するようなＥＦＮＡ４）が会合するという発見に基づくものと認識されるであろう。より具体的には、本出願は、意外にも、様々な例示のＥＦＮＡモジュレーターの投与が腫瘍始原細胞による腫瘍形成性のシグナル伝達に媒介する、それを低下させる、阻害する、又は消失させる（即ち、腫瘍始原細胞の頻度を低下させる）ことができることを証明する。この低下したシグナル伝達は、腫瘍始原細胞の低下、消失、再プログラム化、又は沈静化によっても、又は腫瘍細胞形態を変化させること（例、分化誘導、ニッチ破壊）によっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持、拡張、及び／又は転移及び再発を阻害することによるＥＦＮＡ関連障害のより有効な治療を次々に可能にする。他の態様において、開示モジュレーターは、腫瘍増殖を制限又は束縛し得るＥＦＮＡ媒介性シグナル伝達を促進する、支援する、又は他の方法で増強する場合がある。他の態様において、開示モジュレーターは、腫瘍増殖を促し得るＥＦＮＡ媒介性シグナル伝達に干渉する、それを抑制する、又は他の方法で遅らせる場合がある。さらに、以下でより詳しく考察するように、ＥＦＮＡポリペプチドは、インテグリンと細胞骨格再配列を介して細胞間の付着力と反発力を産生することに関与する。本明細書に記載の新規ＥＦＮＡモジュレーターを使用する、そのような細胞間の相互作用における介入は、それによって、相加効果又は相乗効果をもたらす１より多い機序（即ち、腫瘍始原細胞の低下と細胞付着の破綻）により障害を改善する場合がある。なお他の好ましい態様は、エフリンＡリガンドの細胞内在化を利用して、モジュレーター媒介性の抗癌剤を送達する場合がある。この点に関して言えば、本発明は、どの特別な作用機序にも制限されず、むしろＥＦＮＡ関連障害（様々な新生物が含まれる）を治療するための開示モジュレーターの広汎な使用が含まれると理解されよう。
このように、本発明の別の好ましい態様は、ＥＦＮＡ関連障害を治療することの必要な被検者へＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記被検者においてそれを治療する方法を含む。特に好ましい態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、抗癌剤と会合（例えば、コンジュゲート）している。さらに、本発明の有益な側面（あらゆる細胞の付着破綻と付帯的な利益が含まれる）は、被検者の腫瘍組織が正常隣接組織と比較して上昇レベルのＥＦＮＡを明示しても、低下又は抑圧レベルのＥＦＮＡを明示しても、達成され得る。
上記に述べて、下記により詳しく考察するように、現在、６種のエフリンＡリガンド（即ち、ＥＦＮＡ１〜６）が知られている。本発明に従えば、開示モジュレーターは、単一のエフリンＡリガンド（例、ＥＦＮＡ４）、エフリンＡリガンドの亜集合（例、ＥＦＮＡ４及びＥＦＮＡ１）、又は全６種のエフリンＡリガンドと反応するように、産生、作製、及び／又は選択してよいことが理解されるであろう。より具体的には、本明細書に記載して、以下の「実施例」で説明するように、抗体のような好ましいモジュレーターは、単一のエフリンＡリガンド上で発現されるドメイン又はエピトープと、又は多数又はすべてのＥＦＮＡポリペプチド（例、ＥＦＮＡ１及び４、又はＥＦＮＡ３及び４）にわたって（少なくともある程度は）保存されて提示されているエピトープと反応又は結合するように産生されて選択され得る。このことが本発明に関して重要であるのは、下記の実施例１８に示すように、ＴＩＣでは、あるエフリンＡリガンド（複数）が選好的に発現されることが判明して、腫瘍形成細胞頻度の選択的な低下、及び／又は癌幹細胞集団の枯渇をもたらす、特に有効な療法上の標的として組合せにおいて役立つ場合があるからである。
故に、選択される態様において、本発明は、２以上のエフリンＡリガンドと免疫特異的に会合する汎ＥＦＮＡモジュレーターを含む。このような態様において、選択されるモジュレーターは、特別なリガンド（例、ＥＦＮＡ４）での免疫化により産生されて、様々な被検リガンドと大なり小なりの度合いで会合又は交差反応し得る。従って、なお他の態様において、本発明は、治療有効量の汎ＥＦＮＡモジュレーターを投与することを含んでなる、その必要な被検者を治療する方法を含む。なお他の態様は、１以上のエフリンＡリガンドと免疫特異的に会合するＥＦＮＡモジュレーターの治療有効量を投与することを含んでなる、その必要な被検者を治療する方法を含む。
従って、なお他の態様において、本発明は、汎ＥＦＮＡモジュレーターを含むであろう。なお他の態様において、本発明は、ＥＦＮＡ関連障害を治療することの必要な被検者へ汎ＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記被検者においてそれを治療する方法を含むであろう。
当然ながら、開示されるＥＦＮＡモジュレーターは、単一のエフリンＡリガンド（例、ＥＦＮＡ４）と選好的に反応又は会合して、他のエフリンＡリガンドとの会合をほとんど又は全く示さないように産生、作製、及び／又は選択され得ると理解されよう。従って、本発明の他の態様は、選択されたエフリンＡリガンドと免疫特異的に会合して、他のあらゆるエフリンＡリガンドとの会合をほとんど又は全く示さないＥＦＮＡモジュレーターへ向けられる。この点に関して言えば、本明細書に開示される好ましい態様は、ＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害を治療することの必要な被検者においてそれを治療する方法を含み、ここで該ＥＦＮＡモジュレーターは、選択されたエフリンＡリガンドと免疫特異的に会合して、あらゆる他のエフリンＡリガンドとは実質的に非反応性である。さらに、このようなモジュレーターを産生、作製、及び選択する方法は、本発明の範囲内にある。
本発明の他の面は、腫瘍始原細胞を沈静化する一方で同時に細胞付着相互作用を潜在的に妨害する、開示モジュレーターの能力を利用する。このような多重活性ＥＦＮＡモジュレーター（例、ＥＦＮＡアンタゴニスト）は、標準治療の抗癌剤又は腫瘍減量剤と組み合わせて使用されるときに特に有効であることが判明するかもしれない。加えて、２以上のＥＦＮＡアンタゴニスト（例、エフリンＡリガンド上の２つの別々のエピトープへ特異的に結合するか又は別々のリガンドと会合する抗体）を、本教示に従って組み合わせて使用してよい。さらに、下記にやや詳しく考察するように、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、コンジュゲート状態でも非コンジュゲート状態でも使用してよく、多様な化学品又は生物学的な抗癌剤との組合せにおいて増感剤として使用してもよい。
このように、本発明の別の好ましい態様は、ＥＦＮＡモジュレーターを被検者へ投与する工程を含んでなる、抗癌剤での治療のために前記被検者において腫瘍を増感させる方法を含む。本発明の特に好ましい側面において、ＥＦＮＡモジュレーターは、in vitro 又
は in vivo の限界希釈分析を使用して決定されるように、腫瘍始原細胞頻度の低下を特
異的にもたらして、それによって、同時に又はその後に生じる腫瘍減量のために腫瘍を増感させる。
同様に、本発明の化合物は、様々な生理学的機序を介して治療利益を発揮し得るので、本発明はまた、ある細胞プロセスを利用するように特異的に作製される、選択されたエフェクター又はモジュレーターへ向けられる。例えば，ある態様において、好ましいモジュレーターは、腫瘍始原細胞の表面の上又は近くでＥＦＮＡと会合して被検者の免疫応答を刺激するように設計され得る。他の態様において、モジュレーターは、インテグリンと細胞骨格との再配列を介した細胞間の付着力及び反発力に影響を及ぼし得る、エフリンＡのリガンド活性とエフリン受容体との相互作用を中和するエピトープへ指向される抗体を含んでよい。なお他の態様において、開示モジュレーターは、ＥＦＮＡ会合細胞を枯渇するか又は消失させることによって作用し得る。このように、本発明がある特別な作用形式に制限されず、むしろ本発明には、所望の結果を達成するあらゆる方法又はＥＦＮＡモジュレーターが含まれると理解することが重要である。
このような枠組み内で、開示される態様の好ましい態様は、少なくとも１つの中和性ＥＦＮＡモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法へ向けられる。
他の態様は、少なくとも１つの枯渇性ＥＦＮＡモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害に罹患している被検者を治療する方法へ向けられる。関連した方法は、ＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、ＥＦＮＡ会合細胞を枯渇することの必要な被検者においてそれを枯渇することへ向けられる。
なお別の態様において、本発明は、腫瘍量の少なくとも一部を取り除くように設計された初期手順（例、化学療法、放射線、又は外科手術）に続く時間帯にわたって、開示されるエフェクター又はモジュレーターが投与される、維持療法の方法を提供する。このような療法レジメンは、数週の期間、数ヶ月の期間、又は数年の期間にもわたって投与してよく、ここでＥＦＮＡモジュレーターは、転移及び／又は腫瘍再発を阻むように予防的に作用し得る。なお他の態様において、開示モジュレーターは、転移を防ぐか又は遅らせるために、既知の腫瘍減量レジメンと連携して投与してよい。
上記に考察した療法上の使用にとどまらず、本発明のモジュレーターは、ＥＦＮＡ関連障害、及び、特に過剰増殖性障害を診断するために使用し得ることも理解されよう。いくつかの態様において、該モジュレーターは、被検者へ投与して、in vivo で検出又はモニターされ得る。当業者は、このようなモジュレーターを、下記に開示するようなマーカー又はレポーターで標識するか又はそれと会合させて、数多くの標準技術（例、ＭＲＩ又はＣＡＴスキャン）のいずれかを使用して検出し得ることを理解されよう。他の例において、モジュレーターは、当該技術分野で認められた手順を使用する in vitro 診断の場で使用してよい。このように、好ましい態様は、過剰増殖性障害を診断することの必要な被検者においてそれを診断する方法を含み、該方法は：
ａ．前記被検者より組織試料を入手する工程；
ｂ．該組織試料を少なくとも１つのＥＦＮＡモジュレーターと接触させる工程；及び
ｃ．該試料と会合したＥＦＮＡモジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる。
このような方法は、本出願と併せて容易に理解し得て、自動プレートリーダー、専用レポーター系、等のような一般に利用可能な市販技術を使用して、容易に実施し得る。選択された態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、試料中に存在する腫瘍永続化細胞と会合する。他の好ましい態様において、検出又は定量の工程は、腫瘍始原細胞頻度の低下とその検出を含むであろう。さらに、限界希釈分析は、上記においてすでに述べたように実施してよくて、好ましくは、頻度の低下に関する正確な数的処理をもたらすために、ポアソン分布統計の使用を利用する。
同じように、本発明はまた、癌のようなＥＦＮＡ関連障害の診断及びモニタリングに有用であるキットを提供する。このために、本発明は、好ましくは、ＥＦＮＡモジュレーターを含んでなる容器（receptacle）とＥＦＮＡ関連障害を治療又は診断するのに前記ＥＦＮＡモジュレーターを使用するための指示物（instructional materials）とを含んでな
る、ＥＦＮＡ関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品を提供する。
本発明の他の好ましい態様はまた、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又はレーザー媒介分画法のような方法を介して腫瘍始原細胞の集団又は亜集団を同定、単離、分画、又は濃縮するのに有用な道具としての開示モジュレーターの特性を利用する。
このように、本発明の別の好ましい態様は、腫瘍始原細胞をＥＦＮＡモジュレーターと接触させる工程を含んでなる、前記腫瘍始原細胞の集団を同定、単離、分画、又は濃縮する方法へ向けられる。
上述のことは、概要であるので、必要上、簡略化、一般化、及び詳細の省略を含有する；従って、当業者は、この概要が説明にすぎず、限定的であることを決して企図しないと理解されよう。本明細書に記載する方法、組成物、及び／又はデバイスの他の側面、特徴、及び利点、及び／又は他の主題は、本明細書で説明する教示において明らかになろう。この概要を提供するのは、選択される概念を単純化された形式で紹介するためであって、それについては「発明を実施するための形態」において以下でさらに記載する。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴又は本質的な特徴を特定することを企図するものでも、特許請求される主題の範囲を決定するときの一助として使用することを企図するものでもない。
図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ４をコードする核酸配列（配列番号１）、対応するヒトＥＦＮＡ４アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号２）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ４ａ、ｂ、及びｃアイソフォームの配列（配列番号２〜４）のアラインメントを図示し、一方、図面１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ１をコードする核酸配列（配列番号５）、対応するヒトＥＦＮＡ１アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号６）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ１ａ及びｂアイソフォームの配列（配列番号６及び７）のアラインメントを示す； 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ４をコードする核酸配列（配列番号１）、対応するヒトＥＦＮＡ４アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号２）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ４ａ、ｂ、及びｃアイソフォームの配列（配列番号２〜４）のアラインメントを図示し、一方、図面１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ１をコードする核酸配列（配列番号５）、対応するヒトＥＦＮＡ１アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号６）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ１ａ及びｂアイソフォームの配列（配列番号６及び７）のアラインメントを示す； 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ４をコードする核酸配列（配列番号１）、対応するヒトＥＦＮＡ４アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号２）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ４ａ、ｂ、及びｃアイソフォームの配列（配列番号２〜４）のアラインメントを図示し、一方、図面１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ１をコードする核酸配列（配列番号５）、対応するヒトＥＦＮＡ１アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号６）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ１ａ及びｂアイソフォームの配列（配列番号６及び７）のアラインメントを示す； 図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ４をコードする核酸配列（配列番号１）、対応するヒトＥＦＮＡ４アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号２）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ４ａ、ｂ、及びｃアイソフォームの配列（配列番号２〜４）のアラインメントを図示し、一方、図面１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ１をコードする核酸配列（配列番号５）、対応するヒトＥＦＮＡ１アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号６）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ１ａ及びｂアイソフォームの配列（配列番号６及び７）のアラインメントを示す； 図面２Ａ及び２Ｂは、結直腸腫瘍標本全体の一部より入手した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）の集団の全トランスクリプトーム（transcriptome）配列決定法を使用して測定した、未処置（図面２Ａ）及びイリノテカン処置（図面２Ｂ）マウス中の選択したヒトエフリンＡリガンド及びエフリンＡ受容体の遺伝子発現レベルを図示するグラフ表示である； 図面３Ａ及び３Ｂは、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）集団又は腫瘍形成細胞（ＴＧ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）集団の全トランスクリプトーム配列決定法を使用して測定した、結直腸腫瘍試料（図面３Ａ）及び膵臓腫瘍試料（図面３Ｂ）中のヒトエフリンＡ４リガンドの遺伝子発現レベルを図示するグラフ表示である； 図面４は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、４種の異なる非従来型異種移植片（ＮＴＸ）の結直腸又は膵臓腫瘍細胞株の１つを担うマウスより入手した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）集団と、非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）に対して正規化した濃縮細胞集団中のヒトＥＦＮＡ４の相対的な遺伝子発現レベルを示すグラフ表示である； 図面５Ａ及び５Ｂは、ステージＩ〜ＩＶの疾患の患者由来の全結直腸腫瘍標本においてＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ヒトＥＦＮＡ４の相対的な遺伝子発現レベルを、正常な結腸及び直腸組織中の発現の平均に対して正規化して（図面５Ａ）、又は正常隣接組織と比べて（図面５Ｂ）示すグラフ表示である； 図面６Ａ〜６Ｅは、測定したヒトＥＦＮＡ遺伝子の遺伝子発現レベルを表し、図面６Ａ及び６Ｂでは、１８種の異なる固形腫瘍型の１つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色のドット）又は比較したＮＡＴ（白色のドット）中のＥＦＮＡ４をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、図面６Ｃ及び６Ｄでは、選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４及びＥＦＮＡ１をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、そして図面６Ｅでは、正常な組織と選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４についてウェスタンブロット分析によって測定した； 図面６Ａ〜６Ｅは、測定したヒトＥＦＮＡ遺伝子の遺伝子発現レベルを表し、図面６Ａ及び６Ｂでは、１８種の異なる固形腫瘍型の１つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色のドット）又は比較したＮＡＴ（白色のドット）中のＥＦＮＡ４をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、図面６Ｃ及び６Ｄでは、選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４及びＥＦＮＡ１をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、そして図面６Ｅでは、正常な組織と選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４についてウェスタンブロット分析によって測定した； 図面６Ａ〜６Ｅは、測定したヒトＥＦＮＡ遺伝子の遺伝子発現レベルを表し、図面６Ａ及び６Ｂでは、１８種の異なる固形腫瘍型の１つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色のドット）又は比較したＮＡＴ（白色のドット）中のＥＦＮＡ４をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、図面６Ｃ及び６Ｄでは、選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４及びＥＦＮＡ１をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、そして図面６Ｅでは、正常な組織と選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４についてウェスタンブロット分析によって測定した； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（Chothia et al. によって定義されるような）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する； 図面８Ａ〜８Ｄは、図面８Ａの表形式で表される例示モジュレーターの生化学的及び免疫学的特性を示す。図面８Ｂ及び８Ｃでは、一定量の抗体と系列希釈液の抗原との非標識相互作用分析を使用して決定されるようなマウスＳＣ４．４７とヒト化ＳＣ４．４７それぞれの親和性の比較を示し、図面８Ｄでは、選択したヒト化モジュレーターとマウスモジュレーターの特性の表形式の比較を示す； 図面８Ａ〜８Ｄは、図面８Ａの表形式で表される例示モジュレーターの生化学的及び免疫学的特性を示す。図面８Ｂ及び８Ｃでは、一定量の抗体と系列希釈液の抗原との非標識相互作用分析を使用して決定されるようなマウスＳＣ４．４７とヒト化ＳＣ４．４７それぞれの親和性の比較を示し、図面８Ｄでは、選択したヒト化モジュレーターとマウスモジュレーターの特性の表形式の比較を示す； 図面９は、本発明の５０種の例示のエフリンＡリガンドモジュレーターの、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６細胞とＺ１３８細胞それぞれに関する細胞表面結合特性を例証する； 図面１０Ａ及び１０Ｂは、エフリンＡ受容体を発現する細胞に対するエフリンＡリガンドの用量依存的な様式での結合（図面１０Ａ）と、例示の開示モジュレーターへの曝露によるエフリンＡリガンド細胞表面結合の阻害（図面１０Ｂ）を図示する； 図面１１Ａ〜１１Ｄは、ヒト及びマウスのエフリンＡリガンドの細胞表面結合を阻害する開示モジュレーターの能力を例証するグラフ表示であって、ここで図面１１Ａは、陽性対照曲線を示して、図面１１Ｂ〜１１Ｄは、３種の例示ＥＦＮＡモジュレーターの、リガンド結合を低下させる能力を証明する； 図面１２Ａ〜１２Ｅは、本発明のモジュレーターの、可溶性エフリンＡ受容体の細胞表面結合を阻害する能力を示すグラフ表示であり、ここで図面１２Ａは、受容体結合の標準曲線を提供し、図面１２Ｂは、可溶性受容体の濃度が変動するときの例示モジュレーターの特性を例証し、図面１２Ｃは、受容体の量を一定に保ちながらモジュレーターの濃度を変化させることの結果を証明し、そして図面１２Ｄ及び１２Ｅは、エフリンＡ受容体がエフリンＡ４とエフリンＡ１リガンドへそれぞれ結合することを阻害する、当該モジュレーターの能力を示す； 図面１２Ａ〜１２Ｅは、本発明のモジュレーターの、可溶性エフリンＡ受容体の細胞表面結合を阻害する能力を示すグラフ表示であり、ここで図面１２Ａは、受容体結合の標準曲線を提供し、図面１２Ｂは、可溶性受容体の濃度が変動するときの例示モジュレーターの特性を例証し、図面１２Ｃは、受容体の量を一定に保ちながらモジュレーターの濃度を変化させることの結果を証明し、そして図面１２Ｄ及び１２Ｅは、エフリンＡ受容体がエフリンＡ４とエフリンＡ１リガンドへそれぞれ結合することを阻害する、当該モジュレーターの能力を示す； 図面１３Ａ〜１３Ｃは、本発明の選択したモジュレーターの、エフリンＡ４リガンドのマウス相同分子種（ortholog）と交差反応する能力を例証し、ここで図面１３Ａは、非反応性モジュレーターを例証して、図面１３Ｂ及び図面１３Ｃは、交差反応するマウスのモジュレーターとヒト化モジュレーターをそれぞれ例証する； 図面１３Ａ〜１３Ｃは、本発明の選択したモジュレーターの、エフリンＡ４リガンドのマウス相同分子種（ortholog）と交差反応する能力を例証し、ここで図面１３Ａは、非反応性モジュレーターを例証して、図面１３Ｂ及び図面１３Ｃは、交差反応するマウスのモジュレーターとヒト化モジュレーターをそれぞれ例証する； 図面１４Ａ〜１４Ｄは、エフリンＡリガンドの発現が、全結直腸腫瘍試料（図面１４Ａ）において、結直腸ＮＴＸ腫瘍細胞の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｂ）において、そして肺ＮＴＸ細胞株の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｄ）において上方調節されているが、正常な末梢血単核細胞（図面１４Ｃ）上では上方調節されていないことを証明する； 図面１４Ａ〜１４Ｄは、エフリンＡリガンドの発現が、全結直腸腫瘍試料（図面１４Ａ）において、結直腸ＮＴＸ腫瘍細胞の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｂ）において、そして肺ＮＴＸ細胞株の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｄ）において上方調節されているが、正常な末梢血単核細胞（図面１４Ｃ）上では上方調節されていないことを証明する； 図面１５Ａ〜１５Ｄは、本発明の選択したモジュレーターがエフリンＡリガンドとの結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１５Ａは、３種の例示モジュレーターに関連した蛍光シフトを示し、図面１５Ｂは、１９種の開示モジュレーターが内在化を示唆するデルタ平均蛍光強度を示すことを証明し、図面１５Ｃは、ＥＦＮＡ発現が低い細胞では、相対的に内在化がほとんど無いことを示し、そして図面１５Ｄは、高レベルのＥＦＮＡを発現する細胞に関連した実質的な内在化を示す； 図面１５Ａ〜１５Ｄは、本発明の選択したモジュレーターがエフリンＡリガンドとの結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１５Ａは、３種の例示モジュレーターに関連した蛍光シフトを示し、図面１５Ｂは、１９種の開示モジュレーターが内在化を示唆するデルタ平均蛍光強度を示すことを証明し、図面１５Ｃは、ＥＦＮＡ発現が低い細胞では、相対的に内在化がほとんど無いことを示し、そして図面１５Ｄは、高レベルのＥＦＮＡを発現する細胞に関連した実質的な内在化を示す； 図面１６Ａ〜１６Ｆは、開示モジュレーターが、エフリンＡリガンドを発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分として有効に使用し得る（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことの証拠を提供し、ここで図面１６Ａは、モジュレーターＳＣ４．５の殺傷効果を示し、図面１６Ｂは、肺及び皮膚のＮＴＸ腫瘍細胞株に内在化して殺傷する、選択したモジュレーターの能力を例証し、図面１６Ｃ及び１６Ｄは、モジュレーターが会合した細胞毒素をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）とＨＥＫ−．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）の中へ運ぶことを示し、図面１６Ｅは、ヒト化モジュレーターが同様に反応することを例証し、そして図面１６Ｆは、マウス又はヒトのエフリンＡリガンドを発現している標的細胞の殺傷を証明する（図面１６を通して、モジュレーターは、ＳＣ４よりむしろＥと呼称される場合があることに留意されたい）； 図面１６Ａ〜１６Ｆは、開示モジュレーターが、エフリンＡリガンドを発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分として有効に使用し得る（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことの証拠を提供し、ここで図面１６Ａは、モジュレーターＳＣ４．５の殺傷効果を示し、図面１６Ｂは、肺及び皮膚のＮＴＸ腫瘍細胞株に内在化して殺傷する、選択したモジュレーターの能力を例証し、図面１６Ｃ及び１６Ｄは、モジュレーターが会合した細胞毒素をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）とＨＥＫ−．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）の中へ運ぶことを示し、図面１６Ｅは、ヒト化モジュレーターが同様に反応することを例証し、そして図面１６Ｆは、マウス又はヒトのエフリンＡリガンドを発現している標的細胞の殺傷を証明する（図面１６を通して、モジュレーターは、ＳＣ４よりむしろＥと呼称される場合があることに留意されたい）； 図面１６Ａ〜１６Ｆは、開示モジュレーターが、エフリンＡリガンドを発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分として有効に使用し得る（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことの証拠を提供し、ここで図面１６Ａは、モジュレーターＳＣ４．５の殺傷効果を示し、図面１６Ｂは、肺及び皮膚のＮＴＸ腫瘍細胞株に内在化して殺傷する、選択したモジュレーターの能力を例証し、図面１６Ｃ及び１６Ｄは、モジュレーターが会合した細胞毒素をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）とＨＥＫ−．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）の中へ運ぶことを示し、図面１６Ｅは、ヒト化モジュレーターが同様に反応することを例証し、そして図面１６Ｆは、マウス又はヒトのエフリンＡリガンドを発現している標的細胞の殺傷を証明する（図面１６を通して、モジュレーターは、ＳＣ４よりむしろＥと呼称される場合があることに留意されたい）； 図面１６Ａ〜１６Ｆは、開示モジュレーターが、エフリンＡリガンドを発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分として有効に使用し得る（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことの証拠を提供し、ここで図面１６Ａは、モジュレーターＳＣ４．５の殺傷効果を示し、図面１６Ｂは、肺及び皮膚のＮＴＸ腫瘍細胞株に内在化して殺傷する、選択したモジュレーターの能力を例証し、図面１６Ｃ及び１６Ｄは、モジュレーターが会合した細胞毒素をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）とＨＥＫ−．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）の中へ運ぶことを示し、図面１６Ｅは、ヒト化モジュレーターが同様に反応することを例証し、そして図面１６Ｆは、マウス又はヒトのエフリンＡリガンドを発現している標的細胞の殺傷を証明する（図面１６を通して、モジュレーターは、ＳＣ４よりむしろＥと呼称される場合があることに留意されたい）； 図面１７Ａ〜１７Ｅは、分泌されたエフリンＡリガンドに指向する開示モジュレーターの能力を証明する生化学アッセイの様々な側面のグラフ表示であり、ここで図面１７Ａは、標準曲線を提供し、図面１７Ｂは、選択した血液系腫瘍より分泌されたＥＦＮＡのレベルを定量し、図面１７Ｃは、腫瘍量と分泌されたＥＦＮＡの相関性を提示し、図面１７Ｄは、健常成人中の循環エフリンＡリガンドの範囲を確定し、そして図面１７Ｅは、選択した固形腫瘍のある患者が有意により高いレベルの循環エフリンＡリガンドを有することを証明する； 図面１７Ａ〜１７Ｅは、分泌されたエフリンＡリガンドに指向する開示モジュレーターの能力を証明する生化学アッセイの様々な側面のグラフ表示であり、ここで図面１７Ａは、標準曲線を提供し、図面１７Ｂは、選択した血液系腫瘍より分泌されたＥＦＮＡのレベルを定量し、図面１７Ｃは、腫瘍量と分泌されたＥＦＮＡの相関性を提示し、図面１７Ｄは、健常成人中の循環エフリンＡリガンドの範囲を確定し、そして図面１７Ｅは、選択した固形腫瘍のある患者が有意により高いレベルの循環エフリンＡリガンドを有することを証明する； 図面１８Ａ〜１８Ｃは、様々なエフリンＡリガンドモジュレーターが、細胞傷害性ペイロードを選択した細胞と会合させる標的化部分として使用することができる（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことを例証するグラフ表示であり、そしてここで図面１８Ａ〜１８Ｃは、エフリンＡ４リガンド（図面１８Ａ）、エフリンＡ３リガンド（図面１８Ｂ）、及びエフリンＡ１リガンド（図面１８Ｃ）を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結合サポリン（Saporin）存在下での殺傷に媒介する、モジュレーターＳＣ４．２．１（又はＥ２．１）とＳＣ９．６５（又は９Ｍ０６５）の能力を具体的に証明する； 図面１９Ａ及び１９Ｂは、数多くのＥＰＨＡ受容体と選択的に相互作用するエフリンＡリガンドの能力を例証し、ここでＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、内因的に発現されるエフリンＡリガンドを介して、ＥＰＨＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ受容体構築体へ限られた度合いでのみ結合し（図面１９Ａ）、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞は、結合しないＥＰＨＡ１以外は、試験したすべてのＥＰＨＡ受容体構築体へ様々な度合いで結合する（図面１９Ｂ）；及び 図面２０Ａ及び２０Ｂは、ＥＰＨＢ受容体と選択的に相互作用するエフリンＡリガンドの能力を例証し、ここでＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、内因的に発現されるエフリンＡリガンドを介して、ＥＰＨＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ受容体構築体へ限られた度合いでのみ結合し（図面２０Ａ）、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞は、ＥｐｈＢ２受容体へ結合するが、ＥｐｈＢ３受容体とＥｐｈＢ４受容体へは結合しない（図面２０Ｂ）。
Ｉ．序論
本発明は、多くの異なる形態で具現化され得るが、本明細書に開示するのは、本発明の諸原理を具体化する、本発明の例示の具体的態様である。本発明が例証される具体的態様に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用するどのセクション見出しも、編成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。
先に述べたように、驚くべきことに、エフリンＡリガンド（又はＥＦＮＡ）の発現が新生物増殖と過剰増殖性障害に関連していること、そしてそのようなリガンドが関連疾患の治療に利用し得る有用な腫瘍マーカーを提供することが見出された。より具体的には、本明細書に開示するようなＥＦＮＡモジュレーターが、有利にも、その必要な被検者における新生物障害の診断、セラグノーシス（theragnosis）、治療、又は予防に使用し得るこ
とが発見された。従って、本発明の好ましい態様について、特に癌幹細胞と開示モジュレーターとのその相互作用の文脈で、以下に広汎に考察するが、当業者は、本発明の範囲がそのような例示態様によって限定されないことを理解されよう。むしろ、本発明と付帯の特許請求項は、どの特別な作用機序にも、特異的に標的化される腫瘍成分にも拘ることなく、ＥＦＮＡモジュレーターと、新生物障害又は過剰増殖性障害が含まれる、多様なＥＦＮＡ関連障害又はＥＦＮＡ媒介障害の診断、セラグノーシス、治療、又は予防におけるそれらの使用へ概括的かつ明白に向けられる。
さらに、多くの先行技術の開示とは対照的に、本発明は、エフリン受容体（即ち、ＥＰＨ）モジュレーターではなく、エフリンリガンドモジュレーター（即ち、ＥＦＮ）へ主に向けられる。即ち、エフリン受容体が数種の障害との関連が広く示唆されて、概して治療的介入の標的とされてきたのに対し、エフリンリガンドはこれまでさほど注意を惹いてこなかった。これは、一部は、そのリガンドに起因する雑多な挙動の結果であろうし、それらを筋道の通らない治療標的とするそのような多様な相互作用は、余剰経路のためにあらゆるリガンド拮抗作用を相殺するはずだとする誤った信念の結果であろう。しかしながら、本明細書において証明されるように、開示されるエフリンＡリガンドモジュレーターは、効果的に、腫瘍形成細胞に標的指向して、それを消失させるか又は他の方法で無能力化するために使用することができる。さらに、選択態様において、本発明は、１種より多いエフリンＡリガンドと会合又は反応して、それによって１種より多いエフリンリガンド媒介経路の静止を可能にし得る、予期せぬ相加又は相乗効果を提供する汎ＥＦＮＡモジュレーターを含む。
直前に考察した一般的な会合とは別に、本発明者は、選択した「腫瘍始原細胞」（ＴＩＣ）とエフリンＡリガンドの間のこれまで知られていなかった表現型的な会合をさらに発
見した。この点に関して言えば、選択したＴＩＣでは、正常組織及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）（一緒に固形腫瘍の多くを含む）と比べるときに、上昇レベルのエフリンＡリガンドが発現されていることが見出された。このように、エフリンＡリガンドは、腫瘍関連マーカー（又は抗原）を含んで、細胞表面上又は腫瘍微小環境中のこのタンパク質の上昇レベルの故に、ＴＩＣと関連新生物との検出及び抑制に有効な薬剤を提供することが見出された。より具体的には、ＥＦＮＡモジュレーターは、このタンパク質と会合又は反応する免疫反応性のアンタゴニスト及び抗体を含めて、腫瘍始原細胞の頻度を有効に低下させて、それ故に、腫瘍始原細胞を消失させ、無能化し、低下させ、その分化を促進し、あるいは他の方法で、これらの腫瘍始原細胞の患者の中での潜伏能力、及び／又は腫瘍の増殖、転移、又は再発を促すことを続ける能力を排除するか又は制限するのに有用であることがさらに発見された。下記により詳しく考察するように、ＴＩＣ腫瘍細胞の亜集団は、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）からなる。
上記の発見に鑑みて、当業者は、さらに本発明がＥＦＮＡモジュレーターと腫瘍始原細胞の頻度を低下させることにおけるそれらの使用を提供することを理解されよう。以下に広汎に考察するように、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、エフリンＡリガンド又はその遺伝子を認識する、それと反応する、競合する、拮抗する、相互作用する、結合する、それを作動させる、又はそれと会合するどの化合物も概括的に含む。これらの相互作用によって、ＥＦＮＡモジュレーターは、それにより腫瘍始原細胞の頻度を低下させるか又は適度にする。本明細書に開示する例示のモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はポリペプチドを含む。ある好ましい態様において、選択されるモジュレーターは、ＥＦＮＡに対する抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体を含むであろう。そのような抗体は、本質的に拮抗性であっても作動性であってもよく、場合により、細胞傷害剤とコンジュゲートしても会合してもよい。他の態様において、本発明内のモジュレーターは、エフリンＡリガンド又はその反応性断片を含んでなるＥＦＮＡ構築体を含むであろう。そのような構築体は、融合タンパク質を含んでよくて、免疫グロブリン又は生物学的応答調節物質のような他のポリペプチド由来の反応性ドメインを含み得ることが理解されるであろう。なお他の側面において、ＥＦＮＡモジュレーターは、所望の効果をゲノムレベルで発揮する核酸アセンブリーを含むであろう。本教示と適合可能な更なる他のモジュレーターについては、下記に詳しく考察する。
どの形態のモジュレーターが最終的に選択されたとしても、それは、被検者への導入に先立って、好ましくは、単離及び精製された状態にある。この点に関して、「単離（された）ＥＦＮＡモジュレーター」という用語は、広義に解釈されて、標準の薬務に従って、望まれない混在物質（生物学的又は他の）が実質的に存在しない状態で該モジュレーターを含んでなるあらゆる調製物又は組成物を意味するように解釈されよう。以下にやや詳しく考察するように、上記の調製物は、当該技術分野で認められた様々な技術を使用して、所望のように精製及び製剤化してよい。当然ながら、そのような「単離」調製物は、最終製品の市販、製造、又は療法上の側面を改善して医薬組成物を提供するために所望されるように、活性又は不活性成分とともに意図的に製剤化又は複合化してよいと理解されるであろう。
ＩＩ．ＥＦＮＡの生理学
Ｉ型膜貫通タンパク質であるエフリン受容体チロシンキナーゼ（ＥＰＨ）は、動物ゲノム内で最大の受容体チロシンキナーゼのファミリーを含み、やはり細胞表面に会合しているエフリンリガンド（ＥＦＮ）と相互作用する。ＥＰＨサブファミリー中の受容体は、典型的には、単一のキナーゼドメイン、並びにＣｙｓリッチドメイン及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含有する細胞外領域を有する。慣例によれば、エフリン受容体は、その細胞外ドメイン配列とエフリンＡリガンド及びエフリンＢリガンドへ結合するそれらの親和性の類似性に基づいて、２つの群へ分けられる。これまでの研究は、ＥＰＨ媒
介性シグナル伝達事象が、特に神経系において、胚発生の多重の側面を制御して、細胞の付着、形状、及び移動性を調節する細胞間連絡の重要なメディエーターであることを示した。さらに、エフリン受容体ファミリーの多くのメンバーは、エフリンリガンドとは対照的に、癌の発症及び進行の重要なマーカー及び／又は制御因子として同定されてきた。今日まで、９種のエフリンＡ受容体と６種のエフリンＢ受容体が知られている。
本出願の目的のために、「エフリン受容体」、「エフリンＡ受容体」、「エフリンＢ受容体」、「ＥＰＨＡ」又は「ＥＰＨＢ」（又は、ＥｐｈＡ又はＥｐｈＢ）という用語は、可換的に使用してよく、文脈によって指示されるように、特定のファミリー、サブファミリー、又は個別の受容体（即ち、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）を意味するものとする。
配列分析に基づいて、エフリンリガンドは、２つの群へ分けることができる：典型的には、グリコシルホスファチジルイノシトール連結を介して細胞表面へ繋留される６種のエフリンＡリガンド（又はＥＦＮＡ）（但し、エフリンｍＲＮＡの選択的スプライシングによって産生される非ＧＰＩ繋留タンパク質もある；例、ＥＦＮＡ４）と、膜貫通ドメイン並びに保存されたチロシン残基及びＰＤＺ結合モチーフがある短い細胞質領域を含有する３種のエフリンＢリガンド（又はＥＦＮＢ）とである。ＥＦＮＡリガンドが９種の異なるＥＰＨＡ受容体のいずれとも選好的に相互作用するのに対し、ＥＦＮＢリガンドは、６種の異なるＥＰＨＢ受容体のいずれとも選好的に相互作用するが、いくつかの特異的なＥＦＮＡ−ＥＰＨＢ及びＥＦＮＢ−ＥＰＨＡの交差相互作用も報告されている。
本出願の目的のために、「エフリンリガンド」、「エフリンＡリガンド」、「エフリンＢリガンド」、「ＥＦＮＡ」又は「ＥＦＮＢ」という用語は、可換的に使用してよく、文脈によって指示されるように、特定のファミリー、サブファミリー、又は個別のリガンド（即ち、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ２、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ４、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３）を意味するものとする。例えば、「エフリンＡ４」、「エフリンＡ４リガンド」、又は「ＥＦＮＡ４」という用語は、同じファミリーのタンパク質アイソフォーム（例えば、図面１Ｃに示されるような）を意味し、一方、「エフリンＡリガンド」及び「ＥＮＦＡ」という用語は、全６種のＡ型リガンドとそのあらゆるアイソフォームを含んでなるエフリンサブファミリー（即ち、Ｂに対するＡ）を意味するものとする。この点に関して言えば、「エフリンＡモジュレーター」、「エフリンＡリガンドモジュレーター」、又は「ＥＦＮＡモジュレーター」は、１以上のＡ型リガンド若しくはアイソフォーム、又はその断片若しくは誘導体と会合、結合、又は反応するあらゆるモジュレーター（本明細書に定義されるような）を意味する。
エフリン受容体及びリガンドの命名法のより詳しい要約を直下の表１に見出すことができる。
すべての細胞表面受容体−リガンド相互作用と同様に、エフリンリガンドによるエフリン受容体の会合（engagement）は、最終的には、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。受容体−リガンド相互作用は、同じ細胞の表面上の分子間で起こり得る（シス相互作用）が、一般的には、シス相互作用は、シグナル伝達カスケードの誘発に通じないか、或いはシス相互作用は、トランス相互作用（例えば、別々の細胞上の受容体とリガンドの間での）によって始動されるシグナル伝達カスケードに実際は拮抗しない場合があると考えられている。ＥＰＨ−ＥＦＮトランス相互作用の１つの独特な側面は、受容体−リガンド会合時に２つのシグナル伝達カスケード（エフリン受容体を発現している細胞中の前方シグナル伝達カスケードと、エフリンリガンドを発現している細胞中の後方シグナル伝達カスケード）の引き金となる能力である。この２種の別々のシグナル伝達カスケードの活性化は、動物の胚発生において調整するようにＥＰＨとＥＦＮが進化させてきた細胞選別及び細胞定位のプロセスを反映するのかもしれない。
ＥＰＨ−ＥＦＮシグナル伝達は、細胞骨格の動態を調節する細胞シグナル伝達経路を頻繁に活性化して、異なる種類の細胞間の付着及び反発の相互作用の調節をもたらす。一般的なこととして、ＥＰＨ及びＥＦＮタンパク質は、成体組織において観測されるレベルに
対してずっと高いレベルで、胚発生の間に見出されるが、成体にあっても低レベルの発現が継続していることは、成体の腸管（分化途上の細胞が腸陰窩中の組織幹細胞でのその供給源から腸管腔に対面する柔突起の表面にあるその最終位置へ移動することより生じる、明確化された構造を有する）のような組織の正常な機能におけるこれら分子の役割を反映するのかもしれない。エフリン受容体は、最初に、肝細胞癌において確認されて、ＥＰＨ及びＥＦＮの発現は、典型的には成体に限られているので、ヒト癌におけるエフリンリガンド及び／又はエフリン受容体の発現の再活性化は、癌細胞の脱分化、及び／又は周囲の正常組織に浸潤して原発性腫瘍の部位から離れた場所へ移動するこれら癌細胞の能力に関連する可能性がある。他の研究成果は、ＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用が血管新生にも何らかの役割があることを示唆している。
非リンパ系組織におけるＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用が、インテグリンと細胞骨格との再配列を介して細胞間の付着力又は反発力を産生することによって細胞の相互作用を調節するという知見に一致して、リンパ系細胞上で見出されるＥＰＨ及びＥＦＮ分子は、細胞外マトリックス成分への細胞付着、走化性、及び細胞遊走を媒介することが示されてきた。例えば、ＥＦＮＡ１（ＥｐｈＡ２受容体へ結合して、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４４２８にあるようなアミノ酸配列を含む）の原発性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞上での参画（engagement）は、細胞遊走を刺激して、走化性を高めることが見出された。ＥＦＮＡ１のように、ＥＦＮＡ４は、原発性ＣＤ４Ｔ細胞上で発現されるが、ＥＰＨ−ＥＦＮ相互作用の雑多性のために、ＥＦＮＡ４の参画がこれらの細胞に対して類似の影響を及ぼすかどうかは不明である。しかしながら、成熟したヒトＢリンパ球がＥＦＮＡ４を発現して、活性時にそれを分泌することは証明されている。さらに、ＥＦＮＡ４は、他のどのＥＦＮ又はＥＰＨ分子とも異なり、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者のＢ細胞上でも、又はそれによっても定常的に発現されている。興味深いことに、Ｑ−ＰＣＲによって測定されるようなＥＦＮＡ４アイソフォームの発現は、この疾患の臨床症状と相関する場合がある。また、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞（ＥＦＮＡ４の発現が増加していることが知られている）は、健常個体由来のＢ細胞と比較して、経内皮遊走能障害を示した。ＥＦＮＡ４の参画は、細胞外マトリックス分子へ付着するＣＬＬ細胞の能力を低下させて、ＣＣＬ１に対するその走化性応答を低下させたようである。まとめてこれらの報告は、Ｂ及びＴ細胞の膜輸送におけるＥＦＮＡ４の役割を示唆して、上記に考察した細胞内シグナル伝達データと組み合わせて視ると、エフリンＡリガンド、そして特にＥＦＮＡ４を、抗癌治療剤の開発にとってきわめて興味深い標的とする。
上述の特徴に加えて、本開示は、ＥＦＮＡ４の発現が様々な癌幹細胞集団において上昇していることを証明する。バルク腫瘍においていくつかのＥＰＨＡ受容体が同時に上方調節されていることと一致して、このことは、ＥＦＮＡ４媒介性リガンド受容体相互作用が、腫瘍増殖、血管新生、及び／又は腫瘍転移に関連した細胞シグナル伝達カスケードの引き金になり得るという可能性を提起する。ある特別な理論によって束縛されることを望まないが、本発明のＥＦＮＡ４モジュレーター（特に、拮抗性又は中和性の態様）は、少なくとも一部は、腫瘍始原細胞頻度を低下させるか又は消失させるかのいずれかによって、従来の標準的な治療法レジメン（例、イリノテカン）とは異なる様式で、又は免疫療法的なシグナル伝達を介して、又はＥＦＮＡ４発現細胞を殺傷することが可能なペイロードを送達することを介して、腫瘍の増殖又は生存に干渉することによって作用すると考えられている。例えば、ＥＦＮＡ４に拮抗することによるＴＰＣの消失には、増殖性の細胞を消失させる化学療法レジメンに対抗して細胞増殖を単に促進すること、又はＴＰＣの自己再生（即ち、無限の増殖と多能性の維持）能力が失われるようにその分化を促進することを含めてよい。あるいは、好ましい態様では、ＥＦＮＡ４発現細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞の動員、又は抗ＥＦＮＡ４抗体へコンジュゲートした、内在化することができる強力な毒素の送達によって、ＴＰＣを選択的に殺傷するか又は他の方法で無能化することができる。
本明細書に使用するように、ＥＦＮＡ４（ｅｐｈ関連キナーゼ４のリガンド、ＬＥＲＫ４；又はｅｐｈ関連受容体チロシンキナーゼリガンド４、ＥＦＬ−４としても知られる）という用語は、文脈により他に指定されなければ、天然に存在するヒトＥＦＮＡ４を意味する。代表的なＥＦＮＡ４タンパク質の相同分子種には、限定されないが、ヒト（即ち、ｈＥＦＮＡ４、ＮＰ＿００５２１８、ＮＰ＿８７２６３１、又はＮＰ＿８７２６３２）、マウス（ＮＰ＿０３１９３６）、チンパンジー（ＸＰ＿００１１５３０９５、ＸＰ＿００１１５２９７１、ＸＰ＿５２４８９３、及びＸＰ＿００１１５２９１６）、及びラット（ＮＰ＿００１１０１１６２）のものが含まれる。転写されるヒトＥＦＮＡ４遺伝子は、第一染色体由来の最低でも５８１７のｂｐ（塩基対）を含む。３種のｍＲＮＡ転写物変異体がこれまでに記載されてきた（このそれぞれは、転写されるＲＮＡの選択的スプライシングより生じる）：（１）２０１アミノ酸のプロタンパク質（ＮＰ＿００５２１８；ＥＦＮＡ４変異体ａ；配列番号２）をコードする、１２７６ｂｐ変異体（ＮＭ＿００５２２７；ＥＦＮＡ４転写物変異体１；配列番号１）；（２）２０７アミノ酸プロタンパク質（ＮＭ＿８７２６３１；ＥＦＮＡ４変異体ｂ；配列番号３）をコードする、１１１０ｂｐ変異体（ＮＭ＿１８２６８９；ＥＦＮＡ４転写物変異体２）；及び（３）１９３アミノ酸プロタンパク質（ＮＰ＿８７２６３２；ＥＦＮＡ４変異体ｃ；配列番号４）をコードする、１１１１ｂｐ変異体（ＮＭ＿１８２６９０；ＥＦＮＡ４転写物変異体３）。このヒトＥＦＮＡ４タンパク質のそれぞれには、脱落してこのタンパク質の成熟型（即ち、１６８〜１８２ａａ）をもたらす、配列番号２のアミノ酸１〜２５を含んでなる、予測されるシグナル又はリーダー配列が含まれることが理解されよう。このシグナルペプチドは、このポリペプチドを細胞表面／分泌経路へ標的化する。このタンパク質のコード配列に対する続発的な結果を伴うｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、このタンパク質のアイソフォームは、細胞によって異なるプロセシングを受けて、アイソフォームａは、膜局在化して、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結によって細胞表面へ繋留され、一方アイソフォームｂ及びｃは、ＧＰＩ繋留シグナル配列を欠くので、その細胞によって分泌されると予測される。ヒトＥＦＮＡ４の３種のタンパク質アイソフォームのアラインメントを図面１Ｃに示す。先に示したように、直接の言及又は文脈の必要性によって他に示さなければ、ＥＦＮＡ４という用語は、ヒトＥＦＮＡ４のアイソフォームａと免疫反応性の同等物を指すものとする。この用語は、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合し得るエピトープを含有する、ＥＦＮＡ４のネイティブ型又は変異型の誘導体又は断片も意味する場合があることがさらに理解されよう。
ＩＩＩ．腫瘍永続化細胞
先行技術の教示とは対照的に、本発明は、腫瘍始原細胞、そして特に腫瘍永続化細胞に標的指向して、それによって新生物障害の治療、管理、又は予防を促進するのに特に有用であるＥＦＮＡモジュレーターを提供する。より具体的には、先に示したように、驚くべきことに、特定の腫瘍細胞亜集団は、ＥＦＮＡを発現して、癌幹細胞の自己再生と細胞の生存に重要なモルフォゲンシグナル伝達の局在化調整を変化させる可能性があることが見出された。このように、好ましい態様では、ＥＦＮＡのモジュレーターを本教示に従って使用して、腫瘍始原細胞頻度を低下させて、それによって過剰増殖性疾患の治療又は管理を促進することができる。
本明細書に使用するように、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）という用語には、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞又はＣＳＣ）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇと呼ばれる）がともに含まれて、これらは一緒に、バルク腫瘍又は塊の独自の亜集団（即ち、０．１〜４０％）を概ね含む。本開示の目的では、腫瘍永続化細胞及び癌幹細胞という用語は、同等であって、本明細書において可換的に使用してよい。逆に、ＴＰＣは、腫瘍内部に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現し得て、少数の単離細胞の連続移植（マウスを介した２回以上の継代）によって証明されるような無制限の自己再生能力を有する点で、ＴＰｒ
ｏｇとは異なる。下記により詳しく考察するように、適正な細胞表面マーカーを使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、少なくとも一部は、単一の細胞と細胞の塊（即ち、ダブレット等）を識別するその能力の故に、高度に濃縮した細胞亜集団（９９．５％より高い純度）を単離するのに信頼し得る方法である。そのような技術を使用して、少ない細胞数の高度精製ＴＰｒｏｇ細胞が免疫不全マウスへ移植されるときに、それらが一次移植体中の腫瘍増殖を促すことができることが示された。しかしながら、精製されたＴＰＣ亜集団とは異なり、ＴＰｒｏｇ産生腫瘍は、表現型の細胞異種性において親腫瘍を完全には反映せず、後続の移植体において連続した腫瘍形成を再始動させることが明らかに非効率である。対照的に、ＴＰＣ亜集団は、親腫瘍の細胞異種性を完全に再構成して、連続的に単離及び移植されるときに、腫瘍を効率的に始動させることができる。このように、当業者は、いずれも一次移植体において腫瘍を産生し得ても、ＴＰＣとＴＰｒｏｇの間には明確な違いがあって、それは、少ない細胞数での連続移植時に異種な腫瘍増殖を永続的に促進するＴＰＣ独自の能力であることを認められよう。ＴＰＣの特性決定をするための他の通常のアプローチは、形態学と、細胞表面マーカー、転写プロフィール、及び薬物応答の検証に関連するが、マーカーの発現は、培養条件と in vitro での継代細胞株で変化する場合がある。
従って、本発明の目的では、腫瘍永続化細胞は、正常組織において細胞の階層構造を支える正常幹細胞と同様に、好ましくは、多系統分化の能力を維持しながら無限に自己再生するその能力によって定義される。このように、腫瘍永続化細胞は、腫瘍形成性子孫（即ち、腫瘍始原細胞：ＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ）と非腫瘍形成性（ＮＴＧ）子孫をともに産生することが可能である。本明細書に使用するように、非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）は、腫瘍始原細胞より生じるが、それ自体では自己再生する能力も腫瘍を含む異種な系統の腫瘍細胞を産生する能力も有さない、腫瘍細胞を意味する。実験的には、ＮＴＧ細胞は、過剰の細胞数で移植されるときでも、マウスにおいて腫瘍を再現可能的に形成することができない。
示したように、ＴＰｒｏｇは、マウス中で腫瘍を産生するその限られた能力により、腫瘍始原細胞（又はＴＩＣ）としても分類される。ＴＰｒｏｇは、ＴＰＣの子孫であって、典型的には、有限回の非自己再生性の細胞分裂が可能である。さらに、ＴＰｒｏｇ細胞は、初期腫瘍始原細胞（ＥＴＰ）と後期腫瘍始原細胞（ＬＴＰ）へさらに分割される場合があり、このそれぞれは、表現型（例、細胞表面マーカー）と腫瘍細胞構造を再現する能力の差によって識別され得る。そのような技術上の差異にも拘らず、ＥＴＰとＬＴＰはともに、少ない細胞数で移植されるときに腫瘍を連続的に再構成することが概ね不可能であって、典型的には、親腫瘍の異種性を反映しないという点で、ＴＰＣとは機能的に異なる。上述の差異にも拘らず、様々なＴＰｒｏｇ集団が、稀な場合に、通常は幹細胞に起因する自己再生能力を獲得して、それ自体でＴＰＣ（又はＣＳＣ）になることが可能であることも示されてきた。いずれにしても、一人の患者の典型的な腫瘍塊には、両方の種類の腫瘍始原細胞が現れる可能性があって、本明細書に開示するモジュレーターでの治療の影響を受ける。即ち、開示される組成物は、腫瘍に表れる特別な態様又は混在に拘らず、このようなＥＦＮＡ陽性腫瘍始原細胞の頻度を低下させるか又はその化学療法感受性を変化させるのに概ね有効である。
本発明の文脈では、ＴＰＣは、ＴＰｒｏｇ（ＥＴＰとＬＴＰの両方）、ＮＴＧ細胞、及び腫瘍のバルクを含む腫瘍浸潤性非ＴＰＣ由来細胞（例、線維芽細胞／間質細胞、内皮及び造血細胞）より腫瘍形成性であって、相対的により不活動性であって、より化学療法抵抗性であることが多い。慣用の療法及びレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させるとともに増殖中の細胞を速やかに攻撃するように設計されてきたとすれば、ＴＰＣは、慣用の療法及びレジメンに対して、より速く増殖中のＴＰｒｏｇや他のバルク腫瘍細胞集団よりも、抵抗性になる可能性がある。さらに、ＴＰＣは、慣用の療法に対してそれらを相対的に
化学療法抵抗性にする、多剤耐性輸送体の発現増加、ＤＮＡ修復機序の増強、及び抗アポトーシスタンパク質といった他の特徴をしばしば発現する。そのそれぞれがＴＰＣによる薬剤耐性に寄与するこれらの特性は、標準腫瘍学の治療レジメンが進行期の新生物を担うほとんどの患者に長期の利益を保証することができないこと、即ち、継続した腫瘍の増殖及び再発を促すそれらの細胞（即ち、ＴＰＣ又はＣＳＣ）に充分に標的指向してそれらを根絶することができないことの主要な理由を構成する。
上述した先行技術の治療法の多くと異なり、本発明の新規組成物は、好ましくは、選択したモジュレーターの形態又は特定の標的（例、遺伝物質、ＥＦＮＡ抗体、又はリガンド融合構築体）に拘らず、被検者への投与時に、腫瘍始原細胞の頻度を低下させる。上記に注目したように、腫瘍始原細胞頻度の低下は、ａ）腫瘍始原細胞の消失、枯渇、増感、沈静化、又は阻害；ｂ）腫瘍始原細胞の増殖、拡張、又は再発を制御すること；ｃ）腫瘍始原細胞の始動、伝播、維持、又は増殖を妨害すること；又はｄ）他の方法で、腫瘍形成細胞の生存、再生、及び／又は転移を妨げることの結果として起こり得る。いくつかの態様において、腫瘍始原細胞の頻度の低下は、１以上の生理学的経路における変化の結果として起こる。この経路の変化は、腫瘍始原細胞の低下又は消失によっても、それらの潜在能力（例、分化誘導、ニッチ破壊）を変化させるか又は、腫瘍環境又は他の細胞に対して影響を及ぼすそれらの能力に他の方法で干渉することによっても、腫瘍形成、腫瘍維持、及び／又は転移と再発を阻害することによって、ＥＦＮＡ関連障害のより有効な治療を同様に可能にする。
このような腫瘍始原細胞の頻度の低下を評価するために使用し得る方法には、in vitro
又は in vivo のいずれかの限界希釈分析があり、好ましくは、ポアソン分布統計を使用する計数、又は in vivo で腫瘍を産生する能力の有無といった、既定義の決定的な事象
の頻度を評価することをそれに続ける。そのような限界希釈分析は、腫瘍始原細胞頻度の低下を計算する好ましい方法であるが、他のさほど厳密でない方法も、やや正確ではないとしても、所望の数値を有効に決定するために使用し得て、本明細書の教示と全く適合可能である。このように、当業者によって理解されるように、頻度値の低下をよく知られたフローサイトメトリー又は免疫組織化学の手段により決定することも可能である。上述のすべての方法に関しては、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 及び Hoey et al. 2009, PMID: 19664991 を参
照のこと。
限界希釈分析に関して言えば、コロニー形成を助長する in vitro 増殖条件の中へ分画又は未分画いずれかのヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置済み又は未処置の腫瘍に由来する）を沈着させることによって、腫瘍始原細胞頻度の in vitro 計数を達成することができる。この方法では、コロニーの単純なカウンティング及び特性決定によっても、例えば、系列希釈液のプレート中へのヒト腫瘍細胞の沈着と、各ウェルについてコロニー形成が陽性又は陰性かをプレート培養後少なくとも１０日間採点することからなる分析によっても、コロニー形成細胞を計数することができる。腫瘍始原細胞頻度を決定するその能力が概してより正確である、in vivo の限界希釈実験又は分析には、未処置対照又は処置条件のいずれかに由来のヒト腫瘍細胞を、例えば免疫不全マウスの中へ系列希釈液で移植した後で、各マウスについて腫瘍形成が陽性又は陰性かを移植後少なくとも６０日間採点することが含まれる。in vitro 又は in vivo での限界希釈分析による細胞頻度値の導出は、好ましくは、ポアソン分布統計を陽性及び陰性事象の既知頻度へ適用して、それにより陽性事象（この場合は、それぞれ、コロニー又は腫瘍の形成）の定義を満たす事象の頻度を提供することによって行う。
腫瘍始原細胞頻度を計算するために使用し得る、本発明と適合可能な他の方法に関して言えば、ごく普通の方法は、定量可能なフローサイトメトリー技術と免疫組織化学染色手
順を含む。直前に記載した限界希釈分析技術ほど正確ではないが、これらの手順は、ずっと労働集約的ではなくて、妥当な数値を相対的に短い時間枠で提供する。このように、当業者は、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている、当該技術分野で認められた細胞表面タンパク質（例えば、下記の実施例１で説明するような、潜在的に適合可能なマーカー）と結合する１以上の抗体又は試薬を利用して、それによって様々な試料由来のＴＩＣレベルを測定する、フローサイトメトリー細胞表面マーカープロフィール決定法を使用し得ることが理解されよう。なお別の適合可能な方法において、当業者は、これらの細胞を区別すると考えられる細胞表面タンパク質へ結合することが可能である１以上の抗体又は試薬を使用する免疫組織化学によって、ＴＩＣ頻度を in situ で（例えば、組織切
片において）計数することができよう。
従って、上記に参照した方法のいずれを使用しても、本明細書の教示に従って、開示されるＥＦＮＡモジュレーター（細胞傷害剤へコンジュゲートしたものを含めて）によって提供されるＴＩＣ（又はその中のＴＰＣ）の頻度の低下を定量することが可能である。いくつかの事例において、本発明の化合物は、ＴＩＣの頻度を（消失、分化誘導、ニッチ破壊、沈静化、等が含まれる、上記に注目した多様な機序によって）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％も低下させる場合がある。他の態様において、ＴＩＣの頻度の低下は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、又は６５％のオーダーであり得る。ある態様において、開示される化合物は、ＴＩＣの頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％も低下させる場合がある。当然ながら、ＴＩＣの頻度のどの低下も、新生物の腫瘍形成性、永続性、再発、及び攻撃性の対応する低下をもたらす可能性がある。
ＩＶ．ＥＦＮＡモジュレーター
いずれにしても、本発明は、いくつかのＥＦＮＡ関連悪性腫瘍のいずれもの診断、治療及び／又は予防のためのＥＦＮＡモジュレーター（ＥＦＮＡアンタゴニストが含まれる）の使用へ向けられる。開示モジュレーターは、単独で使用しても、化学療法剤又は免疫療法剤又は生物学的応答調節物質のような多種多様な抗癌化合物と一緒に使用してもよい。他の選択された態様では、２以上の別々のＥＦＮＡモジュレーターを組み合わせて使用して増強された抗新生物効果をもたらす場合もあれば、それを使用して多重特異性の構築体を作製する場合もある。
ある態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はポリペプチドを含む。なおより好ましくは、当該モジュレーターは、可溶性ＥＦＮＡ（ｓＥＦＮＡ）、又はその形態、変異体、誘導体又は断片を含み、それには、例えば、ＥＦＮＡ融合構築体（例、ＥＦＮＡ−Ｆｃ、ＥＦＮＡ−標的化部分、等）又はＥＦＮＡ−コンジュゲート（例、ＥＦＮＡ−ＰＥＧ、ＥＦＮＡ−細胞傷害剤、ＥＦＮＡ−ｂｒｍ、等）が含まれる。また、他の態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、抗体（例、抗ＥＦＮＡ１又は抗ＥＦＮＡ４ ｍＡｂ）又はその免疫反応性断片若しくは誘導体を含むと理解される。特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。他の態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、内在化抗体（internalizing antibody）又はその断片を含んでよい。なお他の態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、枯渇性抗体又はその断片を含んでよい。さらに、上述した融合構築体に関して言えば、これらの抗体モジュレーターは、選択される細胞傷害剤、ポリマー、生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）、等とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合して、様々な（そして任意選択的に、多数の）作用機序で、指向される免疫療法を提供することができる。上記に述べたように、そのような抗体は、汎ＥＦＮＡ抗体であって２以上のエフリンＡリガンドと会合しても、６種のエフリンＡリガンドの１つと選択的に反応する免疫特異抗体であってもよい。なお他の態様において、当該モジュレーターは、遺伝子レベルで機能し得て、アンチセンス構築体、ｓｉ
ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、等といった化合物を含んでよい。
本明細書の教示に基づいて、当業者は、本発明の特に好ましい態様が、ｓＥＦＮＡ４又はｓＥＦＮＡ１を含んでも、ＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１の一方又は両方と会合する抗体モジュレーターを含んでもよいことを理解されよう。
開示されるＥＦＮＡモジュレーターは、選択される経路に作動するか又は拮抗すること、又は、例えば、ＥＦＮＡモジュレーター、あらゆる会合ペイロード、又は投薬、及び送達法の形態に依存して、特定の細胞を消失させることが含まれる多様な機序を介して、腫瘍細胞（特にＴＰＣ）及び／又は関連する新生物を枯渇する、沈静化する、中和する、消失させる、又はその増殖、伝播、又は生存を阻害し得ることがさらに理解されよう。従って、本明細書に開示する好ましい態様は、腫瘍永続化細胞のような特定の腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害、又は沈静化へ向けられるが、そのような態様は、単に例示であって、いかなる意味でも限定的ではないことが強調されなければならない。むしろ、付帯の特許請求項において説明されるように、本発明は、如何なる特別な機序にも標的腫瘍細胞集団にも関係なく、ＥＦＮＡモジュレーターと、様々なＥＦＮＡ関連過剰増殖性障害の治療、管理、又は予防におけるそれらの使用へ概括的に向けられる。
同じ意味において、本発明の開示態様は、１以上のＥＦＮＡアンタゴニストを含んでよい。そのために、本発明のＥＦＮＡアンタゴニストは、ＥＦＮＡタンパク質又はその断片を認識する、それと反応する、結合する、複合する、競合する、会合する、又は他の方法で相互反応して、腫瘍始原細胞又は他の新生物細胞（バルク腫瘍又はＮＴＧ細胞が含まれる）の増殖を消失させる、沈静化する、低下させる、阻害する、妨害する、束縛する、又は制御する、如何なるリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、又は免疫学的に活性なその断片若しくは誘導体も含んでよいことが理解されよう。選択される態様において、ＥＦＮＡモジュレーターは、ＥＦＮＡアンタゴニストを含む。
本明細書に使用するように、アンタゴニストは、特別又は特定のタンパク質の活性（受容体のリガンドへの結合、又は酵素の基質との相互作用が含まれる）を中和する、遮断する、阻害する、廃絶する、低下させる、又はそれに干渉することが可能な分子を意味する。より一般的には、本発明のアンタゴニストは、抗体とその抗原結合性断片若しくは誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣体、薬剤とその代謝産物、転写及び翻訳制御配列、等を含んでよい。アンタゴニストには、該タンパク質へ特異的に結合して、それによってその基質標的へのその結合を隔離する、低分子阻害剤、融合タンパク質、受容体の分子及び誘導体、該タンパク質のアンタゴニスト変異体、該タンパク質へ指向されるアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、並びに該タンパク質に対するリボザイムも含めてよい。
本明細書に使用するように、そして２以上の分子又は化合物へ適用されるように、「認識する」又は「会合する」という用語は、それによって一方の分子が他方の分子に対して影響を及ぼす、共有結合的又は非共有結合的な、両分子の反応、結合、特異結合、複合、相互作用、接続、連結、一体化、合体、合併、又は接合を意味するものとする。
さらに、本発明の実施例において証明するように、ヒトＥＦＮＡのモジュレーターには、ある事例において、ヒト以外の種由来の（例、マウスの）ＥＦＮＡと交差反応するものがある。他の事例において、例示のモジュレーターは、ヒトＥＦＮＡの１以上のアイソフォームに特異的であり得、他の種由来のＥＦＮＡ相同分子種との交差反応性を示さない。当然ながら、本明細書の教示に一致して、そのような態様は、単一の種由来の２以上のエフリンＡリガンドと会合する汎ＥＦＮＡ抗体、又は単一のエフリンＡリガンドと排他的に
会合する抗体を含んでよい。
いずれにしても、そして下記により詳しく考察するように、当業者は、開示モジュレーターをコンジュゲート形態でも非コンジュゲート形態でも使用してよいことを理解されよう。即ち、当該モジュレーターは、医薬活性化合物、生物学的応答調節物質、抗癌剤、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤、診断部分、又は生体適合可能な修飾剤と（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）会合又はコンジュゲートしてよい。この点について言えば、そのようなコンジュゲートは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性核種を含んでよいと理解されよう。さらに、本明細書で示したように、選択したコンジュゲートは、そのコンジュゲーションに影響を及ぼすのに使用される方法に少なくとも一部は依存して、ＥＦＮＡモジュレーターへ様々なモル比で共有結合的又は非共有結合的に連結してよい。
ＩＶ．抗体
ａ．概説
先に述べたように、本発明の特に好ましい態様は、ＥＦＮＡモジュレーターを抗体の形態で含む。抗体という用語は最も広義に使用されて、具体的には、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体（CDR-grafted antibody）、霊長類化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖ＦｖＦｃｓ（ｓｃＦｖＦｃ）、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び（所望される生理活性、即ち、ＥＦＮＡとの会合又は結合を示す限りにおいて）他のあらゆる免疫学的に活性な抗体断片を網羅する。より広義において、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片（即ち、抗原結合部位を含有する分子）が含まれて、ここでこれらの断片は、限定されないが、Ｆｃ領域又はその断片が含まれる、別の免疫グロブリンドメインへ融合してもしなくてもよい。さらに、本明細書においてより詳しく概説されるように、抗体及び抗体（複数）という用語には、具体的には、下記に記載のようなＦｃ変異体が含まれ、完全長の抗体と、Ｆｃ領域又はその断片を含んでなり、少なくとも１つのアミノ酸残基修飾を含んでもよく、そして免疫グロブリンの免疫学的に活性な断片へ融合してもよい、変異体Ｆｃ融合体が含まれる。
下記により詳しく考察するように、抗体又は免疫グロブリンという一般用語は、生化学的に、そしてその重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依って、識別することができて、適正なクラスへ容易に帰属させることができる、５種の別個の抗体のクラスを含む。史的な理由のために、インタクト抗体の主要クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭと呼ばれる。ヒトでは、ＩｇＧ及びＩｇＡのクラスが、構造とある種の生化学的特性に依って、認知されたサブクラス（アイソタイプ）、即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へさらに分類され得る。ヒトのＩｇＧアイソタイプは、血清中のその豊富さの順で命名されて、ＩｇＧ１が最も豊富であることが理解されよう。
全５種の抗体クラス（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）とすべてのアイソタイプ（即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、並びにその変異体が本発明の範囲内にあるが、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを含んでなる好ましい態様について、単に例証の目的のために、やや詳しく考察する。しかしながら、そのような開示は、本発明を実施する例示の組成物及び方法について単に実証するのであって、本発明の範囲又は付帯の特許請求項を決して限定するものではないことを理解されたい。
この点に関して言えば、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンは、分子量がほぼ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽いポリペプチド鎖と、分子量がアイソタイプに依存して５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖を含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、対応するギリシャ語の小文字、α、δ、ε、γ、及びμによってそれぞれ示される。どの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに別個の型の１つへ帰属させることができる。当業者は、異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置がよく知られていることを理解されよう。
この４本の鎖は、ジスルフィド結合によってＹ配置で結合して、ここで軽鎖は、重鎖の外側にあって、Ｙの開口部より始まって、可変領域を通して続いて、Ｙの両端に至る。それぞれの軽鎖が重鎖へ１つの共有ジスルフィド結合によって連結するのに対し、ヒンジ領域にある２つのジスルフィド連結は、重鎖を結合する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有するが、その数は、ＩｇＧのアイソタイプに基づいて変動し得る。
それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインがこれに続く。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そしてその他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと並置して、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置している。この点に関して言えば、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）の両方の部分が抗原認識と特異性を決定すると理解される。一方、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、循環半減期、補体結合、等といった重要な生物学的特性を付与して制御する。転換によって、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより離れるにつれて増加する。このように、抗体のアミノ又はＮ末端は、可変領域を含み、カルボキシ又はＣ末端は、定常領域を含む。このように、ＣＨ３ドメインとＣＬドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が免疫グロブリン間の配列において広範囲に異なっていて、これらのホットスポットが特別な抗体の結合及び特異性の特徴を概ね決定するという事実に関連する。これらの超可変部位は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる、それぞれ３つのセグメントで出現する。ＣＤＲの近傍にある可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。より具体的には、天然に存在する単量体のＩｇＧ抗体において、抗体の各アームに存在するこの６つのＣＤＲは、抗体が水性環境においてその三次元構造をとるときに、抗原結合部位を形成するように特異的に定位される、アミノ酸の短い不連続配列である。
重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りを含んでなるフレームワーク領域は、アミノ酸配列において、より少ない分子間変動性を示す。むしろ、フレームワーク領域は、概ねβシートコンホメーションを採って、ＣＤＲは、このβシート構造に連結して、ある場合はその一部となるループを形成する。このように、これらのフレームワーク領域は、６つのＣＤＲを非共有結合性の鎖間相互作用によって正確な配向で定位することをもたらす骨格を形成するように作用する。この定位されたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原（即ち、ＥＦＮＡ４）上のエピトープに対する表面相補性を決定する。この相補的な表面は、免疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は、当業者によって容易に確定され得ると理解されよう。
下記により詳しく考察するように、そして付帯の「実施例」において示すように、有効
な抗体を提供するために、標準の組換え及び発現技術を使用して、重鎖及び軽鎖の可変領域の全部又は一部を再結合又は工学処理してよい。即ち、第一抗体（又はそのあらゆる部分）由来の重鎖又は軽鎖可変領域を、第二抗体由来の重鎖又は軽鎖可変領域のどの選択される部分とも混合して適合させてよい。例えば、１つの態様では、第一抗体の３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる軽鎖可変領域全体を、第二抗体の３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる重鎖可変領域全体と対合させて、作動可能な（operative）抗体を提供することができる。さ
らに、他の態様では、様々な抗体に由来する個々の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを混合して適合させて、最適化された特徴を有する所望の抗体を提供することができる。このように、例示の抗体は、第一抗体由来の３つの軽鎖ＣＤＲ、第二抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲ、及び第三抗体由来の第三の重鎖ＣＤＲを含んでよい。
より具体的には、本発明の文脈では、図面７Ａにおいて開示される重鎖及び軽鎖ＣＤＲのいずれも、本明細書の教示に従ってこの方法で再配置させて、最適化された抗ＥＦＮＡ（例、抗ｈＥＦＮＡ４）抗体を提供し得ることが理解されよう。即ち、図面７Ａに開示されるＣＤＲの１以上を、ＥＦＮＡモジュレーターに、そして特に好ましい態様では、１以上のエフリンＡリガンドと免疫特異的に会合するＣＤＲ移植又はヒト化抗体に取り込むことができる。
いずれにしても、相補性決定領域の残基番号は、Kabat et al.（1991, NIH 公開公報 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.）のそれのように定義し得て、具体的には、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＣＤＲ３）と重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲ３）である。ＣＤＲは、抗体ごとにかなり変動する（そして、定義上、カバット（Kabat）コンセンサス配列との相同性
を示さない）ことに留意されたい。フレームワーク残基の最大の並置には、しばしば、Ｆｖ領域に使用するために、スペーサー残基をこの番号付けシステムに挿入することが求められる。加えて、ある個別残基の同一性は、どの所与のカバット部位番号でも、種間又は対立遺伝子の多様性により、抗体鎖ごとに変動する場合がある。Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp.877-883 (1989) 及び MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) も参照のこと。ここでその定義には、互いに対して比較するときのアミノ酸残基の重なり又は亜集合が含まれる。上述した参考文献のそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれて、上記に引用した参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲが含まれるアミノ酸残基を比較のために示す。
ＣＤＲの諸定義
簡便性のために、図面７Ａに示すＣＤＲ（配列番号８〜５９及び７０〜９５）は、Chothia et al. の命名法を使用して定義されているが、本出願の内容があれば、当業者は、
それぞれの各重鎖及び軽鎖配列について、Kabat et al. 又は MacCallum et al. によっ
て定義されるようにＣＤＲを容易に同定して列挙することができよう。この点に関して言えば、実施例７（ｂ）で説明するヒト化分析には、Kabat et al. によって定義されるよ
うなＣＤＲを使用して、本発明に従ってヒト化抗体配列を図示する図面７Ｏ〜７Ｒ（配列番号１４８〜１６３）において下線を施している。従って、本発明の範囲内には、すべてのそのような命名法によって定義されるＣＤＲを含んでなる抗体が明白に含まれる。より概括的に言えば、「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」という用語には、上記に示したようなどの配列又は構造ベースの方法を使用しても同定されるようなＣＤＲ中のアミノ酸が含まれる。
本明細書に使用するように、「可変領域フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸に言及する。本明細書に使用する「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」という用語には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＣＤＲのカバット定義を使用する）アミノ酸残基が含まれる。故に、可変領域フレームワークは、長さが約１００〜１２０個のアミノ酸の不連続配列であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸だけが含まれる。
重鎖可変領域の具体例では、そして Kabat et al. によって定義されるようなＣＤＲでは、フレームワーク領域１がアミノ酸１〜３０を囲む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域２がアミノ酸３６〜４９を囲む可変領域のドメインに対応し；フレームワーク領域３がアミノ酸６６〜９４を囲む可変領域のドメインに対応して、フレームワーク領域４がアミノ酸１０３〜可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域も、軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれによって同様に分離している。同様に、Chothia et al. 又は McCallum et al. によるＣＤＲの定義を使用すると、フレームワーク領域の境界は、上記に記載のようなそれぞれのＣＤＲ末端によって分離される。
上述した構造上の考慮事項を銘記して、当業者は、本発明の抗体が、いくつかの機能的な態様のいずれも含んでよいことを理解されよう。この点に関して言えば，適合可能な抗体は、被検者において所望される生理学的応答をもたらす、どの免疫反応性抗体（この用語は、本明細書において定義される）も含んでよい。開示される抗体のいずれも本教示に従って使用してよいが、本発明のある態様は、キメラ、ヒト化、又はヒトモノクローナル抗体、又はそれらの免疫反応性断片を含む。なお他の態様は、例えば、ホモ（homogeneou
s）又はヘテロ（heterogeneous）の多量体構築体、Ｆｃ変異体、及びコンジュゲートされたか又はグリコシル化により改変された抗体を含んでよい。さらに、そのような配置が相互に排他的ではないこと、そして適合可能な個々の抗体が本明細書に開示する機能的な側面の１以上を含んでよいことが理解されよう。例えば、適合可能な抗体は、ヒト化可変領域がある一本鎖の二重特異性抗体（diabody）、又はグリコシル化パターンを変化させて
血清半減期を調節するＦｃ修飾がある、完全にヒトの完全長ＩｇＧ３抗体を含んでよい。当業者には、他の例示態様が容易に明らかであって、本発明の範囲内にあるものとして容易に識別可能であり得る。
ｂ．抗体作製
よく知られているように、本明細書の教示に従った抗体を提供するには、ウサギ、マウス、ラット、等が含まれる様々な宿主動物に接種して、これを使用してよい。免疫学的応答を高めるために使用し得る、当該技術分野で知られたアジュバントには、接種される種に依存して、限定されないが、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル剤、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性物質、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）のような、潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、抗原を局所の貯蔵部位（deposit）へ隔離することによってその速やかな
拡散を防ぐ場合もあれば、マクロファージにとって走化性である因子や免疫系の他の成分を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合もある。好ましくは、ポリペプチドを投与するならば、免疫化のスケジュールは、該ポリペプチドの２回以上の投与が数週にわたって行われることを伴う。
選択されるアイソフォーム及び／又はペプチド、又は所望のタンパク質を発現する生細胞又は細胞調製物を含み得るＥＦＮＡ免疫原（例、可溶性ＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１）での動物の接種後、その動物より、当該技術分野で公知の技術を使用して、抗体及び／又は抗体産生細胞を入手することができる。いくつかの態様では、動物を出血させるか又は犠牲にすることによってポリクローナル抗ＥＦＮＡ抗体含有血清を入手する。この血清は、動物より入手した形態で研究目的に使用しても、あるいは、この抗ＥＦＮＡ抗体を部分的又は完全に精製して、免疫グロブリン画分又は同種の抗体調製物を提供してもよい。
ｃ．モノクローナル抗体
本発明のある側面と併せてポリクローナル抗体を使用してよいが、好ましい態様は、ＥＦＮＡ反応性モノクローナル抗体の使用を含む。本明細書に使用するように、「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、実質的に同種の抗体の集団より得られる抗体を意味し、即ち、この集団を含んでなる個々の抗体は、微量に存在し得る可能な突然変異（例、天然に存在する突然変異）以外は、同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示して、どの種類の抗体と併せて使用してもよい。ある態様において、そのようなモノクローナル抗体には、ＥＦＮＡと結合又は会合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれて、ここでＥＦＮＡ結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択が含まれる方法によって入手される。
好ましい態様では、免疫化した動物より単離した細胞より抗体産生細胞株を調製する。免疫化の後で、その動物を犠牲にして、付帯の「実施例」に示すような、当該技術分野で周知の手段によって、リンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法には、限定されないが、それらを癌遺伝子でトランスフェクトすること、それらを癌ウイルスに感染させて不死化細胞を選別する条件の下でそれらを培養すること、それらを発癌性化合物又は変異原性化合物へ処すること、それらを不死化細胞（例、骨髄腫細胞）と
融合すること、及び腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが含まれる。骨髄腫細胞との融合を使用する場合、骨髄腫細胞は、好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。エフリンＡリガンド（選択されるアイソフォームが含まれる）又はその免疫反応性部分を使用して、不死化細胞をスクリーニングする。好ましい態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイを使用して実施する。
より一般的には、ハイブリドーマ、組換え技術、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、トランスジェニック動物（例、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）又はＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標））、又はこれらの何らかの組み合わせが含まれる、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して、本発明に一致した別々のモノクローナル抗体を製造することができる。例えば、上記に概括的に記載されて、Harlow et al.「抗体：実
験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）」（コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー出版局、第2版、1988）；「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）」（エルセヴィエ、ニューヨーク、1981）中、Hammerling, et al., 563-681（このそれぞれは、本明細書に組み込まれる）におい
てより詳しく教示されるようなハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を製造することができる。開示されるプロトコールを使用して、好ましくは、関連の抗原とアジュバントの多数の皮下又は腹腔内注射によって、抗体を哺乳動物中で産生する。先に考察したように、この免疫化は、活性化された脾臓細胞又はリンパ球からの抗原反応性抗体（免疫化動物がトランスジェニックであれば、完全にヒトのものであり得る）の産生を含む免疫応答を概ね誘発する。生じる抗体は、この動物の血清より採取してポリクローナル調製物を提供し得るが、一般的には、脾臓、リンパ節、又は末梢血より個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体の同種調製物を提供することがより望ましい。最も典型的には、脾臓よりリンパ球を入手して不死化して、ハイブリドーマを提供する。
例えば、上記に記載のように、この選択法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。例えば、標的への親和性を高める、標的結合配列をヒト化する、細胞培養中でのその産生を改善する、その in vivo での免疫原性を低下させる、多重特
異性抗体を創出する、等のために選択したＥＦＮＡ結合配列をさらに改変することができること、そしてその改変した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された別々の抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、交差反応性であり得る他の免疫グロブリンがそこに混在していない点で有利である。
ｄ．キメラ抗体
別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種又は種類の抗体からの共有結合したタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含んでよい。本明細書に使用するように、「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種に由来するか又は特別な抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である一方で、この鎖（複数）の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片（それらが所望される生理活性を示す限りにおいて）の中の対応配列と同一又は相同である構築体へ向けられると理解されよう（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。１つの例示態様において、本明細書の教示に従うキメラ抗体は
、マウスのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列とヒトの供給源に由来する定常領域を含んでよい。他の適合可能な態様において、本発明のキメラ抗体は、下記に記載のようなＣＤＲ移植抗
体又はヒト化抗体を含んでよい。
一般的に言えば、キメラ抗体を作製する目標は、企図される被検者種からのアミノ酸の数が最大化されたキメラを創出することである。１つの例は、ＣＤＲ移植抗体であって、ここでこの抗体は、特別な種に由来するか又は特別な抗体クラス又はサブクラスに属する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方で、この抗体鎖（複数）の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である。ヒトにおける使用のためには、齧歯動物の抗体からの可変領域又は選択ＣＤＲをヒト抗体の中へ移植して、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲに置き換える。これらの構築体は、一般的には、最強のモジュレーター機能（例、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、等）を提供する一方で、この抗体に対する被検者による望まれない免疫応答を低下させるという利点を有する。
ｅ．ヒト化抗体
ＣＤＲ移植抗体に似ているのがヒト化抗体である。一般的に言えば、ヒト化抗体は、初めは非ヒト動物において作製されたモノクローナル抗体より産生する。本明細書に使用するように、非ヒト（例、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。１つの態様において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体のＣＤＲからの残基が、所望される特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト霊長動物のような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換わっている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント又はアクセプター抗体）である。
一般的に言えば、抗体のヒト化は、ドナー抗体とレシピエント抗体の両方の配列相同性及びカノニカル構造の分析を含む。選択態様において、レシピエント抗体は、コンセンサス配列を含む場合がある。ヒトのコンセンサスフレームワークを創出するには、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列からのフレームワークを並置して、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。さらに、多くの事例では、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン中の１以上のフレームワーク残基を、ドナー抗体からの対応する非ヒト残基によって置き換える。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって（例えば、ＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、及び特別な位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって）確認される。このような置換は、移植ＣＤＲ（複数）適正な三次元配置を維持するのに役立ち、フレームワーク置換のない類似の構築体に優って親和性をしばしば改善する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体やドナー抗体に見出されない残基を含んでよい。これらの修飾を施して、既知の技術を使用して抗体性能をさらに洗練させることができる。
ＣＤＲ移植抗体とヒト化抗体については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号、及び５，５３０，１０１号に記載されている。概して言えば、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここでそのＣＤＲのすべて又は実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応して、フレームワーク領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)；及び Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) を参照のこと。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (
1994)；及び、米国特許第６，９８２，３２１号及び７，０８７，４０９号を参照のこと
。なお別の方法は、ヒューマニアリング（humaneering）と呼ばれて、例えば、Ｕ．Ｓ．
２００５／０００８６２５に記載されている。本出願の目的では、「ヒト化抗体」という用語には、フレームワーク置換が無いかほとんど無いＣＤＲ移植抗体（即ち、１以上の移植非ヒトＣＤＲを含んでなるヒト抗体）が明白に含まれるものとする。
追加的に言えば、非ヒト抗ＥＦＮＡ抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に開示される方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的除去又は脱免疫化によって修飾してよい。簡潔に言えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域についてＭＨＣクラスＩＩへ結合するペプチドを解析することができて；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７において定義されるような）を代表する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、ペプチドスレディング（peptide threading）と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用し得て、加えて、Ｗ
Ｏ９８／５２９７６及びＷＯ００／３４３１７に記載のように、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを求めて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれへも結合して、それにより潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を置換することによるか又は単一アミノ酸置換によって消失させることができる。可能な限り、保守的な置換がなされる。しばしば、絶対的ではないが、ヒト生殖細胞系抗体配列中のある位置に共通のアミノ酸が使用され得る。脱免疫化の変化を確認した後で、突然変異誘発又は他の合成法（例、de novo 合成、カセット置換、等）によって、ＶＨ及びＶＬをコードする核酸を構築することができる。突然変異誘発した可変配列をヒト定常領域へ融合させてもよい。
選択態様では、ヒト化抗体可変領域残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％が親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。他の態様では、ヒト化抗体残基の少なくとも８５％又は９０％が親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。さらに好ましい態様では、ヒト化抗体残基の９５％より多くが親のフレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列の残基に対応する。
ヒト化抗体は、本明細書に記載のような通常の分子生物学及び生体分子工学の技術を使用して製造することができる。これらの方法には、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖由来の免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること、及び発現させることが含まれる。そのような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば、上記に記載のような、予め決定された標的に対する抗体又は免疫反応性断片を産生するハイブリドーマ、真核細胞、又はファージより、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子より、又は合成構築体より入手し得る。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡを適正な発現ベクターの中へクローン化することができる。
ヒト生殖細胞系配列は、例えば、Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227: 799-817; 及び Tomlinson et al. (1995) EMBOJ 14: 4628-4638 に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域
配列の包括的なディレクトリを提供する（Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674 を参照のこと）。これらの配列は、ヒト配列の（例えば、フレームワーク領域及び
ＣＤＲのための）供給源として使用することができる。本明細書に説明するように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も、例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載のように、使用することができる。
ｆ．ヒト抗体
上述した抗体に加えて、当業者は、本発明の抗体が完全ヒト抗体を含み得ることを理解されよう。本出願の目的では、「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された、及び／又は本明細書に開示するようなヒト抗体を作製するための技術のいずれも使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を含む。このヒト抗体の定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を排除する。
当該技術分野で公知の様々な技術を使用して、ヒト抗体を産生することができる。上記に述べたように、ファージディスプレイ技術を使用して、本教示に準拠した免疫活性の結合領域を提供することができる。このように、本発明のある態様は、（好ましくは、ヒト）抗体のライブラリーをファージ上で合成する工程、このライブラリーを選択されるＥＦＮＡ又はその抗体結合部分でスクリーニングする工程、ＥＦＮＡへ結合するファージを単離する工程、及びこのファージより免疫反応性断片を入手する工程を含んでなる、抗ＥＦＮＡ抗体又はその抗原結合部分を産生するための方法を提供する。例を挙げると、ファージディスプレイ技術における使用のための抗体ライブラリーを製造するための１つの方法は、ヒト又は非ヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含んでなる非ヒト動物を、選択したＥＦＮＡ又はその抗原性部分で免疫化して、免疫応答を創出する工程、免疫化した動物より抗体産生細胞を抽出する工程；この抽出した細胞より、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＲＮＡを単離する工程、このＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生する工程、プライマーを使用してこのｃＤＮＡを増幅する工程、及びこのｃＤＮＡを、抗体がファージ上で発現されるように、ファージディスプレイベクターへ挿入する工程を含む。より具体的には、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡをｓｃＦｖリンカーと共にＰＣＲによって組換えて、ファージミドベクター（例、ｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）へクローン化する。次いで、このベクターは、大腸菌（E. coli）中へ電気穿孔させてよく、
次いでこの大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用するファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３が含まれる繊維状ファージであって、ＶＨ及びＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩの一方へ組換え的に融合される。
上記のように製造した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明の組換えヒト抗ＥＦＮＡ抗体を単離することができる。好ましい態様において、該ライブラリーは、Ｂ細胞より単離したｍＲＮＡより製造されるヒトのＶＬ及びＶＨｃＤＮＡを使用して産生される、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。当該技術分野では、このようなライブラリーを製造してスクリーニングする方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを産生するためのキットが市販されている（例えば、ファルマシア社の組換えファージ抗体システム（Recombinant Phage Antibody System）、カタログ番号：２７−９４００−０１；及び、Stratagene のＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号：２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを産生してスクリーニングするのに使用し得る他の方法及び試薬も存在する（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開公報番号：ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et. al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); 及び Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991) を参照のこと）。
ナイーブライブラリー（天然又は合成のいずれか）によって産生される抗体は、中等度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）であるが、当該技術分野で記載されるような
二次ライブラリーより構築して再選択することによって、親和性成熟も in vitro で模倣することができる。例えば、Hawkins et. al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) の方法において、又は Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)
の方法において、エラーを起こしやすい（error-prone）ポリメラーゼ（Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) に報告されている）を使用することによって、突然変異を in vitro で無作為に導入することができる。追加的に言えば、例えば、選択した個々の
Ｆｖクローンにおいて、対象のＣＤＲが含まれるランダム配列を担うプライマーでＰＣＲを使用して１以上のＣＤＲを無作為に突然変異させて、より高親和性のクローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を実施することができる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域中に突然変異誘発を引き起こして、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効なアプローチは、Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992) に記載のように、ファージディスプレイによって選択されるＶＨ又はＶＬドメインを、非免疫化ドナーより得られる天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと組換えて、数回の鎖リシャッフリング（chain reshuffling）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術により、解離
定数：Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下である抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
結合対をその表面に発現する真核細胞（例、酵母）を含んでなるライブラリーを使用して同様の手順を利用し得ることがさらに理解されよう。ファージディスプレイ技術と同様に、この真核細胞ライブラリーを対象の抗原（即ち、ＥＦＮＡ）に対してスクリーニングして、候補結合対を発現する細胞を単離してクローン化する。ライブラリー内容を最適にすることと反応性結合対の親和性成熟のために種々の工程を講じてよい。例えば，米国特許第７，７００，３０２号及び米国仮特許出願シリアル番号：１２／４０４，０５９を参照のこと。１つの態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーより選択されて、ここでそのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI.
Biol, 222:581 (1991)）。他の態様では、酵母のような真核細胞において産生されるコ
ンビナトリアル抗体ライブラリーよりヒト結合対を単離してよい。例えば、米国特許第７，７００，３０２号を参照のこと。このような技術は、有利にも、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能にして、候補配列の相対的に容易な操作（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリング（recombinant shuffling）による）を提供する。
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が一部又は完全に不活性化されたマウス）の中へ導入することによって作製することができる。抗原チャレンジすると、ヒト抗体産生が観測されて、これは、遺伝子再編成、アセンブリー、及び抗体レパートリーを含めて、ヒトで見られるものとすべての点で酷似している。このアプローチについては、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号に記載され、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（登録商標）技術に関しては、以下の科学文献とともに米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号に記載されている：Marks et al., Bio/Technology
10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向された抗体を
産生するヒトＢリンパ球の不死化により産生してよい（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体より回収してもよく、in vitro で免疫化してもよい）。例えば
、Cole et al.「モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy）」Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); 及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
ＶＩ．抗体の特徴
当該抗体モジュレーターをどのように入手したとしても、またそれが上述した形態（例、ヒト化、ヒト、等）のいずれを採るとしても、開示モジュレーターの好ましい態様は、様々な特徴を示す可能性がある。この点に関して言えば、抗ＥＦＮＡ抗体産生細胞（例、ハイブリドーマ又は酵母コロニー）を、例えば、活発な増殖、高い抗体産生、及び（下記により詳しく考察するような）望ましい抗体特徴が含まれる望ましい特徴について選択し、クローン化して、さらにスクリーニングしてよい。ハイブリドーマは、同系遺伝子の動物、免疫系を欠損している動物（例、ヌードマウス）において in vivo で、又は細胞培
養において in vitro で拡充させることができる。そのそれぞれが別々の抗体種を産生するハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択する、クローン化する、及び拡充させる方法は、当業者に周知である。
ａ．中和抗体
特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、中和抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「中和抗体」又は「中和アンタゴニスト」という用語は、エフリンＡリガンドへ結合するか又はそれと相互作用してリガンドのその結合相手（例、ＥＰＨＡ受容体）への結合又は会合を防ぐことによって、これら分子の相互作用より生じるはずの生体応答を妨害する抗体又はアンタゴニストを意味する。抗体又はその免疫学的に機能的な断片若しくは誘導体の結合と特異性について評価する場合、抗体又は断片がリガンドのその結合相手又は基質への結合を実質的に阻害するのは、例えば、in vitro 競合結合アッセ
イ（例えば、本明細書の実施例９〜１２を参照のこと）で測定されるように、過剰の抗体が標的分子へ結合する結合相手の量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％以上低下させるときである。例えば、ＥＦＮＡ４に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは、ＥｐｈＡ４へ結合するＥＦＮＡ４の能力を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％以上減少させる。この減少した活性は、当該技術分野で認められた技術を使用して直接測定しても、そのような低下がＥＰＨ（例、ＥＰＨＡ４）受容体活性に及ぼす影響によって測定してもよいと理解されよう。
ｂ．内在化抗体
選択されるエフリンＡリガンド又はそれらのアイソフォームが可溶型で存在する場合があることを示す証拠はあるが、少なくともある種のＥＦＮＡ（例、ＥＦＮＡ１及びＥＦＮＡ４）は、細胞表面と会合した状態にあるようであり、それにより開示モジュレーターの内在化を可能にしている。従って、本発明の抗ＥＦＮＡ抗体は、エフリンＡリガンドを発現する細胞によって、少なくともある程度は、内在化され得る。例えば、腫瘍始原細胞の表面上のＥＦＮＡ４へ結合する抗ＥＦＮＡ４抗体は、腫瘍始原細胞によって内在化され得る。特に好ましい態様では、そのような抗ＥＦＮＡ抗体を、内在化と同時に細胞を殺傷する細胞傷害性部分のような抗癌剤と会合させるか又はそれへコンジュゲートさせてよい。
本明細書に使用するように、内在化する抗ＥＦＮＡ抗体とは、哺乳動物細胞と会合したＥＦＮＡへの結合時にその細胞によって取り込まれるものである。この内在化抗体には、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体、及び抗体コンジュゲートが含まれる。内在化は、in vitro でも in vivo でも起こり得る。療法上の応用では、内在化が in vivo で起こり得る
。内在化される抗体分子の数は、ＥＦＮＡ発現細胞、特にＥＦＮＡ発現腫瘍始原細胞を殺傷するのに十分又は充分であり得る。抗体又は抗体コンジュゲートの効力に依っては、いくつかの事例において、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに、該細胞への単一の抗体
分子の取込みで十分である。例えば、ある毒素は、殺傷においてきわめて強力であるので、腫瘍細胞を殺傷するには、抗体へコンジュゲートした毒素の１分子の内在化で十分である。抗ＥＦＮＡ抗体が哺乳動物細胞上のＥＦＮＡへの結合時に内在化されるかどうかは、下記の実施例（例、実施例１５及び１６）に記載されるものが含まれる様々なアッセイによって決定することができる。抗体が細胞中へ内在化されるかどうかを検出する方法については、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６１９，０６８号にも記載されている。
ｃ．枯渇性抗体
他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、枯渇性抗体又はその誘導体若しくは断片を含む。「枯渇性抗体」という用語は、細胞表面の上又は近くにあるＥＦＮＡへ結合するか又はそれと会合して、該細胞の死滅又は消失を（例えば、補体依存性細胞傷害又は抗体依存性細胞傷害によって）誘発する、促進する、又は引き起こす抗体又は断片を意味する。下記により詳しく考察するいくつかの態様において、選択した枯渇性抗体は、細胞傷害剤へ会合又はコンジュゲートされる。好ましくは、枯渇性抗体は、ある一定の細胞集団において、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の腫瘍永続化細胞を枯渇する、消失させる、又は殺傷する。いくつかの態様において、この細胞集団は、濃縮、分画、精製、又は単離された腫瘍永続化細胞を含んでよい。他の態様において、この細胞集団は、腫瘍永続化細胞を含む腫瘍試料全体又は異種の腫瘍抽出物を含んでよい。当業者は、下記の実施例（例、実施例１６）に記載のような標準の生化学技術を本明細書の教示に従って使用して、腫瘍形成細胞又は腫瘍永続化細胞の枯渇をモニターして定量し得ることを理解されよう。
ｄ．エピトープ結合
開示される抗ＥＦＮＡ抗体は、選択された標的（複数）によって提示される別々のエピトープ又は決定基と会合するか又はそれへ結合するとさらに理解されよう。本明細書に使用するように、エピトープという用語は、特別の抗体によって認識されて特異的に結合されることが可能な標的抗原のその部分を意味する。抗原がＥＦＮＡのようなポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸からも、タンパク質の三次元フォールディングによって並列される不連続アミノ酸からも形成され得る。連続したアミノ酸より形成されるエピトープがタンパク質の変性時に典型的には保持されるのに対し、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質の変性時に典型的には失われる。エピトープには、典型的には、少なくとも３個、そしてより通常は、少なくとも５又は８個〜１０個のアミノ酸が独自の空間コンホメーションに含まれる。より具体的には、当業者は、エピトープという用語には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体へ特異結合するか又は他の方法で分子と相互作用することが可能などのタンパク質決定基も含まれると理解されよう。エピトープの決定基は、一般的には、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置からなり、一般的には、特異的な三次元構造上の特性、並びに特異的な荷電特性を有する。追加的に言えば、エピトープは、線状でも高次構造状でもよい。線状エピトープでは、該タンパク質と相互作用分子（抗体のような）の間の相互作用点のすべてが該タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に生じる。高次構造状エピトープでは、相互反応の点が、直線的には互いに分離しているタンパク質上のアミノ酸残基の全体で生じる。
抗原上の所望のエピトープが決定されたならば、例えば、本発明において記載される技術を使用して、エピトープを含んでなるペプチドで免疫化することによって、そのエピトープに対する抗体を産生することが可能である。あるいは、この探索プロセスの間に、抗体の産生及び特性決定によって、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。次いで、この情報より、抗体について同じエピトープへ結合することを競合的にスク
リーニングすることが可能である。このことを達成するアプローチは、競合試験を実施して、互いに競合的に結合する抗体（即ち、この抗体は、抗原への結合に関して競合する）を見出すことである。ＷＯ０３／４８７３１には、それらの交差競合性に基づいて抗体をビニングする（binning）ためのハイスループット法が記載されている。
本明細書に使用するように、「ビニング（binning）」という用語は、それらの抗原結
合特性に基づいて抗体を群分けするための方法を意味する。ビンの割当ては、試験した抗体の観測された結合パターンがどのくらい異なるかに依存して、やや恣意的である。このように、この技術は、本発明の抗体を分類するのに有用なツールであるが、そのビンは、必ずしも直にエピトープと相関するものではないので、そのような初めの決定は、他の当該技術分野で認められた方法論によってさらに確かめるべきである。
この注意事項に留意して、選択した一次抗体（又はその断片）が同じエピトープへ結合するのかどうか、又は結合に関して二次抗体と交差競合するのかどうかを、当該技術分野で公知であり、且つ本明細書の実施例で説明されている方法を使用することによって決定することができる。１つの態様では、本発明の一次抗体を飽和条件の下でＥＦＮＡへ結合させることが可能であり、次いでＥＦＮＡへ結合する二次抗体の能力を測定する。この試験抗体が一次の抗ＥＦＮＡ抗体と同時にＥＦＮＡへ結合することが可能であれば、その二次抗体は、一次抗体と異なるエピトープへ結合する。しかしながら、二次抗体が同時にＥＦＮＡへ結合することが可能でなければ、二次抗体は、同じエピトープ、部分的に重なるエピトープ、又は一次抗体が結合するエピトープのごく近傍にあるエピトープへ結合する。当該技術分野で公知であり、下記の実施例において詳述されるように、所望のデータは、固相の直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム（即ち、表面プラズモン共鳴法−GE Healthcare）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚ
ｅｒ（即ち、バイオレイヤー干渉法−ForteBio 社）、又はフローサイトメトリー法を使
用して入手することができる。本明細書に使用する「表面プラズモン共鳴法」という用語は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象に関連する。特に好ましい態様において、この分析は、下記の実施例において証明されるように、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＦｏｒｔｅＢｉｏ機器を使用して実施する。
同じエピトープについて競合する抗体の文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、試験下の抗体又は免疫学的に機能的な断片が共通抗原に対する参照抗体の特異結合を防ぐか又は阻害するアッセイにおいて決定される、抗体間の競合を意味する。典型的には、そのようなアッセイは、上記抗体のいずれかを担う固体表面又は細胞へ結合する精製抗原、非標識の被検免疫グロブリン、及び標識された参照免疫グロブリンの使用を伴う。競合阻害は、被検免疫グロブリンの存在下でこの固体表面又は細胞へ結合する標識の量を定量することによって測定する。通常、この被検免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープへ結合する抗体と、参照抗体が結合するエピトープに対して立体障害が起こるほど十分近傍にある隣接エピトープへ結合する抗体が含まれる。競合結合を決定するための方法に関する追加の詳細を本明細書の実施例に提供する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、参照抗体の共通抗原への特異結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又は７５％阻害する。ある事例では、結合が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％以上阻害される。
エピトープ特異性以外に、開示される抗体は、いくつかの異なる物理特性（例えば、結合親和性、融点（Ｔｍ）、及び等電点が含まれる）を使用して、特性決定してよい。
ｅ．結合親和性
この点に関して言えば、本発明には、選択されるＥＦＮＡに対して（又は、汎抗体の場合は、１種より多いエフリンＡリガンドに対して）高い結合親和性を有する抗体の使用がさらに含まれる。本発明の抗体がその標的抗原へ特異的に結合すると言われるのは、解離定数：Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−８Ｍであるときである。この抗体は、Ｋｄが≦５ｘ１０−９Ｍであるときには高い親和性で、そしてＫｄが≦５ｘ１０−１０Ｍであるときはきわめて高い親和性で抗原へ特異的に結合する。本発明の１つの態様において、該抗体は、１０−９Ｍ以下のＫｄと約１ｘ１０−４／秒のオフ速度を有する。本発明の１つの態様において、オフ速度は、＜１ｘ１０−５／秒である。本発明の他の態様において、該抗体は、ＥＦＮＡへ約１０−８Ｍと１０−１０Ｍの間のＫｄで結合して、なお別の態様において、それは、２ｘ１０−１０Ｍ以下のＫｄで結合する。本発明のなお他の選択される態様は、１０−２Ｍ未満、５ｘ１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５ｘ１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５ｘ１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５ｘ１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５ｘ１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５ｘ１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５ｘ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５ｘ１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５ｘ１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５ｘ１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５ｘ１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５ｘ１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５ｘ１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ、又は５ｘ１０−１５Ｍ未満の解離定数又はＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
具体的態様において、ＥＦＮＡへ免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも２ｘ１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５ｘ１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、又は少なくとも１０８Ｍ−ｌｓ−ｌの会合速度定数又はｋｏｎ速度（ＥＦＮＡ（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
別の態様において、ＥＦＮＡへ免疫特異的に結合する本発明の抗体は、ｌ０−ｌｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−ｌｓ−ｌ未満、ｌ０−２ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−２ｓ−ｌ未満、ｌ０−３ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−３ｓ−ｌ未満、ｌ０−４ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−４ｓ−ｌ未満、ｌ０−５ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−５ｓ−ｌ未満、ｌ０−６ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−６ｓ−ｌ未満、ｌ０−７ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−７ｓ−ｌ未満、ｌ０−８ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−８ｓ−ｌ未満、ｌ０−９ｓ−ｌ未満、５ｘｌ０−９ｓ−ｌ、又はｌ０−１０ｓ−未満のｋｏｆｆ速度（ＥＦＮＡ（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）を有する。
本発明の他の選択された態様において、抗ＥＦＮＡ抗体は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５ｘ１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、又は少なくとも５ｘ１０１５Ｍ−１の親和定数又はＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。
ｆ．等電点
上述した結合特性に加えて、抗ＥＦＮＡ抗体とその断片は、すべてのポリペプチドのように、一般的にはポリペプチドが実効電荷を担わないときのｐＨとして定義される、等電点（ｐＩ）を有する。当該技術分野では、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）に等
しい場合、典型的には該タンパク質の溶解度が最低になることが知られている。故に、抗体中のイオン化可能な残基の数と位置を改変してｐＩを調整することによって溶解度を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適正なアミノ酸置換を施すことによって（例えば、アラニンのような非電荷残基にリジンのような荷電アミノ酸を代用することによって）操作することができる。どの特別な理論にも束縛されることを望まずに言えば、抗体のｐＩの変化をもたらす前記抗体のアミノ酸置換は、該抗体の溶解度及び／又は安定性を改善する場合がある。当業者は、ある特別な抗体が所望のｐＩを達成するのにどのアミノ酸置換が最も適正であるかを理解されよう。
タンパク質のｐＩは、限定されないが、等電点電気泳動と様々なコンピュータアルゴリズムが含まれる多様な方法によって決定することができる（例えば、Bjellqvist et al.,
1993, Electrophoresis 14: 1023 を参照のこと）。１つの態様において、本発明の抗ＥＦＮＡ抗体のｐＩは、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、又は約９．０の間かそれより高い。別の態様において、本発明の抗ＥＦＮＡ抗体のｐＩは、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、又は９．０の間かそれより高い。なお別の態様において、本発明の抗体のｐＩの改変をもたらす置換は、ＥＦＮＡへのその結合親和性を有意には減少させない。下記により詳しく考察するように、具体的には、ＦｃγＲへの結合の改変をもたらすＦｃ領域の置換（複数）は、ｐＩの変化ももたらす場合があると考慮される。好ましい態様では、所望されるＦｃγＲ結合の改変とｐＩの所望されるあらゆる変化をともに有効にするように、Ｆｃ領域の置換（複数）が具体的に選択される。本明細書に使用するように、ｐＩ値は、優勢な荷電形状のｐＩとして定義される。
ｇ．熱安定性
抗体のＦａｂドメインのＴｍは、抗体の熱安定性の良好な指標であり得、さらに貯蔵寿命の目安となり得ることがさらに理解されよう。Ｔｍは、所与のドメイン又は配列の５０％アンフォールディングの温度に他ならない。Ｔｍが低いほどより多くの凝集／より少ない安定性を示すのに対し、Ｔｍが高いほど、より少ない凝集／より大きな安定性を示す。従って、より高いＴｍを有する抗体又はその断片若しくは誘導体が好ましい。さらに、当該技術分野で認められた技術を使用して、抗ＥＦＮＡ抗体又はそのドメインの組成を改変して、分子安定性を高めるか又は最適化することが可能である。例えば、米国特許第７，９６０，１４２号を参照のこと。このように、１つの態様において、選択した抗体のＦａｂドメインは、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、又は１２０℃より高いＴｍ値を有する。別の態様において、抗体のＦａｂドメインは、少なくとも約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃又は約１２０℃より高いＴｍ値を有する。当該技術分野で公知の標準法を使用して、例えば、示差走査熱量測定（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Vermeer et al., 2000, Biophys.
J. 78: 394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154 を参照のこと）
によって、タンパク質ドメイン（例、Ｆａｂドメイン）の熱融解温度（Ｔｍ）を測定することができる。
ＶＩＩ．ＥＦＮＡモジュレーターの断片及び誘導体
本発明の薬剤が、インタクト融合構築体、抗体、断片、又は誘導体のいずれを含むとしても、選択したモジュレーターは、ＥＦＮＡと反応する、結合する、組み合わさる、複合する、接続する、付着する、一緒になる、相互作用する、又は他の方法で会合して、それによって所望の抗新生物効果をもたらす。当業者は、抗ＥＦＮＡ抗体を含んでなるモジュレーターが該抗体上で発現される１以上の結合部位を介してＥＦＮＡと相互作用するか又は会合することを理解されよう。より具体的には、本明細書に使用するように、「結合部位」という用語は、対象の標的分子（例、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質、又は阻
害剤）へ選択的に結合することの原因となるポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも１つの結合部位を含む（例えば、インタクトＩｇＧ抗体は、２つの結合ドメインと２つの結合部位を有するものである）。例示の結合ドメインには、抗体の可変ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインが含まれる。本発明の目的では、ＥＦＮＡの典型的な活性領域は、（例えば、Ｆｃ−ＥＦＮＡ融合構築体の一部として）基質（例、Ｅｐｈ受容体）の結合部位を含み得る。
ａ．断片
本発明を実施するのに、どの形態のモジュレーター（例、キメラ、ヒト化、等）を選択しても、その免疫反応性断片は、本明細書の教示に従って使用し得ると理解されよう。最も広義において、「抗体断片」という用語は、インタクト抗体（例、天然に存在する免疫グロブリン）の少なくとも一部を含む。より具体的には、「断片」という用語は、インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含んでなる抗体又は抗体鎖（又は、Ｆｃ融合の場合はＥＦＮＡ分子）の一部又は部分を意味する。「抗原結合断片」という用語は、抗原と結合するか又はインタクト抗体と（即ち、それらが導かれたインタクト抗体と）抗原結合（即ち、特異結合）について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書に使用するように、「抗体分子の断片」という用語には、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単ドメイン抗体断片、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片より生成される多重特異性抗体が含まれる。同様に、ＥＦＮＡの活性断片は、ＥＦＮＡ基質又は受容体と相互作用してインタクトＥＦＮＡのそれと似た様式でそれらを修飾する（やや低い効率であるかもしれないが）その能力を保持するＥＦＮＡ分子の一部を含む。
当業者は、インタクト又は完全なモジュレーター（例、抗体又は抗体鎖）の化学的又は酵素的処理によるか又は組換え手段によって断片を入手し得ることを理解されよう。この点に関して言えば、インタクト抗体の消化の点から様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、そのような断片を化学的に、又は組換えＤＮＡの方法論を使用することによって de novo 合成し得ることを理解されよう。このように、本明細書に使用する抗体という用
語には、抗体全体の修飾によって産生されるか又は組換えＤＮＡの方法論を使用して de novo 合成される抗体又はその断片若しくは誘導体が明白に含まれる。
より具体的には、抗体のパパイン消化は、それぞれに単一の抗原結合部位がある、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残余のＦｃ断片（この名称は、容易に結晶するその能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、依然として抗原と交差結合することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインが含まれる重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数）が少なくとも１つのフリーチオール基を担うＦａｂ’の明示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングについても知られている。他の抗体断片のより詳しい記載については、例えば「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」W. E. Paul（監修）レイブン・プレス、ニ
ューヨーク（1999）を参照のこと。
Ｆｖ断片が完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片であることがさらに理解されよう。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが緊密に会合した（これは、天然では、例えばｓｃＦｖでは、共有結合性であり得る）二量体からなる。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原
結合部位を規定するのは、この配置においてである。この６つのＣＤＲ又はその亜集合は、集合的に、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなる、ＦＶの半分）でも、通常は完全な結合部位より低い親和性であるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
他の態様において、抗体断片は、例えば、Ｆｃ領域を含み、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、及び補体結合といった、インタクト抗体中に存在しているときのＦｃ領域に普通は関連する生体機能の少なくとも１つを保持する。１つの態様において、抗体断片は、インタクト抗体に実質的に類似した in vivo 半減期を有する一価抗体である
。例えば、そのような抗体断片は、その断片へin vivo 安定性を付与することが可能なＦｃ配列へ連結した抗原結合アームを含む場合がある。
ｂ．誘導体
別の態様では、本発明のモジュレーターが一価でも多価（例、二価、三価、等）でもよいことがさらに理解されよう。本明細書に使用するように、「結合価」という用語は、抗体と会合する潜在的な標的（即ち、ＥＦＮＡ）結合部位の数を意味する。それぞれの標的結合部位は、１つの標的分子、又は標的分子上の特定の位置又は座へ特異的に結合する。本発明の抗体が１より多い標的結合部位を含む（多価）とき、それぞれの標的結合部位は、同じ分子か又は異なる分子へ特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンド又は異なる抗原へ、又は同じ抗原上の異なるエピトープ又は位置へ結合し得る）。本発明の目的では、主題の抗体は、好ましくは、ヒトＥＦＮＡに特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。１つの態様において、本発明の抗体は、その分子のそれぞれの結合部位が単一のＥＦＮＡの位置又はエピトープへ特異的に結合するという点で一価であろう。他の態様において、該抗体は、それらが１より多い結合部位と、単一より多い位置又はエピトープと特異的に会合する異なる結合部位を含むという点で多価であろう。そのような場合は、選択したＥＦＮＡポリペプチド又はスプライス変異体に多重エピトープが存在し得るか、又はＥＦＮＡ上に単一エピトープが存在し得る一方で、別の分子又は表面上に第二の異なるエピトープが存在し得る。例えば、米国特許第２００９／０１３０１０５号を参照のこと。
上記に述べたように、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープへ免疫特異的に結合しても、標的分子だけでなく、異種ポリペプチドのような異種エピトープ又は固体支持材料へも免疫特異的に結合してよい。抗ＥＦＮＡ抗体の好ましい態様は、２つの抗原だけに結合する（即ち、二重特異性抗体）が、本発明には、三重特異性抗体のような追加の特異性がある抗体も含まれる。二重特異性抗体の例には、限定なしに、ＥＦＮＡへ対して指向される１つのアームと他のあらゆる抗原（例、モジュレーター細胞マーカー）に対して指向される他のアームがあるものが含まれる。当該技術分野では、二重特異性抗体を作製するための方法が公知である。完全長の二重特異性抗体の従来的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539）。他のより洗練された適合可能な多重特異性構築体とそれらの製造の方法は、米国特許第２００９／０１５５２５５号に説明されている。
なお他の態様では、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）のある抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合する。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含んでなる、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。１つの例では、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一重鎖定常領域（ＣＨ１）がその融合物の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望されるならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクター中へ挿入して、好適な宿主生物へ同時トランスフェクトする。これにより、構築体中で使用される３つのポリペプチド鎖の同等でない割合が最適な収量をもたらす場合の態様において、こ
の３つのポリペプチド断片の相互比率を調整するのに大きな柔軟性が得られる。しかしながら、等しい割合の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、又はこの割合が特に重要でないときは、２個又は全３個のポリペプチド鎖のコーディング配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの１つの態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性が一方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖（例、ＥＦＮＡ４）と、他のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）からなる。この不斉構造は、二重特異性分子の片方だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離法がもたらされるので、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生することのさらなる詳細には、例えば、Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121: 210 を参照のこと。ＷＯ９６／２７０１１
に記載される別のアプローチによれば、抗体分子の対を工学処理して、組換え細胞培養より回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にすることができる。好ましいインターフェイスは、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子のインターフェイス由来の１以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例、チロシン又はトリプトファン）に置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例、アラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第二抗体分子のインターフェイス上に、大きな側鎖（複数）と同一又は類似の大きさの代償性空洞（compensatory cavities）が創出される。これにより、ホモ二量体のような他の望まれない最終産物に優って
ヘテロ二量体の収量を高めるための機序が提供される。
二重特異性抗体には、架橋連結又はヘテロコンジュゲートの抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンへ、他方をビオチンへカップリングすることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まれない細胞へ標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）に提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、どの簡便な架橋連結法を使用しても作製してよい。当該技術分野では好適な架橋連結剤が周知であり、いくつかの架橋連結技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
ＶＩＩＩ．ＥＦＮＡモジュレーター−定常領域の修飾
ａ．Ｆｃ領域及びＦｃ受容体
上記に示した、開示モジュレーター（例、Ｆｃ−ＥＦＮＡ又は抗ＥＦＮＡ抗体）の可変又は結合領域に対する様々な修飾、置換、付加、又は削除に加えて、当業者は、本発明の選択態様が定常領域（即ち、Ｆｃ領域）の置換又は修飾も含み得ることを理解されよう。より具体的には、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、限定されないが、改変した薬物動態、増加した血清半減期、増加した結合親和性、低下した免疫原性、増加した産生、改変したＦｃリガンド結合、増強又は低下したＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性、改変したグリコシル化及び／又はジスルフィド結合、及び変化した結合特異性が含まれる、好ましい特徴のある化合物をもたらす１以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異及び／又は修飾をとりわけ含有してよいと考慮される。この点に関して言えば、これらのＦｃ変異体を有利にも使用して、開示モジュレーターの有効な抗新生物特性を高めることができると理解されよう。
本明細書の「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列のＦｃ領域と変異体のＦｃ領域が含まれる、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトのＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びるよ
うに定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号方式によれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に工学処理することによって除去してよい。従って、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基が有る抗体と無い抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。機能的なＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域のエフェクター機能を保有する。例示のエフェクター機能には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節、等が含まれる。そのようなエフェクター機能には、概して、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例、抗体可変ドメイン）と結びつくことが求められて、例えば、本明細書の諸定義において開示されるような様々なアッセイを使用して、評価することができる。
Ｆｃ受容体又はＦｃＲは、抗体のＦｃ領域へ結合する受容体を言い表す。いくつかの態様では、ＦｃＲがネイティブなヒトＦｃＲである。いくつかの態様では、ＦｃＲがＩｇＧ抗体（γ受容体）へ結合するものであって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれて、それら受容体の対立遺伝子変異体と選択的にスプライスされた形態が含まれる。ＦｃγＩＩ受容体には、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる同様のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）とＦｃγＲＩＩＢ（阻害性受容体）が含まれる。活性化受容体のＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体のＦγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体のチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) を
参照のこと）。ＦｃＲｓについては、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及び de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。他のＦｃＲも、将来同
定されるものを含めて、本明細書のＦｃＲという用語に含まれる。Ｆｃ受容体又はＦｃＲという用語には、ある事例では、母体ＩｇＧの胎児への輸送（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 及び Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)）と免疫グロブリン
のホメオスタシスの調節の原因となる新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が知られている（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12) :592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004)；ＷＯ２００４／９２２１９
（Hinton et al. を参照のこと）。
ｂ．Ｆｃ機能
本明細書に使用するように、補体依存性細胞傷害及びＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解に関連する。この補体活性化経路は、補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）が、例えば、コグネイト抗原と複合した分子、抗体へ結合することによって始動される。補体活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202: 163 に記載のようなＣＤＣアッセイを実施することができる。
さらに、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣは、ある種の細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上へ結合して分泌されたＩｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担う標的細胞へ特異的に結合して、その後この標的細胞を細胞毒素で殺傷することが可能になる、細胞毒性の形態に関連する。標的へ指向される特異的な高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を装備して、そのような殺傷に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞−細胞の接触が必要とされて、補体は関与しない。
ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性が改変されたＥＦＮＡモジュレーター変異体とは、
親抗体又は非修飾抗体と、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターと比較して増強又は減少したＦｃＲ結合活性及び／又はＡＤＣＣ活性を有するものである。ＦｃＲへの増加した結合を示すモジュレーター変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターに優る親和性で少なくとも１つのＦｃＲへ結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示す変異体は、親抗体又は非修飾抗体、又はネイティブ配列のＦｃ領域を含んでなるモジュレーターに劣る親和性で少なくとも１つのＦｃＲへ結合する。ＦｃＲへの減少した結合を示すそのような変異体は、ＦｃＲに対する結合性をほとんど又は認められるほどに保有しない。例えば、当該技術分野で周知の技術によって決定されるように、ネイティブ配列のＩｇＧ Ｆｃ領域に比較して、例えば、ＦｃＲへの０〜２０％の結合を保有する。
ＦｃＲｎに関しては、本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より大きい、１０日より大きい、１５日より大きい、好ましくは２０日より大きい、２５日より大きい、３０日より大きい、３５日より大きい、４０日より大きい、４５日より大きい、２ヶ月より大きい、３ヶ月より大きい、４ヶ月より大きい、又は５ヶ月より大きい半減期（例、血清半減期）をもたらす、定常領域への修飾があるＦｃ変異体を含むか又はそれに含まれる。本発明の抗体（又はＦｃ含有分子）の増加した半減期は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、該哺乳動物中の前記抗体又は抗体断片のより高い血清力価をもたらして、それによって前記抗体又は抗体断片の投与の頻度を低下させる、及び／又は投与される前記抗体又は抗体断片の濃度を低下させる。増加した in vivo 半減期を有する抗
体は、当業者に公知の技術によって産生することができる。例えば、in vivo 半減期が増加した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を修飾すること（例えば、置換すること、欠失させること、又は付加すること）によって産生することができる（例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号及び米国特許第２００３／０１９０３１１号を参照のこと）。ヒトＦｃＲｎへの in vivo での結合とヒ
トＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期については、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株において、又は変異体Ｆｃ領域があるポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が改善又は減少した抗体変異体について記載する。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
ｃ．グリコシル化修飾
なお他の態様では、本発明の抗体のグリコシル化の様式又は組成が修飾される。より具体的には、本発明の好ましい態様は、１以上の工学処理された糖型、即ち、Ｆｃ領域を含んでなる分子へ共有結合的に付加される、改変したグリコシル化様式又は改変した炭水化物組成を含んでよい。工学処理された糖型は、限定されないが、エフェクター機能を増強又は低下させること、抗体の標的抗原への親和性を高めること、又は抗体の産生を高めることが含まれる、多様な目的に有用であり得る。低下したエフェクター機能が所望される事例では、その分子が非グリコシル化型で発現されるように工学処理し得ることが理解されよう。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を改変することによって達成することができる。即ち、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失をもたらすことによってその部位でのグリコシル化を消失させる、１以上のアミノ酸置換を行うことができる（例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び６，３５０，８６１号を参照のこと）。逆に、１以上の追加のグリコシル化部位において工学処理することによって、Ｆｃ含有分子へエフェクター機能の増強又は結合の改善を付与することができる。
追加的に、あるいはまた、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体又は二分する
ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体といった、改変したグリコシル化組成を有するＦｃ変異体も作製することができる。これらの、そして同様の改変したグリコシル化様式は、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが証明されてきた。工学処理される糖型は、当業者に公知の如何なる方法によっても、例えば、工学処理されたか又は変異体の発現株を使用することによって、１以上の酵素（例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））での同時発現によって、Ｆｃ領域を含んでなる分子を様々な生物又は様々な生物由来の細胞株において発現させることによって、又はＦｃ領域を含んでなる分子が発現された後で炭水化物（複数）を修飾することによって産生してよい。例えば、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1、並びに欧州特許番号：ＥＰ１，１７６，１９５；ＰＣＴ公開公
報：ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)、米国特許第６，６０２，６８４号；米国仮特許出願シリアル番号：１０／２７
７，３７０；１０／１１３，９２９；ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ技術（Biowa 社）；ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭグリコシル化工学技術（GLYCART biotechnology AG）；ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；米国特許第２００３／０１１５６１４号；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 を参照のこと。
ＩＸ．モジュレーター発現
ａ．概論
慣用の手順を使用して（例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、所望のＥＦＮＡモジュレーターをコードするＤＮＡを容易に単離して配列決定することができる。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞（又はファージ若しくは酵母由来のコロニー）は、そのモジュレーターが抗体であれば、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ場合がある。所望されるならば、この核酸を本明細書に記載のようにさらに操作して、融合タンパク質、又はキメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体が含まれる薬剤を創出することができる。より具体的には、単離ＤＮＡ（修飾されている場合がある）を使用して、米国特許第７，７０９，６１１号に記載のような製造抗体のために、定常及び可変領域の配列をクローン化することができる。
この例示の方法には、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及び抗体特異プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。好適なプライマーは、当該技術分野で周知であり、また本明細書において例示されるように、数多くの市販供給源より容易に入手可能である。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離される組換えヒト又は非ヒト抗体を発現するには、この抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターへクローン化して、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌が含まれる宿主細胞へ導入することが理解されよう。なお他の態様において、モジュレーターは、サルＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は（他の方法では所望の構築体を産生しない）骨髄腫細胞へ導入されてそれによって発現される。下記により詳しく考察するように、臨床及び市販の融合構築体又は免疫グロブリンの供給をもたらすには、所望のモジュレーターを発現する形質転換細胞を相対的に多い量で増殖させてよい。
ＥＦＮＡモジュレーターの所望の部分をコードする核酸が、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、ハイブリドーマベースの技術、合成的に、又は市販の供給源より入手されるか又はそれらに由来するかに拘らず、本発明には、融合タンパク質と抗ＥＦＮＡ
抗体又はその抗原結合断片若しくは誘導体が含まれるＥＦＮＡモジュレーターをコードする核酸分子及び配列が明白に含まれると理解されるべきである。さらに本発明には、高いストリンジェンシーの下で、またあるいは、中間的又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、下記に定義するような）の下で、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸へ相補的なポリヌクレオチドへハイブリダイズする核酸又は核酸分子（例、ポリヌクレオチド）が含まれる。本明細書に使用する「核酸分子」又は「単離（された）核酸分子」という用語には、少なくともＤＮＡ分子とＲＮＡ分子が含まれると企図される。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。さらに、本発明は、そのようなモジュレーターコード化ポリヌクレオチドを取り込むどの担体又は構築体も含み、限定なしに、ベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド、又はウイルス構築体が含まれる。
「単離（された）核酸」という用語は、その核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって in vitro で増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え的に産生された、（ｉｉｉ）例えば、切断とゲル電気泳動分画化によって精製された、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸とは、組換えＤＮＡ技術による操作によって入手可能である核酸である。
より具体的には、本発明の抗体の一方又は両方の鎖、又はその断片、誘導体、ムテイン、又は変異体が含まれるモジュレーターをコードする核酸、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する、分析する、突然変異させる、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又は配列決定プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び上記の相補性配列も提供される。この核酸はどの長さでもあり得る。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００又はそれより多いヌクレオチドの長さであり得る、及び／又は１以上の追加配列（例えば、調節配列）を含み得る、及び／又はより大きな核酸（例えば、ベクター）の一部であり得る。これらの核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよくて、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチドとその人工的な変異体（例、ペプチド核酸）を含み得る。抗体又はその免疫反応性断片若しくは誘導体が含まれる、本発明のモジュレーターをコードする核酸は、好ましくは、上記に記載のように単離されている。
ｂ．ハイブリダイゼーションと同定
示したように、本発明は、他の核酸へ特別なハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする核酸をさらに提供する。当該技術分野では、核酸をハイブリダイズさせる方法が周知である。例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1989）、6.3.1-6.3.6 を参照のこと。本出願の目的では、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有するプレ洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液と５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は、約５０％ホルムアミドを含有するもののような他の同様のハイブリダイゼーション溶液を４２℃のハイブリダイゼーション温度で）と、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、６ｘＳＳＣ中４５℃でハイブリダイズさせることに、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中６８℃での１回以上の洗浄を続ける。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸が典型的には互い
にハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。より一般的には、本開示の目的では、「核酸配列に関して実質的に同一である」という用語は、参照の核酸配列に対して少なくとも約８５％、又は９０％、又は９５％、又は９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈され得る。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本のパラメータと好適な条件を設計するための手引きについては、例えば、Sambrook, Fritsch, and Maniatis（1989）「
分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」：コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、第9章及び11章；及び「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（1995）Ausubel et al.（監修）ジョン・ウィリー・アンド・サン
ズ社、セクション2.10 及び 6.3-6.4）に示されて、例えば、核酸の長さ及び／又は塩基
組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
本発明によれば、核酸が単独で存在しても、相同又は異種であり得る、他の核酸との組合せにおいて存在してもよいことがさらに理解されよう。好ましい態様において、核酸は、前記核酸に関して相同又は異種であり得る発現制御配列へ機能的に連結している。この文脈において、相同という用語は、核酸が天然の発現制御配列へ機能的にも連結していることを意味し、異種という用語は、核酸が天然の発現制御配列へ機能的には連結していないことを意味する。
ｃ．発現
ＲＮＡ及び／又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸のような核酸と発現制御配列は、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるような様式でそれらが互いに共有結合的に連結しているならば、互いに機能的に連結している。その核酸が機能的なタンパク質へ翻訳されるならば、発現制御配列機能はコーディング配列へ機能的に連結していて、前記発現制御配列の誘導は、コーディング配列のフレームシフトを引き起こすことも、前記コーディング配列が所望のタンパク質又はペプチドへ翻訳されることが可能でないことも無く、前記核酸の転写をもたらす。
「発現制御配列」という用語は、本発明のプロモーターによれば、リボソーム結合部位、促進剤、及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御要素を含む。本発明の特別な態様において、発現制御配列は、調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、その種又は細胞種に応じて変動し得るが、一般的に言えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列、等といった、転写と翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列と５’及び３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結した核酸の転写制御のためのプロモーター配列が含まれるプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、プロモーター配列又は上流アクチベータ配列も含み得る。
本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列の上流（５’）に位置して、ＲＮＡポリメラーゼに認識及び結合部位を提供することによって該配列の発現を制御する核酸配列に関する。プロモーター領域には、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識及び結合部位が含まれ得る。プロモーターは、原核生物又は真核生物の遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは、誘導可能であり得、誘導剤に応答して転写を開始してもよく、転写が誘導剤によって制御されない場合は、常時発現性であってもよい。誘導可能プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤が存在しなければ、発現されないか又はわずかな程度しか発現されない。誘導剤の存在下では、その遺伝子にスイッチが入るか、又は転写のレベルが増加
する。このことは、概して、特定の転写因子の結合によって媒介される。
本発明により好ましいプロモーターには、ＳＰ６、Ｔ３、及びＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びこれらの人工的なハイブリッドプロモーター（例、ＣＭＶ）［ここでは、例えば、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロヒドロゲナーゼ）のような他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの一部又は諸部分へその一部又は諸部分が融合して、追加のイントロン（複数）が含まれるか又は含まれない］が含まれる。
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用されて、ＲＮＡの産生、又はＲＮＡ及びタンパク質／ペプチドの産生を含む。それは、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は、一過的に行われても安定的に行われてもよい。
好ましい態様において、本発明による核酸分子は、適宜（該核酸の発現を制御する）プロモーターとともに、ベクター中で存在する。「ベクター」という用語は、本明細書において、その最も一般的な意味で使用されて、核酸が例えば原核細胞及び／又は真核細胞の中へ導入されて、適宜、ゲノムの中へ組み込まれることを可能にする、前記核酸のどの媒介担体も含む。この種のベクターは、好ましくは、細胞中で複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、又はウイルスゲノムを含んでよい。本明細書に使用する「プラスミド」という用語は、一般的には、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築体、通常は、環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
本発明を実施する場合、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術中の多くの慣用技術が任意選択的に使用されると理解されよう。そのような慣用技術は、本明細書に定義されるようなベクター、宿主細胞、及び組換え方法に関する。これらの技術は周知であり、例えば、Berger and Kimmel「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」第152巻、「
分子クローニング技術の手引き（Guide to Molecular Cloning Techniques）」、アカデ
ミックプレス社（カリフォルニア州サンディエゴ）；Sambrook et al.「分子クローニン
グ：実験マニュアル（Molecular Cloning - A Laboratory Manual）」第3版、1-3 巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2000）、及び「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」F. M. Ausubel et al.（監修）上掲、に説明されている。例えば、細胞の単離及び培養のために（例えば、後続の核酸又はタンパク質の単離のために）有用な他の参考文献には、Freshney（1994）「動物細胞の培養、基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique）」第3版、Wiley-Liss，ニューヨークとその中の参
考文献；Payne et al.（1992）「植物細胞及び組織の液体系培養（Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク
州ニューヨーク；Gamborg and Phillips（監修）（1995）「植物細胞、組織、及び器官の培養；基礎的な方法のスプリンガー・ラボ・マニュアル（Plant Cell and Tissue Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual）」Springer-Verlag（ベルリン−ハイデ
ルベルグ−ニューヨーク）、及び Atlas and Parks（監修）「微生物培地ハンドブック（The Handbook of Microbiological Media）」（1993）ＣＲＣプレス（フロリダ州ボカラ
トン）が含まれる。核酸を作製する方法（例えば、in vitro 増幅、細胞からの精製、又
は化学合成によって）、核酸を操作する方法（例えば、制限酵素消化、ライゲーション、等による部位特異的突然変異誘発）、及び核酸を操作して作製するのに有用な様々なベクター、細胞株、等についても、上記の参考文献に記載されている。加えて、本質的には、どのポリヌクレオチド（例えば、標識化又はビオチニル化ポリヌクレオチドが含まれる）も、多様な市販供給源のいずれかより、カスタム又は標準注文することができる。
このように、１つの側面において、本発明は、本発明の抗体又はその部分の組換え発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。そのような組換え宿主細胞中での発現によって産生される抗体を本明細書では組換え抗体と呼ぶ。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞と、それによって産生される抗体を提供する。
本明細書に使用する「組換え宿主細胞（又は単に、宿主細胞）」という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。組換え宿主細胞と宿主細胞は、特別な被検細胞だけでなくそのような細胞の子孫も意味すると理解されるべきである。後継の世代では、突然変異又は環境上の影響により、ある何らかの修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書に使用される宿主細胞という用語の範囲内に含まれる。そのような細胞は、本発明による、上記に記載のようなベクターを含んでよい。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載のような抗体又はその部分を作製するための方法を提供する。１つの態様によれば、前記方法は、上記に記載のようなベクターでトランスフェクトされたか又は形質転換された細胞を培養することと、抗体又はその部分を回収することを含む。
上記に示したように、本発明の抗体（又はその断片若しくは変異体）の発現は、好ましくは、所望の抗ＥＦＮＡ抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（複数）を含む。当業者に周知の方法を使用して、抗体コーディング配列と適正な転写及び翻訳制御シグナルを含んでなる発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術、及び in vivo 遺伝子組換えが含まれる。このように、本発明の態様は、本発明の抗ＥＦＮＡ抗体（例、全抗体、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又はその部分、又は重鎖若しくは軽鎖のＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、又はこれらの断片若しくは変異体）をコードするヌクレオチド配列をプロモーターへ作動可能に連結して含んでなる複製可能なベクターを提供する。好ましい態様では、そのようなベクターに、抗体分子の重鎖（又はその断片）をコードするヌクレオチド配列、抗体の軽鎖（又はその断片）、又は重鎖と軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列が含まれてよい。
本発明のヌクレオチドが本明細書の教示に従って単離されて修飾されたならば、それらを使用して、抗ＥＦＮＡ抗体又はその断片が含まれる、選択したモジュレーターを産生することができる。
Ｘ．モジュレーターの産生及び精製
当該技術分野で認められた分子生物学技術と現行のタンパク質発現の方法論を使用して、所望のモジュレーターの実質的な量を産生することができる。より具体的には、上記に記載のように入手されて工学処理される抗体のようなモジュレーターをコードする核酸分子を、様々な種類の宿主細胞を含んでなる、周知の市販されているタンパク質産生系へ導入して、所望の医薬品の前臨床量、臨床量、又は市販量を提供することができる。好ましい態様において、モジュレーターをコードする核酸分子は、選択した宿主細胞中への効率的な組込みと所望されるＥＦＮＡモジュレーターの後続の高い発現レベルをもたらすベクター又は発現ベクターの中へ工学処理されると理解されよう。
好ましくは、ＥＦＮＡモジュレーターをコードする核酸分子とこれらの核酸分子を含んでなるベクターを好適な哺乳動物、植物、細菌、又は酵母の宿主細胞のトランスフェクションに使用することができるが、モジュレーターの産生には、原核細胞系が使用し得ると理解されよう。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入することで知られたどの方法によってもよい。当該技術分野では、異種ポリヌクレオチドの哺乳動物
細胞への導入の方法が周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数）のリポソーム被包化、及びＤＮＡの核中への直接的なマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子を哺乳動物細胞中へウイルスベクターによって導入してよい。当該技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、４，９１２，０４０号、４，７４０，４６１号、及び４，９５９，４５５号を参照のこと。さらに、当該技術分野では、植物細胞を形質転換する方法が周知であり、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、生物銃（biolistic）形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、及びウイルス形
質転換が含まれる。当該技術分野では、細菌細胞や酵母細胞を形質転換する方法も周知である。
さらに、宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一ベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二ベクターで同時トランスフェクトしてよい。この２つのベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの実質的に等しい発現を可能にする、同一の選択可能マーカーを含有し得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードして、それらを発現することが可能である単一ベクターを使用してよい。そのような状況では、軽鎖は、好ましくは、重鎖の手前に配置されて、過度の有害な遊離重鎖を回避する。重鎖及び軽鎖のコーディング配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでよい。
ａ．宿主発現系
多くが市販されている、多様な宿主発現ベクター系は、本明細書の教示に適合可能であって、本発明のモジュレーターを発現するために使用し得る。そのような宿主発現系は、対象のコーディング配列が発現されて後に精製される媒体を意味するが、適正なヌクレオチドコーディング配列で形質転換されるか又はトランスフェクトされる場合は、本発明の分子を in situ で発現する細胞も意味する。そのような系には、限定されないが、モジ
ュレーターコーディング配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス）のような微生物；モジュレーターコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例、サッカロミセス属、ピキア属）；モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；モジュレーターコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されたか又はそれを含有する組換えプラスミド発現ベクター（例、Ｔｉプラスミド）でトランスフェクトされた植物細胞系（例、タバコ属、アラビドプシス属、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、等）；又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築体を収容する哺乳動物細胞系（例、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。
細菌系では、有利にも、発現される分子のために企図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、モジュレーターの医薬組成物の産生のために、大量のそのようなタンパク質を産生すべき場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、限定されないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBO1. 2
： 1791 (1983)）[ここでは、融合タンパク質を産生するように、コーディング配列を該
ベクターの中へｌａｃＺコーディング領域と正しいフレームで個別にライゲート（ligate）し得る]；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (19
85)；Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)）、等が含まれる。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するのに使用してよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であって、溶解した細胞より、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合に続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位が含まれるように設計されているので、クローン化された標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分より放出され得る。
昆虫系では、異種遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica（キンウワバ科）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用してよい。このウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。コーディング配列は、このウイルス
の非本質的な領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へ個別にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置してよい。
哺乳動物の宿主細胞では、所望のヌクレオチド配列を導入するのに、いくつかのウイルスベースの発現系を使用してよい。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、対象のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター及び３部分（tripartite）リーダー配列）へライゲートしてよい。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitro 又は in vivo の組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入してよい。ウイルスゲノムの非本質領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）での挿入は、被感染宿主において生存可能でその分子を発現することが可能である組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984) を参照
のこと）。挿入されたコーディング配列の効率的な翻訳には、特定の始動シグナルが求められる場合もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これら外因性の翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然と合成ともに、多様な起源のものであり得る。発現の効率は、適正な転写促進剤要素、転写ターミネーター、等の包含によって増強することができる（例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987) を参照のこと）。このように、当該技術分野では、発現用の宿主として利用し得る適合可能な哺乳動物細胞株が周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、293 Freestyle 細胞（Life Technologies）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（Ｂ
ＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、及びいくつかの他の細胞株が含まれる。
組換えタンパク質の長期の高収量産生には、安定した発現が好ましい。従って、当該技術分野で認められた標準技術を使用して、選択されるモジュレーターを安定的に発現する細胞株を設計することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用することよりむしろ、宿主細胞は、適正な発現制御要素（例、プロモーター、プロモーター配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）と選択可能マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入に続いて、工学処理された細胞を濃縮培地においてそのまま１〜２日間増殖してよく、次いで選択培地へスイッチさせる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、この選択に対する抵抗性を付与して、細胞がプラスミドをその染色体中へ安定的に組み込んで、増殖して細胞巣を形成することを可能にし、次いでこれをクローン化して細胞株へ拡大することができる。この方法は、有利にも、上記分子を発現する細胞株を設計するために使用し得る。このような設計された細胞株は、該分子と直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に
おいて特に有用であり得る。
当該技術分野では、いくつかの選択系が周知であり、限定されないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 48:202 (1992)）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et
al., Cell 22:8 17 (1980)）の遺伝子がそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ
−の細胞中で利用され得る系を含めて、使用することができる。また、代謝拮抗薬への抵抗性を以下の遺伝子の選択についての基礎として使用することができる：メトトレキセートに対する抵抗性を付与する、ｄｈｆｒ（Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357
(1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する、ｇｐｔ（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与する、ｎｅｏ（Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 及び Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH
11(5):155-2 15 (May, 1993)）；並びに、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する、
ｈｙｇｒｏ（Santerre et al., Gene 30:147 (1984)）。所望の組換えクローンを選択す
るには、当該技術分野で一般に公知の組換えＤＮＡ技術の方法を定型的に適用してよくて、そのような方法については、例えば、Ausubel et al. (監修)「分子生物学の最新プロ
トコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（1993）；Kriegler,「遺伝子の移入及び発現：実験マニュアル（Gene Transfer and
Expression, A Laboratory Manual）」ストックトン・プレス、ニューヨーク（1990）；及び、Dracopoli et al.（監修)「ヒト遺伝学の最新プロトコール（Current Protocols in Human Genetics）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1994）中12及び13章；Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981) に記載されている。安定した高収量細胞株を確立する１つの特に好ましい方法は、ある条件の下で発現を高めるのに効率的なアプローチを提供するグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含むと理解されよう。このＧＳ系については、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ特許：０２１６８４６、０２５６０５５、０３２３９９７、及び０３３８８４１に関連して、その全体又は一部が考察されている。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか又はその遺伝子産物を所望される特定の形式で修飾及び処理する宿主細胞株を選択してよい。タンパク質のそのような修飾（例、グリコシル化）及びプロセシング（例、切断）は、該タンパク質産物の機能及び／又は精製に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングとタンパク質及び遺伝子産物の修飾に特徴的で特異的な機序を有する。当該技術分野で公知なように、適正な細胞系又は宿主系を選択して、発現されるポリペプチドの望まれる修飾及びプロセシングを確実にすることができる。このために、本発明における使用には、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞が特に有効である。従って、特に、好ましい哺乳動物宿主細胞には、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、並びに、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、及びＴ４７Ｄのような乳癌細胞株と、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株が含まれる。モジュレーターと選択される産生系に依って、当業者は、モジュレーターの効率的な発現に適正な宿主細胞を容易に選択して最適化することができる。
ｂ．化学合成
上述した宿主細胞株以外に、本発明のモジュレーターは、当該技術分野で公知の技術を使用して、化学的に合成し得ることが理解されよう（例えば、Creighton (1983)「タンパ
ク質：構造及び分子の諸原理（Proteins: Structures and Molecular Principles）」W. H. フリーマン社、ニューヨーク、及び Hunkapiller, M., et al.（1984）Nature 310: 105-111 を参照のこと）。例えば、本発明のポリペプチド断片に対応するペプチドをペプ
チド合成機の使用によって合成することができる。さらに、所望されるならば、ポリペプチド配列中への代用物又は付加物として非典型型アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を導入することができる。非典型型アミノ酸には、限定されないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、並びにアミノ酸類似体全般が含まれる。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）でもＬ（左旋性）でもよい。
ｃ．トランスジェニック系
本発明のＥＦＮＡモジュレーターはまた、対象の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖配列（又は、その断片若しくは誘導体若しくは変異体）についてトランスジェニックである哺乳動物又は植物の産生と、所望の化合物の回収可能形態での産生により、トランスジェニックに産生することができる。哺乳動物中でのトランスジェニック産生に関連して、抗ＥＦＮＡ抗体は、例えば、ヤギ、ウシ、又は他の哺乳動物において産生されて、その乳より回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、５，７５６，６８７号、５，７５０，１７２号、及び５，７４１，９５７号を参照のこと。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を上記に記載のようにＥＦＮＡ又はその免疫原性部分で免疫化する。抗体を植物中で作製する方法については、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号及び５，９５９，１７７号に記載されている。
本明細書の教示に従って、本発明のＥＦＮＡモジュレーターをコードする１以上の核酸分子を動物又は植物の中へ標準トランスジェニック技術によって導入することによって、非ヒトのトランスジェニック動物又は植物を産生することができる。Hogan と米国特許第６，４１７，４２９号を参照のこと。トランスジェニック動物を作製するのに使用するトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞でも、体細胞でも、受精卵でもよい。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラの異型接合体と非キメラの同型接合体であり得る。例えば、Hogan et al.「マウス胚の操作法：実験マニュアル（Manipulating the Mouse
Embryo: A Laboratory Manual）」第2版、コールドスプリングハーバー出版局（1999）
；Jackson et al.「マウスの遺伝学とトランスジェニック技術：実践アプローチ（Mouse Genetics and Transgencs: A Practical Approach）」オックスフォード大学出版局（2000）；及び Pinkert「トランスジェニック動物技術：実験手引き（Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook）」アカデミックプレス（1999）を参照のこと。いくつかの態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、対象の重鎖及び／又は軽鎖をコードする標的化構築体による、標的指向された破壊及び置換を有する。１つの態様において、トランスジェニック動物は、ＥＦＮＡへ特異的に結合する重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含んで発現する。抗ＥＦＮＡ抗体は、どのトランスジェニック動物でも作製してよいが、特に好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、又はウマである。さらなる態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、所望の医薬品を血液、乳、尿、唾液、涙液、粘液、及び他の体液において発現して、それは、当該技術分野で認められた精製技術を使用して、容易に入手することができる。
異なる細胞株によるか又はトランスジェニック動物において発現されるモジュレーター（抗体が含まれる）は、互いに異なるグリコシル化様式を有する可能性がある。しかしながら、本発明で提供される核酸分子によってコードされるか又は本発明で提供されるアミノ酸配列を含んでなるすべてのモジュレーターが、該分子のグリコシル化状態に拘らず、そしてより一般的には、翻訳後修飾（複数）の存在又は非存在に拘らず、本発明の一部である。加えて、本発明には、翻訳の間又は後に異なって修飾される（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導化、タンパク分解的切断、抗体分子又は他の細胞リガンドへの連結、等により）モジュレーターが含まれる。数多くの化学修飾のいずれも、限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成、等が含まれる既知の技術によって行ってよい。様々な翻訳後修飾も本発明に含まれて、例えば、Ｎ連結又はＯ連結した炭水化物鎖、Ｎ末端又はＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学部分の付加、Ｎ連結又はＯ連結した炭水化物鎖の化学修飾、並びに原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加又は削除が含まれる。さらに、本文と下記の「実施例」において説明するように、該ポリペプチドはまた、そのモジュレーターの検出及び単離を可能にする、酵素、蛍光、放射性同位体、又は親和性の標識のような、検出可能な標識で修飾してよい。
ｄ．精製
本明細書に開示する組換え発現技術又は他の技術のいずれによっても本発明のモジュレーターを産生したならば、それは、免疫グロブリンの精製について当該技術分野で公知の如何なる方法によって精製してもよく、又はより一般的には、タンパク質の精製についての如何なる他の標準技術によって精製してもよい。この点に関して言えば、モジュレーターは、単離することができる。本明細書に使用するように、単離ＥＦＮＡモジュレーターとは、同定されて、その本来の環境の成分より分離及び／又は回収されたものである。その本来の環境の混在成分は、該ポリペプチドの診断又は療法上の使用に干渉し得る物質であって、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性の溶質が含まれる場合がある。単離モジュレーターには、該ポリペプチドの本来環境の少なくとも１つの成分も存在していないという理由から、組換え細胞内の in situ モジュレーターが含ま
れる。
組換え技術を使用する場合、ＥＦＮＡモジュレーター（例えば、抗ＥＦＮＡ抗体又はその誘導体若しくは断片）は、細胞内で、又は細胞周辺腔で産生され得るか、その培地へ直接分泌され得る。所望の分子が細胞内で産生されるならば、第一の工程として、粒子状の残渣（宿主細胞又は溶出断片）を例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去することができる。例えば、Carter, et al., Bio／Technology 10: 163 (1992) は、大腸菌の細胞
周辺腔へ分泌される抗体を単離する手順について説明する。簡潔に言えば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたり融解する。遠心分離によって細胞残滓を取り除くことができる。抗体が培地中へ分泌される場合、一般的には、そのような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）又はミリポア（Millipore）ペリコン（Pellicon）限外濾過ユニットを使用して初めに濃縮する。上記工程
のいずれでも、タンパク質加水分解を防ぐためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を含めてよくて、偶発的な汚染体の増殖を防ぐために抗生物質を含めてよい。
細胞より調製したモジュレーター（例、ｆｃ−ＥＦＮＡ又は抗ＥＦＮＡ抗体）組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができて、親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適格性は、選択した構
築体に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖に基づいた抗体を精製することができる（Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)）。すべてのマウスアイソタイプとヒトＩｇＧ３には、プロテインＧが推奨されている（Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)）。親和性リガンドが付着するマトリックスは、多くの場合、ほぼアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るものより速い流速とより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J. T. Baker；ニュージャージ
ー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン樹脂でのセファロースクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムのような）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿といった、タンパク質精製用の他の技術も、回収すべき抗体に依って利用可能である。特に好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、少なくとも一部は、プロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを使用して精製される。
ＸＩ．コンジュゲートされたＥＦＮＡモジュレーター
本明細書の教示に従って本発明のモジュレーターを精製したならば、それらは、医薬活性部分又は診断部分、又は生体適合性の修飾剤と連結、融合、コンジュゲートさせる（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）、又は他の方法で会合させることができる。本明細書に使用するように、「コンジュゲート（conjugate）」という用語は概括的に使用さ
れて、会合の方法に拘らず、開示モジュレーターと会合したあらゆる分子を意味するものとする。この点に関して言えば、そのようなコンジュゲートは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、低分子、模倣薬剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性同位体を含んでよいと理解されよう。さらに、上記に示したように、選択したコンジュゲートは、モジュレーターへ共有結合的又は非共有結合的に連結してよく、少なくとも一部は、このコンジュゲーションを有効にするために使用される方法に依存して、様々なモル比を示し得る。
好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、選択される特徴を付与するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド（例、生体毒素、バイオマーカー、精製タグ、等）とコンジュゲート又は会合し得ることが明らかであろう。より一般的には、選択態様において、本発明には、異種のタンパク質又はポリペプチドへ組換え的に融合されるか又は化学的にコンジュゲートされる（共有結合と非共有結合の両方のコンジュゲーションが含まれる）モジュレーター又はその断片の使用が含まれ、ここで該ポリペプチドは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００のアミノ酸を含む。この構築体は、必ずしも直接的に連結している必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。例えば、抗体を使用して、特別な細胞表面受容体に特異的な抗体へ本発明のモジュレーターを融合又はコンジュゲートさせることによって、ＥＦＮＡを発現する特別な細胞種へ異種ポリペプチドを in vitro 又は in vivo のいずれかで標的指向す
ることができる。さらに、異種ポリペプチドへ融合又はコンジュゲートしたモジュレーターはまた、in vitro イムノアッセイに使用し得て、当該技術分野で公知の精製の方法論
と適合可能であり得る。例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許番号：ＥＰ４３９，０９５；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99；米
国特許第５，４７４，９８１号；Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432；及び Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452 を参照のこと。
ａ．生体適合性の修飾剤
好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、モジュレーター特徴を所望のように調整、改変、改善、又は加減するために使用し得る、生体適合性の修飾剤とコンジュゲートさせるか又は他の方法で会合させることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーといった、相対的に分子量が高いポリマー分子を付着させることによって、in vivo 半減期が増加した抗体又は融合構築体を産生することができる。当業者は、該抗体へ特異的な特性を付与する（例えば、半減期を設計することができる）ように選択することが可能である、多くの異なる分子量及び分子配置でＰＥＧを入手し得ることを理解されよう。ＰＥＧは、多機能性リンカーを伴うか又は伴わずに、前記抗体又は抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的なコンジュゲーションによるか、又はリジン残基上に存在するε−アミノ基を介して、モジュレーター又は抗体断片若しくは誘導体へ付着させることができる。生理活性の損失をほとんどもたらさない、線状又は分岐鎖ポリマーの誘導体化を使用してよい。コンジュゲーションの度合いは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって密接にモニターして、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲートより分離することができる。同様の方法で、開示モジュレーターをアルブミンへコンジュゲートさせて、抗体又は抗体断片を in vivo でより安定にするか又はより長い in vivo 半減期を持たせることができる。この技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、国際特許公開公報番号：ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、及びＷＯ０１／７７１３７；及び欧州特許第０４１３，６２２号を参照のこと。当業者には、他の生体適合性コンジュゲートが明らかであって、本明細書の教示に従って容易に確定することができる。
ｂ．診断剤又は検出剤
他の好ましい態様では、本発明のモジュレーター又はその断片若しくは誘導体を、診断又は検出可能な薬剤、生体分子であり得るマーカー又はレポーター（例、ペプチド又はヌクレオチド）、低分子、フルオロフォア、又は放射性同位体へコンジュゲートする。標識化モジュレーターは、過剰増殖性障害の発症又は進行をモニターするのに、又は開示モジュレーターが含まれる特別な療法の効力を決定するための臨床検査手技（即ち、診断・治療）の一部として有用であり得る。そのようなマーカー又はレポーターは、選択したモジュレーターを精製すること、ＴＩＣを分離又は単離すること、又は前臨床手順又は毒性試験においても有用であり得る。
そのような診断及び検出は、限定されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含んでなる様々な酵素；限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンのような補欠分子族；限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンのような蛍光物質；限定されないが、ルミノールのような発光物質；限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンのような生物発光物質；限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎのような放射活性物質；様々な陽電子放射断層撮影法に使用する陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、及び放射標識化されるか
又は特定の放射性同位体へコンジュゲートした分子が含まれる、検出可能な物質へ当該モジュレーターをカップリングすることによって達成することができる。そのような態様において、当該技術分野では、適正な検出の方法論が周知であり、数多くの市販供給源より容易に入手可能である。
上記に示したように、他の態様において、当該モジュレーター又はその断片は、ペプチド又はフルオロフォアのようなマーカー配列へ融合させて、免疫組織化学又はＦＡＣのような精製又は診断の手順を促進することができる。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、中でも、その多くが市販されている、ｐＱＥベクター（Qiagen）において提供されるタグのような、ヘキサヒスチジン（配列番号１６６）ペプチドである。Gentz et
al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 に記載されるように、例えば、
ヘキサヒスチジン（配列番号１６６）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、限定されないが、インフルエンザへマグルチニンタンパク質（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に由来するエピトープに対応する、へマグルチニン「ＨＡ」タグと「ｆｌａｇ（フラッグ）」タグ（米国特許第４，７０３，００４号）が含まれる。
ｃ．治療薬の部分
先に述べたように、当該モジュレーター又はその断片若しくは誘導体はまた、抗癌剤、細胞毒素又は細胞傷害剤（例、細胞増殖抑制剤又は細胞致死剤）、治療薬剤、又は放射活性金属イオン（例、α又はβ−放出体）のような治療薬部分へコンジュゲート、連結、又は融合させるか又は他の方法でそれと会合させてよい。本明細書に使用するように、細胞毒素又は細胞傷害剤には、細胞に有害であって、細胞の増殖又は生存を阻害し得るあらゆる薬剤又は治療薬部分が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ＤＭ−１ａ及びＤＭ−４（Immunogen 社）のようなメイタンシノイド類、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミドとこれらの類似体又は相同体が含まれる。追加の細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Seattle Genetics 社）が含まれるアウリ
スタチン類、α−アマンチン、β−アマンチン、γ−アマンチン又はε−アマンチン（Heidelberg Pharma AG）のようなアマンチン類、デュオカマイシン誘導体（Syntarga, B. V.）のようなＤＮＡ副溝結合剤、及び修飾されたピロロベンゾジアピン二量体（ＰＢＤ、Spirogen 社）を含む。さらに、１つの態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、抗ＣＤ３結合分子と会合して細胞傷害性Ｔ細胞を動員して、それらを腫瘍始原細胞へ標的指向させることができる（ＢｉＴＥ技術；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Fuhrmann, S. et. al. ＡＡＣＲ年次会合抄録番号：5625（2010）を参照のこと）。
追加の適合可能な治療薬部分は、限定されないが、代謝拮抗薬（例、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例、ダクチノマイシン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例、ビンクラスチン及びビンブラスチン）が含まれる細胞傷害剤を含む。治療薬部分のより広汎なリストは、そのそれぞれが参
照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開公報：ＷＯ０３／０７５９５７及び米国特許第２００９／０１５５２５５号に見出すことができる。
選択したモジュレーターはまた、放射活性物質、又は放射金属イオンをコンジュゲートするのに有用な大環状キレート剤といった治療薬部分へコンジュゲートすることができる（放射活性物質の例については、上記を参照のこと）。ある態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体へ付けることができる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当該技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553；及び Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943 に記載されている。
本発明のこの側面と適合可能であり得る例示の放射性同位体には、限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ、）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｔｉｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び２１１Ａｔが含まれる。他の放射性核種（特に、６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲にあるもの）も、診断剤及び治療剤として利用可能である。治療される状態と望まれる治療プロフィールに依存して、当業者は、開示モジュレーターとの使用に適した放射性同位体を容易に選択することができる。
本発明のＥＦＮＡモジュレーターはまた、所与の生体応答を変化させる治療薬部分又は薬物（例、生物学的応答調節物質又はＢＲＭ）へコンジュゲートさせてよい。即ち、本発明に適合可能な治療薬剤又は治療成分は、典型的な化学治療薬剤に限定されると解釈してはならない。例えば、特に好ましい態様において、薬物部分は、所望の生理活性を保有する、タンパク質又はポリペプチド又はその断片であってよい。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Onconaze）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベータ、アポトーシス誘発剤（例、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３３８９９を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567）、及びＶＥＧＩ（国際特許公開公報番号：ＷＯ９９／２３１０５を参照のこと）、血栓形成剤又は抗血管新生剤（例、アンジオスタチン又はエンドスタチン）のようなタンパク質；又は、例えば、リンホカイン（例、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は成長因子（例、成長ホルモン（「ＧＨ」））のような生物学的応答調節物質を含めてよい。上記に説明したように、当該技術分野では、モジュレーターをポリペプチド部分へ融合又はコンジュゲートさせる方法が公知である。先に開示した主題の参考文献に加えて、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３３６，６０３号；５，６２２，９２９号；５，３５９，０４６号；５，３４９，０５３号；５，４４７，８５１号、及び５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公
開公報：ＷＯ９６／０４３８８及びＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535；Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590；及び Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337 を参照のこと。ある部分とモジュレーターの会合は、必ずしも直
接的である必要はなくて、リンカー配列を介して生じてよい。当該技術分野では、そのようなリンカー分子が一般に公知であり、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4 :2483；Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553；Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26: 943；Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 に記載されている。
より一般的には、治療薬部分又は細胞傷害剤をモジュレーターへコンジュゲートさせるための技術が周知である。限定されないが、アルデヒド／シッフ連結、スルフィドリル連結、酸不安定連結、ｃｉｓ−アコチニル連結、ヒドラゾン連結、酵素分解可能連結（一般的には、Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 を参照のこと）が含まれる、当該技術分野で認められたどの方法によっても部分をモジュレーターへコンジュゲートさせることができる。また、例えば、「モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」Reisfeld et al.（監修）中、Amon et al.「癌療法における薬物の免疫標的化のためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」、243-56頁（Alan R. Liss 社、1985）；「制御され
た薬物送達（Controlled Drug Delivery）第2版」Robinson et al.（監修）中、Hellstrom et al.「薬物送達用の抗体（Antibodies For Drug Delivery）」623-53頁（マーセル・デッカー社、1987）；「モノクローナル抗体 '８４：生物学及び臨床上の応用（Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications）」Pinchera et al.（監修）中、Thorpe「癌療法における細胞傷害剤の抗体担体：概説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」475-506頁 (1985)；「癌の検出及び療
法用のモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Cancer Detaction and Therapy）」Baldwin et al.（監修）中、「放射標識化抗体の癌療法における療法上の使用の分析、結果、及び将来展望（Analysis, Results And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）」 303-16頁（アカデミック・プ
レス、1985）、及び Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119 を参照のこと。好ましい態様では、治療薬部分又は細胞傷害剤へコンジュゲートしたＥＦＮＡモジュレーターを細胞表面と会合したＥＦＮＡ分子への結合時に細胞によって内在化させて、それによって治療薬ペイロードを送達することができる。
ＸＩＩ．診断薬とスクリーニング
ａ．診断
示したように、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、診断する、又はモニターするための in vitro 又は in vivo の方法と、ＴＰＣが含まれる腫瘍形成細胞を同定するため
に患者由来の細胞についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法には、患者又は患者より入手した試料を本明細書に記載のような選択したＥＦＮＡモジュレーターと接触させて、試料中の結合型又は遊離エフリンＡリガンドへの該モジュレーターの会合の存在又は非存在、又はそのレベルを検出することを含んでなる、癌の治療又はその進行のモニタリングのために癌を有する個体を同定することが含まれる。該モジュレーターが抗体又はその免疫学的に活性な断片を含む場合、試料中の特別なＥＦＮＡとの会合は、該試料が腫瘍永続化細胞（例、癌幹細胞）を含有し得る可能性があることを示し、癌を有する個体が本明細書に記載のようなＥＦＮＡモジュレーターで効果的に治療され得ることを示唆する。この方法は、対照への結合のレベルを比較する工程をさらに含んでよい。逆に、選択したモジュレーターがＦｃ−ＥＦＮＡである場合、試料との接触時に、選択したエフリンＡリガンドの結合特性を（in vivo 又は in vitro で直接的又は間接的に）利用してモニターして、所望の情報を得ることができる。当該技術分野では、本明細書の教示と適合可能な他の診断又はセラグノーシスの方法が周知であり、専用のレポーティング系の
ような市販の材料を使用して、実践することができる。
特に好ましい態様では、本発明のモジュレーターを使用して、患者試料（例、血漿又は血液）中のＥＦＮＡレベルを検出して定量することができ、次いでそれを使用して、過剰増殖性障害が含まれるＥＦＮＡ関連障害を検出、診断、又はモニターすることができる。１つのそのような態様について、血漿試料中のＥＦＮＡの検出について提供する下記の実施例１７において説明する。
例示の適合可能なアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリーアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。より一般的には、生体試料中のＥＦＮＡの検出、又はＥＦＮＡの酵素的活性（又はその阻害）の測定は、当該技術分野で公知のどのアッセイを使用しても達成してよい。適合可能な in vivo
セラグノーシス又は診断は、当該技術分野で認められた、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（例、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影法（例、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影法、超音波法、等のような造影又はモニタリング技術を含んでよい。当業者には、障害の病因、病理学的症状、又は臨床進行に基づいて、適正な検出、モニタリング、又は造影技術（他の市販の供給源を含んでなる）を認識して実行することが容易に可能であろう。
別の態様において、本発明は、癌の進行及び／又は発病を in vivo で分析する方法を
提供する。別の態様において、癌の進行及び／又は発病の in vivo 分析は、腫瘍進行の
程度を決定することを含む。別の態様において、分析は、腫瘍の同定を含む。別の態様では、腫瘍進行の分析を原発性腫瘍について実施する。別の態様では、当業者に公知のような癌の種類に依存して、分析を経時的に実施する。別の態様では、原発性腫瘍の転移細胞を起源とする続発性腫瘍のさらなる分析を in vivo で分析する。別の態様では、続発性
腫瘍の大きさと形状を分析する。いくつかの態様では、さらなる体外（ex vivo）分析を
実施する。
別の態様において、本発明は、細胞転移を決定することを含めて、癌の進行及び／又は発病を in vivo で分析する方法を提供する。なお別の態様において、細胞転移の分析は
、原発性腫瘍から断続している部位での細胞の進行性増殖の決定を含む。別の態様において、細胞転移分析の部位は、新生物拡散の経路を含む。いくつかの態様では、細胞が血管系構造、リンパ管を介して、体腔内で、又はこれらの組合せで分散することができる。別の態様では、細胞遊走、播種、滲出、増殖、又はこれらの組合せの観点で細胞転移分析を実施する。
ある実施例では、被検者又は被検者由来試料中の腫瘍形成細胞について、開示モジュレーターを療法又はレジメンに先立って使用して評価又は特性決定して、ベースラインを確定することができる。他の実施例において、試料は、治療された被検者に由来する。いくつかの実施例では、被検者が治療を始めるか又は終えてから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、又は１２ヶ月以上後で該被検者より試料を採取する。ある実施例では、ある回数の投薬後に（例えば、２、５、１０、２０、３０又はそれ以上の回数の治療薬の投薬後に）腫瘍形成細胞について特性決定するか又は評価する。他の実施例では、１以上の療法を受けてから１週、２週、１ヶ月、２ヶ月、１年、２年、３年、４年、又はそれ以上の後で腫瘍形成細胞について特性決定するか又は評価する。
別の側面において、そして下記により詳しく考察するように、本発明は、過剰増殖性障害を検出する、モニターする、又は診断する、そのような障害を有する個体について可能
な治療を確定する、又は患者における障害の進行（又は退縮）をモニターするためのキットを提供し、ここで該キットは、本明細書に記載のようなモジュレーターと、試料に対する該モジュレーターの影響を検出するための試薬を含む。
ｂ．スクリーニング
当該ＥＦＮＡモジュレーターとそれを含んでなる細胞、培養物、集団、並びに組成物（それらの子孫が含まれる）はまた、エフリンＡリガンド（例えば、そのポリペプチド又は遺伝成分）と相互作用することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼす化合物又は薬剤（例、薬物）をスクリーニングするか又は同定するために使用することができる。故に、本発明は、ＥＦＮＡ又はその基質と会合することによって腫瘍始原細胞又はその子孫の機能又は活性に影響を及ぼし得る化合物又は薬剤の評価又は同定のためのシステム及び方法をさらに提供する。そのような化合物及び薬剤は、例えば、過剰増殖性障害の治療についてスクリーニングされる薬物候補であり得る。１つの態様において、システム又は方法には、ＥＦＮＡを明示する腫瘍始原細胞と化合物又は薬剤（例、薬物）が含まれ、ここで該細胞と化合物又は薬剤（例、薬物）は、互いに接触している。
さらに本発明は、腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能を変化させることについて、ＥＦＮＡモジュレーター又は薬剤及び化合物をスクリーニングして同定する方法を提供する。１つの態様では、試験薬剤又は化合物と腫瘍始原細胞又はその子孫を接触させること；及び、この試験薬剤又は化合物がエフリンＡリガンドの会合した腫瘍始原細胞の活性又は機能を調節するかどうかを決定することが方法に含まれる。
そのような腫瘍始原細胞又はその集団内の子孫細胞のＥＦＮＡ関連活性又は機能を調節する試験薬剤又は化合物により、試験薬剤又は化合物を活性剤として同定する。調節され得る例示の活性又は機能には、腫瘍始原細胞又はその子孫の細胞形態の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、成熟化、増殖、生存能力、アポトーシス、又は細胞死が含まれる。
「接触させること」は、細胞又は細胞培養物、又は方法工程又は治療と関連して使用される場合、組成物（例、エフリンＡリガンド会合細胞又は細胞培養物）と別の参照実体（referenced entity）との間の直接的又は間接的な相互作用を意味する。直接的な相互作
用の特別な例は、物理的な相互作用である。間接的な相互作用の特別な例は、組成物が中間分子に作用して、次いでそれが参照実体（例、細胞又は細胞培養物）と相互作用する。
本発明のこの側面において、「調節する」は、本発明の腫瘍始原細胞又は子孫細胞の特別な側面（例、転移又は増殖）に関連していることが判明した細胞の活性又は機能に対する効果を検出することに適合可能な様式で、腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能に影響を及ぼすことを示す。例示の活性及び機能には、限定されないが、計量し得る形態、発生マーカー、分化、増殖、生存能力、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜完全性、又はある状態に関連したマーカーの発現が含まれる。従って、化合物又は薬剤（例、候補医薬品）について、該化合物又は薬剤と腫瘍始原細胞又は子孫細胞とを接触させて、本明細書に開示されるか又は当業者に公知であるような腫瘍始原細胞又は子孫細胞の活性又は機能のあらゆる調節を測定することによって、そのような細胞又は子孫細胞に対するその効果を評価することができる。
薬剤及び化合物についてスクリーニングして同定する方法には、ハイスループットスクリーニングに適したものが含まれて、それには、任意選択的に所定の位置又はアドレスに定位又は配置された細胞のアレイ（例、マイクロアレイ）が含まれる。ハイスループットのロボット又はマニュアル操作法では、化学的な相互作用を精査して、多くの遺伝子の発現レベルを短い時間帯で定量することができる。分子シグナル（例、フルオロフォア）と
、情報をごく高速で処理する自動分析を利用する技術が開発されてきた（例えば、Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 133 (2004) を参照のこと）。例
えば、特定遺伝子の情報を提供する一方で、何千もの遺伝子の相互作用を同時に精査するためのマイクロアレイ技術が広汎に利用されてきた（例えば、Mocellin and Rossi, Adv.
Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007) を参照のこと）。
そのようなスクリーニング方法（例、ハイスループット）では、活性のある薬剤及び化合物を迅速かつ効率的に同定することが可能である。例えば、潜在的に療法性の分子を同定するために、培養皿、試験管、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４、及び１５３６穴のマルチウェルプレート又はディッシュのような、単一のマルチウェルプレート又はディッシュ）に、任意選択的に所定の位置で、細胞を定位又は配置する（予め播く）ことができる。スクリーニングされ得るライブラリーには、例えば、低分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリー（Adimab, LLC）、ｓｉＲＮＡライブラリー、及び
アデノウイルストランスフェクションベクターが含まれる。
ＸＩＩＩ．医薬調製物と療法使用
ａ．製剤と投与経路
モジュレーターの形態、並びに任意選択のコンジュゲート、企図される送達形式、治療又はモニターされる疾患、及び他の数多くの変数に依存して、本発明の組成物は、当該技術分野で認められた技術を使用して、所望されるように製剤化してよい。即ち、本発明の様々な態様では、ＥＦＮＡモジュレーターを含んでなる組成物を多種多様な医薬的に許容される担体とともに製剤化する（例えば、Gennaro「レミントン：調剤の科学と実践：事
実と比較（Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons）」Drugfacts Plus, 第20版 (2003); Ansel et al.「医薬剤形と薬物送達系（Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems）」第7版、Lippencott Williams and Wilkins（監修）(2004); Kibbe et al.「医薬賦形剤の手引き（Handbook of Pharmaceutical Excipients）」第3版、Pharmaceutcal Press (2000) を参照のこと）。媒体、ア
ジュバント、及び希釈剤が含まれる、様々な医薬的に許容される担体が数多くの市販供給源より容易に利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤、等のような、医薬的に許容される補助物質の取り合わせも利用可能である。ある非限定的な例示の担体には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれる。
より具体的には、いくつかの態様において、本発明の治療組成物は、そのまま投与しても、最少量の追加成分とともに投与してもよいと理解されよう。逆に、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、当該技術分野で周知の相対的に不活性な物質であって、該モジュレーターの投与を促進するか又は作用部位への送達について医薬的に最適化された調製物への活性化合物の加工処理を補佐する賦形剤及び補助剤を含んでなる、好適な医薬的に許容される担体を含有するように任意に製剤化してもよい。例えば、賦形剤は、形態又は堅さを与えるか又は希釈剤として作用して、モジュレーターの薬物動態を改善することができる。好適な賦形剤には、限定されないが、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透性を変化させるための塩類、被包化剤、緩衝液、及び皮膚浸透促進剤が含まれる。
全身投与用の開示モジュレーターは、経腸、非経口、又は局所投与用に製剤化することができる。実際、有効成分の全身投与を達成するには、全３種類の製剤を同時に使用してよい。非経口及び非腸管外の薬物送達用の賦形剤並びに製剤については、「レミントン、調剤の科学及び実践（Remington, The Science and Practice of Pharmacy）」第20版、
マック・パブリッシング（2000）に説明されている。非経口投与に適した製剤には、水溶型の活性化合物、例えば、水溶性塩の水溶液剤が含まれる。加えて、油性の注射懸濁液剤
に適正のような活性化合物の懸濁液剤も投与し得る。好適な脂溶性の溶媒又は媒体には、脂肪油剤、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル類、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドが含まれる。水性注射懸濁液剤は、該懸濁液剤の粘度を高める物質を含有してよくて、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又はデキストランが含まれる。懸濁液剤は、安定化剤を含有してもよい。また、リポソーム剤を使用して、細胞中への送達のために薬剤を被包化することができる。
経腸投与に適した製剤には、硬又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤（被覆錠剤が含まれる）、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、又は吸入剤とこれらの制御放出形態が含まれる。
一般に、ＥＦＮＡモジュレーターを含んでなる本発明の化合物及び組成物は、その必要な被検者へ、限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、心室内、気管内、頬内、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び鞘内が含まれる様々な経路によって、また他の様式では、移植又は吸入によって in vivo で投与され得
る。主題の組成物は、調製物へ固体、半固体、液体、又は気体の形態で製剤化し得て；限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、及びエアゾール剤が含まれる。企図される適用と療法レジメンに従って、適正な製剤と投与経路を選択してよい。
ｂ．投与量
同様に、特別な投与レジメン（即ち、用量、時機、及び反復）は、特別な個体とその個体の治療歴に依存するものである。投与量の決定には、薬物動態（例、半減期、クリアランス速度、等）のような経験的な考慮事項が寄与する。投与の頻度は、療法の経過にわたって決定して調整してよくて、腫瘍始原細胞が含まれる過剰増殖性細胞又は新生物細胞の数を低下させること、そのような新生物細胞の低下を維持すること、新生物細胞の増殖を低下させること、又は転移の発現を遅らせることに基づく。あるいは、主題の治療組成物の持続した連続放出製剤が適正であり得る。上記に述べたように、当該技術分野では、持続放出を達成するための様々な製剤及びデバイスが公知である。
治療上の視点から、当該医薬組成物は、特定の適応症の治療又は予防に有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被検者の体重、彼又は彼女の身体又は健康状態、治療すべき状態の広がり、又は治療される被検者の年齢に依存する。一般に、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、投薬につき約１０μｇ／ｋｇ（体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。ある態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、投薬につき、約５０μｇ／ｋｇ（体重）〜約５ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。ある他の態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、投薬につき、約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してよい。本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、投薬につき、約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してもよい。さらに、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、投薬につき、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与してもよい。ある態様において、本発明の化合物は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で提供される。
他の投薬レジメンは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７４４，８７７号に開示されるような体表面積（ＢＳＡ）計算値に基づいてよい。当該技術分野で周知であるように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算して、彼又は彼女の身体の表面積によって表されるような被検者のサイズの尺度を提供する。Ｂ
ＳＡを使用する、本発明の選択された態様において、モジュレーターは、１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与してよい。他の好ましい態様において、該モジュレーターは、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で、そしてなおより好ましくは、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与される。当然ながら、投与量をどのように計算するかに拘らず、選択された時間帯にわたって多数の投与量を投与して、個々の投与より実質的に高い絶対的な投与量を提供してよい。
いずれにしても、当該ＥＦＮＡモジュレーターは、好ましくは、その必要な被検者へ必要とされるように投与される。投与頻度の決定は、担当医のような当業者によって、治療される状態、治療される被検者の年齢、治療される状態の重症度、治療される被検者の全般的な健康状態、等の考慮事項に基づいてなされてよい。一般的には、ＥＦＮＡモジュレーターの有効量が被検者へ１回以上投与される。より具体的には、該モジュレーターの有効量が被検者へ１ヶ月に１回、１ヶ月に１回より多く、又は１ヶ月に１回より少なく投与される。ある態様において、ＥＦＮＡモジュレーターの有効量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年の期間の間を含めて、数回投与してよい。
開示される治療組成物の投与量及びレジメンはまた、１回以上の投与（複数）を受けてきた個体において、経験的に決定することができる。例えば、本明細書に記載のように製造した治療組成物の漸増する投与量を個体へ与えてよい。選択した組成物の効力を評価するために、特定の疾患、障害、又は状態のマーカーを先に記載のように追跡することができる。個体が癌を有する態様において、これらには、触診又は目視観察による腫瘍サイズの直接的な測定、Ｘ線又は他の造影技術による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍生検と腫瘍試料の顕微鏡検査によって評価されるような改善；間接的な腫瘍マーカー（例、前立腺癌のＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法によって同定される抗原の測定、疼痛又は麻痺の減少；言語能力、視覚、呼吸、又は腫瘍に関連した他の無能力の改善；食欲増加；又は承認された検査法によって測定されるような生活の質の増加、又は生存の延長化が含まれる。当業者には、その個体、新生物状態の種類、新生物状態の段階、その新生物状態が個体中の他の部位へ転移し始めたかどうか、及び使用されているこれまでの治療薬と併用治療薬に依って、投与量が変動するものであることが明らかであろう。
ｃ．組合せ療法
本発明によって考慮される組合せ療法は、望まれない新生物細胞増殖（例、内皮細胞）を減少させるか又は阻害すること、癌の発生を減少させること、癌の再発を減少させるか又は予防すること、又は癌の広がり又は転移を減少させるか又は予防することに特に有用であり得る。そのような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊（例、ＮＴＧ細胞）を支援して永続化させるＴＰＣを除去することによって増感剤又は化学増感剤として機能し得て、現行の標準治療の腫瘍減量剤又は抗癌剤のより有効な使用を可能にし得る。即ち、ＥＦＮＡモジュレーターと１以上の抗癌剤を含んでなる組合せ療法を使用して、定着した癌を減衰させる（例えば、存在する癌細胞の数を減少させる、及び／又は腫瘍負荷を減少させる）、又は癌の少なくとも１つの徴候又は副作用を改善することができる。このように、組合せ療法は、ＥＦＮＡモジュレーターと１以上の抗癌剤（限定されないが、細胞傷害剤、細胞増殖抑制薬剤、化学療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、免疫療法剤、癌ワクチン、抗血管新生剤、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、及び抗転移剤が含まれる）の投与に関連する。
本発明の方法によれば、組み合わせた結果がそれぞれの治療法（例、抗ＥＦＮＡ抗体と抗癌剤）を別々に実施するときに観測される効果の相加である必要はない。少なくとも相加的な効果が一般的には望ましいが、単一療法の１つに優る増加された抗腫瘍効果が有益
である。さらに、本発明は、組合せ治療が相乗効果を明示することを求めない。しかしながら、当業者は、好ましい態様を含むある選択した組合せでは、相乗作用が観測され得ることを理解されよう。
本発明による組合せ療法を実践するには、１以上の抗癌剤と組合せたＥＦＮＡモジュレーター（例、抗ＥＦＮＡ抗体）を、その必要な被検者へ抗癌活性を該被検者内でもたらすのに有効な様式で投与してよい。ＥＦＮＡモジュレーターと抗癌剤は、それらの組合わされた存在と腫瘍環境中でのそれらの組合わされた作用を所望されるようにもたらすのに有効な量と有効な時間帯で提供される。この目標を達成するために、ＥＦＮＡモジュレーターと抗癌剤は、単一組成物において、又は同じか又は異なる投与経路を使用する２以上の別個の組成物として、被検者へ同時に投与してよい。
あるいは、当該モジュレーターは、例えば、数分〜数週に及ぶ間隔で、抗癌剤の治療に先行又は後続してよい。抗癌剤と抗体が被検者へ別々に適用されるある態様において、それぞれの送達の時機の間の時間帯は、抗癌剤とモジュレーターが腫瘍に対して組合せ効果を発揮することができるようなものである。特別な態様では、抗癌剤とＥＦＮＡモジュレーターの両方が互いから約５分〜約２週以内に投与される。
なお他の態様では、モジュレーターと抗癌剤の投与の間に、数日（２、３、４、５、６又は７日）、数週（１、２、３、４、５、６、７又は８週）、又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）が経過してよい。ＥＦＮＡモジュレーターと１以上の抗癌剤（組合せ療法）は、１回、２回、又は少なくとも該状態が治療、緩和、又は治癒されるまでの時間帯で投与してよい。好ましくは、組合せ療法は、数回投与される。組合せ療法は、１日３回〜６ヶ月ごとに１回投与してよい。投与することは、１日３回、１日２回、１日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、週１回、２週ごとに１回、１ヶ月ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回のようなスケジュールであっても、ミニポンプより連続的に投与してもよい。先に示したように、組合せ療法は、経口、粘膜、頬内、鼻腔内、吸入可能、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、腫瘍内、又は局所の経路より投与してよい。組合せ療法は、腫瘍の部位より離れた部位で投与してよい。組合せ療法は、一般的には、腫瘍が存在する限りにおいて、その組合せ療法が腫瘍又は癌の増殖を止める、又はその重量又は体積を減少させるという前提で、投与される。
１つの態様では、ＥＦＮＡモジュレーターを１以上の抗癌剤と組合せて、その必要な被検者へ短い治療サイクルの間投与する。この抗体での治療の継続期間は、使用する特別な抗癌剤に従って変動してよい。本発明はまた、不連続な投与、又は数回の部分投与へ分割される１日用量を考慮する。当業者には、特別な抗癌剤に適正な治療時間が評価されて、本発明は、それぞれの抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を考慮する。
本発明は、組合せ療法が投与される間の少なくとも１回のサイクル、好ましくは、１回より多いサイクルを考慮する。当業者には、１回のサイクルに適正な時間帯が評価されて、サイクルの全数とサイクル間の間隔も評価されよう。本発明は、それぞれのモジュレーター及び抗癌剤に最適な治療スケジュールの継続的な評価を考慮する。さらに、本発明はまた、抗ＥＦＮＡ抗体又は抗癌剤のいずれか一方の１回より多い投与を提供する。モジュレーターと抗癌剤は、可換的に、隔日又は隔週で投与してよい；又は連続した抗体治療を与えて、抗癌剤療法の１回以上の治療を続けてよい。いずれにしても、当業者によって理解されるように、化学療法剤の適正な用量は、一般的には、臨床療法においてすでに利用されてきた用量に近いものであって、ここでこの化学療法剤は、単独で、又は他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
別の好ましい態様において、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、腫瘍疾患の初期症状
に続く腫瘍再発の見込みを低下又は消失させるために、維持療法で使用されてよい。好ましくは、該障害は、治療が済んで、患者が無症候性又は寛解状態にあるように、最初の腫瘍塊は、消失、低下、又は他の様式で改善している。このような時間に、標準の診断手順を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くないとしても、被検者へ開示モジュレーターの医薬有効量を１回以上投与してよい。いくつかの態様において、エフェクターは、ある時間帯にわたり規則的なスケジュールで投与される。例えば、ＥＦＮＡモジュレーターは、毎週、毎２週、毎月、毎６週、毎２ヶ月、毎３ヶ月、毎６ヶ月、又は毎年で投与することができる。本明細書の教示があれば、当業者は、疾患再発の潜在可能性を低下するのに好ましい投与量及び投薬レジメンを容易に決定することができよう。さらに、そのような治療は、患者の応答と臨床及び診断の諸変数に依って、数週、数ヶ月、数年の期間、又は無期限でも続けることができる。
なお別の好ましい態様において、発明のエフェクターは、腫瘍減量術（debulking procedure）に続く腫瘍転移の可能性を防ぐか又は抑えるために予防的に使用してよい。本開
示に使用されるように、腫瘍減量術は概括的に定義されて、腫瘍又は腫瘍増殖を消失、低下、治療、又は改善するあらゆる手順、技術、又は方法を意味する。例示の腫瘍減量術には、限定されないが、外科手術、放射線治療（即ち、ビーム放射線）、化学療法、又は除去が含まれる。本開示に照らして当業者によって容易に決定される適正な時間で、臨床及び診断、又はセラグノーシスの手順によって示唆されるように、腫瘍転移を抑えるためにＥＦＮＡモジュレーターを投与してよい。当該モジュレーターは、標準的な技術を使用して決定されるように、医薬的に有効な投与量で１回以上投与してよい。好ましくは、投薬レジメンには、それを必要に応じて変更することを可能にする、適正な診断又はモニタリング技術が付随するものである。
ｄ．抗癌剤
本明細書に使用するように、「抗癌剤」という用語は、癌のような細胞増殖性障害を治療するために使用し得るあらゆる薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制薬剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法と放射線療法剤、標的化抗癌剤、生物学的応答調節物質、抗体、及び免疫療法剤が含まれる。上記に考察したような選択態様では、抗癌剤がコンジュゲートを含む場合があって、投与に先立ってモジュレーターと会合させてよいと理解されよう。
細胞傷害剤という用語は、細胞の機能を減少させるか又は阻害する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味し、即ち、その物質は、細胞にとって有害である。典型的には、この物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例には、限定されないが、細菌（例、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシン）、真菌（例、α−サクリン、レストリクトシン）、植物（例、アブリン、リシン、モデッシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポニン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、麦毒、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Phytolacca Americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシ
ナリス（saponaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、
フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン類）、又は動物（例、細胞外膵臓ＲＮアーゼのような細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）に由来する、低分子毒素又は酵素活性毒素が含まれて、これらの断片及び／又は変異体が含まれる。
化学療法剤は、癌細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に減少させるか又は阻害する化学化合物（例、細胞傷害性又は細胞増殖抑制性の薬剤）を意味する。そのような化学薬剤は、多くの場合、細胞の増殖又は分裂に必要な細胞内プロセスへ指向されるので
、概して速やかに増殖及び分裂する癌性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合させて、それにより細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤には、癌性細胞、又は癌性になるか又は腫瘍形成性の子孫（例、ＴＩＣ）を産生する可能性がある細胞を阻害するか又は阻害するように設計されたあらゆる化学薬剤を含めることができる。そのような薬剤は、多くの場合、組合せて（例えば、ＣＨＯＰ処方において）投与され、そして多くの場合、最も効果的である。
本発明のモジュレーターと組み合わせて（又はそれへコンジュゲートして）使用され得る抗癌剤の例には、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エネジイン抗生物質、ダイネマイシン、ビスホスホネート類、エスペラマイシン、色素タンパク質−エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプレオマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、キュエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン類、抗副腎薬、フロリン酸のような葉酸リプレニッシャー、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド類、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカバルジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, オレゴン州ユージーン）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、クロラムブシル；ジェムザール（ＧＥＭＺＡＲ）（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤：ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン；細胞増殖を抑制する、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤と、上記のいずれもの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。この定義にまた含まれるのは、抗エストロゲン剤と選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、酵素アロマターゼ［副腎中でのエストロゲン産生を調節する］を阻害するアロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲン剤のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；並びに、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥ
ＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤のようなリボザイム；ワクチン類、プロロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）（登録商標）ｒＩＬ−２；ラルトテカン（ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；アバレリクス（ＡＢＡＲＥＬＩＸ）（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラマイシン類、及び上記のいずれもの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が含まれる。他の態様は、限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、及びブレンツキシマブ・ベドチンが含まれる、癌療法について承認された抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示と適合可能である追加の抗癌剤を容易に同定することができよう。
ｅ．放射線療法
本発明はまた、放射線療法（即ち、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、等といった、ＤＮＡ損傷を腫瘍細胞内で局所的に誘発するあらゆる機序）とＥＦＮＡモジュレーターの組合せを提供する。腫瘍細胞へ指向された放射性同位体の送達を使用する組合せ療法も考慮されて、標的指向された抗癌剤又は他の標的化手段と共に使用してよい。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週の時間帯にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部癌を有する被検者へ約６〜７週の間投与することができる。放射線療法は、単一用量として投与してもよく、多数回の連続用量として投与してもよい。
ｆ．新生物状態
単独、又は抗癌剤又は放射線療法との組合せのいずれで投与しても、本発明のＥＦＮＡモジュレーターは、一般的には、良性又は悪性の腫瘍（例、腎癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝細胞癌；肉腫；膠芽腫；及び様々な頭頚部腫瘍）；白血病とリンパ系悪性腫瘍；神経細胞、神経膠細胞、星状細胞、視床下部、及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質、及び割腔の障害のような他の障害；並びに、炎症性障害、血管新生障害、免疫障害、及び病原体によって引き起こされる障害が含まれ得る、患者又は被検者の新生物状態を全般的に治療するのに特に有用である。本発明の治療組成物及び方法での治療に特に好ましい標的は、固形腫瘍を含んでなる新生物状態である。他の好ましい態様において、本発明のモジュレーターは、血液悪性腫瘍の診断、予防、又は治療に使用してよい。本明細書に使用するように、この用語は、明白に、あらゆる哺乳動物種を含むとみなされるが、好ましくは、治療される被検者又は患者はヒトであろう。
より具体的には、本発明による治療へ処せられる新生物状態は、限定されないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱癌（扁平上皮癌と移行上皮癌）、骨癌（アダマンチノーム、脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄の癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頚動脈小体腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、淡明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（fibrogenesis
imperfecta ossium）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管癌、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頚部癌、島細胞腫瘍、カポシ肉腫、腎臓癌（腎芽腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪様腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、等）、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、多発性内分泌新生物、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌、副甲状腺腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後ブドウ膜黒色腫、稀な血液系障害、腎転移癌、横紋筋肉腫様腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、及び子宮癌（子宮頚癌、子宮内膜癌、及び平滑筋腫）が含まれる群より選択され得る。ある好ましい態様において、癌性細胞は、限定さ
れないが、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、肉腫、腎転移癌、甲状腺転移癌、及び淡明細胞癌が含まれる固形腫瘍の群より選択される。
血液系腫瘍に関しては、本発明の化合物及び方法は、低悪性度／ＮＨＬ濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非開裂型小細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤疾患ＮＨＬ、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、リンパ形質細胞様リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管性免疫芽細胞性リンパ腺症、小リンパ球性、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小分割型細胞、大細胞免疫芽球性リンパ芽腫、小細胞、非分割型、バーキット及び非バーキット、濾胞性、大細胞優勢型；濾胞性、小分割細胞優勢型；及び、濾胞性、小分割型細胞及び大細胞混合型のリンパ腫が含まれる多様なＢ細胞リンパ腫を治療するのに特に有効であり得る。「癌：腫瘍学の原理と実践（PRINCIPLES & PRACTICE OF
ONCOLOGY）」第2巻：2131-2145（DeVita et al（監修）、第5版、1997）中 Gaidono et al.「リンパ腫（Lymphomas）」を参照のこと。当業者には、上記のリンパ腫が、多くの場合、分類体系の変更によって異なる名称を有するであろうことと、異なる名称下に分類されるリンパ腫を有する患者も本発明の組合せ療法レジメンより利益を得る可能性があることとが明らかなはずである。
なお他の好ましい態様において、当該ＥＦＮＡモジュレーターは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ又はＢ−ＣＬＬ）のような白血病が含まれる、ある種の骨髄性及び血液系腫瘍を効果的に治療するために使用し得る。ＣＬＬは、５０歳以降で発症率が増加し始めて６０代後半にピークに達する、主に高齢者の疾患である。それは、一般的には、新生物性の末梢血リンパ球の増殖を伴う。ＣＬＬの臨床知見には、リンパ球増加症、リンパ腺症、巨脾症、貧血、及び血小板減少症が伴う。ＣＬＬの特徴的な特質は、モノクローナルＢ細胞増殖と分化の中間段階で進行阻止されたＢリンパ球の蓄積であり、ここではそのようなＢ細胞が表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）又はｓＩｇＭとｓＩｇＤの両方と、単一の軽鎖を正常なＢ細胞上のそれより低い密度で発現する。しかしながら、上記に考察して、本明細書に付帯した「実施例」において示すように、Ｂ−ＣＬＬ細胞上では、選択したＥＦＮＡ発現（例、ＥＦＮＡ）が上方調節されていて、それにより開示モジュレーターにとって魅力的な標的を提供する。
本発明はまた、良性又は前癌性の腫瘍を提示する被検者の防止的又は予防的な治療を提供する。ある特別な種類の腫瘍又は新生物障害は、本発明を使用する治療より除外されるべきであるとは考えられない。しかしながら、腫瘍細胞の種類は、二次的な治療薬剤、特に、化学療法剤と標的化抗癌剤と組み合わせた本発明の使用に関連する場合がある。
本発明のなお他の好ましい態様は、固形腫瘍に罹患している被検者を治療するためのＥＦＮＡモジュレーターの使用を含む。そのような被検者では、これら固形腫瘍の多くが、開示されるエフェクターでの治療に対して特に敏感にさせ得る様々な遺伝子変異を示す組織を含む。例えば、結直腸癌の患者では、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、及びＣＤＨ１の突然変異が相対的に共通している。さらに、上記の突然変異がある腫瘍に罹患している患者は、通常、現行の療法に対して最も難治性である；特に、ＫＲＡＳ突然変異のある患者でそうである。ＫＲＡＳ活性化突然変異（典型的には、単一のアミノ酸置換をもたらす）はまた、肺腺癌、粘液腺腫、及び膵臓の腺管癌が含まれる、他の治療困難な悪性腫瘍において関連が示唆されている。
現在、結直腸癌患者が例えばＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ阻害性の薬物へ応答するかどうかの最も信頼し得る予測は、ある種のＫＲＡＳ「活性化」突然変異を検査することである。結直腸癌の３５〜４５％でＫＲＡＳが突然変異しており、腫瘍が突然変異ＫＲＡＳを発現している患者は、これらの薬物に対して十分に応答しない。例えば、ＫＲＡＳの突然変異から、結直腸癌におけるパニツムマブ及びツキシマブ療法に対する応答の不足が予測される（Lievre et al. Cancer Res 66: 3992-5; Karapetis et al. NEJM 359: 1757-1765）。
結直腸癌患者のほぼ８５％でＡＰＣ遺伝子に突然変異があって（Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361: 2449-60）、家族性大腸腺腫症と結直腸癌の患者では、８００より多いＡＰＣ突然変異が特性決定されてきた。これら突然変異の大多数が、β−カテニンの破壊に媒介する機能能力が低下した、末端切断型のＡＰＣタンパク質をもたらす。β−カテニン遺伝子、ＣＴＮＮＢ１中の突然変異はまた、該タンパク質の増加した安定化をもたらし得て、いくつかの発癌転写プログラムの細胞核輸入と後続の活性化をもたらすが、これは、突然変異したＡＰＣがβ−カテニン破壊に適正に媒介し得ないこと（正常な細胞増殖及び分化のプログラムを阻止するために必要とされる）より生じる発癌の機序でもある。
ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）発現の喪失は、結直腸癌において一般に発生する更なる別の事象であり、多くの場合、この疾患がより進行した段階で観察される。Ｅ−カドヘリンは、上皮層中の細胞を繋げて組織化する接着構造の中心的なメンバーである。通常、Ｅ−カドヘリンは、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を形質膜で物理的に捕捉するので、結直腸癌におけるＥ−カドヘリン発現の喪失は、β−カテニンの核への局在化とβ−カテニン／ＷＮＴ経路の転写活性化をもたらす。異常なβ−カテニン／ＷＮＴシグナル伝達は、発癌にとって中核的であって、核内のβ−カテニンは、癌の幹細胞性との関連が示唆されてきた（Schmalhofer et al., 2009 PMID 19153669）。Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞中のＥＦＮＡリガンドの既知の結合相手である、ＥｐｈＡ２の発現及び機能に必要とされる（Dodge Zantek et al., 1999 PMID 10511313; Orsulic S and Kemler R, 2000 PMID 10769210
）。ＥＦＮＡリガンドへ結合してＥｐｈ受容体結合と作動するか又はそれに拮抗するモジュレーターを使用することは、発癌促進プロセスを変化させる、妨害する、又は逆転させる可能性がある。あるいは、ＥＦＮＡモジュレーターは、ＥＦＮＡモジュレーターの結合選好性に基づいて、Ｅｐｈ／エフリン相互作用が異常な腫瘍細胞へ選好的に結合する可能性がある。従って、上記に言及した遺伝形質を担う担癌患者は、上述したＥＦＮＡモジュレーターでの治療より利益を得る可能性がある。
ＸＩＶ．製造品
ＥＦＮＡモジュレーターの１以上の用量を含んでなる１以上の容器を含んでなる、医薬パック及びキットも提供される。ある態様では、単位投与量が提供され、ここで該単位投与量は、例えば、抗ＥＦＮＡ抗体を１以上の追加薬剤の有り無しで含んでなる所定量の組成物を含有する。他の態様では、そのような単位投与量が単回使用の注射用充填済みシリンジにおいて供給される。なお他の態様において、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖、等；リン酸塩、等のような緩衝液を含んでよい；及び／又は、安定して有効なｐＨ範囲内で製剤化してよい。あるいは、ある態様において、当該組成物は、適正な液体、例えば、無菌水の添加時に復元され得る凍結乾燥散剤として提供してよい。ある好ましい態様において、当該組成物は、タンパク質凝集を阻害する１以上の物質（限定されないが、ショ糖及びアルギニンが含まれる）を含む。その容器（複数）上にあるか又はそれに付随したどのラベルも、開示組成物が第一選択の疾患状態を診断又は治療するために使用されることを示す。
本発明はまた、ＥＦＮＡモジュレーターの単用量又は多用量の投与単位と、任意選択的に、１以上の抗癌剤をもたらすためのキットを提供する。当該キットは、容器と、その容器の上にあるか又はそれに付随したラベル又は添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのよう
な多様な材料より生成され得る。容器は、該状態を治療するのに有効である組成物を保持して、無菌のアクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。そのようなキットは、一般に、好適な容器中に、ＥＦＮＡモジュレーターの医薬的に許容される製剤を含有して、同じか又は異なる容器に１以上の抗癌剤を含有してもよい。当該キットは、診断又は組合せ療法のいずれかのために、他の医薬的に許容される製剤を含有してよい。例えば、本発明のＥＦＮＡモジュレーターに加えて、そのようなキットは、化学療法薬又は放射線療法薬；抗血管新生薬剤；抗転移剤；標的化抗癌剤；細胞傷害剤；及び／又は他の抗癌剤といった幅広い抗癌剤のどの１以上も含有してよい。そのようなキットはまた、抗癌剤又は診断剤とＥＦＮＡモジュレーターをコンジュゲートするのに適正な試薬を提供する（例えば、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２２，３７９号を参照のこと）。
より具体的には、当該キットは、ＥＦＮＡモジュレーターを追加成分の有り無しで含有する単一容器を有しても、所望される各薬剤で別個の容器を有してもよい。組み合わされた治療剤がコンジュゲーションのために提供される場合、単一の溶液剤を、モル濃度が等しい組合せで、又はある成分を他の成分より過剰な状態でプレ混合してよい。あるいは、このキットのＥＦＮＡモジュレーターとどの任意選択の抗癌剤も、患者への投与に先立って、別個の容器内で別々に維持されてよい。当該キットはまた、無菌の医薬的に許容される緩衝液、又は注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、及びデキストロース溶液のような他の希釈剤を含有するための第二／第三の容器手段を含んでよい。
当該キットの成分が１以上の液体溶液剤で提供される場合、この液体溶液剤は、好ましくは、水溶液剤であって、無菌水溶液剤が特に好ましい。しかしながら、当該キットの成分は、乾燥散剤（複数）として提供してよい。試薬又は成分が乾燥散剤として提供される場合、この散剤は、好適な溶媒の添加によって復元することができる。この溶媒も、別の容器で提供されてよいことが想定される。
上記に簡潔に示したように、当該キットはまた、当該抗体とある任意選択の成分を動物又は患者へ投与するための手段（例えば、それより該製剤が動物へ注射又は導入され得るか又は身体の患部へ適用され得る、１以上の針又はシリンジ、又は点眼器、ピペット、又は他のそのような器具）を含有してよい。本発明のキットには、典型的には、バイアル又はそのようなものと他の成分を市販用に厳重密封して含有するための手段（例えば、所望のバイアルと他の器具がその中へ配置されて保持される、注入又は吹込み成形されたプラスチック容器のような）も含まれる。どのラベル又は添付文書も、当該ＥＦＮＡモジュレーター組成物が癌（例えば、結直腸癌）を治療するために使用されることを示す。
ＸＶ．研究試薬
本発明の他の好ましい態様はまた、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、又はレーザー媒介分画法のような方法を介して腫瘍始原細胞の集団又は亜集団を同定、単離、分画、又は濃縮するのに有用な道具としての開示モジュレーターの特性を利用する。当業者は、癌幹細胞が含まれるＴＩＣの特性決定及び操作に適合可能ないくつかの技術において当該モジュレーターが使用し得ることを理解されよう（例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６、及び１２／７５７，６４９を参照のこと）。
ＸＶＩ．その他
本明細書において他に定義されなければ、本発明に関連して使用される科学及び技術用
語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に求められなければ、単数形の用語には複数が含まれて、複数形の用語には単数が含まれる。より具体的には、本明細書と付帯の特許請求項において使用されるように、単数形の冠詞（「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈が明らかに他のことを示さなければ、複数の指示語が含まれる。このように、例えば、「タンパク質（a protein）」への言及
には、複数のタンパク質が含まれ；「細胞（a cell）」への言及には、細胞の混合物が含まれる、といった具合である。加えて、本明細書と付帯の特許請求項において提供される範囲には、両方の終点とその終点間のすべての点が含まれる。故に、２．０〜３．０の範囲には、２．０、３．０と２．０と３．０の間のすべての点が含まれる。
一般的に言えば、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法とその技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、他に示さなければ、当該技術分野で周知の、本明細書を通して引用されて考察される様々な概説とより専門的な参考文献に記載されるような慣用の方法に従って概ね実施される。例えば、Sambrook J. & Russell D.「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第3版、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（2000）；Ausubel et al.「分子生物学の簡略プロトコール：分子生物学の最新プロトコールからの方法の要約（A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology）」Wiley, John & Sons 社（2002）；Harlow and Lane「抗体の使用法：実験マニュア
ル（Using Antibodies: A Laboratory Manual）」コールドスプリングハーバーラボラト
リー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1998）；及び、Coligan et al.「タンパク質科学の簡略プロトコール（Short Protocols in Protein Science）」Wiley, John & Sons 社（2003）を参照のこと。酵素反応と精製技術は、当該技術分野で通常
実施されているか又は本明細書に記載のように、製造業者の仕様に従って実施する。本明細書に記載のような分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び製薬化学に関連して使用される命名法とその実験手順及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。
本明細書内で開示又は引用されるすべての参考文献又は文書は、限定なしに、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に使用するどのセクション見出しも、編成上の目的のみのためであって、記載される主題を限定するものと解釈してはならない。
このように、上記で一般的に記載された本発明は、以下の実施例を参照して、より容易に理解されよう。これらは、例証のために提供されるのであって、本発明を限定することを企図するものではない。これらの実施例は、下記の実験が実施されるすべての実験又は唯一の実験であることを表明するものではない。他に示さなければ、割合は、重量割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、そして圧力は大気圧か又は大気圧付近である。
実施例１
腫瘍始原細胞集団の濃縮
癌患者の中に存在するような固形腫瘍の細胞異種性について特性決定し、特別な表現型マーカーを使用して腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞：ＣＳＣ）の同一性を解明して、臨床意義のある療法標的を同定するために、当該技術分野で認められた技術を使用して大きな非従来型の異種移植片（ＮＴＸ）腫瘍バンクを開発して維持した。多数の別個の腫瘍細胞株を含んでなるＮＴＸ腫瘍バンクを、免疫不全マウスにおいて、当初は多様な
固形悪性腫瘍に罹患している数多くの癌患者より得られた異種の腫瘍細胞を多数回にわたって継代することを通じて、増殖させた。明確に定義された系統を有する多数の個別の初期継代ＮＴＸ腫瘍細胞株が継続して利用可能であることで、この細胞株より精製された細胞の再現可能で反復性の特性決定を可能にするようなＴＰＣの同定及び単離が大いに促進される。より具体的には、単離又は精製されたＴＰＣは、その細胞の起源となった患者腫瘍試料を反復するマウスにおいて、表現型でも形態学的にも異種の腫瘍を産生するそれらの能力に従って、レトロスペクティブに極めて正確に特徴付けられる。このように、単離細胞の小集団を使用して完全に異種の腫瘍をマウスにおいて産生する能力は、その単離細胞がＴＰＣを含むという事実を強く示唆する。そのような研究において、最小限に継代されたＮＴＸ細胞系の使用は、in vivo 実験を大いに単純化して、容易に証明可能な結果を提供する。さらに、初期継代ＮＴＸ腫瘍はまた、イリノテカン（即ち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））のような治療薬剤に反応して、腫瘍増殖、現行療法への抵抗性、及び腫瘍再発を推進する根源的な機序への臨床的に関連性のある見識を提供する。
ＮＴＸ腫瘍細胞株が確立されたので、構成要素の腫瘍細胞表現型についてフローサイトメトリーを使用して分析して、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）について特性決定し、単離、精製、又は濃縮して、そのような集団内のＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ細胞を分離又は分析するために使用され得る別々のマーカーを同定した。この点に関して、本発明者は、タンパク質の発現に基づいた細胞の迅速な特性決定と潜在的に有用なマーカーの同時同定をもたらす、専用のプロテオミックベースプラットフォーム（即ち、PhenoPrintＴＭ Array）を利用した。PhenoPrint Array は、その多くが市販供給源より入手されて、９６ウェルプレート
に配置された、数百もの別々の結合分子を含んでなる専用のプロテオミックプラットフォームであって、ここで各ウェルは、フィコエリトリン蛍光チャネル中の別個の抗体とプレート全体で各ウェルに配置された異なる蛍光色素の多数の追加抗体を含有する。これにより、非フィコエリトリンチャネルを介して関連細胞を迅速に包含させ、又は非関連細胞を除外することを通じて、選択した腫瘍細胞の亜集団における対象の抗原の発現レベルの決定が可能になる。この PhenoPrint Array を当該技術分野で周知の組織解離、移植、及び幹細胞の技術（Al-Hajj et al., 2004, Dalerba et al., 2007 及び Dylla et al., 2008, いずれも上掲、このそれぞれは、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）と組み合わせて使用した場合、関連マーカーを効果的に同定した後で、特異的なヒト腫瘍細胞亜集団をきわめて効率的に単離及び移植することが可能であった。
従って、重度の免疫不全マウス中のヒト腫瘍について一般になされているように様々なＮＴＸ腫瘍細胞系を確立したらすぐに、８００〜２，０００ｍｍ３に達した時点でマウスより腫瘍を切除して、当該技術分野で認められた酵素消化技術（例えば、本明細書に取り込まれる、米国特許第２００７／０２９２４１４号を参照のこと）を使用して、この細胞を単一細胞懸濁液へ解離させた。これらの懸濁液より PhenoPrint Array を使用して得られたデータは、細胞ごとのベースで、絶対的（各細胞あたり）と相対的（集団中の他の細胞に対する）の両方の表面タンパク質発現を提供し、細胞集団のより複雑な特性決定及び層別化をもたらした。より具体的には、PhenoPrint Array の使用は、ＮＴＧバルク腫瘍
細胞及び腫瘍間質よりＴＩＣ又はＴＰＣをあらかじめ識別するタンパク質又はマーカーの迅速な同定を可能にして、ＮＴＸ腫瘍モデルから分離されるときに、特異的な細胞表面タンパク質の異なるレベルを発現する腫瘍細胞亜集団の相対的に迅速な特性決定を提供した。特に、腫瘍細胞集団全体で異種に発現されるタンパク質により、ある特別なタンパク質又はマーカーの発現レベルが高いか又は低い、独自の高度精製された腫瘍細胞亜集団の単離と免疫不全マウスへの移植が可能になり、それによって、ある亜集団又は別の亜集団においてＴＰＣが濃縮されたかどうかの評価が促進される。
「濃縮する」という用語は、細胞を単離することと同義的に使用されて、ある種類の細胞の収率（画分）が出発又は最初の細胞集団と比較して、他の種類の細胞の画分に対して
増加していることを意味する。好ましくは、「濃縮すること」は、ある細胞集団中の１種類の細胞の百分率を、出発の細胞集団と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、又は５０％より多く高めることを意味する。
本明細書に使用するように、細胞又は組織の文脈において、マーカーは、ある特別な細胞、細胞集団、又は組織と同定可能なほどに関連しているか又はその中又は上に特異的に見出される化学的又は生物学的な実体（疾患又は障害に影響を受けている組織又は細胞集団の中又は上で同定されるものも含まれる）の形式のあらゆる特徴を意味する。はっきり明示されるように、マーカーは、本質的に、形態学的、機能的、又は生化学的であり得る。好ましい態様において、マーカーは、特定の細胞種（例、ＴＰＣ）によるか又はある条件下の細胞（例えば、細胞周期の特別な時点にある細胞、又は特別なニッチにある細胞）によって差示的又は選好的に発現される細胞表面抗原である。好ましくは、そのようなマーカーは、タンパク質であり、そして好ましくは、当該技術分野で公知であるような抗体、アプタマー、又は他の結合分子のエピトープを保有する。しかしながら、マーカーは、細胞の表面又はその内部に見出されるどの分子からもなってよく、限定されないが、タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）、脂質、多糖、核酸、及びステロイドが含まれる。形態学的マーカーの特徴又は形質の例には、限定されないが、形状、大きさ、及び「核」対「細胞質」比が含まれる。機能的マーカーの特徴又は形質の例には、限定されないが、特別な基質へ付着する能力、特別な色素を取り込むか又は排除する能力（例えば、限定されないが、脂溶性色素の排除）、特別な条件の下で遊走する能力、及び特別な系譜に沿って分化する能力が含まれる。マーカーはまた、レポーター遺伝子より発現されるタンパク質であり得、例えば、レポーター遺伝子をコードする核酸配列の細胞への導入とその転写の結果として該細胞によって発現されるレポーター遺伝子は、マーカーとして使用し得るレポータータンパク質の産生をもたらす。マーカーとして使用し得るこのようなレポーター遺伝子は、例えば、限定されないが、蛍光タンパク質酵素、呈色性（chromomeric）タ
ンパク質、耐性遺伝子、等である。
関連した意味において、「マーカー表現型」という用語は、組織、細胞、又は細胞集団（例、安定したＴＰＣ表現型）の文脈において、特別な細胞又は細胞集団を（例えば、ＦＡＣＳによって）特性決定する、同定する、分離する、単離する、又は濃縮するために使用し得るあらゆるマーカー又はマーカーの組合せを意味する。具体的態様において、マーカー表現型は、細胞表面マーカーの組合せの発現を検出又は同定することによって決定され得る細胞表面表現型である。
当業者は、数多くのマーカー（又はそれらの非存在）が癌幹細胞の様々な集団と関連付けられて、腫瘍細胞亜集団を単離するか又は特性決定するのに使用されてきたことを認めよう。この点に関して言えば、例示の癌幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、Ｍ
ＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、及びＣＤ４９ｆを含む。例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburg et al., 2010, PMID：20185329、米国特許第７，６３２，６７８号、及び米国特許公開公報番号：２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６、及び２０１１／００２０２２１を参照のこと。上記に記載の PhenoPrint Array には、これらマーカーのいくつかが含まれていたことを理解されたい。
同様に、ある腫瘍型の癌幹細胞に関連した細胞表面表現型の非限定的な例には、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋、並びに、当該技術分野で公知である他の癌幹細胞表面表現型が含まれる。例えば、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburg et al., 2010、上掲、Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 及び米国特許公開公報番号：２００８／０１３８３１３を参照のこと。当業者は、直前に例示したようなマーカー表現型を標準のフローサイトメトリー分析及び細胞選別技術と併せて使用して、ＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団をさらなる分析のために特性決定する、単離する、精製する、又は濃縮することができることを理解されよう。本発明に関連して興味深い、ＣＤ４６、ＣＤ３２４、及び任意選択的にＣＤ６６ｃは、多くのヒト結直腸（「ＣＲ」）、乳房（「ＢＲ」）、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺（ＳＣＬＣ）、膵臓（「ＰＡ」）、メラノーマ（「Ｍｅｌ」）、卵巣（「ＯＶ」）、及び頭頚部癌（「ＨＮ」）の腫瘍細胞の表面で、分析される腫瘍標本が原発性の患者腫瘍標本であるか又は患者由来のＮＴＸ腫瘍であるかに拘らず、高度に、又は異種に発現されている。
陰性発現（即ち、「−」）の細胞とは、本明細書において、対象の他のタンパク質を蛍光放射の追加チャネルにおいて標識する完全な抗体染色カクテルの存在下に蛍光のチャネル中のアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイル以下を発現する細胞として定義される。当業者は、陰性事象を明確化するためのこの手順が「蛍光マイナス１」又は「ＦＭＯ」染色と呼ばれることを理解されよう。本明細書では、上記に記載したＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルより大きい発現がある細胞を「陽性」（即ち「＋」）と定義する。本明細書で明確にされるように、概括的に「陽性」と定義される様々な細胞の集団がある。第一に、低い発現（即ち「ｌｏ」）の細胞とは、観測される発現が、アイソタイプ対照抗体でのＦＭＯ染色を使用して決定される９５パーセンタイルより高くて、上記に記載のＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルの標準偏差内にある細胞として一般的に定義される。「高い」発現（即ち「ｈｉ」）の細胞とは、観測される発現が、アイソタイプ対照抗体でのＦＭＯ染色を使用して決定される９５パーセンタイルより高くて、上記に記載のＦＭＯ染色手順を使用してアイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイルより１標準偏差だけ大きい細胞として定義され得る。他の態様では、好ましくは、９９パーセンタイルを陰性及び陽性のＦＭＯ染色の間の境界点として使用してよく、特に好ましい態様において、このパーセンタイルは、９９％より大きくてよい。
結直腸癌患者由来のいくつかのＮＴＸ腫瘍全体の発現の強度及び異種性に基づいて結直腸腫瘍抗原を速やかに同定して順位付ける上記に記載のような技術を使用して、候補のＴＰＣ抗原について、「腫瘍」対「正常隣接組織」の比較によってさらに評価してから、少なくとも一部は、悪性腫瘍細胞中の特別な抗原の上方又は下方調節に基づいて選択した。さらに、完全に異種な腫瘍をマウス中へ移植する能力を高めるその能力（即ち、腫瘍形成能力）に関して多様な細胞表面マーカーについて体系的に分析して、その後これらのマーカーを組み合わせることで、この方法の解明が実質的に向上して、移植時に全ての腫瘍産生能力を専ら含有する、高く濃縮された区別可能な腫瘍細胞亜集団（即ち、腫瘍始原細胞）を同定して特性決定するように蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術を独自設計する能力も向上した。繰り返すと、腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）又は腫瘍形成（ＴＧ）細胞という用語には、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；即ち、癌幹細胞）と高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）が共に含まれ、これらは一緒に、バルク腫瘍又は塊の独自の亜集団（即ち、０．１〜２５％）を概して含み；その特徴は、上記に定義されている。この形式で特性決定される腫瘍細胞の大部分はこの腫瘍形成能力を欠失しているので、非腫瘍形成性（ＮＴＧ）と特性決定され得る。驚くべきことに、専用の PhenoPrint Array を使用して同定されたほとんどの個別マーカーは、標準ＦＡＣＳプロトコールを使用すると、結直腸腫瘍中の腫瘍始原細胞集団を濃縮する能力を証明しなかったが、個別マーカーの組合せを使用すれば、腫瘍始原細胞の２つの亜集団：ＴＰＣとＴＰｒｏｇを同定し得ることが観測された。当業者は、ＴＰＣとＴＰｒｏｇの間の明確な違いが、いずれも一次移植体において始動する腫瘍であるが、低い細胞数での連続移植時にも腫瘍増殖を永続的に促進するＴＰＣの能力であることを認めよう。さらに、ＴＰＣとＴＰｒｏｇをともに濃縮するために組み合わせて使用されるマーカー／タンパク質は、腫瘍形成細胞を濃縮するために同様に使用し得る明確化された細胞表面マーカー又は酵素活性を有するものもあるが、本発明者による発見以前には、どの組織又は新生物中でもそのような活性を含有する細胞に関連していることが知られていなかった（Dylla et al 2008, 上掲）。下記に説明するように、次いで、上記に言及した細胞表面マーカーの組合せを使用して単離した特定の腫瘍細胞亜集団を、全トランスクリプトームの次世代配列決定法を使用して分析して、差示的に発現される遺伝子を同定して特性決定した。
実施例２
濃縮された腫瘍始原細胞集団からのＲＮＡ試料の単離と分析
実施例１に記載のように産生して継代したいくつかの確立された結直腸ＮＴＸ細胞株（ＳＣＲＸ−ＣＲ４、ＣＲ１１、ＣＲ３３、ＰＡ３、ＰＡ６、及びＰＡ１４）を使用して、免疫不全マウスにおいて腫瘍を始動させた。ＳＣＲＸ−ＣＲ４、ＰＡ３、又はＰＡ６腫瘍を担うマウスでは、平均腫瘍負荷が約３００ｍｍ３に達したならば、このマウスを無作為化して、１５ｍｇ／ｋｇのイリノテカン、２５ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、又は媒体対照（ＰＢＳ）で週２回、安楽死に先立つ少なくとも２０日の期間の間、処理した。全６種のＮＴＸ系より生じる腫瘍（化学療法の処理を受けているマウス由来のものも含まれる）を取り出して、切除したばかりの結直腸ＮＴＸ腫瘍より、ＴＰＣ、ＴＰｒｏｇ、及びＮＴＧ細胞をそれぞれ単離して、同様に、実施例１で説明した技術を概ね使用して、膵臓ＮＴＸ腫瘍よりＴＧ細胞とＮＴＧ細胞を単離した。より具体的には、ＦＡＣＳによって細胞集団を単離して、すぐにペレット状にして、Qiagen RLTplus ＲＮＡ溶解緩衝液（Qiagen 社）に溶解させた。次いで、この溶解物を使用するまで−８０℃で保存した。融解させてすぐに、Qiagen RNeasy 単離キット（Qiagen 社）をベンダーの説明書に従って使用して、全
ＲＮＡを抽出して、ベンダーのプロトコールと推奨される機器設定を再び使用して、Nanodrop（Thermo Scientific）と Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）で定量した。生じる全ＲＮＡ調製物は、遺伝子の配列決定及び解析に適していた。
媒体又は化学療法剤で処理されたマウスより上記に記載のように単離したそれぞれの細
胞集団より入手した全ＲＮＡ試料を、Applied Biosystems SOLiD 3.0（オリゴライゲーション／検出による配列決定法）次世代配列決定プラットフォーム（Life Technologies）
を使用する全トランスクリプトーム配列決定用に、各試料につき５ｎｇの全ＲＮＡから開始して、調製した。SOLiD プラットフォームによって作成されたデータより、ヒトゲノム由来の３４，６０９の遺伝子へマッピングして、ＥＦＮＡ４が含まれるエフリンＡリガンドを検出することができて、ほとんどの試料中のＥＮＦＡレベルの実証可能な測定値を得た。
一般的には、SOLiD3 次世代配列決定プラットフォームは、ビーズへ連結したクローン
増幅ＲＮＡ／ＤＮＡ断片の並列した配列決定を可能にする。次いで、色素標識化オリゴヌクレオチドでのライゲーションによる配列決定を使用して、試料中に存在する各断片の５０塩基読み取りを５０００万より多い読み取りの全数で作成し、ゲノム中のタンパク質のｍＲＮＡ転写物レベル発現のずっとより正確な表示を作成する。SOLiD3 プラットフォー
ムは、読み取りカバー率（ゲノム位置へ独自にマッピングされる読み取り）だけに基づいて、発現だけでなく、ＳＮＰ、既知及び未知の選択的スプライシング事象、及び潜在的に新しいエクソンの発見を捉えることができる。このように、この次世代プラットフォームの使用は、転写物レベルでの発現の差異だけでなく、発現されるｍＲＮＡ転写物の特定のスプライス変異体の差異又は選好性の決定を可能にした。さらに、Applied Biosystems
からの改良された全トランスクリプトームプロトコールを使用する SOLiD3 プラットフォームでの分析には、増幅前にほぼ５ｎｇの出発材料だけを必要とした。このことが重要であるのは、選別された細胞集団では、例えば、ＴＰＣ細胞の亜集合がＮＴＧ又はバルク腫瘍よりごくわずかな数しかないので、全ＲＮＡの抽出がごく少量の使用可能な出発材料しかもたらさないからである。
SOLiD3 プラットフォームからの同一２回試行の配列決定データを正規化して変換して
、標準的な業界手法のように倍率比を計算した。図面２に示すように、腫瘍由来のＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、及びＥＦＮＡ４のレベル、並びにＥｐｈ受容体：ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、及びＥＰＨＡ１０のレベルを測定した。このデータの解析は、媒体（図面２Ａ）又は１５ｍｇ／ｋｇのイリノテカン（図面２Ｂ）で処理されたマウスより細胞を入手したかに拘らず、ＥＦＮＡ４がＳＣＲｘ−ＣＲ４ ＮＴＸ腫瘍ＴＰＣにおいてＮＴＧ集団に対して転写物レベルで１．９〜３倍、そしてＴＰＣにおいてＴＰｒｏｇ集団に対して１．２〜１．４倍上方調節されていることを示した。さらに、ＥＦＮＡ１も、ＴＰｒｏｇ及びＮＴＧそれぞれの細胞に対して、ＴＰＣにおいて上昇していたことが理解されよう（但し、ＥＦＮＡ４より低い程度で）。さらに、追加の結直腸（ＳＣＲｘ−ＣＲ１１及びＣＲ３３）及び膵臓（ＳＣＲｘ−ＰＡ３、ＰＡ６、及びＰＡ１４）の腫瘍試料について、SOLiD3 全
トランスクリプトーム配列決定法によって分析すると、ＥＦＮＡ４遺伝子発現は、同様に、結直腸癌（図面３Ａ）ではＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞に対してＴＰＣにおいて、そして膵臓腫瘍（図面３Ｂ）由来の細胞のＴＩＣ（又はＴＧ）亜集団において上昇して、上記に例証したように発見された独自の細胞表面マーカーのパネルを使用して明確化された（膵臓腫瘍中のＴＩＣ集団を構成するＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ細胞の亜集合は、まだ明確化されていない）。
また、ＥＦＮＡ４リガンドとＥＦＮＡ１リガンドがともに相互作用するＥＰＨＡ２受容体の発現は、ＴＰＣ細胞からＮＴＧ細胞への分化の進行の間のＥＦＮＡ４とＥＦＮＡ１の両方の発現を逆に反映することが観測された。このＥＦＮＡ１／ＥＦＮＡ４リガンドとＥＰＨＡ２受容体の逆の発現パターンは、これらのリガンド／受容体対の間の応答が結直腸癌幹細胞分化の間の細胞運命の決定においてある役割を演じている可能性があること、そしてこれらの相互作用を中和することが腫瘍増殖に対して負の影響を及ぼす可能性があることを示唆する。具体的には、エフリンＡリガンドの後者の対に抗する中和抗体を使用してＥＦＮＡ１及び／又はＥＦＮＡ４とのＥｐｈＡ２相互作用を遮断することによって、例
えば、ＴＰＣを化学療法剤に対して増感させるか又は分化するように強制することができるかもしれない。さらに、ＥＦＮＡ１及び／又はＥＦＮＡ４−内在化抗体を使用してＴＰＣを標的化することによって、裸のモジュレーターによって直接的に、又は毒素又は抗体−薬物コンジュゲートの使用を介して、ＴＰＣを殺傷することができるかもしれない。
上記に詳述した観測事実は、ＥＦＮＡ１及び／又はＥＦＮＡ４の発現がＴＰＣ集団において概ね上昇していることを示して、これらの膜繋留（tethered）リガンドが腫瘍形成性と腫瘍維持において重要な役割を担うことにより、新規の治療アプローチへの優れた標的を構成する可能性があることを示唆する。
実施例３
濃縮された腫瘍始原細胞集団中のエフリンＡリガンドのリアルタイムＰＣＲ分析
結直腸癌ではＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞に対してＴＰＣ集団において、そして膵臓癌ではＮＴＧ細胞に対してＴＧにおいて、全トランスクリプトーム配列決定によって観測された、エフリンＡリガンドの差示的な発現を検証するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、上記に示したような様々なＮＴＸ系より単離したそれぞれの細胞集団中の遺伝子発現レベルを測定した。そのようなリアルタイムＰＣＲ分析は、特別な対象の遺伝子に特異的なプライマー及びプローブのセットを使用する別々の標的の遺伝子発現レベルのより直接的で迅速な測定を可能にする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲを Applied Biosystems 7900HT Machine（Life Technologies）で実施して、これを使用して多数の患者由来ＮＴＸ系細胞集団と対応する対照におけ
るＥＦＮＡ４遺伝子発現を測定した。さらに、この分析は、TaqMan System と共に供給される説明書において特定されるように、そして市販のＥＦＮＡ４プライマー／プローブセット（Life Technologies）を使用して行った。
図面４に見られるように、３種の別個の結直腸ＮＴＸ腫瘍系（ＳＣＲｘ−ＣＲ４、ＣＲ５、及びＣＲ１４）より単離したＮＴＧ、ＴＰｒｏｇ、及びＴＰＣ集団における遺伝子発現の定量的リアルタイムＰＣＲインターロゲーション（interrogation）は、ＥＦＮＡ４
遺伝子発現がＮＴＧ細胞に対してＴＩＣ亜集団（ＴＰＣ及び／又はＴＰｒｏｇ）において１．４倍より多く上昇していることを示した。ＥＦＮＡ４はまた、イリノテカンでの処理を受けているマウスのＴＩＣ集団や膵臓腫瘍のＴＧ細胞集団（例、ＳＣＲｘ−ＰＡ３）においてもほぼ１．８倍上昇していた。リアルタイム定量的ＰＣＲのより広く認められた方法論を使用する、結直腸と膵臓の両方の患者由来ＮＴＸ腫瘍からのＮＴＧ細胞対照と比較した、ＮＴＸ ＴＩＣ細胞調製物における上昇したＥＦＮＡ４発現の観測事実は、先の実施例の SOLiD3 全トランスクリプトーム配列決定データがより高感度であることを確認して、腫瘍形成性、治療への抵抗性、及び再発の根底にあるＥＦＮＡ４と細胞の間で観測される関連性を裏付ける。
実施例４
未分画結直腸腫瘍標本におけるエフリンＡリガンドの発現
エフリンＡリガンド遺伝子発現が結直腸腫瘍由来のＴＰＣ集団において同じ腫瘍由来のＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞と比較するときに上昇していることがわかったという事実に照らして、上昇したエフリンＡリガンド（即ち、ＥＦＮＡ４）発現が未分画結直腸腫瘍試料においても正常隣接組織（ＮＡＴ）に対して検出可能であるかどうかを判定する実験を行った。同様に、エフリンＡリガンドの腫瘍中の発現が正常組織試料中のレベルといかに比較されるかを判定するための測定も行った。当該技術分野で公知の技術を使用して、１１０の結直腸患者腫瘍標本、正常隣接組織、及び４８の正常組織を含有する Custom TumorScan qPCR（Origene Technologies）３８４ウェルアレイを設計して製作した。実施例３において詳述した手順と、同一のＥＦＮＡ４特異プライマー／プローブセットを使用して、カスタムプレートのウェルにおいて TaqMan リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。
図面５Ａ及び５Ｂは、発現データの結果を正常な結腸及び直腸組織における平均の発現に対して正規化したグラフ形式で示す。より具体的には、図面５Ａは、１１０名の結直腸癌患者より入手した１６８の組織標本（このうち３５の組織標本は、結直腸癌患者由来の正常（ＮＬ）隣接組織である）と他の部位由来の４８の正常組織（他のＮＬ）を使用して作成したデータを要約する。このプロットでは、それぞれの組織標本／患者からのデータを点によって表して、Ｘ軸上で区切られた各集団の幾何平均値が線として表される。同様に、図面５Ｂは、この疾患の様々なステージ（Ｉ〜ＩＶ）での腫瘍（Ｔ）又は正常隣接組織（Ｎ）より入手した、２４のマッチした結直腸患者標本からのデータを含有する。ここでプロットしたデータは、試料ごとのベースで提示されて、個々の患者由来のそれぞれの腫瘍と正常隣接組織の間に連結がある。ＥＦＮＡ４の発現は、マッチした「腫瘍」対「正常隣接組織」の大多数で明らかにより高くて、ステージ２、３、及び４における差示的な発現は、統計学的有意差（ｎ≧４、Ｐ≦０．０４７）に達する。図面５Ａと図面５Ｂはともに、提示した全４つのステージにおいて、ＥＦＮＡ４遺伝子の発現レベルが結直腸腫瘍の大多数において、そして正常隣接組織に対してマッチした腫瘍標本において上昇していることを示す。さらに、結直腸癌のどのステージでも、平均のＥＦＮＡ４遺伝子発現は、上記の実験において調べたどの正常組織におけるＥＦＮＡ４遺伝子発現の最高レベルほど高くはないとしても少なくとも同等であるように見える（図面５Ａ）。上記の結果は、ＥＦＮＡ４発現が結直腸癌において増加していること、そして上記の観測事実と併せた場合に、ＥＦＮＡ４発現が結直腸ＴＰＣと膵臓ＴＩＣにおいて最大であることを証明して、ＥＦＮＡ４を発現する腫瘍形成細胞の療法標的化が癌患者に対して大きな治療利益をもたらす可能性があることを示唆する。
実施例５
例示の腫瘍試料におけるエフリンＡリガンドの差示的な発現
追加の結直腸癌患者の腫瘍試料と１７の他の異なる固形腫瘍型のうち１つを診断された患者からの腫瘍標本におけるエフリンＡリガンド遺伝子発現についてさらに評価するために、実施例４に記載のようにカスタム製作されたＴｉｓｓｕｅＳｃａｎＴＭｑＰＣＲ（Origene Technologies）３８４ウェルアレイを使用して、Ｔａｑｍａｎ ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。この測定の結果は、図面６に提示されて、ＥＦＮＡ４の遺伝子発現がいくつかの腫瘍試料において有意に上昇又は抑制されていることを示す。
この点に関して、図面６Ａ及び６Ｂは、１８の異なる固形腫瘍型の１つがある患者由来の全腫瘍標本（灰色の点）又はマッチした正常隣接組織（ＮＡＴ；白色の点）中のヒトＥＦＮＡ４の相対的な遺伝子発現レベルと絶対的な遺伝子発現レベルをそれぞれ示す。図面６Ａでは、分析した各腫瘍型についてＮＡＴ中の平均した遺伝子発現に対してデータを正規化している。図面６Ｂでは、ＥＦＮＡ４の絶対的な発現について様々な組織／腫瘍で評価して、このデータを、定量的リアルタイムＰＣＲによる指数的増幅に達するのに必要とされるサイクルの数（Ｃｔ）としてプロットした。増幅しなかった標本には４５のＣｔ値を割り当てたが、これは、この実験プロトコールでの最終増幅サイクルを表す。各点は、個別の組織標本を表して、その平均値を実線として表す。
このカスタムアレイを使用すると、結直腸癌と診断された患者の大多数と、子宮内膜癌、食道癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、及び子宮癌と診断されたほとんどの患者がその腫瘍においてＮＡＴに対して有意に多いＥＦＮＡ４遺伝子発現を有することが観測され、これらの腫瘍における腫瘍形成及び／又は腫瘍進行にＥＦＮＡ４がある役割を担う可能性があることを示唆した。対照的に、副腎癌と膵臓癌の患者由来の腫瘍では、ＥＦＮＡ４の発現が有意に抑制されているように見えた。また上記の試験から明らかであったのは、ＥＦＮＡ４遺伝子発現がほとんどのＮＡＴ試料において概して低い〜中等度であったことであり；最も高い発現は、副腎、乳房、子宮頚部、及び卵巣において観測された。再び
、上記のデータは、選択した過剰増殖性障害を示す患者の腫瘍形成性又は永続性に関して、差示的なＥＦＮＡ４発現（高いか又は低い）がその指標になって、手掛かりとなる（dispositive）可能性があることを示唆する。
ＥＦＮＡ４発現については、上記に考察したような専用の非従来型異種移植片（ＮＴＸ）を使用して評価して、正常な組織発現に関連して定量した。市販の正常組織ＲＮＡ試料（乳房、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、骨格筋、小腸）と、乳癌（ＢＲ）、結直腸癌（ＣＲ）、腎臓癌（ＫＤＹ）、肝臓癌（ＬＩＶ）、メラノーマ（ＭＥＬ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌（ＯＶ）、膵臓癌（ＰＡ）、及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）由来のＮＴＸ腫瘍に対して定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。図面６Ｃに示す結果は、正常組織中の発現に比べて、乳房、結腸、及び肝臓のＮＴＸ系においてＥＦＮＡ４の発現が上昇していることを証明する。逆に、図面６Ｄは、同一の正常系とＮＴＸ系の多くにおける関連したファミリーメンバーのＥＦＮＡ１の発現を明らかにして、正常組織と腫瘍組織の間の差示的な発現がほとんどないことを示す。この発現プロフィールにも拘らず、ＥＦＮＡ１と反応する本発明のＥＦＮＡモジュレーター（他のＥＦＮＡと反応するものも含まれる）は、後続の実施例で裏付けられるように、腫瘍形成細胞を消失させるために有効に使用することができる。
いずれにしても、定量的リアルタイムＰＣＲによって検出されるｍＲＮＡ発現の上昇がＥＦＮＡ４のタンパク質レベルの上昇へ翻訳されることを確かめるために、ウェスタンブロットを行った。全タンパク質抽出キット（Bio Chain Institute ＃ K3011010）を提供
のプロトコールに従って使用して、ＮＴＸ及び細胞株（２９３のナイーブ細胞と２９３のＥＦＮＡ４過剰発現細胞）の細胞溶解物を産生して、市販の正常組織溶解物（Novus Biologicals）とマッチさせた。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce/Thermo Fisher ＃23225
）を使用して、溶解物のタンパク質濃度を定量した。等量の細胞溶解物を還元条件下にＭＥＳ緩衝液中の NuPAGE Novex ４−１２％ Bis-Tris ゲル剤（Life Technologies）に泳
動させた。ヒトＥＦＮＡ４に対する市販抗体（R&D Systems-AF369）を使用して、ＥＦＮ
Ａ４タンパク質発現を検出した。図面６Ｅのトップパネルでは、ＥＦＮＡ４を過剰発現するように工学処理された２９３細胞が、ナイーブ２９３細胞に比較して高い発現を示す。追加的に言えば、このトップパネルでは、いくつかの乳癌、結腸癌、及び非小細胞肺癌のＮＴＸが相対的に高いＥＦＮＡ４の発現を示した。同様の条件の下で、図面６Ｅの最下部のパネル中のウェスタンブロットは、ＮＴＸ細胞株のＣＲ１１中の高いＥＦＮＡ４発現と比較したときに、正常組織が低いか又は検出不能なレベルのＥＦＮＡ４を発現することを示す。両方のパネルで細胞溶解物のローディングが等しいことを証明するために、抗ＧＡＰＤＨ対照抗体を使用する。
実施例６
ＥＦＮＡ免疫原を使用する、抗ＥＦＮＡ抗体の産生
本明細書の教示に従って、ＥＦＮＡ４−ＥＣＤ−Ｆｃ、ｈＥＦＮＡ４−ＥＣＤ−Ｈｉｓ、ｈＥＦＮＡ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ、ＥＦＮＡ４を過剰発現するＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞の全細胞、又は本明細書で説明したように調製した血漿調製物での接種により、マウスの抗体の形態でのＥＦＮＡモジュレーターを産生した（ＥＣＤ−細胞外ドメイン）。免疫原は、いずれも市販の出発材料（例、組換えヒトエフリンＡ４ Ｆｃキメラ、CF R&D systems ＃ 369-EA-200）及び／又は当業者に周知の技術を使用して調製した。
より具体的には、９匹の雌性マウス（各３匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）をＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１抗原の様々な調製物で免疫化することによって、マウスの抗体を産生した。免疫原には、Ｆｃ構築体又はＨｉｓタグ付きヒトＥＦＮＡ４若しくはＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ４を過剰発現する１０７個の２９３細胞より抽出した膜画分、又はヒトＥＦＮＡ４を表面で過剰発現する３Ｔ３細胞全体が含まれた。すべての注射で足蹠（footpad
）の経路よりマウスを免疫化した。免疫化には、１０μｇのＥＦＮＡ４若しくはＥＦＮＡ１免疫原、又は１Ｘ１０６個の細胞、又は等量のＴＩＴＥＲＭＡＸＴＭ又はアルムアジュバントで乳化した細胞同等物を使用した。免疫化の後でマウスを安楽死させて、漏出するリンパ節（拡げれば、膝窩及び鼠蹊部）を切り出して、抗体産生細胞の供給源として使用した。組織グラインダーを使用する、リンパ節の機械的な破壊によってリンパ球を放出した。
２種の融合プロトコールの１つを使用した。第一のプロトコールでは、Genetronic デ
バイスでの電気細胞融合を実施して、プレーティングを続けて、ポリクローナルハイブリドーマを後続のサブクローニングでスクリーニングして、モノクローナルハイブリドーマを産生した。第二のプロトコールでは、ＢＴＸ機器での電気細胞融合を実施し、ハイブリドーマライブラリーのバルクでの増殖とこのハイブリドーマの単一細胞沈着を続けて、後にこのクローンをスクリーニングした。
Genetronic デバイス融合プロトコール：Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を（ATCC CRL-1580；Kearney et al, J. Immunol. 123: 1548-1550 (1979)）より購入した非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比で混合することによって融合を実施した。この細胞混合物を８００ｇでの遠心分離によって穏やかにペレット化した。上清の完全な除去の後で、この細胞を２〜４ｍＬのプロナーゼ（Pronase）溶液で２分以下の間処理した。融
合ジェネレーター、モデルＥＣＭ２００１（Genetronic 社）を使用して、電気細胞融合
を実施した。
細胞を平底マイクロタイタープレートに２Ｘ１０４個／ウェルで播いた後で、選択ＨＡＴ培地（シグマ、CRL P-7185）にて２週間のインキュベーションを続けた。次いで、個々のウェルについて、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって抗ヒトＥＦＮＡ４モノクローナルＩｇＧ抗体をスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、トランスフェクトした２９３細胞より精製した組換えＥＦＮＡ４ Ｈｉｓ融合タンパク質で、炭酸塩緩衝液中１００ｎｇ／ウェルで被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートしてから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中３％ ＢＳＡの２００μｌ／ウェルでブロックした。ハイブリドーマプレートからの上清を各ウェルへ加えて、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄してから、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）へコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）（Jackson Immuno Research）ととも
に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをＴＭＢ基質（Thermo Scientific 34028）で発色させて、分光光度計によってＯＤ４５０で分析した。
陽性ウェルからのＥＦＮＡ４分泌ハイブリドーマについて再スクリーニングして、限界希釈又は単一細胞ＦＡＣＳ選別によってサブクローン化した。
選択した抗原陽性ウェルについて、限界希釈プレーティングを使用して、サブクローニングを実施した。プレートについて、単一コロニー増殖の存在を外観的に検査してから、単一コロニーウェル由来の上清を上記に記載の抗原特異的ＥＬＩＳＡと下記に記載のようなＦＡＣＳ確認によってスクリーニングした。生じるクローン集団を増やして凍結培地（９０％ ＦＢＳ，１０％ ＤＭＳＯ）中で凍結保存して、液体窒素に保存した。ＥＦＮＡ４で免疫化したマウスからのこの融合より、上記に記載のＥＬＩＳＡプロトコールを使用して、ＥＦＮＡ４に反応性の１５９のマウスモノクローナル抗体を得た。
ＢＴＸ機器融合プロトコール：Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比率で電気細胞融合によって融合した。電気細胞融合は、Hybrimune System, モデル47-0300（BTX Harvard Apparatus）を使用して実施した。融合し
た細胞を、アザセリン（Azaserine）（シグマ ＃Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ選択培地［１５％胎仔クローンＩ血清（Hyclone）、１０％ BM Condimed（Roche Applied
Sciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵペニ
シリン−ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び１００μＭヒポキサンチンを含有するＤＭＥＭ（Cellgro カタログ番号：15-017-CM）培地］に再懸濁
させてから、４つのＴ２２５フラスコにおいてフラスコあたり９０ｍｌの選択培地でプレート培養した。次いで、このフラスコを、５％ ＣＯ２と９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベーターに６〜７日間入れた。
６〜７日の増殖時に、このライブラリーを、Aria I 細胞ソーターを使用して、48 Falcon 96 ウェルＵ底プレートにおいてウェルあたり１細胞でプレート培養する。簡潔に言えば、１５％胎仔クローンＩ血清（Hyclone）、１０％ BM Condimed（Roche Applied Sciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、及び１００μＭヒポキサンチンを含有する培養基を 48 Falcon 96 ウェルＵ底プレートにおいてウェルあたり２００μｌで播く。生存可能なハイブリドーマを、Aria I 細胞ソーターを使用して、ウェル
につき１細胞で入れて、１０〜１１日間培養して、その上清について、ＦＡＣＳ又はＥＬＩＳＡによってＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１に反応性の抗体をアッセイする。
マウス免疫グロブリンを分泌している増殖陽性ハイブリドーマウェルについて、上記の記載に似たＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウスのＥＦＮＡ４特異性をスクリーニングした。簡潔に言えば、９６ウェルプレート（VWR, 610744）を炭酸ナトリウム緩衝液中１
μｇ／ｍＬのマウスＥＦＮＡ４−Ｈｉｓで、４℃で一晩被覆した。このプレートを２％ ＦＣＳ−ＰＢＳで、３７℃で１時間洗浄してブロックして、すぐに使用するか又は４℃で保存した。非希釈ハイブリドーマ上清をプレート上にて室温で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄して、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧで、室温で１時間プローブする。次いで、このプレートを上記に記載のような基質溶液とともにインキュベートして、ＯＤ４５０で読み取る。
マウス免疫グロブリンを分泌する増殖陽性ハイブリドーマウェルについても、以下のようなＦＡＣＳアッセイを使用して、ヒトＥＦＮＡ１特異性をスクリーニングした。簡潔に言えば、ヒトＥＦＮＡ１を発現する、ウェルにつき１ｘ１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を２５〜１００μｌのハイブリドーマ上清とともに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２回洗浄してから、試料あたり５０μｌのＤｙｅＬｉｇｈｔ ６４９標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的二次抗体（ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２００倍希釈）とともにインキュベートした。１５分のインキュベーションの後で細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳで２回洗浄して、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ ＦＣＳに再懸濁させて、標準条件下にＨＴＳ付属装置を使用して、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）によって分析した。生じるＥＦＮＡ１特異的クローンのハイブリドーマを増やして、ＣＳ−１０凍結培地（Biolife Solutions）に冷凍保存して、液体窒素に保存した。ＥＦＮＡ
１で免疫化したマウスからのこの融合より、ＦＡＣＳ分析を使用して決定されるような、ＥＦＮＡ４と反応する１つのハイブリドーマを得た。さらに、ＦＡＣＳ分析により、これらハイブリドーマのほとんど又はすべてに由来する精製抗体が濃度依存的な様式でＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１へ結合することを確認した。
実施例７
エフリンＡリガンドモジュレーターの配列決定及びヒト化
７（ａ）配列決定：
上述したことに基づいて、固定化したヒトＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１へ見かけ上高い親和性で結合する、いくつかの例示の別個のモノクローナル抗体を選択した。図面７Ａ中の
表形式に示すように、実施例６からのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列分析により、その多くが独自のＶＤＪ再配列を有して新規の相補性決定領域を示すことが確認された。図面７Ａに示す相補性決定領域（配列番号８〜５９及び７０〜９５）は、Chothia et al. 上
掲に従って定義されていることに留意されたい。
配列決定の開始のために、ＴＲＩＺＯＬ試薬を Invitrogen（Life Technologies）より購入した。ワンステップＲＴ ＰＣＲキットとＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを Qiagen 社より購入して、ＲＮａｓｉｎは、プロメガ（Promega）より購入した。カスタム
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies より購入した。
ハイブリドーマ細胞をＲＮＡ調製のためにＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解させた。１０４〜１０５個の細胞を１ｍｌ ＴＲＩＺＯＬに再懸濁させた。２００μｌのクロロホルムの添加後に、試験管を激しく振り混ぜた。試料を４℃で１０分間遠心分離させた。水相を新鮮な微量遠心管へ移して、等量のイソプロパノールを加えた。管を激しく振り混ぜて、そのまま室温で１０分間インキュベートした。次いで、試料を４℃で１０分間遠心分離させた。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄して、室温で少しの間乾燥させた。このＲＮＡペレットを４０μＬのＤＥＰＣ処理水で再懸濁させた。ＲＮＡ調製物の量は、１％アガロースゲルに３μＬを分画することによって決定した。このＲＮＡを、使用するまで、−８０℃のフリーザーに保存した。
可変ドメインプライマーのミックスを使用して、マウスの免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖に特異的なコンセンサスプライマーで増幅した、ハイブリドーマの多様なＤＮＡ配列を入手した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、それぞれのＲＮＡ試料からのＶＨ及びＶＫ遺伝子セグメントを増幅した。この Qiagen ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットは、Sensiscript 及び Omniscript の逆転写酵素、HotStarTaq ＤＮＡポリメラーゼ、Qiagen ワンステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰミックス、及びＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎの混和物（「困難な」（例えば、ＧＣリッチ）鋳型の効率的な増幅を可能にする新規添加剤）を提供する。
３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖又はκ軽鎖いずれかのプライマーの０．５μＬ、５μＬの５ｘＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックス、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）が含まれる反応混合物を調製した。この反応混合物は、両方の逆転写とＰＣＲに必要とされる試薬のすべてを含有する。熱サイクルプログラムは、ＲＴ（逆転写）工程、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間に、３０サイクルの（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１．０分間）を続けた。次いで、７２℃で１０分間の最終インキュベーションがあった。
直接的なＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ産物を産生するために、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＰＣＲ精製キットを製造業者のプロトコールに従って使用して、それらを精製した。このＤＮＡを、５０μＬの無菌水を使用してスピンカラムより溶出させてから、両鎖より直接的に配列決定した。ＰＣＲ断片について直接的に配列決定して、ＶＢＡＳＥ２（Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005）を使用して、ＤＮＡ配列を解析した。
上記で簡潔に述べたように、いくつかの例示の抗ｈＥＦＮＡ４／ｈＥＦＮＡ１抗体の遺伝子配置と導かれたＣＤＲ（Chotia et al., 上掲によって定義されるような）を図面７
Ａ（配列番号８〜５９及び７０〜９５）において表形式で示す。さらに、同じ例示の抗体重鎖及び軽鎖可変領域の核酸配列とアミノ酸配列を図面７Ｂ〜７Ｎ（配列番号９６〜１４７）に示す。
７（ｂ）ヒト化：
実施例６からのマウスの抗体のうち４つを、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法を使用してヒト化した。機能性ヒト生殖細胞系遺伝子に関する配列及び構造の類似性に基づいて、重鎖及び軽鎖のヒトフレームワークを選択した。この点に関して言えば、Chothia et al.（上掲）に記載のように、マウスカノニカルＣＤＲ構造を同じカノニカル構造のあるヒト候補物と比較することによって、構造類似性を評価した。
より具体的には、コンピュータ支援ＣＤＲ移植法（Abysis Database, UCL Business Plc.）と標準分子工学技術を使用してマウスの抗体：ＳＣ４．５、ＳＣ４．１５、ＳＣ４．２２、及びＳＣ４．４７をヒト化して、ｈＳＣ４．５、ｈＳＣ４．１５、ｈＳＣ４．２２、及びｈＳＣ４．４７のモジュレーターを得た（註：クローン又は抗体の表示に続く後続の数字の付加（即ち、ＳＣ４．４７．３）は、特別なサブクローンに言及するのであって、他に述べなければ、又は文脈によって要請されなければ、本開示の目的のための材料ではない）。マウスフレームワーク配列とそのカノニカル構造に対する最高の配列相同性に基づいて、可変領域のヒトフレームワーク領域を選択した。この解析の目的では、ＣＤＲドメインそれぞれのアミノ酸の帰属は、Kabat et al. の番号付けに準拠する。最適のヒ
ト化抗体を産生するためにいくつかのヒト化抗体変異体を作製したが、このヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域に関連する、マウスハイブリドーマ由来の抗原結合性の相補性決定領域（ＣＤＲ）を概して保持していた。ヒト化ＳＣ４．１５、ＳＣ４．２２、及びＳＣ４．４７１のｍＡｂがそのマウス対照物と同様の親和性でＥＦＮＡ４抗原へ結合するのに対し、ｈＳＣ１．５は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定されるように、やや弱い親和性で結合した。
当該技術分野で認められた技術を使用して、分子工学手順を実行した。そのために、製造業者のプロトコール（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製システム、Life
Technologies）に従って、先のハイブリドーマより全ｍＲＮＡを抽出した。完全なマウ
スレパートリーに標的指向するように設計された、３２種のマウス特異的５’リーダー配列プライマーを含んでなるプライマーミックスを３’マウスＣγ１プライマーと組み合わせて使用して、抗体重鎖の可変領域を増幅して配列決定した。同様に、Ｖｋマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計された３２種の５’Ｖｋリーダー配列プライマーミックスをマウスκ定常領域へ特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅して配列決定した。このＶＨ及びＶＬ転写物は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、１００ｎｇの全ＲＮＡより増幅した。
それぞれのハイブリドーマにつき、全８回のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した（Ｖκ軽鎖についての４回とＶγ重鎖（γ１）についての４回）。増幅には、QIAGEN ワンステップＲ
Ｔ−ＰＣＲキット（Qiagen 社）を使用した。特異的なＶ領域プライマーを使用して、抽
出したＰＣＲ産物を直接的に配列決定した。ＩＭＧＴを使用してヌクレオチド配列を解析して、最高の配列相同性がある生殖細胞系Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子メンバーを同定した。Ｖ−ＢＡＳＥ２（Retter et al., 上掲）を使用して、そしてＶＨ及びＶＬ遺伝子のマウス
生殖細胞系データベースへの並置によって、この導いた配列をＩｇＶ及びＪ領域の既知の生殖細胞系ＤＮＡ配列と比較した。
このヌクレオチド配列情報より、ＳＣ４．５、ＳＣ４．１５、ＳＣ４．２２、及びＳＣ４．４７の重鎖及び軽鎖のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントに関するデータを入手した。この配列データに基づいて、抗体のＩｇ ＶＨ及びＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な新しいプライマーセットを組換えモノクローナル抗体のクローニングのために設計した。引き続き、このＶ−（Ｄ）−Ｊ配列をマウスＩｇ生殖細胞系配列と並置した。ＳＣ４．５の重鎖遺伝子をＩＧＨＶ２−６（Ｖ）及びＪＨ３と同定した。Ｅ５モノクローナル抗体重鎖の短いＣＤＲ３の解析では、特異的なマウスＤ遺伝子が同定されなかった。ＳＣ４．１５の
重鎖遺伝子をＩＧＨＶ５−６（Ｖ）、ＤＳＰ２．９（Ｄ）及びＪＨ３と同定した。ＳＣ４．２２の重鎖遺伝子をＶＨＪ５５８（Ｖ）と同定し、ＤセグメントをＤＦＬ１６．１ｅ及びＪＨ４（Ｊ）と同定した。ＳＣ４．４７の重鎖遺伝子をＩＧＨＶ１−２６（Ｖ）、Ｐ１ｉｎｖ（Ｄ）及びＪＨ２（Ｊ）と同定した。４種の軽鎖は、いずれもＫクラスであった。軽鎖遺伝子は、ＳＣ４．５ ｍＡｂではＩＧＫＶ６−１５、ＪＫ２として、ＳＣ４．１５
ｍＡｂではＩＧＫＶ６−ｂ及びＪＫ５として、ＳＣ４．２２ ｍＡｂではＩＧＫＶ１−１１０及びＪＫ１生殖細胞系配列として、そしてＳＣ４．４７κ軽鎖ではＩＧＫＶ２１−７、ＪＫ１生殖細胞系配列として同定した。これらの結果をすぐ下の表２に要約する。
全４つのクローンより入手した重鎖及び軽鎖配列を機能性ヒト可変領域配列へ並置して、相同性とカノニカル構造について検討した。この重鎖及び軽鎖解析の結果を下記の表３及び４にそれぞれ示す。
この生殖細胞系選択とＣＤＲ移植の方法により、その結合特性を概ね保持する抗体が提供されたようであったので、この構築体のほとんどにマウスの残基を挿入することは、ほとんど必要ないようであった。しかしながら、ｈＳＣ４．１５では、重鎖残基６８をＴｈｒ（Ｔ）からＬｙｓ（Ｋ）へ復帰突然変異させて、その抗体特性を改善した。
全４種の抗体のヒト化重鎖可変領域及びヒト化κ軽鎖のアミノ酸配列を（関連の核酸配列とともに）図面７Ｏ〜７Ｒ（配列番号１４８〜１６３）に示し、ここでアミノ酸配列中のＣＤＲ（Kabat et al., 上掲によって定義されるような）は下線を施されている。
より具体的には、ヒト化ＳＣ４．５重鎖の核酸配列と対応するアミノ酸配列（配列番号１４８及び１４９）とヒト化軽鎖のそれ（配列番号１５０及び１５１）を図面７Ｏに示す。同様に、ヒト化ＳＣ４．１５重鎖の核酸配列と対応するアミノ酸配列（配列番号１５２及び１５３）とヒト化軽鎖のそれ（配列番号１５４及び１５５）を図面７Ｐに示す。本発明の別の態様を図面７Ｑに例証するが、ここではヒト化ＳＣ４．２２重鎖の核酸配列と対応するアミノ酸配列（配列番号１５６及び１５７）とヒト化軽鎖のそれ（配列番号１５８及び１５９）を示す。なお別の態様において、図面７Ｒは、ヒト化ＳＣ４．４７重鎖の核酸配列と対応するアミノ酸配列（配列番号１６０及び１６１）とヒト化軽鎖のそれ（配列番号１６２及び１６３）を示す。下記の実施例で証明されるように、上述のヒト化抗体のそれぞれは、本明細書の教示に従って、有効なＥＦＮＡモジュレーターとして機能する。
いずれにしても、当該技術分野で認められた技術を使用して、開示モジュレーターを発現させて単離した。そのために、両方の重鎖の合成ヒト化可変ＤＮＡ断片（Integrated DNA Technologies）をヒトＩｇＧ１発現ベクター中へクローン化した。可変軽鎖断片は、
ヒトＣ−κ発現ベクター中へクローン化した。この重鎖と軽鎖のＣＨＯ細胞への同時トランスフェクションによって、抗体を発現させた。
より具体的には、抗体産生のために、マウス及びヒト化の可変遺伝子ＰＣＲ産物のヒト免疫グロブリン発現ベクター中への一方向性クローニングを行った。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲに使用したすべてのプライマーには、制限部位（ＩｇＨではＡｇｅＩとＸｈｏＩ、ＩｇＫではＸｍａＩとＤｒａＩＩＩであり、これらによりヒトＩｇＧ１及びＩＧＫの定常領域をそれぞれ含有する発現ベクター中への直接的なクローニングが可能になる）が含まれた。簡潔に言えば、ＰＣＲ産物を Qiaquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen 社）で精製して
、ＡｇｅＩとＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩとＤｒａＩＩＩ（ＩｇＫ）のそれぞれでの消化を続けた。発現ベクターへのライゲーションに先立って、消化されたＰＣＲ産物を精製した。全量１０μＬにおいて、２００Ｕ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（NewEngland Biolabs）、７．５μＬの消化及び精製済み遺伝子特異的ＰＣＲ産物、及び２５ｎｇの線状化ベクターＤＮＡでライゲーション反応を実施した。コンピテント大腸菌：ＤＨ１０Ｂ細菌（Life
Technologies）を４２℃での熱ショックにより３μＬのライゲーション産物で形質転換
させて、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）上へ播いた。次いで、ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同じ部位へ挿入する一方、合成のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ ＶＫ挿入物をそれぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−κ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位へクローン化した。
２９３フェクチンを使用する、適正なプラスミドでのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって、ヒト化抗体を産生する細胞を作製した。この点に関しては、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎカラム（Qiagen）で精製した。１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧ（いずれも Life Technologies より）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の
標準条件下で１５０ｍｍプレート（Falcon, Becton Dickinson）においてヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１１２６８）細胞を培養した。
一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％の集密度まで増殖させた。１．５ｍＬ ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した１．５ｍＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭへ等量のＩｇＨと対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（各ベ
クターＤＮＡの１２．５μｇ）を加えた。この混合物を室温で３０分間インキュベートして、培養プレートへ均等に分配した。トランスフェクションの３日後に上清を採取し、１０％ ＦＢＳを補充した２０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭに置き換えて、トランスフェクション後６日目に再び採取した。８００ｘｇで１０分間の遠心分離によって培養上清から細胞残滓を除いて、４℃で保存した。組換えキメラ抗体とヒト化抗体をプロテインＧビーズ（GE
Healthcare）で精製した。
実施例８
ＥＦＮＡモジュレーターの特性
８（ａ） 全般的なモジュレーター特性
様々な方法を使用して、上記に説明したように産生した、選択したエフリンＡ４モジュレーターの結合特性を分析した。具体的には、いくつかのＥＦＮＡ４抗体について、親和性、動態、ビニング（binning）、並びにカニクイザル及びマウスの相同体（内製）との
交差反応性に関する特性をＦｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標）によって決定した。ウェスタン反応性も測定して、還元条件下で結合する２つの抗体（ＳＣ４．２２及びＳＣ４．９１）についてエピトープを決定した。加えて、この抗体について、中和する（即ち、受容体リガンド相互作用をブロックする）、内在化する能力を試験して、これらの実施例（例えば、実施例１２及び１６を参照のこと）に示す手順を使用する in vitro 細胞傷害性アッセイによって、それらの相対的な殺傷のＥＣ５０を比較評価（benchmark）した。この特性
決定の結果を図面８Ａにおいて表形式で示す。
このデータに関して言えば、精度を確実にするために３つの様式で親和性を測定した。第一に、ＥＬＩＳＡにおいて、抗原の系列希釈液に対してプローブされる一定量の抗体について結合シグナルを測定して、相対的なモジュレーター活性（シアノ結合についてのみデータを示す）を決定した。第二に、次いで、標準抗原濃度系列でのバイオ層干渉測定分析をＦｏｒｔｅＢＩＯ ＲＥＤ（ForteBIO 社）で使用して、選択したモジュレーターの
親和性及び運動定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を測定した。最後に、選択したモジュレーターの親和性を表面プラズモン共鳴法（Biacore System, GE Healthcare）によって測定し
た。標準抗原濃度系列に基づいて、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用して、抗原への抗体結合のＫｄと運動定数（ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）を決定した。全般に、選択したモジュレーターは、相対的に高い親和性をナノモル濃度範囲で明示した。
抗体ビニングに関しては、ＦｏｒｔｅＢＩＯを製造業者の説明書に従って使用して、同じ又は異なるビン（bins）へ結合する抗体を同定した。簡潔に言えば、抗体（Ａｂ１）を抗マウス捕捉チップ上に捕捉させてから、高濃度の非結合抗体を使用してそのチップをブロックして、ベースライン値を採取した。次いで、単量体の組換えエフリンＡ４−Ｈｉｓを特異抗体（Ａｂ１）に捕捉させて、そのチップを、対照としての同一抗体（Ａｂ１）のあるウェルか又は異なる抗体（Ａｂ２）のあるウェルのいずれかへ浸漬した。新しい抗体との追加の結合が観測されたならば、Ａｂ１とＡｂ２は、異なるビンにあるものと判定した。対照のＡｂ１と同様に、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ２は同じビンにあると判定された。この方法を拡張して、９６ウェルプレートにおいて独自のビンを表す完全列の抗体を使用して、独自抗体の大きなライブラリーについてスクリーニングすることができる。この実験は、スクリーニングされた抗体がＥＦＮＡ４タンパク質上の少なくとも３種の異なるビン又はエピトープへ結合することを示した。
エフリンＡ４モジュレーターによって認識されるエピトープが連続アミノ酸を含むのか、又は抗原の二次構造によって並列される不連続アミノ酸によって形成されるのかを決定するために、還元条件と非還元条件の下でウェスタンブロットを行った。より具体的には、当該技術分野で周知の標準の電気泳動技術を使用して、両方の状態のエフリンＡ４抗原を選択したモジュレーターへ曝露した。図面８Ａに示すように、ほとんどのエフリンＡ４
モジュレーターは、ジスルフィド結合がインタクトである（ＮＲ）抗原とのみ実質的に反応したが、２つのモジュレーターは、非還元抗原と還元抗原（ＮＲ／Ｒ）の両方と反応した。これらの抗体について、Ｐｅｐｓｐｏｔ（ＪＰＴ）膜を使用して、ペプチドによる抗体認識の限界を決定した。ＳＣ４．２２とＳＣ４．９１は、配列ＱＲＦＴＰＦＳＬＧＦＥ（配列番号１６４）とＲＬＬＲＧＤＡＶＶＥ（配列番号１６５）をそれぞれ認識することがわかった。対象のペプチドへ結合するこれらペプチドの能力のＥＬＩＳＡによる再試験により、これらの抗体が実際に上記エピトープに特異的であることを確かめた。
最後に、カニクイザルエフリンＡ４相同体に関する交差反応性について、組換え的に発現された単量体エフリンＡ４抗原での濃度系列を使用して、ＦｏｒｔｅＢＩＯにおいて評価した。図面８Ａに示すように、選択したモジュレーターは、この相同体と反応した。特に、きわめて似ているカニクイザルエフリンＡ４とはすべての抗体が交差反応したのに対し、マウスエフリンＡ４と交差反応性であったのは、ＳＣ４．５、ＳＣ４．１５、ＳＣ４．９１、及びＳＣ４．１０５である。表中のＮＤは、そのデータが「判断不能」であったことを示す。
８（ｂ）ヒト化モジュレーターの特性
本実施例において上記に説明した技術を使用して、ヒト化構築体のｓｈＳＣ４．１５、ｈＳＣ４．２２、及びｈＳＣ４．４７について分析して、それらの結合特性を決定した。さらに、ヒト化抗体の結合性を親マウスの抗体と直接比較して、両方の抗体について、ヒト化の方法によって生じた速度定数の微妙な変化を同定した。
より具体的には、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用するＢｉａｃｏｒｅによってマウスのＳＣ４．４７の親和性を測定して、図面８Ｂに示す結果を得た。２５、１２．５、及び６．２５ｎＭの濃度系列（図面８Ｂ及び８Ｃ中の最上部から最下部への曲線を作成する）に基づいて、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用して、抗原への抗体結合のＫｄが１．１ｎＭであると推定した。次いで、ヒト化構築体で行った同様の実験は、ヒト化の方法が親和性に悪影響を及ぼさなかったことを示唆する同様の結果を示した（図面８Ｃ）。この点に関して言えば、この測定は、ヒト化構築体が、親マウスの抗体と実質的に同一である、１ｘ１０−１０未満のＫｄを有することを示した。
本実施例において説明した他の技術と共に、これらの測定は、実施例７からのすべてのヒト化エフリンＡ４エフェクターが望ましい特質を保有することを示した。図面８Ｄに示すように、ＳＣ４．１５は、マウスのエフリンＡ４相同体と強く交差反応して、それによって毒性試験を促進した。すべての抗体のカニクイザル抗原へ反応性は、ＥＬＩＳＡによってはヒトＥＦＮＡから識別し得なかったので、非常に類似していることが予測される。
実施例９
エフリンＡリガンドモジュレーターは、細胞表面結合を証明する
上記に説明したようにｈＥＦＮＡ４−Ｆｃに対して産生した抗体を産生するハイブリドーマからの上清について、フローサイトメトリーアッセイで測定するように、細胞表面結合をスクリーニングした。この抗体の結合特性を証明するために、２種の細胞株、ＪｕｒｋａｔＥ６細胞とＺ１３８細胞（このいずれも、高レベルの表面エフリンＡ４を発現することが知られている）を利用した。より具体的には、細胞標識色素のＣＦＳＥ（簡易同定用）で染色した６００万個のＪｕｒｋａｔ Ｅ６細胞と４００万個の非標識化Ｚ１３８細胞を２０μｇ／ｍｌのＦｃブロッキング試薬（Trueblock，Biolegend 社）とともにイン
キュベートして混合して、１００万個の細胞／ｍＬの最終濃度とした。この細胞混合物の５０μＬを各ウェル中５０μＬの抗体含有上清へ加えて、４℃で６０分間インキュベートした。この細胞を、２％ ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で１回洗浄してから、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９へコンジュ
ゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research）のＦｃ
領域特異的Ｆ（ａｂ）２断片で、暗所において４℃で６０分間染色した。細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄して、２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩで対比染色した。陰性対照試料は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ抗体（１０μｇ／ｍｌ，Biolegend 社）と、マウスＩｇＧを分泌しないことが知られているハイブリドーマ（Ｈ１３．２）由来の上清であった。ＥＦＮＡ４特異的であることがＥＬＩＳＡによってすでに同定された、１０μｇ／ｍｌの精製抗体（Ｅ７６．２としても知られるＳＣ４．７６．２）（図面９の左側）を使用して、陽性対照試料を調製した。標準条件下に、そしてＨＴＳ付属装置を使用して、試料をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）で採取した。１１４個のクローンのうち８４個のクローンが、両方の細胞株を陰性対照試料より高く有意に染色することによるフローサイトメトリーによって実証されるような有意な細胞表面結合を示すと判定された。この点に関して、図面９は、５０の例示ハイブリドーマ上清の相対的な結合能力を示す。
実施例１０
選択したＥＦＮＡ４モジュレーターは、エフリンＡ４リガンド結合を中和する
ＥＮＦＡ４発現細胞へ結合することが知られた抗体を産生するハイブリドーマ由来の上清（実施例９）について、ＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞の表面にあるその受容体（ＥｐｈＡ）へ結合する可溶性ｈＥＦＮＡ４−Ｆｃの結合をブロックするその能力を試験した。初めに、図面１０Ａに見られるように、ＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞は、陰性対照抗体と比較するときに、ＥＦＮＡ４−Ｆｃへ用量依存的な様式で結合することが示される。この結合の中和を証明するために、６０μｌの抗ＥＦＮＡ４ハイブリドーマ上清を、洗浄緩衝液に希釈した２００ｎｇ／ｍｌ ｈＥＦＮＡ４−Ｆｃとともに４℃で２時間インキュベートした。次いで、この混合物を５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞へ加えて、４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液に１回洗浄してから、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９へコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research）で、暗所
において４℃で４５分間染色した。次いで、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄して、２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで対比染色した。陰性対照試料は、非染色細胞、非ＩｇＧ産生ハイブリドーマ（Ｈ１３．２）由来上清で染色した細胞、及びヒトＩｇＧＦｃγ１断片で染色した細胞であった。陽性対照試料は、ハイブリドーマ上清の非存在下でのｈＥＦＮＡ４−Ｆｃ染色細胞と、非ＩｇＧ産生ハイブリドーマ上清の存在下でのｈＥＦＮＡ４−Ｆｃ染色試料であった（図面１０Ｂの左側）。先に考察したように、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで試料を測定した。図面１０Ｂによって裏付けられるように、フローサイトメトリーを使用して測定するとき、試験した８３個のうち６２個のクローンがｈＥＦＮＡ４−Ｆｃのその細胞表面受容体への結合を中和するいくらかの能力を証明した。
実施例１１
ＥＦＮＡモジュレーターは、細胞表面ＥＦＮＡ結合を濃度依存的な様式でブロックする
ＥＦＮＡ活性を中和する、本発明のエフリンＡリガンドモジュレーターの能力をさらに測定するために、選択したハイブリドーマ由来の抗ＥＦＮＡ４抗体を精製して、ＰＢＳ緩衝液中の無菌試薬として使用した。初めに、ヒト及びマウスのＥＦＮＡ４−Ｆｃ（組換えマウスエフリンＡ４Ｆｃキメラ、CF R＆D Systems）単独の全用量応答曲線を同時に設定
して、ＥＦＮＡ４−ＦｃのＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞への用量制限的な結合を証明した（図面１１Ａ）。この対照を確定したならば、３種の例示ハイブリドーマ（即ち、ＳＣ４．１５．３、ＳＣ４．４７．３、及びＳＣ４．７６．２）より入手した抗ＥＦＮＡ４抗体の系列希釈液を、洗浄緩衝液中のこの限界濃度（０．１μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌ）のｈＥＦＮＡ４−Ｆｃ及びｍＥＦＮＡ４−Ｆｃのそれぞれと４℃で１時間インキュベートした。次いで、得られた試薬混合物を５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞へ移して、４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液に１回洗浄してから、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９へコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research）のＦｃ領域特異的Ｆ（ａｂ）２断片で、暗所において４℃で４５分間染色した。
細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄して、２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩで対比染色した。陰性対照試料は、非染色と、ヒトＩｇＧＦｃγ１断片で染色した細胞であった。上記ですでに述べたように、試料をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで採取した。図面１１Ｂは、ヒト及びマウスのＥＦＮＡ４−Ｆｃの細胞への結合を相対的に高い濃度で一部阻害する、ｍＡｂ ＳＣ４．１５．３の活性を示す。図面１１Ｃは、細胞へ結合するｈＥＦＮＡ４−Ｆｃの能力をほぼ完全にブロックするが、ｍＥＦＮＡ４−Ｆｃの能力はブロックしない、ｍＡｂ ＳＣ４．４７．３の活性を例証する。同様に、図面１１Ｄは、細胞へ結合するｈＥＦＮＡ４−Ｆｃの能力を実質的に阻害する一方で、その細胞へ結合するｍＥＦＮＡ４−Ｆｃの能力に劇的に影響を及ぼさない、エフリンＡリガンドモジュレーターのｍＡｂ ＳＣ４．７６．２の能力を証明する。これらの結果は、エフリンＡリガンドの細胞表面受容体への結合を阻害することにより、付随した腫瘍形成活性を阻害する、本発明の選択したモジュレーターの能力を強く示唆する。
実施例１２
ＥＦＮＡモジュレーターは、ＥＦＮＡのＥｐｈＡ受容体への結合を濃度依存的な様式でブロックする
上記に考察したように、ＥｐｈＡ２は、ＥＦＮＡ４について知られた結合相手である。この既知の関係を利用するために、標準的な技術を使用してＥｐｈＡ２の細胞外ドメインをヒトＩｇＧのＦｃ部分へ融合させ、ＨＥＫ２９３Ｔｄ細胞において一過的に発現させて、培養物の上清より、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。図面１２Ａに見られるように、ＥｐｈＡ２−Ｆｃホモ二量体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＥＦＮＡを発現することが知られている）へ用量依存的な形式で結合するが、ヒトＩｇＧのＦｃ部分単独では、結合を全く示さない。このＥｐｈＡ２−ＦｃのＪｕｒｋａｔ細胞への結合は、本発明のエフリンＡモジュレーターを使用して、そして特に、エフリンＡ４に対するモノクローナル抗体の使用を介して阻害することができる。このために、ウェルあたり５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を、洗浄緩衝液中１０μｇ／ｍｌの４種の選択した抗ＥＮＦＡ４抗体（即ち、ＳＣ４．２２、ＳＣ４．３１．３、ＳＣ４．４７．３、及びＳＣ４．７３、いずれも上記に記載のように調製した）とともに４℃で１時間インキュベートした。マウスＩｇＧと無抗体（データ示さず）を陰性対照として役立てる。洗浄後、洗浄緩衝液中のこの細胞へＥｐｈＡ２−Ｆｃの系列希釈液を４℃で１時間加えて、図面１２Ｂにグラフ表示される結果を得た。図面１２Ｂの検討により、モジュレーターのＳＣ４．３１．３とＳＣ４．４７．３がＥｐｈＡ２−ＦｃのＥＦＮＡ４への結合を実質的に阻害するのに対し、モジュレーターのＳＣ４．２２とＳＣ４．７３は、相対的により少ない阻害を示すことが示される。この受容体との相互作用を阻害する開示モジュレーターの能力をさらに例証するために、最初にＪｕｒｋａｔ細胞を抗体の系列希釈液とともにインキュベートして、１０μｇ／ｍｌ ＥｐｈＡ２−Ｆｃとのインキュベーションを続けた。次いで、この細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩで対比染色して、ＨＴＳ付属装置を使用する標準条件下にＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）で分析して、図面１２Ｃに表示するデータを得た。図面１２Ｂと同様に、図面１２Ｃは、モジュレーターのｍＡｂ ＳＣ４．４７．３が相対的に強力な阻害剤であって、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現されるＥＦＮＡ４へのＥｐｈＡ２−Ｆｃの結合を効率的にブロックすることを証明する。比較すると、他のモジュレーターは、やや小さい活性を示して、ＳＣ４．３１．３は、中等度の阻害をより高い濃度でもたらす。
上記の知見を拡張するために、追加のＥＦＮＡ４モジュレーターとＥｐｈＡ受容体の間の相互作用を探究した。レトロウイルス形質導入の手段によりＥＦＮＡ４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞として言及される）（図面１２Ｄ）又はレトロウイルス形質導入の手段によりＥＦＮＡ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１２Ｅ）を使用すること以外は、上記に記載の実験と同様の実験を行った。加えて、このアッセイは、単一のＥｐｈＡｘ−Ｆｃ濃度（１０μｇ／ｍｌ）で行った。この
データは、ＳＣ４．２、ＳＣ４．３１、及びＳＣ４．４７が、試験したすべてのＥｐｈＡ受容体結合相手のエフリンＡ４リガンド（即ち、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、及びＥｐｈＡ１０）への結合をブロックすることができることを示す。加えて、ＥＦＮＡ１に対する免疫化活動（campaign）（実施例６による）において作製したＥＦＮＡ４モジュレーターのＳＣ９．６５が、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、及びＥｐｈＡ７のエフリンＡ１リガンドへの結合に干渉する能力を有することが確認された。これらのデータは、本明細書の他の実施例の結果と組み合わせると、様々な受容体の結合に拮抗するこのモジュレーターの能力には、本発明の観測された治療効果をもたらすのに意義深い可能性があることを示唆する。
実施例１３
ヒトエフリンＡに対するモジュレーターは、マウス相同分子種と交差反応する
ヒト及びマウスのエフリンＡ４リガンドの細胞外ドメインがタンパク質レベルで８０％の配列同一性を共有するという事実に照らして、ヒトＥＦＮＡ４に対する開示モジュレーターについて、それらがマウス相同体と会合するかどうかを見るために試験した。より具体的には、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＥＦＮＡ４特異的モノクローナル抗体のそのマウス相同体との交差反応性のレベルを定量した。高タンパク質結合性９６ウェルアッセイプレートをＩｇＧ分子のＦｃ部分に特異的なロバ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体の０．５μｇ／ｍｌで被覆した。このプレートのタンパク質コーティングは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を１６時間のインキュベーションの間に４℃で使用して、ウェルあたり１００μｌの容量で行った。ヒトＩｇＧ分子のＦｃγ１部分へ融合したヒト及びマウスのＥＦＮＡ４分子（ＥＦＮＡ４−Ｆｃ）を２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳＡ）で系列希釈した。この被覆プレートを０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳＴ）中で洗浄後、ＰＢＳＡで希釈されたマウス及びヒトＥＦＮＡ４−Ｆｃの１００μｌ／ウェルを３時間の間周囲温度でウェルへ加えた。次いで、このプレートをＰＢＳＴで再び洗浄して、このプレートへ１０％使用済ハイブリドーマ上清含有ＰＢＳＡ又は１μｇ／ｍｌの精製モノクローナル抗体（陽性対照として）の１００μｌ／ウェルを周囲温度で１時間の間に加えた。このプレートをＰＢＳＴで洗浄後、マウスＩｇＧのＦｃ部分に特異的で、西洋ワサビペルオキシダーゼへコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research）の５００
０倍希釈液を含有する１００μｌ／ウェルのＰＢＳＡをこのプレートへ周囲温度で３０分間加えた。このプレートをＰＢＳＴで十分に洗浄した後で、このウェルへウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質（Thermo Fisher）を１５分間加えた。１００μｌ／ウェルの２Ｍ
硫酸を添加することによって、この酵素反応を止めた。この比色分析法の吸光度は、Victor プレートリーダー（パーキンエルマー）を使用して、４５０ｎｍで測定した。データ
は、２つの反復値を使用して、吸光度読取り値の平均＋標準偏差として提示する。図面１３Ａは、ｈＥＦＮＡ４を認識するがｍＥＦＮＡ４は認識しない、例示のモノクローナル抗体ＳＣ４．３１．３を示す。逆に、図面１３Ｂは、ヒトとマウスの両方のＥＦＮＡ４を認識する、例示のモノクローナル抗体ＳＣ４．９１．４の結合を示す。
上記の結果を確実にするために、ヒト化エフリンＡ４モジュレーター、ｈＳＣ４．１５を使用するアッセイを行った。より具体的には、用量設定された量のヒト及びマウスのエフリンＡ４−Ｈｉｓを高タンパク質結合性９６ウェルプレートにＰＢＳ中４℃で１６時間被覆した。このプレートをＰＢＳＡにおいて周囲温度で２時間ブロックした後で、ＰＢＳＡ中０．５μｇ／ｍｌのｈＳＣ４．１５モジュレーターを２時間加えた。ＥＬＩＳＡは、西洋ワサビペルオキシダーゼへコンジュゲートしたロバ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research）を使用して、上記に記載のように展開した。図面１３Ｃは
、ｈＳＣ４．１５モジュレーターがヒトとマウスの両方のエフリンＡ４リガンドを十分に等しく認識することを示し、開示されたヒト化モジュレーターが本明細書の教示と完全に適合可能であることを示唆する。
実施例１４
例示の腫瘍試料、腫瘍細胞亜集団、及び造血系細胞におけるエフリンＡリガンドの発現
先の実施例において、上昇した遺伝子発現レベルを報告してＥＦＮＡ４に対する抗体を作製した後で、選択した細胞集団における対応するＥＦＮＡ４タンパク質の発現についての証拠を探求した。この点に関して言えば、１１の腫瘍型からの４３２の組織溶解物、又はそのそれぞれの正常隣接組織の４つの希釈液を含んでなる逆相癌タンパク質溶解物アレイ（ProteoScan Arrays；OriGene Technologies）を、外因性プロモーターによって推進
されるＴＰ５３過剰発現の有り無しのＨＥＫ２９３細胞からなる対照と共に提供した。ＥＦＮＡ４タンパク質を認識する本発明のマウスモノクローナルＥＦＮＡ４抗体（例えば、ＳＣ４．４７．３としても知られるクローンＥ４７．３）を使用して、ウェスタンブロットによって、このアレイ上の溶解物中のＥＦＮＡ４タンパク質発現を検出した。比色検出試薬とプロトコールは、ProteoScan Arrays の製造業者によって提供されて、製作したアレイ上のスポットは、BZScan2 Java（登録商標） Software（INSERM-TAGC）を使用する平底型スキャナーを使用してデジタル画像へ変換して、スポット強度を定量した。
このようなアッセイの選択した結果を図面１４に示し、その結果は、ＥＦＮＡ４タンパク質の発現が結直腸腫瘍試料において上方調節されていることを示す。より具体的には、図面１４Ａは、ＥＦＮＡ４タンパク質発現が結直腸腫瘍標本の亜集合において有意に上昇しているようである（特に、ステージＩＶ疾患の患者において、正常隣接組織、又はより初期の疾患より入手した標本由来の腫瘍組織と比較した場合）ことを示す。上記の記載のようにデータを作成して、スポットあたりの平均ピクセル強度（スポット強度）として表した。各試料中の水平の黒いバーは、それぞれのカテゴリーの標本についての平均を表す。
ある種の結直腸腫瘍の全細胞溶解物においてＥＦＮＡ４タンパク質が上方調節されていることを確かめた後で、腫瘍始原細胞でも同じ標的が発現されていることを確定するための試験を実施した。より具体的には、ＥＦＮＡ４タンパク質の発現が腫瘍始原細胞の細胞表面でも検出され得るかどうかを決定するために、フローサイトメトリー分析用に腫瘍を上記に記載のように解離させた。腫瘍試料（例、実施例２の結直腸細胞株ＣＲ３３）を単一細胞懸濁液へ解離させた後で、それらを３７℃で２４時間インキュベートして、抗原の再発現（コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼに対するＥＦＮＡ４抗原の酵素感受性による）を促進してから、ＥＦＮＡ４を認識することができるフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート化モノクローナル抗体で染色した。次いで、この細胞を、ＨＴＳ付属装置を使用する標準条件下にＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）で、先の実施例のように分析した。そのような実験を実施しているときに、ＥＦＮＡ４発現がＴＩＣ細胞亜集団（ＴＩＣ明示細胞表面マーカー（例、４６＋、３２４＋、６６−）を認識する抗体での細胞の同時染色によって明確化される）上で、ＮＴＧ細胞上より顕著に高いことが観測された。ＳＣＲｘ−ＣＲ３３結直腸ＮＴＸ腫瘍細胞とＥＦＮＡ４モジュレーターのＳＣ４．４７．３を使用する実験からの代表的な結果は、ＥＦＮＡ４の発現がＴＩＣ上でＮＴＧ細胞上より２倍より多く高かったことを示す（図面１４Ｂ）。
ＥＦＮＡ４がＴＩＣ細胞上で相対的に高く発現されていることをさらに確かめるために、ＬＵ８６細胞とＬＵ６４細胞を in vitro で１０日間培養して、本明細書において説明したようなＰＥコンジュゲート化ＳＣ４．４７抗体を使用するフローサイトメトリーによって発現を測定した。生じるコロニーを採取して、上記に記載のように染色した。図面１４Ｄに例証されるように、ＬＵ８６細胞のＴＩＣ集団（黒色の実線）は、ＥＦＮＡ４をアイソタイプ対照（陰付きの灰色）や同じ腫瘍系由来のＮＴＧ集団（黒色の破線）より十分高く発現する。追加的に言えば、in vivo 培養されたＬＵ８６細胞は、ＥＦＮＡ４抗体で殺傷することができる（下記の実施例１６に示すように）。逆に、ＬＵ６４細胞は、上昇
レベルのＥＦＮＡ４を発現することが見出せず（図面１４Ｄ）、後に抗ＥＦＮＡ抗体で殺傷されなかった。
本開示より前には、固形腫瘍の標本においてＥＦＮＡ４タンパク質発現が関連付けられたことはないと考えられるが、このタンパク質は、Ｂ細胞上では相対的に低いレベルで発現されて、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者由来のＢ細胞では上昇していることが報告されている。正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でのＥＦＮＡ４タンパク質の発現を確かめるために、本実施例において先に記載したようなアッセイを行って、図面１４Ｃに示すデータを得た。図面１４Ｃに提示されるプロットの検討は、正常ドナー由来のＰＢＭＣでＥＦＮＡ４発現について測定したとき、ＣＤ１９＋Ｂ細胞だけが弱陽性であることを示し、ＥＦＮＡ４が発現される場所に関する文献の報告が確認された。
上記のデータは、ＥＦＮＡ４の過剰発現が結直腸癌中のＴＩＣ及び／又はＴＰＣに関連していて、増殖及び／又は生存に関与している可能性があるという上記実施例での観測事実を裏付ける。さらにこのデータは、ＥＦＮＡ４が大多数の正常ＰＢＭＣ上では発現されないことと、正常Ｂ細胞上での発現が最小であることを示す。ａ）ＥＦＮＡ４遺伝子発現が結直腸癌中のＴＰＣ細胞亜集団と膵臓腫瘍中の腫瘍形成細胞亜集団に関連していること；ｂ）そのＥＦＮＡ４タンパク質発現がＴＩＣ細胞亜集団上でより高いこと；ｃ）ＥＦＮＡ４タンパク質発現が後期結直腸癌由来の腫瘍標本全体で上昇していること；及びｄ）ＴＩＣがより頻繁であるのは後期腫瘍においてであること、という全般的な観測事実を示す上述の実施例に照らせば、ＥＦＮＡ４は、腫瘍増殖、療法への抵抗性、及び腫瘍再発の根底にあるそれらの細胞に関連しているように見えて、上記に言及した腫瘍のＴＰＣ及び／又はＴＩＣを支援するのにＥＦＮＡ４が不可欠な役割を担う可能性があるとする仮説を支持するものである。
実施例１５
エフリンＡリガンドモジュレーターは、Ｋ５６２細胞によって内在化される
先の実施例において確定されたエフリンＡリガンドの発現プロフィールを前提として、本発明のモジュレーターが細胞表面抗原への結合時に内在化されるかどうかを見るためのアッセイを実施した。この点に関して言えば、実施例においてＥＦＮＡ４−Ｆｃに対して産生した抗体を産生するハイブリドーマ由来の上清について、（ＥＦＮＡ４を細胞表面上で低いレベルで発現する）Ｋ５６２細胞に内在化されるその能力をスクリーニングした。１０６個／ｍｌ（単一細胞懸濁液）の出発濃度でのＫ５６２細胞を Human TruStain（BioLegend 社）で、室温で１０分間ブロックしてから、ウェルあたり５ｘ１０４個の細胞へ
希釈した。次いで、同一２検体の試料を、最終容量５０μｌの抗ＥＦＮＡ抗体含有上清で、氷上にて３０分間染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％胎仔ウシ血清／ハンクス緩衝化生理食塩水溶液／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］）で洗浄して、非結合抗体を除去した。これに、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（Life Technologies）での氷上で３０分間の第二染色を続けた。試料を再び洗浄して未結合抗体を除去して
から、内在化培地（２％胎仔ウシ血清／イスコブ（Iscove's）改良ダルベッコ培地）に再懸濁させた。内在化を可能にするために、試料を５％ ＣＯ２において３７℃で（又は、対照では４℃で）１時間インキュベートした。試料を氷へ移して過剰の氷冷ＦＳＭを加えることによって、内在化を停止させた。内在化せずに細胞表面に残ったあらゆる抗体を除去するために、試料を低ｐＨのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ［ｐＨ２．０］）で、氷上で１０分間処理した。この「酸ストリップ」手順に続いて、試料をＦＳＭで十分洗浄し、２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有する１５０μｌのＦＳＭに再懸濁させて、フローサイトメトリー（ＨＴＳ付属装置を使用する標準条件下にＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）を再び使用する）によって分析した。バックグラウンドを超えて検出されたどのシグナルも、抗体内在化［酸ストリップ法の間に蛍光コンジュゲートを細胞表面からの除去から護るプロセス］より生じるものである。すべてのインキュベーションは、他に述
べない限り、ＦＳＭにおいて実施した。
上記に記載の酸ストリッププロトコールを使用する、１５９ＥＦＮＡ４抗体含有ハイブリドーマ上清クローンのスクリーニングは、多くの上清が（ＩｇＧ陰性対照抗体に対して）蛍光のポジティブシフトを表示することを示した（データ示さず）。例えば、例示のＳＣ４．５、ＳＣ４．２２、及びＳＣ４．７３クローンは、これらクローン由来の上清がＡｌｅｘａ６４７二次抗体を内在化してこれを酸ストリッピングの間に護ることができる限りにおいて、内在化を証明した（図面１５Ａ）。ＩｇＧ対照と比較すると、ＥＦＮＡ４抗体含有上清のほぼ１５％が内在化を様々な度合いで引き起こして、上位１９検体では、デルタ平均蛍光強度（４℃に対して３７℃でのＭＦＩ）を１５０より高く示した（図面１５Ｂ）。このデータは、ヒトＥＦＮＡ４ ＥＣＤに対して産生したモジュレーターの亜集合が細胞上に提示されるままの抗原へ結合して内在化することができることを証明した。このような結果は、本発明のモジュレーターの標的としてのエフリンＡリガンドの潜在的な治療価値を細胞傷害性ペイロードが有っても無くても強調するものである。
選択した精製ＥＦＮＡ４モジュレーターを１０μｇ／ｍｌの濃度で使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１５Ｃ）とＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１５Ｄ）を標的細胞として使用して、このアッセイを繰り返した。親のＨＥＫ２９３Ｔは、その細胞表面に低いレベルのエフリンＡ４リガンドを発現する。上記に記載のプロトコールに従うと、データは、試験したすべてのエフリンＡ４モジュレーターが、細胞の表面で発現されるエフリンＡ４リガンドへの結合時に内在化されることを証明する。それぞれの試料について記録した蛍光強度（ＭＦＩ）を、８種の異なる既知量の被包化フルオロフォアを含有する標準ビーズ（Becton Dickenson Spherotech ８色虹ビーズ）に対して比較した（データ示さず）。これにより、ＭＦＩ値の線形値への変換と細胞あたりの相対的な受容体数の計算が可能になった。
実施例１６
標的化部分としてのＥＦＮＡ４モジュレーター
抗体へ安定的に連結した細胞傷害薬の標的化は、固形腫瘍のある患者へ大きな治療利益を与える可能性がある、強化された抗体アプローチを代表する。上記に記載のＥＦＮＡ４特異抗体が細胞傷害剤の生細胞への送達に媒介することができるかどうかを判定するために、リボソーム不活性化タンパク質、サポリン（Advanced Targeting Systems）へコンジュゲートしたストレプトアビジンをビオチニル化ＥＦＮＡ４抗体へ結合させる in vitro 細胞殺傷アッセイを実施して、これらのサポリン複合体が内在化して細胞を殺傷する能力を、細胞生存度を測定することによって７２時間後に測定した。
具体的には、ウェルあたり１０５個のＺ１３８細胞を９６ウェルプレートのウェルに播いた。上記に記載の抗ＥＦＮＡ４抗体を上清より精製し、ビオチニル化してから、２０μｇ／ｍＬへ希釈した。Ｚ１３８細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−３００１）は、マントル細胞リンパ腫の患者より導かれて、適度な量のＥＦＮＡ４を発現する。それぞれの抗体のアリコートをストレプトアビジンＺＡＰ（Advanced Targeting Systems）とそれぞれ１：１で混合し、５秒間激しく振り混ぜてから、室温で１時間インキュベートした。次いで、抗体−サポリン複合体の２つの更なる１０倍系列希釈液を作製してそれぞれ５０μＬの各混合物として、Ｚ１３８細胞含有ウェルへ加えた。次いで、この細胞／抗体−サポリン混合物を３７℃／５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞を丸底９６ウェルプレートにおいてスピンダウンさせ、上清を除去して、１００μＬの新鮮な培養基を各ウェルへ加えた。次いで、この細胞をさらに７２時間インキュベートしてから、CellTiter-Glo（プロメガ社）を製造業者のプロトコールに従って使用し
て、生存細胞数を計数した。
このプロトコールを使用すると、ビオチニル化したアイソタイプ対照抗体が細胞を殺傷することができないのに対し、先の実施例に記載されたように内在化することができるいくつかの抗体は、in vitro での細胞殺傷に媒介することもできた（データ示さず）。即
ち、これら内在化モジュレーターのいくつかは、細胞死をもたらすサポリン毒素内在化を媒介することができた。図面１６Ａは、例示の内在化モジュレーターＳＣ４．５．３の細胞殺傷能力を例証するが、ここでは、この曲線の下方の傾きが対照と比較される濃度依存的な様式での細胞死を表す。これらのデータは、エフリンＡリガンドを発現する腫瘍形成細胞における細胞傷害性ペイロードの選択的内在化のためのベクターとして作用する場合の開示モジュレーターの有効性を明らかに証明する。
これらの結果を確証して、ＥＦＮＡ４エフェクターが毒素内在化と原発性ヒト腫瘍細胞の細胞殺傷に媒介し得るのかどうかを判定するために、マウスの系統枯渇（lineage-depleted）ＮＴＸ細胞（即ち、免疫不全マウス中の低継代異種移植片として増殖させたヒト腫瘍細胞）をプレート培養して、その後抗ＥＦＮＡ４抗体とＦａｂ−ＺＡＰへ曝露した。
具体的には、肺及び皮膚の腫瘍標本を代表するＮＴＸ腫瘍を単一細胞懸濁液へ解離させて、当該技術分野で公知であるような増殖因子補充無血清培地において、ＢＤ ＰｒｉｍａｒｉａＴＭプレート（BD Biosciences）に播いた。３７℃／５％ ＣＯ２／５％ Ｏ２で３〜５日の培養後、細胞を対照（ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｂ）又はマウスのＥＦＮＡ４モジュレーター（１ｎＭでのＳＣ４．５、ＳＣ４．２２、ＳＣ４．４７、又はＳＣ４．９１）、及びＦａｂ−ＺＡＰ（４０ｎＭで）と接触させた。次いで、モジュレーター媒介性サポリン細胞傷害性について、CellTiter Glo を５〜７日後に使用して残存細胞数を定量することによって評価した。図面１６Ｂに見られるように、Ｇ２ｂ及びＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体が処理後の生細胞の数に影響を及ぼさなかったのに対し、ＥＦＮＡ４抗体への曝露は、ＬＵ８６細胞数の低下をもたらした。図面１６Ｃでは、アイソタイプ対照とＳＣ４．２２が無効であったのに対し、ＳＣ４．５、ＳＣ４．４７、ＳＣ４．９１抗体への曝露は、ＳＫ１９細胞数の低下をもたらした。このデータは、本明細書に記載の例示抗体がＥＦＮＡ４に特異的で、その細胞表面上のＥＦＮＡ４抗原へ結合して細胞傷害性ペイロードの送達を促進して細胞死をもたらすことを証明するだけでなく、上記データは、多数の抗ＥＦＮＡ４抗体が多数のＮＴＸ腫瘍細胞の殺傷を媒介し得ることも証明した。
上述した殺傷アッセイの変法において、ＥＦＮＡモジュレーターを介した細胞傷害性ペイロードの送達を、追加の抗体について、そして追加の細胞において証明した。以下の細胞種の２０００個の細胞／ウェルを抗体と毒素の添加の１日前に９６ウェル組織培養プレート中のそれぞれの培地へ播いた：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）。その培養物へ様々な濃度での精製（「裸の」）マウスモノクローナル抗体と、サポリン（Advanced Targeting Systems，＃ＩＴ−４８）へ共有結合した一定濃度（１０ｎＭ）の抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ断片を７２時間加えた。生存細胞数を上記に記載のように計数した。サポリン−Ｆａｂ断片とともに細胞を含有する培養物を使用する未処理（raw）発光カウントを１００％基準値として設定して、他のすべ
てのカウントをそれに従って計算した（「正規化ＲＬＵ」として言及する）。
このアッセイを使用して、我々は、アイソタイプ対照抗体以外の試験したすべてのＥＦＮＡ抗体が標的細胞を殺傷し得ることを証明することができる。さらにこのアッセイは、内在化が生じるのは、ＥＦＮＡ４抗体の細胞表面への結合の故のみであって、追加の架橋形成の必要はないことを証明する。最後に、このデータは、その表面で十分な数のＥＦＮＡを発現する細胞だけがＥＦＮＡモジュレーターによって殺傷されることを証明する。親のＨＥＫ２９３Ｔ細胞がその細胞表面に少数のＥＦＮＡを発現するのに対し、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞は、このリガンドを強く発現する（先の実施例からの図面１５Ｃ及び１５Ｄを参照のこと）。下記の表５は、試験したすべての抗体／標的細胞の組合せに
ついての５０％有効濃度（通常「ＥＣ５０」と呼ばれる）を収載する。上述の細胞株に加えて、ヒト腺癌由来の細胞株であるＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）を標的細胞として使用した。
in vitro 殺傷アッセイの別の変法では、ヒト化ＥＦＮＡモジュレーターについて、細
胞傷害性ペイロードを内在化して送達するその能力を試験した。このアッセイは、わずか５００個の細胞／ウェルをプレート培養して、サポリン（Advanced Targeting Systems, ＃ＩＴ−５１）へ共有結合した抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ断片をこの培養物へ加えること以外は、上記に記載の通りに行った。図面１６Ｅは、実施例７に記載のヒト化（図面１６Ｅ中のＨｚ）ＥＦＮＡモジュレーターが、標的細胞の表面上で発現されるエフリンＡ４リガンドへ結合して、結合した抗体と細胞傷害性ペイロードと一緒にＥＦＮＡの内在化を引き起こすことができることを例証する。
in vitro 殺傷アッセイのなお別の変法では、マウスＥＦＮＡとヒトＥＦＮＡへ等しく
十分に結合することが示されたヒト化ＥＦＮＡモジュレーター、ｈＳＣ４．１５（図面１３Ｃを参照のこと）について、ヒト又はマウスのＥＦＮＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に内在化して細胞傷害性ペイロードを送達するその能力を試験した。直接的な比較可能性を確実にするために、レンチウイルスで形質導入した細胞をｈＳＣ４．１５で染色して、ヒト又はマウスのいずれかのエフリンＡ４の適度な発現についてのＦＡＣＳによって選別した（データ示さず）。殺傷アッセイは、上記の記載通りに行った。図面１６Ｆは、マウス又はヒトのＥＦＮＡを等しく十分に発現する細胞をヒト化ＳＣ４．１５モジュレーターが殺傷することを例証する。
実施例１７
ＥＦＮＡモジュレーターは、分泌されたエフリンＡリガンドを検出する
上記でやや詳しく考察したように、ＥＦＮＡ４は、細胞膜と会合したＧＰＩ連結分子として、又は分泌された末端切断（truncated）リガンド若しくはアイソフォームとして存
在することができる。これらの分泌された化合物の、体液又は細胞培養基のような生体材料中の検出は、診断目的に、又は患者管理における補助手段として有用であり得る（バイオマーカーとしての有用性）。例えば、その分泌されたＥＦＮＡ４は、Ｂ細胞慢性リンパ
球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）患者において濃度が上昇して見られる場合があることが示唆されてきた（Alonso-C LM et al., 2009, Leukemia Research 33: 395-406）。本発明のそ
のような好ましい側面を証明するために、精製ＥＦＮＡ４の非重複エピトープを認識する開示モジュレーターを使用して、選択した腫瘍形成性の試料に分泌されたＥＦＮＡリガンドを概して検出して定量した。本発明のこの後者の特徴に関して、ＥＦＮＡモジュレーターを使用して、ヒト血清（データ示さず）とＢ−ＣＬＬ患者より入手したヒト血漿、及びヒト腫瘍異種移植体（例、上記の実施例１に記載のような）を担うマウスの血清からの分泌エフリンＡリガンドを検出して定量した。いずれの場合も、このモジュレーターは、すぐ下記に記載のようなリガンドレベルを有効に測定することができた。
可溶性ヒトＥＦＮＡ４を検出するために、抗体ＳＣ４．９１を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌで高タンパク質結合マイクロタイタープレート（Greiner BioOne Microlon プレート）へ４℃で一晩のインキュベーションの間に吸着させた。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ）中でこのプレートを洗浄後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＰＢＳＡ）においてこのプレートを周囲温度で２時間ブロックした。ＣＨＯ−Ｓ細胞中で一過的に発現されて、ニッケル（Nickel）ＮＴＡ樹脂とゲル濾過を連続的に使用して精製した、精製エフリンＡ４−ＨｉｓをＰＢＳＡに系列希釈して、このプレートへ２時間加えた。ＰＢＳＴで洗浄後、このプレートへビオチニル化抗体のＳＣ４．４７をＰＢＳＡ中１μｇ／ｍｌで１時間加えた。次いで、このプレートをＰＢＳＴで洗浄してから、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（例、Jackson Immuno Research）をＰＢＳＡ中５０００倍希釈液で３０分間加えた。次いで、この処理済のプレートを
ＰＢＳＴにおいて再び洗浄して、ＴＭＢ基質溶液（例、Thermo Fisher）を３０分間加え
た。等量の２Ｍ硫酸を加えることによってこの発色反応を止めた後で、４５０ｎｍの吸光度読取りを標準プレートリーダーで使用して、このプレートを読み取った。この実験の結果を図面１７Ａ〜Ｃに示す。
すぐ上記に記載の技術を使用して、可溶性エフリンＡ４−Ｈｉｓの濃度を吸光度値に対してプロットして、図面１７Ａに示す曲線を得た。より具体的には、この増幅曲線は、０〜４０ｐｇ／ｍｌの可溶性ＥＦＮＡ４濃度での吸光度測定値の結果を示し、一方、差し込み図は、０〜１，０００ｐｇ／ｍｌの濃度での同じ曲線を示す。当業者は、図面１７Ａに示す標準曲線を使用して、生体試料中のＥＦＮＡ４濃度の測定のためにきわめて高感度のアッセイを提供することができることを理解されよう。
上述の測定値を利用して、そして非線形回帰（Prism 5，Graphpad Software）を使用して、未知試料中のエフリンＡ４の濃度を計算した。この点に関しては、４名の健常成人、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）と診断された４名の患者、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断された４名の患者の血漿試料について、その分泌されたエフリンＡ４の濃度を分析した。得られたデータは、ｈＥＦＮＡ４分析物がＣＬＬ患者において、健常成人や他の選択したＢ細胞由来腫瘍におけるより有意に高い可能性があることを示唆する（図面１７Ｂ）。さらに、すでに示唆して、図面１７Ｃに示されるように、分泌されるｈＥＮＦＡ４は、ヒト結直腸癌異種移植体を収容するマウスにおいても検出可能である。具体的には、図面１７Ｃにおいて、各点は、異なるマウスより入手した血清中の分泌ｈＥＦＮＡ４レベルを表している。逆に、非異種移植マウス中の分泌ｈＥＦＮＡ４の血清レベルは、本質的に検出不能であった（データ示さず）。なおより驚くべきことに、腫瘍量をｈＥＦＮＡ４の血清試料中の濃度に対してプロットすると、有意な相関性が観測されて、この分泌された分析物がある種のヒト固形腫瘍の腫瘍増殖を in vivo でモニターするのに特に
有用であり得ることを示唆した。より一般的には、これらの結果は、治療と診断の両方の状況における本発明の応用可能性について強く示唆するものである。
上記に記載の方法を使用して、血液バンクより入手した２３名の正常ヒトドナー由来の血漿試料を使用して、この分析物の健常成人における濃度範囲を決定した。図面１７Ｄに示すように、ＥＦＮＡ４の平均濃度：３３２ｐｇ／ｍｌ（標準偏差：６．２ｐｇ／ｍｌ）を見出した。このことは、ＥＦＮＡがごく低くて厳しく調節された濃度で分泌又は発散されることを示唆し、ＥＦＮＡをＥＦＮＡ関連障害の疾患進行をモニターするか又は診断するのに理想的なバイオマーカー又は診断マーカーとする。
上記の可能性をさらに探究するために、１７名の結直腸癌患者由来の血清試料と非小細胞肺癌患者由来の１０試料を市販品より入手し、上記に記載の方法を使用して、健常成人由来の１２試料と比較してＥＦＮＡ４濃縮を試験した。図面１７Ｅに示すように、結直腸癌患者と非小細胞肺癌患者は共に、その血液中に有意に上昇した循環ＥＦＮＡ４レベルを有した。独立（unpaired）ｔ検定を使用すると、健常成人と結直腸癌患者の間の比較は０．０００２のｐ値に達して、健常成人と非小細胞肺癌患者の間の比較は０．０１のｐ値に達した。このデータは、分泌又は発散されたＥＦＮＡ４が固形腫瘍のある患者において上昇していることを証明し、開示モジュレーターを分析検査又は臨床診断に使用することの価値を例証する。
実施例１８
ＥＦＮＡ４モジュレーターは、関連するＥＦＮＡリガンドを発現する細胞に標的指向することができる
ＥＦＮＡ４モジュレーターのリガンド特異性について関連するＥＦＮＡリガンドに対して試験して、交差反応性の度合いを評価した。１例として、ＳＣ４．２．１とＳＣ９．６５について、ＥＦＮＡ４（図面１７Ａ）、ＥＦＮＡ３（図面１７Ｂ）、及びＥＦＮＡ１（図面１７Ｃ）を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用する in vitro 殺傷アッセイで試験した。モジュレーターのＳＣ９．６５は、マウスをＥＦＮＡ１免疫原で免疫化することによって産生した（実施例６による）ことに留意されたい。この殺傷アッセイは、実施例１６に記載の通りに行った。図面１７は、ＳＣ４．２．１がＥＦＮＡ４発現細胞に加えてＥＦＮＡ３発現細胞も殺傷することができることと、ＳＣ９．６５がＥＦＮＡ１発現細胞とＥＦＮＡ４発現細胞を殺傷することができることを証明する。これらのデータは、特定のＥＦＮＡファミリーメンバーに対して産生した選択モジュレーターが他のファミリーメンバーへ十分によく結合し、内在化を引き起こして、細胞傷害性ペイロードをリガンド発現細胞へ送達することができることを例証する。この発見は、ＥＦＮＡファミリーメンバー間の相同性の低い度合い（ヒトＥＦＮＡ１、２、３、及び４の間でほぼ３４〜４５％のアミノ酸配列同一性）からすればやや予測外であって、本明細書に記載のように、診断又は治療の目的のために汎ＥＦＮＡモジュレーターを産生することが可能であることを例示する。
実施例１９
ＥＦＮＡリガンドは、多数のＥｐｈＡ受容体と選択的に相互作用する
上記に考察したように、エフリンＡリガンドは、数多くのＥｐｈＡ受容体へ結合することが知られている。どのＥｐｈＡ受容体がＥＦＮＡ４と相互作用するポテンシャルを有するかを探究するために、実施例９の記載に類似したフローサイトメトリー結合アッセイを開発した。より具体的には、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合構築体として発現される可溶性ＥｐｈＡ受容体を、ウェルあたり５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１９Ａ）、又はレトロウイルス形質導入の手段によってＥＦＮＡ４を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞と称する）（図面１９Ｂ）へ染色緩衝液において４℃で１時間加えた。洗浄後、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９へコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧポリクローナル二次抗体（Jackson Immuno Research）を１時間加えた。２回洗浄後、２
μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩを含有する染色緩衝液に試料を再懸濁させて、ＨＴＳ付属装置を使用する標準条件下にＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）で分析した。図面１
９Ａ及び１９Ｂは、ＥｐｈＡ１を除いて、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、及びＥｐｈＡ１０がエフリンＡ４リガンドへ結合することを証明する。このことはまた、本発明のモジュレーターに固有の作用の利点と潜在的に多面的な要素を指摘する。
実施例２０
ＥＦＮＡ４は、ＥｐｈＢ２受容体へ結合するが、ＥｐｈＢ３及びＥｐｈＢ４受容体へ結合しない
実施例２０に示された知見を拡げて、種々のＥｐｈＢ受容体へ結合するエフリンＡ４リガンドの能力を探究した。ＥＦＮＡ４は、当初、上記の実施例２〜４で証明したように、ＣＳＣ関連標的として同定された。正常なマウス結腸陰窩の組織階層構造において、ＥｐｈＢ２及びＥｐｈＢ３受容体は、結腸陰窩底部に存在する細胞によって高度に発現されて陰窩の上に位置する細胞によっては発現されないので、ＥｐｈＢ発現とＥｐｈＢ受容体を介した前向き又は逆向きのシグナル伝達が組織構築と個々の細胞運命の決定に重要であることを示唆している（Batlle et al.; 2002 PMID: 12408869）。より最近になって、結直腸癌細胞によるＥｐｈＢ２発現は、腫瘍の始動及び長期増殖の能力に関連付けられて、ＥｐｈＢ２が結腸の癌幹細胞の表現型マーカーとして役立ち得ることが示唆された（Merlos-Suarez et al., 2011 PMID: 21419747）。従って、差示的に発現されるＥｐｈＢ受容体
のいずれかへ結合するエフリンＡ４リガンドの能力は、結直腸癌幹細胞にとって生物学的に重要である可能性がある。
当該技術分野で認められた技術を使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合構築体として発現される可溶性ＥｐｈＢ受容体、並びにＥｐｈＡ１−Ｆｃ（ＥＦＮＡ４へ結合しない）及びＥｐｈＡ２−Ｆｃ（ＥＦＡＮＡ４リガンドへ強く結合する）をウェルあたり５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面２０Ａ）又はＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面２０Ｂ）へ染色緩衝液において４℃で１時間加えた。洗浄後、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９へコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧポリクローナル二次抗体（Jackson Immuno Research）を１時
間加えた。２回洗浄後、２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩを含有する染色緩衝液に試料を再懸濁させて、ＨＴＳ付属装置を使用する標準条件下にＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（BD Biosciences）で分析した。図面２０Ａ及び２０Ｂは、ＥｐｈＢ３やＥｐｈＢ４でなく、ＥｐｈＢ２がＥＦＮＡ４リガンドへ結合することを証明して、開示モジュレーターによって有利に影響を及ぼすことが可能である、治療経路の潜在的な多様性を再び強調する。
当業者は、本発明が、その精神又は主要属性より逸脱することなく他の特定の形態で具現化し得ることをさらに理解されよう。上記の本発明の記載は、その例示態様だけを開示したのであって、他の変更態様も本発明の範囲内にあると考慮されると理解されたい。従って、本発明は、本明細書において詳しく記載した特別な態様に制限されない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとしては、付帯の特許請求項を参照にすべきである。
なお、本願発明は、以下のものにも関する。
（請求項１）
単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２）
ＥＦＮＡモジュレーターがＥＦＮＡアンタゴニストを含む、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項３）
ＥＦＮＡモジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項４）
抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項５）
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項４に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項６）
前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項４に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項７）
前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、請求項４に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項８）
前記モノクローナル抗体が枯渇性抗体を含む、請求項４に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項９）
前記モノクローナル抗体がＥＦＮＡ４と会合する抗体を含む、請求項４に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１０）
前記モノクローナル抗体が３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、ここで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域は、図面７Ａに示す相補性決定領域を含む、請求項９に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１１）
前記モノクローナル抗体が軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、及び配列番号１６３に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、及び配列番号１６１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１２）
細胞傷害剤をさらに含んでなる、請求項９、１０又は１１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１３）
請求項１１に記載のアミノ酸重鎖可変領域又はアミノ酸軽鎖可変領域をコードする核酸。
（請求項１４）
請求項１３に記載の核酸を含んでなるベクター。
（請求項１５）
請求項１４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
（請求項１６）
配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその断片を含んでなる、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１７）
ＥＦＮＡモジュレーターが免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む、請求項１６に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１８）
モジュレーターが、腫瘍始原細胞の頻度を低下させることの必要な被検者への投与時に腫瘍始原細胞の頻度を低下させる、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項１９）
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を使用して決定される、請求項１８に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２０）
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項１８に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２１）
前記腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項１８に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２２）
細胞傷害剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２３）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが汎ＥＦＮＡモジュレーターを含む、請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
（請求項２４）
請求項１に記載の単離されたＥＦＮＡモジュレーターを含んでなる、医薬組成物。
（請求項２５）
単離されたＥＦＮＡ４モジュレーター。
（請求項２６）
前記ＥＦＮＡ４モジュレーターが汎ＥＦＮＡ４モジュレーターを含む、請求項２５に記載の単離されたＥＦＮＡ４モジュレーター。
（請求項２７）
請求項２５に記載の単離されたＥＦＮＡ４モジュレーターを含んでなる、医薬組成物。
（請求項２８）
治療有効量のＥＦＮＡモジュレーターを、ＥＦＮＡ関連障害の治療が必要な被検者へ投与することを含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害を治療する方法。
（請求項２９）
前記ＥＦＮＡモジュレーターがＥＦＮＡアンタゴニストを含む、請求項２８に記載の方法。
（請求項３０）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項２８に記載の方法。
（請求項３１）
抗体又はその免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
（請求項３２）
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
（請求項３３）
前記モノクローナル抗体が３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、ここで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域は、図面７Ａに示す相補性決定領域を含む、請求項３２に記載の方法。
（請求項３４）
前記モノクローナル抗体がＥＦＮＡ４と会合する、請求項３１に記載の方法。
（請求項３５）
前記モノクローナル抗体が中和抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
（請求項３６）
前記モノクローナル抗体が内在化抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
（請求項３７）
前記内在化抗体が細胞傷害剤を含む、請求項３６に記載の方法。
（請求項３８）
前記ＥＦＮＡ関連障害が過剰増殖性障害を含む、請求項２８に記載の方法。
（請求項３９）
前記過剰増殖性障害が新生物障害を含む、請求項３８に記載の方法。
（請求項４０）
前記新生物障害が固形腫瘍を含む、請求項３９に記載の方法。
（請求項４１）
新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、又は乳癌を含む、請求項４０に記載の方法。
（請求項４２）
前記新生物障害が血液系腫瘍を含む、請求項３９に記載の方法。
（請求項４３）
前記血液系腫瘍が白血病又はリンパ腫を含む、請求項４２に記載の方法。
（請求項４４）
前記新生物障害に罹患している被検者が、腫瘍始原細胞を含んでなる腫瘍を明示する、請求項３９に記載の方法。
（請求項４５）
腫瘍始原細胞の頻度を前記被検者において低下させる工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
（請求項４６）
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項４５に記載の方法。
（請求項４７）
頻度の低下が、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される、請求項４５に記載の方法。
（請求項４８）
頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の免疫不全マウス中への移植を含んでなる in vivo 限界希釈分析を使用して決定される、請求項４７に記載の方法。
（請求項４９）
in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、請求項４８に記載の方法。
（請求項５０）
頻度の低下が、生きたヒト腫瘍細胞の in vitro コロニー支持条件中への限界希釈沈着を含んでなる in vitro 限界希釈分析を使用して決定される、請求項４７に記載の方法。
（請求項５１）
in vivo 限界希釈分析を使用して決定される頻度の低下が、ポアソン分布統計を使用する腫瘍始原細胞頻度の定量を含む、請求項５０に記載の方法。
（請求項５２）
抗癌剤を投与する工程をさらに含んでなる、請求項２８に記載の方法。
（請求項５３）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその断片を含む、請求項２８に記載の方法。
（請求項５４）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが汎ＥＦＮＡモジュレーターを含む、請求項２８に記載の方法。
（請求項５５）
腫瘍始原細胞の頻度を低下させることの必要な被検者において腫瘍始原細胞の頻度を低下させる方法であって、前記被検者へＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記方法。
（請求項５６）
腫瘍始原細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
（請求項５７）
前記腫瘍永続化細胞がＣＤ４４＋細胞又はＣＤ１３３＋細胞である、請求項５６に記載の方法。
（請求項５８）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体を含む、請求項５５に記載の方法。
（請求項５９）
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項５８に記載の方法。
（請求項６０）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗ＥＦＮＡ４抗体を含む、請求項５９に記載の方法。
（請求項６１）
被検者が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される新生物障害に罹患している、請求項５５に記載の方法。
（請求項６２）
被検者が血液系腫瘍に罹患している、請求項５５に記載の方法。
（請求項６３）
腫瘍始原細胞の頻度が少なくとも１０％低下する、請求項５５に記載の方法。
（請求項６４）
頻度の低下が、腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析、又は腫瘍始原細胞について濃縮することが知られている腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学検出を使用して決定される、請求項５５に記載の方法。
（請求項６５）
頻度の低下が、in vitro 又は in vivo の限界希釈分析を使用して決定される、請求項５５に記載の方法。
（請求項６６）
血液系腫瘍に罹患している被検者を治療する方法であって、前記被検者へＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、前記方法。
（請求項６７）
前記ＥＦＮＡモジュレーターがＥＦＮＡ４モジュレーターである、請求項６６に記載の方法。
（請求項６８）
ＥＦＮＡモジュレーターを被検者へ投与する工程を含んでなる、被検者における腫瘍を抗癌剤での治療のために増感させる方法。
（請求項６９）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体を含む、請求項６８に記載の方法。
（請求項７０）
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項６８に記載の方法。
（請求項７１）
前記抗癌剤が化学療法剤を含む、請求項６８に記載の方法。
（請求項７２）
前記抗癌剤が免疫療法剤を含む、請求項６８に記載の方法。
（請求項７３）
過剰増殖性障害を診断することの必要な被検者において過剰増殖性障害を診断する方法であって：
ａ）前記被検者より組織試料を入手する工程；
ｂ）該組織試料を少なくとも１つのＥＦＮＡモジュレーターと接触させる工程；及び
ｃ）該試料と会合したＥＦＮＡモジュレーターを検出又は定量する工程を含んでなる、前記方法。
（請求項７４）
ＥＦＮＡモジュレーターがモノクローナル抗体を含む、請求項７３に記載の方法。
（請求項７５）
抗体がレポーターと作動可能に会合している、請求項７４に記載の方法。
（請求項７６）
ＥＦＮＡモジュレーターを含んでなる容器（receptacle）とＥＦＮＡ関連障害を治療又は診断するのに前記ＥＦＮＡモジュレーターを使用するための指示物（instructional materials）とを含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害を診断するか又は治療するのに有用な製造品。
（請求項７７）
前記ＥＦＮＡモジュレーターがモノクローナル抗体である、請求項７６に記載の製造品。
（請求項７８）
容器が読取り可能プレートを含む、請求項７６に記載の製造品。
（請求項７９）
少なくとも１つの内在化ＥＦＮＡモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
（請求項８０）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体を含む、請求項７９に記載の方法。
（請求項８１）
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８０に記載の方法。
（請求項８２）
モノクローナル抗体が細胞傷害剤をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
（請求項８３）
モノクローナル抗体がＥＦＮＡ４と会合する、請求項８１に記載の方法。
（請求項８４）
少なくとも１つの中和ＥＦＮＡモジュレーターの治療有効量を投与する工程を含んでなる、新生物障害に罹患している被検者を治療する方法。
（請求項８５）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体を含む、請求項８４に記載の方法。
（請求項８６）
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８５に記載の方法。
（請求項８７）
前記モノクローナル抗体が抗ＥＦＮＡ４抗体を含む、請求項８６に記載の方法。
（請求項８８）
前記ＥＦＮＡ４抗体が汎ＥＦＮＡ抗体を含む、請求項８７に記載の方法。
（請求項８９）
新生物障害が、副腎癌、膀胱癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、結直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群より選択される、請求項８４に記載の方法。
（請求項９０）
腫瘍始原細胞をＥＦＮＡモジュレーターと接触させる工程を含んでなる、腫瘍始原細胞の集団を同定する、単離する、分画する、又は濃縮する方法。
（請求項９１）
前記ＥＦＮＡモジュレーターが抗体を含む、請求項９０に記載の方法。
（請求項９２）
ｈＳＣ４．５、ｈＳＣ４．１５、ｈＳＣ４．２２、及びｈＳＣ４．４７からなる群より選択される抗体上に見出されるヒト化可変領域に実質的に類似したヒト化抗体可変領域と医薬的に許容される担体とを含んでなる、組成物。
（請求項９３）
軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなる抗ＥＦＮＡ４抗体であって、ここで前記軽鎖可変領域は、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５９、及び配列番号１６３に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてここで前記重鎖可変領域は、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、及び配列番号１６１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記抗ＥＦＮＡ４抗体。
（請求項９４）
医薬有効量のＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、転移を阻害するか又は予防することの必要な被検者において転移を阻害又は予防する方法。
（請求項９５）
被検者がＥＦＮＡモジュレーターの投与の前又は後に腫瘍減量術を受ける、請求項９４に記載の方法。
（請求項９６）
前記腫瘍減量術が少なくとも１つの抗癌剤の投与を含む、請求項９４に記載の方法。
（請求項９７）
医薬有効量のＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、維持療法の必要な被検者に維持療法を実施する方法。
（請求項９８）
前記被検者がＥＦＮＡモジュレーターの投与に先立って新生物障害について治療された、請求項９７に記載の方法。
（請求項９９）
ＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、過剰増殖性障害に罹患している被検者において腫瘍細胞を枯渇する方法。
（請求項１００）
前記腫瘍細胞が腫瘍始原細胞を含む、請求項９９に記載の方法。
（請求項１０１）
ＥＦＮＡモジュレーターを投与する工程を含んでなる、ＥＦＮＡ関連障害を in vivo で診断する、検出する、又はモニターすることの必要な被検者において、ＥＦＮＡ関連障害を in vivo で診断する、検出する、又はモニターする方法。

Claims (1)

  1. 単離されたＥＦＮＡモジュレーター。
JP2017130334A 2010-12-08 2017-07-03 新規モジュレーターと使用の方法 Expired - Fee Related JP6491701B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42115710P 2010-12-08 2010-12-08
US61/421,157 2010-12-08
USPCT/US2011/050451 2011-09-02
PCT/US2011/050451 WO2012031280A2 (en) 2010-09-03 2011-09-02 Identification and enrichment of cell subpopulations

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013543326A Division JP6279903B2 (ja) 2010-12-08 2011-12-07 新規モジュレーターと使用の方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018008949A true JP2018008949A (ja) 2018-01-18
JP2018008949A5 JP2018008949A5 (ja) 2018-06-14
JP6491701B2 JP6491701B2 (ja) 2019-04-03

Family

ID=46207727

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013543326A Expired - Fee Related JP6279903B2 (ja) 2010-12-08 2011-12-07 新規モジュレーターと使用の方法
JP2017130334A Expired - Fee Related JP6491701B2 (ja) 2010-12-08 2017-07-03 新規モジュレーターと使用の方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013543326A Expired - Fee Related JP6279903B2 (ja) 2010-12-08 2011-12-07 新規モジュレーターと使用の方法

Country Status (18)

Country Link
US (5) US9320812B2 (ja)
EP (2) EP2648749A2 (ja)
JP (2) JP6279903B2 (ja)
KR (1) KR20140031175A (ja)
CN (2) CN103347538B (ja)
AR (1) AR084208A1 (ja)
AU (4) AU2011360938B2 (ja)
BR (2) BR112013014321A2 (ja)
CA (2) CA2820885A1 (ja)
CO (1) CO6821883A2 (ja)
MX (1) MX356400B (ja)
NZ (3) NZ705008A (ja)
PE (2) PE20171143A1 (ja)
PH (1) PH12017501139A1 (ja)
RU (2) RU2592672C9 (ja)
SG (3) SG191081A1 (ja)
TW (2) TWI655210B (ja)
WO (2) WO2012078813A2 (ja)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2648749A2 (en) 2010-12-08 2013-10-16 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
US10323081B2 (en) * 2011-07-06 2019-06-18 Genmag A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the C-terminus of antibody heavy chains
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
WO2014124326A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Stem Centrx, Inc. Novel multispecific constructs
EP2986627B1 (en) * 2013-04-18 2019-04-10 Carmel Haifa University Economic Corporation Ltd. Inhibitors of the eph-a receptor and uses thereof
EP3003368A4 (en) 2013-05-24 2017-05-03 Biogen MA Inc. Anti-gpiib/iiia antibodies or uses thereof
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3065780A1 (en) * 2013-11-04 2016-09-14 Pfizer Inc. Anti-efna4 antibody-drug conjugates
US10538591B2 (en) * 2014-03-10 2020-01-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Anti-fibulin-3 antibodies and uses thereof
CN105504049B (zh) * 2014-09-26 2019-07-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
US10556959B2 (en) 2014-11-07 2020-02-11 Xencor, Inc. Anti-CD39 antibodies and uses thereof
CA2929542A1 (en) 2015-05-13 2016-11-13 Pfizer Inc. Treatment with anti-efna4 antibody-drug conjugates
CN114796520A (zh) * 2016-01-27 2022-07-29 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
MX2018010445A (es) 2016-03-01 2019-10-17 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Anticuerpos especificos del receptor de poliovirus humano (rvp).
TWI752012B (zh) 2016-03-04 2022-01-11 美商Ｊｎ生物科學有限責任公司 針對tigit之抗體
CN109453382A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭、转移的药物中的应用
JP2022507295A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 アーチ オンコロジー，インコーポレイテッド 治療用ＳＩＲＰα抗体
EP3976793A4 (en) * 2019-05-27 2023-06-21 The University of British Columbia CONFORMATION-SPECIFIC EPITOPES IN TAU, ANTIBODIES AGAINST IT AND METHODS RELATED THERETO
AU2021284273A1 (en) 2020-06-02 2022-12-15 Arcus Biosciences, Inc. Antibodies to TIGIT
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
CN113278075B (zh) * 2021-06-18 2021-12-14 芜湖森爱驰生物科技有限公司 一种炎症检测试剂盒
KR20230142330A (ko) 2022-03-31 2023-10-11 주식회사 에스알이엔지 일체형 수배전반 열화 방지 시스템 및 이를 이용한 열화 방지 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003532365A (ja) * 1997-08-29 2003-11-05 イミュネックス・コーポレーション Ｌｅｒｋ−６と称されるサイトカイン
JP2007522096A (ja) * 2003-06-06 2007-08-09 メディミューン，インコーポレーテッド 癌の診断、治療、及び予防のためのＥｐｈＡ４及びＥｐｈＡ４変調因子の使用
WO2009052830A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Genmab A/S Novel antibody therapies
JP2009539413A (ja) * 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
JP2010501596A (ja) * 2006-08-31 2010-01-21 エー・シー・エヌ・１３５ ４９３ ３９１・プロプライエタリー・リミテッド・アズ・トラスティー・フォー・コンカ・ユニット・トラスト 抗体含有組成物を用いた非感染性の病状の処置および／または予防
US20100113415A1 (en) * 2008-05-29 2010-05-06 Rajapakse Hemaka A Epha4 rtk inhibitors for treatment of neurological and neurodegenerative disorders and cancer

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2096749T3 (es) 1990-12-14 1997-03-16 Cell Genesys Inc Cadenas quimericas para vias de transduccion de señal asociada a un receptor.
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
EP0749475A4 (en) 1992-08-26 1997-05-07 Harvard College USE OF THE CYTOKIN IP-10 AS AN ANTI-TUMOR AGENCY
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5516658A (en) 1993-08-20 1996-05-14 Immunex Corporation DNA encoding cytokines that bind the cell surface receptor hek
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0859841T3 (da) 1995-08-18 2002-09-09 Morphosys Ag Protein/(poly)peptidbiblioteker
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP2000508522A (ja) 1996-03-22 2000-07-11 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド アポトーシス誘導分子ｉｉ
CA2259157A1 (en) 1996-07-05 1998-01-15 Mount Sinai Hospital Corporation Oligomerized receptors which affect pathways regulated by transmembrane ligands for elk-related receptor tyrosine kinases
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US5994076A (en) 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6864227B1 (en) 1998-04-13 2005-03-08 California Institute Of Technology Artery-and vein-specific proteins and uses therefor
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AUPP674898A0 (en) 1998-10-27 1998-11-19 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A method of treatment
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
JP2003517816A (ja) 1999-08-11 2003-06-03 イオス バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 新脈管形成の診断の新規方法、新脈管形成調節因子についてのスクリーニングの組成物および方法
US6927203B1 (en) 1999-08-17 2005-08-09 Purdue Research Foundation Treatment of metastatic disease
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6992170B2 (en) * 1999-10-15 2006-01-31 Curagen Corporation Polypeptides and polynucleotides homologous to thymosin, ephrin a receptors, and fibromodulin
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
WO2001029224A2 (en) 1999-10-20 2001-04-26 Zymogenetics, Inc. Granulocyte peptide homolog zgpa1
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
EP1333032A4 (en) 2000-10-06 2005-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR PURIFYING ANTIBODIES
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
AU2002365216A1 (en) 2001-01-23 2003-09-02 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040043928A1 (en) 2001-08-02 2004-03-04 Ramesh Kekuda Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
WO2003004057A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 The Hospital For Sick Children Ephrin and eph receptor mediated immune modulation
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003040304A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Neuronova Ab Method of proliferation in neurogenic regions
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040001835A1 (en) 2002-03-04 2004-01-01 Medimmune, Inc. Prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
US20040091486A1 (en) 2002-05-10 2004-05-13 Kinch Michael S. EphA2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
EP1852441B1 (en) 2002-09-24 2012-03-28 The Burnham Institute Agents that modulate EPH receptor activity
EP1553963A4 (en) 2002-09-24 2006-05-03 Burnham Inst NOVEL AGENTS MODULATING EPH RECEPTOR ACTIVITY
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
WO2004029218A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Incyte Corporation Receptors and membrane-associated proteins
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004048938A2 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
WO2004072266A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
EP1633784B1 (en) 2003-05-09 2011-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
US20050153923A1 (en) 2003-12-04 2005-07-14 Kinch Michael S. Targeted drug delivery using EphA2 or EphA4 binding moieties
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
US7659374B2 (en) 2004-08-16 2010-02-09 Medimmune, Llc Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
WO2006047298A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 The Penn State Research Foundation Eph receptor tumor biomarkers
US8222253B2 (en) 2004-10-23 2012-07-17 Case Western Reserve University Peptide and small molecule agonists of EphA and their uses
EP2422811A2 (en) 2004-10-27 2012-02-29 MedImmune, LLC Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
KR20080080482A (ko) 2005-09-07 2008-09-04 메디뮨 엘엘씨 독소가 컨쥬게이트된 ｅｐｈ 수용체 항체
US7807459B2 (en) 2005-09-27 2010-10-05 Reneuron, Inc. EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
EP2004228A1 (en) 2006-02-28 2008-12-24 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector functions of anti-epha4 antibodies
JP5167155B2 (ja) 2006-03-09 2013-03-21 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム ペプチド結合に基づく多数の細胞株のプロファイリングに関連した組成物および方法
US20080003210A1 (en) 2006-03-13 2008-01-03 Medimmune, Inc. Non-human primate receptor tyrosine kinases
EA015992B1 (ru) 2006-03-17 2012-01-30 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела
EP2032694A4 (en) 2006-06-06 2010-09-15 Univ Tennessee Res Foundation COMPOSITIONS ENRICHED IN NEOPLASTIC STEM CELLS AND METHODS INVOLVING THEM
MX2009000709A (es) * 2006-07-18 2009-02-04 Sanofi Aventis Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.
CA3007075C (en) 2006-09-07 2019-10-15 Arthur E. Frankel Methods and compositions based on diphtheria toxin-interleukin-3 conjugates
US8907065B2 (en) 2006-12-15 2014-12-09 Ablynx N.V. Polypeptides that modulate the interaction between cells of the immune system
JP2010516259A (ja) 2007-01-22 2010-05-20 レイベン バイオテクノロジーズ ヒトがん幹細胞
EP3199180B1 (en) * 2007-03-08 2022-01-05 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of solid tumors
US9289492B2 (en) 2007-07-17 2016-03-22 The General Hospital Corporation Collecting ovarian cancer stem cells from ovarian cancer cells
EP2022848A1 (en) 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
CA2699394C (en) * 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
US20100162416A1 (en) 2008-09-29 2010-06-24 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
WO2010066835A2 (en) 2008-12-10 2010-06-17 Ablynx Nv Eph receptor and ephrin ligand interaction
US8788213B2 (en) 2009-01-12 2014-07-22 Intrexon Corporation Laser mediated sectioning and transfer of cell colonies
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
WO2010141974A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 The University Of Melbourne Therapeutic applications
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2689787A1 (en) 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2446895A1 (en) 2010-10-01 2012-05-02 Stemgen S.P.A. EPH receptor expression in tumor stem cells
EP2648749A2 (en) 2010-12-08 2013-10-16 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
AU2014312215B2 (en) 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
US20190209704A1 (en) 2014-10-20 2019-07-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions and methods of use
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003532365A (ja) * 1997-08-29 2003-11-05 イミュネックス・コーポレーション Ｌｅｒｋ−６と称されるサイトカイン
JP2007522096A (ja) * 2003-06-06 2007-08-09 メディミューン，インコーポレーテッド 癌の診断、治療、及び予防のためのＥｐｈＡ４及びＥｐｈＡ４変調因子の使用
JP2009539413A (ja) * 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
JP2010501596A (ja) * 2006-08-31 2010-01-21 エー・シー・エヌ・１３５ ４９３ ３９１・プロプライエタリー・リミテッド・アズ・トラスティー・フォー・コンカ・ユニット・トラスト 抗体含有組成物を用いた非感染性の病状の処置および／または予防
WO2009052830A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Genmab A/S Novel antibody therapies
US20100113415A1 (en) * 2008-05-29 2010-05-06 Rajapakse Hemaka A Epha4 rtk inhibitors for treatment of neurological and neurodegenerative disorders and cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDOU A G ET AL, INDIAN JOURNAL OF CANCER, vol. 47, no. 1, JPN5014002258, March 2010 (2010-03-01), pages 46 - 52, ISSN: 0003850789 *
ALONSO-C LUIS M ET AL, LEUKEMIA RESEARCH, vol. 33, no. 3, JPN5014002259, 1 March 2009 (2009-03-01), US, pages 395 - 406, ISSN: 0003850790 *
YANG JUN-JIE ET AL, JOURNAL OF CENTRAL SOUTH UNIVERSITY. MEDICAL SCIENCES, vol. 30, no. 5, JPN5014002257, October 2005 (2005-10-01), pages 529 - 532, ISSN: 0003850791 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ728016A (en) 2020-06-26
AU2011360938A8 (en) 2013-05-16
NZ611428A (en) 2015-07-31
RU2013128444A (ru) 2015-01-20
SG190990A1 (en) 2013-07-31
MX2013006569A (es) 2014-01-31
NZ705008A (en) 2017-05-26
WO2012078813A3 (en) 2012-08-02
RU2016123839A (ru) 2018-11-30
WO2012078813A2 (en) 2012-06-14
CA2819861A1 (en) 2012-06-14
EP2648749A2 (en) 2013-10-16
WO2012118547A1 (en) 2012-09-07
SG10201601792UA (en) 2016-04-28
US20160264653A1 (en) 2016-09-15
AU2011360938B2 (en) 2016-07-28
US20140093495A1 (en) 2014-04-03
EP2648748A1 (en) 2013-10-16
JP6279903B2 (ja) 2018-02-14
AU2011338425A1 (en) 2013-05-02
TWI585106B (zh) 2017-06-01
US9969798B2 (en) 2018-05-15
AR084208A1 (es) 2013-05-02
TWI655210B (zh) 2019-04-01
TW201305212A (zh) 2013-02-01
US9765136B2 (en) 2017-09-19
CN103347538B (zh) 2016-08-24
AU2011360938A1 (en) 2013-05-02
BR112013014119A8 (pt) 2017-07-11
JP6491701B2 (ja) 2019-04-03
US20180237512A1 (en) 2018-08-23
TW201734048A (zh) 2017-10-01
PE20171143A1 (es) 2017-08-10
CN103347538A (zh) 2013-10-09
US20140302034A1 (en) 2014-10-09
US20160257745A1 (en) 2016-09-08
PE20140673A1 (es) 2014-06-14
RU2592672C2 (ru) 2016-07-27
BR112013014321A2 (pt) 2019-09-24
CA2820885A1 (en) 2012-09-07
RU2592672C9 (ru) 2016-11-27
US9320812B2 (en) 2016-04-26
KR20140031175A (ko) 2014-03-12
CN106279415A (zh) 2017-01-04
AU2018250466A1 (en) 2018-11-15
PH12017501139A1 (en) 2019-11-04
JP2014507117A (ja) 2014-03-27
SG191081A1 (en) 2013-07-31
BR112013014119A2 (pt) 2016-09-27
MX356400B (es) 2018-05-28
AU2016247113A1 (en) 2016-11-03
CO6821883A2 (es) 2013-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6491701B2 (ja) 新規モジュレーターと使用の方法
US10836831B2 (en) Anti-PTK7 antibodies and methods of use
US9458231B2 (en) Modulators and methods of use
AU2011293127B2 (en) Notum protein modulators and methods of use
US20130058947A1 (en) Novel Modulators and Methods of Use

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180502

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180802

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181101

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181227

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190131

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190301

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6491701

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees