MX2013006569A - Moduladores novedosos y metodos de uso. - Google Patents

Moduladores novedosos y metodos de uso.

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MX2013006569A
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modulator
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Johannes Hampl
Scott J Dylla
Orit Foord
Robert A Stull
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Abstract

Se proveen moduladores novedosos, que incluyen anticuerpos y derivados de los mismos, y métodos de uso de dichos moduladores para tratar trastornos hiperproliferativos.

Description

MODULADORES NOVEDOSOS Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES DE INTERREFERENCIA Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. No. de serie 61/421 ,157, presentada el 8 de diciembre de 2010, y del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes (PCT) No. PCT/US201 1/050451 , presentada el 2 de septiembre de 201 1 , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente invención contiene un listado de secuencias que se ha presentado en formato ASCII vía EFS-Web y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 22 de noviembre de 201 1 , tiene el nombre 11200PCT.txt y tiene un tamaño de 80,102 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN En general, esta solicitud se refiere a composiciones y métodos novedosos para su uso en la prevención, tratamiento o alivio de trastornos hiperproliferativos y cualquier expansión, reaparición, recaída o metástasis de los mismos. En un aspecto amplio, la presente invención se refiere al uso de moduladores del ligando efrina A (EFNA), que incluyen anticuerpos anti-EFNA y construcciones de fusión, para el tratamiento o profilaxis de trastornos neoplásicos. Modalidades particularmente preferidas de la presente invención proveen el uso de estos moduladores de EFNA para el tratamiento inmunoterapéutico de malignidades, que comprende una reducción de la frecuencia de iniciación de la célula de tumor.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diferenciación de células madre y progenitoras y la proliferación de células son procesos normales en curso, que actúan en concierto para sostener el crecimiento de tejido durante la oncogénesis y el reemplazo de células y reparación de la mayoría de los tejidos durante la vida de todos los organismos vivos. Las decisiones de diferenciación y proliferación frecuentemente son controladas por muchos factores y señales que se equilibran para mantener las decisiones del destino de las células y la arquitectura del tejido. La arquitectura del tejido normal es mantenida principalmente por células que responden a indicaciones microambientales que regulan la división celular y la maduración del tejido. Por consiguiente, la proliferación y diferenciación celular ocurren normalmente solo cuando es necesario para el reemplazo de las células dañadas o que mueren, o para el crecimiento. Lamentablemente la proliferación y/o diferenciación celular puede ser interrumpida por una gran cantidad de factores que incluyen, por ejemplo, la carencia o abundancia de varias sustancias químicas de señalización, la presencia de microambientes alterados, mutaciones genéticas, o alguna combinación de las mismas. Cuando la proliferación y/o diferenciación celular normal es perturbada o interrumpida en alguna forma, esto puede llevar a varias enfermedades o trastornos que incluyen trastornos proliferativos como el cáncer.
Los tratamientos convencionales para el cáncer incluyen quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia (por ejemplo modificadores de la respuesta biológica, vacunas o terapias dirigidas), o combinaciones de las mismas. Lamentablemente muchos tipos de cáncer no responden o responden mínimamente a estos tratamientos convencionales, dejando pocas opciones para los pacientes. Por ejemplo, en algunos pacientes algunos tipos de cáncer exhiben mutaciones de genes que los hacen no responsivos a pesar de la eficacia general de las terapias seleccionadas. Además, dependiendo del tipo de cáncer, algunos tratamientos disponibles, como cirugía, pueden no ser alternativas viables. Las limitaciones inherentes delaterapia actual del estándar de atención son particularmente evidentes cuando se intenta atender a los pacientes que han sido sometidos a tratamientos previos y han recaído subsiguientemente. En estos casos los regímenes terapéuticos fallidos y el deterioro resultante del paciente pueden contribuir a tumores refractarios que frecuentemente se manifiestan por sí solos como una enfermedad más agresiva que finalmente resulta ser incurable. Aunque por años ha habido grandes mejoras en el diagnóstico y tratamiento del cáncer, las tasas de supervivencia general de muchos tumores sólidos han permanecido casi sin cambio debido al fracaso de las terapias existentes para prevenir la recaída, la reaparición del tumor y las metástasis. De esta manera, persiste el reto de desarrollar terapias más dirigidas y potentes.
Un área prometedora de investigación incluye el uso de terapias dirigidas en busca de las células tumorigénicas "semilla" que parecen ser el soporte de muchos tipos de cáncer. Para ese fin, ahora se sabe que la mayoría de los tejidos sólidos contienen poblaciones de células madre adultas residentes en tejido que generan los tipos de células diferenciadas que comprenden la mayor parte de ese tejido. Los tumores que se originan en estos tejidos consisten similarmente en poblaciones heterogéneas de células que también se originan de células madre, pero que difieren notablemente en su proliferación y organización general. Aunque se reconoce, cada vez más, que la mayoría de las células de tumor tienen una capacidad limitada de proliferar, una población minoritaria de células de cáncer (conocidas comúnmente como células madres cancerosas o CSC) tienen la capacidad exclusiva de autorrenovarse extensamente, permitiendo así una capacidad inherente de reinicio de tumor. Más específicamente, la hipótesis de la célula madre cancerosa propone que hay una subclase distinta de células (es decir, CSC) dentro de cada tumor (aproximadamente 0.1-10 %) que son capaces de autorrenovación indeterminada y de generar células de tumor progresivamente limitadas en su capacidad de duplicación, como resultado de la diferenciación en células progenitoras de tumor y subsiguientemente en células de tumor diferenciadas terminalmente.
En los últimos años se ha hecho más evidente que estas CSC (también conocidas como células que perpetúan tumores o TPC) podrían ser más resistentes a los agentes quimioterapéuticos tradicionales o la radiación y así podrían persistir después de las terapias clínicas del estándar de atención para más tarde estimular el crecimiento de tumores refractarios, tumores secundarios y promover metástasis. Además, evidencia creciente sugiere que en las CSC las rutas que regulan la organogénesis y/o la autorrenovación de células madre normales residentes en tejido están descontroladas o alteradas, dando como resultado la expansión continua de células cancerosas de autorrenovación y la formación de tumor. Véase en general Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087; y Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. De esta manera, la eficacia de los métodos de tratamiento tradicionales y también de los métodos más recientes de tratamiento dirigido, ha sido limitada aparentemente por la existencia y/o emergencia de células cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el cáncer, incluso frente a estos diversos métodos de tratamiento: Huff ef al., European Journal of Cáncer Al. 1293-1297 (2006), y Zhou ef al., Nature Reviews Drug Discovery 8; 806-823 (2009), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Estas observaciones se confirman por la incapacidad consistente de los agentes de extirpación tradicionales para aumentar sustancialmente la supervivencia del paciente cuando padece tumores sólidos, y por medio del desarrollo de una comprensión crecientemente sofisticada de cómo los tumores crecen, reaparecen u originan metástasis. Por consiguiente, las estrategias recientes para tratar los trastornos neoplásicos han reconocido la importancia de eliminar, agotar, silenciar o promover la diferenciación de células que perpetúan tumores a fin de disminuir la posibilidad de la reaparición del tumor, la metástasis o recaída del paciente.
Los esfuerzos por desarrollar estas estrategias han incorporado trabajo reciente que implica modelos de xenoinjerto no tradicionales (NTX), en donde especímenes de tumor sólido primario humano se implantan y se pasan exclusivamente a ratones inmunocomprometidos. En muchos tipos de cáncer estas técnicas confirman la existencia de una subpoblación de células con la capacidad única de generar tumores heterogéneos y alimentar su crecimiento indefinidamente. Como se supuso previamente, el trabajo en los modelos de NTX ha confirmado que las subpoblaciones identificadas de CSC de células de tumor parecen más resistentes a los regímenes de extirpación, tales como quimioterapia y radiación, explicando potencialmente la disparidad entre las tasas de respuesta clínica y supervivencia general. Además, el uso de modelos de NTX en la investigación de CSC ha provocado un cambio fundamental en el descubrimiento de fármacos y la evaluación preclínica de fármacos candidatos, que puede llevar a terapias dirigidas a CSC que tienen un impacto mayor sobre la reaparición del tumor y la metástasis, mejorando así las tasas de supervivencia del paciente. Aunque se ha progresado, las dificultades técnicas inherentes asociadas con el manejo del tejido de tumor primario y/o de xenoinjerto, junto con la falta de plataformas experimentales para caracterizar la identidad de CSC y el potencial de diferenciación, plantean mayores desafíos. Por lo tanto, persiste una necesidad sustancial de hacer blanco selectivo en lascélulas madre de cáncer y desarrollar compuestos o métodos diagnósticos, profilácticos o terapéuticos que se puedan usar en el tratamiento, prevención y/o manejo de los trastornos hiperproliferativos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Estos y otros objetivos son provistos por la presente invención que, en un sentido amplio, está dirigida a métodos, compuestos, composiciones y artículos de fabricación que se pueden usar en el tratamiento de trastornos asociados con EFNA (por ejemplo, trastornos hiperproliferativos o trastornos neoplásicos). Para ese fin, la presente invención provee moduladores de EFNA (o ligandos efrina A) novedosos que hacen blanco eficientemente en células de tumor o células madre de cáncer, y se pueden usar para tratar pacientes que padecen una amplia variedad de malignidades. Como se expondrá en la presente en mayor detalle, actualmente hay seis ligandos efrina A conocidos (es decir, EFNAs 1-6), y los moduladores descritos pueden comprender o asociarse con cualesquiera uno o más ligandos efrina A. Además, en algunas modalidades los moduladores de EFNA descritos pueden comprender cualquier compuesto que reconoce, compite, agoniza, antagoniza, interacciona, se une o se asocia con un polipéptido de EFNA, su receptor o su gen, y modula, ajusta, altera, cambia o modifica el impacto de la proteína EFNA sobre una o más rutas fisiológicas. De esta manera, en un sentido amplio, la presente invención está dirigida a moduladores de EFNA aislados. En modalidades preferidas, la invención está dirigida más particularmente a moduladores de EFNA1 aislados o moduladores de EFNA4 aislados (es decir, moduladores que comprenden o se asocian con por lo menos EFNA1 o EFNA4). Además, como se expone extensamente más abajo, estos moduladores se pueden usar para proveer composiciones farmacéuticas.
En modalidades seleccionadas de la invención, los moduladores de EFNA pueden comprender el mismo ligando efrina A o fragmentos del mismo, ya sea en forma aislada o fusionada o asociada con otras porciones (por ejemplo, Fc-EFNA, PEG-EFNA o EFNA asociado con una porción de direccionamiento). En otras modalidades seleccionadas, los moduladores de EFNA pueden comprender antagonistas de EFNA que, para los fines de la presente solicitud, significarán cualquier construcción o compuesto que reconoce, compite, interacciona, se une o se asocia con EFNA y neutraliza, elimina, reduce, sensibiliza, reprograma, inhibe o controla el crecimiento de las células neoplásicas, que incluyencélulas que inician tumores. En modalidades preferidas los moduladores de EFNA de la presente invención comprenden anticuerpos anti-EFNA, o fragmentos o derivados de los mismos, que se ha encontrado inesperadamente que silencian, neutralizan, reducen, decrecen, agotan, moderan, disminuyen, reprograman, eliminan o inhiben de otro modo la capacidad de las células que inician tumores para propagarse, mantenerse, expandirse, proliferar o facilitar de otro modo la supervivencia, reaparición, regeneración y/o metástasis de las células neoplásicas. En modalidades particularmente preferidas, los anticuerpos o fragmentos ¡nmunorreactivos se pueden asociar o conjugar con uno o más agentes anticancerosos.
En una modalidad, el modulador de EFNA puede comprender un anticuerpo humanizado en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 161 , y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151 , SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 163. En otras modalidades preferidas, la invención estará en forma de una composición que comprende un anticuerpo humanizado seleccionado del grupo que consiste en hSC4.5, hSC4.15, hSC4.22 y hSC4.47, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad preferida, el modulador de EFNA puede comprender un anticuerpo que comprende una o más CDRs del cuadro A (SEQ ID NOs: 8-59 y 70-95). Preferiblemente, el anticuerpo que comprende por lo menos una CDR del cuadro A comprenderá un anticuerpo humanizado.
CUADRO A Regiones determinantes de complementariedad y disposiciones genéticas de distintos anticuerpos anti- EFNA El cuadro A es una representación tabular que muestra la disposición genética y las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera (como lo definen Chotia ef al.) de moduladores de EFNA distintos, aislados y clonados como se describe en la presente.
En otras modalidades, la invencióncomprenderá un modulador de EFNA que reduce la frecuencia de las células que inician tumores tras la administración a un sujeto. Preferiblemente, la reducción de frecuencia será determinada usando análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo. En modalidades particularmente preferidas, estos análisis se pueden hacer usando análisis de dilución limitativa en vivo que comprende el trasplante de células de tumor humanas vivas en ratones inmunocomprometidos. Alternativamente, el análisis de dilución limitativa se puede hacer usando análisis de dilución limitativa in vitro que comprende el depósito de dilución limitativa de las células de tumor humanas vivas en condiciones de soporte de colonia in vitro. En cualquier caso, el análisis, cálculo o cuantificación de la reducción de frecuencia preferiblemente comprenderá el uso de estadística de distribución de Poisson para proveer un conteo exacto. Se apreciará que, aunque se prefieren estos métodos de cuantificación, también se pueden usar otros métodos menos laboriosos tales como citometría de flujo o inmunohistoquímica, para proveer los valores deseados, por consiguiente, se contemplan expresamente dentro del alcance de la presente invención. En tales casos la reducción de la frecuencia se puede determinar usando análisis de citometría de flujo o detección inmunmohistoquímica de marcadores de superficie de célula de tumor conocidos para enriquecer las células que inician tumores.
Por lo tanto, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método de tratamiento de un trastorno asociado con EFNA.que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de EFNA a un sujeto en necesidad del mismo, con lo cual se reduce la frecuencia de las células que inician tumores. Nuevamente, la reducción de la frecuencia de las células que inician tumorespreferiblemente será determinada usando análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo.
A este respecto, se apreciará que la presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que polipéptidos EFNA (y particularmente EFNA4 como se expone abajo) se asocian con células que perpetúan tumores (es decir, células madre de cáncer) que están implicadas en la etiología de varias neoplasias. Más específicamente, la presente solicitud demuestra inesperadamente que la administración de varios moduladores de EFNA ejemplares puede mediar, reducir, inhibir o eliminar la señalización tumorigénica realizada por células que inician tumores (es decir, reducen la frecuencia de las células que inician tumores). A su vez, esta reducción en señalización, ya sea por reducción, eliminación, reprogramación o silenciamiento de las células que inician tumores, o modificando la morfología de la célula de tumor (por ejemplo, diferenciación inducida, interrupción del nicho), permite un tratamiento más eficaz de los trastornos asociados con EFNA inhibiendo la tumorigénesis, mantenimiento del tumor, expansión y/o metástasis y reaparición. En otras modalidades, los moduladores descritos pueden promover, sostener o incrementar de otra manera la señalización mediada por EFNA que puede limitar o restringir el crecimiento del tumor. En otras modalidades los moduladores descritos pueden afectar, suprimir o retardar de otra manera la señalización mediada por EFNA que puede alimentar el crecimiento del tumor. Además, como se expondrá abajo en mayor detalle, los polipéptidos EFNA están implicados en la generación de fuerzas de adhesión y repulsión entre las células por medio de reordenamientos de integrina y citoesqueleto. La intervención en estas interacciones intercelulares, usando los moduladores de EFNA novedosos descritos en la presente, puede así aliviar un trastorno por medio de más de un mecanismo (es decir, reducción de las células que inician tumores e interrupción de la adhesión celular) para proveer efectos aditivos o sinérgicos. Otras modalidades preferidas pueden tomar ventaja del internamiento celular de los ligandos efrina A para suministrar un agente anticanceroso mediado por modulador. A este respecto se apreciará que la presente invención no está limitada por algún mecanismo de acción particular, sino que más bien abarca el uso amplio de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados con EFNA (que incluyen varias neoplasias).
De esta manera, otra modalidad preferida de la invención comprende un método de tratamiento de un trastorno asociado con EFNA en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende el paso de administrar un modulador de EFNA a dicho sujeto. En modalidades particularmente preferidas, el modulador de EFNA estará asociado (por ejemplo, conjugado) con un agente anticanceroso. Además, los aspectos beneficiosos de la presente invención, que incluyen cualquier interrupción de la adhesión celular y beneficios colaterales, se puede lograr ya sea que el tejido tumoral del sujeto exhiba niveles elevados de EFNA o niveles reducidos o deprimidos de EFNA en comparación con el tejido adyacente normal.
Como se menciona arriba y se expone más abajo en mayor detalle, actualmente hay seis ligandos efrina A conocidos (es decir, EFNAs 1-6). De acuerdo con la presente invención se apreciará que los moduladores descritos pueden ser generados, fabricados y/o seleccionados para reaccionar con un solo ligando efrina A (por ejemplo EFNA4), un subgrupo de ligandos efrina A (por ejemplo EFA4 y EFNA1 ) o los seis ligandos efrina A. Más particularmente, como se describe en la presente y se expone más abajo en los ejemplos, los moduladores preferidos, tales como anticuerpos, se pueden generar y seleccionar de tal manera que reaccionen o se unan con dominios o epítopes expresados en un solo ligando efrina A, o con epítopes que están conservados (por lo menos en cierta medida) y se presentan entre muchos polipéptidos EFNA o todos ellos (por ejemplo EFNAs 1 y 4, o EFNAs 3 y 4). Esto es significativo con respecto a la presente invención, ya que como se muestra en el ejemplo 18 más abajo, se ha encontrado que algunos ligandos efrina A son expresados preferiblemente sobre TIC y, en combinación, pueden servir como blancos terapéuticos particularmente eficaces que proveen una reducción selectiva de la frecuencia de células tumorigénicas y/o agotamiento de las poblaciones de células madre de cáncer.
Por lo tanto, en una modalidad seleccionada, la invención comprende un pan-modulador de EFNA que se asocia inmunoespecíficamente con dos o más ligandos efrina A. En estas modalidades, el modulador seleccionado puede ser generado por medio de inmunización con un ligando particular (por ejemplo, EFNA4) y asociarse o reaccionar cruzadamente con los diversos ligandos sujetos a un mayor o menor grado. Por consiguiente, en otras modalidades, la presente invención comprende un método de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un pan-modulador de EFNA. Otras modalidades comprenden un método de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de EFNA que se asocia inmunoespecíficamente con uno o más ligandos efrina A.
Por consiguiente, en otras modalidades, la presente invención comprenderá un pan-modulador de EFNA. En otras modalidades más, la presente invención comprenderá un método de tratamiento de un trastorno asociado con EFNA en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende el paso de administrar un pan-modulador de EFNA a dicho sujeto.
Desde luego, se apreciará que los moduladores de EFNA descritos pueden ser generados, fabricados y/o seleccionados para reaccionar o asociarse preferiblemente con un solo ligando efrina A (por ejemplo, EFNA4), y exhibir asociación nula o mínima con cualquier otro ligando efrina A. Por consiguiente, otras modalidades de la invención están dirigidas a moduladores de EFNA que se asocian inmunoespecíficamente con un ligando efrina A seleccionado y exhiben poca o ninguna asociación con cualquier otro ligando efrina A. A este respecto, las modalidades preferidas descritas en la presente comprenderán métodos de tratamiento de un trastorno asociado con EFNA en un sujeto en necesidad del mismo, que comprenden el paso de administrar un modulador de EFNA en donde el modulador de EFNA se asocia inmunoespecíficamente con un ligando efrina A seleccionado, y es sustancialmente no reactivo con ningún otro ligando efrina A. Además, los métodos de generación, fabricación y selección de estos moduladores están dentro del alcance de la presente invención.
Otras facetas de la presente invención aprovechan la capacidad de los moduladores descritos para interrumpir potencialmente las interacciones de adhesión de las células, silenciando simultáneamente las células que inician tumores. Estos moduladores de EFNA (por ejemplo, antagonistas de EFNA) multiactivos pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en combinación con los agentes anticancerosos o agentes de extirpación del estándar de atención. Además, de acuerdo con las presentes enseñanzas se pueden usar en combinación dos o más antagonistas de EFNA (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a dos epítopes distintos sobre un ligando efrina A, o que se asocian con ligados distintos). Más aún, como se expone abajo en cierto detalle, los moduladores de EFNA de la presente invención se pueden usar en un estado conjugado o no conjugado, y opcionalmente como agente de sensibilización en combinación con una variedad de agentes anticancerosos químicos o biológicos.
De esta manera, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método de sensibilización de un tumor en un sujeto para tratamiento con un agente anticanceroso, que comprende el paso de administrar un modulador de EFNA a dicho sujeto. En un aspecto particularmente preferido de la invención, el modulador de EFNA reducirá específicamente la frecuencia de las células que inician tumores, determinada usando análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo, sensibilizando así el tumor para su extirpación concomitante o subsiguiente.
Similarmente, como los compuestos de la presente invención pueden ejercer beneficios terapéuticos por medio de varios mecanismos fisiológicos, la presente invención también está dirigida a efectores o moduladores seleccionados que se fabrican específicamente para aprovechar algunos procesos celulares. Por ejemplo, en algunas modalidades el modulador preferido se puede diseñar por ingeniería para asociarse con EFNA en o cerca de la superficie de la célula iniciadora de tumor y estimular la respuesta inmune del sujeto. En otras modalidades, el modulador puede comprender un anticuerpo dirigido a un epítope, que neutraliza la actividad del ligando efrina A e interacciona con los receptores de efrina que pueden tener un impacto sobre las fuerzas de adhesión y repulsión entre las células por medio de reordenamientos de integrina y citoesqueleto. En otras modalidades más, los moduladores descritos pueden actuar agotando o eliminando las células asociadas con EFNA. Por lo tanto, es importante apreciar que la presente invención no está limitada a cualquier modo de acción particular, sino que más bien abarca cualquier método o modulador de EFNA que logre el resultado deseado.
En este marco, las modalidades preferidas de las modalidades descritas están dirigidas a un método de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno neoplásico, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un modulador de EFNA neutralizante.
Otras modalidades están dirigidas a un método de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno asociado con EFNA, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un modulador de EFNA de agotamiento. Un método relacionado está dirigido a agotar células asociadas con EFNA en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende el paso de administrar un modulador de EFNA.
En otra modalidad, la presente invención provee métodos de terapia de mantenimiento en donde los efectores o moduladores descritos se administran durante un periodo después de un procedimiento inicial destinado a eliminar por lo menos una porción de la masa tumoral (por ejemplo, quimioterapia, radiación o cirugía). Estos regímenes terapéuticos se pueden administrar durante un periodo de semanas, un periodo de meses, o incluso un periodo de años, en donde los moduladores de EFNA pueden actuar profilácticamente para inhibir la metástasis y/o la reaparición del tumor. En otras modalidades los moduladores descritos se pueden administrar en concierto con regímenes de extirpación conocidos para prevenir o retardar la metástasis.
Además de los usos terapéuticos expuestos más arriba también se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden usar para diagnosticar trastornos relacionados con EFNA y en particular trastornos hiperproliferativos. En algunas modalidades el modulador se le puede administrar al sujeto, y se puede detectar o monitorear in vivo. Los expertos en la materia apreciarán que estos moduladores se pueden marcar o asociar con marcadores o reporteros como se describe abajo, y se pueden detectar usando cualquiera de varias técnicas estándares (por ejemplo, MRI o exploración CAT). En otros casos los moduladores se pueden usar en una situación de diagnóstico in vitro usando los procedimientos reconocidos. Por lo tanto, una modalidad preferida comprende un método de diagnóstico de un trastorno hiperproliferativo en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende los pasos de: a. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto; b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de EFNA; y c. detectar o cuantificar el modulador de EFNA asociado con la muestra.
Estos métodos pueden ser distinguidos fácilmente en conjunto con la presente solicitud y se pueden efectuar fácilmente usando la tecnología comercial generalmente disponible, tal como lectoras de placa automáticas, sistemas de reportero dedicados, etc. En modalidades seleccionadas, el modulador de EFNA se asociará con células que perpetúan tumores presentes en la muestra. En otras modalidades preferidas, el paso de detección o cuantificación comprenderá una reducción de la frecuencia de las células que inician tumores y la detección de la misma. Además, se puede efectuar el análisis de dilución limitativa como se mencionó anteriormente, y preferiblemente se usará estadística de distribución de Poisson para proveer un conteo exacto de la reducción de frecuencia.
En una línea similar, la presente invención también provee kits que son útiles en el diagnóstico y monitoreo de trastornos asociados con EFNA, tales como el cáncer. Para este fin, la presente invención provee preferiblemente un artículo de fabricación útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con EFNA, que comprende un receptáculo que comprende un modulador de EFNA y materiales de instructivo para usar dicho modulador de EFNA para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con EFNA.
Otras modalidades preferidas de la invención también aprovechan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, aislar, dividir o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células que inician tumores, por medio de métodos tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o división mediada por láser.
Por lo tanto, otra modalidad preferida de la presente invención está dirigida a un método de identificación, aislamiento, división o enriquecimiento de una población de células que inician tumores, que comprende el paso de poner en contacto dichas células que inician tumorescon un modulador de EFNA.
Lo anterior es un sumario y contiene así, por necesidad, simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; consecuentemente, los expertos en la materia apreciarán que la breve descripción es únicamente ilustrativa y de ningún modo limitativa. Otros aspectos, características y ventajas de los métodos, composiciones y/o dispositivos, y/u otra materia descrita en la presente, se harán evidentes de las enseñanzas expuestas en la presente. La breve descripción se provee para introducir una selección de conceptos de forma simplificada que se describen adicionalmente más abajo en la Descripción Detallada. Esta breve descripción no está destinada a identificar características clave o características esenciales de la materia reclamada, ni está destinada para usarse como una ayuda en la determinación del alcance de la materia reclamada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1C representan, respectivamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica EFNA4 humano (SEQ ID NO:1), la secuencia de aminoácidos correspondiente de la isoforma a de EFNA4 (SEQ ID NO: 2), y una alineación de las secuencias de las isoformas a, b y c de EFNA4 que muestra diferencias de aminoácidos (SEQ ID NOs: 2-4); mientras que las figuras 1 D-1 F representan, respectivamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica EFNA1 humano (SEQ ID NO: 5), la secuencia de aminoácidos correspondiente de la isoforma a de EFNA1 humano (SEQ ID NO: 6), y una alineación de las secuencias de las isoformas a y b de EFNA1 que muestra diferencias de aminoácidos (SEQ ID NOs: 6 y 7).
Las figuras 2A y 2B son representaciones gráficas que representan el grado de expresión genética de ligandos efrina A humana y receptores de efrina A seleccionados en ratones no tratados (figura 2A) y tratados con irinotecan (figura 2B), medido usando secuenciación del transcriptoma completo de poblaciones de células progenitoras de tumor altamente enriquecidas (TProg) y células que perpetúan tumores (TPC), y células no tumorigénicas (NTG), obtenidas de un subgrupo de especímenes de tumor colorrectal completo.
Las figuras 3A y 3B son representaciones gráficas que representan el grado de expresión genética del ligando efrina A4 humana en muestras de tumor colorrectal (figura 3A) y muestras de tumor pancreático (figura 3B), medido usando secuenciación del transcriptoma completo de poblaciones de células progenitoras de tumor altamente enriquecidas (TProg) y células que perpetúan tumores (TPC) y poblaciones de células no tumorigénicas (NTG), o poblaciones de células tumorigénicas (TG) y no tumorigénicas (NTG).
La figura 4 es una representación gráfica que muestra el grado relativo de expresión genética de EFNA4 humano en poblaciones de células progenitoras de tumor altamente enriquecidas (TProg) y células que perpetúan tumores (TPC), obtenidas de ratones que llevan una de cuatro líneas diferentes de células de tumor colorrectal o pancreático de xenoinjerto no tradicional (NTX), y normalizado contra poblaciones de células enriquecidas no tumorigénicas (NTG), medido usando RT-PCR cuantitativa.
Las figuras 5A y 5B son representaciones gráficas que muestran el grado relativo de expresión genética de EFNA4 humano, medido usando RT-PCR en especímenes de tumor colorrectal completo de pacientes con la enfermedad en etapa l-IV, normalizado contra la media de expresión en tejido normal del colon y recto (figura 5A) o igualado con el tejido adyacente normal (figura 5B).
Las figuras 6A-6E representan el grado de expresión genética de genes EFNA humanos, medido para EFNA4 en las figuras 6A y 6B por medio de RT-PCR en especímenes de tumor completo (punto gris) o NAT-igualados (puntos blancos), en pacientes con uno de dieciocho tipos diferentes de tumor sólido; en las figuras 6C y 6D por medio de RT-PCR para EFNA4 y EFNA1 en líneas de células de tumor NTX seleccionadas; y por medio de análisis de Western blot en la figura 6E para EFBA4 en tejido normal y líneas de células de tumor NTX seleccionadas.
Las figuras 7A-7Q representan las secuencias de varios moduladores de EFNA; las figuras 7A-7M proveen las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y ligera murinas para los mismos moduladores expuestos en el cuadro A; y las figuras 7N-7Q proveen secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y ligera de versiones humanizadas ejemplares de los moduladores de EFNA descritos.
Las figuras 8A-8B exponen las propiedades bioquímicas e inmunológicas de los moduladores ejemplares representados en formato tabular en el cuadro B; en las figuras 8A y 8B se muestra una comparación de la afinidad de SC4.47 murino y SC4.47 humanizado, respectivamente, determinada usando análisis de interacción libre de etiqueta con una cantidad fija de anticuerpo y diluciones seriadas de antígeno; y en el cuadro C se da una comparación tabular de las propiedades de los moduladores humanizados y murinos seleccionados.
La figura 9 ilustra propiedades de unión de superficie celular de cincuenta moduladores ejemplares del ligando efrina A de la presente invención, con respecto a células Jurkat E6 y células Z138, respectivamente.
Las figuras 10A y 10B representan la unión del ligando efrina A a células que expresan receptores de efrina A, de manera dependiente de la dosis (figura 10 A); y la inhibición de la unión a la superficie celular del ligando efrina A por medio de exposición a los moduladores ejemplares descritos (figura 10B).
Las figuras 11A-11 D son representaciones gráficas que ilustran la capacidad de los moduladores descritos para inhibir la unión a la superficie celular del ligando efrina A humano y murino, en donde la figura 11A muestra curvas de control positivo y las figuras 11 B-11D muestran la capacidad de tres moduladores de EFNA ejemplares para reducir la unión del ligando.
Las figuras 12A-12E son representaciones gráficas que muestran la capacidad de los moduladores de la presente invención para inhibir la unión a la superficie celular del receptor soluble de efrina A, en donde la figura 12A provee una curva patrón de la unión del receptor; la figura 12B ilustra las propiedades de moduladores ejemplares conforme varía la concentración del receptor soluble; la figura 12C muestra las consecuencias de la variación de la concentración del modulador mientras se mantiene estable la cantidad de receptor ; y las figuras 12D y 12E muestran la capacidad de los moduladores para inhibir la unión del receptor de efrina A al ligando efrina A4 y efrina A1 , respectivamente.
Las figuras 13A-13C ilustran la capacidad de moduladores seleccionados de la presente invención para reaccionar cruzadamente con el ligando efrina A4 ortólogo de ratón, en donde la figura 13A ilustra un modulador no reactivo y las figuras 13B y 13C ilustran moduladores murinos y humanizados, respectivamente, que reaccionan cruzadamente.
Las figuras 14A-14D muestran que la expresión del ligando efrina A es regulada positivamente en muestras de tumor colorrectal completo (figura 14A) y en la subpoblación tumorigénica de células de tumor colorrectal NTX (figura 14B), y en la subpoblación tumorigénica de una línea de células de pulmón NTX (figura 14D), pero no en células mononucleares normales de sangre periférica (figura 14C).
Las figuras 15A-15D ilustran la capacidad de moduladores seleccionados de la presente invención para internarse tras la unión con los ligandos efrina A, en donde la figura 15A muestra la desviación fluorescente asociada con tres moduladores ejemplares; la figura 15B muestra que diecinueve moduladores descritos exhiben una delta de intensidad fluorescente media indicativa de ¡nternamiento; la figura 15C muestra relativamente poco ¡nternamiento en células con expresión baja de EFNA; y la figura 15D muestra ¡nternamiento sustancial con respecto a las células que expresan altos niveles de EFNA.
Las figuras 16A-16F proveen evidencia de que los moduladores descritos se pueden usar eficientemente como porciones de direccionamiento para dirigir cargas citotóxicas útiles a células que expresan los ligandos efrina A, en donde la curva con pendiente descendente es indicativa de la destrucción celular por medio de ¡nternamiento, y en donde la figura 16A muestra los efectos destructores del modulador SC4.5; la figura 16B ¡lustra la capacidad de moduladores seleccionados para internarse y destruir las líneas de células de tumor de pulmón y piel NTX; las figuras 16C y 16D muestran que los moduladores llevan una citotoxina asociada en las células HEK293T (figura 16C) y células HEK-.hEFNA4 (figura 16D); la figura 16E ilustra que los moduladores humanizados reaccionan similarmente; y la figura 16F muestra la destrucción de las células blanco que expresan el ligando efrina A de ratón o humano (es de notar que en todas las figuras 16A-16F los moduladores pueden denominarse E en vez de SC4).
Las figuras 17A-17E son representaciones gráficas de varios aspectos de una prueba bioquímica que muestra la capacidad de los moduladores descritos para detectar el ligando efrina A seleccionado, en donde la figura 17A provee una curva patrón; la figura 17B cuantifica la cantidad secretada de EFNA de los tumores hematológicos seleccionados; la figura 17C presenta una correlación entre el volumen del tumor y EFNA secretado; la figura 17D establece una extensión del ligando efrina A en circulación en adultos sanos; y la figura 17E muestra que los pacientes con tumores sólidos seleccionados tienen niveles significativamente más altos del ligando efrina A en circulación.
Las figuras 18A-18C son representaciones gráficas que ilustran que varios moduladores del ligando efrina A se pueden usar como porciones de direccionamiento para asociar cargas citotóxicas útiles con células seleccionadas, en donde la curva de pendiente descendente es indicativa de la destrucción celular por medio de la toxina internada, y en donde las figuras 18A-18C muestran específicamente la capacidad de los moduladores SC4.2.1 (o E2.1) y SC9.65 (o 9M065) para mediar la destrucción de células HEK293T que sobreexpresan el ligando efrina A4 (figura 18A), el ligando efrina A3 (figura 18B) y el ligando efrina A1 (figura 18C), en presencia de saporina enlazada.
Las figuras 19A y 19B ilustran la capacidad de los ligandos efrina A para interaccionar selectivamente con muchos receptores de EPHA, en donde las células HEK293T se unen solo a construcciones de receptor EPHA-ECD-Fc mediante los ligandos efrina A expresados endógenamente en un grado limitado (figura 19A), mientras que las células HEK293T.hÉFNA4 se unen a todas las construcciones probadas del receptor de EPHA en varios grados, excepto EPHA1 que no se une (figura 19B).
Las figuras 20A y 20B ilustran la capacidad de los ligandos efrina A para interaccionar selectivamente con los receptores de EPHB, en donde las células HEK293T se unen solo a construcciones de receptor EPHB-ECD-Fc mediante los ligandos efrina A expresados endógenamente en un grado limitado (figura 20A), mientras que las células HEK293T.hEFNA4 se unen a los receptores EphB2 pero no a EphB3 ni EphB4 (figura 20B).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Introducción Aunque la presente invención se puede poner en práctica en muchas formas diferentes, se describen aquí modalidades ilustrativas específicas de la misma que ejemplifican los principios de la invención. Se debe hacer énfasis en que la presente invención no se limita a las modalidades específicas ilustradas. Además, cualquier encabezado de sección usado en la presente es únicamente para fines de organización y no está concebido como limitación de la materia descrita.
Como se mencionó anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que la expresión de los ligandos efrina A (o EFNA) está asociada con crecimiento neoplásico y trastornos hiperproliferativos, y que estos ligandos proveen marcadores de tumor útiles que se pueden aprovechar en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Más específicamente, se ha descubierto que los moduladores de EFNA, como los que se describen en la presente, se pueden usar convenientemente en la diagnosis, teragnosis, tratamiento o prevención de trastornos neoplásicos en los sujetos en necesidad de lo mismo. Por consiguiente, aunque más abajo se expondrán extensamente modalidades preferidas de la invención, particularmente en el contexto de células madre de cáncer y sus interacciones con los moduladores descritos, los expertos en la materia apreciarán que el alcance de la presente invención no está limitado por estas modalidades ejemplares. En vez de eso, la presente invención y las reivindicaciones anexas están dirigidas amplia y expresamente a moduladores de EFNA y su uso en la diagnosis, teragnosis, tratamiento o prevención de una variedad de trastornos asociados o mediados por EFNA, que incluyen trastornos neoplásicos o hiperproliferativos, sin tener en cuenta cualquier mecanismo de acción particular o componente de tumor alcanzado específicamente.
Se apreciará adicionalmente que, a diferencia de muchas descripciones de la técnica anterior, la presente invención está dirigida principalmente a moduladores del ligando efrina (es decir, EFN) en vez de moduladores del receptor de efrina (es decir, EPH). Esto es, aunque los receptores de efrina se han implicado ampliamente en varios tipos de trastornos y generalmente se han hecho el blanco para intervención terapéutica, hasta ahora los ligandos efrina han atraído mucho menos atención. En parte, esto puede ser el resultado del comportamiento promiscuo atribuido a los ligandos y la creencia inapropiada de que tales interacciones variadas los hacen blancos terapéuticos insostenibles, ya que la redundancia de ruta probablemente compensaría cualquier antagonismo de ligando. Sin embargo, como se muestra en la presente, los moduladores del ligando efrina A descritos se pueden usar eficientemente para hacer blanco en células tumorigénicas y eliminarlas o incapacitarlas de otro modo. Además, en modalidades seleccionadas, la presente invención comprende pan-moduladores de EFNA que se asocian o reaccionan con más de un ligando efrina A, suministrando así un efecto aditivo o sinérgico inesperado que puede permitir la quiescencia de más de una ruta mediada por el ligando efrina.
Además de la asociación general expuesta inmediatamente arriba, los inventores han descubierto además una asociación fenotípica hasta ahora desconocida entre "células que inician tumores" (TIC) seleccionadas y los ligandos efrina A. A este respecto, se ha encontrado que TICs seleccionadas expresan niveles elevados de los ligandos efrina A en comparación con las células de tejido normal y no tumorigénicas (NTG), que juntas comprenden mucho de un tumor sólido. De esta manera, los ligandos efrina A comprenden marcadores (o antígenos) asociados con tumor, y se ha encontrado que proveen agentes eficaces para la detección y supresión de las TIC y el neoplasma asociado, debido a niveles elevados de las proteínas sobre las superficies celulares o en el microambiente del tumor. Más específicamente, se ha descubierto que los moduladores de EFNA, que incluyen antagonistas inmunorreactivos y anticuerpos que se asocian o reaccionan con las proteínas, reducen eficientemente la frecuencia de las células que inician tumores y por lo tanto son útiles para eliminar, incapacitar, reducir, promover la diferenciación, u obstruir o limitar de otra manera la capacidad de estas células que inician tumores para permanecer latentes y/o continuar alimentando el crecimiento del tumor, la metástasis o reaparición en un paciente. Como se expone abajo en más detalle, la subpoblación de células de tumor TIC está compuesta tanto decélulas que perpetúan tumores (TPC) como de células progenitoras de tumor altamente proliferativas(TProg).
En vista de estos descubrimientos, los expertos en la materia apreciarán que la presente invención provee además moduladores de EFNA y su uso en la reducción de la frecuencia de células que inician tumores. Como se expondrá extensamente más abajo, los moduladores de EFNA de la invención comprenden ampliamente cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, sea antagonista de, interaccione con, se una a, sea agonista de, o se asocie con, un ligando efrina A o su gen. Mediante estas interacciones, los moduladores de EFNA reducen o moderan la frecuencia de las células que inician tumores. Los moduladores ejemplares descritos en la presente comprenden nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. En algunas modalidades preferidas los moduladores seleccionados comprenderán anticuerpos para un EFNA, o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. Estos anticuerpos pueden tener la naturaleza de antagonista o agonista y opcionalmente pueden estar conjugados o asociados con un agente citotóxico. En otras modalidades, los moduladores en la presente invención comprenderán una construcción de EFNA que comprende un ligando efrina A o un fragmento reactivo del mismo Se apreciará que estas construcciones pueden comprender proteínas de fusión y pueden incluir dominios reactivos de otros polipéptidos, tales como inmunoglobulinas o modificadores de la respuesta biológica. En otros aspectos, el modulador de EFNA comprenderá un ensamble de ácido nucleico que ejerce los efectos deseados en el ámbito genómico. Otros moduladores compatibles con las presentes enseñanzas se expondrán en detalle más abajo.
Cualquiera que sea la forma de modulador seleccionada finalmente, esta estará de preferencia en un estado aislado y purificado antes de su introducción en un sujeto. A este respecto, el término "modulador de EFNA aislado" se debe contemplar en un sentido amplio y de acuerdo con la práctica farmacéutica normal para dar a entender cualquier preparación o composición que comprende el modulador en un estado sustancialmente libre de contaminantes no deseados (biológicos o de otro tipo). Como se expone abajo en cierto detalle, estas preparaciones se pueden purificar y formular a voluntad usando varias técnicas reconocidas. Desde luego, se apreciará que estas preparaciones "aisladas" se pueden formular o combinar intencionalmente con ingredientes inertes o activos a voluntad para mejorar el aspecto comercial, de fabricación o terapéutico del producto terminado, y proveer composiciones farmacéuticas.
II. Fisiología del EFNA Las tirosina cinasas receptoras de efrina (EPH), proteínas de transmembrana de tipo I, comprenden la familia más grande de tirosina cinasas receptoras dentro de los genomas de animal, e interaccionan con los ligandos efrinas (EFN) que también están asociados con la superficie celular. Los receptores de la subfamilia de EPH típicamente tienen un solo dominio de cinasa y una región extracelular que contiene un dominio rico en Cys y 2 repeticiones de fibronectina de tipo III. La costumbre sostiene que los receptores de efrina se dividen en dos grupos basándose en la similitud de sus secuencias de dominio extracelular y sus afinidades para unirse a los ligandos efrina A y efrina B. Investigación previa ha mostrado que los eventos de señalización mediados por EPH controlan muchos aspectos del desarrollo embrionario, particularmente en el sistema nervioso, y son mediadores importantes de la comunicación célula-célula que regula la fijación, forma y movilidad de la célula. Además, muchos miembros de la familia de receptores de efrina, a diferencia de los ligandos efrina, han sido identificados como marcadores y/o reguladores importantes del desarrollo y avance del cáncer. A la fecha se conocen nueve receptores de efrina A y seis receptores de efrina B.
Para los fines de la presente solicitud, los términos "receptor de efrina", "receptor de efrina A", "receptor de efrina B", ????," o "EPHB" (o EphA o EphB) se pueden usar intercambiablemente y significan la familia, subfamilia o receptor individual especificados (es decir, EPHA1 , EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHB1 , EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6), según el contexto.
Basándose en análisis de secuencia, los ligandos efrina se pueden dividir en dos grupos: seis ligandos efrina A (o EFNA), típicamente anclados a la superficie celular mediante enlaces de glicosilfosfatidilinositol (aunque algunas proteínas no ancladas a GPI son producidas por medio de empalme alternativo de ARNms de efrina; por ejemplo, EFNA4), y tres ligandos efrina B (o EFNB) que contienen un dominio de transmembrana y una región citoplásmica corta con residuos de tirosina conservados y un motivo de unión de PDZ. Los ligandos EFNA interaccionan preferiblemente con cualquiera de los nueve receptores de EPHA diferentes, mientras que los ligandos EFNB interaccionan preferiblemente con cualquiera de seis receptores de EPHB diferentes, aunque se han reportado algunas interacciones cruzadas específicas de EFNA-EPHB y EFNB-EPHA.
Para los fines de la presente solicitud, los términos "ligando efrina", "ligando efrina A", "ligando efrina B", "EFNA" o "EFNB" se pueden usar intercambiablemente y significan la familia, subfamilia o receptor individual especificados (es decir, EFNA1 , EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNA6, EFNB1 , EFNB2, EFNB3), según el contexto. Por ejemplo, los términos "efrina A4", "ligando efrina A4" o "EFNA4" designarán todos la misma familia de isoformas de proteína (por ejemplo, como se indica en la figura 1C), mientras que los términos "ligando efrina A" y "EFNA" significarán la subfamilia de efrina (es decir, A en lugar de B) que comprende los seis ligandos de tipo A y cualquier isoforma de los mismos. A este respecto, un "modulador de efrina A", "modulador de ligando efrina A" o "modulador de EFNA" significa cualquier modulador (como se define en la presente) que se asocia, se une o reacciona con uno o más ligandos o isoformas de tipo A, o fragmentos o derivados de los mismos.
Un sumario más detallado de la nomenclatura de receptor y ligando de efrina se puede encontrar en el cuadro 1 que se da inmediatamente a continuación.
CUADRO 1 Eph Nomenclature Committee, Cell. 1997; 90 (3):403-4, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Como con todas las interacciones receptor de superficie celular -ligando, el acoplamiento del receptor de efrina por medio de un ligando efrina resulta finalmente en la activación de cascadas de señalización intracelulares. Aunque las interacciones receptor-ligando pueden ocurrir entre las moléculas sobre la superficie de la misma célula (interacciones cis), generalmente se piensa que las interacciones cis no llevan a la activación de las cascadas de señalización, o que las interacciones cis realmente pueden antagonizar las cascadas de señalización iniciadas por interacciones trans (por ejemplo, entre receptores y ligandos sobre células separadas). Un aspecto único de las interacciones EPH-EFN trans es la capacidad de activación de dos cascadas de señalización tras el acoplamiento receptor-ligando -una cascada de señalización hacia delante en la célula que expresa el receptor de efrina, y una cascada de señalización inversa en la célula que expresa el ligando efrina. La activación de dos cascadas de señalización separadas puede reflejar procesos de clasificación de célula y posicionamiento de célula que han evolucionado EPH y EFN para coordinarse en el desarrollo embrionario animal.
La señalización EPH-EFN activa frecuentemente rutas de señalización celular que regulan la dinámica citoesquelética y llevan a la modulación de las interacciones de adhesión y repulsión entre diferentes tipos de células. Como una generalización, las proteínas EPH y EFN se encuentran en cantidades mucho más altas durante la embriogénesis en comparación con las observadas en tejidos de adulto, aunque la continuación de un grado bajo de expresión en el adulto puede reflejar funciones de estas moléculas en la función normal de tejidos tales como el intestino del adulto, que tiene una arquitectura bien definida originada de la migración de células de diferenciación desde su fuente en la célula madre tisular en la cripta hasta su sitio final en la superficie de la vellosidad frente al lumen intestinal. Puesto que los receptores de efrina primero se identificaron en carcinomas hepatocelulares, y la expresión de EPH y EFN típicamente está limitada en los adultos, la reactivación de la expresión de los ligandos efrina y/o receptores de efrina en el cáncer humano puede ser ligada a la desdiferenciación de las células de cáncer y/o la capacidad de estas células de cáncer a invadir el tejido normal circundante y a emigrar del sitio del tumor primario a sitios distantes. Otros estudios han sugerido que las interacciones EPH-EFN también tienen una función en la neoangiogénesis.
De manera consistente con los hallazgos de que las interacciones EPH-EFN en tejidos no linfoides regulan interacciones celulares generando fuerzas de adhesión o repulsión entre las células por medio de reordenamiento de integrina y citoesqueleto, se ha mostrado que las moléculas de EPH y EFN encontradas sobre las células linfoides median la adhesión de la célula a componentes de matriz extracelulares, quimiotaxis y migración de la célula. Por ejemplo, se ha encontrado que el acoplamiento de EFNA1 (que se une al receptor EphA2 y comprende, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como la del registro NM_004428 de Genbank) sobre células T CD4 y CD8, estimula la migración de la célula e incrementa la quimiotaxis. Como EFNA1, EFNA4 es expresado sobre células T CD4 primarias pero, debido a la promiscuidad de la interacción EPH-EFN, no queda claro si el acoplamiento de EFNA4 tiene efectos similares sobre estas células. Sin embargo, se ha mostrado que los linfocitos B humanos maduros expresan EFNA4 y lo secretan después de activación. Además, EFNA4, a diferencia de cualquier otra molécula de EFN o EPH, también es expresado consistentemente sobre, o por células B, de pacientes de leucemia linfocítica crónica (CLL). De manera interesante, la expresión de isoformas de EFNA4 medida por Q-PCR puede ser correlacionada con la manifestación clínica de la enfermedad. También, las células B de pacientes de CLL, que se sabe que tienen una mayor expresión de EFNA4, mostraron un deterioro del potencial de migración transendotelial en comparación con las células B de individuos sanos. Aparentemente el acoplamiento de EFNA4 redujo la capacidad de las células CLL para adherirse a las moléculas de matriz extracelular y redujo su respuesta quimiotáctica a CCL1. Juntos, estos informes sugieren una función de EFNA4 en el tráfico de células B y T y, cuando se observan en combinación con los datos de señalización intracelular expuestos arriba, hacen a los ligandos efrina A, y en particular a EFNA4, blancos muy interesantes para el desarrollo de terapias anticancerosas.
Además de las características anteriormente mencionadas, la presente descripción muestra que la expresión de EFNA4 está elevada en varias poblaciones de células madre de cáncer. Junto con la regulación positiva concomitante de varios receptores de EPHA en la masa de tumor, esto eleva la posibilidad de que interacciones ligando-receptor mediadas por EFNA4 pueden estar activando cascadas de señalización de célula ligadas a la proliferación de tumor, neoangiogénesis y/o metástasis de tumor. Aunque no se desea limitarse por alguna teoría particular, se cree que los moduladores de EFNA4 de la presente invención (particularmente las modalidades antagónicas o neutralizantes) actúan, por lo menos en parte, reduciendo o eliminando la frecuencia de las células que inician tumores, alterando así la propagación o supervivencia del tumor, de manera diferente de los regímenes terapéuticos del estándar de atención tradicional (por ejemplo, irinotecan), o por medio de señalización inmunoterapéutica o suministro de una carga útil capaz de destruir las células que expresan EFNA4. Por ejemplo, la eliminación de TPC por antagonismo de EFNA4 puede incluir simplemente promover la proliferación celular a pesar de los regímenes quimioterapéuticos que eliminan las células en proliferación, o promueven la diferenciación de TPC de tal manera que se pierde su capacidad de autorrenovación (es decir, proliferación ilimitada y mantenimiento de multipotencia). Alternativamente, en modalidades preferidas, el reclutamiento de células T citotóxicas para atacar las células que expresan EFNA4, o el suministro de una toxina potente conjugada con un anticuerpo anti-EFNA4 que es capaz de internarse, puede destruir selectivamente o incapacitar de otra manera la TPC.
Como se usa en la presente, el término EFNA4 (conocido también como ligando de cinasa relacionada con eph 4, LERK4, o ligando de tirosina cinasa receptora relacionada con eph 4, EFL-4) se refiere a EFNA4 humana natural a menos que el contexto lo indique de otra manera. Los ortólogos de proteína EFNA4 representativos incluyen, sin limitación, de humano (es decir, hEFNA4, NP_005218, NP_872631 o NP_872632), ratón (NP_031936), chimpancé (XP_001 153095, XP_001152971 , XP_524893, y XP_001 152916) y rata (NP_001101162). El gen de EFNA4 humano transcrito comprende como mínimo 5817 p.b. del cromosoma 1. Se han descrito tres variantes del transcrito de ARNm, cada uno de los cuales se origina del empalme alternativo del ARN transcrito: (1) una variante de 1276 p.b. (NM_005227; variante 1 del transcrito de EFNA4; SEQ ID NO: 1) que codifica una proproteína de 201 aminoácidos (NP_005218; variante a de EFNA4; SEQ ID NO: 2); (2) una variante de 11 10 p.b. (NM_182689; variante 2 del transcrito de EFNA4) que codifica una proproteína de 207 aminoácidos (NM_872631 ; variante b de EFNA4; SEQ ID NO: 3); y (3) una variante de 1 1 11 p.b. (NM_182690; variante 3 del transcrito de EFNA4) que codifica una proproteína de 193 aminoácidos (NM_872632; variante c de EFNA4; SEQ ID NO: 4). Se apreciará que cada una de las proteínas EFNA4 humanas incluye una secuencia de señal o guía predicha que comprende los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 2, que es cortada para proveer la forma madura de la proteína (es decir, 168-182 aa). Este péptido señal dirige el polipéptido a la superficie celular/ruta secretoria. Debido al empalme alternativo del ARNm, con efectos consecuentes sobre las secuencias codificadoras de proteína, las isoformas de proteína son procesadas diferentemente por la célula -la isoforma a está localizada en la membrana y anclada a la superficie celular por un enlace de glicosilfosfatidilinositol (GPI), mientras que las isoformas b y c carecen de la secuencia de señal de GPI-ancla, y por lo tanto se espera que sean secretadas por la célula. En la figura 1C se muestra una alineación de las tres isoformas de proteína del EFNA4 humano. Como se indicó anteriormente, a menos que sea indicado de otra manera por referencia directa o necesidad en el contexto, el término EFNA4 estará dirigido a la ¡soforma a de EFNA4 humano y sus equivalentes inmunorreactivos. Además, se apreciará que el término también se puede referir a un derivado o fragmento de una forma nativa o variante de EFNA4, que contiene un epítope al cual se puede unir específicamente un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo.
III. Células perpetuadoras de tumor A diferencia de las enseñanzas de la técnica anterior, la presente invención provee moduladores de EFNA que son particularmente útiles para hacer blanco en las células que inician tumores, y especialmente en células que perpetúan tumores, facilitando así el tratamiento, manejo o prevención de los trastornos neoplásicos. Más específicamente, como se indicó anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que subpoblaciones de células de tumor específicas expresan EFNA y probablemente modifican la coordinación localizada de la señalización de morfógeno, importante para la autorrenovación y supervivencia de la célula madre cancerosa. De esta manera, en modalidades preferidas, los moduladores de EFNA se pueden usar para reducir la frecuencia de las células que inician tumores de acuerdo con las presentes enseñanzas, y con ello facilitan el tratamiento o manejo de las enfermedades hiperproliferativas.
Como se usa en la presente, el término célula iniciadora de tumor (TIC) abarca tanto células que perpetúan tumores(TPC; es decir, células madre de cáncer o CSC), como células progenitoras de tumor altamente proliferativas (denominadas TProg), que generalmente comprenden en conjunto una subpoblacion única (es decir, 0.1-40%) de una masa de tumor. Para los fines de la presente descripción, los términos células que perpetúan tumores y células madre de cáncer son equivalentes y se pueden usar aquí intercambiablemente. Inversamente, TPC difiere de TProg en que pueden recapitular completamente la composición de las células de tumor que existen dentro de un tumor, y tienen capacidad de autorrenovación ilimitada como se muestra por el trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de cantidades bajas de células aisladas. Como se expondrá abajo en más detalle, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) usando los marcadores de superficie celular apropiados es un método confiable para aislar subpoblaciones de células altamente enriquecidas (> 99.5% de pureza), debido, por lo menos en parte, a su capacidad de discriminar entre células solas y racimos de células (es decir, dobletes, etc.). Usando estas técnicas se ha mostrado que cuando cantidades bajas de células TProg altamente purificadas son trasplantadas en ratones inmunocomprometidos, pueden alimentar el crecimiento de tumor en un trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas, los tumores generados por TProg no reflejan completamente el tumor progenitor en la heterogeneidad celular fenotípica y son demostrablemente ineficientes para reiniciar la tumorigénesis seriada en trasplantes subsiguientes. En cambio, las subpoblaciones de TPC reconstituyen completamente la heterogeneidad celular de los tumores progenitores y pueden iniciar tumores eficientemente cuando se aislan y trasplantan seriadamente. De esta manera, los expertos en la materia reconocerán que una diferencia definitiva entre TPC y TProg, aunque ambas pueden ser generadoras de tumor en trasplantes primarios, es la capacidad única de TPC de alimentar perpetuamente el crecimiento de tumor heterogéneo tras el trasplante seriado en cantidades bajas de células. Otros enfoques comunes para caracterizar TPC implican la morfología y examen de marcadores de superficie celular, perfil de transcripción y respuesta a los fármacos, aunque la expresión del marcador puede cambiar con las condiciones del cultivo y con el pasaje de la línea celular in vitro.
Por consiguiente, para los fines de la presente invenciónlas células que perpetúan tumores, como las células madre normales que sostienen las jerarquías celulares en el tejido normal, se definen preferiblemente por su capacidad para autorrenovarse indefinidamente manteniendo al mismo tiempo la capacidad de diferenciación de multilinaje. Las células que perpetúan tumores son así capaces de generar tanto progenie tumorigénica (es decir, células que inician tumores: TPC y TProg) como progenie no tumorigénica (NTG). Como se usa en la presente, una célula no tumorigénica (NTG) se refiere a una célula de tumor que se origina de células que inician tumores, pero no tiene por sí sola la capacidad de autorrenovarse o generar los linajes heterogéneos de células de tumor que comprenden un tumor. Experimentalmente, las células NTG son incapaces de formar tumores reproduciblemente en ratones, incluso cuando se trasplantan en cantidades excesivas de células.
Como se indica, las TProg también se clasifican como células que inician tumores (o TIC) debido a su capacidad limitada de generar tumores en los ratones. Las TProg son progenie de TPC y típicamente son capaces de experimentar un número finito de divisiones celulares no autorrenovadoras. Además, las células TProg se pueden dividir en células progenitoras de tumor tempranas (ETP) y células progenitoras de tumor tardías (LTP), cada una de las cuales puede ser distinguida por el fenotipo (por ejemplo, marcadores de superficie celular) y capacidades diferentes para recapitular la arquitectura de la célula de tumor. A pesar de estas diferencias técnicas, tanto ETP como LTP difieren funcionalmente de TPC en que generalmente son menos capaces de reconstituir tumores seriadamente cuando se trasplantan en cantidades bajas de células, y típicamente no reflejan la heterogeneidad del tumor progenitor. A pesar de las distinciones anteriores, también se ha mostrado que varias poblaciones de TProg pueden, en raras ocasiones, ganar la capacidad de autorrenovación atribuida normalmente a las células madre, y por si solas se convierten en TPC (o CSC). En cualquier caso, ambos tipos de células que inician tumores probablemente están representadas en la masa de tumor típica de un solo paciente, y son sujetas de tratamiento con los moduladores descritos en la presente. Esto es, las composiciones descritas generalmente son eficaces para reducir la frecuencia o alterar la quimiosensibilidad de estas células que inician tumores EFNA-positivas sin tomar en cuenta la modalidad particular o mezcla representada en un tumor.
En el contexto de la presente invención, las TPC son más tumorigénicas, relativamente más quiescentes y frecuentemente más quimiorresistentes que las células TProg (tanto ETP como LTP), NTG y las células no derivadas de TPC de infiltración de tumor (por ejemplo, fibroblastos/células de estroma, endoteliales y hematopoyéticas) que comprenden la masa de un tumor. Dado que las terapias y regímenes convencionales han sido diseñadas en gran parte para extirpar tumores y para atacar rápidamente las células proliferativas, probablemente las TPC son más resistentes a las terapias y regímenes convencionales que las TProg y otras poblaciones de células de la masa de tumor que proliferan más rápido. Además, las TPC frecuentemente expresan otras características que las hacen relativamente quimiorresistentes a las terapias convencionales, tales como expresión intensificada de transportadores de multirresistencia farmacológica, mecanismos de reparación de ADN intensificados y proteínas antiapoptóticas. Estas propiedades, cada una de las cuales contribuye a la tolerancia farmacológica presentada por TPC, constituyen una razón clave del fracaso de los regímenes estándares de tratamiento oncológico para asegurar el beneficio a largo plazo para la mayoría de los pacientes con neoplasia de etapa avanzada; es decir, el fracaso para hacer blanco adecuadamente en las células que alimentan el crecimiento continuo y la reaparición del tumor y para erradicarlas.
A diferencia de muchos de los tratamientos de la técnica anterior mencionados anteriormente, las composiciones novedosas de la presente invención preferiblemente reducen la frecuencia de las células que inician tumores tras su administración a un sujeto, sin tomar en cuenta la forma o blanco especifico (por ejemplo, material genético, anticuerpo de EFNA o construcción de fusión de ligando) delmodulador seleccionado. Como se indicó arriba, la reducción de la frecuencia de las células que inician tumores puede ocurrir como resultado de: a) eliminación, supresión, sensibilización, silenciamiento o inhibición de las células que inician tumores; b) control del crecimiento, expansión o reaparición de las células que inician tumores; c) interrupción de la iniciación, propagación, mantenimiento o proliferación de las células que inician tumores; o d) obstrucción de otra manera de la supervivencia, regeneración y/o metástasis de las células tumorigénicas. En algunas modalidades, la reducción de la frecuencia de las células que inician tumores ocurre como resultado de un cambio en una o más rutas fisiológicas. A su vez, el cambio en la ruta, ya sea por reducción o eliminación de las células que inician tumores, o por modificación de su potencial (por ejemplo diferenciación inducida, interrupción de nicho) o alteración de otra manera de su capacidad para ejercer efectos sobre el ambiente tumoral u otras células, permite un tratamiento más eficaz de los trastornos asociados con EFNA inhibiendo la tumorigénesis, el mantenimiento del tumor y/o la metástasis y reaparición.
Entre los métodos que se pueden usar para evaluar dicha reducción de la frecuencia de las células que inician tumores está el análisis de dilución limitativa, ya sea in vitro o in vivo, preferiblemente seguido por conteo usando estadística de distribución de Poisson, o evaluando la frecuencia de eventos definitivos predefinidos, tales como la capacidad para generar tumores in vivo o no. Aunque este análisis de dilución limitativa es el método preferido para calcular la reducción de la frecuencia de las células que inician tumores, también se pueden usar otros métodos menos demandantes para determinar eficientemente los valores deseados, si bien ligeramente menos exactos, y que son completamente compatibles con las enseñanzas de la presente. De esta manera, como será apreciado por los expertos en la materia, también es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia por medio de métodos muy conocidos de citometría de flujo o inmunohistoquímica. En cuanto a todos los métodos anteriormente mencionados, véase por ejemploDylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402, y Hoey et al. 2009, PMID: 19664991 ;que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
Con respecto al análisis de dilución limitativa, el conteo in vitro de la frecuencia de las células que inician tumores se puede realizar depositando células de tumor humanas fraccionadas o no fraccionadas (por ejemplo, de tumores tratados y no tratados, respectivamente) en condiciones de crecimiento in 'íraque fomentan la formación de colonia. De esta manera, las células formadoras de colonia se podrían contar por medio de conteo simple y caracterización de colonias, o por medio de un análisis que consiste, por ejemplo, en el depósito de células de tumor humanas en placas en diluciones seriadas, y calificación de cada cavidad como positiva o negativa para la formación de colonia por lo menos 10 días después de la siembra en las placas. Los experimentos o análisis in vivo de dilución limitativa, que generalmente son más exactos por su capacidad para determinar la frecuencia de las células que inician tumores, abarcan el trasplante de células de tumor humanas, de las condiciones con tratamiento o de control sin tratamiento, por ejemplo, en ratones inmunocomprometidos, en diluciones seriadas, y subsiguientemente calificando cada ratón como positivo o negativo para la formación de tumor por lo menos 60 días después del trasplante. La derivación de los valores de frecuencia de las células por análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo se hace preferiblemente aplicando estadística de distribución de Poisson a la frecuencia conocida de eventos positivos y negativos, suministrando así una frecuencia de eventos que satisfacen la definición de un evento positivo, en este caso, la formación de colonia o tumor, respectivamente.
En cuanto a otros métodos compatibles con la presente invención que se pueden usar para calcular la frecuencia de las células que inician tumores, el más común comprende técnicas de citometría de flujo cuantificable y procedimientos de tinción inmunohistoquímica. Aunque no tan precisos como las técnicas del análisis de dilución limitativa descritas inmediatamente arriba, estos procedimientos son menos laboriosos y proveen valores razonables en un lapso de tiempo relativamente corto. De esta manera, se apreciará que el experto en la materia puede usar una determinación del perfil del marcador de superficie por citometría de flujo, utilizando uno o más anticuerpos o reactivos que se unen a proteínas de superficie celular reconocidas en la técnica, que se sabe que enriquecen las células que inician tumores (por ejemplo, marcadores potencialmente compatibles como se expone abajo en el ejemplo 1 ), y medir así los niveles de TIC de varias muestras. En otro método compatible, el experto en la materia podría contar la frecuencia de TIC in situ (por ejemplo en una sección de tejido) por medio de inmunohistoquímica, usando uno o más anticuerpos o reactivos que son capaces de unirse a proteínas de superficie celular que se piensa delimitan estas células.
Usando cualquiera de los métodos anteriormente mencionados es posible entonces cuantificar la reducción de la frecuencia de TIC (o las TPC en las mismas) producida por los moduladores de EFNA descritos (que incluyen los conjugados con agentes citotóxicos) de acuerdo con las enseñanzas de la presente. En algunos casos, los compuestos de la presente invención pueden reducir la frecuencia de TIC (por medio de una variedad de mecanismos indicados arriba, que incluyen eliminación, diferenciación inducida, interrupción de nicho, silenciamiento, etc.) en 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, o incluso en 35%. En otras modalidades, la reducción de la frecuencia de TIC puede ser del orden de 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%. En algunas modalidades, los compuestos descritos pueden reducir la frecuencia de TIC en 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o incluso 95%. Desde luego, se apreciará que cualquier reducción de la frecuencia de TIC probablemente resulte en una reducción correspondiente en la tumorigenicidad, persistencia, reaparición y agresividad de la neoplasia.
IV. Moduladores de EFNA En cualquier caso, la presente invención está dirigida al uso de moduladores de EFNA, que incluyen antagonistas de EFNA, para el diagnóstico, tratamiento y/o profilaxis de cualquiera de varias malignidades asociadas con EFNA. Los moduladores descritos se pueden usar solos o en conjunto con una amplia variedad de compuestos anticancerosos, tales como agentes quimioterapéuticos o inmunoterapéuticos o modificadores de la respuesta biológica. En otras modalidades seleccionadas, se pueden usar en combinación dos o más moduladores de EFNA distintos para intensificar los efectos antineoplásicos, o se pueden usar para fabricar construcciones multiespecíficas.
En algunas modalidades, los moduladores de EFNA de la presente invención comprenderán nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. Muy preferiblemente, los moduladores comprenderán EFNA soluble (sEFNA) o una forma, variante, derivado o fragmento del mismo, que incluye, por ejemplo, construcciones de fusión de EFNA (por ejemplo EFNA-Fc, EFNA-porción de direccionamiento, etc.) o conjugados de EFNA (por ejemplo, EFNA-PEG, EFNA-agente citotóxico, EFNA-brm, etc.). También se apreciará que, en otras modalidades, los moduladores de EFNA comprenden anticuerpos (por ejemplo, mAbs anti-EFNA1 o anti-EFNA4) o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos neutralizantes, o derivados o fragmentos de los mismos. En otras modalidades, los moduladores de EFNA pueden comprender anticuerpos de internamiento o fragmentos de los mismos. En otras modalidades, los moduladores de EFNA pueden comprender anticuerpos de agotamiento o fragmentos de los mismos. Además, como con las construcciones de fusión anteriormente mencionadas, estos anticuerpos moduladores se pueden conjugar, enlazar o asociar de otra manera con agentes citotóxicos seleccionados, polímeros, modificadores de la respuesta biológica (BRMs) o similares, para proveer inmunoterapias directas con varios (y opcionalmente múltiples) mecanismos de acción. Como se menciona arriba, estos anticuerpos pueden ser pan-anticuerpos EFNA y se pueden asociar con dos o más ligandos efrina A, o anticuerpos inmunoespecíficos que reaccionan selectivamente con uno de los seis ligandos efrina A. En otras modalidades, los moduladores pueden operar genéticamente y pueden comprender compuestos como construcciones de antisentido, ARNci, micro-ARN, etc.
Basándose en las enseñanzas de la presente, los expertos en la materia apreciarán que las modalidades particularmente preferidas de la invención pueden comprender sEFNA4 o sEFNAl , o moduladores de anticuerpo que se asocian con cualquiera de EFNA4 o EFNA1, o ambos.
Se apreciará que los moduladores de EFNA descritos pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, propagación o supervivencia de las células de tumor, particularmente TPC, y/o la neoplasia asociada por medio de una variedad de mecanismos que incluyen acción agonista o antagonista sobre rutas seleccionadas, o eliminación de células específicas, dependiendo por ejemplo de la forma del modulador EFNA, cualquier carga útil o dosificación asociada y método de suministro. Por consiguiente, aunque las modalidades preferidas descritas en la presente están dirigidas al agotamiento, inhibición o silenciamiento de subpoblaciones de células de tumor específicas, tales como células que perpetúan tumores, se debe hacer énfasis en que dichas modalidades son únicamente ilustrativas y no limitativas en modo alguno. En vez de ello, como se expone en las reivindicaciones anexas, la presente invención está dirigida ampliamente a moduladores de EFNA y a su uso en el tratamiento, manejo o profilaxis de varios trastornos hiperproliferativos asociados con EFNA, sin importar el mecanismo particular ni la población de células tumorales blanco.
En el mismo sentido, las modalidades descritas de la presente invención pueden comprender uno omás antagonistas de EFNA. Para ese fin, se apreciará que los antagonistas de EFNA de la presente invención pueden comprender cualquier ligando, polipéptido, péptido, proteína de fusión, anticuerpo, o fragmento o derivado inmunológicamente activo del mismo, que reconoce, reacciona, se une, se combina, compite, se asocia, o interacciona de otra manera con, la proteína EFNA o fragmento de la misma, y elimina, silencia, reduce, inhibe, obstruye, restringe o controla el crecimiento de las células que inician tumores u otras células neoplásicas que incluyen la masa del tumor o células NTG. En modalidades seleccionadas, el modulador de EFNA comprende un antagonista de EFNA.
Como se usa en la presente, un antagonista se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abolir, reducir o alterar las actividades de una proteína particular o especificada, que incluyen la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con substratos. Más generalmente, los antagonistas de la invención pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión de antígeno o derivados de los mismos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, construcciones de antisentido, ARNci, micro-ARN, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y traducción, etc. Los antagonistas también pueden incluir inhibidores de molécula pequeña, proteínas de fusión, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente a la proteína, secuestrando así su unión a su substrato blanco, variantes de antagonista de la proteína, moléculas dé ahtisentido dirigidas a la proteína, aptámetros de ARN, y ribozimas contra la proteína.
Como se usa en la presente y se aplica a dos o más moléculas o compuestos, los términos 'reconoce' o 'se asocia' significan la reacción, unión, unión específica, combinación, interacción, conexión, enlace, coalescencia, combinación o reunión, covalente o no covalente, de las moléculas, con lo que una molécula ejerce un efecto sobre la otra molécula.
Además, como se muestra aquí en los ejemplos, algunos moduladores de EFNA humano, en algunos casos, pueden reaccionar cruzadamente con EFNA de una especie diferente de la humana (por ejemplo, murina). En otros casos, los moduladores ejemplares pueden ser específicos para una o más isoformas de EFNA humana y no exhibirán reactividad cruzada con los ortólogos de EFNA de otras especies. Desde luego, en conjunto con las enseñanzas de la presente, estas modalidades pueden comprender pan-anticuerpos de EFNA que se asocian con dos o más ligandos efrina A de una sola especie, o anticuerpos que se asocian exclusivamente con un solo ligando efrina A.
En cualquier caso, como se expondrá abajo en más detalle, los expertos en la materia apreciarán que los moduladores descritos se pueden usar en forma conjugada o no conjugada. Esto es, el modulador se puede asociar o conjugarse (por ejemplo covalentemente o no covalentemente) con compuestos farmacéuticamente activos, modificadores de la respuesta biológica, agentes anticancerosos o agentes citostáticos, porciones de diagnóstico o modificadores biocompatibles. A este respecto, se entenderá que estos conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se indica en la presente, el conjugado seleccionado puede estar enlazado covalentemente o no covalentemente al modulador de EFNA en varias proporciones molares dependiendo, por lo menos en parte, del método usado para efectuar la conjugación.
V. Anticuerpos a. Panorama general Como se mencionó anteriormente, modalidades particularmente preferidas de la presente invención comprenden moduladores de EFNA en forma de anticuerpos. El término anticuerpo se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos oligoclonales o policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos producidos recombinantemente, intraanticuerpos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos primatizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFcs de una sola cadena (scFvFc), Fvs de una sola cadena (scFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-ld) y cualquier otro fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, siempre que exhiba la actividad biológica deseada (es decir, asociación o unión de EFNA). En un sentido más amplio, los anticuerpos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígeno, en donde estos fragmentos pueden o no estar fusionados con otro dominio de inmunoglobulina que incluye, sin limitación, una región Fe o fragmento de la misma. Además, como se describe en la presente en más detalle, los términos anticuerpo y anticuerpos incluyen específicamente variantes de Fe como se describe abajo, que incluyen anticuerpos de longitud completa y fusiones de variantes de Fe que comprenden regiones de Fe, o fragmentos de las mismas, que opcionalmente comprenden por lo menos una modificación de residuo de aminoácido, y fusionados con un fragmento inmunológicamente activo de una inmunoglobulina.
Como se expone abajo en más detalle, los términos genéricos anticuerpo o inmunoglobulina comprenden cinco clases distintas de anticuerpo que se pueden distinguir bioquímicamente y, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden ser asignadas fácilmente a la clase apropiada. Por razones históricas, las clases principales de anticuerpos intactos se denominan IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. En los humanos, las clases IgG e IgA se pueden subdividir en las subclases conocidas (isotipos), es decir, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , e lgA2, dependiendo de la estructura y ciertas propiedades bioquímicas. Se apreciará que los isotipos de IgG en los humanos se denominan en el orden de su abundancia en el suero, siendo lgG1 la más abundante.
Aunque las cinco clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM), y todos los isotipos (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , e lgA2), así como también las variaciones de los mismos están dentro del alcance de la presente invención, se expondrán en cierto detalle las modalidades preferidas que comprenden la clase IgG de inmunoglobulina, únicamente con fines de ilustración. Sin embargo, se entenderá que la descripción es solamente demostrativa de las composiciones y métodos ejemplares de la práctica de la presente invención, y de ningún modo limita el alcance de la invención o las reivindicaciones acompañantes.
A este respecto, las inmunoglobulinas IgG humanas comprenden dos cadenas de polipéptido ligeras idénticas de peso molecular aproximado de 23,000 Dalton, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular aproximado de 53,000-70,000, dependiendo del isotipo. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son denotados por la letra griega minúscula correspondiente a, d, e, ??µ, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (?) y lambda (?), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Los expertos en la materia apreciarán que las estructuras de la subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en Y en donde las cadenas ligeras agrupan a las cadenas pesadas empezando en la boca de la Y y continuando a través de la región variable hasta los extremos dobles de la Y. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, mientras que dos enlaces de disulfuro en la región de bisagra unen las cadenas pesadas. Las cadenas pesadas y ligeras respectivas también tienen puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente, cuyo número puede variar según el isotipo de la IgG.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio vanable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de cadena pesada. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad de antígeno. Inversamente, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1 , CH2 o CH3) confieren y regulan propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, vida media en circulación, unión del complemento, etc. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta conforme se, alejan del sitio de unión de antígeno o del extremo amino del anticuerpo. De esta manera, el extremo amino o N del anticuerpocomprende laregiónvariable, y el extremo carboxi o C comprende la región constante. De esta manera, los dominios CH3 y CLcomprenden realmenteel extremo carboxide la cadena pesada y ligera, respectivamente.
El término variable se refiere al hecho de que algunas porciones de los dominios variables difierenextensamente en su secuencia entre las inmunoglobulinas, y estos puntos calientes definen mayormente las características de unión y especificidad de un anticuerpo particular. Estos sitios hipervariables se manifiestan por si mismos en tres segmentos conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada, respectivamente. Las porciones más conservadas de los dominios variables que flanquean las CDRs se denominan regiones de armazón (FRs). Más específicamente, en los anticuerpos de IgG monomérica natural, las seis CDRs presentes en cada brazo del anticuerpo son secuencias de aminoácidos cortas no contiguas que están colocadas específicamente para formar el sitio de unión de antígeno conforme el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un medio acuoso.
Las regiones de armazón que comprenden el resto de los dominios variables de cadena pesada y ligera muestran menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos. Más bien, las regiones de armazón adoptan mayormente una conformación de lámina ß y las CDRs forman vueltas que conectan la estructura de la lámina ß, en algunos casos forman parte de la misma. De esta manera, estas regiones de armazón actúan para formar un andamio que provee la colocación de las seis CDRs en la orientación correcta por medio de interacciones intercatenarias no covalentes. El sitio de unión de antígeno formado por las CDRs colocadas define una superficie complementaria al epítope sobre el antígeno inmunorreactivo (es decir, EFNA4). Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo con el epítope del antígeno inmunorreactivo. Se apreciará que la posición de las CDRs puede ser identificada fácilmente por un experto en la materia.
Como se expone abajo en más detalle y se muestra en los ejemplos adjuntos, todo o parte de las regiones variables de cadena pesada y ligera se puede recombinar o diseñar por ingeniería usando técnicas estándares de recombinación y expresión para proveer anticuerpos eficaces. Esto es, la región variable de cadena pesada o ligera de un primer anticuerpo (o cualquier porción del mismo) se puede mezclar y emparejar con cualquier porción seleccionada de la región variable de cadena pesada o ligera de un segundo anticuerpo. Por ejemplo, en una modalidad, toda la región variable de cadena ligera que comprende las tres CDRs de cadena ligera de un primer anticuerpo, se puede aparear con toda la región variable de cadena pesada que comprende las tres CDRs de cadena pesada de un segundo anticuerpo, para proveer un anticuerpo operativo. Además, en otras modalidades, las CDRs de cadena pesada y ligera derivadas de varios anticuerpos se pueden mezclar y emparejar para proveer el anticuerpo deseado con las características optimizadas. De esta manera, un anticuerpo ejemplar puede comprender tres CDRs de cadena ligera de un primer anticuerpo, dos CDRs de cadena pesada derivadas de un segundo anticuerpo, y una tercera CDR de cadena pesada de un tercer anticuerpo.
Más específicamente, en el contexto de la presente invención se apreciará que cualquiera de las CDRs de cadena pesada y ligera descritas en el cuadro A se puede reordenar de esta manera para proveer anticuerpos anti-EFNA optimizados (por ejemplo, anti-hEFNA4) de acuerdo con las presentes enseñanzas. Esto es, una o más de las CDRs descritas en el cuadro A se pueden incorporar en un modulador de EFNA, y en modalidades particularmente preferidas en un anticuerpo injertado con CDR o humanizado que se asocia inmunoespecíficamente con uno o más ligandos efrina A.
En cualquier caso, los números de residuo de las regiones determinantes de complementariedad se pueden definir como los de Kabat et al. (1991 , Publicación NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.), específicamente los residuos 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3) en el dominio variable de cadena ligera.y 31-35 (CDR1 ), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) en el dominio variable de cadena pesada. Es de notar que las CDRs varían considerablementede un anticuerpo a otro (y por definición no exhibirán homología con las secuencias de consenso de Kabat). La alineación máxima de los residuos de armazón frecuentemente requiere la inserción de residuos espaciadores en el sistema de numeración, para usarse para la regiónFv. Además, la identidad de algunos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat dado puede variar de una cadena de anticuerpo a otra, debido a la divergencia interespecie o alélica. Véase también Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, p. 877-883 (1989);y MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996),en donde las definiciones incluyen el traslape de subgrupos de residuos de aminoácidocuando se comparan unos contra otros. Cada una de las referencias anteriormente mencionadasse incorpora en la presente como referenciaen su totalidad, y los residuos de aminoácido que abarcan las CDRs como se definen en cada una de las reivindicaciones anteriormente citadasse exponen para su comparación.
Definiciones de CDR 1La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., supra 2La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., supra 3La numeración de residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., supra Para fines de conveniencia, las CDRs expuestas en el cuadro A (SEQ ID NOs: 8-59 y 70-95) se definen usando la nomenclatura de Chothia et al., aunque dado el contenido de la presente solicitud, el experto en la materia podría identificar y enumerar fácilmente las CDRs como lo definen Kabat et al. o MacCallum et al. para cada secuencia respectiva de cadena pesada y ligera. A este respecto, las CDRs definidas por Kabat et al. se usaron para el análisis de humanización expuesto en el ejemplo 7(b), y se subrayan en las figuras 7N-7Q (SEQ ID NOs: 148 - 163) que representan secuencias de anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, los anticuerpos que comprenden las CDRs definidas por toda esta nomenclatura se incluyen expresamente dentro del alcance de la presente invención. Más ampliamente, el término residuo de aminoácido de CDR de la región variable incluye los aminoácidos de una CDR identificada usando cualquier método basado en secuencia o estructura como se expone arriba.
Como se usa en la presente, el término residuos de aminoácido de armazón (FR) de la región variable se refiere a los aminoácidos en la región de armazón de una cadena de Ig. El término región de armazón o región FR, como se usa en la presente, incluye los residuos de aminoácido que son parte de la región variable, pero no son parte de las CDRs (por ejemplo, usando la definición de Kabat de CDRs). Por lo tanto, un armazón de la región variable es una secuencia no contigua de entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud pero incluye solo los aminoácidos fuera de las CDRs.
Para el ejemplo específico de una región variable dé cadena pesada y para las CDRs como las define Kabat et al., la región de armazón 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región de armazón 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región de armazón 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y la región de armazón 4 corresponde al dominio de la región variable de los aminoácidos 103 hasta el extremo de la región variable. Las regiones de armazón para la cadena ligera están separadas similarmente por cada una de las CDRs de la región variable de cadena ligera. Similarmente, usando la definición de CDRs de Chothia et al. o McCallum et al., los límites de la región de armazón están separados por los extremos respectivos de CDR como se describe arriba.
Tomando en cuenta las consideraciones estructurales anteriormente mencionadas, los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos de la presente invención pueden comprender cualquiera de varias modalidades funcionales. A este respecto, los anticuerpos compatibles pueden comprender cualquier anticuerpo inmunorreactivo (como se define el término en la presente) que provee la respuesta fisiológica deseada en un sujeto. Aunque cualquiera de los anticuerpos descritos se puede usar en conjunto con las presentes enseñanzas, algunas modalidades de la invención comprenderán anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o fragmentos inmunorreactivios de los mismos. Otras modalidades pueden comprender.por ejemplo, construcciones multiméricas homogéneas o heterogéneas, variantes de Fe, y anticuerpos conjugados o alterados por glicosilación. Además, se entenderá que estas configuraciones no son mutuamente exclusivas y que anticuerpos individuales compatibles pueden comprender uno o más de los aspectos funcionales descritos en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo compatible puede comprender un dianticuerpo de una sola cadena con regiones variables humanizadas, o un anticuerpo lgG3 de longitud completa completamente humano con modificaciones de Fe que alteran el patrón de glicosilación para modular la vida media en el suero. Otras modalidades ejemplares serán evidentes para los expertos en la materia, y puede ser fácilmente discernible que están dentro del alcance de la invención. b. Generación del anticuerpo Como es muy conocido, varios animales hospederos, que incluyen conejos, ratones, ratas, etc., se pueden inocular y usarse para proveer los anticuerpos de acuerdo con las enseñanzas de la presente. Adyuvantes conocidos que se pueden usar para aumentar la respuesta inmune, dependiendo de las especies inoculadas, incluyen, sin limitación, medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacteríum parvum. Estos adyuvantes pueden proteger al antígeno de una dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al hospedero a secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, separadas por varias semanas.
Después de la inmunización de un animal con un inmunógeno EFNA (por ejemplo, EFNA4 o EFNA1 soluble), que puede comprender isoformas y/o péptidos seleccionados, o células vivas, o preparaciones de célula que expresan la proteína deseada, se pueden obtener del animal anticuerpos y/o células productoras de anticuerpo usando técnicas reconocidas. En algunas modalidades, sangrando o sacrificando al animal se obtiene el suero que contiene el anticuerpo anti-EFNA policlonal. El suero se puede usar para fines de investigación en la forma obtenida del animal, o en la alternativa, los anticuerpos anti-EFNA se pueden purificar parcial o totalmente para proveer fracciones de inmunoglobulina o preparaciones de anticuerpo homogéneas. c. Anticuerpos monoclonales Aunque los anticuerpos policlonales se pueden usar en conjunto con algunos aspectos de la presente invención, las modalidades preferidas comprenden el uso deanticuerpos monoclonales reactivos con EFNA. Como se usa en la presente, el término anticuerpo monoclonal o mAb se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador monoclonal indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos, y se puede usar en conjunto con cualquier tipo de anticuerpo. En algunas modalidades, dicho anticuerpo monoclonal incluye un anticuerpo que comprende una secuenciade polipéptido que se une o se asocia con EFNA, en donde la secuencia del polipéptido que se une a EFNA fue obtenida por medio de un procedimiento que incluye la selección de una secuencia de polipéptido que se une a un solo blanco, de una pluralidad de secuencias de polipéptido.
En modalidades preferidas se preparan líneas celulares productoras de anticuerpo a partir de células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y el módulo linfático y/o células B esplénicas se inmortalizan por medios muy conocidos, como los que se muestran en los ejemplos acompañantes. Los métodos de inmortalización de las células incluyen, sin limitación, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogénico y cultivarlas bajo condiciones que seleccionan a las células inmortalizadas, sometiéndolas a compuestos carcinogénicos o mutagénicos, fusionándolas con una célula inmortalizada, por ejemplo una célula de mioma, y desactivando un gen supresor de tumor. Si se usa fusión con células de mieloma, las células de mieloma preferiblemente no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretorias). Las células inmortalizadas se criban usando un ligando efrina A (que incluye las isoformas seleccionadas), o una porción inmunorreactiva del mismo. En una modalidad preferida, el cribado inicial se realiza usando un inmunoensayo enlazado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo.
Más generalmente, usando una amplia variedad de técnicas conocidas, que incluyen hibridoma, técnicas recombinantes, técnicas de despliegue de fago, colecciones de levadura, animales transgénicos (por ejemplo, un XenoMouse® o HuMAb Mouse®), o alguna combinación de los mismos, se pueden preparar anticuerpos monoclonales distintos consistentes con la presente invención. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma como las que se describen arriba ampliamente y se enseñan en más detalle en Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., en: "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), cada una de las cuales se incorpora en la presente. Usando los protocolos descritos, preferiblementelos anticuerpos se desarrollan en mamíferos por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno relevante y un adyuvante. Como se expuso anteriormente, esta inmunización generalmente provoca una respuesta inmune que comprende la producción de anticuerpos reactivos con antígeno (que pueden ser completamente humanos si el animal inmunizado es transgénico) de esplenocitos activados o linfocitos. Aunque los anticuerpos resultantes pueden ser cosechados del suero del animal para proveer preparaciones policlonales, generalmente es más deseable aislar los linfocitos individuales del bazo, nodulos linfáticos o sangre periférica, para proveer preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales. Más típicamente, los linfocitos se obtienen del bazo y se inmortalizan para producir hibridomas.
Por ejemplo, como se describe arriba, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como una reserva de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión de EFNA seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el blanco, para humanizar la secuencia de unión del blanco, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuenciade unión del blanco alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpo policlonal, que típicamente incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son convenientes porque típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas que pueden ser cruzadamente reactivas. d. Anticuerpos quiméricos En otra modalidad, el anticuerpo de la invención puede comprender anticuerpos quiméricos derivados de segmentos de proteína unidos covalentemente de por lo menos dos especies o tipos diferentes de anticuerpos. Se apreciará que, como se usa en la presente, el término anticuerpos quiméricos está dirigido a construcciones en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otras clases o subclases de anticuerpo, y también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). En una modalidad ejemplar, un anticuerpo quimérico de acuerdo con las enseñanzas de la presente puede comprender secuencias de aminoácido VH y VL murinas y regiones constantes derivadas de fuentes humanas. En otras modalidades compatibles, un anticuerpo quimérico de la presente invención puede comprender un anticuerpo injertado con CDR o humanizado como se describe abajo.
Generalmente, una meta para hacer un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que se maximice el número de aminoácidos de la especie del sujeto deseada. Un ejemplo es el anticuerpo injertado con CDR, en donde el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una especie particular, o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas de anticuerpo es idéntico u homólogo a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para usarse en humanos, la región variable o CDRs seleccionadas de un anticuerpo de roedor frecuentemente son injertadas en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones variables naturales o CDRs del anticuerpo humano. Estas construcciones generalmente tienen las ventajas de proveer funciones moduladores de fuerza completa (por ejemplo, CDC, ADCC, etc.) reduciendo al mismo tiempo las respuestas inmunes no deseadas al anticuerpo por parte del sujeto. e. Anticuerpos humanizados Un anticuerpo humanizado es similar al anticuerpo injertado con CDR. Generalmente un anticuerpo humanizado se produce de un anticuerpo monoclonal desarrollado inicialmente en un animal no humano. Como se usa en la presente, las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpodestinatario o aceptor) en el que los residuos de una CDR del anticuerpodestinatario son reemplazadas por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad, y/o capacidad deseada.
Generalmente la humanización de un anticuerpo comprende un análisis de la homología de secuencias y estructuras canónicas del anticuerpo tanto donador como destinatario. En modalidades seleccionadas, el anticuerpo destinatario puede comprender secuencias de consenso. Para crear armazones humanas de consenso, se pueden alinear armazones de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humana para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. Además, en muchos casos, uno o más residuos de armazón del dominio variable de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes del anticuerpo donador. Estas sustituciones de armazón son identificadas por métodos muy conocidos, por ejemplo, modelación de las interacciones de la CDR y residuos de armazón para identificar residuos de armazón importantes para la unión del antígeno, y comparación de secuencias para identificar residuos de armazón inusuales en posiciones particulares. Estas sustituciones ayudan a mantener la configuración tridimensional apropiada de las CDRs injertadas y frecuentemente mejoran la afinidad sobre construcciones similares sin sustituciones de armazón. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo destinatario o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar más el rendimiento del anticuerpo usando técnicas muy conocidas.
Los anticuerpos de injerto de CDR y humanizados se describenpor ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761 , 5,585,089 y 5,530,101. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables, o por lo menos uno, o típicamente dos, en los cuales todas o sustancialmente todas las CDRs corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones de armazón son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles véase por ejemploJones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann er a/., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 : 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y patentes de EE. UU. Nos. 6,982,321 y 7,087,409. Otro método se denomina humaneeríng y se describe por ejemplo en U.S. 2005/0008625. Para los fines de la presente solicitud, el término anticuerpos humanizados incluye expresamente anticuerpos injertados con CDR (es decir, anticuerpos humanos que comprenden una o más CDRs no humanas injertadas) con sustituciones de armazón mínimas o nulas.
Adicionalmente, un anticuerpo anti-EFNA no humano también se puede modificar mediante supresión específica de epítopes de células T humanas, o desinmunización mediante los métodos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, las regiones variables de cadena pesada y ligerade un anticuerpose pueden analizarpara determinar los péptidosque se unen al MHC clase II; estos péptidos representanepítopes potenciales de células T (como se define en WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección deepitopes potenciales de células T, se puede aplicar un enfoque de modulación de computadoradenominadoenhebrado de péptido, y además se puede consultar una base de datos depéptidos de unión de MHC de clase II de humanoen busca de los motivos presentesen las secuencias de VHy VL, como se describe en WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 principales alotipos DR de MHC de clase II, y constituyen así epítopes potenciales de células T. Los epítopes potenciales de células T detectados se pueden eliminar sustituyendo unos pocos residuos de aminoácido en las regiones variables, o mediante sustituciones de un solo aminoácido. Siempre que sea posible se hacen sustituciones conservativas. Frecuentemente, pero no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpo de línea germinal humana. Después de identificar los cambios de desinmunización se pueden construir ácidos nucleicos que codifican VH y VL por medio de mutagénesis u otros métodos sintéticos (por ejemplo síntesis de novo, reemplazo de cásete, etc.). Opcionalmente, una secuencia variable mutada se puede fusionar con una región constante humana.
En modalidades seleccionadas, por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, u 80% de los residuos de la región variable del anticuerpo humanizado corresponderán con las secuencias progenitoras de la región de armazón (FR) y CDR. En otras modalidades, por lo menos 85% o 90% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderáncon las secuencias progenitoras de la región de armazón (FR) y CDR. En una modalidad preferida adicional, más de 95% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderáncon las secuencias progenitoras de la región de armazón (FR) y CDR.
Los anticuerpos humanizados se pueden fabricar usando técnicas comunes de biología molecular e ingeniería biomolecular como las que se describen en la presente. Estos métodos incluyen el aislamiento, manipulación y expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican una parte o todas las regiones variables Fv de inmunoglobulina de por lo menos una cadena pesada o ligera. Las fuentes de estos ácidos nucleicos son muy conocidas y se pueden obtener por ejemplo de un hibridoma, célula eucariota o fago que produce un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo contra un blanco predeterminado, como se describe arriba, de genes de inmunoglobulina de línea germinal, o de construcciones sintéticas. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado se puede clonar entonces en un vector de expresión apropiado.
Secuencias de línea germinal humana se describen por ejemplo en Tomlinson, I. A. et al. (1992), J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995), Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. eí al. (1992), J. Mol. Bio. 227:799-817; y Tomlinson eí al. (1995), EMBO J 14:4628-4638. El directorio V BASE provee un directorio extenso de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (véase Retter eí al., (2005), Nuc Acid Res 33: 671-674). Estas secuencias se pueden usar como una fuente de secuencias humanas, por ejemplo, para regiones de armazón y CDRs. Como se expone en la presente, también se pueden usar regiones de armazón humanas de consenso, por ejemplo como se describe en la patente de EE. UU. No. 6,300,064. f. Anticuerpos humanos Además de los anticuerpos anteriormente mencionados, los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos completamente humanos. Para los fines de la presente solicitud, el término anticuerpo humano comprende un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidosque corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho usando cualquiera de las técnicas de preparación de anticuerpos humanos descritas en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión de antígeno no humanos.
Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas. Como se menciona arriba, se pueden usar técnicas de despliegue de fago para proveer regiones de unión inmunorreactivas de acuerdo con las presentes enseñanzas. De esta manera, algunas modalidades de la invención proveen métodos para producir anticuerpos anti-EFNA, o porciones de unión de antígeno de los mismos, que comprenden los pasos de sintetizar una colección de anticuerpos (preferiblemente humanos) sobre un fago; cribar la colección con un EFNA seleccionado o porción de unión de anticuerpo del mismo; aislar el fago que se une a EFNA; y obtener los fragmentos inmunorreactivos del fago. A manera de ejemplo, un método de preparación de la colección de anticuerpos para usarse en las técnicas de despliegue de fago comprende los pasos de: inmunizar un animal no humano que comprende locus de inmunoglobulina humanos o no humanos con el EFNA seleccionado o una porción antigénica del mismo, para crear una respuesta inmune; extraer las células productoras de anticuerpo del animal inmunizado; aislar el ARN que codifica las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de la invención de las células extraídas; transcribir inversamente el ARN para producir ADNc; amplificar el ADNc usando iniciadores; e insertar el ADNc en un vector de despliegue de fago de tal manera que los anticuerpos se expresen en el fago. Más particularmente, el ADN que codifica los dominios H y VL se recombina junto con un enlazador scFv por medio de PCR, y se clona en un vector fagémido (por ejemplo, p CANTAB 6 o pComb 3 HSS). Después, el vector se puede someter a electroporación en E. coli y después la E. coli se infecta con un fago ayudador. El fago usado en estos métodos típicamente es un fago filamentoso que incluye fd y M13, y los dominios VH y VL usualmente se fusionan recombinantemente con el gen III o el gen VIII del fago.
Los anticuerpos anti-EFNA humanos recombinantes de la invención se pueden aislar cribando una colección combinatoria de anticuerpos recombinantes preparada como se describe arriba. En una modalidad preferida, la colección es una colección de despliegue de fago scFv, generada usando ADNc de VL y VH de humano preparados de ARNm aislado de células B. Los métodos de preparación y cribado de estas colecciones son muy conocidos, y se tienen kits disponibles comercialmente para generar colecciones de despliegue de fago (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, No. catálogo 27-9400-01 ; y el kit de despliegue de fago SurfZAP™ de Stratagene, No. catálogo 240612). También hay otros métodos y reactivos que se pueden usar para generar y cribar colecciones de despliegue de anticuerpo (véase por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,223,409; las publicaciones de PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271 , WO 92/20791 , WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991 ); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et ai, Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty er a/., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991 ); y Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991 ).
Los anticuerpos producidos por colecciones intactas (naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kade aproximadamente 106a 107 M"1), pero también se puede imitar la maduración de afinidad in v íroconstruyendo y reseleccionando desde colecciones secundarias como se describe en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una mutación al azar/'n 'frousando polimerasa susceptible de error(reportado por Leung et al., Technique, 1 : 11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992),o en el método de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, se puede efectuar maduración de afinidadmutando al azaruna o más CDRs, por ejemplo, usando PCR con iniciadores que llevanuna secuencia que abárcala CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados, y cribando en busca délos clones con la afinidad más alta. WO 9607754 describe un método para inducir mutagénesis en una región determinante de complementariedadde una cadena ligera de inmunoglobulinapara crear una colección de genes de cadena ligera. Otro enfoque eficazes recombinarlos dominios VH o Vi_seleccionados pormedio de despliegue de fagocon repertorios de variantes del dominio V naturales obtenidos de donadores no inmunizados, y cribar en busca de afinidad más alta en varias rondas deremezclado, como lo describen Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerposy fragmentos de anticuerpocon una constante de disociación Kd (koff/kon) de aproximadamente 10"9 M o menor.
Se apreciará adicionalmente que se pueden usar procedimientos similares usando colecciones que comprenden células eucanotas (por ejemplo levadura) que expresan pares de unión sobre su superficie. Como con la tecnología de despliegue de fago, las colecciones eucarióticas se criban contra el antígeno de interés (es decir, EFNA), y las células que expresan pares de unión de candidato se aislan y se clonan. Se pueden realizar pasos para optimizar el contenido de la colección y para maduración de afinidad de los pares de unión reactivos. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU No. 7,700,302, y U.S.S.N. 12/404,059. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona de una colección de fago, en donde esa colección de fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991 )). En otras modalidades, los pares de unión de humanóse pueden aislar de colecciones combinatorias de anticuerpogeneradas en células eucariotastales como levaduras. Véase por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 7,700,302. Estas técnicas permiten convenientemente el cribado de una gran cantidad de moduladores candidatos y proveer una manipulación relativamente fácil de las secuencias candidatas (por ejemplo, mediante maduración de afinidad o mezclado recombinante).
Los anticuerpos humanos también se pueden preparar introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones, en los que los genes endógenos de inmunoglobulina se han desactivado parcial o totalmente. Tras la provocación se observa la producción de anticuerpo humano, la cual se asemeja estrechamente a la observada en los humanos en todos los aspectos, incluso reordenamiento de gen, ensamble y repertorio de anticuerpo. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661 ,016, y 6,075,181 y 6,150,584 con respecto a la tecnología Xenomouse®, junto con las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar por medio de inmortalización en linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno blanco (estos linfocitos B se pueden recuperar de un individuo que padece un trastorno neoplásico o que pudo ser inmunizado in vitro). Véase, por ejemplo, Colé et al., "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); y la patente de EE. UU. No. 5,750,373.
VI. Características del anticuerpo Sin importar como se obtenga o cuales de las formas anteriormente mencionadas tenga el modulador de anticuerpo (por ejemplo, humanizado, humano, etc.), las modalidades preferidas de los moduladores descritos pueden exhibir varias características. A este respecto, células productoras de anticuerpo anti-EFNA (por ejemplo, hibridomas o colonias de levadura), se pueden seleccionar, clonar y cribar adicionalmente en busca de las características deseables, que incluyen por ejemplo crecimiento robusto, alta producción de anticuerpo y, como se expone abajo en más detalle, características deseables delanticuerpo. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo ratones sin pelo, o en cultivo celular in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de los hibridomas y/o colonias, cada uno de las cuales produce una especie distinta de anticuerpo, son muy conocidos para los expertos en la materia. a. Anticuerpos neutralizantes En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos neutralizantes o derivados o fragmentos de los mismos. El término anticuerpo neutralizante o antagonista neutralizante se refiere a un anticuerpo o antagonista que se une o interacciona con un ligando efrina A y previene la unión o asociación del ligando con su socio de unión (por ejemplo, receptor de EPHA), interrumpiendo así la respuesta biológica que de otra manera resultaría de la interacción de las moléculas. Al evaluar la unión y especificidad de un anticuerpo o fragmento o derivado inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento sustancialmente inhibirá la unión del ligando a su socio de unión o substrato, cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de socio de unión unido a la molécula blanco en por lo menos aproximadamente20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más, medida, por ejemplo, en una prueba de unión competitiva in vitro (véanse por ejemplo los ejemplos 9-12 de la presente). En el caso de anticuerpo para EFNA4 por ejemplo, un anticuerpo o antagonista neutralizante preferiblemente disminuirá la capacidad de EFNA4 para unirse a EphA4 en por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más. Se apreciará que esta actividad disminuida se puede medir directamente usando las técnicas reconocidas, o se puede medir mediante el impacto que dicha reducción tendrá sobre la actividad del receptor de EPH (por ejemplo, EPHA4). b. Internamiento de anticuerpos Aunque la evidencia indica que ligandos efrina A seleccionados o sus isoformas pueden estar presentes en una forma soluble, por lo menos una parte del EFNA (por ejemplo, EFNA1 y EFNA4) probablemente permanece asociado con la superficie celular, permitiendo así el internamiento de los moduladores descritos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-EFNA de la presente invención pueden ser internados, por lo menos en cierta medida, por células que expresan un ligando efrina A. Por ejemplo, un anticuerpo anti-EFNA4 que se une a EFNA4 sobre la superficie de una célula iniciadora de tumor puede ser internado por la célula iniciadora de tumor. En modalidades particularmente preferidas, estos anticuerpos anti-EFNA se pueden asociar o conjugar con agentes anticancerosos, tales como porciones citotóxicas que destruyen la célula tras el internamiento.
Como se usa en la presente, un anticuerpo anti-EFNA que se interna es uno que es captado por la célula tras la unión con un EFNA asociado con una célula de mamífero. El anticuerpo que se interna incluye fragmentos de anticuerpo, anticuerpo humano o humanizado y conjugados de anticuerpo. El internamiento puede ocurrir in vitro o in vivo. Para aplicaciones terapéuticas, el internamiento puede ocurrir in vivo. El número de moléculas de anticuerpo internadas puede ser suficiente o adecuado para destruir una célula que expresa EFNA, especialmente una célula iniciadora de tumor que expresa EFNA. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o conjugado de anticuerpo, en algunos casos la captación de una sola molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para destruir la célula blanco a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, algunas toxinas son muy potentes para destruir, de tal manera que el internamiento de una molécula de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para destruir la célula de tumor. Por medio de varias pruebas que incluyen las que se describen más abajo en los ejemplos (por ejemplo, ejemplos 15 y 16), se puede determinar si un anticuerpo anti-EFNA se interna en una célula de mamífero tras la unión a EFNA. Los métodos para detectar si un anticuerpo se interna en una célula también se describen en la patente de EE. UU. No. 7,619,068, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. c. Anticuerpos de agotamiento En otras modalidades preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos de agotamiento, o derivados o fragmentos de los mismos. El término anticuerpo de agotamiento se refiere a un anticuerpo o fragmento que se une o se asocia con un EFNA sobre o cerca de la superficie celular, e induce, promueve o causa la muerte o eliminación de la célula (por ejemplo, mediante citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo). En algunas modalidades expuestas más abajo en mayor detalle, los anticuerpos de agotamiento seleccionados se asociarán o conjugarán con un agente citotóxico. Preferiblemente, un anticuerpo de agotamiento será capaz de remover, eliminar o destruir por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% de las células que perpetúan tumores en una población celular definida. En algunas modalidades, la población celular puede comprender células que perpetúan tumores enriquecidas, seccionadas, purificadas o aisladas. En otras modalidades, la población celular puede comprender muestras de tumor completo o extractos de tumor heterogéneos que comprenden células que perpetúan tumores. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar las técnicas de bioquímica estándares que se describen abajo en los ejemplos (por ejemplo, el ejemplo 16), para monitorear y cuantificar el agotamiento de las células tumorigénicas o células que perpetúan tumores de acuerdo con las enseñanzas de la presente. d. Unión del epítope Se apreciará adicionalmente que los anticuerpos anti-EFNA descritos se asociarán o se unirán con epítopes o determinantes distintos presentados por el blanco seleccionado. Como se usa en la presente, el término epítope se refiere a aquella porción del antígeno blanco susceptible de ser reconocida y enlazada específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido tal como EFNA, los epítopes se pueden formar tanto de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el pliegue terciario de una proteína. Los epítopes formados de aminoácidos contiguos típicamente son retenidos tras la desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopes formados por el pliegue terciario típicamente se pierden tras la desnaturalización de la proteína. Típicamente, un epítope incluye por lo menos 3 aminoácidos, más usualmente por lo menos 5 u 8-10, en una conformación espacial única. Más específicamente, el experto en la materia apreciará que el término epítope incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T, o de interaccionar de otra manera con una molécula. Los determinantes epitópicos consisten generalmente en agrupaciones de superficie de moléculas químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidrato o azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Adicionalmente, un epítope puede ser lineal o conformacional. En un epítope lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interaccionante (tal como un anticuerpo) ocurren linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. En un epítope conformacional, los puntos de interacción ocurren entre los residuos de aminoácidoque están linealmente separados uno de otro sobre la proteína .
Una vez que se determina un epítope deseado sobre un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítope, por ejemplo, inmunizando con un péptido que comprende el epítope usando las técnicas descritas en la presente invención. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede elucidar información acerca de los epítopes deseables. De esta información es posible entonces cribar competitivamente los anticuerpos en busca de la unión al mismo epítope. Un enfoque para lograr esto es realizar estudios de competencia para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente uno a otro, es decir, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. En WO 03/48731 se describe un procedimiento de alto rendimiento para categorizaranticuerpos en bins, basado en su competencia cruzada.
Como se usa en la presente, el término categorizaren binsse refiere a un método para agrupar anticuerpos basándose en sus características de unión de antígeno. La asignación de bins es un poco arbitraria, dependiendo de qué tan diferentes sean los patrones de unión observados de los anticuerpos probados. De esta manera, aunque la técnica es una herramienta útil para categorizar los anticuerpos de la presente invención, los bins no siempre se correlacionan directamente con los epítopes, y estas determinaciones iniciales deben confirmarse adicionalmente por medio de otra metodología reconocida.
Con esta advertencia, se puede determinar si un anticuerpo primario seleccionado (o fragmento del mismo) se une al mismo epítope o compite cruzadamente por la unión con un segundo anticuerpo, usando los métodos conocidos y expuestos en los ejemplos de la presente. En una modalidad, se deja que el anticuerpo primario de la invención se una a EFNA bajo condiciones de saturación y después se mide la capacidad del anticuerpo secundario para unirse a EFNA. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a EFNA al mismo tiempo como el anticuerpo anti-EFNA primario,entonces el anticuerpo secundario se une a un epítope diferente del anticuerpo primario. Sin embargo, si el anticuerpo secundario no es capaz de unirse a EFNA al mismo tiempo, entonces el anticuerpo secundario se une al mismo epítope, un epítope de traslape, o un epítope que está muy cercano al epítope enlazado por el anticuerpo primario. Como se conoce en la técnica y se detalla más abajo en los ejemplos, los datos deseados se pueden obtener usando radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo de enzima (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competencia de sándwich, un sistema Biacore™ (es decir, resonancia de plasmón de superficie - GE Healthcare), un ForteBio® Analyzer (es decir, interferometría de biocapa - ForteBio, Inc.) o metodología de citometría de flujo. El término resonancia de plasmón de superficie, como se usa en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor. En una modalidad particularmente preferida, el análisis se realiza usando un instrumento Biacore o ForteBio como se muestra abajo en los ejemplos.
El término 'competencia', cuando se usa en el contexto de anticuerpos que compiten por el mismo epítope, significa que la competencia entre anticuerpos se determina por medio de un ensayo en el que el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional bajo prueba previene o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Típicamente, esta prueba implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referenciamarcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marca unida a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Usualmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítope que el anticuerpo de referencia, y anticuerpos que se unen a un epítope adyacente suficientemente próximo al epítope enlazado por el anticuerpo de referencia para que ocurra impedimento estérico. Detalles adicionales con respecto a los métodos para determinar la unión competitiva se proveen en los ejemplos de la presente. Usualmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia con un antígeno común en por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algún caso, la unión es inhibida por lo menos en 80%, 85%, 90%, 95%, o 97%, o más.
Además de la especificidad del epítope, los anticuerpos descritos se pueden caracterizar usando varias características físicas diferentes que incluyen, por ejemplo, afinidades de unión, temperatura de fusión (Tm), y puntos isoeléctricos. e. Afinidad de unión A este respecto, la presente invención también abarca el uso de anticuerpos que tienen una afinidad alta de unión por un EFNA seleccionado o, en el caso de pan-anticuerpos, más de un tipo de ligando efrina A. Se dice que un anticuerpo de la invención se une específicamente a su antígenoblanco cuando la constante de disociación Kd (k0ff/kon) es= 10"8M. El anticuerpo se une específicamente al antígeno con una afinidad alta cuando la Kd es= 5x10"9M, y con afinidad muy alta cuando la Kd es= 5x10"10M. En una modalidad de la invención, el anticuerpo tiene una Kd de < 10"9M y una velocidad de disociación de aproximadamente IxIO^/s. En una modalidad de la invención, la velocidad de disociación es < 1x10'5/s. En otras modalidades de la invención, los anticuerpos se unirán a EFNA con una Kd de entre aproximadamente 10"8M y 10"10M, y en otra modalidad más se unirán con una Kd= 2x10"10M. Otras modalidades seleccionadas de la presente invención comprenden anticuerpos que tienen una constante de disociación o Ka (koff/kon) menor de 10'2M, menor de 5x10"2M, menor de 10"3M, menor de 5x10" 3M, menor de ??^?, menor de 5x1 ? /?, menor de 10'5M, menor de 5x10"5M, menor de 10"6M, menor de 5x10"6M, menor de 10"7M, menor de 5x10"7M, menor de 10"8M, menor de 5x10'8M, menor de 10'9M, menor de 5x10"9M, menor de 10' 0M, menor de 5x10"10M, menor de 10"11M, menor de 5x10" 1M, menor de 10" 2M, menor de 5x10"12M, menor de 10"13M, menor de 5x10" 3M, menor de 10"14M, menor de 5x10~14M, menor de 10~ 5M, o menor de 5x10"15M.
En modalidades específicas, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a EFNA tiene una constante de velocidad de asociación o velocidad kon (EFNA (Ab) + antígeno(Ag)kon— Ab-Ag) de por lo menos 105M"V1, por lo menos 2x105M"V1, por lo menos 5x105M"1s"1, por lo menos 106M"1s"1, por lo menos 5x106M"V1, por lo menos 107M"V1, por lo menos 5x107M"V1, o por lo menos 108M"1s'1.
En otra modalidad, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a EFNA tiene una velocidad k0» (EFNA (Ab) + antígeno(Ag)k0ff<— Ab-Ag) menor de 10 V1, menor de 5x10"V1, menor de 10" V, menor de 5x1 (TV1, menor de 10"3s 1, menor de 5x1 (TV1, menor de 1<rV ', menor de 5x10"V1, menor de 10~5s~1, menor de 5x10"5s"\ menor de 10"V1, menor de 5x10"6s"1 menor de 10"7s"1, menor de 5x10"7s'\ menor de 10"8s"1, menor de 5x10"8s"1, menor de 10"9s"1, menor de 5x10"9s"1, o menor de 10'10s"1.
En otras modalidades seleccionadas de la presente invención, los anticuerpos anti-EFNA tendrán una constante de afinidad o Ka (kon/k0ff) de por lo menos 102M"1, por lo menos 5x102M"1, por lo menos 103M"1, por lo menos 5x103M'1, por lo menos 10 M"1, por lo menos 5x104M'1, por lo menos 105M"1, por lo menos 5x105M"1, por lo menos 106M"1, por lo menos 5x106M"1, por lo menos 107M"1, por lo menos 5x107M"1, por lo menos 108M'1, por lo menos 5x108M'1, por lo menos 109M"1, por lo menos 5x109M"1, por lo menos 1010M"1, por lo menos 5x1010M"1, por lo menos 1011M'1, por lo menos 5x1011M" \ por lo menos 1012M'1, por lo menos 5x1012M'1, por lo menos 1013M"1, por lo menos 5x10 3M"1, por lo menos 101 M~\ por lo menos 5x101 M \ por lo menos 1015M-\ o por lo menos 5x10 5lvr1. f. Puntos isoeléctricos Además de las propiedades de unión anteriormente mencionadas, los anticuerpos anti-EFNA y fragmentos de los mismos, como todos los polipéptidos, tienen un punto isoeléctrico (pl), que se define generalmente como el pH al que un polipéptido no lleva carga neta. Se sabe que la solubilidad de una proteína típicamente es más baja cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Por lo tanto, es posible optimizar la solubilidad alterando el número y localización de residuos ionizables en el anticuerpo para ajustar el pl. Por ejemplo, el pl de un polipéptido puede ser manipulado haciendo las sustituciones de aminoácido apropiadas (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado como lisina, con un residuo no cargado como alanina). Sin desear limitarse a ninguna teoría particular, las sustituciones de aminoácido de un anticuerpo que resultan en cambios del pl de dicho anticuerpo pueden mejorar la solubilidad y/o la estabilidad del anticuerpo. El experto en la materia entenderá qué sustituciones de aminoácido serían las más apropiadas para un anticuerpo particular para obtener un pl deseado.
El pl de una proteína puede ser determinado mediante una variedad de métodos que incluyen, sin limitación, enfoque isoeléctrico y varios algoritmos de computadora (véase por ejemploBjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023). En una modalidad, el pl de los anticuerpos anti-EFNA de la invención es mayor de aproximadamente 6.5, aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5, aproximadamente 8.0, aproximadamente 8.5, o aproximadamente 9.0. En otra modalidad, el pl de los anticuerpos anti-EFNA de la invención es mayor de 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, o 9.0. En otra modalidad, las sustituciones que resultan en alteraciones del pl de los anticuerpos de la invención no disminuirá significativamente su afinidad de unión por EFNA. Como se expone abajo en más detalle, se contempla específicamente que las sustituciones de la región Fe que alteran la unión a FcyR también pueden resultar en un cambio del pl. En una modalidad preferida, las sustituciones de la región Fe se eligen específicamente para efectuar la alteración deseada en la unión de FcyR y cualquier cambio deseado del pl. Como se usa en la presente, el valor de pl se define como el pl de la forma cargada predominante. g. Estabilidad térmica Se apreciará adicionalmente que la Tm del dominio Fab de un anticuerpo puede ser un buen indicador de la estabilidad térmica de un anticuerpo, y además puede proveer una indicación de la vida útil. La Tm es únicamente la temperatura de 50% de desdoblamiento para un dominio o secuencia dada. Una Tm más baja indica más agregación /menos estabilidad, mientras que una Tm más alta indica menos agregación /más estabilidad. De esta manera, se prefieren los anticuerpos o fragmentos o derivados que tienen una Tm más alta. Además, usando las técnicas reconocidas.es posible alterar la composición de los anticuerpos anti-EFNA o dominios de los mismos para aumentar u optimizar la estabilidad molecular. Véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 7,960,142. De esta manera, en una modalidad, el dominio Fab de un anticuerpo seleccionado tiene un valor de Tm mayor de por lo menos 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 1 15°C o 120°C. En otra modalidad, el dominio Fab de un anticuerpo tiene un valor de Tm mayor de por lo menos aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C, aproximadamente 95°C, aproximadamente 100°C, aproximadamente 105°C, aproximadamente 110°C, aproximadamente 115°C, o aproximadamente 120°C. Las temperaturas de fusión térmica (Tm) de un dominio de proteína (por ejemplo, un dominio Fab) se pueden medir usando cualquier método estándar conocido, por ejemplo, calorimetría de barrido diferencial (véase por ejemplo, Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154 ambas incorporadas en la presente comoreferencia).
VII. Fragmentos y derivados del modulador de EFNA Ya sea que los agentes de la presente invención comprendan construcciones de fusión, anticuerpos, fragmentos, o derivados intactos, los moduladores seleccionados reaccionarán, se unirán, se combinarán, formarán complejo, se conectarán, se fijarán, se pegarán, interaccionarán o se asociarán de otra manera con EFNA, y con ello proveerán los efectos antineoplásicos deseados. Los expertos en la materia apreciarán que los moduladores que comprenden anticuerpos anti-EFNA interaccionan o se asocian con EFNA a través de uno o más sitios de unión expresados sobre el anticuerpo. Más específicamente, como se usa en la presente, el término sitio de unión comprende una región de un polipéptido que es responsable de unirse selectivamente a una molécula blanco de interés (por ejemplo, enzima, antígeno, ligando, receptor, substrato o inhibidor). Los dominios de unión comprenden por lo menos un sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto tendrá dos dominios de unión y dos sitios de unión). Los dominios de unión ejemplares incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio de unión de receptor de un ligando, un dominio de unión de ligando de un receptor, o un dominio enzimático. Para los fines de la presente invención, la región activa típica de EFNA (por ejemplo, como parte de una construcción de fusión Fc-EFNA) puede comprender un sitio de unión para un substrato (por ejemplo, un receptor de Eph). a. Fragmentos Sin tener en cuenta qué forma del modulador se seleccione para practicar la invención (por ejemplo quimérico, humanizado, etc.), se apreciará que fragmentos inmunorreactivos de los mismos se pueden usar de acuerdo con las enseñanzas de la presente. En el sentido más amplio, el término fragmento de anticuerpo comprende por lo menos una porción de un anticuerpo intacto (por ejemplo una inmunoglobulina natural). Más particularmente, el término fragmento se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo (o molécula de EFNA en el caso de fusiones de Fe), que comprende menos residuos de aminoácido que una cadena de anticuerpo intacta o completa. El término fragmento de unión de antígeno se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que deriva) por la unión alantígeno (es decir, unión específica). Como se usa en la presente, el término fragmento de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión de antígeno de anticuerpos, por ejemplo una cadena ligera de anticuerpo (VL), una cadena pesada de anticuerpo (VH), un anticuerpo de una sola cadena (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, fragmentos de anticuerpo de un solo dominio, dianticuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Similarmente, un fragmento activo de EFNA comprende una porción de la molécula de EFNA que retiene su capacidad para interaccionar con substratos o receptores de EFNA y los modifican de manera similar a un EFNA intacto (aunque tal vez con un poco de menos eficiencia).
Los expertos en la materia apreciarán que los fragmentos se pueden obtener por medio de tratamiento químico o enzimático de un modulador (por ejemplo, un anticuerpo o cadena de anticuerpo) intacto o completo, o por medios recombinantes. A este respecto, aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en función de la digestión de un anticuerpo intacto, el experto en la materia apreciará que estos fragmentos se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o usando metodología de ADN recombinante. De esta manera, el término anticuerpo, como se usa en la presente, incluye explícitamente anticuerpos, o fragmentos o derivados de los mismos, producidos ya sea por la modificación de anticuerpos completos, o sintetizados de novo usando metodología de ADN recombinante.
Más específicamente, la digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión de antígeno, y un fragmento Fe residual cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión de antígeno y todavía es capaz de entrelazar antígeno. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente del Fab' en el que los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de gozne entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Véase por ejemplo "Fundamental Immunology", W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo.
Se apreciará adicionalmente que un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión de antígeno. Esta región está formada de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo en scFv. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs o un subgrupo de las mismas confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque usualmente a una afinidad menor que el sitio de unión completo.
En otras modalidades, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, es uno que comprende la región Fe, retiene por lo menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión de FcRn, modulación de la vida media del anticuerpo, función de ADCC, y unión del complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión de antígeno enlazado a una secuencia de Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. b. Derivados En otra modalidad, se apreciará adicionalmente que los moduladores de la invención pueden ser monovalentes o multivalentes (por ejemplo, divalentes, trivalentes, etc.). Como se usa en la presente, el término valencia se refiere al número potencial de sitios de unión del blanco (es decir, EFNA) asociados con un anticuerpo. Cada sitio de unión de blanco se une específicamente a una molécula blanco, o posición o locus específico sobre una molécula blanco. Cuando un anticuerpo de la presente invención comprende más de un sitio de unión de blanco (multivalente), cada sitio de unión de blanco puede unirse específicamente a las mismas moléculas o a diferentes moléculas (por ejemplo, se puede unir a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopes o posiciones sobre el mismo antígeno). Para los fines de la presente invención, preferiblementelos presentes anticuerpos tendrán por lo menos un sitio de unión específico para EFNA humano. En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención serán monovalentes pues cada sitio de unión de la molécula se unirá específicamente a una sola posición o epítope de EFNA. En otras modalidades, los anticuerpos serán multivalentes pues comprenden más de un sitio de unión y los diferentes sitios de unión se asocian específicamente con más de una sola posición o epítope. En estos casos, los múltiples epítopes pueden estar presentes sobre el polipéptido EFNA seleccionado o variante de empalme, o un solo epítope puede estar presente sobre el EFNA mientras que un segundo epítope diferente puede estar presente sobre otra molécula o superficie. Véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 2009/0130105.
Como se menciona arriba, los anticuerpos multivalentes se pueden unir inmunoespecíficamente a diferentes epítopes de la molécula blanco deseada, o se pueden unir inmunoespecíficamente tanto a la molécula blanco como a un epítope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Aunque las modalidades preferidas de los anticuerpos anti-EFNA solo se unen a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos), también están abarcados por la presente invención los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como anticuerpos triespecíficos. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen, sin limitación, los que tienen un brazo dirigido contra EFNA y el otro brazo dirigido contra cualquier otro antígeno (por ejemplo, un marcador celular modulador). Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada - cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). Otras construcciones multiespecíficas compatibles más sofisticadas, y los métodos de su fabricación, se exponen en la patente de EE. UU. No. 2009/0155255.
En otras modalidades más, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos una parte de las regiones de bisagra, CH2 y/o CH3. En un ejemplo, la primera región constante de cadena pesada (CH1 ) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedero adecuado. Esto provee mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidadesen las que diferentes proporciones de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proveen rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión, cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales resulta en rendimientos altos, o cuando las proporciones no son de significado particular.
En una modalidad de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmonuglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo (por ejemplo, EFNA4), y un par cadena pesada-cadena ligera de inmonuglobulina híbrida (que provee una segunda especificidad de unión) en otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de ¡nmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de ¡nmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica provee una manera fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase por ejemplo Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121 :210. De acuerdo con otro enfoque descrito en WO96/2701 1 , se puede construir por ingeniería un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácido de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes con unas más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto provee un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos entrelazados o heteroconjugados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (patente de EE. UU. No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer usando cualquier método de entrelazamiento conveniente. Los agentes de entrelazamiento adecuados son muy conocidos y se describen en patente de EE. UU. No. 4,676,980, junto con varias técnicas de entrelazamiento.
VIII. Moduladores de EFNA - Modificaciones de la Región Constante a. Región Fe y receptores de Fe Además de las diversas modificaciones, sustituciones, adiciones y supresiones de la región variable o de unión de los moduladores descritos (por ejemplo, Fc-EFNA oanticuerpos anti-EFNA) expuestos arriba, los expertos en la materia apreciarán que las modalidades seleccionadas de la presente invención también pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región constante (es decir, la región Fe). Más particularmente, se contempla que los moduladores de EFNA de la invención pueden comprender, entre otras, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones adicionales de residuos de aminoácidos, que resultan en un compuesto con características específicas que incluyen, sin limitación: farmacocinética alterada, aumento de la vida media en el suero, aumento de la afinidad de unión, reducción de la inmunogenicidad, aumento de producción, alteración de la unión de ligando a Fe, aumento o reducción de la actividad de ADCC o CDC, alteración de la glicosilación y/o enlaces de disulfuro, y modificación de la especificidad de unión. A este respecto se apreciará que estas variantes Fe pueden se pueden usar convenientemente para aumentar las propiedades antineoplásicas efectivas de los moduladores descritos.
El término región Fe se usa en la presente para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmuno-globulina, que incluye regiones Fe de secuencias nativas y regiones Fe variantes. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina pueden variar, las regiones Fe de cadena pesada de IgG humana usualmente se definen para abarcar desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo déla misma. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe puede ser removida, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o por la construcción de ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 removidos, y poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Una región Fe funcional tiene una función efectora de una región Fe de secuencia nativa. Las funciones efectoras ejemplares incluyen unión de C1q¡ CDC; unión de receptor de Fe; ADCC; fagocitosis; subregulación de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etcétera. Estas funciones efectoras generalmente requieren la combinación de la región Fe con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo), y pueden ser evaluadas usando varias pruebas como las que se describen por ejemplo en las definiciones de la presente.
Receptor de Fe o FcR describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades un FcR es un FcR humano nativo. En algunas modalidades un FcR es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, Fc.RII y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de los receptores. Los receptores FoyH incluyen FcyRIIA (un receptor de activación) y FCYRIIB (un receptor de inhibición), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FCYRI IA contiene un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FCYRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan por ejemplo en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, que incluyen los identificados en el futuro, están abarcados por el término FcR en la presente. El término receptor de Fe o FcR también incluye el receptor neonatal, FcRn, que algunos casos es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 1 17:587 (1976), y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), y la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Los métodos para medir la unión a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J.
Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton er a/.). b. Funciones de Fe Como se usa en la presente, la citotoxicidad dependiente del complemento, CDC, se refiere al lisado de una célula blanco en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento es iniciada por la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula, por ejemplo un anticuerpo, en complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento se puede efectuar una prueba de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163.
Además, la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a los receptores de Fe (FcRs) presentes sobre ciertas células citotóxicas (por ejemplo células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos), permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula blanco que lleva el antígeno y subsiguientemente destruya la célula blanco con citotoxinas. Para dicha destrucción son absolutamente necesarios anticuerpos de IgG específicos de alta afinidad, dirigidos a las células citotóxicas del brazo objetivo . La lisis de la célula blanco es extracelular, requiere el contacto directo de célula con célula y no implica complemento.
Las variantes del modulador de EFNA con afinidad de unión de FcR o actividad ADCC alterada tienen actividad de unión de FcR y/o actividad de ADCC incrementada o disminuida, en comparación con un anticuerpo progenitoro no modificado, o con un modulador que comprende una región Fe de secuencia nativa. La variante de modulador que presenta unión aumentada a un FcR se une por lo menos a un FcR con mejor afinidad que el anticuerpo progenitor o no modificado, o que un modulador que comprende una región Fe de secuencia nativa. Una variante que presenta unión disminuida a FcR se une por lo menos a un FcR con una afinidad más baja que el anticuerpo progenitor o no modificado o que un modulador que comprende una región Fe de secuencia nativa. Esas variantes que presentan unión disminuida a un FcR pueden tener poca unión o unión no apreciable a un FcR, por ejemplo 0-20% de unión al FcR en comparación con la región de Fe con IgG de secuencia nativa, por ejemplo determinada mediante las técnicas muy conocidas.
En cuanto a FcRn, los anticuerpos de la presente invención también comprenden o abarcan variantes de Fe con modificaciones de la región constante que proveen vidas medias (por ejemplo vidas medias en el suero) en un mamífero, preferiblemente un humano, de más de 5 días, más de 10 días, más de 15 días, más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses o más de 5 meses. El aumento de las vidas medias de los anticuerpos (o moléculas que contienen Fe) de la presente invención en un mamífero, preferiblemente un humano, aumenta el título de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el suero del mamífero, y por lo tanto reduce la frecuencia de administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo por administrar. Los anticuerpos que tienen vida media in vivo aumentada pueden ser generados mediante las técnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos con vida media in wVoaumentada modificando (por ejemplo sustituyendo, suprimiendo o añadiendo) residuos de aminoácido identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (véanse por ejemplo las publicaciones internacionales Nos. WO 97/34631 ; WO 04/029207; patente de EE. UU. No. 6,737,056 y patente de EE. UU. No. 2003/0190311. La unión a FcRn humano in vivo y la vida media en el suero de polipéptidos de unión de alta afinidad de FcRn de humano puede ser evaluada, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas de células humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se les administran los polipéptidos con una región Fe variante. WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcRns. Véase también por ejemplo Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001 ). c. Modificaciones de qlicosilación En otras modalidades, se modifican los patrones de glicosilación o composiciones de los anticuerpos de la invención. Más particularmente, modalidades preferidas de la presente invención pueden comprender una o más glicoformas construidas por ingeniería, es decir, un patrón de glicosilación alterado o composición de carbohidratos alterada, que están unidas covalentemente a una molécula que comprende una región Fe. Las glicoformas construidas por ingeniería pueden ser útiles para una variedad de propósitos que incluyen, sin limitación, incrementar o reducir la función efectora, aumentar la afinidad del anticuerpo por un antígeno blanco, o facilitar la producción del anticuerpo. En los casos en donde se desea reducir la función efectora, se apreciará que la molécula se puede construir por ingeniería para expresarse en una forma aglicosilada. Estas modificaciones de carbohidrato se pueden realizar, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Esto es, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácido que resultan en la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de armazón de la región variable, para así eliminar la glicosilación en ese sitio (véase por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 5,714,350 y 6,350,861). Inversamente, se pueden impartir funciones efectoras incrementadas o unión mejorada a la molécula que contiene Fe construyendo por ingeniería uno o más sitios de glicosilación adicionales.
Adicional o alternativamente, se puede hacer que una variante Fe tenga una composición alterada de glicosilación, tal como un anticuerpo con hipofucosilación que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene un aumento de las estructuras de GIcNAc de bisección. Estos patrones de glicosilación alterados y otros similares han demostrado aumentar la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Las glicoformas diseñadas por ingeniería pueden ser generadas mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, por ejemplo usando cepas de expresión variante o construida por ingeniería, mediante coexpresióncon una o más enzimas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), expresando una molécula que comprende una región Fe en varios organismos o líneas de células de varios organismos, o por modificación de carbohidrato después de que se expresa la molécula que comprende la región Fe. Véase por ejemplo Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1 , también la patente europea No: EP 1 ,176,195; publicaciones de PCT WO 03/035835; WO 99/54342; Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields er a/, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473); patente de EE. UU. No. 6,602,684; documentos U.S.S. Nos. 10/277,370; 10/113,929; PCT WO 00/61739A1 ; PCT WO 01/292246A1 ; PCT WO 02/311 140A1 ; PCT WO 02/30954A1 ; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc.); tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART Biotechnology AG); WO 00061739; EA01229125; patente de EE. UU. No. 2003/01 15614; Okazaki er a/., 2004, JMB, 336: 1239-49.
IX. Expresión del modulador a. Panorama general El ADN que codifica los moduladores de EFNA deseados se puede aislar fácilmente y se puede determinar su secuencia usando los procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Células de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias derivadas de fago o levadura) pueden servir como la fuente preferida de este ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular más como se describe en la presente para crear agentes que incluyen proteínas de fusión o anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser modificado) se puede usar para clonar secuencias de región constante o variable para la fabricación de anticuerpos como se describe en patente de EE. UU. No. 7,709,611.
Este método ejemplar abarca la extracción de ARN de las células seleccionadas, la conversión a ADNc, y la amplificación por medio de PCR usando iniciadores específicos de anticuerpos. Los iniciadores adecuados son muy conocidos y, como se ejemplifica en la presente, están fácilmente disponibles de muchas fuentes comerciales. Se apreciará que, para expresar un anticuerpo recombinante humano o no humano aislado por cribadode una colección combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospederas, que incluyen células de mamífero, células de insecto, células de planta, levadura y bacteria. En otras modalidades, los moduladores se introducen y se expresan en células COS de simio, células NSO, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que, de otra manera, no producen la construcción deseada. Como se expone más abajo en mayor detalle, las células transformadas que expresan el modulador deseado se pueden desarrollar en cantidades relativamente grandes para proveer suministros químicos y comerciales de la construcción de fusión o inmunoglobulina.
Ya sea que el ácido nucleico que codifica la porción deseada del modulador de EFNA se obtenga o derivepor tecnología de despliegue de fago, colecciones de levadura, tecnología basada en hibridoma, sintéticamente o de fuentes comerciales, se entiende que la presente invención abarca explícitamente las moléculas y secuencias de ácido nucleico que codifican los moduladores de EFNA, que incluyen proteínas de fusión y anticuerpos anti-EFNA, o fragmentos de unión de antígeno o derivados de los mismos. La invención abarca, además, ácidos nucleicos o moléculas de ácido nucleico (por ejemplo polinucleótidos) que se hibridan bajo condiciones de hibridación de alta severidad, o alternativamente de severidad intermedia o baja (por ejemplo como se describe abajo), con polinucleótidos complementarios a los ácidos nucleicos que tienen una secuencia de polinucleótido que codifica un modulador de la invención, o un fragmento o una variante del mismo. El término molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico aislado, que se usa en la presente, incluye por lo menos moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola cadenao de doble cadena, pero preferiblemente es ADN de doble cadena. Además, la presente invención comprende cualquier vehículo o construcción que incorpore este polinucleótido que codifica el modulador, que incluye sin limitación vectores, plásmidos, células hospederas, cósmidos y construcciones virales.
El término ácido nucleico aislado significa que el ácido nucleico (i) fue amplificado in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), (ii) producido recombinantemente por clonación; (iii) purificado, por ejemplo por corte y fraccionamiento en gel electroforético; o (iv) sintetizado por ejemplo mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.
Más específicamente, también se proveen ácidos nucleicos que codifican un modulador, que incluyen una o las dos cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, polinucleótidos suficientes para usarse como sondas de hibridación, iniciadores de PCR o iniciadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos de antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de los anteriores. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Por ejemplo, pueden ser de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1 ,000, 1 ,500, 3,000, 5,000, o más nucleótidos de longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo un vector. Estos ácidos nucleicos pueden ser de una sola cadena o de doble cadena y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos péptidos). Preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican los moduladores de la invención, que incluyen anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos, han sido aislados como se describe arriba. b. Hibridación e identidad Como se indicó, la invención provee adicionalmente ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación particulares. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son muy conocidos. Véase por ejemplo "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Para los fines de la presente solicitud, una condición de hibridación moderadamente severa utiliza una solución de prelavado que contiene cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 5x, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente formamida al 50%, SSC6x, y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, como una que contiene formamida aproximadamente al 50%, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C en SSC0.5x, 0.1 % SDS. Una condición de hibridación severa se híbrida en SSC6x a 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC1x, 0.2% SDS a 68°C. Además, el experto en la materia puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o disminuir la severidad de la hibridación, de tal manera que los ácidos nucleicos que comprendan secuencias de nucleótidos que sean por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99% idénticas entre sí típicamente permanezcan hibridadas. Más generalmente, para los fines de la presente invención, el término sustancialmente idéntico con respecto a una secuencia de ácido nucleico se puede considerar como una secuencia de nucleótidos que exhibe por lo menos aproximadamente 85% o 90%, o 95% o 97% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de referencia.
Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación, y una guía para contemplar las condiciones adecuadas se exponen por ejemplo en Sambrook, Fritsch y Maníatis (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., cap. 9 y 1 1 ; y"Current Protocols in Molecular Bíology", 1995, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, Inc., sec. 2.10 y 6.3-6.4), y pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la materia basándose por ejemplo en la longitud y/o composición de bases del ácido nucleico.
Se apreciará además que los ácidos nucleicos, de acuerdo con la invención, pueden estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En modalidades preferidas, un ácido nucleico se enlaza funcionalmente con secuencias de control de expresión que pueden ser homologas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. En este contexto, el término homólogo significa que un ácido nucleico también está enlazado funcionalmente a la secuencia de control de expresión de forma natural, y el término heterólogo significa que un ácido nucleico no está enlazado funcionalmente a la secuencia de control de expresión de forma natural. c. Expresión Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia de control de expresión, están enlazados funcionalmente uno conla otra, si se enlazan covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico quede bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de expresión. Si el ácido nucleico va a ser traducido en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de expresión enlazada funcionalmente a una secuencia codificadora, la inducción de dicha secuencia de control de expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar una desviación de marco en la secuencia codificadora, o dicha secuencia codificadora no es susceptible de ser traducida en la proteína o péptido deseado.
El término secuencia de control de expresión comprende, de acuerdo a la invención, promotores, sitios de unión de ribosoma, incrementadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de ARNm. En modalidades particulares de la invención las secuencias de control de expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias de control de expresión puede variar en función déla especie o tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5'-no traducidas y 5'- y 3 '-no traducidas que están implicadas en la iniciación de la transcripción y traducción, respectivamente, tal como la caja TATA, secuencias de bloqueo, secuencia CAAT, etcétera. Más específicamente, las secuencias de control de expresión 5 '-no transcritas comprenden una región de promotor que incluye una secuencia promotora para el control de transcripción del ácido nucleico enlazado funcionalmente. Las secuencias de control de expresión también pueden comprender secuencias incrementadoras o secuencias activadorasde dirección 5'.
De acuerdo con la invención, el término de promotor o región de promotor se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está localizada en dirección 5' de la secuencia de ácido nucleico que se expresa, y controla la expresión de la secuencia suministrando un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa. La región de promotor puede incluir además sitios de reconocimiento y unión para factores adicionales implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser inducible y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor, o puede ser constitutivo si la transcripción no es controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no es expresado, o solamente es expresado en una pequeña magnitud, si está ausente un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se activa o el grado de transcripción aumenta. Esto es mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.
Los promotores que son preferidos de acuerdo a la invención incluyen promotores para polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 de humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales del mismo (por ejemplo, CMV), en donde una o más partes están fusionadas con una o más partes de promotores de genes de otras proteínas celulares, tales como por ejemplo GAPDH humana (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), e incluye o no incluye uno o más intrones adicionales.
De acuerdo con la invención, el término expresión se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN, o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión se puede efectuar transitoriamente o establemente.
En una modalidad preferida, de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico está presente en un vector, cuando sea apropiado con un promotor que controla la expresión del ácido nucleico. El término vector se usa en la presente en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermedio para un ácido nucleico que permita que dicho ácido nucleico, por ejemplo, sea introducido en células procariotas y/o eucariotas, y, cuando sea apropiado, se integre dentro de un genoma. Preferiblemente los vectores de este tipo se replican y/o se expresan en las células. Los vectores pueden comprender plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término plásmido, como se usa en la presente, se refiere en general a una construcción de material genético extracromosómico, usualmente un dúplex de ADN circular, que se puede replicar independientemente del ADN cromosómico.
En la práctica de la presente invención se apreciará que se usan opcionalmente muchas técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y tecnología de ADN recombinante. Estas técnicas convencionales están relacionadas con vectores, células hospederas y métodos recombinantes como se define en la presente. Estas técnicas son muy conocidas y se explican, por ejemplo, en Berger y Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, California; Sambrook et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual" (3aed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000;y"Current Protocols in Molecular Biology" F. M. Ausubel et al., eds., supra. Otras referencias útiles, por ejemplo para aislamiento y cultivo de células (por ejemplo para aislamiento subsiguiente de ácido nucleico o proteína) incluyen Freshney (1994) "Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique", tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York, y las referencias ahí citadas; Payne et a/.(1992) "Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems", Jonh Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg y Phillips (eds.) (1995),"Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods", Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heídelberg, Nueva York), y Atlas y Parks (eds.) "The Handbook of Microbiological Medía" (1993), CRC Press, Boca Ratón, Florida. En las referencias anteriores se describen métodos de preparación de ácidos nucleicos (por ejemplo mediante amplificación in vitro, purificación de células o síntesis química), métodos para manipulación de ácidos nucleicos (por ejemplo mutagénesís dirigida al sitio, digestión con enzima de restricción, ligación, etcétera), y varios vectores, líneas celulares, etcétera, útiles en la manipulación y preparación de ácidos nucleicos. Además, esencialmente cualquier polinucleótido (que incluye por ejemplo polinucleótidos marcados o bíotinilados) puede ser ordenado de la manera normal o personalizada a cualquiera de una variedad de fuentes comerciales.
De esta manera, en un aspecto, la presente invención provee células hospederas recombinantes que permiten la expresión recombinante de los anticuerpos de la invención o porciones de los mismos. Los anticuerpos producidos mediante la expresión en estas células hospederas recombinantes son referidos aquí como anticuerpos recombinantes. La presente invención también provee células de progenie de tales células hospederas, y anticuerpos producidos por las mismas.
El término célula hospedera recombinante (o simplemente célula hospedera), como se usa en la presente, significa una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que la célula hospedera recombinante y la célula hospedera significan no solo la célula sujeto particular sino también la progenie de dicha célula. Como pueden ocurrir algunas modificaciones en las generaciones subsiguientes debido a mutación o influencias ambientales, esta progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero todavía está incluida dentro del alcance del término célula hospedera como se usa en la presente. Estas células pueden comprender un vector de acuerdo a la invención como se describe arriba.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para preparar un anticuerpo o porción del mismo como se describe en la presente. De acuerdo con una modalidad, dicho método comprende cultivar una célula transfectada o transformada con un vector como se describe arriba, y recuperar el anticuerpo o porción del mismo.
Como se indica arriba, la expresión de un anticuerpo de la invención (o fragmento o variantes del mismo) comprende preferiblemente uno o más vectores de expresión que contienen un polinucleótido que codifica el anticuerpo anti-EFNA deseado. Métodos que son muy conocidos para los expertos en la materia se pueden usar para construir vectores de expresión que comprenden secuencias codificadoras de anticuerpo y señales apropiadas de control de transcripción y traducción. Estos métodos incluyen por ejemplo técnicas de ADN recombinante ¡n vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. De esta manera, las modalidades de la invención proveen vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-EFNA de la invención (por ejemplo un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, un Fv de una sola cadena, o fragmentos o variantes de los mismos), enlazada operativamente a un promotor. En modalidades preferidas, estos vectores pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de una molécula de anticuerpo (o fragmento de la misma), una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo (o fragmento del mismo), o la cadena tanto pesada como ligera.
Una vez que los nucleótidos de la presente invención se han aislado y modificado de acuerdo a las enseñanzas de la presente, se pueden usar para producir moduladores seleccionados que pueden incluir anticuerpos anti-EFNA o fragmentos de los mismos.
X. Producción y purificación del modulador Usando las técnicas reconocidas de biología molecular y la metodología actual de expresión de proteína, se pueden producir cantidades sustanciales de los moduladores deseados. Más específicamente, las moléculas de ácido nucleico que codifican los moduladores, tales como anticuerpos obtenidos y diseñados por ingeniería como se describe arriba, pueden ser integradas en sistemas de producción de proteína muy conocidos y disponibles comercialmente, que comprenden varios tipos de células hospederas para proveer cantidades preclínicas, clínicas o cantidades comerciales del producto farmacéutico deseado. Se apreciará que en modalidades preferidas las moléculas de ácido nucleico que codifican los moduladores seconstruyen por ingeniería y se integran en vectores o vectores de expresión que proveen la integración eficiente a la célula hospedera seleccionada y posteriormente un grado de expresión alto del modulador de EFNA deseado.
Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican losmoduladores de EFNA y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, se pueden usar para transfectar una célula hospedera adecuada de mamífero, planta, bacteria o levadura, aunque se apreciará que se pueden usar sistemas procarióticos para la producción del modulador. La transfección puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son muy conocidas e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación por fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polínucleótido en líposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero por medio de vectores virales. Los métodos de transformación de células de mamíferos son muy conocidos. Véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 , y 4,959,455. Además, los métodos de transformación de células de planta son muy conocidos, incluyendo por ejemplo la transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación, y transformación viral. Los métodos de transformación en células bacterianas y de levadura también son muy conocidos.
Además, la célula hospedera puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión de la invención, por ejemplo el primer vector codificando un polipéptido derivado de una cadena pesada y el segundo vector codificando un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión sustancialmente igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente se puede usar un solo vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. En dichas situaciones, preferiblemente la cadena ligera se pone antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica. Las secuencias codificadoras para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico. a. Sistemas de expresión en hospedero Una variedad de sistemas de vector de expresión en hospedero, muchos disponibles comercialmente, son compatibles con las enseñanzas de la presente y se pueden usar para expresar los moduladores de la invención. Estos sistemas de expresión de hospedero representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificadoras de interés pueden ser expresadas y subsecuentemente purificadas, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas, pueden expresar una molécula de la invención in situ. Estos sistemas incluyen, sin limitación, microorganismos como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Streptomyces) transformados con vectores de expresión recombinante de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN de cósmido, que contienen secuencias codificadoras del modulador; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transfectada con vectores de expresión recombinante de levadura que contienen las secuencias codificadoras del modulador; sistemas de célula de insecto infectados con vectores de expresión recombinante de virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificadoras del modulador; sistemas de células de plantas (por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, maíz, trigo, papa, etc.) infectadas con vectores de expresión recombinante de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV), o transfectadas con vectores de expresión recombinante de plásmido (por ejemplo, plásmido Ti) que contienenlas secuencias codificadoras del modulador; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alojan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína), o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
En los sistemas bacterianos.se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso deseado para la molécula expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una cantidad grande de esta proteína para la generación de composiciones farmacéuticas de un modulador, pueden ser convenientes vectores que dirigen la expresión de cantidades altas de productos de proteína de fusión que sean purificados fácilmente. Estos vectores incluyen, sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther er a/., EMBO 1. 2:1791 (1983)), en el que la secuencia codificadora se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificadora de lac Z, de tal manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); etcétera. También se pueden usar vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente de las células lisadas por adsorción y unión a cuentas de glutatiónagarosa de matriz, seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de corte de trombina o factor Xa de proteasa, de modo que el producto del gen blanco clonado pueda ser liberado de la porción GST.
En un sistema de insecto, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se puede usar como vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificadoras se pueden clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus, y ponerse bajo el control del promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).
En células hospederas de mamífero, se pueden usar varios sistemas de expresión virales para introducir la secuencia de nucleótidos deseada. Cuando se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia codificadora de interés se puede ligar en un complejo de control de transcripción/traducción, por ejemplo el promotor tardío y la secuencia guía tripartita. Este gen quimérico puede ser insertado entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula en los hospederos infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8 1 :355-359 (1984)). También se pueden requerir señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de las secuencias codificadoras insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión puede ser incrementada mediante la inclusión de elementos incrementadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etcétera (véase por ejemplo Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)). De esta manera, las líneas de células de mamífero compatibles, disponibles como hospederos para expresión, son muy conocidas e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Life Technologies), células NIH-3T3, células HeLa, células de riñon de hámster crío (BHK), células de riñon del' mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, y otras líneas de células.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por consiguiente, se pueden construir por ingeniería líneas de células que expresan establemente el modulador seleccionado usando las técnicas reconocidas estándares. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospederas pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, incrementadoras, terminadoras de transcripción, sitios de poliadenilación, etcétera), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN ajeno, las células construidas por ingeniería se pueden dejar desarrollar durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambia a un medio selectivo. El marcador seleccionare en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido en sus cromosomas y desarrollarse para formar focos, que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas de células. Convenientemente, este método se puede usar para construir por ingeniería líneas de células que expresan la molécula. Dichas líneas de células construidas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y evaluación de composiciones que interaccionan directa o indirectamente con la molécula.
Varios sistemas de selección son muy conocidos y se pueden usar, incluyendo sin limitación, los gens de timidina cinasa del virus de herpe simple (Wigler et al., Cell 11 :223(1977)), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybaiska & Szybaiski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:202(1992)), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:8 17(1980)), en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También se puede utilizar resistencia antimetabólica como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexate (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:357 (1981); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); 778 TECH 11 (5):155-215 (mayo de 1993)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147(1984)). Métodos comúnmente conocidos de tecnología de ADN recombinante se pueden aplicar rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y estos métodos se describen por ejemplo en Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, "Gene Transfer and Expressíon, A Laboratory Manual", Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), "Current Protocols in Human Genetics", John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garrapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981 ). Se apreciará que un método particularmente preferido para establecer una línea celular estable de alto rendimiento comprende el sistema de expresión del gen de glutamina sintetasa (el sistema GS) que provee un enfoque eficiente para incrementar la expresión bajo algunas condiciones. El sistema GS se expone parcial o totalmente con respecto a las patentes EP 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 y 0 338 841 , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
Además, se puede elegir una cepa de célula hospedera que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto de gen de la manera específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo glicosilación) y procesamiento (por ejemplo corte) de productos de proteínapueden ser importantes para la función y/o purificación de la proteína. Diferentes células hospederas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraducción y modificación de proteínas y productos de gen. Como se conoce en la técnica, las líneas de células apropiadas o sistemas hospederos se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento deseados del polipéptido expresado. Para este finjas células hospederas eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primarioja glicosilación y fosforilación del producto del gen, son particularmente eficaces para usarse en la presente invención. Por consiguiente, las células hospederas de mamífero particularmente preferidas incluyen, sin limitación, células CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, NSO, MDCK, 293, 3T3, W138, así como también líneas de células de cáncer de mama tales como por ejemplo BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y líneas de células normales de glándula mamaria.tales como por ejemplo CRL7O3Oy HsS78Bst. Dependiendo del modulador y el sistema de producción seleccionado, los expertos en la materia pueden seleccionar y optimizar fácilmente las células hospederas apropiadas para la expresión eficiente del modulador. b. Síntesis química Además de los sistemas de célula hospedera anteriormente mencionados, se apreciará que los moduladores de la invención pueden ser sintetizados químicamente usando las técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Creighton, 1983, "Proteíns: Structures and Molecular Principies", W.H. Freeman & Co., N.Y., y Hunkapiler, M., et al., 1984, Nature 310:105- 11). Por ejemplo, un péptido que corresponde a un fragmento de polipéptido de la invención se puede sintetizar usando un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en una secuencia de polipéptido. Los aminoácidos no clásicos incluyen, sin limitación, los isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino-isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino-butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino-hexanoico, Aib, ácido 2-amino-isobutírico, ácido 3-amino-propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseñado tales como b-metil-aminoácidos, Ca-metil-aminoácidos, Na-metil-aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio). c. Sistemas transgénicos Los moduladores de EFNA de la invención también se pueden producir por vía transgénica mediante la generación de un mamífero o planta que es transgénica para las secuencias de cadena pesada y ligera de ¡nmunoglobulina de interés (o fragmentos o derivados o variantes de las mismas), y la producción de los compuestos deseados en una forma recuperable. Con respecto a la producción transgénica en mamíferos, se pueden producir por ejemplo anticuerpos anti-EFNA, y recuperarse de la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, y 5,741 ,957. En algunas modalidades, animales transgénicos no humanos que comprenden locus de inmunoglobulina humana se inmunizan con EFNA o una porción inmunogénica del mismo como se describe arriba. Los métodos para preparar los anticuerpos en plantas se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos. 6,046,037 y 5,959,177.
De acuerdo con las enseñanzas de la presente, los animales no humanos o plantas transgénicos pueden ser producidos por la introducción de una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un modulador de EFNA de la invención en animales o plantas por medio de técnicas transgénicas estándares. Véase Hogan y la patente de EE. UU. No. 6,417,429. Las células transgénicas usadas para fabricar el animal transgénico pueden ser células madre embrionarias o células somáticas, o un huevo fertilizado. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser quiméricos, heterocigotos no quiméricos y homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual" 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., "Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach", Oxford University Press (2000); y Pinkert, "Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook", Academic Press(1999). En algunas modalidades, losanimalesno humanos transgénicos tienenuna interrupción y reemplazo dirigidos por medio de una construcción de direccionamiento que codifica, por ejemplo, una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. En una modalidad, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras que se unen específicamente a EFNA. Aunque los anticuerpos anti-EFNA se pueden hacer en cualquier animal transgénico, en modalidades particularmente preferidas los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, reses o caballos. En otras modalidades.el animal no humano transgénico expresa el producto farmacéutico deseado en la sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales, de donde es fácilmente obtenible usando las técnicas reconocidas de purificación.
Es probable que los moduladores, incluyendo los anticuerpos, expresados en diferentes líneas celulares o en animales transgénicos.tengan diferentes patrones de glicolisación entre sí. Sin embargo, todos los moduladores codificados por las moléculas de ácido nucleico provistos en la presente, o los que comprenden de las secuencias de aminoácidos provistas en la presente, son parte de la presente invención, independientemente del estado de glicosilación de la molécula, y más generalmente, independientemente de la presencia o ausencia de las modificaciones postraducción. Además, la invención abarca los moduladores que son modificados diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, modificación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, corte proteolítico, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etcétera. Cualquiera de las modificaciones químicas se puede efectuar mediante las técnicas conocidas que incluyen, sin limitación, corte químico específico con bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etcétera. También se incluyen en la invención varias modificaciones postraducción, por ejemplo, cadenas de carbohidrato N-enlazadou O-enlazado, procesamiento de extremos N-terminales o C-terminales, fijación de porciones químicas al esqueleto de aminoácido, modificaciones químicas de cadenas de carbohidrato N-enlazadou O-enlazado, y adición o supresión de un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresión en la célula hospedera procariota. Además, como se expone en el texto y en los ejemplos más abajo, los polipéptidos también pueden ser modificados con unamarca detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, radioisotópica o una marca de afinidad, para permitir la detección y aislamiento del modulador. d. Purificación Una vez que el modulador de la invención ha sido producido por expresión recombinante o por cualquier otra técnica mencionada en la presente, puede ser purificado por cualquier método conocido en la técnica de purificación de inmunoglobulinas, o más generalmente por cualquier otra técnica estándar de purificación de proteínas. A este respecto, el modulador puede ser aislado. Como se usa en la presente, un modulador aislado de EFNA es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos y no proteínicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in s fudentro de las células recombinantes porque al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el modulador de EFNA (por ejemplo, un anticuerpo anti-EFNA o un derivado o fragmento del mismo) puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente en el medio. Si la molécula deseada es producida intracelularmente, como primer paso, los desechos de partículas, o células hospederas o fragmentos lisados, pueden ser removidos, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltracíón. Por ejemplo, Cárter, et al., Bio/Technology 10:163 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3.5),EDTA,y fluoruro de fenilmetilsulfonílo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser removidos por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, primero los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. En cualquiera de los pasos precedentes puede ser incluido un inhibidor de proteasa, tal como PMSF.parainhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composición del modulador (por ejemplo, fc-EFNA oanticuerpo anti-EFNA) preparada de las células, pueden ser purificada usando por ejemplo cromatografía de h id roxi la patita, gel en electroforesis, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en la construcción seleccionada. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas de lgG1 , lgG2 o lgG4 humanas (Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para lgG3 de humano (Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)). La matriz a la que se fijará el ligando de afinidad muy frecuentemente es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tal como el vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten un flujo más rápido y un tiempo de procesamientomás corto del que se puede lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio de CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T, Baker; Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. También están disponibles otras técnicas de purificación de proteína, tales como el fraccionamiento sobre una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía deSepharosesobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico),cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo por recuperar. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención serán purificados, al menos en parte, usando cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G.
XI Moduladores de EFNA conjugados Una vez que los moduladores de la invención han sido purificados conforme a las enseñanzas de la presente, estos se pueden ligar, fusionar, conjugar (por ejemplo covalentemente o no covalentemente), o asociar de otra manera con porciones farmacéuticamente activas o diagnósticas, o con modificadores biocomplatibles. El término conjugado usado en la presente.se usará ampliamentey significa cualquier moléculaasociada conlos moduladores descritos, independientemente del método de asociación. A este respecto.se entenderá que tales conjugados pueden comprenderpéptidos, polipéptidos, proteínas, polímeros, moléculas de ácido nucleico, pequeñas moléculas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se indicó anteriormente, el conjugado seleccionado puede ser enlazado covalentemente o no covalentemente al modulador, y exhibe varias relaciones molares que dependen, por lo menos en parte, del método usado para efectuar la conjugación.
En modalidades preferidas, será evidente que los moduladores de la invención pueden ser conjugados o asociados con proteínas, polipéptidos o péptidos que impartan características seleccionadas (por ejemplo, biotoxinas, biomarcadores, marcadores de purificación, etc.). Más generalmente, en modalidades seleccionadas, la presente invención abarca el uso de moduladores o fragmentos de los mismos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con una proteína o polipéptido heterólogo, en donde el polipéptido comprende por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90 o por lo menos 00 aminoácidos. La construcción no necesariamente necesita ser enlazada directamente, pero puede ocurrir a través de secuencias de enlazador. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos hacia tipos de células particulares que expresan EFNA, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los moduladores de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores particulares de la superficie de la célula. Además, moduladores fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos pueden usarse también en inmunoensayos in vitro, y pueden ser compatibles con la metodología de purificación conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 93/21232; la patente europea No. EP 439,095; Naramura er a/., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99; la patente de E.U.A. No. 5,474,981 ; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; y Fell et al., 1991 , J. Immunol. 146: 2446-2452. a. Modificadores biocompatibles En una modalidad preferida, los moduladores de la invención pueden ser conjugados o de otra manera asociados con modificadores biocompatibles que pueden usarse para ajustar, alterar, mejorar o moderar características del modulador, según se desee. Por ejemplo, anticuerpos o construcciones de fusión con vidas medias in vivo incrementadas, pueden generarse uniendo moléculas de polímero de peso molecular relativamente alto, tales como polietilenglicol (PEG) disponible comercialmente o polímeros biocompatibles similares. Los expertos en la técnica apreciarán que puede obtenerse PEG en muchas configuraciones moleculares y peso molecular diferentes que pueden seleccionarse para impartir propiedades específicas al anticuerpo (por ejemplo, la vida media puede ser adaptada). El PEG puede ser unido a moduladores o fragmentos de anticuerpo o derivados con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de conjugación específica de sitio del PEG al extremo N- o C- terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o por medio de grupos amino épsilon presentes en residuos de lisina. Puede usarse derivatización de polímeros lineales o ramificados que resulte en pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede monitorearse estrechamente medíante SDS-PAGE y espectrometría de masa para garantizar la conjugación óptima de las moléculas de PEG a las moléculas de anticuerpo. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico. En una manera similar, los moduladores descritos pueden ser conjugados con albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo, o para que tenga una vida media in vivo más larga. Las técnicas son bien conocidas en la materia; véase, por ejemplo, la publicación internacional Nos. WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea No. 0 413,622. Otros conjugados biocompatibles son evidentes para los expertos en la técnica, y pueden identificarse fácilmente de acuerdo con las enseñanzas en la presente. b. Agentes de diagnóstico o de detección En otras modalidades preferidas, moduladores de la presente invención, o fragmentos o derivados de los mismos, son conjugados con un agente de diagnóstico o detectable, marcador o reportero que puede ser una molécula biológica (por ejemplo, un péptido o nucleótido), una pequeña molécula, fluoróforo o radioisótopo. Los moduladores marcados pueden ser útiles para monitorear el desarrollo o la progresión de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de prueba clínico para determinar la eficacia de una terapia particular, incluyendo los moduladores descritos (es decir, teragnósticos). Dichos marcadores o reporteros pueden ser también útiles para purificar el modulador seleccionado, separando o aislando TIC, o en procedimientos preclínicos o estudios de toxicología.
Dicho diagnóstico y detección puede lograrse acoplando el modulador a sustancias detectables que incluyen, pero no están limitadas a, varias enzimas que comprenden, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos tales como, pero no limitados a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero no limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, pero no limitados a, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero no limitados a, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos tales como, pero no limitados a, yodo (131l, 125l, 123l, 12 l), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115ln, 113ln, 112ln, 1 1ln) y tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón ( 33Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 53Gd, 169Yb, 5 Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; metales que emiten positrones usando varias tomografías de emisión de positrones, iones de metales paramagnéticos no radiactivos, y moléculas que son radiomarcadas o conjugadas con radioisótopos específicos. En dichas modalidades, la metodología de detección apropiada es bien conocida en la técnica y fácilmente disponible de numerosas fuentes comerciales.
Como se indicó anteriormente, en otras modalidades, los moduladores o fragmentos de los mismos pueden ser fusionados con secuencias de marcadores, tales como un péptido o fluoróforo que facilite la purificación, o procedimientos de diagnóstico tales como inmunohistoquímica o FACs. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de hexa-histidina (SEQ ID NO: 166), tal como el marcador provisto en un vector pQE (Qiagen), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por ejemplo, la hexa-histidina (SEQ ID NO: 166) provee la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros marcadores de péptidos útiles para la purificación incluyen, pero no están limitados a, el marcador de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767) y el marcador "flag" (véase el documento U.S.P.N. 4,703,004). c. Porciones terapéuticas Como se refirió anteriormente, los moduladores o fragmentos o derivados de los mismos pueden ser también conjugados, enlazados o fusionados, o de otra manera asociados, con una porción terapéutica tal como agentes anticancerosos, una citotoxina o agente citotóxico, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ión de metal radiactivo, por ejemplo, emisores alfa o beta. Como se usa en la presente, una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente o porción terapéutica que sea perjudicial para las células, y pueda inhibir el crecimiento o la supervivencia de las células. Ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina, maytansinoides tales como D -1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deh¡drotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirrubicina y ciclofosfamida, y análogos u homólogos de los mismos. Citotoxinas adicionales comprenden auristatinas, que incluyen monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tales como alfa-amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina o épsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG), agentes que se unen a la ranura menor del ADN, tales como derivados de duocarmicina (Syntarga, B.V.) y dímeros de pirrolobenzodiazepina modificados (PBDs, Spirogen, Ltd). Además, en una modalidad, los moduladores de EFNA de la presente invención pueden ser asociados con moléculas de unión anti-CD3 para reclutar células T citotóxicas, y tienen como objetivo las células que inician tumores (tecnología BiTE; véase, por ejemplo, Fuhrmann, S. eí. al. Encuentro Anual de AACR, Resumen No. 5625 (2010), cita incorporada en la presente como referencia).
Porciones terapéuticas compatibles adicionales comprenden agentes citotóxicos que incluyen, pero no están limitados a, anti-metabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Una lista más extensiva de porciones terapéuticas puede encontrarse en la publicación del PCT WO 03/075957 y en el documento U.S.P.N. 2009/0155255, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia.
Los moduladores seleccionados pueden ser también conjugados con porciones terapéuticas tales como materiales radiactivos o agentes quelantes macrocíclicos útiles para la conjugación de iones de metales radiactivos (véase anteriormente para ejemplos de materiales radiactivos). En ciertas modalidades, el agente quelante macrocíclico es ácido 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA), el cual puede ser unido al anticuerpo por medio de una molécula de enlazador. Dichas moléculas de enlazador son conocidas comúnmente en la técnica, y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; y Zimmerman et al., 1999, Nucí. Med. Biol. 26: 943.
Ejemplos de radioisótopos que pueden ser compatibles con este aspecto de la invención incluyen, pero no están limitados a, yodo ( 31l, 125l, 123l, 1211), carbono (1 C), cobre (62Cu, 6 Cu, 67Cu), azufre (35S), tritio (3H), indio (115ln, 113ln, 112ln, 111ln), bismuto (212Bi, 213Bi), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 1 9Pm, 1 0La, 75Yb, 166Ho, 90Y, 7Sc, 186Re, 188Re, 14 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 5 Mn, 75Se, 113Sn, 117Tin, 225Ac, 76Br y 211At. Otros radionúclidos están también disponibles como agentes terapéuticos y de diagnóstico, especialmente aquellos en la escala de energía de 60 a 4,000 keV. Dependiendo de la condición que se va a tratar y el perfil terapéutico deseado, los expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente el radioisótopo apropiado para su uso con los moduladores descritos.
Los moduladores de EFNA de la presente invención pueden ser también conjugados con una porción terapéutica o fármaco que modifique una respuesta biológica dada (por ejemplo, modificadores de respuesta biológica o BRMs). Es decir, no se considerará que las porciones o agentes terapéuticos compatibles con la presente invención se limitan a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, en modalidades particularmente preferidas, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido o fragmento de los mismos que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconase (u otra ribonucleasa citotóxica), exotoxina de Pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón ß, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, FNT-a, FNT-ß, AIM I (véase la publicación internacional No. WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional No. WO 97/3491 1), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567) y VEGI (véase la publicación internacional No. WO 99/23105), un agente antitrombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos ("GM-CSF") y factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento ("GH"). Como se expuso anteriormente, métodos para fusionar o conjugar moduladores con porciones de polipéptidos se conocen en la técnica. Además de las referencias descritas anteriormente véase, por ejemplo, los documentos U.S.P. Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 y 5,1 12,946; EP 307,434; EP 367,166; publicaciones del PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi ef al., 1991 , PNAS USA 88: 10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 1 1337, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. La asociación de un modulador con una porción no necesariamente necesita ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias de enlazador. Dichas moléculas de enlazador son conocidas comúnmente en la técnica, y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553; Zimmerman eí al., 1999, Nucí Med Biol 26: 943; y Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171 , cada una de estas citas siendo incorporada en la presente como referencia.
Más generalmente, técnicas para la conjugación de porciones terapéuticas o agentes citotóxicos con moduladores, son bien conocidas. Las porciones pueden ser conjugadas con moduladores mediante cualquier método reconocido en la técnica que incluye, pero no está limitado a, enlace de aldehído/Schiff, enlace de sulfhidrilo, enlace lábil al ácido, enlace de cis-aconitilo, enlace de hidrazona, enlace enzimáticamente degradable (véase, en general, Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171). Véase también, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a. ed.), Robinson eí al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. En modalidades preferidas, un modulador de EFNA que es conjugado con una porción terapéutica o agente citotóxico, puede ser internado por una célula tras la unión a una molécula de EFNA asociada con la superficie de la célula, suministrando de esta manera la carga útil terapéutica.
XII. Diagnóstico y selección a. Diagnóstico Como se indicó, la presente invención provee métodos in vitro o in vivo para detectar, diagnosticar o monitorear trastornos hiperproliferativos, y métodos de selección de células de un paciente para identificar células tumorigénicas que incluyen TPCs. Dichos métodos incluyen identificar a un individuo que tiene cáncer para el tratamiento o monitoreo de la progresión de un cáncer, que comprenden poner en contacto el paciente o una muestra obtenida de un paciente con un modulador de EFNA seleccionado como se describe en la presente, y detectar la presencia o ausencia, o el nivel de asociación del modulador con el ligando efrina A unido o libre en la muestra. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo, la asociación con la EFNA particular en la muestra denota probablemente que la muestra puede contener células que perpetúan tumores (por ejemplo, células madre de cáncer), indicando que el individuo que tiene cáncer puede ser tratado efectivamente con un modulador de EFNA como se describe en la presente. Los métodos pueden comprender además un paso de comparar el nivel de unión con un control. A la inversa, cuando el modulador seleccionado es Fc-EFNA, las propiedades de unión del ligando efrina A seleccionado pueden ser explotadas o monitoreadas (directamente o indirectamente, in vivo o in vitro) cuando en contacto con la muestra, provee la información deseada. Otros métodos de diagnóstico o teragnóstico compatibles con las enseñanzas en la presente son bien conocidos en la técnica, y pueden ponerse en práctica usando materiales comerciales tales como sistemas de reporte dedicados.
En una modalidad particularmente preferida, los moduladores de la presente invención pueden usarse para detectar y cuantificar los niveles de EFNA en una muestra de un paciente (por ejemplo, plasma o sangre), los cuales pueden usarse a su vez para detectar, diagnosticar o monitorear trastornos asociados con EFNA, incluyendo trastornos hiperproliferativos. Una de dichas modalidades se expone en el ejemplo 17 más adelante, el cual provee la detección de EFNA en muestras de plasma.
Ejemplos de métodos de prueba compatibles incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos de enzimas, pruebas de unión competitiva, inmunoensayo fluorescente, pruebas immunoblot, análisis Western Blot, análisis de citometría de flujo y pruebas de ELISA. Más generalmente, la detección de EFNA en una muestra biológica o la medición de la actividad enzimática de EFNA (o inhibición de la misma), puede lograrse usando cualquier prueba conocida en la técnica. El teragnóstico o diagnóstico in vivo compatible puede comprender técnicas de monitoreo o de formación de imágenes reconocidas en la materia, tales como formación de imágenes de resonancia magnética (MRI), tomografía computada (por ejemplo, exploración CAT), tomografía de positrones (por ejemplo, exploración PET), radiografía, ultrasonido, etc. Los expertos en la técnica serán capaces de reconocer e ¡mplementar fácilmente técnicas apropiadas de detección, monitoreo o formación de imágenes (con frecuencia comprendiendo fuentes disponibles comercialmente) basadas en la etiología, manifestación patológica o progresión clínica del trastorno.
En otra modalidad, la invención provee un método de análisis de la progresión y/o la patogénesis del cáncer in vivo. En otra modalidad, el análisis de la progresión y/o la patogénesis del cáncer in vivo comprende determinar el grado de progresión del tumor. En otra modalidad, el análisis comprende la identificación del tumor. En otra modalidad, el análisis de la progresión del tumor se lleva a cabo en el tumor primario. En otra modalidad, el análisis se lleva a cabo con el tiempo, dependiendo del tipo de cáncer como es sabido por los expertos en la técnica. En otra modalidad, otro análisis de los tumores secundarios que se originan de células que sufren metástasis del tumor primario, se lleva a cabo in vivo. En otra modalidad, se analizan el tamaño y la forma de los tumores secundarios. En algunas modalidades, se lleva a cabo análisis ex vivo adicional.
En otra modalidad, la invención provee un método de análisis de la progresión y/o la patogénesis del cáncer in vivo, que incluye determinar la metástasis de las células. En otra modalidad, el análisis de la metástasis de las células comprende la determinación del crecimiento progresivo de las células en un sitio que es discontinuo del tumor primario. En otra modalidad, el sitio del análisis de la metástasis de las células comprende la vía de la diseminación neoplásica. En algunas modalidades, las células pueden dispersarse por medio de la vasculatura sanguínea, los nodulos linfáticos, dentro de las cavidades del cuerpo, o combinaciones de los mismos. En otra modalidad, el análisis de la metástasis de las células se lleva a cabo en vista de la migración, diseminación, extravasación o proliferación de las células, o combinaciones de las mismas.
En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas en un sujeto o una muestra de un sujeto pueden evaluarse o caracterizarse usando los moduladores descritos antes de la terapia o régimen para establecer una línea base. En otros ejemplos, la muestra se deriva de un sujeto que fue tratado. En algunos ejemplos, la muestra se toma del sujeto por lo menos aproximadamente 1 , 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60 o 90 días, 6 meses, 9 meses, 12 meses o más de 12 meses, después de que el sujeto comienza o termina el tratamiento. En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas se evalúan o se caracterizan después de un cierto número de dosis (por ejemplo, después de 2, 5, 10, 20, 30 o más dosis de una terapia). En otros ejemplos, las células tumorigénicas se caracterizan o se evalúan después de 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o más, después de que reciben una o más terapias.
En otro aspecto, y como se discute en más detalle a continuación, la presente invención provee kits para detectar, monitorear o diagnosticar un trastorno hiperproliferativo, identificando al individuo que tiene dicho trastorno para tratamiento posible o monitoreo de la progresión (o regresión) del trastorno en un paciente, en donde el kit comprende un modulador como se describe en la presente, y reactivos para detectar el impacto del modulador en una muestra. b. Selección Los moduladores de EFNA, y células, cultivos, poblaciones y composiciones que comprenden los mismos, incluyendo la progenie de los mismos, pueden usarse también para seleccionar o identificar compuestos o agentes (por ejemplo, fármacos) que afectan una función o actividad de las células que inician tumores o la progenie de las mismas, interactuando con un ligando efrina A (por ejemplo, el polipéptido o los componentes genéticos de la misma). La invención provee además por lo tanto sistemas y métodos para la evaluación o la identificación de un compuesto o agente que puede afectar una función o actividad de las células que inician tumores o la progenie de las mismas, por asociación con EFNA o sus substratos. Dichos compuestos y agentes pueden ser candidatos de fármacos que se seleccionan, por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo. En una modalidad, un sistema o método incluye células que inician tumores que exhiben EFNA y un compuesto o agente (por ejemplo, fármaco), en donde las células y el compuesto o agente (por ejemplo, fármaco) están en contacto entre sí.
La invención provee además métodos de selección e identificación de moduladores de EFNA o agentes y compuestos para alterar una actividad o función de las células que inician tumores o las células de la progenie de las mismas. En una modalidad, un método incluye poner en contacto células que inician tumores o progenie de las mismas con un agente o compuesto de prueba; y determinar si el agente o compuesto de prueba modula una actividad o función de las células que inician tumores asociadas con el ligando efrina A.
Un agente o compuesto de prueba que modula una actividad o función relacionada con EFNA de dichas células que inician tumores o progenie de las mismas dentro de la población, identifica al agente o compuesto de prueba como un agente activo. Ejemplos de la actividad o función que puede ser modulada incluyen cambios en la morfología de las células, expresión de un marcador, diferenciación o desdiferenciación, maduración, proliferación, viabilidad, apoptosis, o muerte celular de células progenitoras neuronales o progenie de las mismas.
El término poner en contacto, cuando se usa con relación a células o un cultivo de células o paso de método o tratamiento, significa una interacción directa o indirecta entre la composición (por ejemplo, un ligando efrina A asociado con una célula o cultivo de células) y otra entidad referida. Un ejemplo particular de una interacción directa es la interacción física. Un ejemplo particular de una interacción indirecta es donde una composición actúa sobre una molécula intermediaria que a su vez actúa sobre la entidad referida (por ejemplo, célula o cultivo de células).
En este aspecto de la invención, el término modula indica influir sobre una actividad o función de las células que inician tumores o células de progenie, en una manera compatible con la detección de los efectos sobre la actividad o función de las células que se ha determinado es relevante para un aspecto particular (por ejemplo, metástasis o proliferación) de las células que inician tumores o células de progenie de la invención. Ejemplos de actividades y funciones incluyen, pero no están limitados a, la medición de morfología, marcadores de desarrollo, diferenciación, proliferación, viabilidad, respiración celular, actividad mitocondrial, integridad de la membrana, o la expresión de marcadores asociados con ciertas condiciones. Por consiguiente, un compuesto o agente (por ejemplo, un candidato de fármaco) puede evaluarse por su efecto sobre las células que inician tumores o células de progenie, poniendo en contacto dichas células o células de progenie con el compuesto o agente, y midiendo cualquier modulación de una actividad o función de las células que inician tumores o células de progenie como se describe en la presente, o como sería sabido por los expertos en la técnica.
Los métodos de selección e identificación de agentes y compuestos incluyen aquellos adecuados para la selección de alto rendimiento, la cual incluye disposición de células (por ejemplo, microdisposiciones) posicionadas o puestas opcionalmente, en sitios o direcciones predeterminadas. Los métodos de manejo manual o de robótica de alto rendimiento pueden sondear interacciones químicas, y determinar los niveles de expresión de muchos genes en un periodo corto. Se han desarrollado técnicas que utilizan señales moleculares (por ejemplo, fluoróforos) y análisis automatizados, que procesan la información a una velocidad muy rápida (véase, por ejemplo, Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 133 (2004)). Por ejemplo, la tecnología de microdisposiciones se ha usado extensivamente para sondear las interacciones de miles de genes a la vez, mientras que provee información para genes específicos (véase, por ejemplo, Mocellin y Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007)).
Dichos métodos de selección (por ejemplo, de alto rendimiento) pueden identificar agentes y compuestos activos rápidamente y eficientemente. Por ejemplo, las células pueden ser posicionadas o puestas (pre-sembradas) sobre una placa de cultivo, tubo, matraz, botella rodante o placa (por ejemplo, una placa o caja de cavidades múltiples individuales, tal como una placa o caja de 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 cavidades múltiples), opcionalmente en sitios definidos, para la identificación de moléculas potencialmente terapéuticas. Colecciones que pueden seleccionarse incluyen, por ejemplo, colecciones de pequeñas moléculas, colecciones de exhibición de fagos, colecciones de exhibición de levaduras y de anticuerpos completamente humanos (Adimab, LLC), colecciones de ARNsi, y vectores de transfección adenovirales.
XIII. Preparaciones farmacéuticas y usos terapéuticos a Formulaciones y vías de administración Dependiendo de la forma del modulador junto con cualquier conjugado opcional, el modo de suministro deseado, la enfermedad que está siendo tratada o monitoreada y numerosas otras variables, las composiciones de la presente invención pueden formularse según se desee usando técnicas reconocidas en la materia. Es decir, en varias modalidades de la presente invención, composiciones que comprenden moduladores de EFNA se formulan con una amplia variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables (véase, por ejemplo, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, vigésima ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a. ed., Lippincott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a. ed., Pharmaceutical Press (2000)). Varios vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, adyuvantes y diluyentes, están fácilmente disponibles de numerosas fuentes comerciales. Además, está también disponible un surtido de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores y amortiguadores de pH, agentes ajustadores de la tonicidad, estabilizadores, agentes mojantes, y similares. Ciertos ejemplos no limitativos de vehículos incluyen solución salina, solución salina amortiguadora, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos.
Más particularmente, se apreciará que, en algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de la invención pueden administrarse en forma pura o con un mínimo de componentes adicionales. A la inversa, los moduladores de EFNA de la presente invención pueden formularse opcionalmente para que contengan vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprendan excipientes y auxiliares que son bien conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración del modulador o que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que son farmacéuticamente optimizadas para suministro hacia el sitio de acción. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o puede actuar como un diluyente para mejorar la farmacocinética del modulador. Excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, agentes estabilizadores, agentes mojantes y emulsificantes, sales para hacer variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, amortiguadores, e intensificadores de penetración en la piel.
Los moduladores descritos para administración sistémica pueden formularse para administración enteral, parenteral o tópica. Por supuesto, pueden usarse los tres tipos de formulación simultáneamente para lograr la administración sistémica del ingrediente activo. Excipientes así como formulaciones para el suministro parenteral y no parenteral de fármacos, se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, vigésima ed. Mack Publishing (2000). Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos según sea adecuado para suspensiones oleosas para inyección. Solventes lipofílicos o vehículos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrán. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores. Pueden usarse también liposomas para encapsular el agente para suministro en la célula.
Formulaciones adecuadas para administración enteral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, pildoras, tabletas que incluyen tabletas recubiertas, elíxires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de las mismas.
En general, los compuestos y composiciones de la invención que comprenden moduladores de EFNA, pueden administrarse in vivo a un sujeto que necesita de los mismos, mediante varias vías que incluyen, pero no están limitadas a, las vías oral, intravenosa, intra-arterial, subcutánea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracardiaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, rectal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o de otra manera mediante implantación o inhalación. Las presentes composiciones pueden formularse en preparaciones en las formas sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa e incluyen, pero no están limitadas a, tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhalantes y aerosoles. La formulación y vía de administración adecuada puede seleccionarse de acuerdo con la aplicación y el régimen terapéutico deseados. b. Dosificaciones Asimismo, el régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, la oportunidad y la repetición, dependerán del individuo particular y la historia médica de ese individuo. Consideraciones empíricas tales como la farmacocinética (por ejemplo, vida media, velocidad de depuración, etc.), contribuirán a la determinación de la dosificación. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el curso de la terapia, y se basa en la reducción del número de células hiperproliferativas o neoplásicas, incluyendo las células que inician tumores, manteniendo la reducción de dichas células neoplásicas, reduciendo la proliferación de células neoplásicas, o retardando el desarrollo de metástasis. En forma alternativa, pueden ser adecuadas las formulaciones de liberación continua sostenida de una composición terapéutica en cuestión. Como se refirió anteriormente, varias formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida se conocen en la técnica.
Desde un punto de vista terapéutico, las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad efectiva para el tratamiento o profilaxis de la indicación específica. La cantidad terapéuticamente^ efectiva depende típicamente del peso del sujeto que está siendo tratado, su condición física o de salud, la progresión de la condición que se va a tratar, o la edad del sujeto que está siendo tratado. En general, los moduladores de EFNA de la invención pueden administrarse en una cantidad en la escala de aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertas modalidades, los moduladores de EFNA de la invención pueden administrarse en una cantidad en la escala de aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas otras modalidades, los moduladores de EFNA de la invención pueden administrarse en una cantidad en la escala de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Opcionalmente, los moduladores de EFNA de la invención pueden administrarse en una cantidad en la escala de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. Además opcionalmente, los moduladores de EFNA de la invención pueden administrarse en una cantidad en la escala de aproximadamente 0.5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención se proveen a una dosis de por lo menos aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, por lo menos aproximadamente 250 pg/kg de peso corporal, por lo menos aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal, por lo menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, por lo menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o por lo menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.
Otros regímenes de dosificación pueden predecirse con base en los cálculos del área de superficie corporal (BSA) como se describe en el documento U.S.P.N. 7,744,877, el cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como es bien sabido en la técnica, el BSA se calcula usando la estatura y el peso del paciente, y provee una medida de la estatura del sujeto, según se representa por el área de superficie de su cuerpo. En modalidades seleccionadas de la invención que usan el BSA, los moduladores pueden administrarse en dosificaciones de 10 mg/m2 a 800 mg/m2. En otras modalidades preferidas, los moduladores se administrarán en dosificaciones de 50 mg/m2 a 500 mg/m2, y aún más preferiblemente a dosificaciones de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 o 450 mg/m2. De hecho, se apreciará que, sin tener en cuenta de cómo se calculan las dosificaciones, pueden administrarse dosificaciones múltiples durante un periodo seleccionado para proveer una dosificación absoluta que sea sustancialmente mayor que las administraciones individuales.
En cualquier caso, los moduladores de EFNA se administran de preferencia según sea necesario a sujetos que necesitan de los mismos. La determinación de la frecuencia de administración puede ser hecha por los expertos en la técnica, tales como un médico a cargo basado en las consideraciones de la condición que está siendo tratada, la edad del sujeto que está siendo tratado, la severidad de la condición que está siendo tratada, el estado de salud general del sujeto que está siendo tratado, y similares. En general, una dosis efectiva del modulador de EFNA se administra a un sujeto una o más veces. Más particularmente, una dosis efectiva del modulador se administra al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes, o menos de una vez al mes. En ciertas modalidades, la dosis efectiva del modulador de EFNA puede administrarse veces múltiples, incluyendo por periodos de por lo menos un mes, por lo menos seis meses, o por lo menos un año.
Las dosificaciones y los regímenes pueden determinarse también empíricamente para las composiciones terapéuticas descritas en individuos a quienes se les han dado una o más administraciones. Por ejemplo, a los individuos se les pueden dar dosificaciones crecientes de una composición terapéutica producida como se describe en la presente. Para evaluar la eficacia de la composición seleccionada, puede usarse a continuación un marcador de la enfermedad, trastorno o condición específico, como se describió anteriormente. En modalidades en donde el individuo tiene cáncer, estos incluyen mediciones directas del tamaño del tumor por medio de palpación u observación visual, medición indirecta del tamaño del tumor mediante técnicas de rayos X u otras técnicas de formación de imágenes; una mejora según se evalúa mediante una biopsia directa del tumor y examen microscópico de la muestra del tumor; la medición de un marcador indirecto del tumor (por ejemplo, PSA para cáncer de próstata) o un antígeno identificado de conformidad con los métodos descritos en la presente, una disminución en el dolor o parálisis; habla, visión, respiración u otra incapacidad mejorada asociada con el tumor; apetito incrementado; o una mejora en la calidad de vida según se mide mediante pruebas aceptadas o la prolongación de la supervivencia. Será evidente para los expertos en la técnica que la dosificación variará dependiendo del individuo, el tipo de condición neoplásica, la etapa de la condición neoplásica, si la condición neoplásica ha comenzado a sufrir metástasis hacia otro sitio en el individuo, y los tratamientos pasados y concurrentes que están siendo usados. c Terapias de combinación Las terapias de combinación contempladas por la invención pueden ser particularmente útiles en la disminución o inhibición de la proliferación no deseada de células neoplásicas (por ejemplo, células endoteliales), disminución de la ocurrencia de cáncer, disminución o prevención de la recidiva de cáncer, o disminución o prevención de la diseminación o metástasis de cáncer. En dichos casos, los compuestos de la presente invención pueden funcionar como un agente de sensibilización o quimiosensibilización removiendo el mantenimiento de TPC y evitando la perpetuación de la masa tumoral (por ejemplo, células NTG), y permiten el uso más efectivo de los agentes anticancerosos o de extirpación, del estándar de cuidado actual. Es decir, una terapia de combinación que comprenda un modulador de EFNA y uno o más agentes anticancerosos puede usarse para disminuir un cáncer establecido, por ejemplo, para disminuir el número de células cancerosas presentes y/o para disminuir la carga del tumor, o mejorar por lo menos una manifestación o efecto secundario del cáncer. Como tal, la terapia de combinación se refiere a la administración de un modulador de EFNA y uno o más agentes anticancerosos que incluyen, pero no están limitados a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes quimioterapéuticos, agentes anticancerosos elegidos como objetivo, modificadores de respuesta biológica, agentes inmunoterapéuticos, vacunas contra el cáncer, agentes anti-angiogénicos, citocinas, terapias hormonales, radioterapia y agentes anti-metastásicos.
De conformidad con los métodos de la presente invención, no existe el requerimiento de que los resultados combinados sean aditivos a los efectos observados cuando cada tratamiento (por ejemplo, anticuerpo anti-EFNA y agente anticanceroso) se lleva a cabo por separado. Aunque por lo menos los efectos aditivos son generalmente deseables, cualquier efecto anti-tumoral incrementado arriba de una de las terapias individuales es benéfico. Además, la invención no requiere que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que con ciertas combinaciones seleccionadas que comprendan modalidades preferidas, puede observarse sinergia.
Para poner en práctica la terapia de combinación de conformidad con la invención, un modulador de EFNA (por ejemplo, anticuerpo anti-EFNA) en combinación con uno o más agentes anticancerosos puede administrarse a un sujeto que necesita del mismo en una manera efectiva que resulte en actividad anticancerosa dentro del sujeto. El modulador de EFNA y el agente anticanceroso se proveen en cantidades efectivas y por periodos efectivos que resultan en su presencia combinada y sus acciones combinadas en el ambiente del tumor, según se desee. Para lograr este propósito, el modulador de EFNA y el agente anticanceroso pueden administrarse al sujeto simultáneamente, ya sea en una sola composición, o como dos o más composiciones distintas usando las mismas vías de administración o vías de administración distintas.
En forma alternativa, el modulador puede preceder, o seguir, al tratamiento con el agente anticanceroso, por ejemplo, mediante intervalos que varían de minutos a semanas. En ciertas modalidades en donde el agente anticanceroso y el anticuerpo se aplican por separado al sujeto, el periodo entre el tiempo de cada suministro es tal, que el agente anticanceroso y el modulador son capaces de ejercer un efecto combinado sobre el tumor. En una modalidad particular, contempla que tanto el agente anticanceroso como el modulador de EFNA se administren dentro de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas uno del otro.
En otras modalidades, varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) pueden transcurrir entre la administración del modulador y el agente anticanceroso. El modulador de EFNA y uno o más agentes anticancerosos (terapia de combinación) pueden administrarse una vez, dos veces o por lo menos el periodo hasta que la condición sea tratada, aliviada o curada. De preferencia, la terapia de combinación se administra veces múltiples. La terapia de combinación puede administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede ser sobre un plan tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses o una vez cada seis meses, o puede administrarse continuamente por medio de una minibomba. Como se indicó anteriormente, la terapia de combinación puede administrarse por medio de una vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La terapia de combinación puede administrarse en un sitio distante del sitio del tumor. La terapia de combinación se administrará generalmente en tanto el tumor esté presente, siempre que la terapia de combinación haga que el tumor o cáncer deje de crecer o que disminuya en peso o volumen.
En una modalidad, un modulador de EFNA se administra en combinación con uno o más agentes anticancerosos por un ciclo de tratamiento corto a un sujeto que necesita del mismo. La duración de tratamiento con el anticuerpo puede variar de acuerdo con el agente anticanceroso particular usado. La invención contempla también la administración discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. Un tiempo de tratamiento adecuado para un agente anticanceroso particular será apreciado por los expertos en la técnica, y la invención contempla la evaluación continua de planes de tratamiento óptimos para cada agente anticanceroso.
La presente invención contempla por lo menos un ciclo, de preferencia más de un ciclo durante el cual la terapia de combinación se administra. Un periodo apropiado para un ciclo será apreciado por los expertos en la técnica, y será el número total de ciclos, y el intervalo entre los ciclos. La invención contempla la evaluación continua de planes de tratamiento óptimos para cada modulador y agente anticanceroso. Además, la invención provee también más de una administración del anticuerpo anti-EFNA o el agente anticanceroso. El modulador y el agente anticanceroso pueden administrarse recíprocamente, en días o semanas alternos; o puede darse una secuencia de tratamiento con el anticuerpo, seguida de uno o más tratamientos de terapia con el agente anticanceroso. En cualquier caso, como será entendido por los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de agentes quimioterapéuticos serán generalmente alrededor de aquellas ya usadas en las terapias clínicas en donde los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos.
En otra modalidad preferida, los moduladores de EFNA de la presente invención pueden usarse en la terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la posibilidad de recidiva del tumor después de la presentación inicial de la enfermedad. De preferencia, el trastorno habrá sido tratado y la masa tumoral inicial eliminada, reducida o de otra manera mejorada, de modo que el paciente esté asintomático o esté en remisión. Como dicho tiempo, al sujeto se le pueden administrar cantidades farmacéuticamente efectivas de los moduladores descritos una o más veces aún cuando exista poca o ninguna indicación de enfermedad, usando procedimientos de diagnóstico estándar. En algunas modalidades, los efectores se administrarán sobre un plan regular durante un periodo. Por ejemplo, los moduladores de EFNA podrían administrarse semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Dadas las enseñanzas en la presente, el experto en la técnica podría determinar fácilmente las dosificaciones y los regímenes de dosificación favorables para reducir el potencial de recidiva de la enfermedad. Además, dichos tratamientos podrían continuarse por un periodo de semanas, meses, años o incluso indefinidamente, dependiendo de la respuesta del paciente y los parámetros clínicos y de diagnóstico.
En otra modalidad preferida, los efectores de la presente invención pueden usarse para profilácticamente prevenir o reducir la posibilidad de metástasis del tumor después de un procedimiento de extirpación. Como se usa en la presente descripción, un procedimiento de extirpación se define ampliamente, y significará cualquier procedimiento, técnica o método que elimine, reduzca, trate o mejore un tumor o la proliferación del tumor. Ejemplos de procedimientos de extirpación incluyen, pero no están limitados a, cirugía, tratamientos de radiación (es decir, radiación con haces), quimioterapia o ablación. En tiempos apropiados determinados fácilmente por los expertos en la técnica en vista de la presente descripción, los moduladores de EFNA pueden administrarse según sea sugerido por los procedimientos clínicos y de diagnóstico o teragnósticos para reducir la metástasis del tumor. Los moduladores pueden administrarse una o más veces a dosificaciones farmacéuticamente efectivas, según se determina usando técnicas estándar. De preferencia, el régimen de dosificación irá acompañado por técnicas de diagnóstico o monitoreo adecuadas que permitan que sea modificado, según sea necesario. d. Agentes anticancerosos Como se usa en la presente, el término agente anticanceroso significa cualquier agente que pueda usarse para tratar un trastorno proliferativo celular tal como cáncer, e incluye agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes anti-angiogénicos, agentes de extirpación, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticancerosos elegidos como objetivo, modificadores de respuesta biológica, anticuerpos y agentes inmunoterapéuticos. Se apreciará que, en modalidades seleccionadas como se discutió anteriormente, los agentes anticancerosos pueden comprender conjugados, y pueden estar asociados con moduladores antes de la administración.
El término agente citotóxico significa una sustancia que disminuye o inhibe la función de células y/o causa la destrucción de células, es decir, la sustancia es tóxica para las células. Típicamente, la sustancia es una molécula de ocurrencia natural derivada de un organismo vivo. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, toxinas de pequeña molécula o toxinas enzimáticamente activas de bacterias (por ejemplo, toxina de la difteria, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, entere-toxina A de Staphylococcus), hongos (por ejemplo, a-sarcina, restrictocina), plantas (por ejemplo, abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antiviral de la hierba carmín, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de la cebada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos) o animales, por ejemplo, ribonucleasas citotóxicas, tales como las ribonucleasas pancreáticas extracelulares; y desoxirribonucleasa I, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.
Un agente quimioterapéutico significa un compuesto químico que disminuye o inhibe no específicamente el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células cancerosas (por ejemplo, agentes citotóxicos o citostáticos). Dichos agentes químicos son dirigidos con frecuencia hacia procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o la división de la célula, y de esta manera son particularmente efectivos contra células cancerosas, las cuales generalmente crecen y se dividen rápidamente. Por ejemplo, la vincristina despolimeriza los microtúbulos, y de esta manera evita que las células entren en mitosis. En general, los agentes quimioterapéuticos pueden incluir cualquier agente químico que inhiba, o esté diseñado para inhibir, una célula cancerosa, o una célula que probablemente se volverá cancerosa o generará progenie tumorigénica (por ejemplo, TIC). Dichos agentes se administran con frecuencia, y son con frecuencia más efectivos, en combinación, por ejemplo, en la formulación CHOP.
Ejemplos de agentes anticancerosos que pueden usarse en combinación con (o conjugados con) los moduladores de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, agentes alquilantes, alquilsulfonatos, aziridinas, etileniminas y metilamelaminas, acetogeninas, una camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, una sarcodictiina, espongistatina, mostazas de nitrógeno, antibióticos, antibióticos de enediina, dinemicina, bisfosfonatos, una esperamicina, cromoproteína enediina, antibióticos, cromóforos, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN®, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de purina, andrógenos, anti-adrenales, regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, una epotilona, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinano, lonidainina, maytansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, clorambucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11), inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF-A que reducen la proliferación celular, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Incluidos también en esta definición, son los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre los tumores, tales como los anti-estrógenos y los moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs), inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regulan la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales, y anti-andrógenos; así como troxacitabina (un análogo de citosina del nucleósido de 1 ,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión del VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas; rlL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otras modalidades comprenden el uso de anticuerpos aprobados para la terapia del cáncer e incluyen, pero no están limitados a, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicina, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, patitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotin. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente agentes anticancerosos adicionales que sean compatibles con las enseñanzas en la presente. e. Radioterapia La presente invención provee también la combinación de moduladores de EFNA con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir localmente daño del ADN dentro de las células tumorales, como es el caso de: irradiación gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas, y similares). Se contempla también la terapia de combinación usando el suministro dirigido de radioisótopos hacia las células tumorales, y puede usarse con relación a un agente anticanceroso elegido como objetivo u otros medios de direccionamiento. Típicamente, la radioterapia se administra en pulsos durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. La radioterapia puede administrarse a sujetos que tengan cáncer de cabeza y cuello, por aproximadamente 6 a 7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una sola dosis o como dosis secuenciales múltiples. f. Condiciones neoplásicas Si se administran solos o en combinación con un agente anticanceroso o radioterapia, los moduladores de EFNA de la presente invención son particularmente útiles para tratar generalmente condiciones neoplásicas en pacientes o sujetos, las cuales pueden incluir tumores benignos o malignos (por ejemplo, tumores renal, de hígado, riñon, vejiga, mama, gástrico, de ovario, colorrectal, de próstata, pancreático, de pulmón, tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y malignidades linfoides; otros trastornos tales como los trastornos neuronal, glial, astrocital, hipotalámico y otros trastornos glandulares, macrofagales, epiteliales, estromáticos y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos o inmunológicos y trastornos causados por patógenos. Objetivos particularmente preferidos para tratamiento con las composiciones y los métodos terapéuticos de la presente invención, son condiciones neoplásicas que comprenden tumores sólidos. En otras modalidades preferidas, los moduladores de la presente invención pueden usarse para el diagnóstico, prevención o tratamiento de malignidades hematológicas. De preferencia, el sujeto o paciente que se va a tratar será humano aunque, como se usa en la presente, los términos se mantienen expresamente para comprender cualquier especie de mamífero.
Más específicamente, las condiciones neoplásicas sujetas a tratamiento de conformidad con la presente invención pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero no está limitado a, tumores de glándulas suprarrenales, cánceres asociados con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma escamocelular y carcinoma de células de transición), cáncer de huesos (adamantinoma, quistes óseos aneurismáticos, osteocondroma, osteosarcoma), cánceres de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos, cáncer de mama, tumores del cuerpo carotídeo, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma, carcinoma cromófobo de células renales, carcinoma de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores desmoplásicos de pequeñas células redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis ósea imperfecta, displasia fibrosa del hueso, cánceres de vesícula biliar y conductos biliares, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cánceres de pulmón (carcinoma de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma escamocelular, carcinoma de células grandes etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas papilares de tiroides, tumores de paratiroides, cánceres pediátricos, tumores periféricos de la vaina nerviosa, feocromocitoma, tumores de pituitaria, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomiosarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas de tejidos blandos, cáncer escamocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastásico de tiroides y cánceres uterinos (carcinoma del cerviz, carcinoma endometrial y leiomioma). En ciertas modalidades preferidas, las células cancerosas se seleccionan del grupo de tumores sólidos que incluyen, pero no están limitados a, cáncer de mama, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcomas, cáncer metastásico renal, cáncer metastásico de tiroides y carcinoma de células claras.
Con respecto a malignidades hematológicas, se apreciará adicionalmente que los compuestos y métodos de la presente invención pueden ser particularmente efectivos en el tratamiento de una variedad de linfomas de células B, que incluyen linfoma de células foliculares (FCL) NHL/de bajo grado, linfoma de células del manto (MCL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), NHL linfocítico pequeño (SL), NHL folicular/de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL ¡nmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células pequeñas no dividido de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados con SIDA, linfoma monocítico de células B, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfoblastoma linfocítico de células pequeñas, folicular, difuso de células grandes, difuso de células pequeñas dividido, inmunoblástico de células grandes, linfoma de células pequeñas, linfoma no dividido, linfoma folicular de Burkitt y no de Burkitt, predominantemente de células grandes; linfoma folicular, predominantemente de células pequeñas dividido; y linfomas folicular, mixto de células pequeñas dividido y de células grandes. Véase, Gaidono et al., "Lymphomas", en CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5a. ed. 1997). Debe ser claro para los expertos en la técnica, que estos linfomas tendrán con frecuencia diferentes nombres debido a los sistemas de clasificación cambiantes, y que los pacientes que tienen linfomas clasificados bajo diferentes nombres, pueden beneficiarse también de los regímenes terapéuticos combinados de la presente invención.
En otras modalidades preferidas, los moduladores de EFNA pueden usarse para tratar efectivamente ciertas malignidades mieloides y hematológicas que incluyen leucemias tales como leucemia linfocítica crónica (CLL o B-CLL). La CLL es predominantemente una enfermedad del anciano que comienza a aumentar en incidencia después de los cincuenta años de edad, y alcanza un pico alrededor de los sesenta años. Implica generalmente la proliferación de linfocitos neoplásicos de sangre periférica. El hallazgo clínico de la CLL implica linfocitosis, linfadenopatía, esplenomegalia, anemia y trombocitopenia. Un rasgo característico de la CLL es la proliferación de células B monoclonales y la acumulación de linfocitos B detenidos en una etapa de diferenciación intermedia, en donde dichas células B expresan la IgM de superficie (slgM) o slgM y slgD, y una cadena ligera individual a densidades menores que las de las células B normales. Sin embargo, como se discutió anteriormente y como se muestra en los ejemplos anexos, la expresión de EFNA seleccionada (por ejemplo, EFNA) es sobrerregulada en las células de la B-CLL, proveyendo de esta manera un objetivo atractivo para los moduladores descritos.
La presente invención provee también un tratamiento preventivo o profiláctico de los sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos. No se cree que algún tipo particular de tumor o trastorno neoplásico deba ser excluido del tratamiento usando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la invención en combinación con agentes terapéuticos secundarios, en particular agentes quimioterapéuticos y agentes anticancerosos elegidos como objetivo.
Todavía otras modalidades preferidas de la presente invención comprenden el uso de moduladores de EFNA para tratar a sujetos que sufren de tumores sólidos. En dichos sujetos, muchos de estos tumores sólidos comprenden tejido que exhibe varias mutaciones genéticas que pueden hacerlos particularmente susceptibles al tratamiento con los efectores descritos. Por ejemplo, las mutaciones KRAS, APC y CTNNB1 y CDH1 son relativamente comunes en los pacientes con cáncer colorrectal. Además, los pacientes que sufren de tumores con estas mutaciones son usualmente los más refractarios a las terapias actuales; especialmente aquellos pacientes con mutaciones KRAS. Las mutaciones de activación KRAS, las cuales resultan típicamente en sustituciones de aminoácidos individuales, están también implicadas en otras malignidades difíciles de tratar, que incluyen adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso y carcinoma ductal del páncreas.
Actualmente, la predicción más confiable de si los pacientes con cáncer colorrectal responderán a los fármacos que inhiben al EGFR o VEGF, por ejemplo, es poner a prueba ciertas mutaciones de "activación" KRAS. KRAS es mutada en 35 a 45% de los cánceres colorrectales, y los pacientes cuyos tumores expresan KRAS mutada, no responden bien a estos fármacos. Por ejemplo, las mutaciones KRAS son proféticas de una falta de respuesta a la terapia con panitumumab y cetuximab en cáncer colorrectal (Lievre et al. Cáncer Res66: 3992-5; Karapetis et al. NEJM 359: 1757-1765). Aproximadamente 85% de los pacientes con cáncer colorrectal tienen mutaciones en el gen APC (Markowitz y Bertagnolli. A/EJ/W361 : 2449-60), y más de 800 mutaciones APC se han caracterizado en los pacientes con poliposis adenomatosa familiar y cáncer colorrectal. Una mayoría de estas mutaciones resulta en una proteína APC truncada con capacidad funcional reducida para mediar la destrucción de la beta-catenina. Las mutaciones en el gen de beta-catenina, CTNNB1 , pueden resultar también en estabilización incrementada de la proteína, resultando en la importación nuclear y la activación subsiguiente de varios programas de transcripción oncogénicos, el cual es también el mecanismo de la oncogénesis que resulta de la falla de la APC mutada para mediar adecuadamente la destrucción de la beta-catenina, la cual se requiere para mantener los programas normales de proliferación y diferenciación de las células bajo control.
La pérdida de la expresión de CDH1 (E-cadherina) es otra ocurrencia común en el cáncer colorrectal, observada con frecuencia en las etapas más avanzadas de la enfermedad. La E-cadherina es el miembro central de las uniones de la adherina que unen y organizan a las células en las capas epiteliales. Normalmente, la E-cadherina secuestra físicamente a la beta-catenina (CTNNB1 ) en la membrana plasmática; la pérdida de la expresión de la E-cadherina en el cáncer colorrectal, resulta en la localización de la beta-catenina hacia el núcleo y la activación por transcripción de la vía de la beta-catenina/WNT. La señalización aberrante de la beta-catenina/WNT es central para la oncogénesis, y la beta-catenina nuclear ha sido implicada en la falta de represión del cáncer (Schmalhofer ef al., 2009 PMID 19153669). La E-cadherina se requiere para la expresión y función de EphA2, un miembro de unión conocido para los ligandos de EFNA en las células epiteliales (Dodge Zantek ef al., 1999 PMID 10511313; Orsulic S y Kemler R, 2000 PMID 10769210). El uso de moduladores que se unen a los ligandos de EFNA y agonizan o antagonizan la unión del receptor Eph puede modificar, interrumpir o revertir los procesos pro-oncogénicos. En forma alternativa, los moduladores de EFNA pueden unirse de preferencia a las células tumorales con interacciones aberrantes de Eph/efrina basadas en las preferencias de unión de los moduladores de EFNA. Por lo tanto, los pacientes con cánceres que poseen los rasgos genéticos mencionados anteriormente, pueden beneficiarse del tratamiento con los moduladores de EFNA mencionados anteriormente.
XIV. Artículos de fabricación Se proveen también empaques y kits farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores, que comprenden una o más dosis de un modulador de EFNA. En ciertas modalidades, se provee una dosificación unitaria, en donde la dosificación unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende, por ejemplo, un anticuerpo anti-EFNA, con o sin uno o más agentes adicionales. Para otras modalidades, dicha dosificación unitaria se provee en una jeringa pre-llenada de un sólo uso para inyección. En otras modalidades, la composición contenida en la dosificación unitaria puede comprender solución salina, sacarosa, o similares; un amortiguador, tal como amortiguador de fosfato, o similares; y/o puede formularse dentro de una escala de pH estable y efectiva. En forma alternativa, en ciertas modalidades, la composición puede proveerse como un polvo liofilizado que puede ser reconstituido tras la adición de un liquido adecuado, por ejemplo, agua estéril. En ciertas modalidades preferidas, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación de proteínas e incluyen, pero no están limitadas a, sacarosa y arginina. Cualquier etiqueta en, o asociada con, los contenedores, indica que la composición incluida se usa para el diagnóstico o tratamiento de la condición de enfermedad de elección.
La presente invención provee también kits para producir unidades de administración de una sola dosis o de dosis múltiples de un modulador de EFNA y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos. El kit comprende un contenedor y una etiqueta o inserción del empaque en o asociado con el contenedor. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse de una variedad de matenales tales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la condición, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón horadable por una aguja de inyección hipodérmica). Dichos kits contendrán en general en un contenedor adecuado una formulación farmacéuticamente aceptable del modulador de EFNA y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos en el mismo contenedor o en contenedores diferentes. Los kits pueden contener también otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para diagnóstico o terapia combinada. Por ejemplo, además del modulador de EFNA de la invención, dichos kits pueden contener cualquiera de uno o más de una gama de agentes anticancerosos tales como fármacos quimioterapéuticos o radio-terapéuticos; agentes anti-angiogénicos; agentes anti-metastásicos; agentes anticancerosos elegidos como objetivo; agentes citotóxicos; y/u otros agentes anticancerosos. Dichos kits pueden proveer también reactivos adecuados para conjugar el modulador de EFNA con un agente anticanceroso o agente de diagnóstico (véase, por ejemplo, el documento U.S.P.N. 7,422,739, el cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia).
Más específicamente, los kits pueden tener un contenedor individual que contiene al modulador de EFNA, con o sin componentes adicionales, o pueden tener distintos contenedores para cada agente deseado. En donde se proveen terapéuticas combinadas para conjugación, una solución individual puede ser pre-mezclada, ya sea en una combinación equivalente molar, o con un componente en exceso del otro. En forma alternativa, el modulador de EFNA y cualquier agente anticanceroso opcional del kit pueden mantenerse por separado dentro de contenedores distintos antes de la administración a un paciente. Los kits pueden comprender también un segundo/tercer medio contenedor para contener un amortiguador estéril farmacéuticamente aceptable u otro diluyente tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), solución de Ringer y solución de dextrosa.
Cuando los componentes del kit se proveen en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es de preferencia una solución acuosa, siendo particularmente preferida una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit pueden proveerse como polvos desecados. Cuando se proveen reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo puede ser reconstituido mediante la adición de un solvente adecuado. Se contempla que el solvente pueda proveerse también en otro contenedor.
Como se indicó en forma breve anteriormente, los kits pueden contener también medios por los cuales se administra el anticuerpo y algún componente opcional a un animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, pipeta u otro de dichos aparatos, del cual la formulación puede ser inyectada o introducida en el animal, o aplicada a un área deseada del cuerpo. Los kits de la presente invención incluirán también típicamente medios para contener los viales, o similares, y otro componente en estrecho confinamiento para venta comercial tal como, por ejemplo, inyección o contenedores de plástico moldeados por soplado, en los cuales los viales deseados y otro aparato son puestos y retenidos. Cualquier etiqueta o inserción del empaque indica que la composición del modulador de EFNA se usa para el tratamiento de cáncer, por ejemplo, cáncer colorrectal.
XV. Reactivos de investigación Otras modalidades preferidas de la invención explotan también las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o sub-poblaciones de células que inician tumores a través de métodos tales como la separación de células activada por fluorescencia (FACS), la separación de células activada por un campo magnético (MACS) o el seccionamiento mediado por láser. Los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores pueden usarse en varias técnicas compatibles para la caracterización y manipulación de TIC que incluyen células madre de cáncer (véase, por ejemplo, los documentos U.S.P. Nos. 12/686,359, 12/669,136 y 12/757,649, cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia).
XVI. Tópicos diversos A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos técnicos y científicos usados con relación a la presente invención tendrán los significados que son entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares incluirán las pluralidades, y los términos plurales incluirán el singular. Más específicamente, como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, y similares. Además, las escalas provistas en la especificación y en las reivindicaciones anexas incluyen los puntos finales y todos los puntos entre los puntos finales. Por lo tanto, una escala de 2.0 a 3.0 incluye 2.0, 3.0, y todos los puntos entre 2.0 y 3.0.
En general, la nomenclatura usada con relación a, y las técnicas de, cultivo de células y cultivo de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente, son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo de la presente especificación, a menos que se indique otra cosa. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a. ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane,"Using Antibodies: A Laboratory Manual", Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan et al., "Short Protocols in Protein Science", Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se llevan a cabo comúnmente en la técnica o como se describen en la presente. La nomenclatura usada con relación a, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, son aquellos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica.
Todas las referencias o documentos descritos o citados dentro de esta especificación se incorporan, sin limitación, en su totalidad en la presente como referencia. Además, los encabezados de cualquier sección usados en la presente son sólo para propósitos de organización, y no se considerará que limitan la materia en cuestión descrita.
EJEMPLOS La presente invención, generalmente descrita de esta manera anteriormente, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proveen a manera de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. No se pretende que los ejemplos representen que los experimentos siguientes sean todos o los únicos experimentos llevados a cabo. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es a presión atmosférica o cerca de la misma.
EJEMPLO 1 Enriquecimiento de poblaciones de células que inician tumores Para caracterizar la heterogeneidad celular de tumores sólidos como existen en los pacientes con cáncer, dilucidar la identidad de células que perpetúan tumores (TPC; es decir, células madre de cáncer: CSC) usando marcadores fenotípicos particulares, e identificar objetivos terapéuticos clínicamente relevantes, un gran banco de tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX) se desarrolló y se mantuvo usando técnicas reconocidas en la materia. El banco de tumores NTX, que comprende un gran número de líneas de células tumorales discretas, se propagó en ratones inmunocomprometidos a través de pasadas múltiples de células tumorales heterogéneas obtenidas originalmente de numerosos pacientes con cáncer afligidos por una variedad de malignidades de tumores sólidos. La disponibilidad continua de un gran número de líneas de células tumorales NTX de pasada temprana discretas que tienen linajes bien definidos, facilita ampliamente la identificación y el aislamiento de TPC, ya que permiten la caracterización reproducible y repetida de células purificadas de las líneas de células. Más particularmente, las TPC aisladas o purificadas se definen más precisamente retrospectivamente de acuerdo con su capacidad para generar tumores fenotipicamente y morfológicamente heterogéneos, en ratones que recapitulan la muestra de tumor del paciente de la cual las células se originaron. De esta manera, la capacidad para usar pequeñas poblaciones de células aisladas para generar tumores completamente heterogéneos en ratones, es fuertemente indicativa del hecho de que las células aisladas comprenden TPC. En dicho trabajo, el uso de líneas de células NTX con pasadas mínimas, simplifica ampliamente la experimentación in vivo y provee resultados fácilmente verificables. Además, los tumores NTX de pasada temprana responden también a agentes terapéuticos tales como el irinotecan (es decir, Camptosar®), lo cual provee discernimientos clínicamente relevantes en los mecanismos subyacentes que dirigen el crecimiento del tumor, la resistencia a las terapias actuales y la recidiva del tumor.
Conforme las líneas de células tumorales NTX se establecieron, los fenotipos de células tumorales constituyentes se analizaron usando citometría de flujo para identificar marcadores discretos que podrían usarse para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células que inician tumores (TIC), y separar o analizar células TPC y TProg dentro de dichas poblaciones. A este respecto, los inventores usaron una plataforma de base proteómica patentada (es decir, la disposición PhenoPrint™) que provee la caracterización rápida de las células con base en la expresión de proteínas, y la identificación concomitante de marcadores potencialmente útiles. La disposición PhenoPrint es una plataforma proteómica patentada que comprende cientos de moléculas de unión discretas, muchas obtenidas de fuentes comerciales, dispuestas en placas de 96 cavidades, en donde cada cavidad contiene un anticuerpo distinto en el canal fluorescente de ficoeritrina y anticuerpos adicionales múltiples en diferentes fluorocromos dispuestos en cada cavidad a través de la placa. Esto permite la determinación de los niveles de expresión del antígeno de interés en una subpoblación de células tumorales seleccionadas a través de la inclusión rápida de células relevantes o la eliminación de células no relevantes por medio de canales no de ficoeritrina. Cuando la disposición PhenoPrint se usó en combinación con técnicas de disociación de tejidos, trasplante y uso de células madre bien conocidas en la materia (Al-Hajj ef al., 2004, Dalerba et al., 2007 y Dylla et al., 2008, citas referidas anteriormente, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), fue posible identificar efectivamente marcadores relevantes, y posteriormente aislar y trasplantar subpoblaciones de células tumorales humanas específicas con gran eficiencia.
Por consiguiente, después de que se establecen varias líneas de células tumorales NTX como se hace comúnmente para tumores humanos en ratones severamente inmunocomprometidos, los tumores fueron resecados de los ratones tras alcanzar 800 - 2,000 mm3, y las células se disociaron en suspensiones de células individuales usando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (véase, por ejemplo, el documento U.S.P.N. 2007/0292414, el cual se incorpora en la presente como referencia). Los datos obtenidos de estas suspensiones usando la disposición PhenoPrint, proveen la expresión de las proteínas de superficie absoluta (por célula) y relativa (contra otras células en la población), sobre una base de célula por célula, llevando a la caracterización y estratificación más complejas de las poblaciones de células. Más específicamente, el uso de la disposición PhenoPrint permitió la identificación rápida de proteínas o marcadores que distinguieron presuntamente a las TIC o TPC de las células tumorales globales NTG y el estroma del tumor y, cuando se aislan de modelos de tumores NTX, proveen la caracterización relativamente rápida de subpoblaciones de células tumorales que expresan diferentes niveles de proteínas específicas de la superficie de la célula. En particular, las proteínas con expresión heterogénea a través de la población de células tumorales permiten el aislamiento y el trasplante de subpoblaciones de células tumorales distintas y altamente purificadas que expresan altos y bajos niveles de una proteína o marcador particular en ratones inmunocomprometidos, facilitando de esta manera la evaluación de si las TPC fueron enriquecidas en una subpoblación u otra.
El término enriquecimiento se usa con el mismo significado que el aislamiento de células, y significa que el rendimiento (fracción) de células de un tipo es incrementado sobre la fracción de otros tipos de células en comparación con la población de células de partida o inicial. De preferencia, el enriquecimiento se refiere al incremento del porcentaje por aproximadamente 10%, por aproximadamente 20%, por aproximadamente 30%, por aproximadamente 40%, por aproximadamente 50% o más de 50% de un tipo de célula en una población de células, en comparación con la población de células de partida.
Como se usa en la presente un marcador, en el contexto de una célula o tejido, significa cualquier característica en la forma de una entidad química o biológica que está identificablemente asociada con, o específicamente encontrada en o sobre una célula, población de células o tejido particular, incluyendo aquellas identificadas en o sobre un tejido o población de células afectados por una enfermedad o trastorno. Como se manifiesta, los marcadores pueden ser de naturaleza morfológica, funcional o bioquímica. En modalidades preferidas, el marcador es un antígeno de la superficie de la célula que es diferencialmente o preferiblemente expresado por tipos de célula específicos (por ejemplo, TPC), o por células bajo ciertas condiciones (por ejemplo, durante puntos específicos del ciclo de vida de la célula o células en un nicho particular). De preferencia, dichos marcadores son proteínas, y más preferiblemente, poseen un epítope para anticuerpos, aptámeros u otras moléculas de unión como es sabido en la técnica. Sin embargo, un marcador puede consistir de cualquier molécula encontrada sobre la superficie o dentro de una célula e incluye, pero no está limitada a, proteínas (péptidos y polipéptidos), lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos y esferoides. Ejemplos de características o rasgos morfológicos del marcador incluyen, pero no están limitados a, forma, tamaño y relación nuclear a citoplásmica. Ejemplos de características o rasgos funcionales del marcador incluyen, pero no están limitados a, la capacidad para adherirse a substratos particulares, la capacidad para incorporar o excluir colorantes particulares, por ejemplo, pero no limitada a, la exclusión de colorantes lipofílicos, la capacidad para migrar bajo condiciones particulares, y la capacidad para diferenciarse a lo largo de linajes particulares. Los marcadores pueden ser también una proteína expresada de un gen reportero, por ejemplo, un gen reportero expresado por la célula como resultado de la introducción de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el gen reportero en la célula, y su transcripción que resulta en la producción de la proteína reportera que puede usarse como un marcador. Dichos genes reporteros que pueden usarse como marcadores son, por ejemplo, pero no limitados a, enzimas proteínas fluorescentes, proteínas cromoméricas, genes de resistencia, y similares.
En un sentido relacionado, el término fenotipo marcador en el contexto de un tejido, célula o población de células (por ejemplo, un fenotipo de TPC estable), significa cualquier marcador o combinación de marcadores que puede usarse para caracterizar, identificar, separar, aislar o enriquecer una célula o población de células particular (por ejemplo, mediante FACS). En modalidades específicas, el fenotipo marcador es un fenotipo de la superficie de la célula que puede determinarse detectando o identificando la expresión de una combinación de marcadores de la superficie de la célula.
Los expertos en la técnica reconocerán que numerosos marcadores (o su ausencia) se han asociado con varias poblaciones de células madre de cáncer, y se han usado para aislar o caracterizar subpoblaciones de células tumorales. A este respecto, ejemplos de marcadores de células madre de cáncer comprenden OCT4, Nanog, STAT3, EPCA , CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, receptor de transferrina, JAM3, carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestina, Sox1 , Bmi-1 , eed, easyhl , easyh2, mf2, yy1 , smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcEI , mllt3, FZD1 , FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1 RAP, TEM8, TMPRSS4, UC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11 , PPAP2C, CAV1 , CAV2, PTPN3, EPHA1 , EPHA2, SLC1A1 , CX3CL1 , ADORA2A, MPZL1 , FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1 , TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1 , IL1 R1 , 0PN3, DAF, MUC1 , MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1 , SLC19A2, ABCA1 , PCDH7, ADCY9, SLC39A1 , NPC1 , ENPP1 , N33, GPNMB, LY6E, CELSR1 , LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, ß-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31 , CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1 , GLI2, CD49b y CD49f. Véase, por ejemplo, Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 y U.S.P.N. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 201 1/0020221 , citas que se incorporan en la presente como referencia. Se apreciará que muchos de estos marcadores se incluyeron en la disposición PhenoPrint descrita anteriormente.
Asimismo, ejemplos no limitativos de fenotipos de la superficie de la célula asociados con células madre de cáncer de ciertos tipos de tumor, incluyen CD44hiCD24l0w, ALDH+, CD133+, CD123\ CD34+CD38", CD44+CD24", CD46hiCD324+CD66c", CD133+CD34+CD10"CD19", CD138"CD34"CD19+, CD133+RC2+, CD44+a2 PihiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+ y ABCB5+, así como otros fenotipos de la superficie de células madre de cáncer que se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Schulenburg et al., 2010, citado anteriormente, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 y el documento U.S.P.N. 2008/0138313, citas que se incorporan en s totalidad en la presente como referencia. Los expertos en la técnica apreciarán que fenotipos marcadores tales como los inmediatamente ejemplificados anteriormente, pueden usarse en conjunto con el análisis citométrico de flujo estándar y técnicas de separación de células, para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células o poblaciones de células TIC y/o TPC para análisis posterior. De interés con respecto a la presente invención CD46, CD324 y, opcionalmente, CD66c, son altamente o heterogéneamente expresados sobre la superficie de muchas células tumorales de cáncer colorrectal ("CR"), de mama ("BR"), pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), pulmonar de células pequeñas (SCLC), pancreático ("PA"), de melanoma (" el"), de ovario ("OV") y de cabeza y cuello ("HN"), sin tener en cuenta de si los especímenes del tumor que están siendo analizados fueron especímenes de tumores primarios de pacientes o tumores NTX derivados de pacientes.
Las células con expresión negativa (es decir, "-"), se definen en la presente como aquellas células que expresan menos que, o igual a, el percentil 95 de expresión observado con un anticuerpo control de isotipos, en el canal de fluorescencia en presencia del coctel completo de tinción de anticuerpos que marca para otras proteínas de interés en canales adicionales de emisión de fluorescencia. Los expertos en la técnica apreciarán que este procedimiento para definir eventos negativos, es referido como tinción de "fluorescencia menos uno" o "FMO". Las células con expresión mayor que el percentil 95 de expresión observado con un anticuerpo control de isotipos usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente, se definen en la presente como "positivas" (es decir, "+"). Como se define en la presente, existen varias poblaciones de células definidas ampliamente como "positivas".
Primero, las células con baja expresión (es decir, "lo") se definen generalmente como aquellas células con expresión observada arriba del percentil 95 determinado usando la tinción FMO con un anticuerpo control de isotipos y dentro de una desviación estándar del percentil 95 de expresión observado con un anticuerpo control de isotipos, usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente. Las células con "alta" expresión (es decir, "ni") pueden definirse como aquellas células con expresión observada arriba del percentil 95 determinado usando la tinción FMO con un anticuerpo control de isotipos y más de una desviación estándar arriba del percentil 95 de expresión observado con un anticuerpo control de isotipos, usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente. En otras modalidades, el percentil 99 puede usarse de preferencia como un punto de demarcación entre la tinción FMO negativa y positiva, y en modalidades particularmente preferidas, el percentil puede ser mayor de 99%.
Mediante el uso de técnicas tales como las descritas anteriormente para rápidamente identificar y clasificar antígenos de tumores colorrectales con base en la intensidad y heterogeneidad de la expresión a través de varios tumores NTX de pacientes con cáncer colorrectal, antígenos de TPC candidatos se evaluaron adicionalmente mediante la comparación de tejido adyacente normal contra tumoral, y entonces se seleccionan con base, por lo menos en parte, en la sobrerregulación o subregulación del antígeno particular en células malignas. Además, el análisis sistemático de una variedad de marcadores de la superficie de la célula por su capacidad para enriquecer la capacidad para trasplantar tumores enteramente heterogéneos en ratones (es decir, capacidad tumorigénica), y la combinación subsiguiente de estos marcadores, mejoró sustancialmente la resolución del método, y mejoró la capacidad para adaptar las técnicas de separación de células activada por fluorescencia (FACS), para identificar y caracterizar subpoblaciones de células tumorales distintas altamente enriquecidas que contenían exclusivamente toda la capacidad de generación de tumores tras el trasplante (es decir, células que inician tumores). Para reiterar, el término célula que inicia tumores (TIC) o célula tumorigénica (TG), abarca células que perpetúan tumores (TPC; es decir, células madre de cáncer) y células progenitoras tumorales altamente proliferativas (TProg), las cuales en conjunto comprenden generalmente una subpoblación única (es decir, 0.1 a 25%) de un tumor o masa global, cuyas características se definieron anteriormente. La mayoría de las células tumorales caracterizadas de esta manera carecen de esta capacidad de formación de tumores, y pueden caracterizarse de esta manera como no tumorigénicas (NTG). En forma sorprendente, se observó que la mayoría de los distintos marcadores identificados usando la disposición PhenoPrint patentada, no demostraron la capacidad para enriquecer a las poblaciones de células que inician tumores en tumores colorrectales usando protocolos de FACS estándar, pero que distintas combinaciones de marcadores podrían usarse para identificar dos subpoblaciones de células que inician tumores: TPC y TProg. Los expertos en la técnica reconocerán que la diferencia definitiva entre las TPC y TProg, aunque ambas inician tumores en trasplantes primarios, es la capacidad de las TPC para perpetuamente favorecer el crecimiento del tumor tras el trasplante en serie a bajos números de células. Además, no se sabía que el marcador/las proteínas usados en combinación para enriquecer a las TPC y TProg, están asociados con células que contienen dicha actividad en cualquier tejido o neoplasma antes del descubrimiento por los presentes inventores, aunque otros han definido marcadores de la superficie de la célula o actividad enzimática que pueden usarse asimismo para enriquecer a células tumorigénicas (Dylla et al., 2008, citado antenormente). Como se expone más adelante, subpoblaciones de células tumores específicas aisladas usando combinaciones de marcadores de la superficie de la célula referidas anteriormente, se analizaron entonces usando la secuenciación de la siguiente generación del transcriptoma entero para identificar y caracterizar genes diferencialmente expresados.
EJEMPLO 2 Aislamiento y análisis de muestras de ARN de poblaciones enriquecidas de células que inician tumores Varias líneas de células NTX colorrectales establecidas (SCRX- CR4, CR11 , CR33, PA3, PA6 y PA14) generadas y pasadas como se describió en el ejemplo 1 , se usaron para iniciar tumores en ratones inmunocomprometidos. Para ratones que poseen tumores SCRX-CR4, PA3 o PA6, una vez que la carga media de tumores alcanzó ~ 300 mm3, los ratones fueron aleatorizados y tratados con 15 mg/kg de irinotecan, 25 mg/kg de gemcitabina o control de vehículo (PBS) dos veces por semana por un periodo de por lo menos veinte días antes de la eutanización. Se removieron los tumores que surgen de las seis líneas NTX, incluyendo aquellos de los ratones que sufren tratamiento quimioterapéutico, y las células TPC, TProg y NTG, respectivamente, se aislaron de tumores NTX colorrectales recién resecados y, asimismo, las células TG y NTG se aislaron de tumores NTX pancreáticos, usando generalmente las técnicas expuestas en el ejemplo 1. Más particularmente, se aislaron poblaciones de células mediante FACS, e inmediatamente fueron convertidas a pellas y lisadas en amortiguador de lisis de ARN RLTpIus de Qiagen (Qiagen, Inc.). Los lisados se almacenaron entonces a -80°C hasta su uso. Después de la descongelación, se extrajo ARN total usando el kit de aislamiento RNeasy de Qiagen (Qiagen, Inc.) siguiendo las instrucciones del vendedor, y se cuantificó en el Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), usando de nuevo los protocolos del vendedor y los ajustes del instrumento recomendados. La preparación de ARN total resultante fue adecuada para el análisis y la secuenciación genética.
Muestras de ARN total obtenidas de las poblaciones de células respectivas aisladas como se describió anteriormente de ratones tratados con agente quimioterapéutico o vehículo, se prepararon para la secuenciación del transcriptoma entero usando una plataforma de secuenciación de siguiente generación SOLiD 3.0 (secuenciación por ligación/detección de oligómeros) de Applied Biosystems (Life Technologies), partiendo con 5 ng de ARN total por muestra. Los datos generados por la plataforma SOLiD mapearon hacia 34,609 genes del genoma humano, y fueron capaces de detectar ligandos efrina A, incluyendo EFNA4, y proveyeron mediciones verificables de los niveles de EFNA en la mayoría de las muestras.
En general, la plataforma de secuenciación de siguiente generación SOUD3 permite la secuenciación paralela de fragmentos de ARN/ADN clonalmente amplificados enlazados a las perlas. La secuenciación mediante ligación con oligonucleótidos marcados con colorante, se usa entonces para generar las lecturas de 50 bases de cada fragmento que existen en la muestra, generando un total de más de 50 millones de lecturas una representación mucho más precisa de la expresión de proteínas al nivel de transcritos de ARNm en el genoma. La plataforma SOUD3 es capaz de capturar no sólo la expresión, sino los SNPs, con base solamente en la cobertura de la lectura (lecturas mapeadas únicamente hacia sitios genómicos). De esta manera, el uso de esta plataforma de siguiente generación permitió la determinación de diferencias en la expresión al nivel de transcritos, así como diferencias o preferencias por variantes de empalme específicas de aquellos transcritos de ARNm expresados. Además, el análisis con la plataforma SOLÍD3 usando un protocolo modificado del transcriptoma entero de Applied Biosystems, sólo requirió aproximadamente 5 ng de material de partida antes de la amplificación. Esto es significante como la extracción de ARN total de las poblaciones de células separadas, en donde el subgrupo de células TPC es, por ejemplo, bastamente más pequeño en número que los tumores NTG o globales, y de esta manera resulta en cantidades muy pequeñas de material de partida utilizable.
Series duplicadas de datos de secuenciación de la plataforma SOLÍD3 fueron normalizadas y transformadas, y se calcularon las relaciones del número de veces como es la práctica estándar de la industria. Como se observa en las figuras 2A-2B, se midieron los niveles de EFNA1 , EFNA3 y EFNA4 de un tumor, así como los niveles de los receptores de Eph EPHA1 , EPHA2 y EPHA10. Un análisis de los datos mostró que EFNA4 fue sobrerregulado al nivel de transcritos por 1.9 a 3 veces en las TPC de tumores NTX SCRx-CR4 sobre la población de NTG, y 1.2 a 1.4 veces en las TPC sobre la población de TProg, sin tener en cuenta si las células se obtuvieron de ratones que estaban siendo tratados con vehículo (figura 2A) o 15 mg/kg de irinotecan (figura 2B). Se apreciará además que EFNA1 estaba también elevado en células TPC contra células TProg y NTG, respectivamente, aunque a un menor grado que EFNA4. Además, cuando se analizaron muestras de tumores colorrectales (SCRx-CR1 1 y CR33) y pancreáticos (SCRx-PA3, PA6 y PA14) adicionales mediante la secuenciación del transcriptoma entero SOLÍD3, la expresión génica de EFNA4 estaba asimismo elevada en células TPC contra células TProg y NTG en cáncer colorrectal (figura 3A), y en la subpoblación de TIC (o TG) de células de tumores pancreáticos (figura 3B), definida usando un panel de marcadores únicos de la superficie de la célula descubiertos como se ilustró anteriormente (los subgrupos de células TPC y TProg, que constituyen la población de TIC en tumores pancreáticos, aún no han sido definidos).
Se observó también que la expresión del receptor EPHA2, con el cual ambos ligandos EFNA4 y EFNA1 interactúan, refleja inversamente la expresión de EFNA4 y EFNA1 durante la progresión de la diferenciación de células TPC a NTG. Este patrón de expresión recíproca de los ligandos EFNA1/EFNA4 y el receptor EPHA2, sugiere que el cruce entre estos pares de ligando/receptor podría desempeñar una función en las decisiones del destino de las células durante la diferenciación de las células madre de cáncer colorrectal, y que la neutralización de estas interacciones podría influir negativamente sobre el crecimiento del tumor. Específicamente, bloqueando las interacciones de EphA2 con EFNA1 y/o EFNA4 usando anticuerpos neutralizantes contra el par tardío de ligandos efrina A, las TPC podrían ser sensibilizadas a los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, o forzadas a que se diferencien. Además, eligiendo como objetivo las TPC usando anticuerpos que internan a EFNA1 y/o EFNA4, las TPC podrían ser destruidas directamente por el modulador desnudo o a través del uso de una toxina o conjugado de fármaco-anticuerpo.
Las observaciones detalladas anteriormente muestran que la expresión de EFNA1 y/o EFNA4 es generalmente elevada en las poblaciones de TPC, y sugiere que estos ligandos unidos a la membrana : pueden desempeñar una función importante en la tumorigénesis y el mantenimiento de los tumores, constituyendo de esta manera objetivos excelentes para procedimientos terapéuticos novedosos.
EJEMPLO 3 Análisis por PCR en tiempo real de liqandos efrina A en poblaciones enriquecidas de células que inician tumores Para validar la expresión diferencial del ligando efrina A observada por la secuenciación del transcriptoma entero en poblaciones de TPC contra células TProg y NTG en cáncer colorrectal, y células TG contra NTG en cáncer pancreático, se usó la PCR en tiempo real cuantitativa TaqMan® para medir los niveles de la expresión génica en poblaciones de células respectivas aisladas de varias líneas NTX como se expuso anteriormente. Se apreciará que dicho análisis por PCR en tiempo real permite una medición más directa y rápida de los niveles de la expresión génica para objetivos discretos usando series de iniciadores y sondas específicos para un gen particular de interés. Se llevó a cabo PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan® en una máquina 7900HT de Applied Biosystems (Life Technologies), la cual se usó para medir la expresión génica de EFNA4 en poblaciones de células de la línea NTX derivadas de pacientes múltiples y controles correspondientes. Además, el análisis se llevó a cabo como se especifica en las instrucciones provistas con el sistema TaqMan y usando series de iniciadores/sondas de EFNA4 disponibles comercialmente (Life Technologies).
Como se observa en la figura 4, la interrogación por la PCR en tiempo real cuantitativa de la expresión génica en las poblaciones de NTG, TProg y TPC aisladas de 3 líneas distintas de tumores NTX colorrectales (SCRx-CR4, CR5 y CR14), mostró que la expresión génica de EFNA4 está elevada más de 1.4 veces en las subpoblaciones de TIC (TPC y/o TProg) contra las células NTG. EFNA4 estaba también elevado aproximadamente 1.8 veces en las poblaciones de TIC en ratones que sufren tratamiento con irinotecan, y en la población de células TG de tumores pancreáticos (por ejemplo, SCRx-PA3). La observación de la expresión elevada de EFNA4 en las preparaciones de células TIC de NTX en comparación con los controles de células NTG de tumores NTX derivados de pacientes con cáncer pancreático y colorrectal usando la metodología más ampliamente aceptada de la PCR cuantitativa en tiempo real, confirma los datos de la secuenciación del transcriptoma entero SOUD3 más sensible del ejemplo previo, y apoya la asociación observada entre EFNA4 y las células que sufren tumorigénesis, resistencia a la terapia y recidiva.
EJEMPLO 4 Expresión de los liqandos efrina A en especímenes no fraccionados de tumores colorrectales A la luz del hecho de que se encontró que la expresión génica del ligando efrina A está elevada en las poblaciones de TPC de tumores colorrectales cuando se comparan con las células TProg y NTG de los mismos tumores, se llevaron a cabo experimentos para determinar si la expresión elevada del ligando efrina A (es decir, EFNA4) era también detectable en muestras no fraccionadas de tumores colorrectales contra tejido adyacente normal (NAT). Asimismo, se hicieron también mediciones para determinar cómo la expresión de los ligandos efrina A en los tumores se compara con los niveles en muestras de tejido normal. Se diseñaron y se fabricaron disposiciones de 384 cavidades para qPCR TumorScan (Origene Technologies) adaptadas que contenían 1 10 especímenes de tumores de pacientes con cáncer colorrectal, tejido adyacente normal y 48 tejidos normales, usando técnicas conocidas en la materia. Mediante el uso de los procedimientos detallados en el ejemplo 3 y las mismas series de iniciadores/sondas específicas de EFNA4, se llevó a cabo PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan en las cavidades de las placas adaptadas.
Las figuras 5A y 5B muestran los resultados de los datos de la expresión en un formato gráfico normalizado contra la expresión media en tejido normal del colon y recto. Más específicamente, la figura 5A resume los datos generados usando 168 especímenes de tejido obtenidos de 1 10 pacientes con cáncer colorrectal (de los cuales 35 especímenes de tejido son tejido adyacente normal (NL) de los pacientes con cáncer colorrectal) y 48 tejidos normales de otros sitios (otro NL). En la gráfica, los datos de cada espécimen de tejido/paciente se representan mediante un punto, con el valor medio geométrico de cada población demarcado sobre el eje X representado como una línea. Asimismo, la figura 5B contiene los datos de 24 especímenes comparados de pacientes con cáncer colorrectal obtenidos de tejido tumoral (T) o de tejido adyacente normal (N) en varias etapas de la enfermedad (l-IV). Aquí, los datos graficados se presentan sobre una base de muestra por muestra con enlace entre el tejido adyacente normal y tumoral respectivo de pacientes individuales. La expresión de EFNA4 es claramente mayor en la mayor parte del tejido adyacente normal contra el tejido tumoral comparado, alcanzando la significancia estadística la expresión diferencial en las etapas 2, 3 y 4 (n > 4, P < 0.047). Las figuras 5A y 5B indican que, en las cuatro etapas presentadas, el nivel génico expresado de EFNA4 está elevado en la mayoría de los tumores colorrectales y en los especímenes de tumor comparados contra el tejido adyacente normal. Además, la expresión génica media de EFNA4 en cualquier etapa del cáncer colorrectal parece ser por lo menos igual a, si no mayor que, los niveles más altos de la expresión génica de EFNA4 en cualquier tejido normal interrogado en estos experimentos (figura 5A). Estos resultados demuestran que la expresión de EFNA4 está incrementada en el cáncer colorrectal, y cuando es acoplada con las observaciones anteriores de que la expresión de EFNA4 es mayor en las TPC colorrectales y las TIC pancreáticas, sugiere que el direccionamiento terapéutico de las células tumorigénicas que expresan EFNA4 puede proveer gran beneficio terapéutico a los pacientes con cáncer.
EJEMPLO 5 Expresión diferencial del ligando efrina A en ejemplos de muestras de tumores Para evaluar adicionalmente la expresión génica del ligando efrina A en muestras adicionales de tumores de pacientes con cáncer colorrectal y especímenes de tumores de pacientes diagnosticados con 1 de otros 17 diferentes tipos de tumores sólidos, se llevó a cabo qRT-PCR Taqman usando disposiciones de 384 cavidades para qPCR TissueScan™ (Origene Technologies), las cuales se fabricaron a la medida como se describió en el ejemplo 4. Los resultados de las mediciones se muestran en las figuras 6A-6E, y muestran que la expresión génica de EFNA4 está significativamente elevada o reprimida en muchas muestras de tumores.
A este respecto, las figuras 6A y 6B muestran los niveles relativo y absoluto de la expresión génica, respectivamente, de EFNA4 de humano en especímenes de tumores enteros (puntos grises) o tejido adyacente normal (NAT; puntos blancos) comparado, de pacientes con uno de dieciocho diferentes tipos de tumores sólidos. En la figura 6A, los datos están normalizados contra la expresión génica media en NAT para cada tipo de tumor analizado. En la figura 6B, la expresión absoluta de EFNA4 se evaluó en varios tejidos/tumores, siendo graficados los datos como el número de ciclos (Ct) necesarios para alcanzar la amplificación exponencial mediante PCR en tiempo real cuantitativa. A los especímenes no amplificados se les asignó un valor de Ct de 45, el cual representa el último ciclo de amplificación en el protocolo experimental. Cada punto representa un espécimen de tejido individual, siendo representado el valor medio como una línea negra.
Mediante el uso de la disposición hecha a la medida, se observó que la mayoría de los pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal y la mayoría de los pacientes diagnosticados con cáncer endometrial, esofágico, de hígado, pulmón, próstata, vejiga y uterino, tuvieron significativamente más expresión génica de EFNA4 en sus tumores contra NAT, sugiriendo que EFNA4 podría desempeñar una función en la tumorigénesis y/o la progresión del tumor en estos tumores. En contraste, la expresión de EFNA4 pareció ser significativamente reprimida en los tumores de los pacientes con cáncer adrenal y pancreático. Lo que fue también claro de estos estudios, es que la expresión génica de EFNA4 fue generalmente baja a moderada en la mayoría de las muestras de NAT, siendo observada la expresión más alta en las glándulas suprarrenales, la mama, el cerviz y los ovarios. De nuevo, estos datos sugieren que la expresión diferencial de EFNA4 (alta o baja) es indicativa, y potencialmente dispositiva, de tumorigénesis o perpetuación en los pacientes que presentan trastornos hiperproliferativos seleccionados.
Se evaluó también la expresión de EFNA4 usando xenoinjertos no tradicionales (NTX) patentados como se discutió anteriormente, y cuantificados con relación a la expresión del tejido normal. Se llevó a cabo PCR en tiempo real cuantitativa en muestras comerciales de ARN de tejido normal (mama, colon, esófago, corazón, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, músculo esquelético, intestino delgado) y en tumores NTX de cáncer de mama (BR), cáncer colorrectal (CR), cáncer de riñon (KDY), cáncer de hígado (LIV), melanoma (MEL), cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario (OV), cáncer pancreático (PA) y cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC). Los resultados, mostrados en la figura 6C, demuestran la expresión elevada de EFNA4 en las líneas de NTX de mama, colon e hígado respecto a la expresión en los tejidos normales. A la inversa, la figura 6D documenta la expresión del miembro de la familia relacionado EFNA1 en muchas de las mismas líneas de NTX y normales, y muestra poca expresión diferencial entre los tejidos tumoral y normal. A pesar de este perfil de expresión, los moduladores de EFNA de la presente invención que reaccionan con EFNA1 (incluyendo aquellos que reaccionan con otro EFNA) pueden usarse efectivamente para eliminar células tumorigénicas, según se evidencia en los ejemplos subsiguientes.
En cualquier caso, para confirmar que la expresión elevada del ARNm detectada mediante la PCR en tiempo real cuantitativa se traduce también en niveles elevados de proteínas de EFNA4, se llevaron a cabo Western blots. Se produjeron lisados de células de NTX y líneas dé células (células 293 no afectadas y células 293 que sobreexpresan EFNA4), usando un kit de extracción de proteínas totales (Bio Chain Institute # K3011010) siguiendo el protocolo provisto, para comparar los lisados de tejido normal disponibles comercialmente (Novus Biologicals). Se determinó la concentración de proteínas de los lisados usando una prueba de proteínas BCA (Pierce/Thermo Fisher #23225). Se hicieron correr cantidades iguales de lisados de células en geles de Bis-Tris a 4-12% Novex NuPAGE (Life Technologies), en amortiguador MES bajo condiciones reductoras. Un anticuerpo disponible comercialmente contra EFNA4 de humano (R&D Systems-AF369) se usó para detectar la expresión de las proteínas de EFNA4. En el panel superior de la figura 6E, las células 293 diseñadas para sobreexpresar EFNA4 muestran alta expresión, en comparación con las células 293 no afectadas. Además, en el panel superior, varios NTX de cáncer de mama y de colon y de cáncer pulmonar de células no pequeñas, mostraron expresión relativamente alta de EFNA4. Bajo condiciones similares, el Western blot en el panel inferior de la figura 6E muestra que los tejidos normales expresan niveles bajos o indetectables de EFNA4 cuando se comparan con la alta expresión de EFNA4 en la línea de células de NTX CR11. Se usa un anticuerpo control anti-GAPDH para demostrar la carga igual de lisados de células en ambos paneles.
EJEMPLO 6 Generación de anticuerpos anti-EFNA usando inmunógenos de EFNA Se produjeron moduladores de EFNA en la forma de anticuerpos de murino de acuerdo con las enseñanzas de la presente, a través de la inoculación con hEFNA4-ECD-Fc, hEFNA4-ECD-His, hEFNA1-ECD-His, células 3T3 de ratones BALB/c que sobreexpresan EFNA4, o las preparaciones de plasma obtenidas como se expone en la presente (ECD -dominio extracelular). Todos los inmunógenos se prepararon usando materiales de partida disponibles comercialmente (por ejemplo, quimera de Fe efrina-A4 recombinante de humano, CF R&D systems #369-EA-200), y/o técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.
Más particularmente, se generaron anticuerpos de murino inmunizando a 9 ratones hembras (3 de cada uno de Balb/c, CD-1 , FVB) con varias preparaciones de antígeno de EFNA4 o EFNA1. Los inmunógenos incluyeron construcciones de Fe o EFNA4 o EFNA1 de humano marcados con His, fracciones de membrana extraídas de 07 células 293 que sobreexpresan a EFNA4 o células 3T3 enteras que sobreexpresan a EFNA4 de humano sobre la superficie. Se inmunizó a los ratones por medio de la vía del cojinete de la pata para todas las inyecciones. Para la inmunización, se usaron 10 pg de inmunógeno de EFNA4 o EFNA1 o 1X106 células o equivalentes de células emulsificados con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante de alumbre. Después de la inmunización, se sometió a los ratones a eutanasia, y los nodulos linfáticos estando drenando (poplíteo e inguinal, si eran alargados) se disecaron y se usaron como una fuente de células que producen anticuerpos. Los linfocitos se liberaron mediante disrupción mecánica de los nodulos linfáticos usando un triturador de tejidos.
Se usó uno de dos protocolos de fusión. En el primero, se llevó a cabo electrofusión con un dispositivo Genetronic, seguida de siembra y selección de los hibridomas policlonales con una subclonación subsiguiente, para generar hibridomas monoclonales. En el segundo protocolo, se llevó a cabo electrofusión con un instrumento BTX seguida de crecimiento de la colección de hibridomas a granel y deposición de las células individuales de los hibridomas con una selección subsiguiente de los clones.
Protocolo de fusión del dispositivo Genetronic: Se llevó a cabo la fusión mezclando una suspensión de células individuales de células B con células de mieloma P3x63Ag8.653 no secretando adquiridas de la ATCC CRL-1580; Kearney et al., J. Immunol. 123: 1548-1550 (1979), a una relación de 1 :1. La mezcla de células fue convertida suavemente a pellas mediante centrifugación a 800 g. Después de la remoción completa del sobrenadante, las células se trataron con 2 a 4 mL de solución de Pronase por no más de 2 minutos. Se llevó a cabo electrofusión usando un generador de fusión, modelo ECM2001 (Genetronic, Inc.).
Las células se sembraron a 2X104/cavidad en placas de microtítulo de fondo plano, seguido de dos semanas de incubación en medio HAT selectivo (Sigma, CRL P-7185). Las cavidades individuales se seleccionaron entonces mediante ELISA y FACS para anticuerpos de IgG monoclonales de EFNA4 anti-humano.
Se recubrieron las placas de microtítulo de ELISA con proteínas de fusión His EFNA4 recombinantes purificadas, de células 293 transfectadas a 100 ng/cavidad en amortiguador de carbonato. Las placas incubadas a 4°C durante la noche fueron bloqueadas con 200 µ?/cavidad de BSA a 3% en PBSfTween (0.05%). El sobrenadante de las placas de hibridoma se añadió a cada cavidad, y se incubó por 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y entonces se incubaron con IgG anti-ratón de cabra específica del fragmento Fe conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch) por una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con substrato de TMB (Thermo Scientific 34028) y se analizaron mediante espectrofotómetro a DO 450.
EFNA4 secretado por el hibridoma de cavidades positivas fue seleccionado de nuevo y subclonado mediante dilución limitativa o separación de células individuales por FACS.
Se llevó a cabo subclonación en cavidades seleccionadas positivas para el antígeno usando siembra por dilución limitativa. Las placas se inspeccionaron visualmente para la presencia de crecimiento de colonias individuales, y los sobrenadantes de las cavidades de las colonias individuales se seleccionaron entonces mediante ELISAs específicas del antígeno descritas anteriormente, y confirmación por FACS como se describe a continuación. Las poblaciones clónales resultantes se expandieron y criopreservaron en medio de congelación (FBS a 90%, DMSO a 10%), y se almacenaron en nitrógeno líquido. Esta fusión de ratones inmunizados con EFNA4 dio 159 anticuerpos monoclonales de murino reactivos para EFNA4 usando el protocolo de ELISA descrito anteriormente.
Protocolo de fusión del instrumento BTX: Una suspensión de células individuales de células B se fusionó con células de mieloma P3x63Ag8.653 no secretando a una relación de 1 :1 mediante electrofusión. La electrofusión se llevó a cabo usando el sistema Hybrimune, modelo 47-0300 (BTX Harvard Apparatus). Las células fusionadas se resuspendieron en medio de selección de hibridomas complementado con medio de azaserina (Sigma #A9666) (DMEM (Cellgro # de catálogo 15-017-CM)) que contenía suero de clon fetal I a 15% (Hyclone), BM-Condimed a 10% (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 Ul de penicilina-estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 µ? e hipoxantina 100 µ?), y se sembraron entonces en cuatro matraces T225 en 90 mi de medio de selección por matraz. Los matraces se pusieron entonces en una incubadora humidificada a 37°C que contenía 5% de C02 y 95% de aire por 6 a 7 días.
A 6 a 7 días de crecimiento, la colección se sembró a 1 célula por cavidad en 48 placas Falcon de fondo en U de 96 cavidades usando el separador de células Aria I. En resumen, el medio de cultivo que contenía suero de clon fetal I a 15% (Hyclone), BM-Condimed a 10% (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 Ul de penicilina- estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 µ? e hipoxantina 100 µ?, se sembró a 200 µ? por cavidad en 48 placas Falcon de fondo en U de 96 cavidades. Los hibridomas viables se sembraron a 1 célula por cavidad usando el separador de células Aria I y se cultivaron por 10 a 11 días, y los sobrenadantes se pusieron a prueba para anticuerpos reactivos mediante FACS o ELISA para EFNA4 o EFNA1.
Las cavidades de hibridoma positivas para crecimiento que secretan inmunoglobulinas de ratón se seleccionaron para especificidad por EFNA4 de murino, usando una prueba de ELISA similar a la descrita anteriormente. En resumen, se recubrieron placas de 96 cavidades (VWR, 610744) con 1 pg/mL de EFNA4-His de murino en amortiguador de carbonato de sodio durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron y fueron bloqueadas con PBS-FCS a 2% por una hora a 37°C, y se usaron de inmediato o se mantuvieron a 4°C. Los sobrenadantes de hibridoma no diluidos se incubaron en las placas por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se sondearon con IgG anti-ratón de cabra marcado con HRP diluido 1 :10,000 en PBS-BSA a 1% por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se incubaron entonces con solución de substrato como se describió anteriormente, y se leyeron a DO 450.
Las cavidades de hibridoma positivas para crecimiento que secretan inmunoglobulinas de ratón se seleccionaron también para especificidad por EFNA1 de humano usando una prueba de FACS, como se indica a continuación. En resumen, 1x105 células de Jurkat por cavidad que expresan EFNA1 de humano se incubaron por 30 minutos con 25 a 100 µ? de sobrenadante de hibridomas. Las células se lavaron dos veces con PBS/FCS a 2%, y entonces se incubaron con 50 µ? de IgG anti-ratón de cabra marcada con DyeLight 649 por muestra, fragmento de Fe específico secundario diluido 1 :200 en PBS/FCS a 2%. Después de una incubación por 15 minutos, las células se lavaron 2 veces con PBS/FCS a 2%, y se resuspendieron en PBS/FCS a 2% con DAPI y se analizaron mediante FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar y usando el accesorio HTS. Los hibridomas clónales específicos de EFNA1 resultantes se expandieron y se chopreservaron en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions), y se almacenaron en nitrógeno líquido. Esta fusión de ratones inmunizados con EFNA1 dio un hibridoma reactivo con EFNA4, según se determinó usando el análisis por FACS. Además, el análisis por FACS confirmó que el anticuerpo purificado de la mayoría o la totalidad de estos hibridomas, se une a EFNA4 o EFNA1 en una manera dependiente de la concentración.
EJEMPLO 7 Secuenciación y humanización de los moduladores del ligando efrina A 7(a) Secuenciación: Con base en lo anterior, se seleccionaron muchos ejemplos de anticuerpos monoclonales distintos que se unen a EFNA4 o EFNA1 inmovilizados de humano, con aparentemente alta afinidad. Como se muestra en una forma tabular en el cuadro A, el análisis de la secuencia del ADN que codifica para los mAbs del ejemplo 6, confirmó que muchos tuvieron reordenamientos de VDJ únicos, y exhibieron regiones determinantes de complementariedad novedosas. Nótese que las regiones determinantes de complementariedad expuestas en el cuadro A (SEQ ID NOs: 8 - 59 y 70 - 95) se definen según Chothia et al., citado anteriormente.
Para el inicio de la secuenciación, se adquirió el reactivo TRIZOL de Invitrogen (Life Technologies). Se adquirieron el kit de RT-PCR de un paso y el kit de purificación de PCR QIAquick de Qiagen, Inc. con RNasin de Promega. Oligonucleótidos hechos a la medida se adquirieron de Integrated DNA Technologies.
Células de hibridoma fueron lisadas en reactivo TRIZOL para la preparación de ARN. Entre 104 pL y 105 células se resuspendieron en 1 mi de TRIZOL. Los tubos se agitaron vigorosamente después de la adición de 200 µ? de cloroformo. Las muestras se centrifugaron a 4°C por 10 minutos. La fase acuosa se transfirió a un tubo micrófugo nuevo, y se añadió un volumen igual de isopropanol. Los tubos se agitaron vigorosamente y se dejó que se incubaran a temperatura ambiente por 10 minutos. Las muestras se centrifugaron entonces a 4°C por 10 minutos. Las pellas se lavaron una vez con 1 mi de etanol a 70% y se secaron brevemente a temperatura ambiente. Las pellas de ARN se resuspendieron con 40 pL de agua tratada con DEPC. La calidad de las preparaciones de ARN se determinó fraccionando 3 pL en un gel de agarosa a 1 %. El ARN se almacenó en un congelador a -80°C hasta su uso.
Las secuencias de ADN variables del hibridoma amplificadas con series de iniciadores consenso específicos para las cadenas ligeras kappa y las cadenas pesadas de inmunoglobulina de murino, se obtuvieron usando una mezcla de iniciadores de dominio variable. Se usó el kit de RT-PCR de un paso para amplificar los segmentos de los genes de VH y VK de cada muestra de ARN. El kit de RT-PCR de un paso de Qiagen provee una mezcla de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN polimerasa HotStarTaq, amortiguador de RT-PCR de un paso de Qiagen, una mezcla de dNTP y solución Q, un aditivo novedoso que permite la amplificación eficiente de moldes "difíciles" (por ejemplo, ricos en GC).
Se prepararon mezclas de reacción que incluían 3 pL de ARN, 0.5 de 100 µ? de iniciadores de la cadena ligera kappa o la cadena pesada, 5 µ?_ de 5x amortiguador de RT-PCR, 1 µ?_ de dNTPs, 1 pl_ de mezcla de enzimas que contenía transcriptasa inversa y ADN polimerasa, y 0.4 µ?_ del inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad). La mezcla de reacción contiene todos los reactivos requeridos para la transcripción inversa y la PCR. El programa del ciclizador térmico fue el paso de temperatura ambiente, 50°C por 30 minutos y 95°C por 15 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 48°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto. Hubo entonces una incubación final a 72°C por 10 minutos.
Para preparar los productos de PCR para la secuenciación directa del ADN, se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAquick™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se eluyó de la columna de centrifugación usando 50 µ?_ de agua estéril, y entonces se secuenció directamente a partir de ambas cadenas. Los fragmentos de PCR se secuenciaron directamente, y se analizaron las secuencias de ADN usando VBASE2 (Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005).
Como se refirió en forma breve anteriormente, las disposiciones genéticas y las CDRs derivadas (como es definido por Chothia et al., citado anteriormente) de varios ejemplos de anticuerpos anti-hEFNA4/hEFNA1 , se exponen en una forma tabular en el cuadro A (SEQ ID NOs: 8 - 59 y 70 - 95). Además, las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de estos mismos ejemplos de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo, se exponen en las figuras 7A - 7M (SEQ ID NOs: 96 - 147). 7(b) Humanización: Cuatro de los anticuerpos de murino del ejemplo 6 fueron humanizados, usando el injerto de la región determinante de complementariedad (CDR). Se seleccionaron estructuras de humano para las cadenas ligera y pesada, con base en la similitud de secuencia y estructura con respecto a genes funcionales de la línea germinal humana. A este respecto, se evaluó la similitud estructural comparando la estructura de CDR canónica de ratón con candidatos de humano con las mismas estructuras canónicas como se describe en Chothia et al (citado anteriormente).
Más particularmente, los anticuerpos de murino SC4.5, SC4.15, SC4.22 y SC4.47 fueron humanizados usando un método de injerto de CDR asistido por computadora (base de datos Abysis, UCL Business Pie.) y técnicas de ingeniería molecular estándar, para proveer los moduladores hSC4.5, hSC4.15, hSC4.22 y hSC4.47 (Nota: la adición de un número subsiguiente después de la designación del clon o anticuerpo, es decir, SC4.47.3, se refiere a un subclon particular, y no es material para los propósitos de la presente descripción, a menos que de otra manera se observe o se requiera por contexto). Las regiones de estructura de humano de las regiones variables se seleccionaron con base en su homología de secuencia más alta con la secuencia de estructura de ratón y su estructura canónica. Para los propósitos del análisis, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios de CDR está de acuerdo con la numeración de Kabat et al. Se obtuvieron varias variantes de anticuerpos humanizados para generar el anticuerpo humanizado óptimo, reteniendo generalmente los anticuerpos humanizados las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de unión al antígeno del hibridoma de ratón, en asociación con las regiones de estructura de humano. Los mAbs SC4.15, SC4.22 y SC4.471 humanizados se unen al antígeno de EFNA4 con afinidad similar a sus contrapartes de murino, mientras que hSC1.5 unido con una afinidad ligeramente menor, se mide usando el sistema Biacore.
Se llevaron a cabo procedimientos de ingeniería molecular usando técnicas reconocidas en la materia. Para ese fin, se extrajo ARNm total de los hibridomas de acuerdo con el protocolo del fabricante (sistema de purificación de ARN Trizol® Plus, Life Technologies). Una mezcla de iniciadores que comprende treinta y dos iniciadores de secuencia guía 5' específicos de ratón, diseñados para elegir como objetivo el repertorio completo de ratón, se usó en combinación con el iniciador Cy1 3' de ratón para amplificar y secuenciar la región variable de las cadenas pesadas de anticuerpo. Asimismo, treinta y dos secuencias guía 5' Vk de la mezcla de iniciadores diseñada para amplificar cada una de las familias Vk de ratón combinadas con un iniciador inverso individual específico para la región constante kappa de ratón, se usaron para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Los transcritos de VH y VL fueron amplificados a partir de 100 ng de ARN total, usando la técnica de transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR).
Se llevó a cabo un total de ocho reacciones de RT-PCR para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera kappa V, y cuatro para la cadena pesada gamma V (?1). Se usó el kit de RT-PCR de un paso de Qiagen para la amplificación (Qiagen, Inc.). Los productos de PCR extraídos se secuenciaron directamente usando iniciadores específicos de la región V. Se analizaron las secuencias de nucleótidos usando IMGT para identificar a los miembros de genes V, D y J de la línea germinal con la homología de secuencia más alta. Las secuencias derivadas se compararon con secuencias de ADN conocidas de la línea germinal de las regiones de Ig V y J usando V-BASE2 (Retter et al., citado anteriormente), y mediante la alineación de los genes de VH y VL respecto a la base de datos de la línea germinal de ratón.
A partir de la información de la secuencia de nucleótidos, se obtuvieron datos respecto a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas ligera y pesada de SC4.5, SC4.15, SC4.22 y SC4.47. Con base en los datos de la secuencia, se diseñaron nuevas series de iniciadores específicas para la secuencia guía de la cadena de Ig VH y V« de los anticuerpos para la clonación del anticuerpo monoclonal recombinante. Posteriormente, las secuencias V-(D)-J fueron alineadas con las secuencias de Ig de la línea germinal de ratón. Se identificó a los genes de la cadena pesada de SC4.5 como IGHV2-6 (V) y JH3. El análisis de la CDR3 corta de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal E5 no permitió identificar un gen D específico de ratón. Se identificó a los genes de la cadena pesada de SC4.15 como IGHV5-6 (V), DSP2.9(D) y JH3. Se identificó a los genes de la cadena pesada de SC4.22 como VHJ558 (V). Se identificó al segmento D como DFL16.1e y JH4 (J). Se identificó a los genes de la cadena pesada de SC4.47 como IGHV1-26 (V), P1 inv(D) y JH2 (J). Las cuatro cadenas ligeras fueron de la clase K. Se identificó a los genes de las cadenas ligeras como IGKV6-15, JK2 para el mAb SC4.5, IGKV6-b y JK5 para el mAb SC4.15, secuencias de la línea germinal IGKV1-110 y JK1 para el mAb SC4.22, y secuencias de la línea germinal IGKV21-7, JK1 para la cadena ligera kappa de SC4.47. Estos resultados se resumen el cuadro 2 inmediatamente a continuación.
CUADRO 2 Las secuencias de la cadena ligera y pesada obtenidas de los cuatro clones fueron alineadas con las secuencias de la región variable funcionales de humano, y revisadas para homología y estructura canónica. El resultado del análisis de la cadena ligera y pesada se muestra a continuación en los cuadros 3 y 4, respectivamente.
CUADRO 3 CUADRO 4 Puesto que los procedimientos de injerto de la CDR y de selección de la línea germinal parecieron proveer anticuerpos que retuvieron generalmente sus características de unión, había aparentemente poca necesidad de insertar residuos de murino en la mayoría de las construcciones. Sin embargo, en hSC4.15, el residuo 68 de la cadena pesada fue mutado de nuevo de Thr (T) a Lys (K) para mejorar las características de los anticuerpos.
Las secuencias de aminoácidos (junto con la secuencia de ácido nucleico asociada) de las cadenas pesadas humanizadas de la región variable y las cadenas ligeras kappa humanizadas para los cuatro anticuerpos se muestran en las figuras 7N - 7Q (SEQ ID NOs: 148 - 163), en donde las CDRs en las secuencias de aminoácidos (como es definido por Kabat et al., citado anteriormente), están subrayadas.
Más particularmente, las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos correspondientes de la cadena pesada SC4.5 humanizada (SEQ ID NOs: 148 y 149) y la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOs: 150 y 51), se muestran en la figura 7N. Asimismo, las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos correspondientes de la cadena pesada SC4.15 humanizada (SEQ ID NOs: 152 y 153) y la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOs: 154 y 155), se muestran en la figura 70. Otra modalidad de la invención se ilustra en la figura 7P, en donde se muestran las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos correspondientes de la cadena pesada SC4.22 humanizada (SEQ ID NOs: 156 y 157) y la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOs: 158 y 159). En otra modalidad, la figura 7Q muestra las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos correspondientes de la cadena pesada SC4.47 humanizada (SEQ ID NOs: 160 y 161) y la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOs: 162 y 163). Como se demuestra en los ejemplos más adelante, cada uno de los anticuerpos humanizados mencionados anteriormente funciona como un modulador de EFNA efectivo de conformidad con las enseñanzas en la presente.
En cualquier caso, los moduladores descritos fueron expresados y aislados usando técnicas reconocidas en la materia. Para ese fin, fragmentos de ADN variables humanizados sintéticos (Integrated DNA Technologies) de ambas cadenas pesadas, fueron clonados en el vector de expresión de lgG1 humana. Los fragmentos variables de la cadena ligera fueron clonados en el vector de expresión C-kappa de humano. Los anticuerpos fueron expresados mediante co-transfección de la cadena pesada y la cadena ligera en células CHO.
Más particularmente, para la producción de anticuerpos, se llevó a cabo la clonación direccional de los productos de PCR del gen variable humanizado y de murino en vectores de expresión de inmunoglobulina humana. Todos los iniciadores usados en las PCRs específicas del gen de Ig incluyeron sitios de restricción (Agel y Xhol para IgH, Xmal y Dralll para IgK, que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contienen la lgG1 humana, y regiones constantes de IGK, respectivamente. En resumen, los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen, Inc.), seguido de digestión con Agel y Xhol (IgH), Xmal y Dralll (IgK), respectivamente. Los productos de PCR digeridos fueron purificados antes de la ligación en vectores de expresión. Las reacciones de ligación se llevaron a cabo en un volumen total de 10 pL con 200 unidades de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs), 7.5 pL de producto de PCR específico de genes purificado y digerido, y 25 ng de ADN de vector linealizado. Bacterias DH10B competentes de E. coli (Life Technologies), fueron transformadas por medio de choque térmico a 42°C con 3 pL de producto de ligación, y sembradas en placas de ampicilina (100 pg/mL). El fragmento Agel-EcoRI de la región VH fue insertado entonces en los mismos sitios del vector de expresión pEE6.4HulgG1 , mientras que la inserción de VK Xmal-Dralll sintética fue clonada en los sitios Xmal-Dralll del vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa respectivo.
Se generaron células que producen anticuerpos humanizados mediante transfección de células HEK 293 con los plásmídos adecuados, usando 293fectin. A este respecto, se purificó ADN de plásmido con columnas de rotación QIAprep (Qiagen). Se cultivaron células 293T de riñon embrionario humano (HEK) (ATCC No CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) bajo condiciones estándar, en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con FCS a 10% inactivado con calor, 100 pg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de penicilina G (todos de Life Technologies).
Para las transfecciones transitorias, se cultivaron las células hasta 80% de confluencia. Cantidades iguales de IgH y ADN de vector de la cadena de IgL correspondiente (12.5 pg de ADN de cada vector) se añadieron a 1.5 mL de Opti-MEM mezclado con 50 pL de reactivo de transfección de células HEK 293 en 1.5 mL de opti-MEM. La mezcla se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Los sobrenadantes se cosecharon tres días después de la transfección, se reemplazaron con 20 mL de DMEM nuevo complementado con FBS a 10%, y se cosecharon de nuevo en el día 6 después de la transfección. Los sobrenadantes de cultivo se depuraron de los restos de células mediante centrifugación a 800 xg por 10 minutos, y se almacenaron a 4°C. Los anticuerpos humanizados y quiméricos recombinantes se purificaron con perlas de proteína G (GE Healthcare).
EJEMPLO 8 Características de los moduladores de EFNA 8(a) Características generales de los moduladores Varios métodos se usaron para analizar las características de unión de moduladores de efrina-A4 seleccionados generados como se expuso anteriormente. Específicamente, muchos anticuerpos de EFNA4 se caracterizaron en cuanto a afinidad, cinética, categorización en bins y reactividad cruzada con respecto a homólogos de Cynomolgus y de ratón (generados internamente) mediante ForteBIO®. Se midió también la reactividad Western y se determinaron los epítopes para dos anticuerpos (SC4.22 y SC4.91 ) que se unen bajo condiciones reductoras. Además, los anticuerpos se pusieron a prueba por su capacidad para neutralizar (es decir, bloquear la interacción del receptor y el ligando) e internar, y fueron referidos por su EC50 de destrucción relativa mediante prueba de citotoxicidad in vitro, usando los procedimientos expuestos en estos ejemplos (véase, por ejemplo, los ejemplos 12 y 16). Los resultados de esta caracterización se exponen en forma tabular en el cuadro B.
CUADRO B Propiedades de moduladores de ligando efrina A seleccionados Afinidad usando el sistema Biacore; comparación interna ForteBIO.
Con respecto a los datos, se midió la afinidad de tres maneras para garantizar la exactitud. Primero, se midió la señal de unión para una cantidad fija de anticuerpo sondeado contra diluciones en serie de antígeno en una ELISA, para determinar la actividad relativa del modulador (datos mostrados sólo para la unión en Cynomolgus). En segundo lugar, se midieron entonces las afinidades y las constantes de cinética kon y koff de los moduladores seleccionados usando análisis de ¡nterferometría de biocapa en un ForteBIO RED (ForteBIO, Inc.), con una serie estándar de concentración del antígeno. Por último, se midió la afinidad de moduladores seleccionados mediante resonancia de plasmones de superficie (sistema Biacore, GE Healthcare). Con base en una serie estándar de concentración del antígeno y usando un modelo de unión de Langmuir 1 :1 , se determinaron la Kd de la unión del anticuerpo al antígeno y las constantes de cinética kon y k0ff. En general, los moduladores seleccionados exhibieron afinidades relativamente altas en la escala nanomolar.
En cuanto a la categorización en bins del anticuerpo, se usó ForteBIO por instrucciones del fabricante para identificar los anticuerpos, que se unieron al mismo bin o diferentes bins. En resumen, se capturó un anticuerpo (Ab1) en un chip de captura anti-ratón, se usó entonces una alta concentración de anticuerpo de no unión para bloquear el chip, y se colectó una línea base. efrina-A4-His recombinante monomérico fue capturado entonces por el anticuerpo específico (Ab1 ), y la punta se sumergió en una cavidad con el mismo anticuerpo (Ab1) como un control, o en una cavidad con un diferente anticuerpo (Ab2). Si se observaba unión adicional con un nuevo anticuerpo, entonces se determinaba que Ab1 y Ab2 están en un diferente bin. Si no ocurría más unión, similar al Ab1 control, entonces se determinaba que Ab2 está en el mismo bin. Este procedimiento puede expandirse para seleccionar grandes colecciones de anticuerpos únicos usando una hilera completa de anticuerpos que representan bins únicos en una placa de 96 cavidades. Este experimento mostró los anticuerpos seleccionados unidos a por lo menos tres bins o epítopes diferentes en la proteína EFNA4.
Para determinar si el epítope reconocido por el modulador de efrina-A4 comprende aminoácidos contiguos o es formado por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por la estructura secundaria del antígeno, se llevaron a cabo Western blots bajo condiciones reductoras y no reductoras. Más particularmente, usando técnicas de electroforesis estándar bien conocidas en la materia, el antígeno de efrina-A4 en ambos estados fue expuesto al modulador seleccionado. Como se muestra en el cuadro B, la mayoría de los moduladores de efrina-A4 reaccionaron sustancialmente sólo con el antígeno en donde los enlaces disulfuro estaban intactos (NR), mientras que dos moduladores reaccionaron con el antígeno no reducido y reducido (NR/R). Para estos anticuerpos, se usó una membrana Pepspot (JPT) para determinar los límites del reconocimiento del anticuerpo por el péptido. Se encontró que SC4.22 y SC4.91 reconocen las secuencias QRFTPFSLGFE (SEQ ID NO: 164) y RLLRGDAWE (SEQ ID NO: 165), respectivamente. La repetición de la prueba de la capacidad de estos péptidos para unirse a los péptidos de interés mediante ELISA, confirmó que los anticuerpos eran por supuesto específicos para estos epítopes.
Por último, se evaluó la reactividad cruzada con respecto a los homólogos de efrina-A4 de Cynomolgus en ForteBIO, usando una serie de concentraciones con antígenos de efrina-A4 monoméricos expresados en forma recombinante. Como se muestra en el cuadro B, los moduladores seleccionados fueron reactivos con los homólogos. En particular, SC4.5, SC4.15, SC4.91 y SC4.105 reaccionaron en forma cruzada con efrina-A4 de ratón, mientras que todos los anticuerpos reaccionaron en forma cruzada con efrina-A4 altamente similar de Cynomolgus. ND en el cuadro indica que no se determinaron los datos. 8(b) Características de los moduladores humanizados Mediante el uso de las técnicas expuestas anteriormente en este ejemplo, las construcciones humanizadas hSC4.15, hSC4.22 y hSC4.47 se analizaron para determinar sus características de unión. Además, la unión del anticuerpo humanizado se comparó directamente con el anticuerpo de murino precursor para ambos anticuerpos para identificar cualquier cambio sutil en las constantes de velocidad producidas por el procedimiento de humanización.
Más específicamente, se midió la afinidad de SC4.47 de murino mediante un Biacore usando resonancia de plasmones de superficie (SPR) para obtener los resultados expuestos en la figura 8A. Con base en una serie de concentraciones de 25, 12.5 y 6.25 nM (generando las curvas de arriba a abajo en las figuras 8A y 8B) y usando un modelo de unión de Langmuir 1 :1 , se estimó que la Kd de la unión del anticuerpo al antígeno es de 1.1 nM. Experimentos similares realizados entonces con la construcción humanizada mostraron resultados equivalentes (figura 8B), indicando que el procedimiento de humanización no había influido adversamente sobre la afinidad. A este respecto, las mediciones indicaron que la construcción humanizada tuvo una Kd<1x10'10, la cual fue sustancialmente idéntica al anticuerpo de murino precursor.
Junto con las otras técnicas expuestas en este ejemplo, estas mediciones mostraron que todos los efectores de efrina-A4 humanizados del ejemplo 7, poseen cualidades deseables. Como se expone en el cuadro C, SC4.15 reacciona fuertemente en forma cruzada con el homólogo de efrina-A4 de murino, facilitando de esta manera estudios de toxicología. La reactividad de todos los anticuerpos para el antígeno de Cynomolgus mediante ELISA, no pudo distinguirse del EFNA de humano, y se espera de esta manera que sea muy similar.
CUADRO C Comparación tabular de las propiedades de los moduladores humanizados v murinos seleccionados EJEMPLO 9 Los moduladores del ligando efrina A demuestran unión a la superficie de la célula Sobrenadantes de hibridomas que producen anticuerpos producidos contra hEFNA4-Fc como se expuso anteriormente, se cribaron para determinar la unión a la superficie de la célula según se mide en una prueba citométrica de flujo. Para demostrar las propiedades de unión de los anticuerpos se usaron dos líneas de células, células JurkatE6 y células Z138, cada una de las cuales es conocida por expresar altos niveles de efrina-A4 de superficie. Más específicamente, seis millones de células Jurkat E6, teñidas con el colorante de marcación de células CFSE (para simple identificación), y cuatro millones de células Z138 no marcadas incubadas con 20 pg/ml de reactivo de bloqueo Fe (Trueblock, Biolegend, Inc.), se mezclaron a una concentración final de 1 millón de células/mL. 50 pL de esta mezcla de células se añadieron a 50 pL de sobrenadante que contenía anticuerpos en cada cavidad, y se incubaron por 60 minutos a 4°C. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía FBS a 2%, EDTA 2 mM y azida de sodio a 0.05% (amortiguador de lavado), y entonces se tiñeron por 60 minutos a 4°C en la oscuridad con un fragmento F(ab)2 específico de la región Fe de un anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón de cabra conjugado con DyLight649 (Jackson Immuno Research). Las células se levaron dos veces con amortiguador de lavado, y se contratiñeron con 2 pg/ml de DAPI. Las muestras de control negativo fueron un anticuerpo de isotipo de lgG1 de ratón (10 pg/ml, Biolegend, Inc.) y el sobrenadante de un hibridoma (H13.2) conocido por no secretar IgG de ratón. Se prepararon muestras de control positivo usando 10 pg/ml de un anticuerpo purificado (SC4.76.2, conocido también como E76.2) que se identificó antes mediante ELISA, es específico de EFNA4 (lado izquierdo de la figura 9). Las muestras se colectaron en un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar y usando el accesorio HTS. Se consideró que ochenta y cuatro (84) clones de los ciento catorce (114), exhiben unión significativa a la superficie de la célula según se demostró mediante citometria de flujo a través de la tinción de ambas líneas de células significativamente arriba de las muestras de control negativo. A este respecto, la figura 9 muestra la capacidad de unión relativa de cincuenta ejemplos de sobrenadantes de hibridoma.
EJEMPL0 10 Los moduladores de EFNA4 seleccionados neutralizan la unión del ligando efrina A4 Los sobrenadantes de hibridomas que producen anticuerpos que se sabe se unen a células que expresan EFNA4 (ejemplo 9), se pusieron a prueba por su capacidad para bloquear la unión de hEFNA4-Fc soluble para unirse a sus receptores (EphAs) sobre la superficie de células HEK293Td. Inicialmente, como se observa en la figura 10A, se muestra que las células HEK293Td se unen a hEFNA4-Fc en una manera dependiente de la dosis, cuando se comparan con un anticuerpo de control negativo. Para demostrar la neutralización de esta unión, se incubaron 60 µ? de sobrenadantes de hibridomas anti-EFNA4 con 200 ng/ml de hEFNA4-Fc diluidos en amortiguador de lavado por 2 horas a 4°C. La mezcla se añadió entonces a cincuenta mil células HEK293Td, y se incubó por 1 hora a 4°C. Las células se lavaron una vez en amortiguador de lavado, y se tiñeron entonces por 45 minutos a 4°C en la oscuridad con el fragmento F(ab)2 específico de la región Fe de anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón de cabra conjugado con Dyüght649 (Jackson Immuno Research). Las células se lavaron entonces dos veces con amortiguador de lavado, y se contratiñeron con 2 pg/ml de DAPI. Las muestras de control negativo eran células no teñidas, células teñidas con sobrenadantes de un hibridoma que no produce IgG (H13.2), y células teñidas con un fragmento Fcy1 de IgG humana. Las muestras de control positivo eran células teñidas con hEFNA4-Fc en ausencia de sobrenadantes de hibridoma, y muestras teñidas con hEFNA4-Fc en presencia de sobrenadante de hibridoma que no produce IgG (lado izquierdo de la figura 10B). Las muestras se midieron en un FACS Canto II como se discutió anteriormente. Como se pone en evidencia en la figura 10B, sesenta y dos (62) clones de los ochenta y tres (83) puestos a prueba demostraron cierta capacidad para neutralizar la unión de hEFNA4-Fc a sus receptores de la superficie de la célula cuando se midieron usando citometría de flujo.
EJEMPLO 11 Los moduladores de EFNA bloquean la unión de EFNA en la superficie de las células, en una manera dependiente de la concentración Para medir adicionalmente la capacidad de los moduladores del ligando efrina A de la presente invención para neutralizar la actividad de EFNA, anticuerpos anti-EFNA4 de hibridomas seleccionados se purificaron y se usaron como reactivos estériles en amortiguador de PBS. Inicialmente, se preparó una curva completa de respuesta a la dosis de EFNA4-Fc de humano y de murino (quimera recombinante de efrina-A4 Fe de murino, CF R&D Systems) en paralelo para demostrar la unión limitada por la dosis de EFNA4-Fc a células HEK293Td (figura 1 1A). Una vez que este control se había establecido, diluciones en serie de anticuerpos anti-EFNA4 obtenidos de tres ejemplos de hibridomas (es decir, SC4.15.3, SC4.47.3 y SC4.76.2) se incubaron con concentraciones limitativas (0.1 pg/ml y 1.0 pg/ml) de hEFNA4-Fc y mEFNA4-Fc, respectivamente, en amortiguador de lavado por 1 hora a 4°C. Las mezclas de reactivos resultante se transfirieron entonces a cincuenta mil células HEK293Td y se incubaron por 1 hora a 4°C. Las células se lavaron una vez en amortiguador de lavado, y entonces se tiñeron por 45 minutos a 4°C en la oscuridad con un fragmento F(ab)2 específico de la región Fe de anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón de cabra conjugado con DyLight649 (Jackson Immuno Research). Las células se lavaron dos veces con amortiguador de lavado, y se contratiñeron con 2 pg/ml de DAPI. Las muestras de control negativo eran células no teñidas y células teñidas con un fragmento Fcy1 de IgG humana. Las muestras se colectaron en un FACS Canto II como se refirió anteriormente. La figura 11 B muestra la actividad del mAb SC4.15.3 que inhibe parcialmente la unión de EFNA4-Fc de humano y de ratón a células a concentraciones relativamente altas. La figura 11C ilustra la actividad del mAb SC4.47.3 que casi bloquea completamente la capacidad de hEFNA4-Fc para unirse a las células, pero no la capacidad de mEFNA4-Fc. Asimismo, la figura 11 D demuestra la capacidad del modulador del ligando efrina-A mAb SC4.76.2, para inhibir sustancialmente la capacidad de hEFNA4-Fe para unirse a las células, mientras que no influye dramáticamente sobre la capacidad de mEFNA4-Fc para unirse a las células. Estos resultados son fuertemente indicativos de la capacidad de los moduladores seleccionados de la presente invención para inhibir la unión de los ligandos efrina A a los receptores de la superficie de la célula, e inhibir de esta manera cualquier actividad tumorigénica asociada.
EJEMPLO 12 Los moduladores de EFNA bloquean la unión de EFNA a los receptores de EphA, en una manera dependiente de la concentración Como se discutió anteriormente, EphA2 es un miembro de unión conocido para EFNA4. Para explotar esta relación conocida, el dominio extracelular de EphA2 fue fusionado con la porción Fe de una IgG humana usando técnicas estándar, expresado transitoriamente en células HEK293Td, y purificado del sobrenadante del cultivo usando cromatografía de afinidad de proteína A. Como se observa en la figura 12A, el homodímero de EphA2-Fc se une en una manera dependiente de la dosis a células de Jurkat (conocidas por expresar EFNA), mientras que la porción Fe de la IgG humana sola no muestra unión alguna. Esta unión de EphA2-Fc a las células de Jurkat puede ser inhibida usando los moduladores de efrina A de la presente invención y, en particular, a través del uso de anticuerpos monoclonales para efrina-A4. Para este fin, cincuenta mil células de Jurkat por cavidad se incubaron con 10 pg/ml de cuatro anticuerpos ant¡-EFNA4 seleccionados (es decir, SC4.22, SC4.31.3, SC4.47.3 y SC4.73, todos preparados como se describió anteriormente) en amortiguador de lavado por 1 hora a 4°C. IgG y no anticuerpos de ratón (datos no mostrados) sirven como controles negativos. Después de lavado, se añadieron diluciones en serie de EphA2-Fc a las células en amortiguador de lavado por 1 hora a 4°C para proveer los resultados representados gráficamente en la figura 12B. Una revisión de la figura 12B muestra que los moduladores SC4.31.3 y SC4.47.3 inhiben sustancialmente la unión de EphA2-Fc a EFNA4, mientras que los moduladores SC4.22 y SC4.73 exhiben relativamente menos la inhibición. Para ilustrar adicionalmente la capacidad de los moduladores descritos para inhibir las interacciones con el receptor, se incubaron primero células de Jurkat con diluciones en serie de anticuerpos, seguido de incubación con 10 pg/ml de EphA2-Fc. Las células se lavaron entonces dos veces con amortiguador de lavado, se contratiñeron con 2 pg/ml de DAPI, y se analizaron en un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar, usando el accesorio HTS para proveer los datos representados en la figura 12C. Como con la figura 12B, la figura 12C demuestra que el mAb SC4.47.3 modulador es un inhibidor relativamente potente y bloquea eficientemente la unión de EphA2-Fc a EFNA4 expresado sobre las células de Jurkat. A manera de comparación, los otros moduladores muestran poco menos actividad con SC4.31.3, proveyendo una cantidad moderada de inhibición a mayores concentraciones.
Para extender estos hallazgos, se exploraron las interacciones entre moduladores de EFNA4 adicionales y los receptores de EphA. Se llevaron a cabo experimentos similares a los descritos anteriormente, salvo que se usaron células HEK293T que sobreexpresan a EFNA4 por medio de transducción retroviral (referidas como células HEK293T.hEFNA4) (figura 12D) o células HEK293T que sobreexpresan a EFNA1 por medio de transducción retroviral (figura 12E). Además, la prueba se llevó a cabo a una sola concentración de EphAx-Fc (10 pg/ml). Los datos muestran que SC4.2, SC4.31 y SC4.47 son capaces de bloquear la unión de todos los miembros de unión del receptor de EphA puestos a prueba con el ligando efrina-A4 (es decir, EphA2, EphA3, EphA4, EphA6, EphA7, EphA8 y EphAI O. Además, se estableció que el modulador SC9.65 de EFNA4, el cual se generó en una campaña de inmunización contra EFNA1 (según el ejemplo 6); tiene la capacidad de interferir con la unión de EphA1 , EphA2, EphA4 y EphA7 al ligando efr¡na-A1. Estos datos, cuando se combinan con los resultados de los otros ejemplos en la presente, sugieren que la capacidad de este modulador para antagonizar la unión de varios receptores, puede ser significativa en la provisión de los efectos terapéuticos observados de la presente invención.
EJEMPLO 13 Los moduladores para efrina A de humano reaccionan en forma cruzada con el ortólogo de ratón A la luz del hecho de que los dominios extracelulares del ligando efrina A4 de humano y de ratón comparten 80% de identidad de secuencia al nivel de proteína, los moduladores descritos para EFNA4 de humano se pusieron a prueba para ver si están asociados con el homólogo de ratón. Más específicamente, se usó una ELISA en sandwich para anticuerpos para determinar el nivel de reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales específicos de hEFNA4 con su homólogo de ratón. Una placa de prueba de 96 cavidades de alta unión a proteínas se recubrió con 0.5 g/ml de un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano de asno específico para la porción Fe de la molécula de IgG. El recubrimiento de la placa con proteínas ocurrió en un volumen de 100 µ? por cavidad usando un amortiguador de carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) durante un periodo de incubación de 16 horas a 4°C. Moléculas de EFNA4 de humano y de ratón fusionadas con la porción Fcy1 de una molécula de IgG humana (EFNA4-Fc), fueron diluidas en serie en amortiguador de PBS que contenía albúmina de suero de bovino (PBSA) a 2% (en p/v). Después del lavado de la placa recubierta en amortiguador de PBS que contenía Tween 20 (PBST) a 0.05%, se añadieron 100 µ? de EFNA4-Fc diluido de humano o de ratón por cavidad en PBSA a las cavidades por la duración de 3 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó entonces de nuevo con PBST, y se añadieron 100 µ? de PBSA/cavidad que contenía sobrenadante de hibridomas agotado a 10% o 1 pg/ml de anticuerpo monoclonal purificado (como control positivo) a la placa por la duración de 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado de la placa con PBST, se añadieron 100 µ? por cavidad de PBSA que contenía una dilución 1 :5000 de anticuerpo policlonal de IgG anti-ratón de cabra, específico para la porción Fe de IgG de ratón y conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research), a la placa por 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado de la placa extensivamente con PBST, se añadieron 100 µ? de substrato de TMB por cavidad (Thermo Fisher) a las cavidades por 15 minutos. La reacción enzimática se interrumpió añadiendo 100 µ?/cavidad de ácido sulfúrico 2 M. La absorbancia de esta prueba colorimétrica se midió a 450 nm usando un lector de placas Víctor (Perkin Elmer). Los datos se muestran como la lectura de absorbancia media más desviación estándar usando dos réplicas. La figura 13A muestra un ejemplo de anticuerpo monoclonal SC4.31.3 que reconoce a hEFNA4 pero no a mEFNA4. A la inversa, la figura 13B muestra la unión del ejemplo de anticuerpo monoclonal SC4.91.4 que reconoce a EFNA4 de humano y de ratón.
Para confirmar estos resultados, la prueba se llevó a cabo usando el modulador de efrina A4 humanizado hSC4.15. Más particularmente, cantidades tituladas de efrina-A4-His de humano y de ratón fueron recubiertas en placas de 96 cavidades de alta unión a proteínas en PBS a 4°C por 16 horas. Después del bloqueo de las placas por 2 horas a temperatura ambiente en PBSA, se añadieron 0.5 pg/ml del modulador hSC4.15 por 2 horas en PBSA. La ELISA se desarrolló como se describió anteriormente usando un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano de asno conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research). La figura 13C muestra que el modulador hSC4.15 reconoce al ligando efrina A4 de humano y de ratón igualmente bien, indicando que los moduladores humanizados descritos son enteramente compatibles con las enseñanzas en la presente.
EJEMPLO 14 Expresión del ligando efrina A en ejemplos de muestras de tumores, subpoblaciones de células tumorales y células hematopovéticas Después de la documentación de niveles elevados de la expresión génica y de la generación de anticuerpos contra EFNA4 en los ejemplos previos, se buscó evidencia para la expresión correspondiente de la proteína EFNA4 en poblaciones de células seleccionadas. A este respecto, se proveyeron disposiciones de lisados de proteínas de cáncer de fase invertida (disposiciones ProteoScan; OriGene Technologies) que comprendían 4 diluciones de 432 lisados de tejido de 1 1 tipos de tumor, o su tejido adyacente normal respectivo, junto con controles que consistían de células HEK 293 sin o con sobreexpresión de TP53 dirigida por un promotor exógeno. La expresión de la proteína EFNA4 en los lisados en esta disposición se detectó usando un anticuerpo monoclonal de EFNA4 de ratón de la presente invención que reconoce a la proteína EFNA4 mediante Western Blot (por ejemplo, el clon E47.3 conocido también como SC4.47.3). Los protocolos y reactivos de detección colorimétrica fueron provistos por el fabricante de las disposiciones ProteoScan, y los puntos en la disposición fabricada fueron convertidos a una imagen digital usando un escáner de lecho plano que usa el software BZScan2 Java (INSERM-TAGC) para cuantificar la intensidad de los puntos.
Resultados seleccionados de dichas pruebas se muestran en las figuras 14A-14D, e indican que la expresión de la proteína EFNA4 es sobrerregulada en las muestras de tumor colorrectal. Más específicamente, la figura 14A muestra que la expresión de la proteína EFNA4 parece estar significativamente elevada en un subgrupo de especímenes de tumor colorrectal, especialmente en los pacientes con enfermedad de etapa IV cuando se compara con tejido tumoral o tejido adyacente normal de especímenes obtenidos de las primeras etapas de la enfermedad. Los datos se generaron como se describió anteriormente, y se representaron como la intensidad promedio de pixeles por punto (intensidad de puntos). La barra negra horizontal en cada muestra representa la media para los especímenes en cada categoría respectiva.
Después de que se confirma que la proteína EFNA4 fue sobrerregulada en ciertos lisados de células tumorales enteros de cáncer colorrectal, se llevaron a cabo pruebas para establecer que el mismo objetivo fue expresado en células que inician tumores. Más específicamente, para determinar si la expresión de la proteína EFNA4 podría detectarse sobre la superficie celular de células que inician tumores, se disociaron los tumores como se describió anteriormente por análisis citométrico de flujo. Después de que la muestra del tumor (por ejemplo, la línea de células CR33 de cáncer colorrectal, según el ejemplo 2) fue disociada hasta una suspensión de células individuales, se incubó a 37°C por 24 horas para facilitar la re-expresión del antígeno (debido a la sensibilidad enzimática del antígeno de EFNA4 a la colagenasa/hialuronidasa), y se tiñó entonces con un anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina (PE) capaz de reconocer a EFNA4. Las células se analizaron entonces como en los ejemplos previos con un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar usando el accesorio HTS. En la realización de dichos experimentos, se observó que la expresión de EFNA4 fue notablemente mayor en la subpoblación de células TIC (según se define mediante la co-tinción de las células con anticuerpos que reconocen a marcadores de la superficie de la célula que definen TIC; por ejemplo, 46+, 324+, 66"), que en células NTG. Un resultado representativo de un experimento usando células tumorales NTX SCRx-CR33 de cáncer colorrectal y el modulador SC4.47.3 de EFNA4, muestra que la expresión de EFNA4 fue más de 2 veces mayor en células TIC que en células NTG (figura 14B).
Para confirmar además que EFNA4 es relativamente altamente expresada en células TIC, se cultivaron células LU86 y LU64 in vitro por 10 días, y se midió la expresión mediante citometría de flujo usando un anticuerpo SC4.47 conjugado con PE como se expone en la presente. Las colonias resultantes se cosecharon y se tiñeron como se describió anteriormente. Como se ilustra en la figura 14D, la población de células LU86 de TIC (línea negra continua) expresa a EFNA4 bien arriba del control de isotipos (gris sombreado) y la población de NTG (línea negra a rayas) de la misma línea de células tumorales. Adicionalmente, las células LU86 cultivadas in vivo pueden ser destruidas con anticuerpos de EFNA4 (como se muestra en el ejemplo 16 más adelante). A la inversa, se encontró que las células LU64 no expresan niveles elevados de EFNA4 (figura 14D), y posteriormente no fueron destruidas con anticuerpos anti-EFNA.
Mientras que se cree que la expresión de la proteína EFNA4 no se ha evaluado en especímenes de tumores sólidos antes de la presente descripción, se ha reportado que la proteína es expresada a niveles relativamente bajos en células B y a niveles elevados en células B de los pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL). Para confirmar la expresión de las proteínas EFNA4 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) normales, se llevaron a cabo pruebas como se describió anteriormente en este ejemplo, para proveer los datos expuestos en la figura 14C. Una revisión de las gráficas mostradas en la figura 14C muestra que cuando la expresión de EFNA4 se midió en PBMC de un donador normal, sólo las células B CD19+ fueron débilmente positivas, confirmando los reportes en la literatura en cuanto a dónde la EFNA4 es expresada.
Los datos apoyan las observaciones en los ejemplos anteriores, que la sobreexpresion de EFNA4 está asociada con TIC y/o TPC en el cáncer colorrectal, y puede estar implicada en proliferación y/o supervivencia. Los datos muestran además que EFNA4 no es expresada en la mayoría de las PBMC normales, y que la expresión en células B normales es mínima. En vista de los ejemplos anteriores que muestran que: a) la expresión génica de EFNA4 está asociada con la subpoblación de células TPC en cáncer colorrectal y la subpoblación de células tumorigénicas en tumores pancreáticos; b) la expresión de la proteína EFNA4 es mayor en la subpoblación de células TIC; c) la expresión de la proteína EFNA4 es elevada en los especímenes de tumores enteros de cáncer colorrectal de etapa tardía; y d) la observación general de que las TIC son más frecuentes en los tumores de etapa tardía, parece ser que EFNA4 está asociada con aquellas células que sufren crecimiento del tumor, resistencia a la terapia y recidiva del tumor, apoyando que EFNA4 puede desempeñar una función integral en el soporte de las TPC y/o TIC en los tumores mencionados anteriormente.
EJEMPLO 15 Los moduladores del ligando efrina A son internados por las células K562 Dado el perfil de expresión de los ligandos efrina A establecido en los ejemplos previos, se llevaron a cabo pruebas para ver si los moduladores de la presente invención eran internados tras la unión al antígeno de la superficie de la célula. A este respecto, los sobrenadantes de hibridomas que producen anticuerpos producidos contra EFNA4-Fc en el ejemplo se cribaron para determinar su capacidad para internarse en células K562 que expresan a EFNA4 a bajos niveles en la superficie de la célula. Células K562 a una concentración de partida de 106/ml (suspensión de células individuales) fueron bloqueadas con Human TruStain (BioLegend, Inc.) por 10 minutos a temperatura ambiente, y diluidas entonces hasta 5x104 células por cavidad. Muestras duplicadas se tiñeron entonces por 30 minutos sobre hielo con sobrenadante que contenía anticuerpos anti-EFNA para un volumen final de 50 µ?. Las células se lavaron entonces con medio de tinción de FACS (FS ; suero de bovino fetal a 2%/solución amortiguadora de Hank/HEPES 25 mM [pH7.4]), para remover el anticuerpo no unido. Esto fue seguido por una segunda tinción con Alexa647 anti-ratón de asno (Life Technologies) por 30 minutos sobre hielo. Las muestras se lavaron de nuevo para remover el anticuerpo no unido, y se resuspendieron entonces en medio de internamiento (suero de bovino fetal a 2%/medio de Dulbecco modificado de Iscove). Para permitir el internamiento, las muestras se incubaron en CO2 a 5% a 37°C (o 4°C para el control) por una hora. El internamiento se interrumpió transfiriendo las muestras a hielo y añadiendo el exceso de FSM enfriado en hielo. Para remover cualquier anticuerpo que no fue internado y permaneció sobre la superficie de la célula, las muestras se trataron con solución salina amortiguadora de fosfato de pH bajo (PBS [pH 2.0]) por 10 minutos sobre hielo. Después de este procedimiento "extracción por ácido", las muestras se lavaron extensivamente con FSM, se resuspendieron en 150 µ? de FSM que contenía 2 pg/ml de DAPI, y se analizaron mediante citometría de flujo (de nuevo usando un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar usando el accesorio HTS). Cualquier señal detectada más allá del fondo resulta del internamiento del anticuerpo: un proceso que protege al conjugado fluorescente de la remoción de la superficie de la célula durante el procedimiento de extracción por ácido. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en FSM, a menos que se indicara de otra manera.
La selección de 159 clones del sobrenadante de hibridomas que contiene al anticuerpo de EFNA4 usando el protocolo de extracción por ácido descrito anteriormente, mostró que muchos sobrenadantes exhiben un cambio positivo en fluorescencia contra los anticuerpos de control negativo de IgG (datos no mostrados). Los ejemplos de clones SC4.5, SC4.22 y SC4.73, por ejemplo, demostraron internamiento hasta que los sobrenadantes de estos subclones fueran capaces de internar y proteger al anticuerpo secundario Alexa647 de la extracción por ácido (figura 15A). En comparación con los controles de IgG, aproximadamente 15% de los sobrenadantes que contenían anticuerpos de EFNA4 indujeron internamiento a grados variables, demostrando los diecinueve (19) superiores una intensidad de fluorescencia media (MFI a 37°C contra 4°C) delta arriba de 150 (figura 15B). Estos datos demuestran que un subgrupo de los moduladores generados contra el ECD de EFNA4 de humano se une al antígeno conforme es presentado sobre las células y es capaz de ser internado. Dichos resultados subrayan el valor terapéutico potencial de los ligandos efrina A como objetivos para los moduladores de la presente invención, con o sin cargas útiles citotóxicas.
La prueba se repitió usando moduladores de EFNA4 purificados seleccionados a una concentración de 10 pg/ml y células HEK293T (figura 15C) y HEK293T.hEFNA4 (figura 15D) como células objetivo. Las células HEK293T precursoras expresan un bajo nivel del ligando efrina A4 sobre su superficie. Después del protocolo descrito anteriormente, los datos demuestran que todos los moduladores de efrina A4 puestos a prueba son internados tras la unión al ligando efrina A4 expresado sobre la superficie de las células. Las intensidades de fluorescencia media (MFI) registradas para cada muestra se compararon contra una perla estándar (perlas arcoiris Spherotech de 8 colores, de Becton Dickinson) que contenían ocho diferentes cantidades conocidas de fluoróforo encapsulado (datos no mostrados). Esto permitió la transformación de los valores de la MFI en valores lineales, y el cálculo del número relativo de receptores por célula.
EJEMPLO 16 Moduladores de EFNA4 como porciones de direccionamiento El direccionamiento de un fármaco citotóxico enlazado establemente a un anticuerpo, representa un procedimiento de anticuerpos habilitados que podría tener gran beneficio terapéutico para los pacientes con tumores sólidos. Para determinar si los anticuerpos específicos de EFNA4 descritos anteriormente eran capaces de mediar el suministro de un agente citotóxico hacia células vivas, se llevó a cabo una prueba de destrucción de células in vitro en donde estreptavidina conjugada con la proteína inactivadora de ribosomas, saporina (Advanced Targeting Systems), fue unida a anticuerpos de EFNA4 biotinilados, y la capacidad de estos complejos de saporina para internar y destruir células se midió 72 horas después midiendo la viabilidad de las células.
Específicamente, 105 células Z138 por cavidad se sembraron en las cavidades de una placa de 96 cavidades. Los anticuerpos anti-EFNA4 descritos anteriormente fueron purificados de los sobrenadantes, biotinilados y diluidos entonces hasta 20 pg/mL La línea de células Z138 (ATCC CRL-3001) se derivó de un paciente con linfoma de células del manto, y expresa cantidades modestas de EFNA4. Una alícuota de cada anticuerpo, respectivamente, se mezcló 1 :1 con estreptavidina-ZAP (Advanced Targeting Systems), se sometió a acción de remolino por 5 segundos, y entonces se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Entonces se hicieron dos diluciones adicionales en serie de 10 veces los complejos de anticuerpo-saporina, y se añadieron 50 µ?_ de cada mezcla, respectivamente, a las cavidades que contenían a las células Z138. La mezcla de células/anticuerpos/saporina se incubó entonces a 37°C/C02 a 5% por 24 horas. Después de esta incubación, las células se hicieron girar en las placas de 96 cavidades de fondo redondo, el sobrenadante se removió, y se añadieron 100 µ?_ de medio de cultivo nuevo a cada cavidad. Las células se incubaron entonces por otras 72 horas, y entonces se hizo el conteo de las células viables usando CelITiter-Glo (Promega Corp.) siguiendo el protocolo del fabricante.
Mediante el uso de este protocolo, varios anticuerpos que fueron capaces de ser internados como se describió en el ejemplo previo, fueron también capaces de mediar la destrucción de células in vitro (datos no mostrados), mientras que un anticuerpo control de isotipos biotinilado no fue capaz de destruir a las células. Es decir, varios de estos moduladores de internamiento fueron capaces de mediar el internamiento de la toxina saporina que resultó en la muerte de las células. La figura 16A ilustra esta capacidad de destrucción de células para el ejemplo de modulador de internamiento SC4.5.3, en donde la pendiente descendente de la curva representa la muerte de las células en una manera dependiente de la concentración, en comparación con el control. Estos datos demuestran claramente la eficacia de los moduladores descritos cuando actúan como vectores para el internamiento selectivo de cargas útiles citotóxicas en células tumorigénicas que expresan ligandos efrina A.
Para corroborar estos resultados y determinar si los efectores de EFNA4 pueden mediar el internamiento de la toxina y la destrucción de células tumorales humanas primarias, se sembraron células NTX agotadas de linaje de ratón (es decir, células tumorales humanas propagadas como xenoinjertos de baja pasada en ratones inmunocomprometidos), y fueron expuestas posteriormente a anticuerpos anti-EFNA4 y Fab-ZAP.
Específicamente, tumores NTX que representan especímenes de tumores de piel y pulmón, fueron disociados en una suspensión de células individuales y sembrados en placas BD Primaria™ (BD Biosciences) en medio libre de suero complementado con factor de crecimiento, como es sabido en la técnica. Después de 3 a 5 días de cultivo a 37°C/C02 a 5%/02 a 5%, las células fueron puestas en contacto con un control (lgG1 o lgG2b) o un modulador de EFNA4 de murino (SC4.5, SC4.22, SC4.47 o SC4.91 a 1 nM) y Fab-ZAP (a 40 nM). Se evaluó entonces la citotoxicidad de la saporina mediada por el modulador, cuantificando el número de células restantes usando CelITiter Glo 5 a 7 días después. Como se observa en la figura 16B, la exposición a los anticuerpos de EFNA4 resultó en números reducidos de células LU86, mientras que el anticuerpo control de isotipos lgG2b e lgG1 no influyó sobre el número de células vivas después del tratamiento. En la figura 16C, la exposición a los anticuerpos SC4.5, SC4.47 y SC4.91 resultó en números reducidos de células SK19, mientras que los controles de isotipos y SC4.22 fueron ineficaces. No sólo estos datos demuestran que los ejemplos de anticuerpos descritos en la presente son específicos para EFNA4, son capaces de unirse al antígeno de EFNA4 sobre la superficie de las células y de facilitar el suministro de una carga útil citotóxica que resulta en la muerte de las células, sino los datos anteriores demuestran también que los anticuerpos anti-EFNA4 múltiples pueden mediar la destrucción de células tumorales NTX múltiples.
En una variación de la prueba de destrucción mencionada anteriormente, se demostró el suministro de una carga útil citotóxica por medio de moduladores de EFNA para anticuerpos adicionales y en células adicionales. 2000 células/cavidad de los siguientes tipos de células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 cavidades en sus medios de cultivo respectivos un día antes de la adición de los anticuerpos y la toxina: células HEK293T (figura 16C) y células HEK293T.hEFNA4 (figura 16D). Se añadieron anticuerpos monoclonales de ratón purificados ("desnudos") a varias concentraciones y una concentración fija de fragmento Fab de IgG antiratón 10 nM enlazado covalentemente a saporina (Advanced Targeting Systems, #IT-48), a los cultivos por 72 horas. Los números de células viables se enumeraron como se describió anteriormente. Los conteos de luminiscencia sin elaborar usando cultivos que contenían células con el fragmento Fab saporina se ajustaron como valores de referencia de 100%, y todos los demás conteos se calcularon en consecuencia (referidos como "RLU normalizada").
Mediante el uso de esta prueba, se pudo demostrar que todos los anticuerpos de EFNA puestos a prueba, pero no los anticuerpos control de isotipos, fueron capaces de destruir a las células objetivo. Esta prueba demuestra adicionalmente que el internamiento ocurre solamente debido a la unión del anticuerpo de EFNA4 a la superficie de la célula sin la necesidad de entrelazamiento adicional. Por último, los datos demuestran que sólo las células que expresan un número suficiente de EFNA sobre su superficie, son destruidas por los moduladores de EFNA. Las células HEK293T precursoras expresan un bajo número de EFNA sobre su superficie, mientras que las células HEK293T.hEFNA4 expresan este ligando fuertemente (véase las figuras 15C y 15D del ejemplo previo). El cuadro 5 siguiente enlista la concentración efectiva semi-máxima (referida comúnmente como "EC50) para todas las combinaciones de células objetivo/anticuerpos puestas a prueba. Además de las líneas de células mencionadas anteriormente, se usaron células PC3 (ATCC CRL-1435), una línea de células derivada de un adenocarcinoma humano, como una célula objetivo.
CUADRO 5 Los moduladores de EFNA suministran una carga útil citotóxica (NT. = no puesto a prueba).
En otra variación de la prueba de destrucción in vitro, se pusieron a prueba moduladores de EFNA humanizados por su capacidad para internar y suministrar una carga útil citotóxica. La prueba se llevó a cabo como se describió anteriormente, salvo que sólo se sembraron 500 células/cavidad, y se añadió a los cultivos el fragmento Fab de IgG anti-humano enlazado covalentemente a saporina (Advanced Targeting Systems, #IT-51). La figura 16E ilustra que los moduladores de EFNA humanizados (Hz en la figura 16E) descritos en el ejemplo 7, son capaces de unirse al ligando efrin-A4 expresado sobre la superficie de células objetivo y de inducir el internamiento de EFNA junto con el anticuerpo unido y la carga útil citotóxica.
En otra variación de la prueba de destrucción in vitro, el modulador de EFNA humanizado hSC4. 5 que se muestra se une igualmente bien a EFNA de humano y de ratón (véase la figura 13C), se puso a prueba por su capacidad para internar y suministrar una carga útil citotóxica hacia células HEK293T que sobreexpresan a EFNA de humano o de ratón. Para garantizar la comparación directa, se tiñeron células lentiviralmente transducidas con hSC4.15, y se separaron mediante FACS para la expresión moderada de efrin-A4 de humano o de ratón (datos no mostrados). La prueba de destrucción se llevó a cabo como se describió anteriormente. La figura 16F ilustra que el modulador SC4.15 humanizado destruye igualmente bien a las células que expresan a EFNA de humano o de ratón.
EJEMPL0 17 Los moduladores de EFNA detectan el ligando EfrinA secretado Como se discutió en cierto detalle anteriormente, EFNA4 puede existir como una molécula enlazada a GPI asociada con la membrana de las células, o como ligandos o isoformas truncados secretados. La detección de estos compuestos secretados en material biológico tal como fluidos corporales o medios de cultivo de células, puede ser útil para propósitos de diagnóstico, o como un auxiliar en el manejo del paciente (utilidad como biomarcador). Por ejemplo, se ha sugerido que la EFNA4 secretada puede encontrarse a concentraciones elevadas en los pacientes con leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) (Alonso-C LM et al., 2009, Leukemia Research 33: 395-406). Para demostrar dichos aspectos preferidos de la presente invención, los moduladores descritos se usaron para reconocer epítopes no traslapantes de la EFNA4 purificada, y detectan y cuantifican generalmente ligandos de EFNA secretados en muestras tumorigénicas seleccionadas. Con respecto a esta última característica de la presente invención, se usaron moduladores de EFNA para detectar y cuantificar el ligando efr¡n-A secretado en suero humano (datos no mostrados) y plasma humano obtenido de pacientes con células B-CLL, y del suero de ratones que poseen xenotrasplantes de tumores humanos (por ejemplo, como se describió en el ejemplo 1 anterior). En cada caso, los moduladores fueron capaces de medir efectivamente los niveles del ligando como se describe inmediatamente a continuación.
Para detectar la EFNA4 soluble de humano, el anticuerpo SC4.91 fue absorbido a una placa de microtítulo de alta unión de proteínas (placas Greiner BioOne Microlon), a 5 pg/ml en amortiguador de carbonato de sodio 50 mM (pH9.6) durante una incubación durante la noche a 4°C. Después del lavado de la placa en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) que contenía Tween 20 (PBST) a 0.05% (en v/v), la placa fue bloqueada en PBS que contenía albúmina de suero de bovino (PBSA) a 2% (en p/v) por 2 horas a temperatura ambiente. Efrin-A4-His purificada, expresada transitoriamente en células CHO-S y purificada usando secuencialmente resina NTA de níquel y filtración en gel, fue diluida en serie en PBSA y añadida por 2 horas a la placa. Después del lavado con PBST, el anticuerpo biotinilado SC4.47 se añadió a 1 pg/ml en PBSA por 1 hora a la placa. La placa se lavó entonces con PBST, y entonces se añadió conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (por ejemplo, de Jackson Immuno Research) a una dilución de 1 :5000 en PBSA por 30 minutos. La placa tratada se lavó entonces de nuevo en PBST, y se añadió solución de substrato de TMB (por ejemplo, de Thermo Fisher) por 30 minutos. La reacción de color se interrumpió añadiendo un volumen igual de ácido sulfúrico 2 M, después de lo cual la placa se leyó usando una lectura de absorbancia de 450 nm en un lector de placas estándar. Los resultados de los experimentos se muestran en las figuras 17A-17C.
Mediante el uso de las técnicas descritas inmediatamente anteriormente, la concentración de hefrin-A4-His soluble se gráfico contra los valores de absorbancia para proveer las curvas mostradas en la figura 17A. Más específicamente, la curva primaria muestra los resultados de las mediciones de absorbancia a las concentraciones de EFNA4 soluble de 0 a 40 pg/ml, mientras que la inserción muestra la misma curva a concentraciones de 0 a 1 ,000 pg/ml. Los expertos en la técnica apreciarán que las curvas estándar mostradas en la figura 17A pueden usarse para proveer una prueba extremadamente sensible para la medición de las concentraciones de EFNA4 en muestras biológicas.
Sacando ventaja de las mediciones mencionadas anteriormente y usando regresión no lineal (software Prism 5, Graphpad), se calculó la concentración de efrin-A4 en muestras desconocidas. A este respecto, se analizaron muestras de plasma de cuatro adultos sanos, cuatro pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y cuatro pacientes diagnosticado con mieloma múltiple (MM), por su concentración de efrin-A4 secretada. Los datos obtenidos sugieren que el analito de hEFNA4 es significativamente mayor en los pacientes con CLL que en los adultos sanos u otros tumores seleccionados derivados de células B (figura 17B). Además, como se indicó anteriormente y como se muestra en la figura 17C, la hENFA4 secretada es también detectable en ratones que albergan xenotrasplantes de cáncer colorrectal humano. Específicamente, en la figura 17C, cada punto es representativo de los niveles de hEFNA4 secretados en sueros obtenidos de un diferente ratón. A la inversa, los niveles de hEFNA4 secretada en suero en ratones no xenotrasplantados, fueron esencialmente indetectables (datos no mostrados). Aún más sorprendentemente, cuando se gráfico el volumen del tumor contra la concentración de hEFNA4 en las muestras de suero, se observó una correlación significativa que sugiere que el analito secretado podría ser particularmente útil para monitorear el crecimiento del tumor de ciertos tumores sólidos humanos in vivo. Más generalmente, estos resultados son fuertemente indicativos del campo de aplicación de la presente invención en ambientes terapéuticos y de diagnóstico.
Mediante el uso del método descrito anteriormente, múestras de plasma de 23 donadores humanos normales obtenidas de un banco de sangre, se usaron para determinar la escala de concentración de este analito en adultos sanos. Como se muestra en la figura 17D, se encontró una concentración media de 332 pg/ml de EFNA4 (desviación estándar de 6.2 pg/ml). Esto indica que EFNA es secretada o dispersa a una concentración muy baja y estrechamente regulada, y hace de EFNA un biomarcador o marcador de diagnóstico ideal para monitorear la progresión de la enfermedad o diagnosticar trastornos asociados con EFNA.
Para explorar esta posibilidad adicionalmente, muestras de suero obtenidas comercialmente de 17 pacientes con cáncer colorrectal y 10 muestras de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas se compraron con 12 muestras de adultos sanos, y se pusieron a prueba para la concentración de EFNA4 usando el método descrito anteriormente. Como se muestra en la figura 17E, ambos pacientes con cáncer colorrectal y cáncer pulmonar de células no pequeñas tuvieron niveles de EFNA4 circulante significativamente elevados en su sangre. Mediante el uso de una prueba t no pareada, la comparación entre los adultos sanos y los pacientes con cáncer colorrectal alcanzó un valor p de 0.0002, y entre los adultos sanos y los pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas, de 0.01. Los datos demuestran que la EFNA4 secretada o dispersa está elevada en los pacientes con tumores sólidos, e ilustra el valor del uso de los moduladores descritos en pruebas analíticas o diagnósticos clínicos.
EJEMPLO 18 Los moduladores de EFNA4 pueden elegir como objetivo células que expresan liqandos de EFNA4 relacionados La especificidad de los moduladores de EFNA4 por el ligando se prueba contra ligandos de EFNA relacionados, para evaluar el grado de reactividad cruzada. Como un ejemplo, se pusieron a prueba SC4.2.1 y SC9.65 en la prueba de destrucción in vitro usando células HEK293T que sobreexpresan a EFNA4 (figura 17A), EFNA3 (figura 17B) y EFNA1 (figura 17C). Nótese que el modulador SC9.65 se generó inmunizando a ratones con inmunógeno de EFNA1 (según el ejemplo 6). La prueba de destrucción se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 16. Las figuras 17A-17E demuestran que SC4.2.1 es capaz de destruir a las células que expresan a EFNA3 además de las células que expresan a EFNA4, y SC9.65 es capaz de destruir a las células que expresan a EFNA1 y EFNA4. Estos datos ilustran que los moduladores seleccionados generados contra un miembro específico de la familia de EFNA, pueden unirse a otros miembros de la familia suficientemente bien para unir, inducir el internamiento y suministrar una carga útil citotóxica, a células que expresan el ligando. Este descubrimiento es un poco inesperado, dado el bajo grado de homología entre los miembros de la familia de EFNA (aproximadamente 34 a 45% de identidad de secuencia de aminoácidos entre la EFNA1 , 2, 3 y 4 de humano) y ejemplifica que, como se describe en la presente, pueden generarse pan-moduladores de EFNA para propósitos de diagnóstico o terapéuticos.
EJEMPLO 19 Los ligandos de EFNA interactúan selectivamente con receptores EphA múltiples Como se discutió anteriormente, se sabe que los ligandos de efrin-A se unen a numerosos receptores EphA. Para explorar qué receptores EphA tienen el potencial de interactuar con EFNA4, se desarrolló una prueba de unión citométrica de flujo similar a la descrita en el ejemplo 9. Más particularmente, los receptores EphA solubles expresados como construcciones de fusión de Fc-lgG1 de humano se añadieron a cincuenta mil células HEK293T por cavidad (figura 19A) o células HEK293T que sobreexpresan a EFNA4 (figura 19B) por medio de transducción retroviral (referidas como células HEK293T.hEFNA4) por 1 hora en amortiguador de tinción a 4°C. Después del lavado, un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano secundario conjugado con Dylight 649 (Jackson Immuno Research), se añadió por una hora. Después de lavado dos veces, las muestras se resuspendieron en amortiguador de tinción que contenía 2 pg/ml de DAPI, y se analizaron en un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar usando el accesorio HTS. Las figuras 19A y 19B demuestran que EphA2, EphA3, EphA4, EphA6, EphA7 y EphAI O, pero no EphA1 , se unen al ligando efrin-A4. Esto de nuevo apunta hacia las ventajas y los puntos de acción de facetas múltiples potenciales inherentes en los moduladores de la presente invención.
EJEMPLO 20 EFNA4 se une a los receptores EphB2, pero no a los receptores EphB3 y EphB4 Extendiendo el hallazgo mostrado en el ejemplo 20, se exploró la capacidad del ligando efrin-A4 para unirse a los receptores EphB. Se identificó inicialmente a EFNA4 como un objetivo asociado con CSC como se demostró anteriormente en los ejemplos 2 a 4. En la jerarquía de tejidos de las criptas de colon normal de ratón, los receptores EphB2 y EphB3 son altamente expresados por las células que residen en la base de la cripta del colon, y no por las células localizadas arriba de la cripta, indicando que la expresión de EphB y la señalización hacia adelante o inversa a través de los receptores EphB, es importante en la organización del tejido y las decisiones del destino de las células individuales (Batlle et al.; 2002 PMID: 12408869). Más recientemente, la expresión de EphB2 por las células de cáncer colorrectal se ha vinculado con las capacidades proliferativas a largo plazo y de inicio de tumores, sugiriendo que EphB2 puede servir como un marcador fenotípico para las células madre de cáncer del colon (Merlos-Suárez et al., 201 1 PMID: 21419747). Por lo tanto, la capacidad del ligando efrin-A4 para unirse a cualquiera de los receptores EphB diferencialmente expresados, podría ser de importancia biológica ante las células madre de cáncer colorrectal.
Mediante el uso de técnicas reconocidas en la materia, se añadieron receptores EphB solubles expresados como construcciones de fusión de Fc-lgG1 de humano así como EphA1-Fc (que no se une a EFNA4) y EphA2-Fc (que se une fuertemente al ligando EFNA4), a cincuenta mil células HEK293T por cavidad (figura 20A) o células HEK293T.hEFNA4 (figura 20B) por 1 hora en amortiguador de tinción a 4°C. Después del lavado, se añadió por 1 hora un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano secundario conjugado con Dylight 649 (Jackson Immuno Research). Después de lavado dos veces, las muestras se resuspendieron en amortiguador de tinción que contenía 2 pg/ml de DAPI, y se analizaron en un FACS Canto II (BD Biosciences) bajo condiciones estándar usando el accesorio HTS. Las figuras 20A y 20B demuestran que EphB2, pero no EphB3 y EphB4, se une al ligando EFNA4, de nuevo subrayando la diversidad potencial de las vías terapéuticas que pueden ser impactadas en forma ventajosa por los moduladores descritos.
Los expertos en la técnica apreciarán adicionalmente que la presente invención puede describirse en otras formas específicas, sin que se aparten del espíritu o los atributos centrales de la misma. En vista de que la descripción anterior de la presente invención describe sólo ejemplos de modalidades de la misma, se entenderá que se contempla que otras variaciones están dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención no se limita a las modalidades particulares que se han descrito en detalle en la presente. Más bien, debe hacerse referencia a las reivindicaciones anexas como indicativas del alcance y contenido de la invención.

Claims (113)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un modulador de EFNA aislado.
2. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el modulador de EFNA comprende un antagonista de EFNA.
3. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el modulador de EFNA comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
4. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
5.- El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
6. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante.
7. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de internamiento.
8.- El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de agotamiento.
9.- El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo que se asocia con EFNA4.
10. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera que tiene tres regiones determinantes de complementariedad y una región variable de cadena pesada que tiene tres regiones determinantes de complementariedad, en donde las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y ligera comprenden las regiones determinantes de complementariedad como se exponen en el cuadro A.
11. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111 , SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131 , SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 , SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 163, y en donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que se exponen en SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121 , SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 161.
12. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 9, 10 u 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un agente citotóxico.
13. - Un ácido nucleico que codifica para una región variable de cadena pesada de aminoácidos o una región variable de cadena ligera de aminoácidos de la reivindicación 11.
14. - Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.
15. - Una célula hospedera que comprende el vector de la reivindicación 14.
16. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos como la que se expone en SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma.
17. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el modulador de EFNA comprende adicionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.
18. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho modulador reduce la frecuencia de células que inician tumores tras la administración a un sujeto que necesita del mismo.
19. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis citométrico de flujo de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores.
20. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la reducción de la frecuencia se determina usando detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores.
21. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dichas células que inician tumores comprenden células que perpetúan tumores.
22. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un agente citotóxico.
23. - El modulador de EFNA aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho modulador de EFNA comprende un pan-modulador de EFNA.
24. - Una composición farmacéutica que comprende el modulador de EFNA aislado de la reivindicación 1.
25. - Un modulador de EFNA4 aislado.
26. - El modulador de EFNA4 aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho modulador de EFNA4 comprende un pan-modulador de EFNA4.
27. - Una composición farmacéutica que comprende el modulador de EFNA4 aislado de conformidad con la reivindicación 25.
28. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno asociado con EFNA en un sujeto.
29. - Un modulador de EFNA para usarse en el tratamiento de un trastorno asociado con EFNA en un sujeto.
30. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho modulador de EFNA comprende un antagonista de EFNA.
31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el modulador de EFNA comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 31 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 31 , en donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
33. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 32 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
34. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 33 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera que tiene tres regiones determinantes de complementariedad y una región variable de cadena pesada que tiene tres regiones determinantes de complementariedad, en donde las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y ligera comprenden las regiones determinantes de complementariedad como se exponen en el cuadro A.
35. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 32 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho anticuerpo monoclonal se asocia con EFNA4.
36. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 32 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante.
37.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 32 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de internamiento.
38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 37, en donde dicho anticuerpo de internamiento comprende un agente citotóxico.
39. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho trastorno asociado con EFNA comprende un trastorno hiperproliferativo.
40. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho trastorno hiperproliferativo comprende un trastorno neoplásico.
41. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 40 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 40, en donde dicho trastorno neoplásico comprende un tumor sólido.
42. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 41 , en donde el trastorno neoplásico comprende cáncer adrenal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer de mama.
43. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 40 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 40, en donde dicho trastorno neoplásico comprende una malignidad hematológica.
44. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 43 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicha malignidad hematológica comprende leucemia o linfoma.
45. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 40 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el sujeto que sufre dicho trastorno neoplásico exhibe tumores que comprenden células que inician tumores.
46.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 45 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la frecuencia de células que inician tumores en dicho sujeto se reduce adicionalmente.
47. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 46 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis citométrico de flujo de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores o la detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores.
48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 46 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo.
49. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 48 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 48, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis de dilución limitativa in vivo en donde células tumorales humanas vivas son transplantables en ratones inmunocomprometidos.
50. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 49 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis de dilución limitativa in vivo que comprende la cuantificación de la frecuencia de células que inician tumores usando la estadística de distribución de Poisson.
51. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 48 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 48, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis de dilución limitativa in vitro que comprende la deposición por dilución limitativa de células tumorales humanas vivas en condiciones que sustentan colonias in vitro.
52. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 51 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 51 , en donde la reducción de la frecuencia determinada usando el análisis de dilución limitativa in vivo, comprende la cuantificación de la frecuencia de células que inician tumores usando la estadística de distribución de Poisson.
53. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde el medicamento está además adaptado para ser administrable con un agente anticanceroso.
54.- El modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el modulador de EFNA está además adaptado para ser administrable con un agente anticanceroso.
55.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho modulador de EFNA comprende una secuencia de aminoácidos como la que se expone en SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma.
56. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho modulador de EFNA comprende un pan-modulador de EFNA.
57. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para reducir la frecuencia de células que inician tumores en un sujeto.
58.- Un modulador de EFNA para usarse en la reducción de la frecuencia de células que inician tumores en un sujeto.
59.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde las células que inician tumores comprenden células que perpetúan tumores.
60.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 59 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 59, en donde dichas células que perpetúan tumores son células CD44+ o CD133+.
61.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo.
62. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 61 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 61 , en donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
63. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 62 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 62, en donde dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo anti-EFNA4.
64. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado del grupo que consiste en cáncer adrenal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama.
65.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el sujeto padece una malignidad hematológica.
66. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde la frecuencia de las células que inician tumores es reducida por cuando menos 10%.
67. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando el análisis citométrico de flujo de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores, o la detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de la célula tumoral que se sabe enriquecen a células que inician tumores.
68.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 57 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 58, en donde la reducción de la frecuencia se determina usando análisis de dilución limitativa in vitro o in vivo.
69.- El uso un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto que sufre de una malignidad hematológica.
70.- Un modulador de EFNA para usarse en el tratamiento de un sujeto que sufre de una malignidad hematológica.
71.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 69 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 70, en donde dicho modulador de EFNA es un modulador de EFNA4.
72. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para sensibilizar un tumor en un sujeto para tratamiento con un agente anticanceroso.
73. - Un modulador de EFNA para usarse en la sensibilización de un tumor en un sujeto para tratamiento con un agente anticanceroso.
74. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 72 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 73, en donde dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo.
75. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 72 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 73, en donde dicho tumor es un tumor sólido.
76. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 72 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 73, en donde dicho agente anticanceroso comprende un agente quimioterapéutico.
77. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 72 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 73, en donde dicho agente anticanceroso comprende un agente inmunoterapéutico.
78. - Un método de diagnóstico de un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita del mismo, que comprende los pasos de: a. poner en contacto una muestra de tejido de dicho sujeto con por lo menos un modulador de EFNA; y b. detectar o cuantificar el modulador de EFNA asociado con la muestra.
79. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque el modulador de EFNA comprende un anticuerpo monoclonal.
80.- El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado además porque el anticuerpo está asociado operablemente con un reportero.
81.- Un artículo de fabricación útil para diagnosticar o tratar un trastorno asociado con EFNA, que comprende un receptáculo que comprende un modulador de EFNA y materiales de instrucción para el uso de dicho modulador de EFNA para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con EFNA.
82.- El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 81 , caractenzado además porque dicho modulador de EFNA es un anticuerpo monoclonal.
83. - El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado además porque el receptáculo comprende una placa legible.
84. - El uso de por lo menos un modulador de EFNA de internamiento en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto que sufre de un trastorno neoplásico.
85. - Por lo menos un modulador de EFNA de internamiento para usarse en el tratamiento de un sujeto que sufre de un trastorno neoplásico.
86. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 84 o el por lo menos un modulador de EFNA de internamiento para uso de acuerdo con la reivindicación 85, en donde dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo.
87.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 86 o el por lo menos un modulador de EFNA de internamiento para uso dé acuerdo con la reivindicación 86, en donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
88.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 87 o el por lo menos un modulador de EFNA de internamiento para uso de acuerdo con la reivindicación 87, en donde el anticuerpo monoclonal comprende adicionalmente un agente citotóxico.
89.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 87 o el por lo menos un modulador de EFNA de internamiento para uso de acuerdo con la reivindicación 87, en donde el anticuerpo monoclonal se asocia con EFNA4.
90. - El uso de por lo menos un modulador de EFNA de neutralización en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto que sufre de un trastorno neoplásico.
91. - Por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para usarse en el tratamiento de un sujeto que sufre de un trastorno neoplásico.
92. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 90 o el por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para uso de acuerdo con la reivindicación 91, en donde dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo.
93. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 92 o el por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para uso de acuerdo con la reivindicación 92, en donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
94. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 93 o el por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para uso de acuerdo con la reivindicación 93, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo anti-EFNA4.
95. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 94 o el por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para uso de acuerdo con la reivindicación 94, en donde dicho anticuerpo de EFNA4 comprende un pan-anticuerpo de EFNA.
96. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 90 o el por lo menos un modulador de EFNA de neutralización para uso de acuerdo con la reivindicación 91 , en donde el trastorno neoplásico se selecciona del grupo que consiste en cáncer adrenal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama.
97. - Un método in vitro para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células que inician tumores, que comprende el paso de poner en contacto dichas células que inician tumores con un modulador de EFNA.
98. - El método in vitro de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado además porque dicho modulador de EFNA comprende un anticuerpo.
99- Una composición que comprende una región variable de anticuerpo humanizado sustancialmente similar a una región variable humanizada encontrada en un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en hSC4.5, hSC4.15, hSC4.22 y hSC4.47 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
100. - Un anticuerpo anti-EFNA4 que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que se exponen en SEQ ID NO: 151 , SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 y SEQ ID NO: 163, y en donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que se exponen en SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 161.
101. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para inhibir o prevenir la metástasis en un sujeto.
102. - Un modulador de EFNA para usarse en la inhibición o prevención de metástasis en un sujeto.
103. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 101 , en donde el sujeto es sometido a un procedimiento de extirpación antes o después de la administración del medicamento.
104. - El modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 102, caracterizado además porque el sujeto es sometido a un procedimiento de extirpación antes o después de la administración del modulador de EFNA.
105. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 103 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 104, en donde dicho procedimiento de extirpación comprende la administración de por lo menos un agente anticanceroso.
106. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para llevar a cabo terapia de mantenimiento en un sujeto.
107. - Un modulador de EFNA para usarse en llevar a cabo terapia de mantenimiento en un sujeto.
108.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 106, en donde dicho sujeto fue tratado por un trastorno neoplásico antes de la administración del medicamento.
109. - El modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 107, caracterizado además porque dicho sujeto fue tratado por un trastorno neoplásico antes de la administración del modulador de EFNA.
110. - El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para agotar células tumorales en un sujeto que sufre de un trastorno hiperproliferativo.
111. - Un modulador de EFNA para usarse en el agotamiento de células tumorales en un sujeto que sufre de un trastorno hiperproliferativo.
112. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 110 o el modulador de EFNA para uso de acuerdo con la reivindicación 111 , en donde dichas células tumorales comprenden células que inician tumores.
113.- El uso de un modulador de EFNA en la elaboración de un medicamento para diagnosticar, detectar o monitorear un trastorno asociado con EFNA in vivo en un sujeto.
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