CN103347538B - 新型调节子及使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了新型调节子以及使用此类调节子来治疗过度增生性病症的方法，所述新型调节子包括抗体及其衍生物。

Description

新型调节子及使用方法
交叉引用的申请
本申请是2011年12月7日递交的PCT/US2011/063831的国家阶段申请，所述PCT/US2011/063831要求2010年12月8日递交的美国临时申请系列号61/421,157的优先权和2011年9月2日递交的专利合作条约(PCT)号PCT/US2011/050451的优先权，其中的每一个都在此以其全部通过引用而并入。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式通过EFS-Web递交并且在此以其全部通过引用而并入。2011年11月22日创建的所述ASCII拷贝被命名为11200PCT.txt并且大小为80102字节。
发明领域
本申请一般性地涉及新型组合物以及它们在预防、治疗或改善过度增生性病症及其任何扩张，复发，再发或转移中使用的方法。在广泛的方面，本发明涉及肝配蛋白-A配体(EFNA)调节子（包括抗-EFNA抗体及融合构建体）用于治疗或预防肿瘤性病症的用途。本发明的特别优选的实施方案提供此类EFNA调节子用于免疫治疗恶性肿瘤的用途，包括减少肿瘤引发细胞频率。
发明背景
干细胞和祖细胞分化和细胞增殖是正常进行中的过程，其协力作用以支持器官发生过程中的组织生长和所有活体生物生存期中多数组织的细胞置换和修复。分化和增殖决定通常是由被平衡以保持细胞命运决定和组织结构的众多因子和信号控制的。正常的组织结构主要是由响应于调节细胞分裂和组织成熟的微环境提示的细胞维持的。因此，细胞增殖和分化通常仅为了置换损伤的或死亡中的细胞或为了生长所需而发生。不幸地，对细胞增殖和/或分化的破坏可由许多因素引起，这包括例如各种信号传导化学物质的不足和过多，存在经改变的微环境，遗传突变或它们的一些组合。当正常的细胞增殖和/或分化被干扰或因某种原因被破坏时，其可导致各种疾病或病症，这包括过度增生性病症例如癌症。
常规的癌症治疗包括化学疗法，放射疗法，手术，免疫疗法(例如生物学应答调节子，疫苗或靶向治疗剂)或它们的组合。令人遗憾地，太多的癌症对此类常规治疗没有应答或有最小程度的应答，给患者留下了很少的选择。例如，在某些患者中，某些癌症显示出使得其无应答的基因突变，尽管所选疗法一般是有效的。此外，取决于癌症的类型，一些可用的治疗（例如手术）可能不是可行的替代选择。当试图护理经历了之前的治疗且随后复发的患者时，目前的护理标准治疗固有的限制特别明显。在这种情形中，失败的治疗方案及所引起的患者恶化可促成顽固性肿瘤，其通常自我表现为最终证明是不可治愈的更为侵袭性的疾病。虽然这些年来在癌症的诊断和治疗方面有了很大的提高，由于现存疗法不能防止再发、肿瘤复发和转移，许多实体肿瘤的总体存活率保持基本未变。因此，开发更为靶向和有效的疗法仍然是个挑战。
一个有前景的研究领域涉及使用靶向治疗剂来追击似乎是许多癌症的基础的肿瘤发生性“种”细胞。为此，许多实体组织现已知含有成人，组织-留置的干细胞群，其产生包括所述组织大部分的、经分化的细胞类型。在这些组织中产生的肿瘤类似地由异质细胞群组成，所述异质细胞群也产生自干细胞，但是在其总体增殖和结构方面差异显著。虽然日益认识到大多数肿瘤细胞具有有限的增殖能力，少数癌细胞群(通常已知为癌症干细胞或CSC)具有大量自我更新的独特能力，从而使其具有固有的肿瘤重新起始能力。更具体地，癌症干细胞假说提出每种肿瘤内有区别性细胞亚组(即CSC)(大约0.1-10%)，其能够无限地自我更新并产生由于分化为肿瘤祖细胞及随后分化为末端分化的肿瘤 细胞而复制能力逐渐受限的肿瘤细胞。
近年来，更加明显的是，这些CSC(也已知为肿瘤永存细胞或TPC)可能对传统的化学治疗剂或放射更有抗性并因此在护理标准临床治疗之后持续从而以后激起顽固性肿瘤、继发肿瘤的生长并促进转移。此外，增加的证据表明调节器官发生和/或正常组织-留置的干细胞自我更新的通路在CSC中失调或被改变，导致自我更新的癌细胞的连续扩张以及肿瘤形成。一般性地参见Al-Hajj等人，2004，PMID：15378087；和Dalerba等人，2007，PMID：17548814；其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。因此，传统的、以及最近的靶向治疗方法的有效性显然受到了能够使癌症即使面对这些多种治疗方法仍永存的抗性癌细胞的存在和/或出现的限制。Huff等人，European Journal of Cancer42：1293-1297(2006)和Zhou等人，Nature Reviews Drug Discovery8：806-823(2009)，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。这些观察通过下述得到了证实：患有实体肿瘤时传统的减瘤剂一贯地不能实质上增加患者存活，以及通过对肿瘤如何生长、复发和转移产生了越来越详细的理解。因此，对于治疗肿瘤病症的最近的策略认识到了消除、耗竭、沉默肿瘤永存细胞或促进其分化从而减少肿瘤复发、转移或患者再发的可能性的重要性。
开发这种策略的努力并入了最近涉及非传统异种移植物(NTX)模型的工作中，其中在免疫受损的小鼠中专门地植入和传代原发人类实体肿瘤样本。在众多癌症中这种技术证实了具有产生异质肿瘤和激起其无限生长的独特能力的细胞亚群的存在。如之前所假设的，NTX模型中的工作证实了所鉴别的肿瘤细胞CSC亚群似乎对减瘤方案（例如化学疗法和辐射）更有抗性，潜在地解释了临床应答率和总体存活之间的差异。此外，在CSC研究中采用NTX模型在药物发现和候选药物的临床前评价中引发了根本性改变，这可能产生对于肿瘤复发和转移具有主要影响的CSC-靶向疗法，从而增加患者存活率。虽然取得了进展，与处理原发和/或异种移植物肿瘤组织相关的固有技术困难，以及缺乏实验平台来表征CSC标识和分化潜能形成主要的挑战。由 此，仍有对于选择性地靶向癌症干细胞并开发可被用于治疗、预防和/或管理过度增生性病症的诊断性、预防性或治疗性化合物或方法的大量需求。
发明概述
本发明所提供的这些和其它目的在广义上涉及可用于治疗EFNA相关病症(例如过度增生性病症或肿瘤性病症)的方法、化合物、组合物和制品。为此，本发明提供了新型EFNA(或肝配蛋白-A配体)调节子，其有效靶向肿瘤细胞或癌症干细胞并且可被用于治疗患有各种恶性肿瘤的患者。如本文中将更加详细地讨论的，目前有六种已知的肝配蛋白-A配体(即EFNA1-6)并且所公开的调节子可包含任意一种、或多于一种肝配蛋白-A配体或与其结合。此外，在某些实施方案中，所公开的EFNA调节子可包含任何下述化合物：其识别、激动、拮抗EFNA多肽、其受体或其基因，或与EFNA多肽、其受体或其基因竞争、相互作用、结合或缔合；并且调节、调整、更改、改变或修饰EFNA蛋白对于一个或多个生理学通路的影响。因此，广义上本发明涉及分离的EFNA调节子。在优选的实施方案中，本发明更具体地涉及分离的EFNA1调节子或分离的EFNA4调节子(即包含至少EFNA1或EFNA4、或与其相结合的调节子)。此外，如下文中所详尽讨论的，此类调节子可被用于提供药物组合物。
在本发明的所选实施方案中，EFNA调节子可包含肝配蛋白-A配体本身或其片段，以分离的形式或者与其它部分相融合或结合(例如Fc-EFNA，PEG-EFNA或与靶向部分相结合的EFNA)。在其它所选实施方案中EFNA调节子可包含EFNA拮抗剂，为了本申请的目的，其应被认为指任何下列构建体或化合物：其识别EFNA或与之竞争、相互作用、结合或缔合并且中和、消除、减少、敏化、重编、抑制或控制肿瘤性细胞（包括肿瘤引发细胞）的生长。在优选的实施方案中，本发明的EFNA调节子包括抗-EFNA抗体或其片段或衍生物，其出人意料地被发现沉默、中和、降低、减少、耗竭、调节、减小、重编、 消除、或以其它方式抑制肿瘤引发细胞繁殖、维持、扩增、增殖或以其它方式促进肿瘤性细胞的存活、复发、再生和/或转移的能力。在特别优选的实施方案中，所述抗体或免疫反应性片段可与一种或多种抗癌试剂结合或缀合。
在一个实施方案中，所述EFNA调节子可包含人源化抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：161的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：163的轻链可变区氨基酸序列。在其它优选的实施方案中本发明将为组合物的形式，所述组合物包含选自hSC4.5、hSC4.15、hSC4.22和hSC4.47的人源化抗体和药学上可接受的载体。在另一个优选的实施方案中，所述EFNA调节子可包含抗体，所述抗体包含来自图7A(SEQ ID NO：8-59和70-95)的一个或多个CDR。优选地，包含至少一个来自图7A的CDR的抗体将包括人源化抗体。
在某些其它实施方案中，本发明将包括EFNA调节子，其施用于受试者之后减少肿瘤引发细胞的频率。优选地，所述频率的减少将利用体外或体内有限稀释分析来确定。在特别优选的实施方案中，此类分析可使用包括将活的人肿瘤细胞移植到免疫受损的小鼠中的体内有限稀释分析进行。备选地，所述有限稀释分析可使用体外有限稀释分析进行，其包括将活的人肿瘤细胞有限稀释沉积到体外集落支持条件中。在任一情形中，分析、计算或定量频率的减少将优选包括使用泊松分布统计来提供准确的计算。将理解的是，虽然优选此类定量方法，也可使用其它劳动密集性更低的方法（例如流式细胞术或免疫组织化学）来提供所需的值，并且因此明确预期这些方法在本发明的范围之内。在这些情形中，可利用对肿瘤引发细胞已知所富集的肿瘤细胞表面标记物进行流式细胞计数分析或免疫组织化学检测来确定频率的降低。
由此，本发明的另一个优选的实施方案包括治疗EFNA相关病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的EFNA调 节子从而减少肿瘤引发细胞的频率。再次地，肿瘤引发细胞频率的减少将优选使用体外或体内有限稀释分析来确定。
在这方面，将理解的是本发明是基于（至少部分地）下述发现：EFNA多肽(特别是EFNA4，如下文所讨论的)与各种肿瘤的病源中所涉及的肿瘤永存细胞(即癌症干细胞)相关。更具体地，本申请出人意料地显示出施用各种示例性EFNA调节子能够介导、减少、抑制或消除肿瘤引发细胞的肿瘤发生性信号传导(即减少肿瘤引发细胞的频率)。这种减少的信号传导，无论是通过减少、消除、重编或沉默肿瘤引发细胞还是通过修饰肿瘤细胞形态(例如诱导的分化，小生境破坏)，转而允许了通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持、扩张和/或转移以及复发而更有效地治疗EFNA相关病症。在其它实施方案中，所公开的调节子可促进、支持或以其它方式提高可限制或抑制肿瘤生长的EFNA介导的信号传导。在其它实施方案中，所公开的调节子可干扰、抑制或以其它方式减缓可激起肿瘤生长的EFNA介导的信号传导。此外，如下文中将更详细讨论的，EFNA多肽通过整联蛋白和细胞骨架重排而参与产生细胞之间的粘附和排斥力。使用本文中所描述的新型EFNA调节子干预此类细胞间相互作用可从而通过超过一种机制(即肿瘤引发细胞减少和破坏细胞粘附)来改善病症，以提供加成或协同效果。其它优选的实施方案可利用肝配蛋白-A配体的细胞内吞来递送调节子介导的抗癌试剂。在这方面将理解的是，本发明不受任何特定作用机制所限而是涵盖所公开的调节子治疗EFNA相关病症(包括各种肿瘤)的广泛用途。
因此，本发明的另一个优选实施方案包括治疗有需要的受试者中的EFNA相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用EFNA调节子的步骤。在特别优选的实施方案中，所述EFNA调节子将与抗癌试剂相结合(例如缀合)。此外，本发明的有益方面包括任何细胞粘附破坏及相关益处，无论与正常的相邻组织相比受试肿瘤组织显示升高的EFNA水平还是减少或降低的EFNA水平，这都可实现。
如上文所述以及下文中将更详细地讨论的，目前有六种已知的肝 配蛋白-A配体(即EFNA1-6)。根据本发明将理解的是，可产生、制造和/或选择所公开的调节子以与单一肝配蛋白-A配体(例如EFNA4)、肝配蛋白-A配体亚组(例如EFNA4和EFNA1)或所有六个肝配蛋白-A配体反应。更特别地，如本文中所描述的和下文的实施例中所示，可产生和选择优选的调节子（例如抗体），从而它们与在单一肝配蛋白-A配体上表达的结构域或表位、或者与在多个或所有EFNA多肽(例如EFNA1和4或EFNA3和4)中保守（至少某种程度上）和呈递的结构域或表位反应或结合。这在下述方面关于本发明是显著的：如下文的实施例18中所示，发现了某些肝配蛋白-A配体优选在TIC上表达，并且组合时它们可作为特别有效的治疗靶标，其提供选择性减少肿瘤发生性细胞频率和/或耗尽癌症干细胞群。
因此，在所选的实施方案中，本发明包括免疫特异性地与两种或更多种肝配蛋白-A配体结合的泛-EFNA调节子。在此类实施方案中，所选的调节子可通过用特定配体(例如EFNA4)进行免疫接种而产生并且其或多或少地与各种受试配体结合或交叉反应。因此，在其它实施方案中，本发明包括治疗有需要的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的泛-EFNA调节子。其它的实施方案包括治疗有需要的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的、与一种或多种肝配蛋白-A配体免疫特异性结合的EFNA调节子。
因此，在其它实施方案中，本发明将包括泛-EFNA调节子。在其它实施方案中，本发明将包括治疗有需要的受试者中的EFNA相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用泛-EFNA调节子的步骤。
当然，将理解的是，可产生、制造和/或选择所公开的EFNA调节子以优先与单一肝配蛋白-A配体(例如EFNA4)反应或结合而显示与任何其它肝配蛋白-A配体的最少程度的结合或不结合。因此，本发明的其它实施方案涉及下述EFNA调节子：其与所选的肝配蛋白-A配体免疫特异性地结合而显示与任何其它肝配蛋白-A配体很少结合或不结合。在这方面，本文中所公开的优选实施方案将包括治疗有需要的受试者中的EFNA相关病症的方法，所述方法包括施用EFNA调节子 的步骤，其中所述EFNA调节子与所选的肝配蛋白-A配体免疫特异性地结合并且与任何其它肝配蛋白-A配体基本上不反应。此外，产生、制造和选择此类调节子的方法在本发明的范围内。
本发明的其它方面利用所公开的调节子潜在地破坏细胞粘附相互作用而同时沉默肿瘤引发细胞的能力。当与护理标准抗癌试剂或减瘤试剂组合使用时，这种多活性EFNA调节子(例如EFNA拮抗剂)可证明是特别有效的。此外，根据当前的教导，可组合使用两种或更多种EFNA拮抗剂(例如，特异性结合肝配蛋白-A配体上的两种分立的表位或与分立的配体结合的抗体)。此外，如下文详细讨论的，可在缀合或非缀合的状态下使用本发明的EFNA调节子并且任选地，其作为敏化剂与各种化学或生物学抗癌试剂相组合。
因此，本发明的另一个优选的实施方案包括敏化受试者中的肿瘤而用于用抗癌试剂治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用EFNA调节子的步骤。在本发明的特别优选的方面，所述EFNA调节子将特异性地引起肿瘤引发细胞频率的减少（如利用体外或体内有限稀释分析所确定的）从而敏化肿瘤用于相伴或随后的体积减小。
类似地，由于本发明的化合物可通过各种生理学机制发挥治疗益处，本发明也涉及被特别制造以利用某些细胞过程的经选择的效应子或调节子。例如，在某些实施方案中，可工程化优选的调节子以在肿瘤引发细胞表面上或附近与EFNA相结合并刺激受试者的免疫应答。在其它实施方案中，所述调节子可包含针对表位的抗体，其中和肝配蛋白-A配体活性以及与肝配蛋白受体的相互作用，所述活性和相互作用可通过整联蛋白和细胞骨架的重排影响细胞之间的附着和排斥力。在其它实施方案中，所公开的调节子可通过耗竭或消除EFNA结合细胞而起作用。由此，重要的是要理解本发明不限于任何特定的作用模式而是涵盖实现所需结果的任何方法或EFNA调节子。
在这样的框架内，所公开的实施方案的优选实施方案涉及治疗患有肿瘤性病症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种中和性EFNA调节子的步骤。
其它的实施方案涉及治疗患有EFNA相关病症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种耗竭性EFNA调节子的步骤。相关的方法涉及耗竭有需要的受试者中的EFNA结合细胞，所述方法包括施用EFNA调节子的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供维持疗法的方法，其中在设计用于去除至少一部分肿瘤块的初始程序(例如化学疗法、辐射或手术)之后的一段时间中施用所公开的效应子或调节子。可在数周、数月或甚至数年的时期中施用此治疗方案，其中所述EFNA调节子可预防性地起作用以抑制转移和/或肿瘤复发。在其它实施方案中，可与已知的减瘤方案配合施用所公开的调节子以预防或减缓转移。
除了上文所讨论的治疗性用途之外，还将理解本发明的调节子可被用于诊断EFNA相关的病症并且，特别是过度增生性病症。在某些实施方案中，可将所述调节子施用至受试者并在体内检测或监控。本领域技术人员将理解，如下文所公开的可用标记物或报告子标记或结合所述调节子并使用若干标准技术(例如MRI或CAT扫描)中的任一种来进行检测。在其它情形中，所述调节子可被用于使用本领域认可的程序的体外诊断设置。由此，优选的实施方案包括诊断有需要的受试者中的过度增生病症的方法，所述方法包括下列步骤:
a.从所述受试者获得组织样品；
b.使所述组织样品与至少一种EFNA调节子相接触；和
c.检测或定量与所述样品相结合的EFNA调节子。
与本申请相结合可容易地辨别所述方法，并且使用一般商业上可得的技术（自动化平板读取器，专用报告子系统等）可容易地实施所述方法。在所选的实施方案中，所述EFNA调节子将与样品中存在的肿瘤永存细胞相结合。在其它优选的实施方案中，所述检测或定量步骤将包括减少肿瘤引发细胞的频率及其检测。此外，有限稀释分析可如之前上文所述地进行并将优选地采用使用泊松分布统计来提供关于频率减少的准确计算。
类似地，本发明还提供可用于诊断和监控EFNA相关病症（例如 癌症）的试剂盒。为此，本发明优选提供可用于诊断或治疗EFNA相关病症的制品，其包含含有EFNA调节子和用于使用所述EFNA调节子来治疗或诊断EFNA相关病症的指导材料的容器。
本发明的其它优选实施方案也利用所公开的调节子的特性作为可用于通过例如荧光激活的细胞分选(FACS)或激光介导的分级的方法来鉴别、分离、分级或富集肿瘤引发细胞的群体或亚群体的手段。
由此，本发明的另一个优选实施方案涉及鉴别、分离、分级或富集肿瘤引发细胞群的方法，所述方法包括使所述肿瘤引发细胞与EFNA调节子相接触的步骤。
前述是总结，因此必要地含有对细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将理解所述总结仅仅是阐释性的而不意在以任何方式为限制性的。本文所描述的方法、组合物和/或设备和/或其它主题的其它方面、特征和优势在本文中所示的教导中将变得显然。提供了总结来以简化的形式提供对选择的概念的介绍，其在下文的详述中将被进一步描述。此总结不意在鉴别要求保护的主题的主要特征或关键特征，也不意在被用于帮助确定要求保护的主题的范围。
附图说明
图1A-C分别描绘了编码人EFNA4的核酸序列(SEQ ID NO：1)，人EFNA4同种型a的相应氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和显示氨基酸差异的人EFNA4a、b和c同种型序列(SEQ ID NO：2-4)的比对，而图1D-F分别描绘了编码人EFNA1的核酸序列(SEQ ID NO：5)，人EFNA1同种型a的相应氨基酸序列(SEQ ID NO：6)以及显示氨基酸差异的人EFNA1a和b同种型序列(SEQID NO：6和7)的比对；
图2A和2B是描绘下列的图示：所选的人肝配蛋白-A配体和肝配蛋白-A受体在未经治疗(图2A)和经伊立替康治疗(图2B)的小鼠中的基因表达水平，如使用从全结肠直肠肿瘤样本的亚组获得的高度富集的肿瘤祖细胞(TProg)和肿瘤永存细胞(TPC)以及非-肿瘤发生性细胞(NTG)群体的全转录组测序所测量的；
图3A和3B是描绘结肠直肠肿瘤样品(图3A)和胰腺肿瘤样品(图3B)中人肝配蛋白-A4配体的基因表达水平的图示，如使用高度富集的肿瘤祖细胞(TProg)和肿瘤永存细胞(TPC)以及非肿瘤发生性细胞(NTG)群体或肿瘤发生性(TG)和非肿瘤发生性细胞(NTG)群体的全转录组测序所测量的；
图4是显示下列的图示：如使用定量RT-PCR所测量的、相对于非肿瘤发生性(NTG)富集的细胞群归一化的、从携带四种不同的非传统异种移植物(NTX)结肠直肠或胰腺肿瘤细胞系之一的小鼠中获得的高度富集的肿瘤祖细胞(TProg)和肿瘤永存细胞(TPC)群中人EFNA4的相对基因表达水平；
图5A和5B是显示下列的图示：如使用RT-PCR所测量的、相对于正常结肠和直肠组织中的表达平均值归一化的、来自患有I-IV期疾病的患者的全结肠直肠肿瘤样本(图5A)或匹配的正常相邻组织(图5B)中人EFNA4的相对基因表达水平；
图6A–6E代表人EFNA基因的基因表达水平，图6A和6B中是在来自患有十八种不同实体肿瘤类型之一的患者的全肿瘤样本(灰点)或匹配的NAT(白点)中通过RT-PCR对于EFNA4所测量的，图6C和6D中是在所选的NTX肿瘤细胞系中通过RT-PCR对于EFNA4和EFNA1测量的，以及图6E中是在正常的组织和所选的NTX肿瘤细胞系中通过蛋白质印迹分析对于EFNA4测量的；
图7A-7R描绘了数个EFNA调节子的序列，其中图7A是表格显示，其显示了如本文所述分离和克隆的分立的EFNA调节子的遗传排布以及重链和轻链CDR序列(源自VBASE2分析)，图7B-7N提供了对于图7A中所示的相同调节子的鼠的重链和轻链可变区核酸及氨基酸序列，图7O–7R提供了所公开的EFNA调节子的示例性人源化版本的重链和轻链可变区核酸和氨基酸序列；
图8A–8D显示示例性调节子的生物化学和免疫学特性，如图8A中的表格形式所表示的；图8B和8C中是鼠SC4.47和人源化SC4.47各自亲和性的比较，如通过使用以固定量的抗体和抗原的系列稀释物 酸残基被显示用于比较。
图9显示了五十种示例性本发明的肝配蛋白-A配体调节子分别关于Jurkat E6细胞和Z138细胞的细胞表面结合特性；
图10A和10B描绘了肝配蛋白-A配体以剂量依赖性方式与表达肝配蛋白-A受体的细胞的结合(图10A)和通过暴露于示例性的所公开的调节子对肝配蛋白-A配体细胞表面结合的抑制(图10B)；
图11A–11D为显示了下列的图示：所公开的调节子抑制人和鼠肝配蛋白-A配体的细胞表面结合的能力，其中图11A显示阳性对照曲线，图11B-11D显示三种示例性EFNA调节子减少配体结合的能力；
图12A–12E是显示下列的图示：本发明的调节子抑制可溶性肝配蛋白-A受体的细胞表面结合的能力，其中图12A提供受体结合的标准曲线，图12B显示了作为可溶性受体浓度的示例性调节子的特性是变化的，图12C显示改变调节子浓度而保持受体量稳定的结果，图12D和12E分别显示所述调节子抑制肝配蛋白-A受体分别结合肝配蛋白-A4和肝配蛋白-A1配体的能力；
图13A-13C显示了本发明的所选的调节子与肝配蛋白-A4配体的小鼠直系同源物交叉反应的能力，其中图13A显示了非反应性调节子，而图13B和图13C分别显示了交叉反应的鼠和人源化调节子；
图14A–14D显示了肝配蛋白-A配体的表达在全结肠直肠肿瘤样品(图14A)和结肠直肠NTX肿瘤细胞的肿瘤发生性亚群(图14B)和肺NTX细胞系的肿瘤发生性亚群(图14D)中被上调，但是在正常的外周血单核细胞上不被上调(图14C)；
图15A–15D显示了本发明的所选的调节子在与肝配蛋白-A配体结合后内化的能力，其中图15A显示了与三个示例性调节子相关的荧光迁移，图15B显示了十九个所公开的调节子显示出指示内化的δ平均荧光强度，图15C显示在低EFNA表达细胞中相对小的内化，图15D显示表达高水平EFNA的细胞的大量内化；
图16A–16F提供了下列证据：所公开的调节子可有效地被用作 靶向部分以将细胞毒性有效负荷引向表达肝配蛋白-A配体的细胞，其中下行坡度曲线指示通过内化的细胞杀伤，其中图16A显示了调节子SC4.5的杀伤效应，图16B显示了所选的调节子内化和杀死肺及皮肤NTX肿瘤细胞系的能力，图16C和16D显示了调节子将相结合的细胞毒素携带进入HEK293T细胞(图16C)和HEK-.hEFNA4细胞(图16D)中，图16E显示了人源化调节子类似地反应，而图16F显示了杀死表达小鼠或人肝配蛋白-A配体的靶细胞(注意，在整个图16中所述调节子可被称为E而非SC4)；
图17A–17E是生物化学测定的各个方面的图示，其显示出所公开的调节子检测经分泌的肝配蛋白-A配体的能力，其中图17A提供了标准曲线，图17B定量了来自所选择的血液学肿瘤的经分泌的EFNA的水平，图17C呈现了肿瘤体积与分泌的EFNA之间的关联，图17D建立了健康成年人中循环肝配蛋白-A配体的范围，图17E显示了患有所选的实体肿瘤的患者具有显著更高水平的循环肝配蛋白-A配体；
图18A–18C的图示显示了各种肝配蛋白-A配体调节子可被用作靶向部分以将细胞毒性有效负荷与所选的细胞相结合，其中向下的坡度曲线指示通过内化的毒素的细胞杀伤，且其中图18A-18C具体显示了在结合的皂素的存在下，调节子SC4.2.1(或E2.1)和SC9.65(或9M065)介导过表达肝配蛋白-A4配体(图18A)、肝配蛋白-A3配体(图18B)和肝配蛋白-A1配体(图18C)的HEK293T细胞的杀伤的能力；
图19A和19B显示了肝配蛋白-A配体选择性地与众多EPHA受体相互作用的能力，其中HEK293T细胞仅通过内源性表达的肝配蛋白-A配体以有限的程度结合EPHA-ECD-Fc受体构建体(图19A)，而HEK293T.hEFNA4细胞以各种程度结合所有所测试的EPHA受体构建体，除了不结合的EPHA1(图19B)之外；和
图20A和20B显示了肝配蛋白-A配体与EPHB受体选择性相互作用的能力，其中HEK293T细胞仅通过内源表达的肝配蛋白-A配体以有限的程度上与EPHB-ECD-Fc受体构建体相互作用(图20A)，而HEK293T.hEFNA4细胞结合EphB2受体但不结合EphB3和EphB4 受体(图20B)。
发明详述
I.引言
虽然本发明可以许多不同的形式实施，本文中公开的是示例本发明的原理的本发明的特定阐释性实施方案。应当强调的是本发明不限于所阐释的特定实施方案。此外，本文中所使用的任何部分标题仅是为了组织的目的而不应被解释为限制所描述的主题。
如之前所述，令人惊讶地发现了肝配蛋白-A配体(或EFNA)的表达与肿瘤性生长和过度增生性病症相关，并且所述配体提供可在相关疾病的治疗中采用的有用的肿瘤标记物。更具体地，发现了所述EFNA调节子（例如本文中所描述的那些）可有利地被用于诊断、治疗诊断、治疗或预防有需要的受试者中的肿瘤性病症。因此，虽然下文中将详尽讨论本发明的优选实施方案，特别是在癌症干细胞及它们与所公开的调节子相互作用的情境中，本领域技术人员将理解本发明的范围不受所述示例性实施方案所限。相反，本发明及所附的权利要求广泛且明确地涉及EFNA调节子及它们在各种EFNA相关或介导的病症（包括肿瘤性或过度增生性病症）的诊断、治疗诊断、治疗或预防中的用途，这与任何特定的作用机制或特异性靶向的肿瘤组分无关。
还将理解，与许多现有技术的公开相反，本发明主要涉及肝配蛋白配体调节子(即EFN)而非肝配蛋白受体(即EPH)调节子。也即，虽然肝配蛋白受体在数种病症中被广泛地牵涉并且被一般性地被靶向用于治疗性干预，迄今为止肝配蛋白配体吸引了少得多的关注。这一部分可能是由于被归于所述配体的杂乱行为以及错误地相信这些各种各样的相互作用使得它们为不可靠的治疗靶标，因为通路冗余性将可能补偿任何配体拮抗作用。然而，如本文中所显示的，所公开的肝配蛋白-A配体调节子能够有效地被用于靶向和消除肿瘤发生性细胞、或以其它方式使肿瘤发生性细胞失去能力。此外，在所选的实施方案中，本发明包括泛-EFNA调节子，其与多于一种肝配蛋白-A配体相结合 或反应从而提供可允许沉默多于一个肝配蛋白配体介导的通路的出人意料的加成或协同效果。
除了上面所讨论的一般性关联之外，发明人还发现了迄今为止未知的、所选的“肿瘤引发细胞”(TIC)与肝配蛋白-A配体之间的表型关联。在这方面，发现了当与正常的组织和非肿瘤发生性细胞(NTG)（其一起构成了实体肿瘤的大部分）相比较时，所选的TIC表达升高水平的肝配蛋白-A配体。因此，所述肝配蛋白-A配体包括肿瘤结合标记物(或抗原)并被发现由于细胞表面上或肿瘤微环境中升高的蛋白水平而为检测和抑制TIC及相关的瘤形成提供有效的试剂。更具体地，发现了EFNA调节子（包括与所述蛋白相结合或反应的免疫反应性拮抗剂和抗体）有效地减少肿瘤引发细胞的频率并因此可用于消除、失能、减少这些肿瘤引发细胞、促进它们的分化，或以其它方式排除或限制这些肿瘤引发细胞在患者中潜伏和/或继续激起肿瘤生长、转移或复发的能力。如下文中更详细讨论的，TIC肿瘤细胞亚群是由肿瘤永存细胞(TPC)和高度增生性的肿瘤祖细胞(TProg)构成的。
鉴于这些发现，本领域技术人员将理解，本发明还提供EFNA调节子及其在减少肿瘤引发细胞的频率中的用途。如下文中将详尽讨论的，本发明的EFNA调节子广泛地包含任何识别，反应，竞争，拮抗，相互作用，结合，激动或缔合肝配蛋白-A配体或其基因的化合物。通过这些相互作用，EFNA调节子从而减少或减轻肿瘤引发细胞的频率。本文中公开的示例性调节子包括核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。在某些优选的实施方案中，所选的调节子将包括EFNA的抗体或其免疫反应性片段或衍生物。所述抗体的性质可以是拮抗性或激动性的并且可任选地缀合或结合细胞毒性试剂。在其它实施方案中，本发明中的调节子将包括EFNA构建体，其包含肝配蛋白-A配体或其反应活性片段。将理解的是，此类构建体可包括融合蛋白并且可包括来自其它多肽（例如免疫球蛋白或生物应答修饰剂）的反应活性结构域。在其它方面，EFNA调节子将包括在基因组水平上发挥所需效果的核酸装配体。与当前的教导相容的其它调节子将在下文中详细讨论。
无论最终选择何种形式的调节子，在引入受试者中之前其将优选是分离的和纯化的状态。在这方面，术语“分离的EFNA调节子”应在广义上解释并且根据标准制药实践应指任何制备物或组合物，其包含处于基本上不含不希望的污染物(生物的或以其它方式)的状态的所述调节子。如下文中将详细讨论的，可使用各种本领域认可的技术按需要纯化和配制这些制备物。当然，将理解的是可按需有意地将所述“分离的”制备物与惰性或活性成分一起配制或组合以改进成品的商业、制造或治疗方面并提供药物组合物。
II.EFNA生理学
肝配蛋白受体酪氨酸激酶(EPH)（I型跨膜蛋白）包含动物基因组中最大的受体酪氨酸激酶家族并且与肝配蛋白配体(EFN)相互作用，所述肝配蛋白配体也是细胞表面结合的。EPH亚家族中的受体通常具有单一激酶结构域和含有富含Cys的结构域及2个纤连蛋白III型重复的细胞外区域。常规认为基于其细胞外结构域序列的相似性和它们结合肝配蛋白-A和肝配蛋白-B配体的亲和性而将肝配蛋白受体分为两组。之前的研究显示了EPH介导的信号传导事件控制胚胎发育的多个方面（特别是在神经系统中）并且是调控细胞附着、形状和移动性的细胞-细胞交流的重要介导子。此外，相对于肝配蛋白配体，肝配蛋白受体家族的许多成员被鉴别为癌症发展和进展的重要标记物和/或调节子。迄今，有九种肝配蛋白-A受体和六种肝配蛋白-B受体是已知的。
为了本申请的目的，术语“肝配蛋白受体”、“肝配蛋白-A受体”、“肝配蛋白-B受体”、“EPHA”或“EPHB”(或EphA或EphB)可被互换地使用并且被认为指所指明的受体家族、受体亚家族或单个受体（即，EPHA1，EPHA2，EPHA3，EPHA4，EPHA5，EPHA6，EPHA7，EPHA8，EPHA9，EPHB1，EPHB2，EPHB3，EPHB4，EPHB5，EPHB6)，如上下文所示。
基于序列分析，肝配蛋白配体可被分为两组：六个肝配蛋白-A配 体(或EFNA)，通常通过糖基磷脂酰肌醇连接被锚定至细胞表面(虽然有些非-GPI锚定的蛋白通过肝配蛋白mRNA的可变剪接产生，例如EFNA4)；和三个肝配蛋白-B配体(或EFNB)，其含有跨膜结构域和短的胞质区，具有保守的酪氨酸残基和PDZ-结合基序。EFNA配体优先与九个不同EPHA受体中的任何一个相互作用，而EFNB配体优先与六个不同EPHB受体中的任何一个相互作用，虽然报道了某些特定的EFNA-EPHB和EFNB-EPHA交叉相互作用。
为了本申请的目的，术语“肝配蛋白配体”，“肝配蛋白-A配体”，“肝配蛋白-B配体”，“EFNA”或“EFNB”可互换地使用并且是指受体家族、受体亚家族或单个受体(即EFNA1，EFNA2，EFNA3，EFNA4，EFNA5，EFNA6，EFNB1，EFNB2，EFNB3)，如上下文所示。例如，术语“肝配蛋白-A4”，“肝配蛋白-A4配体”或“EFNA4”应被认为标示相同的蛋白同种型家族(例如如图1C中所示)，而术语“肝配蛋白-A配体”和“ENFA”将被认为指包含所有六个A型配体及其任何同种型的肝配蛋白亚家族(即A而不是B)。在这方面，“肝配蛋白-A调节子”，“肝配蛋白-A配体调节子”或“EFNA调节子”是指与一种或多种A型配体或其同种型、或片段或衍生物缔合、结合或反应的任何调节子（如本文中所定义的）。
肝配蛋白受体及配体命名的更详细的总结可见于下面的表1中。
表1
Eph命名委员会，Cell.1997；90(3):403-4，其在此以其全部通过引用而并入。
与所有的细胞表面受体-配体相互作用一样，通过肝配蛋白配体接合肝配蛋白受体最终引起激活细胞内信号传导级联。虽然受体-配体相互作用可在同一细胞表面上的分子间进行(顺式相互作用)，一般认为顺式相互作用不引起触发信号传导级联，或者顺式相互作用可实际上 拮抗由反式相互作用(例如在分开的细胞上的受体和配体之间)起始的信号传导级联。EPH-EFN反式相互作用的一个独特方面是在受体-配体接合之后触发两个信号传导级联的能力--在表达肝配蛋白受体的细胞中的正向信号传导级联，和在表达肝配蛋白配体的细胞中的反向信号传导级联。对两个分开的信号传导级联的活化可反应EPH和EFN所演化以在动物胚胎发育中协调的细胞分选和细胞定位过程。
EPH-EFN信号传导常常激活调节细胞骨架动态的细胞信号传导通路并引起对不同细胞类型之间的附着和排斥相互作用的调节。一般地，与在成人组织中所观察到的相比，发现EPH和EFN蛋白在胚胎形成过程中的水平高得多，虽然在成人中持续的低水平表达可反映出这些分子在组织（例如成人的肠）的正常功能中的作用，所述成人的肠具有明确界定的结构，这是由分化中的细胞从隐窝中组织干细胞处的其来源至朝向肠腔的绒毛表面处的其最终位置的迁移产生的。因为肝配蛋白受体首先是在肝细胞癌中被鉴别的，且EPH和EFN表达通常局限于成人中，在人癌症中重新激活肝配蛋白配体和/或肝配蛋白受体的表达可与下列相联系：癌细胞的去分化和/或这些癌细胞侵入周围的正常组织以及从原发肿瘤位点向远端位置迁移的能力。其它的研究显示了EPH-EFN相互作用也在血管生成中起作用。
与EPH-EFN在非淋巴组织中的相互作用由通过整联蛋白和细胞骨架重排产生细胞间的附着或排斥力而调控细胞相互作用这一发现一致，显示了在淋巴细胞上发现的EPH和EFN分子介导细胞与细胞外基质组分的粘附，趋化性和细胞迁移。例如，发现了EFNA1(其结合EphA2受体并包含例如Genbank登陆NM_004428中的氨基酸序列)接合初级CD4和CD8T细胞刺激细胞迁移并增强趋化性。与EFNA1相似，EFNA4在初级CD4T细胞上表达，由于EPH-EFN相互作用的杂乱性，不清楚EFNA4接合在这些细胞上是否具有相似的效果。然而，显示了成熟的人B-淋巴细胞表达EFNA4并在活化后分泌它。此外，不像任何其它的EFN或EPH分子，EFNA4也在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的B细胞上或由所述B细胞一贯性地表达。有趣 地，如由Q-PCR所测量的EFNA4同种型的表达可与疾病的临床表现相关联。此外，与来自健康个体的B细胞相比，来自已知具有增加的EFNA4表达的CLL患者的B细胞显示出跨内皮迁移潜能的损伤。显然，EFNA4的接合降低CLL细胞附着细胞外基质分子的能力并且减少了它们对于CCL1的趋化性应答。总之，这些报道暗示EFNA4在B和T细胞运输中的作用，当与上文所讨论的细胞内信号传导数据结合起来看时，使得肝配蛋白-A配体（特别是EFNA4）成为用于开发抗癌治疗剂的非常有吸引人的靶标。
除了前述特征外，本公开显示了EFNA4的表达在各种癌症干细胞群中升高。与数种EPHA受体在大块肿瘤中的相伴上调一起，这提出了下述可能性：EFNA4介导的配体受体相互作用可触发与肿瘤增殖、血管生成和/或肿瘤转移相联系的细胞信号传导级联。虽然不愿被任何特定理论所束缚，相信本发明的EFNA4调节子(特别是拮抗性或中和性的实施方案)（至少部分地）通过下述起作用：减少或消除肿瘤引发细胞频率从而以不同于传统护理标准治疗方案(例如伊立替康)的方式干扰肿瘤增殖或存活，或通过免疫治疗性信号传导或递送能够杀死表达EFNA4的细胞的有效负荷。例如，通过拮抗EFNA4而清除TPC可包括面对消除繁殖性细胞的化学治疗方案简单地促进细胞增殖，或促进TPC的分化从而它们的自我更新(即无限的增殖和维持多潜能性)能力丧失。备选地，在优选的实施方案中，征募细胞毒性T细胞以攻击表达EFNA4的细胞，或递送与能够内化的抗EFNA4抗体相缀合的强效毒素，可选择性地杀伤TPC或以其它方式使TPC失去功能。
如本文中所使用的，术语EFNA4(也已知为eph-相关激酶4的配体，LERK4；或eph-相关受体酪氨酸激酶配体4，EFL-4)是指天然存在的人EFNA4，除非上下文另有所指。代表性的EFNA4蛋白直系同源物包括但不限于人(即hEFNA4，NP_005218，NP_872631或NP_872632)，小鼠(NP_031936)，黑猩猩(XP_001153095，XP_001152971，XP_524893和XP_001152916)和大鼠(NP_001101162)。 经转录的人EFNA4基因包含来自染色体1的至少5817bp。描述了三个mRNA转录物变体，其中的每一个都是由经转录的RNA的可变剪接产生的：(1)1276bp的变体(NM_005227；EFNA4转录物变体1；SEQ ID NO：1)其编码201个氨基酸的原蛋白(NP_005218；EFNA4变体a；SEQ ID NO：2)；(2)1110bp的变体(NM_182689；EFNA4转录物变体2)其编码207个氨基酸的原蛋白(NM_872631；EFNA4变体b；SEQ ID NO：3)；和(3)1111bp的变体(NM_182690；EFNA4转录物变体3)其编码193个氨基酸的原蛋白(NP_872632；EFNA4变体c；SEQ ID NO：4)。将理解的是每个人EFNA4蛋白包括包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-25的经预测的信号或前导序列(即168-182aa)，将其剪掉以提供蛋白的成熟形式。此信号肽将多肽靶向细胞表面/分泌通路。由于mRNA的可变剪接（以及对于蛋白质编码序列带来的后果），细胞对蛋白质同种型进行不同的加工-同种型a是位于膜上的并且通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接被锚定至细胞表面，而同种型b和c缺少GPI锚定信号序列并因此期待其被细胞分泌。将人EFNA4的三个蛋白质同种型进行的比对显示在图1C中。如之前所示，除非直接的指代或者上下文的必要性另有所指，术语EFNA4应当涉及人EFNA4的同种型及免疫反应性等同物。还将理解，此术语也可指EFNA4的天然或变体形式的衍生物或片段（其含有抗体或免疫反应性片段可特异性结合的表位）。
III.肿瘤永存细胞
与现有技术的教导相反，本发明提供对于靶向肿瘤引发细胞（特别是肿瘤永存细胞）特别有用的EFNA调节子，从而促进肿瘤性病症的治疗、处理或预防。更具体地，如之前所示，令人惊讶地发现了特定的肿瘤细胞亚群表达EFNA并很可能修饰对于癌症干细胞自我更新和细胞存活重要的成形素信号传导的局部协调。因此，在优选的实施方案中，根据当前的教导EFNA的调节子可被用于减少肿瘤引发细胞频率并从而促进对于过度增生疾病的治疗或处理。
如本文中所使用的，术语肿瘤引发细胞(TIC)涵盖肿瘤永存细胞(TPC；即癌症干细胞或CSC)和高度增生性的肿瘤祖细胞(称作TProg)，它们一般一起构成大块肿瘤或团块的独特亚群(即0.1-40%)。为了本公开的目的，术语肿瘤永存细胞和癌症干细胞是等同的并且在本文中可互换地使用。相反地，TPC与TProg的区别在于TPC可完全重现肿瘤内存在的肿瘤细胞的组成并且具有无限的自我更新能力，如通过低数目的分离的细胞的系列移植(通过小鼠的两次或更多次传代)所显示的。如在下文中将更详细地讨论的，使用合适的细胞表面标记物的荧光激活的细胞分选(FACS)是可靠的用于分离高度富集的细胞亚群(>99.5%纯度)的方法，这至少部分是因为其区分单细胞与细胞团(即成对物等)的能力。使用此类技术，已显示当将低细胞数量的高度纯化的TProg细胞移植到免疫受损的小鼠中时，它们可在原代移植物中激起肿瘤生长。然而，不像纯化的TPC亚群，TProg产生的肿瘤在表型细胞异质性方面不完全反映亲本肿瘤并且在随后的移植物中再起始系列肿瘤生成方面明显低效。相反，TPC亚群完全重构亲本肿瘤的细胞异质性并且当被系列分离和移植时可有效地起始肿瘤。因此，本领域技术人员将认可，虽然二者在原代移植物中都可以是肿瘤发生性的，TPC与TProg的决定性差别是在以低细胞数目进行系列移植后TPC永久地激起异质肿瘤生长的能力。表征TPC的其它常用手段涉及形态以及检测细胞表面标记物，转录特征谱，和药物应答（虽然标记物表达在体外可随着培养条件以及随着细胞系传代而改变）。
因此，为了本发明的目的，肿瘤永存细胞（像在正常组织中支持细胞层阶的正常干细胞一样）优选通过下列能力被定义：它们无限自我更新而保持多系分化的能力。肿瘤永存细胞因此能够产生肿瘤发生性后代(即肿瘤引发细胞：TPC和TProg)以及非肿瘤发生性(NTG)后代。如本文中所使用的，非肿瘤发生性细胞(NTG)是指由肿瘤引发细胞产生但本身不具有自我更新或产生构成肿瘤的异质肿瘤细胞系的肿瘤细胞。实验上，NTG细胞在小鼠中不能再现地形成肿瘤，甚至是当以过量的细胞数目被移植时。
如所示的，由于其在小鼠中产生肿瘤的有限的能力，TProg也被分类为肿瘤引发细胞(或TIC)。TProg是TPC的后代并且通常能够进行有限数目的非自我更新性细胞分裂。此外，TProg细胞可进一步被分为早期肿瘤祖细胞(ETP)和晚期肿瘤祖细胞(LTP)，其中的每一种都可以通过表型(例如细胞表面标记物)和重现肿瘤细胞架构的不同能力来区分。尽管有这种技术差异，ETP和LTP二者在功能上与TPC的差异在于当以低细胞数量被移植时它们通常较不能够系列重构肿瘤并且通常不反映亲本肿瘤的异质性。尽管有前述区别，也显示了各种TProg群体能够（在偶然的情形中）获得通常属于干细胞的自我更新能力并且它们本身成为TPC(或CSC)。在任何情况下，两种类型的肿瘤-引发细胞都有可能在单一患者的典型肿瘤块中被呈现并经受本文中所公开的调节子的治疗。也即，所公开的组合物在减少此类EFNA阳性肿瘤引发细胞的频率或改变此类EFNA阳性肿瘤引发细胞的化学敏感性方面一般是有效的，无论特定的实施方案为何或在肿瘤中是否是混合呈现的。
在本发明的情境中，与构成肿瘤大块的TProg(ETP和LTP二者)、NTG细胞和肿瘤浸润性非-TPC衍生细胞(例如成纤维细胞/基质，内皮&造血细胞)相比，TPC是更为肿瘤发生性的、相对更为沉寂的且通常更有化学抗性的。鉴于常规疗法和方案在很大程度上被设计用于减瘤和攻击快速增殖的细胞，与更快增殖的TProg和其它大块肿瘤细胞群相比，TPC很可能对常规疗法和方案更有抗性。此外，TPC常常表达使其对常规疗法相对有化学抗性的其它特征，例如多药物抗性转运子的增加的表达、增强的DNA修复机制和抗凋亡蛋白。这些特性（其中的每一种都促成TPC的药物容忍性）构成了标准肿瘤学治疗方案不能确保患有晚期瘤形成的大多数患者的长期益处的关键原因；即不能充分地靶向和清除激起持续的肿瘤生长和复发的那些细胞(即TPC或CSC)。
不像许多前述的现有技术治疗，本发明的新型组合物优选在向受试者施用后减少肿瘤引发细胞的频率，无论所选调节子的形式或特定 靶标(例如遗传材料、EFNA抗体或配体融合构建体)为何。如上文所述，肿瘤引发细胞频率的减少可作为下述的结果产生：a)清除、耗尽、致敏、沉默或抑制肿瘤引发细胞；b)控制肿瘤引发细胞的生长、扩张或复发；c)中断肿瘤引发细胞的起始、繁殖、维持或增殖；或d)通过其它方式妨碍肿瘤发生性细胞的生存、再生和/或转移。在某些实施方案中，肿瘤引发细胞频率的减少可作为一个或多个生理学通路改变的结果发生。所述通路的改变（无论是通过减少或消除肿瘤引发细胞或通过修饰它们的潜能(例如诱导的分化、小生境破坏)，还是以其它方式干扰它们在肿瘤环境或其它细胞上发挥影响的能力），转而通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移及复发而允许更有效的治疗EFNA相关病症。
在可被用于评估肿瘤引发细胞频率的这种减少的方法中有体外或体内有限稀释分析，优选继以使用泊松分布统计进行的计数；或评估预定的确定事件的频率例如在体内产生或不产生肿瘤的能力。虽然此类有限稀释分析是计算肿瘤引发细胞频率减少的优选方法，其它要求较低的方法也可被用于有效地确定所需的值（虽然准确性稍低），并且与本文中的教导完全相容。因此，如本领域技术人员将理解的，也可能通过熟知的流式细胞计数分析或免疫组织化学手段确定频率值的减少。关于所有前述的方法，见例如Dylla等人2008，PMCID：PMC2413402和Hoey等人2009，PMID：19664991；其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。
关于有限稀释分析，肿瘤引发细胞频率的体外计数可通过将经分级或未分级的人肿瘤细胞(例如分别来自经处理和未经处理的肿瘤)置于促成集落形成的体外生长条件中而实现。以这种方式，集落形成细胞可通过简单的计数和集落表征而被计数，或者通过由下述组成的分析而被计数：例如，将人肿瘤细胞以系列稀释置于板中并在涂板后至少10天对于集落形成将每个孔评分为阳性或阴性。体内有限稀释实验或分析（在其确定肿瘤引发细胞频率的能力方面通常更加准确）包括：将人肿瘤细胞从未经处理的对照或经处理的条件以系列稀释物移植到 例如免疫受损的小鼠中并随后在移植后至少60天对于肿瘤形成将每只小鼠评分为阳性或阴性。通过体外或体内有限稀释分析得到细胞频率值优选是通过将泊松分布统计应用于阳性和阴性事件的已知频率，从而提供满足阳性事件定义（在此情形中，分别为集落或肿瘤形成）的事件频率而进行的。
至于可被用于计算肿瘤引发细胞频率的与本发明相容的其它方法，最常用的包括可定量流式细胞计数技术和免疫组织化学染色程序。虽然不如上面所描述的有限稀释分析技术精确，这些程序的劳动密集性小得多并且在相对短的时间范围中提供合理的值。因此，将理解的是本领域技术人员可使用流式细胞计数细胞表面标记物特征谱确定（采用结合本领域认可的肿瘤引发细胞所富集的细胞表面蛋白的一种或多种抗体或试剂(例如如下文的实施例1中所示的潜在相容的标记物)）并从而测量来自各种样品的TIC水平。在另一个相容的方法中，本领域技术人员可使用一种或多种能够结合被认为区分这些细胞的细胞表面蛋白的抗体或试剂，通过免疫组织化学来原位(例如在组织切片中)计数TIC频率。
然后，使用上述方法中的任一种，有可能根据本文的教导定量由所公开的EFNA调节子(包括与细胞毒性试剂相缀合的那些)提供的TIC(或其中的TPC)频率的减少。在某些情形中，本发明的化合物可(通过上述各种机制，包括清除、诱导的分化、小生境破坏、沉默等)减少TIC的频率10%，15%，20%，25%，30%或甚至35%。在其它实施方案中，TIC频率的减少可以是在40%，45%，50%，55%，60%或65%的级别上。在某些实施方案中，所公开的化合物可减少TIC的频率70%，75%，80%，85%，90%或甚至95%。当然，将理解的是TIC频率的任何减少很可能引起瘤形成的肿瘤发生性、持久性、复发和攻击性的相应减少。
IV.EFNA调节子
在任何情形中，本发明涉及EFNA调节子（包括EFNA拮抗剂） 用于诊断、治疗和/或预防数种EFNA相关恶性肿瘤中任一种的用途。所公开的调节子可被单独使用或与各种抗癌化合物（例如化学治疗或免疫治疗试剂或生物应答修饰剂）结合使用。在其它所选实施方案中，两种或更多种分立的EFNA调节子可被组合使用以提供增强的抗-肿瘤效果或可被用于制造多特异性构建体。
在某些实施方案中，本发明的EFNA调节子将包含核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。甚至更优选的，所述调节子将包括可溶性EFNA(sEFNA)或者其形式、变体、衍生物或片段，这包括例如EFNA融合构建体(例如EFNA-Fc，EFNA-靶向部分等)或EFNA缀合物(例如EFNA-PEG，EFNA-细胞毒性试剂，EFNA-brm等)。还将理解，在其它实施方案中，所述EFNA调节子包括抗体(例如抗EFNA1或抗EFNA4mAb)或者其免疫反应性片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，本发明的调节子将包括中和性抗体或者其衍生物或片段。在其它实施方案中，所述EFNA调节子可包括内化性抗体或其片段。在其它实施方案中，所述EFNA调节子可包括耗竭性抗体或其片段。此外，正如前述的融合构建体，这些抗体调节子可以与所选的细胞毒性试剂、聚合物、生物应答修饰剂(BRMs)等相缀合、连接或以其它方式结合以提供以各种（任选多种）作用机制进行的定向免疫疗法。如上文所述，此类抗体可以是泛-EFNA抗体并与两种或更多种肝配蛋白-A配体相结合，或者是与六种肝配蛋白-A配体之一选择性反应的免疫特异性抗体。在其它实施方案中，所述调节子可在遗传水平起作用并且可包括作为反义构建体，siRNA，micro RNA等的化合物。
基于本文中的教导，本领域技术人员将理解，本发明的特别优选的实施方案可包括sEFNA4或sEFNA1或者与EFNA4和EFNA1中的任一个或二者都结合的抗体调节子。
还将理解，所公开的EFNA调节子可通过各种机制耗竭、沉默、中和、消除或抑制肿瘤细胞（特别是TPC）和/或相关的瘤形成的生长、增殖或存活，所述机制包括激动或拮抗所选的通路或消除特定的细胞，这取决于例如EFNA调节子的形式、任何相结合的有效负荷或递送剂 量和方法。因此，虽然本文所公开的优选实施方案涉及特定肿瘤细胞亚群（例如肿瘤永存细胞）的耗竭、抑制或沉默，必须强调的是，此类实施方案只是阐释性的而不在任何意义上是限制性的。相反，如所附权利要求中所示，本发明广泛地涉及EFNA调节子以及它们在治疗、处理或预防各种EFNA相关过度增生性病症中的用途，不论任何特定的机制或靶肿瘤细胞群为何。
在同样意义上，本发明的所公开的实施方案可包括一种或多种EFNA拮抗剂。为此，将理解的是，本发明的EFNA拮抗剂可包括识别EFNA蛋白或其片段、或与之反应、结合、组合、竞争、缔合或以其它方式相互作用并且消除、沉默、减少、抑制、阻碍、限制或控制肿瘤引发细胞或其它肿瘤性细胞（包括大块肿瘤或NTG细胞）的生长的任何配体，多肽，肽，融合蛋白，抗体或者它们的免疫活性片段或衍生物。在所选的实施方案中，所述EFNA调节子包括EFNA拮抗剂。
如本文中所使用的，拮抗剂是指能够中和、阻断、抑制、废止、减少或干扰特定或指定蛋白的活性的分子，这包括受体与配体的结合或者酶与底物的相互作用。更一般性地，本发明的拮抗剂可包括抗体及其抗原结合片段或衍生物，蛋白，肽，糖蛋白，糖肽，糖脂，多糖，寡糖，核酸，反义构建体，siRNA，miRNA，生物有机分子，模拟肽，药理学试剂及其代谢物，转录和翻译控制序列等。拮抗剂还可包括小分子抑制剂，融合蛋白，受体分子及衍生物（它们特异性结合所述蛋白从而掩蔽其与其底物靶标的结合），所述蛋白的拮抗剂变体，针对所述蛋白的反义分子，RNA适配体，以及抗所述蛋白的核酶。
如本文中所使用的以及应用于两种或更多种分子或化合物的，术语识别或结合应指分子的共价或非共价反应、结合、特异性结合、组合、相互作用、联系、连接、联合、聚结，合并或连结，其中一个分子对另一分子施加影响。
此外，如本文的实施例中所示，某些人EFNA的调节子在某些情况中可与来自除人之外的物种（例如鼠）的EFNA交叉反应。在其它 情形中，示例性的调节子可以对人EFNA的一种或多种同种型是特异性的并且将不显示与来自其它物种的EFNA直系同源物的交叉反应性。当然，与本文的教导相结合，此类实施方案可包括与来自单一物种的两种或更多种肝配蛋白-A配体相结合的泛-EFNA抗体或与单一肝配蛋白-A配体专门结合的抗体。
在任何情况下，并且如在下文中将进一步详细讨论的，本领域技术人员将理解，可以缀合或非缀合的形式使用所公开的调节子。也即，所述调节子可与药学活性化合物，生物学应答调节子，抗癌试剂，细胞毒性或细胞抑制试剂，诊断部分或生物相容性调节子结合或缀合(例如共价地或非共价地)。在这方面，将理解的是，此类缀合物可包含肽，多肽，蛋白，融合蛋白，核酸分子，小分子，模拟试剂，合成药物，无机分子，有机分子和放射性同位素。此外，如本文中所显示的，所选的缀合物可以各种摩尔比与EFNA调节子共价或非共价连接，这至少部分地取决于实现缀合所使用的方法。
V.抗体
a.概况
如前文所述，本发明的特别优选的实施方案包括抗体形式的EFNA调节子。在最广泛的意义上使用术语抗体并且其特别地涵盖合成的抗体，单克隆抗体，寡克隆或多克隆抗体，多克隆（multiclonal）抗体，重组产生的抗体，内体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，CDR-接枝的抗体，灵长源化的抗体，Fab片段，F(ab')片段，单链FvFcs(scFvFc)，单链Fvs(scFv)，抗独特型(抗-Id)抗体以及任何其它的免疫活性抗体片段，只要它们显示所需的生物学活性(即，EFNA缔合或结合)。在更广泛的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子，其中这些片段可与另一个免疫球蛋白结构域相融合或不融合，其中所述另一个免疫球蛋白结构域包括但不限于Fc区域或其片段。此外，如本文中更详细地描述的， 术语抗体（antibody）和抗体(antibodies)特别地包括如下文所述的Fc变体，这包括全长抗体与变体Fc融合物，其包含Fc区域或其片段，任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并与免疫球蛋白的免疫活性片段相融合。
如下文中更详细地讨论的，通用术语抗体或免疫球蛋白包含五个可在生物化学方面被区分的区别性抗体类别，并且取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，可容易地将它们分配至适当的类别。由于历史性的原因，完整抗体的主要类别被称为IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。在人中，类别IgG和IgA可被进一步分为被认可的亚类(同种型)，即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2，这取决于结构和某些生物化学性质。将理解的是，在人中IgG同种型是以其在血清中的丰度的顺序命名的，以IgG1为最丰富的。
虽然全部五种抗体(即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)和所有的同种型(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)以及它们的变体都在本发明的范围内，在下文中仅为了阐释的目的将详细讨论包括免疫球蛋白IgG类的优选的实施方案。然而，将理解这种公开仅仅是显示实施本发明的示例性组合物和方法而不以任何方式限制本发明或所附权利要求的范围。
在这方面，人IgG免疫球蛋白包含两个相同的分子量为约23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链（取决于同种型）。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别以相应的小写希腊字母α，δ，ε，γ和μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列而被分配至两个清楚区别的类型（称作κ和λ)之一。本领域技术人员将理解，不同免疫球蛋白类别的亚基结构和三维构型是公知的。
四条链在Y构型中被二硫键连接，其中轻链支托重链，所述重链从Y的口部开始并继续经过可变区到达Y的两个端部。每条轻链都通过一个共价二硫键与重链相连而铰链区的两个二硫连接连接重链。重链和轻链各自也具有经规律间隔的链内二硫桥，所述二硫桥的数目可 基于IgG的同种型而变化。
每条重链在一端具有可变结构域(VH)，继以数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并在其另一端具有恒定结构域；所述轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，且轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。在这方面，将理解的是，轻链(VL)和重链(VH)的可变结构域部分确定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予并调节重要的生物学特性，例如分泌，跨胎盘移动性，循环半衰期，补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们距抗体的抗原结合位点或氨基末端越远而增加。因此，抗体的氨基或N末端包含可变区而羧基或C末端包含恒定区。因此，CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
术语可变是指下列事实：在免疫球蛋白间可变结构域的某些部分的序列广泛不同并且这些热点很大程度上限定特定抗体的结合和特异性特征。分别在轻链和重链可变结构域中，这些高变位点在三个区段（已知为互补决定区(CDR)）中表现其自身。所述CDR侧翼的可变结构域的更加高度保守的部分被称为框架区(FR)。更具体地，在天然产生的单体IgG抗体中，存在于抗体的每条臂上的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，它们被特定地放置使得当所述抗体在水性环境中呈现其三维构型时它们形成抗原结合位点。
包含重链和轻链可变结构域其余部分的框架区显示氨基酸序列中的更少的分子间变化。相反，框架区大部分采取β折叠构象并且CDR形成相连的环，且在某些情形中形成β折叠结构的一部分。因此，这些框架区起作用以形成支架，其通过链间、非共价相互作用而提供将六个CDR置于正确的朝向。通过被定位的CDR形成的抗原结合位点确定与免疫反应性抗原(即EFNA4)上的表位互补的表面。这一互补的表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。将理解的是，本领域技术人员可容易地鉴别CDR的位置。
如下文中更详细讨论的以及所附实施例中所示的，可使用标准的重组和表达技术来重组或工程化所述重链和轻链可变区的全部或部 分，以提供有效的抗体。也即，来自第一抗体(或其任何部分)的重链或轻链可变区可与来自第二抗体的重链或轻链可变区的任何所选部分相混合和匹配。例如，在一个实施方案中，包含第一抗体的三个轻链CDR的整个轻链可变区可与包含第二抗体的三个重链CDR的整个重链可变区配对以提供可操作的抗体。此外，在其它实施方案中，可将源自各种抗体的单个重链和轻链CDR相混合和匹配以提供具有最优化特征的所需抗体。因此，示例性的抗体可包含来自第一抗体的三个轻链CDR，源自第二抗体的两个重链CDR和来自第三抗体的第三个重链CDR。
更具体地，在本发明的情境中，将理解的是图7A中的任何所公开的重链和轻链CDR可以这种方式被重排以根据当前的教导提供经优化的抗EFNA(例如抗hEFNA4)抗体。也即，可将图7A中公开的一个或多个CDR并入EFNA调节子，并且在特别优选的实施方案中将其并入与一种或多种肝配蛋白-A配体免疫特异性结合的经CDR接枝的或人源化的抗体中。
在任何情况下，互补决定区残基数目可以如Kabat等人(1991，NIHPublication91-3242，National Technical Information Service，Springfield，Va.)中的那些所定义，特别是轻链可变结构域中的残基24-34(CDR1)，50-56(CDR2)和89-97(CDR3)以及重链可变结构域中的31-35(CDR1)，50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。应注意，CDR从抗体到抗体可观地变化(并且根据定义其将不显示与Kabat共有序列的同源性)。框架残基的最大程度比对常常要求在编号系统中插入间隔子残基以被用于Fv区域。此外，任何给定Kabat位点编号处的某些单个残基的标识可从抗体链至抗体链变化，这是由于种间或等位基因差异。也见Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature342，pp.877-883(1989)和MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中当彼此之间进行比较时所述定义包括氨基酸残基的重叠或亚集。每一篇前述参考文献均在此以其全部通过引用而并入并且涵盖如每个上文所引述的参考文献中所定义的CDR的氨基 酸残基被显示用于比较。
CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1残基编号根据Kabat等人的命名，见上
2残基编号根据Chothia等人的命名，见上
3残基编号根据MacCallum等人的命名，见上
为了方便，图7A中所示的CDR(SEQ ID NO：8–59和70-95)源自VBASE2分析，虽然鉴于本申请的内容，本领域技术人员对于每个相应重链和轻链序列将容易地鉴别和计数如Kabat等人或MacCallum等人所定义的CDR。在这方面，如Kabat等人定义的CDR被用于实施例7(b)中所示的人源化分析，并在图7O–7R(SEQ ID NO：148–163)中被加下划线，其描绘根据本发明的人源化抗体序列。因此，包含由所有此类命名定义的CDR的抗体被明确地包括在本发明的范围内。更广泛地，术语可变区CDR氨基酸残基包括如使用上文所示的任何基于序列或结构的方法所鉴别的CDR中的氨基酸。
如本文中所使用的，术语可变区框架(FR)氨基酸残基是指Ig链的框架区中的那些氨基酸。如本文中所使用的术语框架区或FR区包括为可变区的一部分但不是CDR（例如使用CDR的Kabat定义）的一部分的氨基酸残基。因此，可变区框架是长度为约100-120个氨基酸但仅包括CDR之外的那些氨基酸的非连续序列。
对于重链可变区的具体实例以及对于Kabat等人所定义的CDR，框架区1对应于涵盖氨基酸1-30的可变区的结构域；框架区2对应于涵盖氨基酸36-49的可变区的结构域；框架区3对应于涵盖氨基酸66-94的可变区的结构域，且框架区4对应于氨基酸103至可变区末端的可变区的结构域。轻链的框架区类似地被每个轻链可变区CDR分开。类似地，使用Chothia等人或McCallum等人对CDR的定义，框架区边界被如上文所述的各CDR末端分开。
出于前述结构上的考虑，本领域技术人员将理解，本发明的抗体可包括许多功能性实施方案中的任意一个。在这方面，相容的抗体可包括在受试者中提供所需生理学应答的任意免疫反应性抗体(如所述术语在本文中被定义的)。虽然任何所公开的抗体均可与当前的教导结合使用，本发明的某些实施方案将包含嵌合、人源化或人单克隆抗体或其免疫反应性片段。而其它实施方案可例如包括均质或异质的多聚体构建体，Fc变体以及缀合的或经糖基化更改的抗体。此外，将理解，此类构型不是相互排斥的并且相容的单个抗体可包括本文所公开的一个或多个功能方面。例如，相容的抗体可包括具有人源化可变区的单链双抗体，或具有更改糖基化模式以调节血清半衰期的Fc修饰的全人全长IgG3抗体。其它示例性实施方案对于本领域技术人员是很显然的，并且可被容易地分辨为是在本发明的范围内。
b.抗体产生
如公知的，各种宿主动物（包括兔、小鼠、大鼠等）可被接种并用于提供根据本文的教导的抗体。本领域中已知的可被用于增加免疫应答的佐剂取决于所接种的物种包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物质凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂，复合多元醇（Pluronic polyol），多聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔戚血蓝蛋白，二硝基酚，和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌。此类佐剂可通过将抗原螯合在局部沉积中而保护其免于快速分散，或者它们可含有下述物质：其刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其它组分有趋化性的因子。优选地，如果施用了多肽，则免疫接种计 划将包括两次或更多次施用所述多肽，散布在数周中。
在用EFNA免疫原(例如可溶性EFNA4或EFNA1)（这可包括所选的同种型和/或肽，或表达所需蛋白的活细胞或细胞制备物）免疫接种动物后，可使用本领域中认可的技术从所述动物中获得抗体和/或产生抗体的细胞。在一些实施方案中，通过取血或处死所述动物而获得含有多克隆抗-EFNA抗体的血清。所述血清可以从所述动物中获得的形式被用于研究目的，或者备选地，所述抗-EFNA抗体可被部分或完全纯化以提供免疫球蛋白级分或均质抗体制备物。
c.单克隆抗体
虽然多克隆抗体可与本发明的某些方面结合使用，优选的实施方案包括使用EFNA反应性单克隆抗体。如本文中所使用的，术语单克隆抗体或mAb是指从基本上均质的抗体群获得的抗体，即构成所述群的单个抗体是相同的，除了可少量存在的可能突变（例如天然发生的突变）外。因此，修饰语单克隆表示抗体的特征不是分立抗体的混合物并且可与任何类型的抗体结合使用。在某些实施方案中，此类单克隆抗体包括包含结合或缔合EFNA的多肽序列的抗体，其中所述结合EFNA的多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单一的靶标结合性多肽序列的过程获得的。
在优选的实施方案中，产生抗体的细胞系是由从经免疫的动物中分离的细胞制备的。在免疫接种后，处死所述动物并如所附实施例中所示通过本领域中熟知的手段使淋巴结和/或脾B细胞永生化)。永生化细胞的方法包括但不限于用致癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们并在选择永生化细胞的条件下培养它们，使它们经受致癌性或诱变性化合物，将它们与永生化细胞（例如骨髓瘤细胞）融合并灭活肿瘤抑制子基因。如果使用了与骨髓瘤细胞融合，则所述骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性的细胞系)。使用肝配蛋白-A配体(包括所选的同种型)或其免疫反应性部分筛选永生化细胞。在优选的实施方案中，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定进行最初的筛选。
更一般地，可使用本领域已知的各种技术来制备与本发明相一致 的分立的单克隆抗体，所述技术包括杂交瘤，重组技术，噬菌体展示技术，酵母文库，转基因动物(例如或)或它们的一些组合。例如，可使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术为如上文中所概括描述的以及在下列中更详细地教导的：Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling等人：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)，其中的每一个都在此并入。使用所公开的方案，优选通过多次皮下或腹膜内注射相关的抗原及佐剂而在哺乳动物中产生抗体。如之前所讨论的，这种免疫接种一般引起免疫应答，这包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体(如果被免疫的动物是转基因的，则其可为全人的)。虽然可从动物的血清收获所产生的抗体以提供多克隆制备物，通常更希望的是从脾、淋巴结或外周血分离单个淋巴细胞以提供单克隆抗体的均质制备物。最典型的，从脾脏获得淋巴细胞并将其永生化以提供杂交瘤。
例如，如上文所描述的，所述选择过程可以是从多个克隆（例如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合）中选择独特的克隆。应当理解，所选的EFNA结合性序列可被进一步更改，例如，以改进对于靶标的亲和性，以人源化所述靶标结合性序列，以改进其在细胞培养物中的产生，以减少其体内免疫原性，以产生多特异性抗体等，并且包含所述经更改的靶标结合性序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与多克隆抗体制备物（其通常包括针对不同决定簇（表位）的分立的抗体）相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常不被可能为交叉反应性的其它免疫球蛋白污染。
d.嵌合抗体
在另一个实施方案中，本发明的抗体可包括嵌合抗体，其源自来自至少两个不同的物种或抗体类型的共价连接的蛋白区段。将理解的是，如本文中所使用的，术语嵌合抗体涉及这样的构建体：其中重链 和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。在一个示例性实施方案中，根据本文的教导的嵌合抗体可包括鼠VH和VL氨基酸序列以及源自人来源的恒定区。在其它相容的实施方案中，本发明的嵌合抗体可包含如下文所述的CDR接枝的或人源化抗体。
一般地，制造嵌合抗体的目的是创造嵌合体，其中使来自所欲主题物种的氨基酸数目最大化。一个实例是CDR-接枝的抗体，其中所述抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个互补决定区(CDR)，而所述抗体链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。对于在人中的应用，来自啮齿类抗体的可变区或所选的CDR通常被接枝到人抗体中，替代人抗体的天然存在的可变区或CDR。这些构建体一般具有下列优势：提供全强度的调节子功能(例如CDC，ADCC等)而减少受试者对于所述抗体的不希望的免疫应答。
e.人源化抗体
与CDR接枝的抗体类似的是人源化抗体。一般地，人源化抗体是由起初在非人动物中产生的单克隆抗体产生的。如本文中所使用的，非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受或受体抗体)，其中来自接受抗体的CDR的残基被具有所需特异性、亲和性和/或能力的来自非人物种的CDR（供体抗体）的残基所替代，所述非人物种为例如小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类。
一般地，抗体的人源化包括分析供体和接受抗体的序列同源性和常规结构。在所选的实施方案中，所述接受抗体可包含共有序列。为了创造共有人框架，可将来自数个人重链或轻链氨基酸序列的框架进 行比对以鉴别共有的氨基酸序列。此外，在许多情形中，人免疫球蛋白可变结构域中的一个或多个框架残基被来自供体抗体的相应非人残基替代。通过本领域中熟知的方法鉴别这些框架置换，例如通过建模CDR与框架残基之间的相互作用以鉴别对于抗原结合重要的框架残基，和进行序列比较以鉴别特定位置处的不寻常框架残基。此类置换帮助保持经接枝的CDR的适当的三维构型并常常相对于没有框架置换的相似构建体改进亲和性。此外，人源化抗体可包含在接受抗体或供体抗体中没有发现的残基。可使用公知的技术进行这些修饰以进一步改善抗体表现。
CDR接枝和人源化抗体被描述于例如美国专利号6,180,370，5,693,762，5,693,761，5,585,089和5,530,101中。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR相应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部框架区为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。关于进一步的细节，参见例如Jones等人，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还见例如Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。另一种方法被称为人工程化（humaneering）并且被描述于例如U.S.2005/0008625中。为了本申请的目的，术语人源化抗体将被认为明确地包括没有或有最少的框架置换的CDR接枝的抗体(即包含一个或多个接枝的非人CDR的人抗体)。
此外，也可通过特异性缺失人T细胞表位或通过WO98/52976和WO00/34317中公开的方法进行的去免疫化来修饰非人抗-EFNA抗体。简要地，可就结合MHC II类的肽分析抗体的重链和轻链可变区；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO98/52976和WO00/34317中所 定义的)。为了检测潜在的T细胞表位，可应用称作肽穿线（threading）的计算机建模方法，此外可就存在于VH和VL序列中的基序搜索人MHC II类结合性肽文库，如WO98/52976和WO00/34317中所描述的。这些基序结合18个主要MHC II类DR同种异型中的任何一个，并因此构成潜在的T细胞表位。可通过置换可变区中的少数氨基酸残基或通过单一氨基酸置换来清除所检测的潜在T-细胞表位。尽可能地进行保守置换。通常但不是唯独地，可使用人种系抗体序列中的位置处共有的氨基酸。鉴别了去免疫变化后，可通过诱变或其它合成方法(例如从头合成，盒替换等)构建编码VH和VL的核酸。经诱变的可变序列可任选地与人恒定区相融合。
在所选的实施方案中，至少60%，65%，70%，75%或80%的人源化抗体可变区残基将对应于亲本框架区(FR)和CDR序列的那些。在其它实施方案中，至少85%或90%的人源化抗体残基将对应于亲本框架区(FR)和CDR序列的那些。在其它优选的实施方案中，大于95%的人源化抗体残基将对应于亲本框架区(FR)和CDR序列的那些。
可使用如本文中所描述的常见分子生物学和生物分子工程化技术来制造人源化抗体。这些方法包括从至少一个重链或轻链分离、操控和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。此类核酸的来源是本领域技术人员熟知的，并且例如可从产生抗预定靶标的抗体或免疫反应性片段的杂交瘤、真核细胞或噬菌体（如上文所描述的），从种系免疫球蛋白基因，或从合成的构建体获得。然后，可将编码人源化抗体的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
人种系序列，被公开在例如Tomlinson，I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today16：237-242；Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Bio.227:799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J14:4628-4638中。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的全面目录(见Retter等人，(2005)Nuc Acid Res33：671-674)。这些序列可被用作人序列的来源，例如用于框架区和CDR。如本文中所示，也可使用共有人框架区，例如如美国 专利号6,300,064中所描述的。
f.人抗体
除了前述抗体之外，本领域技术人员将理解，本发明的抗体可包括全人抗体。为了本申请的目的，术语人抗体包括具有下述氨基酸序列的抗体：其对应于由人产生的、和/或使用如本文所公开的任何用于制造人抗体的技术而制造的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除了包含非人抗原结合性残基的人源化抗体。
可使用本领域中已知的各种技术来产生人抗体。如上文所述，可使用噬菌体展示技术来提供根据本发明的免疫活性结合区。因此，本发明的某些实施方案提供用于产生抗-EFNA抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括下列步骤：在噬菌体上合成（优选人）抗体的文库，用所选的EFNA或其抗体结合部分筛选所述文库，分离结合EFNA的噬菌体，和从所述噬菌体获得免疫反应性片段。作为示例，用于制备为了在噬菌体展示技术中使用的抗体文库的一种方法包括下列步骤：用所选的EFNA或其抗原性部分免疫接种包含人或非人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答，从经免疫接种的动物提取产生抗体的细胞；从所提取的细胞分离编码本发明的抗体的重链和轻链的RNA，反转录所述RNA以产生cDNA，使用引物扩增所述cDNA，以及将所述cDNA插入噬菌体展示载体中从而所述抗体在噬菌体上表达。更具体地，通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv连接子重组到一起并克隆到噬菌粒载体(例如p CANTAB6或pComb3HSS)中。然后可将所述载体电穿孔到大肠杆菌中并随后用帮助噬菌体感染所述大肠杆菌。在这些方法中使用的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组地融合。
可通过筛选如上文所制备的重组的组合抗体文库来分离本发明的重组人抗EFNA抗体。在优选的实施方案中，所述文库是scFv噬菌体展示文库，其是使用由从B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNA产生的。用于制备和筛选所述文库的方法是本领域中熟知的且 用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商业上可得的(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。也有可用于产生和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(见例如美国专利号5,223,409；PCT公开号WO92/18619，WO91/17271，WO92/20791，WO92/15679，WO93/01288，WO92/01047，WO92/09690；Fuchs等人，Bio/Technology9:1370-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85(1992)；Huse等人，Science246:1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature348:552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.12:725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)；Clackson等人，Nature352:624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580(1992)；Garrad等人，Bio/Technology9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nuc.Acid Res.19:4133-4137(1991)；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982(1991)。
由幼稚文库(天然或合成的)产生的抗体可以是中等亲和力(Ka为约106至107M-1)，但也可如本领域中所描述的通过构建和从二级文库中重新选择而在体外模拟亲和力成熟。例如，可通过在Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580(1992)的方法中使用易错聚合酶(Leung等人，Technique，1：11-15(1989)中报道的)而在体外随机引入突变。此外，可通过在所选的单个Fv克隆中随机突变一个或多个CDR（例如使用以携带跨越目的CDR的随机序列的引物进行的PCR）并筛选更高亲和力的克隆来进行亲和性成熟。WO9607754描述了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变以产生轻链基因文库的方法。另一种有效的方式是将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与从未经免疫的供体获得的天然存在的V结构域变体储库重组并在数轮链重改组中筛选更高的亲和力，如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)中所描述的。此技术允许产生解离常数Kd(koff/kon)为约 10-9M或更少的抗体和抗体片段。
还将理解，可采用类似的程序，其中使用包含在其表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库。与噬菌体展示技术一样，针对目的抗原(即EFNA)筛选真核细胞文库并分离和克隆表达候选物结合对的细胞。可采取步骤来优化文库内容以及用于反应结合对的亲和力成熟。见例如，美国专利号7,700,302和U.S.S.N.12/404,059。在一个实施方案中，从噬菌体文库中选择人抗体，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人NatureBiotechnology14:309-314(1996)：Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol，227:381(1991)；Marks等人，J.MoI.Biol，222:581(1991))。在其它实施方案中，可从在真核细胞（例如酵母）中产生的组合抗体文库中分离人结合对。见例如美国专利号7,700,302。此类技术有利地允许筛选大量候选调节子并提供相对容易的对候选序列的操控(例如通过亲和力成熟或重组改组)。
也可通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因被部分或完全灭活的转基因动物（例如小鼠）中而制作人抗体。进行刺激（challenge）后，观察到了人抗体产生，其在所有的方面非常类似在人中所见到的，包括基因重排、组装和抗体储库。这种方法被描述在例如关于技术的美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中以及美国专利号6,075,181和6,150,584中，以及在下述科学出版物中：Marks等人，Bio/Technology10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature368:812-13(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。备选地，可通过永生化产生针对靶标抗原的抗体的人B-淋巴细胞来制备人抗体(此类B淋巴细胞可从患有肿瘤性病症的个体回收或者可在体外被免疫)。见例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner等人,J.Immunol, 147(l):86-95(1991);和美国专利号5,750,373
VI.抗体特征
无论是如何获得的，或者所述抗体调节子采取哪种前述形式(例如人源化，人等)，所公开的调节子的优选实施方案可显示各种特征。在这方面，可选择、克隆产生抗-EFNA抗体的细胞(例如杂交瘤或酵母集落)并就所需特征进一步筛选它们，所述特征包括例如强劲生长，高抗体产生和（如下文中更详细地讨论的）所需的抗体特征。可在同基因动物中、在缺乏免疫系统的动物（例如裸小鼠）中体内扩增杂交瘤或在细胞培养物中体外扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或集落的方法（其中的每一种都产生分立的抗体品种）是本领域普通技术人员熟知的。
a.中和性抗体
在特别优选的实施方案中，本发明的调节子将包括中和性抗体或其衍生物或片段。术语中和性抗体或中和性拮抗剂是指下述抗体或拮抗剂：其与肝配蛋白-A配体结合或相互作用并防止所述配体与其结合伴侣(例如EPHA受体)的结合或缔合从而中断否则将由分子的相互作用产生的生物学应答。在评估抗体或其免疫功能性片段或衍生物的结合和特异性时，当过量抗体减少与靶分子结合的结合伴侣的量至少约20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，97%，99%或更多时（如例如在体外竞争性结合测定(见例如本文中的实施例9-12)中所测量的），抗体或片段将实质上抑制配体与其结合伴侣或底物的结合。在EFNA4的抗体的情形中，例如中和性抗体或拮抗剂将优选地减少EFNA4结合EphA4的能力至少约20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，97%，99%或更多。将理解的是，可通过使用本领域中认可的技术直接测量这种降低的活性或者可通过这种降低对于EPH(例如EPHA4)受体活性将具有的影响来测量这种降低的活性。
b.内化抗体
虽然证据表明所选的肝配蛋白-A配体或它们的同种型可以可溶性形式存在，至少某些EFNA(例如EFNA1和EFNA4)很可能保持与细胞表面相结合从而允许所公开的调节子的内化。因此，本发明的抗-EFNA抗体至少在某种程度上可被表达肝配蛋白-A配体的细胞内化。例如，结合肿瘤引发细胞表面上的EFNA4的抗EFNA4抗体可被肿瘤引发细胞内化。在特别优选的实施方案中，这种抗EFNA抗体可与抗癌试剂（例如在内化后杀伤细胞的细胞毒性部分）相结合或缀合。
如本文中所使用的，内化的抗EFNA抗体是这样的抗体：其在结合与哺乳动物细胞相结合的EFNA后被细胞吸取。所述内化抗体包括抗体片段、人或人源化抗体以及抗体缀合物。内化可在体外或体内发生。对于治疗性应用，内化可在体内发生。被内化的抗体分子的数目可以是足够的或充分的以杀伤表达EFNA的细胞，特别是表达EFNA的肿瘤引发细胞。取决于抗体或抗体缀合物的效力，在某些情形中，将单一抗体分子摄入细胞中就足以杀伤所述抗体所结合的靶细胞。例如，某些毒素在杀伤方面是高度有效的而使得内化与抗体相缀合的一个所述毒素的分子就足以杀伤肿瘤细胞。抗EFNA抗体在结合哺乳动物细胞上的EFNA后是否内化可由各种测定来决定，所述测定包括下文的实施例(例如实施例15和16)中所描述的那些。检测抗体是否内化到细胞中的方法也被描述在美国专利号7,619,068中，在此将其以其全部通过引用而并入。
c.耗竭性抗体
在其它优选的实施方案中，本发明的调节子将包括耗竭性抗体或其衍生物或片段。术语耗竭性抗体是指与细胞表面上或附近的EFNA结合或缔合并诱导、促进或引起所述细胞的死亡或清除（例如通过补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性)的抗体或片段。在下文中更全面讨论的某些实施方案中，所选的耗竭性抗体将与细胞毒性试剂相结合或缀合。优选地，耗竭性抗体将能够移除、消除或杀死确定细胞群中至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，97%或99%的肿瘤永存细胞。在某些实施方案中，所述细胞群 可包含富集的、分级的、纯化的或分离的肿瘤永存细胞。在其它实施方案中，所述细胞群可包括全肿瘤样品或包含肿瘤永存细胞的异质肿瘤提取物。本领域技术人员将理解，可使用如下文的实施例(例如实施例16)中所描述的标准生物化学技术来监控和定量根据本文中的教导的肿瘤发生性细胞或肿瘤永存细胞的耗竭。
d.表位结合
还将理解，所公开的抗-EFNA抗体将与所选靶标所呈递的分立的表位或决定簇相缔合或结合。如本文中所使用的，术语表位是指能够被特定抗体识别和特异性结合的靶抗原的那部分。当抗原是多肽（例如EFNA）时，表位能够由连续氨基酸以及通过蛋白的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白变性后被保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白变性后丧失。表位通常包括至少3个，更通常至少5或8-10个为独特空间构象的氨基酸。更具体地，本领域技术人员将理解术语表位包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或以其它方式与分子相互作用的任何蛋白决定簇。表位决定簇一般由有化学活性的分子表面基团（例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链）组成并且一般具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。此外，表位可以是线性的或构象的。在线性表位中，蛋白与相互作用分子(例如抗体)之间的全部相互作用点均沿着蛋白的一级氨基酸序列线性存在。在构象性表位中，相互作用点在彼此在线性上分开的蛋白上的氨基酸残基中存在。
一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对此表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术、用包含所述表位的肽进行免疫接种。备选地，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明关于所需表位的信息。从这种信息，然后有可能竞争性地筛选结合相同表位的抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以找到彼此之间竞争性结合的抗体，即竞争与抗原的结合的抗体。基于它们的交叉竞争而用于分箱（binning）抗体的高通量过程被描述在WO03/48731中。
如本文中所使用的，术语分箱（binning）是指基于其抗原结合特 性而将抗体分组的方法。箱的分配在某种程度上是任意的，这取决于所观察到的所测试的抗体的结合模式有多么不同。因此，虽然所述技术对于本发明的抗体的分类是有用的工具，所述箱不总是与表位直接相关并且这种最初的确定应当通过其它本领域认可的方法被进一步证实。
带着这一警示，人们可通过使用本领域中已知的方法以及本文实施例中所示的方法来确定所选的第一抗体(或其片段)是否与第二抗体结合相同的表位或者交叉竞争结合。在一个实施方案中，人们允许本发明的第一抗体在饱和条件下结合EFNA，然后测量第二抗体结合EFNA的能力。如果测试抗体能够与第一抗EFNA抗体同时结合EFNA，则所述第二抗体与所述第一抗体结合不同的表位。然而，如果所述第二抗体不能同时结合EFNA，所述第二抗体结合相同的表位，重叠的表位，或很靠近所述第一抗体所结合的表位的表位。如本领域中已知的以及下文的实施例中所详述的，可使用固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定，BiacoreTM系统(即表面等离子体共振–GEHealthcare)，分析仪(即生物层干涉测量法-ForteBio，Inc.)或流式细胞计数方法来获得所需的数据。如本文中所使用的，术语表面等离子体共振是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的改变而分析实时生物特异性相互作用的光学现象。在特别优选的实施方案中，如下文的实施例中所示，通过使用Biacore或ForteBio手段来进行分析。
当在竞争相同表位的抗体的情境中使用时，术语竞争是指通过其中所测试的抗体或免疫功能性片段防止或抑制参照抗体与共同抗原的特异性结合的测定所确定的抗体之间的竞争。通常，此类测定涉及使用与携带未标记的测试免疫球蛋白和经标记的参照免疫球蛋白之一的固体表面或细胞相结合的经纯化的抗原。通过确定在测试免疫球蛋白的存在下与所述固体表面或细胞相结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，所述测试免疫球蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体结合相同表位的抗体以及结合与参照抗体 所结合的表位足够近的临近表位以发生位阻的抗体。用于确定竞争性结合的方法的其它细节在本文的实施例中提供。通常，当过量存在竞争性抗体时，其将抑制参照抗体与共同抗原的特异性结合至少40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%或75%。在某些情形中，结合被抑制至少80%，85%，90%，95%或97%或更多。
除了表位特异性外，可使用若干不同的物理特征（包括例如结合亲和性、熔化温度(Tm)和等电点）来表征所公开的抗体。
e.结合亲和性
在这方面，本发明还涵盖使用对于所选的EFNA（或者在泛抗体的情形中，对于超过一种类型的肝配蛋白-A配体）具有高结合亲和性的抗体。当解离常数Kd(koff/kon)≤10-8M时，称本发明的抗体特异性结合其靶抗原。当Kd≤5x10-9M时，所述抗体以高亲和力特异性结合抗原，当Kd≤5x10-10M时以非常高的亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中，所述抗体具有的Kd为≤10-9M且解离速率（off-rate）为约1x10-4/sec。在本发明的一个实施方案中，解离速率为<1x10-5/sec。在本发明的其它实施方案中，所述抗体将以约10-8M至10-10M的Kd结合EFNA，在另一个实施方案中，其将以≤2x10-10M的Kd结合。本发明的其它所选的实施方案包括下述抗体：其具有的解离常数或Kd(koff/kon)为少于10-2M，少于5x10-2M，少于10-3M，少于5x10-3M，少于10-4M，少于5x10-4M，少于10-5M，少于5x10-5M，少于10-6M，少于5x10- 6M，少于10-7M，少于5x10-7M，少于10-8M，少于5x10-8M，少于10-9M，少于5x10-9M，少于10-10M，少于5x10-10M，少于10-11M，少于5x10-11M，少于10-12M，少于5x10-12M，少于10-13M，少于5x10-13M，少于10-14M，少于5x10-14M，少于10-15M或少于5x10-15M。
在特定的实施方案中，免疫特异性地结合EFNA的本发明的抗体具有的结合速率常数或kon速率(EFNA(Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l，至少2x105M-ls-l，至少5x105M-ls-l，至少106M-ls-l，至少5x106M-ls-l，至少107M-ls-l，至少5x107M-ls-1或至少108M-ls-l。
在另一个实施方案中，免疫特异性地结合EFNA的本发明的抗体具有的koff速率(EFNA(Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)为少于l0-ls-l，少于5xl0-ls-l，少于l0-2s-l，少于5xl0-2s-l，少于l0-3s-l，少于5xl0-3s-l，少于l0-4s-l，少于5xl0-4s-l，少于l0-5s-l，少于5xl0-5s-l，少于l0- 6s-l，少于5xl0-6s-l少于l0-7s-l，少于5xl0-7s-l，少于l0-8s-l，少于5xl0-8s-l，少于l0-9s-l，少于5xl0-9s-l或少于l0-10s-l。
在本发明的其它所选实施方案中，所述抗EFNA抗体将具有的亲和力常数或Ka(kon/koff)为至少102M-1，至少5x102M-1，至少103M-1，至少5x103M-1，至少104M-1，至少5x104M-1，至少105M-1，至少5x105M-1，至少106M-1，至少5x106M-1，至少107M-1，至少5x107M-1，至少108M-1，至少5x108M-1，至少109M-1，至少5x109M-1，至少1010M-1，至少5x1010M-1，至少1011M-1，至少5x1011M-1，至少1012M-1，至少5x1012M-1，至少1013M-1，至少5x1013M-1，至少1014M-1，至少5x1014M-1，至少1015M-1或至少5x1015M-1。
f.等电点
除了前述结合特性外，像所有的多肽一样，抗EFNA抗体及其片段具有等电点(pI)，其一般被定义为多肽不带有净电荷的pH。本领域中已知，当溶液的pH等于蛋白的等电点(pI)时，蛋白的溶解性通常是最低的。因此，有可能通过更改抗体中可电离残基的数目和位置以调整pI而优化溶解性。例如，可通过进行适当的氨基酸置换(例如通过用不带电的残基例如丙氨酸置换带电的氨基酸例如赖氨酸)来操控多肽的pI。不愿被任何特定理论所束缚，引起所述抗体的pI改变的抗体的氨基酸置换可改进所述抗体的溶解性和/或稳定性。本领域技术人员将理解哪些氨基酸置换将最适于特定的抗体以达到所需的pI。
可通过各种方法确定蛋白的pI,所述方法包括但不限于等电点聚焦和各种计算机算法(见例如Bjellqvist等人，1993，Electrophoresis14:1023)。在一个实施方案中，本发明的抗EFNA抗体的pI高于约6.5，约7.0，约7.5，约8.0，约8.5或约9.0。在另一个实施方案中，本发明的抗EFNA抗体的pI高于6.5，7.0，7.5，8.0，8.5或9.0。在另一 个实施方案中，引起本发明的抗体的pI改变的置换将不显著减少它们对于EFNA的结合亲和性。如下文中更详细地讨论的，特别预期了引起对于FcγR的改变的结合的Fc区域中的置换也可引起pI的变化。在优选的实施方案中，特别选择了Fc区域中的置换以实现FcγR结合的所需更改以及pI的任何所需改变。如本文中所使用的，pI值被定义为主要带电形式的pI。
g.热稳定性
还将理解，抗体的Fab结构域的Tm可以是抗体热稳定性的良好指标并且可进一步提供存架期的指示。Tm仅仅是给定结构域或序列50%解折叠的温度。较低的Tm显示较多的聚集/较少的稳定性，而较高的Tm指示较少的聚集/较多的稳定性。因此，优选具有较高Tm的抗体或片段或衍生物。此外，使用本领域中认可的技术有可能更改抗EFNA抗体或其结构域的组成以增加或优化分子稳定性。见例如，美国专利号7,960,142。因此，在一个实施方案中，所选抗体的Fab结构域具有的Tm值高于至少50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，100℃，105℃，110℃，115℃或120℃。在另一个实施方案中，抗体的Fab结构域具有的Tm值高于至少约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，约80℃，约85℃，约90℃，约95℃，约100℃，约105℃，约110℃，约115℃或约120℃。可使用本领域中已知的任何标准方法来测量蛋白质结构域(例如Fab结构域)的热熔化温度(Tm)，例如通过差示扫描量热法(见例如Vermeer等人，2000，Biophys.J.78:394-404；Vermeer等人，2000，Biophys.J.79：2150-2154，二者均在此通过引用而并入)。
VII.EFNA调节子片段和衍生物
无论本发明的试剂是包含完整的融合构建体，抗体，片段还是衍生物，所选的调节子将与EFNA反应、结合、组合、复合、连接、附着、连结、相互作用或以其它方式结合并从而提供所需的抗肿瘤效果。本领域技术人员将理解，包含抗EFNA抗体的调节子通过在所述抗体上表达的一个或多个结合位点而与EFNA相互作用或结合。更具体地，如本文中所使用的，术语结合位点包括负责选择性结合目的靶分子(例如酶，抗原，配体，受体，底物或抑制剂)的多肽区域。结合结构域包括至少一个结合位点(例如，完整的IgG抗体将具有两个结合结构域和两个结合位点)。示例性的结合结构域包括抗体可变结构域，配体的受体结合结构域，受体的配体结合结构域或酶促结构域。为了本发明的目的，典型的EFNA活性区域(例如作为Fc-EFNA融合构建体的一部分)可包括底物(例如Eph受体)的结合位点。
a.片段
无论选择所述调节子的何种形式(例如嵌合的，人源化的等)来实施本发明，将理解的是，可根据本文的教导使用其免疫反应性片段。在最广泛的意义上，术语抗体片段包括完整抗体(例如天然存在的免疫球蛋白)的至少一部分。更特别地，术语片段是指包含比完整或完全的抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链（或者在Fc融合的情形中是EFNA分子）的局部或部分。术语抗原结合片段是指结合抗原或与完整的抗体（即其所源自的完整抗体）竞争结合抗原（即特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。如本文中所使用的，术语抗体分子的片段包括抗体的抗原结合性片段，例如抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。类似地，EFNA的活性片段包含保持其与EFNA底物或受体相互作用的能力并以类似于完整EFNA的方式(虽然可能以某种程度上更低的效率)修饰它们的EFNA分子的部分。
本领域技术人员将理解，可通过化学或酶促处理完整或完全的调节子(例如抗体或抗体链)或通过重组手段获得所述片段。在这方面，虽然关于完整抗体的消化定义了各种抗体片段，本领域技术人员将理解，可化学地或通过使用重组DNA方法从新合成所述片段。因此，如本文中所使用的，术语抗体明确地包括通过修饰全抗体产生的、或通过使用重组DNA方法从新合成的抗体或其片段或衍生物。
更具体地，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段（称为Fab片段，每一个都具有单一的抗原结合位点）和剩余的Fc片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原的F(ab')2片段。Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段通过在重链CH1结构域的羧基末端添加少数残基（包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸）而不同于Fab片段。Fab'-SH是本文中对于下述的指称：其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基的Fab'。F(ab')2抗体片段原本是作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。关于其它抗体片段的更详细的描述见例如Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1999)。
还将理解，Fv片段是含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。此区域是由紧密结合（性质可以是共价的，例如在scFv中）的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体形成的。正是在这种构型中每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个CDR或其亚组赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单一的可变结构域(或仅包含三个特异于抗原的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然通常是以比整个结合位点更低的亲和力。
在其它实施方案中，抗体片段例如为下述片段：其包含Fc区域、并保留当存在于完整抗体中时通常与Fc区域相关的生物学功能中的至少一种，所述功能为例如FcRn结合，抗体半衰期调节，ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段为具有基本上类似于完整抗体的体内半衰期的单价抗体。例如此类抗体片段可包含抗原结合臂，其与能够赋予所述片段体内稳定性的Fc序列相连接。
b.衍生物
在另一个实施方案中，将进一步理解，本发明的调节子可以是单价的或多价的(例如二价的、三价的等)。如本文中所使用的，术语化 合价是指与抗体相结合的潜在靶标(即EFNA)结合位点的数目。每个靶标结合位点特异性地结合一个靶标分子或靶分子上的特定位置或部分。当本发明的抗体包含超过一个靶标结合位点时(多价)，每个靶标结合位点可特异性地结合相同或不同的分子(例如可结合不同的配体或不同的抗原，或同一抗原上的不同表位或位置)。为了本发明的目的，本发明的抗体将优选具有至少一个特异于人EFNA的结合位点。在一个实施方案中，本发明的抗体将为单价的，其中所述分子的每个结合位点将特异性结合单一EFNA位置或表位。在其它实施方案中，所述抗体将为多价的，其中它们包含超过一个结合位点并且不同的结合位点与超过单一的位置或表位特异性结合。在这种情形中，所述多个表位可存在于所选的EFNA多肽或剪接变体上，或者单一表位可存在于EFNA上而第二个不同的表位可存在于另一个分子或表面上。见例如，美国专利号2009/0130105。
如上文所述，多价抗体可免疫特异性地结合所需靶分子的不同表位或者可免疫特异性地结合靶分子和异源表位（例如异源多肽或固体支持材料）。虽然抗EFNA抗体的优选实施方案仅结合两个抗原(即双特异性抗体)，具有额外特异性的抗体（例如三特异性抗体）也被本发明所涵盖。双特异性抗体的实例包括而不限于具有抗EFNA的一个臂和抗任何其它抗原(例如调节子细胞标记物)的另一个臂的那些。用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的产生全长双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条链具有不同的特异性(Millstein等人，1983，Nature，305:537-539)。其它更复杂的相容多特异性构建体及它们的制造方法在美国专利号2009/0155255中显示。
在其它实施方案中，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列相融合。所述融合优选是与免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链，CH2和/或CH3区域的至少一部分。在一个实例中，含有轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)在所述融合物的至少一个中存在。编码免疫球蛋白重链 (以及如果需要的话，免疫球蛋白轻链)融合物的DNA被插入分开的表达载体中，并且被共转染到合适的宿主生物体中。当在构建中使用不相等比例的三条多肽链提供最佳产量时，这为调整实施方案中三个多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等的比例表达产生高产量或当比例没有特别的影响时，有可能在一个表达载体中插入两条或全部三条多肽链的编码序列。
在此方法的一个实施方案中，所述双特异性抗体是由在一个臂中具有第一结合特异性(例如EFNA4)的杂合免疫球蛋白重链和另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成的。发现了这种非对称结构促进将所需的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中分离，因为免疫球蛋白轻链仅在一半双特异性分子中存在提供了简便的分离方式。这种方法被公开在WO94/04690中。关于产生双特异性抗体的其它细节，见例如Suresh等人，1986，Methods in Enzymology，121:210。根据WO96/27011中描述的另一个方法，可工程化抗体分子对以使从重组细胞培养物中回收的异聚二聚体的百分比最大化。优选的界面包括抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用更小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大的氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上制造从相同或更小的大小至大侧链的代偿腔。这提供了用于增加异聚二聚体相对于其它不需要的终产物（例如同聚二聚体）的产率的机制。
双特异性抗体也包括交联的或异缀合物（heteroconjugate）抗体。例如，所述异缀合物中的抗体之一可与抗生物素蛋白偶联，而另一个与生物素偶联。此类抗体例如被提出使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。可通过使用任何方便的交联方法来制造异缀合物抗体。合适的交联试剂是本领域中熟知的，并且与若干交联技术一起被公开在美国专利号4,676,980中。
VIII.EFNA调节子-恒定区修饰
a.Fc区域和Fc受体
除了如上文所述的对所公开的调节子(例如Fc-EFNA或抗EFNA抗体)的可变区或结合区进行各种修饰、置换、添加或缺失外，本领域技术人员将理解，本发明的所选实施方案也可包括恒定区(即Fc区)的置换或修饰。更具体地，预期了本发明的EFNA调节子可特别含有一个或多个其它氨基酸残基置换、突变和/或修饰，这产生具有优选的特征的化合物，所述特征包括但不限于：更改的药代动力学，增加的血清半衰期，增加的结合亲和性，减少的免疫原性，增加的产生，更改的Fc配体结合，增强或降低的ADCC或CDC活性，更改的糖基化和/或二硫键以及经修饰的结合特异性。在这方面，将理解的是，这些Fc变体可有利地被用于提高所公开的调节子的有效抗肿瘤特性。
本文的术语Fc区域被用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区域和变体Fc区域。虽然免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能变化，人IgG重链Fc区域通常被定义为从位置Cys226处或Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基末端。可例如在产生或纯化抗体的过程中，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除Fc区域的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含去除了所有K447残基的抗体群，没有K447残基被去除的抗体群，以及具有含有和不含有K447残基的抗体的混合物的抗体群。功能性Fc区域具有天然序列Fc区域的效应子功能。示例性的效应子功能包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能一般要求Fc区域与结合结构域(例如抗体可变结构域)相组合并且可使用例如本文的定义中所公开的各种测定进行评估。
Fc受体FcR描述的是结合抗体的Fc区域的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的并且包括FcγRI，Fc.RII和FcγRIII亚类的受体，其中包括那些受体的等位基因变体和经可变剪接的形式。FcγII受体包括 FcγRIIA(活化受体)和FcγRIIB(抑制性受体)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(见例如Daeron，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR被综述于例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods4:25-34(1994)；and de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其它的FcR（包括未来将鉴别的那些）被本文中的术语FcR涵盖。术语Fc受体或FcR还包括新生儿的受体FcRn，其在某些情况下负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))以及调节免疫球蛋白的稳态。测量与FcRn结合的方法是已知的(见例如Ghetie和Ward.，Immunol.Today18(12):592-598(1997)；Ghetie等人，NatureBiotechnology，15(7):637-640(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hinton等人)。
b.Fc功能
如本文中所使用的，补体依赖性细胞毒性和CDC是指在补体的存在下靶细胞的裂解。补体活化通路是由补体系统的第一组分(C1q)与分子（例如与同源抗原相复合的抗体）的结合引发的。为了评估补体活化，可进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods，202:163中所描述的。
此外，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC是指一种细胞毒性的形式，其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)相结合的被分泌的Ig使得这些细胞毒性效应子细胞能够特异性地结合带有抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀伤所述靶细胞。针对靶标的特定的高亲和性IgG抗体武装细胞毒性细胞并且是所述杀伤所必须需要的。靶细胞的裂解是细胞外的，需要直接的细胞与细胞的接触并且不涉及补体。
具有更改的FcR结合亲和性或ADCC活性的EFNA调节子变体是与亲本或未经修饰的抗体或者包含天然序列Fc区的调节子相比，具有增强的或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性的那些。与亲本或未经修饰的抗体或者包含天然序列Fc区的调节子相比，显示与FcR的增强的结合的调节子变体至少以更好的亲和性结合一个FcR。与亲本或未经修饰的抗体或者包含天然序列Fc区的调节子相比，显示与FcR的减少的结合的变体至少以更差的亲和性结合一个FcR。显示与FcR的减少的结合的此类变体可具有很少的或没有明显的与FcR的结合，例如相比于天然序列IgG Fc区，0-20%的与FcR的结合，例如如通过本领域中熟知的技术所确定的。
至于FcRn，本发明的抗体也包括或涵盖具有对于恒定区的修饰的Fc变体，其在哺乳动物（优选人）中提供大于5天，大于10天，大于15天，优选大于20天，大于25天，大于30天，大于35天，大于40天，大于45天，大于2个月，大于3个月，大于4个月或大于5个月的半衰期(例如血清半衰期)。本发明的抗体（或含有Fc的分子）在哺乳动物（优选人）中的增加的半衰期引起所述抗体或抗体片段在哺乳动物中更高的血清滴度，并因此降低施用所述抗体或抗体片段的频率和/或减少待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。可通过本领域技术人员已知的技术产生具有增加的体内半衰期的抗体。例如，可通过修饰(例如置换、缺失或添加)被鉴别为参与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基(见例如国际公开号WO97/34631；WO04/029207；美国专利号6,737,056和美国专利号2003/0190311)来产生具有增加的体内半衰期的抗体。例如可在下述中测定与人FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期：例如在转基因小鼠中或表达人FcRn的经转染的人细胞系中，或施用了具有变体Fc区域的多肽的灵长类动物中。WO2000/42072描述了具有增加的或减少的与FcRn结合的抗体变体。也参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
c.糖基化修饰
在其它实施方案中，修饰了本发明的抗体的糖基化模式或组成。更具体地，本发明的优选实施方案可包括经工程化的糖型，即与包含Fc区域的分子共价连接的经更改的糖基化模式或经更改的碳水化合物组成。经工程化的糖型可被用于各种目的，这包括但不限于增强或减少效应子功能，增加抗体对靶抗原的亲和性或促进抗体的产生。在需要降低的效应子功能时，将理解的是，所述分子可被工程化从而以非糖基化的形式表达。可通过例如更改抗体序列中的一个或多个糖基化位点而实现所述碳水化合物修饰。也即，可进行引起清除一个或多个可变区框架糖基化位点的一个或多个氨基酸置换从而消除那一位点处的糖基化(见例如美国专利号5,714,350和6,350,861)。相反地，可通过一个或多个其它糖基化位点中的工程化而给予含有Fc的分子增强的效应子功能或改进的结合。
此外或备选地，可制造具有更改的糖基化组成的Fc变体，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。显示了这些和类似的经更改的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。可通过本领域技术人员已知的任何方法来产生经工程化的糖型，例如通过使用经工程化的或表达变体的菌株，通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTI11))共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区域的分子或通过在表达了包含Fc区域的分子后修饰碳水化合物。见例如Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-1，以及欧洲专利号EP1,176,195；PCT公开WO03/035835；WO99/54342，Umana等人，1999，Nat.Biotechnol17:176-180；Davies等人，20017Biotechnol Bioeng74:288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem277:26733-26740；Shinkawa等人，2003，J BiolChem278:3466-3473)美国专利号6,602,684；美国系列号10/277,370；10/113,929；PCTWO00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO02/311140A1；PCT WO02/30954A1；PotillegentTM技术(Biowa，Inc.)；GlycoMAbTM糖基化工程化技术 (GLYCART生物技术AG)；WO00061739；EA01229125；美国专利号2003/0115614；Okazaki等人，2004，JMB，336：1239-49。
IX.调节子表达
a.概述
可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来容易地分离和测序编码所需EFNA调节子的DNA。如果所述调节子为抗体的话，经分离和亚克隆的杂交瘤细胞(或源自噬菌体或酵母的集落)可作为此类DNA的优选来源。如果需要，可如本文中所描述的进一步操控所述核酸以产生包括融合蛋白、或嵌合的、人源化或全人抗体的试剂。更具体地，可使用经分离的DNA(其可被修饰)来克隆用于制造抗体的恒定和可变区序列，如美国专利号7,709,611中所描述的。
这一示例性的方法需要包括从所选的细胞提取RNA，转化为cDNA，以及使用抗体特异性引物通过PCR进行扩增。合适的引物是本领域中熟知的，并且如本文中所示例的，其可从众多商业来源容易地获得。将理解的是，为了表达通过筛选组合文库分离的重组人或非人抗体，将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体中并引入宿主细胞中，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母以及细菌。在其它实施方案中，将调节子引入不以其它方式产生所需构建体的猿猴COS细胞，NS0细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中并由其进行表达。如下文中将更详细地讨论的，可以相对大的量培养表达所需调节子的经转化的细胞，以提供融合构建体或免疫球蛋白的临床和商业供应。
无论是由噬菌体展示技术、酵母文库、基于杂交瘤的技术、合成地还是从商业来源获得或衍生出编码EFNA调节子的所需部分的核酸，将理解本发明明确地涵盖编码包括融合蛋白和抗EFNA抗体或其抗原结合性片段或衍生物的EFNA调节子的核酸分子和序列。本发明还涵盖在高严紧、或备选地在中等或较低的严紧性杂交条件下(例如如 下文中所定义的)与互补于下述核酸的多核苷酸杂交的核酸或核酸分子(例如多核苷酸)：所述核酸具有编码本发明的调节子或其片段或变体的多核苷酸序列。如本文中所使用的，术语核酸分子或分离的核酸分子意在包括至少DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选为双链DNA。此外，本发明包括任何并入了编码所述调节子的多核苷酸的媒介物或构建体，这包括而不限于载体、质粒、宿主细胞、粘粒或病毒构建体。
术语分离的核酸是指所述核酸(i)在体外被扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，(ii)通过克隆被重组地产生，(iii)被纯化，例如通过剪切和凝胶电泳分级，或(iv)被合成，例如通过化学合成。分离的核酸是可用于通过重组DNA技术操控的核酸。
更具体地，还提供了编码所述调节子的核酸，这包括本发明的抗体的一条或两条链，或者其片段、衍生物、突变蛋白或变体，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸，和前述的互补序列。所述核酸可以为任何长度。它们的长度可以是例如，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350，400，450，500，750，1000，1500，3000，5000或更多个核苷酸，和/或它们可包含一种或多种其它的序列例如调控序列，和/或为更大的核酸（例如载体）的一部分。这些核酸可以是单链的或双链的并且可包括RNA和/或DNA核苷酸，以及它们的人工变体(例如肽核酸)。编码本发明的调节子（包括抗体或其免疫反应性片段或衍生物）的核酸优选是如上文所述经分离的。
b.杂交和同一性
如所示的，本发明还提供在特定杂交条件下与其它核酸杂交的核酸。用于杂交核酸的方法是本领域中熟知的。见例如Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。为了本申请的目的，中等严紧的杂交条件使用含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.5%SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)的预清洗溶液；约50%甲 酰胺，6xSSC的杂交缓冲液和55℃的杂交温度(或其它类似的杂交条件，例如含有约50%甲酰胺的，杂交温度为42℃)，且清洗条件为60℃，在0.5xSSC，0.1%SDS中。严紧的杂交条件是在45℃下、在6xSSC中杂交，继而在68℃下、在0.1xSSC，0.2%SDS中进行一次或多次清洗。此外，本领域技术人员能够操控杂交和/或清洗条件以增加或降低杂交的严紧性，从而使包含彼此间至少65，70，75，80，85，90，95，98或99%同一的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。更一般地，为了本公开的目的，关于核酸序列的术语基本上相同可被解释为显示出与参照核酸序列有至少约85%，或90%，或95%，或97%的序列同一性的核苷酸序列。
影响选择杂交条件和指导设计合适的条件的基本参数被下列显示：例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章；和CurrentProtocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等人，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，sections2.10and6.3-6.4)，并且可以由本领域普通技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成而容易地确定。
还将理解，根据本发明，所述核酸可单独存在或与其它核酸（可以是同源或异源的）组合存在。在优选的实施方案中，核酸与相对于所述核酸可为同源或异源的表达控制序列功能性连接。在这种情境中，术语同源是指核酸也天然地与所述表达控制序列功能性连接且术语异源是指核酸天然地不与表达控制序列功能性连接。
c.表达
核酸（例如表达RNA和/或蛋白或肽的核酸）和表达控制序列彼此功能性连接，如果它们彼此共价连接的方式使得所述核酸的表达或转录在所述表达控制序列的控制或影响之下的话。如果核酸要被翻译为功能性蛋白，则随着表达控制序列与编码序列功能性相连，所述表达控制序列的诱导引起所述核酸的转录，而不引起所述编码序列的读框移位或不引起所述编码序列不能够被翻译成为所需的蛋白或肽。
术语表达控制序列根据本发明包括启动子，核糖体结合位点，增强子和调控基因转录或mRNA翻译的其它控制序列。在本发明的特定实施方案中，表达控制序列能够被调控。表达控制序列的确切结构可随着物种或细胞类型而变化，但其一般包括分别参与转录和翻译的起始的5'-非转录和5'-及3'-非翻译序列，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列等。更具体地，5'-非转录表达控制序列包含启动子区，其包括用于转录性控制功能性连接的核酸的启动子序列。表达控制序列还可包含增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语启动子或启动子区域是关于位于被表达的核酸序列上游(5')并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点而控制所述序列的表达的核酸序列。启动子区域可包括用于参与调控基因转录的其它因子的其它识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是可诱导的并可响应于诱导剂而引发转录，或者可以是组成型的（如果转录不是被诱导剂控制的话）。如果不存在诱导剂，则在可诱导的启动子控制之下的基因不被表达或者仅以小的程度表达。在诱导剂的存在下，所述基因被打开或转录水平被增加。这一般是通过特定转录因子的结合介导的。
根据本发明优选的启动子包括用于SP6，T3和T7聚合酶的启动子，人U6RNA启动子，CMV启动子，和它们的人工杂合启动子(例如CMV)，其中一部分与其它细胞蛋白（例如人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)）的基因的启动子的部分相融合，且包括或不包括其它的内含子。
根据本发明，术语表达以其最一般性的含义使用并且包含产生RNA或RNA和蛋白/肽。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可瞬时地或稳定地进行。
在优选的实施方案中，根据本发明的核酸分子存在于载体中，适当时具有启动子，所述启动子控制所述核酸的表达。术语载体在本文中以其最一般性的含义被使用并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其使得所述核酸能够例如被引入原核和/或真核细胞中并且适当的时 候被整合到基因组中。此类载体优选在细胞中被复制和/或表达。载体可包括质粒，噬菌粒，细菌噬菌体或病毒基因组。如本文中所使用的，术语质粒一般涉及染色体外遗传材料的构建体，通常是环形DNA双链体，其可独立于染色体DNA而复制。
在实施本发明时，将理解的是可任选地使用分子生物学，微生物学和重组DNA技术中的许多常规技术。此类常规技术涉及如本文中所定义的载体、宿主细胞和重组方法。这些技术是熟知的并且在例如下列中被解释：Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology volume152Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(3rd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，2000以及CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，eds.，见上。其它有用的参考文献，例如用于细胞分离和培养的(例如用于随后的核酸或蛋白质分离)包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第三版，Wiley-Liss，NewYork和其中所引用的文献；Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in LiquidSystems John Wiley&Sons，Inc.New York，N.Y.；Gamborg和Phillips(Eds.)(1995)PlantCell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(Eds.)The Handbookof Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，Fla。制造核酸的方法(例如通过体外扩增、从细胞中纯化或化学合成)，用于操控核酸的方法(例如定点诱变，通过限制酶消化，连接等)，和可用于操控及制造核酸的各种载体、细胞系等被描述于上面的参考文献中。此外，基本上任何多核苷酸(包括例如经标记的或生物素化的多核苷酸)都可从各种商业来源中的任何一种定制或标准订购。
因此，在一个方面中，本发明提供重组的宿主细胞，其允许本发明的抗体或其部分的重组表达。通过在此类重组宿主细胞中表达而产 生的抗体在本文中被称作重组抗体。本发明还提供此类宿主细胞的后代细胞，以及由其产生的抗体。
如本文中所使用的，术语重组宿主细胞(或简单地宿主细胞)是指其中被引入了重组表达载体的细胞。应当理解，重组宿主细胞和宿主细胞不仅指特定的受试细胞，还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境的影响而可在后续的世代中发生某些修饰，这种后代实际上与亲本细胞可不完全相同，但仍被包括在如本文中所使用的术语宿主细胞的范围内。此类细胞可包含如上文所定义的根据本发明的载体。
另一方面，本发明提供用于制造本文所描述的抗体或其部分的方法。根据一个实施方案，所述方法包括培养经上文所述的载体转染或转化的细胞，和取回所述抗体或其部分。
如上文所示，本发明的抗体(或其片段或变体)的表达优选包括表达含有编码所需抗EFNA抗体的多核苷酸的载体。本领域技术人员熟知的方法可被用于构建表达载体，所述载体包含抗体编码序列和适当的转录及翻译控制信号。这些方法包括例如，体外重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。因此，本发明的实施方案提供可复制的载体，其包含编码本发明的抗EFNA抗体(例如全抗体，抗体的重链或轻链，抗体的重链或轻链可变结构域，或者它们的部分，或者重链或轻链CDR，单链Fv，或者它们的片段或变体)的核苷酸序列，其可操作地与启动子相连。在优选的实施方案中，此类载体可包括编码抗体分子(或其片段)的重链的核苷酸序列，编码抗体(或其片段)的轻链、或者重链和轻链二者的核苷酸序列。
一旦本发明的核苷酸根据本文中的教导被分离和修饰，它们可被用于产生包括抗EFNA抗体或其片段的所选的调节子。
X.调节子产生和纯化
使用本领域中认可的分子生物学技术和当前的蛋白质表达方法，可产生大量所需的调节子。更具体地，如上文所述所获得和工程化的编码调节子（例如抗体）的核酸分子可被整合到熟知且商业上可得的 蛋白质生产系统中（包括各种类型的宿主细胞）以提供临床前、临床或商业用量的所需制药产品。将理解的是在优选的实施方案中，编码所述调节子的核酸分子被工程化到下述载体或表达载体中：其提供有效地整合到所选的宿主细胞中以及所需EFNA调节子随后的高表达水平。
优选地，编码EFNA调节子的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可被用于转染合适的哺乳动物，植物，细菌或酵母宿主细胞，虽然将理解的是原核系统可被用于调节子生产。转染可以是通过用于将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域中熟知的并且包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，聚凝胺介导的转染，原生质体融合，电穿孔，在脂质体中封装多核苷酸，和将DNA直接显微注射到核中。此外，可通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞中。转化哺乳动物细胞的方法是本领域中熟知的。见例如美国专利号4,399,216，4,912,040，4,740,461和4,959,455。另外，转化植物细胞的方法是本领域中熟知的，这包括例如土壤杆菌属介导的转化，生物弹转化，直接注射，电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法是本领域中熟知的。
此外，可用两种本发明的表达载体共转染宿主细胞，例如，编码源自重链的多肽的第一载体和编码源自轻链的多肽的第二载体。所述两个载体可含有使得重链和轻链多肽实质上能够相等表达的相同的可选择标记物。备选地，可使用单一载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽。在这种情形中，所述轻链优选被置于重链之前以避免过量的无毒性重链。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
a.宿主表达系统
各种宿主表达载体系统（许多是商业上可得的）与本文的教导相容并且可被用于表达本发明的调节子。此类宿主表达系统代表媒介物（目的编码序列可由其表达并随后被纯化），但是也代表细胞（当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时其可原位表达本发明的分子）。此类系统包括但不限于用含有调节子编码序列的重组噬菌体DNA、质 粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，链霉菌)；用含有调节子编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如酿酒酵母，毕赤酵母)；用含有调节子编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有调节子编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转染的植物细胞系统(例如烟草，拟南芥，浮萍，玉米，小麦，马铃薯等)；或带有含有源自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)。
在细菌系统中，可有利地选择若干表达载体，这取决于被表达的分子的所欲用途。例如，当要产生大量此类蛋白时，对于产生调节子的药物组合物，可能需要指导表达容易纯化的高水平的融合蛋白产物的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO1.2:1791(1983))，其中编码序列可与lacZ编码区同框地被单独连接到载体中从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))；等。pGEX载体也可被用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，此类融合蛋白是可溶的并且可通过吸附和结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠继而在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，而从经裂解的细胞中容易地纯化。设计了pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶剪切位点，从而所克隆的靶基因产物可从GST部分被释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可被用作载体来表达外来基因。所述病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。编码序列可被单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用若干基于病毒的表达系统来引入 所需的核苷酸序列。在使用腺病毒作为表达载体的情形中，可将目的编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物（例如晚期启动子和三联前导序列）。然后可通过体外或体内重组将这一嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如区域E1或E3)中将产生可存活且能够在被感染的宿主中表达所述分子的重组病毒(例如见Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:355-359(1984))。也可能需要特定的起始信号用于所插入的编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。此外，所述起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保整个插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，包括天然的和合成的。可通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达的效率(见例如Bittner等人，Methods in Enzymol.153:51-544(1987))。因此，可作为宿主用于表达的相容的哺乳动物细胞系是本领域中熟知的并且包括许多可从美国典型培养物收集中心(ATCC)得到的永生化细胞。这些特别包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NS0细胞，SP2细胞，HEK-293T细胞，293自由式细胞(Life Technologies)，NIH-3T3细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，非洲绿猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如HepG2)，A549细胞和若干其它细胞系。
对于长期、高产量的生产重组蛋白，优选稳定的表达。因此，可使用标准的本领域中认可的技术来工程化稳定表达所选调节子的细胞系。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，可用被适当的表达控制元件(例如启动子，增强子，序列，转录终止子，多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择的标记物转化宿主细胞。在引入外来DNA之后，可允许经工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换至选择性培养基。重组质粒中的可选择标记物赋予对选择的抗性并允许细胞将所述质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长以形成foci，其转而可被克隆和扩增成为细胞系。这种方法可有利地被用于工程化表达所述分子的细胞系。此类经工程化的细胞系在筛选和评价与所述分子直接或间接相互作用的组合物中可以是特别有用的。
若干选择系统是本领域中熟知的并且可被使用，这包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(Wigler等人，Cell11:223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell22:817(1980))基因可分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中被采用。此外，抗代谢物抗性可被用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA77:357(1980)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy12:488-505；Wu和Wu，Biotherapy3:87-95(1991))；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan，Science260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH11(5):155-215(May，1993))；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30:147(1984))。可常规地应用本领域中通常已知的重组DNA技术的方法来选择所需的重组克隆，并且这种方法被描述于例如Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；and in Chapters12and13，Dracopoli等人(eds)，Current Protocols in HumanGenetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1(1981)。将理解的是，建立稳定的、高产量细胞系的一种特别优选的方法包括谷氨酰氨合成酶基因表达系统(GS系统)，其提供有效的方法用于在某些条件下提高表达。与欧洲专利0216 846，0 256 055，0 323 997及0 338 841（其中的每一个都在此通过引用而并入）相联系而完全或部分地讨论了GS系统。
此外，可选择宿主细胞株，其调节插入的序列的表达，或者以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化) 和加工(例如剪切)对于所述蛋白的功能和/或纯化可以是重要的。不同的宿主细胞对于翻译后加工和修饰蛋白及基因产物具有特征性和特定的机制。如本领域中已知的，可选择适当的细胞系或宿主系统以确保经表达的多肽的所需修饰和加工。为此，具有用于适当加工初级转录物、糖基化、及磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞对于本发明中的应用是特别有效的。因此，特别优选的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，VERY，BHK，HeLa，COS，NS0，MDCK，293，3T3，W138以及乳腺癌细胞系，例如BT483，Hs578T，HTB2，BT2O和T47D，以及正常的乳腺细胞系，例如CRL7O3O和HsS78Bst。取决于调节子和所选的生产系统，本领域技术人员可容易地选择和优化适当的宿主细胞用于所述调节子的高效表达。
b.化学合成
除了前述宿主细胞系统外，将理解的是，可使用本领域中已知的技术(例如见Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，和Hunkapiller，M.等人，1984，Nature310:105-111)化学合成本发明的调节子。例如，可通过使用肽合成仪来合成相应于本发明的多肽片段的肽。此外，如果需要的话，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为置换或添加引入多肽序列。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-同种型，2,4-二氨基丁酸，a-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，设计者(designer)氨基酸例如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和一般性的氨基酸类似物。此外，所述氨基酸可以是D(右旋物)或L(左旋物)。
c.转基因系统
可通过产生对于目的免疫球蛋白重链和轻链序列(或者它们的片段或衍生物或变体)为转基因的哺乳动物或植物以及以可回收的形式 产生所需的化合物而转基因地生产本发明的EFNA调节子。与在哺乳动物中的转基因生产相关，可例如在山羊、牛或其它哺乳动物的乳液中生产及从其中回收抗EFNA抗体。见例如美国专利号5,827,690，5,756,687，5,750,172和5,741,957。在某些实施方案中，如上文所述，用EFNA或其免疫原性部分免疫接种包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。用于在植物中制造抗体的方法被描述于例如美国专利号6,046,037和5,959,177中。
根据本文中的教导，可通过经标准转基因技术将一个或多个编码本发明的EFNA调节子的核酸分子引入动物或植物中而产生非人转基因动物或植物。见Hogan及美国专利号6,417,429。用于制造所述转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞或受精卵。所述转基因非人生物体可以是嵌合、非嵌合杂合体以及非嵌合纯合体。见例如Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual2nd ed.，Cold Spring HarborPress(1999)；Jackson等人，Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach，Oxford University Press(2000)；和Pinkert，Transgenic Animal Technology：ALaboratory Handbook，Academic Press(1999)。在某些实施方案中，所述转基因非人动物被编码例如目的重链和/或轻链的靶向构建体靶向破坏和替换。在一个实施方案中，所述转基因动物包含和表达编码特异性结合EFNA的重链和轻链的核酸分子。虽然可以在任何转基因动物中制造抗EFNA抗体，在特别优选的实施方案中，所述非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在其它实施方案中，所述非人转基因动物在血液、乳液、尿液、唾液、泪、粘液及其它体液中表达所需的制药产品，使用本领域中认可的纯化技术可容易地从中获得所述制药产品。
由不同的细胞系或在转基因动物中表达的调节子（包括抗体）很可能彼此将具有不同的糖基化模式。然而，由本文中提供的核酸分子编码的、或包含本文所提供的氨基酸序列所有调节子都是本发明的一部分，无论所述分子的糖基化状态如何，并且更一般地，无论是否存 在翻译后修饰。此外，本发明涵盖在翻译过程中或翻译之后被差异化修饰的调节子，例如通过糖基化，乙酰化、磷酸化、酰胺化、经已知的保护性/封闭性基团衍生、蛋白水解剪切、与抗体分子或其它细胞配体连接等。众多化学修饰中的任何一种都可以通过已知的技术进行，这包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学剪切，乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下的代谢合成等。本发明还涵盖各种翻译后修饰，这包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链，N-末端或C-末端的加工，将化学部分附着至氨基酸骨架，对N-连接或O-连接的碳水化合物链进行化学修饰，以及作为原核宿主细胞表达的结果添加或缺失N-末端甲硫氨酸残基。此外，如下文的文本和实施例中所示，还可用可检测的标记物（例如酶促、荧光、放射性同位素或亲和性标记物）修饰所述多肽以允许检测和分离所述调节子。
d.纯化
一旦通过重组表达或本文中所公开的任何一种其它技术产生了本发明的调节子，可通过本领域中已知的用于免疫球蛋白纯化的任何方法、或更一般地通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术来纯化所述调节子。在这方面，所述调节子可以是分离的。如本文中所使用的，分离的EFNA调节子是从其天然环境的组分中被鉴别及分开和/或回收的调节子。其天然环境中的污染物组分是这样的物质：其将干扰所述多肽的诊断或治疗用途并且可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。分离的调节子包括在重组细胞中原位的调节子，因为所述多肽的天然环境中的至少一种组分将不存在。
当使用重组技术时，可在细胞内、在周质空间中、或直接分泌到培养基中而产生所述EFNA调节子(例如抗EFNA抗体或其衍生物或片段)。如果在细胞内产生所需的分子，作为第一步，可例如通过离心或超滤去除颗粒性碎片（宿主细胞或裂解的片段）。例如，Carter等人，Bio/Technology10:163(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的程序。简要地，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯 甲基磺酰氟(PMSF)的存在下，在约30分钟中使细胞糊状物解冻。可通过离心去除细胞碎片。当所述抗体被分泌到培养基中时，一般首先使用商业上可得的蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自所述表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂（例如PMSF）可被包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止偶然污染物的生长。
可使用例如羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析（其中亲和层析是优选的纯化技术）来纯化从细胞制备的调节子(例如fc-EFNA或抗EFNA抗体)组合物。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于存在于所选构建体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可被用于纯化基于人IgG1，IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等人，J ImmunolMeth62:1(1983))。蛋白G被推荐用于所有的小鼠同种型以及人IgG3(Guss等人，EMBO J5:1567(1986))。亲和配体所附着的基质最通常为琼脂糖，但是其它的基质是可获得的。与用琼脂糖所能实现的相比，机械上稳定的基质例如受控的孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。当所述抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体，也可使用用于蛋白质纯化的其它技术，例如在离子交换柱上分级，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅胶上层析，在肝素上层析，在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上进行琼脂糖层析，层析聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在特别优选的实施方案中，将至少部分地使用蛋白A或蛋白G亲和层析来纯化本发明的调节子。
XI.缀合EFNA调节子
一旦根据本文的教导纯化了本发明的调节子，可将它们与药学活性的或诊断性部分或生物相容的修饰物连接、融合、缀合(例如共价或非共价地)或以其它方式结合。如本文中所使用的，术语缀合物将被广泛地使用并且被认为指与所公开的调节子结合的任何分子，无论结合 的方法为何。在这方面，将理解此类缀合物可包括肽，多肽，蛋白，聚合物，核酸分子，小分子，模拟试剂，合成药物，无机分子，有机分子和放射性同位素。此外，如上文所示，所选的缀合物可与所述调节子共价或非共价连接并显示各种摩尔比，这至少部分地取决于用于实现所述缀合的方法。
在优选的实施方案中，下述将是显然的：本发明的调节子可与给予所选特征(例如生物毒素，生物标记物，纯化标签等)的蛋白，多肽或肽缀合或结合。更一般地，在所选的实施方案中，本发明涵盖与异源蛋白或多肽重组性融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)的调节子或其片段的用途，其中所述多肽包含至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，至少80，至少90或至少100个氨基酸。所述构建体不必然需要被直接连接，而是可通过连接子序列发生。例如，可使用抗体来将异源多肽靶向表达EFNA的特定细胞类型（在体外或体内），这是通过将本发明的调节子与特异于特定细胞表面受体的抗体相融合或缀合。此外，与异源多肽相融合或缀合的调节子也可被用于体外免疫测定中并且可与本领域中已知的纯化方法相容。见例如国际公开号WO93/21232；欧洲专利号EP439,095；Naramura等人，1994，Immunol.Lett.39:91-99；美国专利号5,474,981；Gillies等人，1992，PNAS89:1428-1432；和Fell等人，1991，J.Immunol.146:2446-2452。
a.生物相容调节子
在优选的实施方案中，本发明的调节子可与生物相容修饰物缀合或以其它方式结合，所述生物相容修饰物可按所需而被用于调整，更改，改进或调节调节子特征。例如，可通过附着相对高分子量的聚合物分子（例如商业上可得的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容聚合物）来产生具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域技术人员将理解，可以许多不同的分子量和分子构型获得PEG，其可被选择以给予所述抗体特定的特性(例如可定制半衰期)。可通过PEG与所述抗体或抗体片段的N或C末端的位点特异性缀合或通过存在于赖氨酸残 基上的ε-氨基基团，用或不用多功能性连接子而使PEG附着至所述调节子或抗体片段或衍生物。可使用引起生物活性最小程度丧失的线性或分支的聚合物衍生。可通过SDS-PAGE和质谱法紧密监控缀合的程度以确保PEG分子与抗体分子的最优缀合。可通过例如尺寸排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物分开。以类似的方式，可使所公开的调节子与白蛋白缀合从而使得所述抗体或抗体片段在体内更加稳定或在体内具有更长的半衰期。所述技术是本领域中熟知的，见例如国际公开号WO93/15199，WO93/15200和WO01/77137；以及欧洲专利号0413,622。其它生物相容缀合物对于本领域技术人员是明显的并且可根据本文中的教导被容易地鉴定。
b.诊断或检测试剂
在其它优选的实施方案中，本发明的调节子或其片段或衍生物与诊断性或可检测的试剂、标记物或报告子相缀合，所述诊断性或可检测的试剂、标记物或报告子可以是生物分子(例如肽或核苷酸)，小分子，荧光团或放射性同位素。经标记的调节子可被用于监控过度增生病症的发展或进展或者作为临床测试程序的一部分以确定包括所公开的调节子的特定疗法的效力(即治疗诊断)。此类标记物或报告子也可用于纯化所选的调节子，分开或分离TIC或用在临床前程序或毒理学研究中。
可通过将所述调节子与可检测的物质偶联来实现所述诊断和检测，所述可检测的物质包括但不限于：各种酶，包括例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉抗生素蛋白生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(131I，125I，123I，121I,)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115In，113In，112In，111In,)以及锝(99Tc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm， 140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru， 68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn和117Tin；使用各种正电子成像术的正电子发射金属，非放射性顺磁金属离子，以及与特定的放射性同位素放射性标记或缀合的分子。在此类实施方案中，适当的检测方法是本领域中熟知的并且可从众多商业来源中容易地获得。
如上文所示，在其它实施方案中，所述调节子或其片段可与标记物序列（例如肽或荧光团）融合以促进纯化或诊断程序（例如免疫组织化学或FAC）。在优选的实施方案中，标记物氨基酸序列是六组氨酸(SEQ ID NO：166)肽，例如pQE载体(Qiagen)中提供的标签，其中的许多是商业上可得的。例如，如Gentz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所描述的，六组氨酸(SEQ ID NO：166)提供了对于融合蛋白的方便的纯化。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签（其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell37:767)）和"flag"标签(美国专利号4,703,004)。
c.治疗性部分
如之前所述的，所述调节子或其片段或衍生物也可以与下述相缀合、结合、融合或以其它方式缔合：治疗性部分例如抗癌试剂，细胞毒素或细胞毒性试剂，例如细胞抑制或杀细胞的试剂，治疗性试剂或放射性金属离子，例如α或β发射体。如本文中所使用的，细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害且可抑制细胞生长或存活的任何试剂或治疗性部分。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类（maytansinoids）例如DM-1和DM-4(Immunogen，Inc.)、二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺，以及它们的类似物或同源物。其它的细胞毒素包括奥瑞斯他汀（auristatin），包括单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞斯他 汀F(MMAF)(Seattle Genetics，Inc.)，鹅膏蕈碱例如α鹅膏蕈碱，β鹅膏蕈碱，γ鹅膏蕈碱或ε鹅膏蕈碱(Heidelberg Pharma AG)，DNA小沟结合剂例如多卡霉素衍生物(Syntarga，B.V.)以及经修饰的吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)二聚体(PBDs，Spirogen，Ltd)。此外，在一个实施方案，本发明的EFNA调节子可与抗CD3结合分子相结合以招募细胞毒性T细胞并使它们靶向肿瘤引发细胞(BiTE technology；见例如Fuhrmann，S.等人Annual Meeting of AACR Abstract No.5625(2010)，其在此通过引用而并入)。
其它相容的治疗性部分包括细胞毒性试剂，这包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5氟脲嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴环霉素(例如柔红霉素(之前称为道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如更生霉素(之前称为放线菌素)，博来霉素，光神霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。治疗性试剂的更详尽的列表可在PCT公开WO03/075957和美国专利号2009/0155255中找到，其中的每一个都在此通过引用而并入。
所选的调节子也可与下述治疗性部分缀合：例如放射性物质或可用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂(见上文的放射性物质的实例)。在某些实施方案中，所述大环螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N'',N''-四乙酸(DOTA)，其可通过连接子分子与抗体连接。此类连接子分子是本领域中通常已知的并且被描述于Denardo等人，1998，ClinCancer Res.4:2483；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10:553；和Zimmerman等人，1999，Nucl.Med.Biol.26:943。
可与本发明的这方面相容的示例性放射性同位素包括但不限于碘(131I，125I，123I，121I,)，碳(14C)，铜(62Cu，64Cu，67Cu)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115In，113In，112In，111In,)，铋(212Bi，213Bi)，锝(99Tc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc， 186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P， 153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，117Tin，225Ac，76Br和 211At。其它的放射性核素也可用作诊断和治疗试剂，特别是在60至4,000keV的能量范围中的那些。取决于待治疗的病况和所需的治疗特性，本领域技术人员可容易地选择适当的放射性同位素以与所公开的调节子一起使用。
本发明的EFNA调节子也可与修饰给定生物学应答的治疗部分或药物(例如生物学应答调节子或BRM)相缀合。也即，与本发明相容的治疗剂或部分不应被解释为被限制为经典的化学治疗剂。例如，在特别优选的实施方案中，所述药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白或多肽或其片段。此类蛋白可包括例如，毒素例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，Onconase(或另一种细胞毒性RNA酶)，假单胞菌外毒素，霍乱毒素或白喉毒素；蛋白例如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍化生长因子，组织纤溶酶原激活剂，细胞凋亡试剂，例如TNF-α，TNF-β，AIM I(见国际公开号WO97/33899)，AIM II(见国际公开号WO97/34911)，Fas配体(Takahashi等人，1994，J.Immunol.，6:1567)和VEGI(见国际公开号WO99/23105)，血栓性试剂或抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑素；或者生物应答修饰剂，例如淋巴因子(例如白细胞介素-1(“IL-1”)，白细胞介素-2(“IL-2”)，白细胞介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，以及粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))，或生长因子(例如生长激素(“GH”))。如上文所示，用于将调节子与多肽部分融合或缀合的方法是本领域中已知的。除了之前公开的参考文献外，见例如美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851和5,112,946；EP307,434；EP367,166；PCT公开WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等人，1991，PNAS USA88:10535；Zheng等人，1995，JImmunol154:5590；和Vil等人，1992，PNAS USA89:11337，其中的每一篇都在此通过引用而并入。调节子与一个部分的结合不必然需 要是直接的，而是可通过连接子序列发生。此类连接子分子是本领域中通常已知的并且被描述于Denardo等人，1998，Clin CancerRes4:2483；Peterson等人，1999，Bioconjug Chem10:553；Zimmerman等人，1999，Nucl MedBiol26:943；Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev53:171中，其中的每一篇都在此并入。
更一般地，用于将治疗性部分或细胞毒性试剂与调节子相缀合的技术是熟知的。可通过本领域中认可的任何方法使部分与调节子相缀合，这包括但不限于醛/Schiff连接，巯基连接，酸不稳定连接，顺式乌头酸连接，腙连接，酶可降解的连接(一般性地见Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev53:171)。还参见例如Amon等人，"Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，in Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy,Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in MonoclonalAntibodies'84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Academic Press1985)，以及Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62:119。在优选的实施方案中，与治疗性部分或细胞毒性试剂相缀合的EFNA调节子在结合与细胞表面相结合的EFNA分子后可以被细胞内化，从而递送治疗性有效负荷。
XII.诊断和筛选
a.诊断
如所示的，本发明提供用于检测、诊断或监控过度增生性病症的 体外或体内方法，以及用于筛选来自患者的细胞以鉴别肿瘤发生性细胞（包括TPC）的方法。此类方法包括为了治疗或监控癌症的进展而鉴别患有癌症的个体，这包括使所述患者或从所述患者获得的样品与本文所述的所选EFNA调节子相接触，和检测调节子与结合或游离的肝配蛋白-A配体的缔合在样品中是否存在或者其水平。当所述调节子包含抗体或其免疫活性片段时，与样品中特定EFNA的结合很可能表示所述样品可含有肿瘤永存细胞(例如癌症干细胞)，显示出所述患有癌症的个体可被本文所描述的EFNA调节子有效地治疗。所述方法还可包括比较与对照相结合的水平的步骤。相反地，当所选的调节子为Fc-EFNA时，可利用和监控(直接或间接地，在体内或体外)所选的肝配蛋白-A配体与样品相接触时的结合特性以提供所需的信息。与本文中的教导相容的其它诊断或治疗诊断方法是本领域中熟知的并且可通过使用商业材料（例如专用报告系统）来实施。
在特别优选的实施方案中，本发明的调节子可被用于检测和定量患者样品(例如血浆或血液)中的EFNA水平，其转而可被用于检测、诊断或监控EFNA相关病症（包括过度增生性病症）。一个此类实施方案被显示在下文中的实施例17中，其提供检测血浆样品中的EFNA。
示例性的相容的测定方法包括放射性免疫测定，酶免疫测定，竞争性结合测定，荧光免疫测定，免疫印迹测定，蛋白质印迹分析，流式细胞术测定，和ELISA测定。更一般地，对生物学样品中的EFNA的检测或对EFNA酶促活性(或其抑制)的测量可通过使用任何本领域中已知的测定来完成。相容的体内治疗诊断或诊断可包括本领域中认可的成像或监控技术例如磁共振成像(MRI)，计算机层析成像(例如CAT扫描)，正电子层析成像(例如PET扫描)，放射显影，超声等。基于病症的病因学、病理学表现或临床进展，本领域技术人员将容易地能够识别和实施适当的检测、监控或成像技术(通常包括商业上可得的来源)。
在另一个实施方案中，本发明提供用于分析体内的癌症进展和/ 或发病机理的方法。在另一个实施方案中，对于体内癌症进展和/或发病机理的分析包括确定肿瘤进展的程度。在另一个实施方案中，分析包括肿瘤的鉴定。在另一个实施方案中，肿瘤进展的分析是在原发肿瘤上进行的。在另一个实施方案中，取决于如本领域技术人员已知的癌症类型，随时间进行分析。在另一个实施方案中，在体内分析对源自原发肿瘤的转移性细胞的继发肿瘤进行进一步的分析。在另一个实施方案中，分析了继发肿瘤的大小和形状。在一些实施方案中，进行了其它的离体分析。
在另一个实施方案中，本发明提供了分析体内的癌症进展和/或发病机理的方法，其包括确定细胞转移。在另一个实施方案中，对细胞转移的分析包括确定与原发肿瘤不连续的位点处细胞的渐进生长。在另一个实施方案中，所述细胞转移分析的位点包括肿瘤散布的路径。在一些实施方案中，细胞可通过血液血管、淋巴管、在体腔内或它们的组合散布。在另一个实施方案中，细胞转移分析是鉴于细胞迁移、散播、外渗、增殖或其组合而进行的。
在某些实例中，可在进行治疗或方案之前，使用所公开的调节子评估或表征受试者中的或来自受试者的样品中的肿瘤发生性细胞，以建立基线。在其它实例中，样品源自经治疗的受试者。在一些实例中，所述样品在受试者开始或终止治疗后至少约1，2，4，6，7，8，10，12，14，15，16，18，20，30，60，90天，6个月，9个月，12个月或>12个月取自受试者。在某些实例中，在一定数目的剂量(例如2，5，10，20，30或更多治疗剂量)之后，评估或表征所述肿瘤发生性细胞。在其它实例中，在接受一种或多种疗法后1周，2周，1个月，2个月，1年，2年，3年，4年之后表征或评估所述肿瘤发生性细胞。
另一方面，如下文中更详细地讨论的，本发明提供试剂盒，其用于检测、监控或诊断过度增生病症，对于在患者中可能的治疗所述病症或监控所述病症的进展(或消退)鉴别患有此类病症的个体，其中所述试剂盒包含如本文所述的调节子以及用于检测所述调节子对于样品的影响的试剂。
b.筛选
EFNA调节子以及包含其的细胞、培养物、群体和组合物（包括其后代）也可被用于筛选或鉴别通过与肝配蛋白-A配体(例如多肽或其遗传组分)相互作用而影响肿瘤引发细胞或其后代的功能或活性的化合物或试剂（例如药物）。因此，本发明还提供用于评价或鉴别可通过与EFNA或其底物相结合而影响肿瘤引发细胞或其后代的功能或活性的化合物或试剂的系统和方法。此类化合物和试剂可以是例如被筛选而用于治疗过度增生病症的候选药物。在一个实施方案中，系统或方法包括显示EFNA的肿瘤引发细胞和化合物或试剂(例如药物)，其中所述细胞和化合物或试剂(例如药物)彼此相互接触。
本发明还提供用于筛选和鉴别用于更改肿瘤引发细胞或后代细胞的活性或功能的EFNA调节子或试剂和化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使肿瘤引发细胞或其后代与测试试剂或化合物接触；和确定所述测试试剂或化合物是否调节结合肝配蛋白-A配体的肿瘤引发细胞的活性或功能。
群体中调节此类肿瘤引发细胞或其后代的EFNA相关活性或功能的测试试剂或化合物将所述测试试剂或化合物鉴别为活性试剂。可被调节的示例性活性或功能包括细胞形态的改变，标记物的表达，分化或去分化，成熟，增殖，存活，凋亡或细胞死亡神经祖细胞或其后代。
当关于细胞或细胞培养物或方法步骤或治疗使用时，接触是指组合物(例如肝配蛋白-A配体结合细胞或细胞培养物)与另一种所引述的实体之间的直接或间接相互作用。直接相互作用的具体实例是物理相互作用。间接相互作用的具体实例是其中组合物对中间分子起作用，而所述中间分子转而对所引述的实体（例如细胞或细胞培养物）起作用。
在本发明的这方面，调节表示以与下述相容的方式影响肿瘤引发细胞或后代细胞的活性或功能：检测对于已被确定为与本发明的肿瘤引发细胞或后代细胞的特定方面(例如转移或增殖)相关的细胞活性或功能的影响。示例性的活性和功能包括但不限于测量形态，发育标记 物，分化，增殖，存活，细胞呼吸，线粒体活性，膜完整性，或与某些病况相关的标记物的表达。因此，通过使细胞或后代细胞与化合物或试剂相接触并如本文中所公开的或本领域技术人员将知晓的测量对肿瘤引发细胞或后代细胞的活性或功能的任何调节，可评价化合物或试剂(例如药物候选物)对于肿瘤引发细胞或后代细胞的影响。
筛选和鉴别试剂和化合物的方法包括适合用于高通量筛选的那些，这包括细胞阵列(例如微阵列)，其被定位或放置，任选地是在预先确定的位置或地址。高通量自动或手动处理方法可探测化学相互作用并在短时间内确定许多基因的表达水平。开发了下述技术：其利用分子信号(例如荧光团)和以非常快的速度处理信息的自动化分析(见例如Pinhasov等人，Comb.Chem.High Throughput Screen.7:133(2004))。例如，微阵列技术被广泛地用于同时探测数千基因的相互作用，而提供关于特定基因的信息(见例如Mocellin和Rossi，Adv.Exp.Med.Biol.593:19(2007))。
此类筛选方法(例如高通量)可快速和有效地鉴别活性试剂和化合物。例如，可将细胞定位或放置(预种)于培养皿，管，摇瓶，转瓶或板(例如单一的多孔板或皿，例如8，16，32，64，96，384和1536多孔板或皿)（任选地在限定的位置）用于鉴别潜在的治疗分子。可被筛选的文库包括例如，小分子文库，噬菌体展示文库，全人抗体酵母展示文库(Adimab，LLC)，siRNA文库，和腺病毒转染载体。
XIII.药物制备物及治疗用途
a.制剂和施用途径
取决于所述调节子以及任何任选的缀合物的形式，所欲递送的模式，待治疗或监控的疾病和众多其它变量，可使用本领域认可的技术按需配制本发明的组合物。也即，在本发明的各种实施方案中，用各种药学上可接受的载体配制包含EFNA调节子的组合物(见例如Gennaro，Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts andComparisons：Drugfacts Plus，20th ed.(2003)；Ansel等 人，Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，7thed.，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd ed.，Pharmaceutical Press(2000))。各种药学上可接受的载体（这包括媒介物，佐剂，和稀释剂）可从众多商业来源容易地获得。此外，也可获得各种药学上可接受的辅助物质，例如pH调整和缓冲剂，张力调整剂，稳定剂，湿润剂等。某些非限制性的示例性载体包括盐溶液、缓冲盐溶液、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合。
更具体地，将理解的是在一些实施方案中，本发明的治疗组合物可被纯地施用或与最少的其它组分一起施用。相反地，本发明的EFNA调节子可任选地被配制为含有合适的药学上可接受的载体，其包括下述赋形剂和佐剂：它们是本领域中熟知的并且为促进所述调节子的施用或帮助将活性化合物加工成为对于递送至作用位点为药学上最优化的制备物的相对惰性的物质。例如，赋形剂可给予形式或稠度或作为稀释剂来改进所述调节子的药代动力学。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂，湿润和乳化剂，用于改变渗透性的盐，封装试剂，缓冲液和皮肤渗透增强剂。
用于系统施用的所公开的调节子可被配制为用于肠内、肠胃外或局部施用。的确，可同时使用所有三种类型的制剂以实现活性成分的系统施用。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂在下述中显示：Remington，The Science and Practice ofPharmacy20th Ed.Mack Publishing(2000)。用于肠胃外施用的合适制剂包括水溶性形式（例如水溶性盐）的活性化合物的水性溶液。此外，可施用活性化合物的混悬剂适当时用于油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂的粘性的物质并且包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，所述混悬剂也可含有稳定剂。也可使用脂质体来封装所述试剂用于递送到细胞中。
用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂（包 括包衣片剂），酏剂，混悬剂，糖浆或吸入剂，以及它们的受控释放形式。
一般地，包含EFNA调节子的本发明的化合物和组合物可在体内通过各种途径被施用于有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、心脏内、心室内、气管内、颊、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮和鞘内，或否则通过植入或吸入。本发明的组合物可被配制成为固体、半固体、液体或气体形式的制备物；这包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。可根据所欲的应用和治疗方案选择适当的制剂和施用途径。
b.剂量
类似地，具体的剂量方案（即剂量、时间和重复）将取决于特定的个体和所述个体的医疗史。经验的考虑（例如药代动力学(例如半衰期、清除速率等)）将促成对剂量的决定。可确定并在治疗过程中调整施用频率，并且其是基于减少过度增生或肿瘤性细胞（包括肿瘤引发细胞）的数目，维持此类肿瘤性细胞的减少，减少肿瘤性细胞的增殖，或延迟转移的产生。备选地，主题治疗组合物的持续连续释放制剂可以是适当的。如上文所述，用于实现持续释放的各种制剂和设备是本领域已知的。
从治疗的立场，以用于治疗或预防特定指征的有效量施用所述药物组合物。所述治疗有效量通常取决于被治疗的受试者的重量，他或她的身体或健康状况，待治疗的病况的严重性，或待治疗的受试者的年龄。一般地，可以约10μg/kg体重至约100mg/kg体重/剂量的范围内的量施用本发明的EFNA调节子。在某些实施方案中，可以约50μg/kg体重至约5mg/kg体重/剂量范围内的量施用本发明的EFNA调节子。在某些其它实施方案中，可以约100μg/kg体重至约10mg/kg体重/剂量范围内的量施用本发明的EFNA调节子。任选地，可以约100μg/kg体重至约20mg/kg体重/剂量范围内的量施用本发明的EFNA调节子。还任选地，可以约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重/剂量范 围内的量施用本发明的EFNA调节子。在某些实施方案中，提供了本发明的化合物，其以至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重的剂量被施用。
可基于身体表面积(BSA)计算来预测其它剂量方案，如美国专利号7,744,877中所公开的，在此以其全部通过引用而并入。如本领域中所熟知的，BSA是使用患者的身高和体重计算的并且提供了由他或她身体的表面积代表的患者尺寸的量度。在利用BSA的本发明的所选实施方案中，可以10mg/m2至800mg/m2的剂量施用所述调节子。在其它优选的实施方案中，将以50mg/m2至500mg/m2，甚至更优选地以100mg/m2，150mg/m2，200mg/m2，250mg/m2，300mg/m2，350mg/m2，400mg/m2或450mg/m2的剂量施用所述调节子。当然，将理解的是，无论如何计算剂量，可在所选的时间段中施用多个剂量以提供比单次施用显著更高的绝对剂量。
在任何情况下，优选按需要向有需要的受试者施用所述EFNA调节子。可由本领域技术人员（例如主治医师）基于对被治疗的病况、被治疗的受试者的年龄、被治疗的病况的严重性、被治疗的受试者的一般健康状态等的考虑确定施用频率。一般地，向受试者施用有效剂量的所述EFNA调节子一次或多次。更具体地，每月一次、每月超过一次、或每月少于一次向受试者施用有效剂量的所述调节子。在某些实施方案中，可多次施用有效剂量的所述EFNA调节子，包括至少一个月、至少六个月或至少一年的时间段。
也可在曾被给予了一次或多次施用的个体中经验性地确定用于所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体递增剂量的如本文所述产生的治疗组合物。为了评估所选组合物的效力，可如前文所述跟踪特定疾病、病症或病况的标志物。在其中个体患有癌症的实施方案中，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤的大小，通过X射线或其它成像技术间接测量肿瘤大小；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改进；测量间接肿瘤标记物(例如用于前列 腺癌的PSA)或根据本文中所述的方法鉴定的抗原，疼痛或麻痹的减少；改进的语言，视力，呼吸或与肿瘤相关的其它残疾；增加的食欲；或生命质量的增加，如通过接受的测试或存活的延长所测量的。对于本领域技术人员而言显然的是，剂量将取决于个体、肿瘤性病况的类型、肿瘤性病况的阶段、肿瘤性病况是否已经开始转移到个体中的其它位置、以及所使用的过去和现在的治疗而变化。
c.组合治疗
本发明所预期的组合治疗在下述中可以是特别有用的：减少或抑制不希望的肿瘤性细胞增殖(例如内皮细胞)，减少癌症的出现，减少或预防癌症的复发，或者减少或预防癌症的散播或转移。在这种情形中，本发明的化合物可通过去除支撑肿瘤块且使其永存的TPC(例如NTG细胞)而作为敏化剂或化学敏化剂起作用并允许更有效地使用目前的护理标准减瘤或抗癌试剂。也即，包含EFNA调节子和一种或多种抗癌试剂的组合治疗可被用于减少已建立的癌症，例如减少所存在的癌细胞的数目和/或减少肿瘤负担，或改善癌症的至少一种表现或副作用。由此，组合治疗是指施用EFNA调节子以及一种或多种抗癌试剂，其包括但不限于细胞毒性试剂，细胞抑制剂，化学治疗剂，靶向抗癌试剂，生物应答修饰剂，免疫治疗剂，癌症疫苗，抗血管生成剂，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂。
根据本发明的方法，当每种治疗(例如抗EFNA抗体和抗癌试剂)分开进行时，不要求组合的结果是所观察到的效果的加成。虽然一般至少希是加成的效果，任何超过单一疗法之一的增加的抗肿瘤效果都是有益的。此外，本发明不要求组合的治疗显示协同效果。然而，本领域技术人员将理解，使用包含优选实施方案的某些所选的组合时可观察到协同作用。
为了实施根据本发明的组合治疗，可将EFNA调节子(例如抗EFNA抗体)与一种或多种抗癌试剂相组合以在受试者中有效产生抗癌活性的方式施用给有需要的受试者。以引起它们在肿瘤环境中的组合存在以及它们的组合作用的有效量和有效时间段按需要提供所述 EFNA调节子和抗癌试剂。为了实现这一目标，可在单一的组合物中或是作为使用相同或不同施用途径的两种或更多种区别性组合物，同时向受试者施用所述EFNA调节子和抗癌试剂。
备选地，所述调节子可在所述抗癌剂治疗之前或之后，这是通过例如数分钟至数周的间隔。在某些实施方案中，其中所述抗癌剂和所述抗体被分别应用于受试者，每次递送时刻之间的时间段使得所述抗癌剂和调节子能够在肿瘤上发挥组合效果。在特定的实施方案中，预期所述抗癌剂和所述EFNA调节子在彼此的约5分钟至约两周之内被施用。
在其它实施方案中，在所述调节子和所述抗癌剂的施用之间可经过数天(2，3，4，5，6或7)，数周(1，2，3，4，5，6，7或8)或者数月(1，2，3，4，5，6，7或8)。EFNA调节子和一种或多种抗癌剂(组合治疗)可被施用一次、两次或至少一段时间直至所述病况被治疗、减轻或治愈。优选地，多次施用所述组合治疗。所述组合治疗可被施用每天三次至每六个月一次。所述施用可以按照下述计划：例如每天三次，每天两次，每天一次，每两天一次，每三天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每六个月一次，或可通过迷你泵连续施用。如之前所示，可通过口服、粘膜、颊、鼻内、可吸入的、静脉内、皮下、肌内、肠胃外、肿瘤内或局部途径施用所述组合治疗。可在远离肿瘤位点的位点施用所述组合治疗。一般只要肿瘤存在就将施用所述组合治疗，条件是所述组合治疗引起肿瘤或癌症停止生长或者重量或体积减小。
在一个实施方案中，将EFNA调节子与一种或多种抗癌试剂向有需要的受试者组合施用短的治疗周期。用抗体治疗的持续时间可根据所使用的特定抗癌剂而变化。本发明还预期分成若干部分施用的不连续施用或每日剂量。本领域技术人员将领会对于特定抗癌剂的适当治疗时间，并且本发明预期持续评估对于每种抗癌剂的最佳治疗计划。
本发明预期施用所述组合治疗至少一个周期，优选多于一个周期。本领域技术人员将领会对于一个周期的适当时间段，以及周期总数和 周期之间的间隔。本发明预期持续评估对于每种调节子和抗癌剂的最佳治疗计划。此外，本发明还提供了对所述抗EFNA抗体或抗癌剂进行多于一次施用。可隔日或隔周交替施用所述调节子和抗癌剂；或者可给予一系列的抗体治疗，继以一次或多次抗癌剂治疗。在任何情况下，如本领域技术人员将理解的，化学治疗剂的适当剂量一般将围绕在临床治疗中已经采用的那些，其中单独施用化学疗法或与其它化学疗法组合施用。
在另一个优选的实施方案中，可在维持疗法中使用本发明的EFNA调节子以减少或消除疾病的起初呈现后肿瘤复发的机会。优选地，病症将已经治疗且起初的肿瘤块被消除，减少或以其它方式被改善，从而患者无症状或在缓解期。在这种时期，可一次或多次向受试者施用药学有效量的所公开的调节子，即使使用标准的诊断程序有很少的疾病指征或者没有疾病指征。在一些实施方案中，将在一段时间中按照规律的计划施用效应子。例如，可每周、每两周、每月、每六周、每两个月、每三个月、每六个月或每年施用所述EFNA调节子。鉴于本文中的教导，本领域技术人员能够容易地确定有利的剂量和剂量方案以降低疾病复发的潜在可能。此外，此类治疗可持续数周、数月、数年的时期或甚至无限地持续，这取决于患者的反应和临床及诊断参数。
在另一个优选的实施方案中，可使用本发明的效应子来预防性地防止或减少减瘤程序之后肿瘤转移的可能性。如本公开中所使用的，减瘤程序被广义地定义且应当指消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何程序，技术或方法。示例性的减瘤程序包括但不限于手术，放射治疗(即束辐射)，化学疗法或切除。在由本领域技术人员鉴于本公开而容易地确定的适当时刻，可如临床和诊断或治疗诊断程序所建议地施用所述EFNA调节子以减少肿瘤转移。可以药学上有效的剂量（如使用标准技术所确定的）一次或多次施用所述调节子。优选地，剂量方案将伴以允许其必要时被修饰的适当的诊断或监控技术。
d.抗癌试剂
如本文中所使用的，术语抗癌剂是指可被用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何试剂，这包括细胞毒性试剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，减瘤剂，化学治疗剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌试剂，生物应答修饰剂，抗体和免疫治疗剂。将理解的是，在如上文所讨论的所选实施方案中，抗癌试剂可包括缀合物，其可在施用前与所述调节子相结合。
术语细胞毒性试剂是指减少或抑制细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质，即所述物质对于细胞是有毒性的。通常，所述物质是源自活体生物的天然存在的分子。细胞毒性试剂的实例包括但不限于小分子毒素或细菌的酶活性毒素(例如白喉毒素,假单胞菌内毒素和外毒素,葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-帚曲菌素，局限曲霉素)，植物(例如相思豆毒素，蓖麻毒素，莫迪素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐蛋白，石竹素蛋白，美国商陆蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，saponaria officinals抑制剂，gelonin，mitegellin，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素和单端孢霉烯)或动物，例如细胞毒性RNA酶，例如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括它们的片段和/或变体。
化学治疗剂是指非特异性地减少或抑制癌细胞的生长，增殖和/或存活的化合物(例如细胞毒性或细胞抑制试剂)。此类化学试剂通常涉及细胞生长或分裂所必需的细胞内过程，并因此抵抗癌细胞（其一般快速地生长和分裂）是特别有效的。例如，长春新碱使微管解聚，并因此抑制细胞进入有丝分裂。一般地，化学治疗剂可包括抑制、或被设计为抑制癌性细胞或有可能成为癌性的或产生肿瘤发生性后代(例如TIC)的细胞的任何化学试剂。此类试剂试剂通常被组合施用并且组合时通常最有效，例如在制剂CHOP中。
可与本发明的调节子组合（或缀合）使用的抗癌试剂的实例包括但不限于烷化剂，烷基磺酸盐，氮丙啶，乙撑亚胺和甲基蜜胺，多聚乙酰，喜树碱，苔藓抑素，callystatin，CC-1065，隐藻素，尾海兔素， duocarmycin，艾榴素，pancratistatin，sarcodictyin，软海绵素（spongistatin），氮芥类，抗生素，烯二炔类抗生素，达内霉素，二磷酸盐，埃斯培拉霉素，色蛋白烯二炔抗生素生色团，阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，cactinomycin，carabicin，洋红霉素，嗜癌霉素，chromomycinis，更生霉素，道诺霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，榄霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，quelamycin，rodorubicin，链黑菌，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物，叶酸类似物，嘌呤类似物，雄激素，抗肾上腺，叶酸补充剂例如frolinicacid，醋葡醛内酯，醛磷酰胺糖苷，氨基乙酰丙酸，恩尿嘧啶，安吖啶，bestrabucil，比生群，edatraxate，defofamine，地美可辛，亚丝醌，elfornithine，依利醋铵，埃博霉素，依托格鲁，硝酸镓，羟基脲，香菇多糖，lonidainine，登木素生物碱，米托胍腙，米托蒽醌，mopidanmol，nitraerine，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，洛索蒽醌，足叶草酸，2-乙基酰肼，甲基苄肼，多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)，雷佐生;根霉素;西佐喃;锗螺胺;细交链孢菌酮酸;2,2',2"-三氯代三乙胺；单端孢霉烯族毒素（尤其是T-2毒素，verracurin A，漆斑菌素A和anguidine）;尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺，噻替派;紫杉烷类，苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，长春碱；铂；依托泊苷（VP-16），异环磷酰胺，米托蒽醌，长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；正定霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)，拓扑异构酶抑制剂RFS2000；difluorometlhylornithine(DMFO);类视黄醇;卡培他滨;康普立停;亚叶酸(LV），奥沙利铂;减少细胞增殖的PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR 和VEGF-A的抑制剂，以及上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在此定义中的是调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素试剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节子(SERM)，抑制酶芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生，和抗雄激素；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸；核糖体酶例如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素（Esperamicins），以及上述任意的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其它的实施方案包括使用已被批准用于癌症治疗的抗体这包括但不限于利妥昔单抗，曲妥珠单抗，吉妥珠单抗奥唑米星，阿仑单抗，替伊莫单抗，托西莫单抗,贝伐单抗，西妥昔单抗，patitumumab，奥法木单抗，伊匹单抗和brentuximab vedotin。本领域技术人员将能够容易地鉴别与本文的教导相容的其它抗癌试剂。
e.放射疗法
本发明还提供EFNA调节子与放射治疗(即在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ辐射，X射线，UV辐射，微波，电子发射等)的组合。也预期了使用向肿瘤细胞定向递送放射性同位素的组合疗法，并且其可与靶向抗癌剂或其它靶向手段结合使用。通常，在约1至约2周的时间段中以脉冲施用放射治疗。可向患有头颈癌的受试者施用所述放射治疗约6至7周。任选地，所述放射治疗可作为单一剂量或作为多次、顺次计量被施用。
f.肿瘤性病况
无论是单独施用还是与抗癌剂或放射疗法组合施用，本发明的EFNA调节子对于一般性地治疗下述患者或受试者中的肿瘤性病况是特别有用的，所述患者或受试者可包括良性或恶性肿瘤(例如肾脏，肝，肾，膀胱，乳腺，胃，卵巢，结肠直肠，前列腺，胰腺，肺，甲状腺，肝癌；肉瘤；恶性胶质瘤；以及各种头颈肿瘤)；白血病和淋巴恶性肿瘤；其它病症，例如神经，神经胶质，星形胶质细胞，下丘脑和其它 腺体，巨噬细胞，上皮，间质和囊胚腔病症；以及感染性，血管生成性，免疫性病症和由病原体引起的病症。用于用本发明的治疗组合物和方法治疗的特别优选的靶标为包括实体肿瘤的肿瘤性病况。在其它优选的实施方案中，本发明的调节子可被用于血液恶性肿瘤的诊断、预防或治疗。优选地，待治疗的受试者或患者将是人，虽然如本文中所使用的，所述术语被明确地认为包括任何哺乳动物物种。
更具体地，经受根据本发明的治疗的肿瘤病况可选自包括但不限于下述的组：肾上腺肿瘤，AIDS-相关癌症，腺泡状软组织肉瘤，星形细胞肿瘤，膀胱癌(鳞状细胞癌和过渡性细胞癌)，骨癌（釉质瘤，动脉瘤样骨囊肿，骨软骨瘤，骨肉瘤），脑和脊椎癌，转移性脑肿瘤，乳腺癌，颈动脉体肿瘤，宫颈癌，软骨肉瘤，脊索瘤，肾嫌色细胞癌，透明细胞癌，结肠癌，结肠直肠癌，皮肤良性纤维组织细胞瘤，促纤维增生性小圆细胞瘤，室管膜瘤，尤文氏肿瘤，骨外黏液样软骨肉瘤，骨纤维生成不良，骨纤维结构发育不良，胆囊和胆道癌，妊娠滋养细胞疾病，生殖细胞肿瘤，头颈癌，胰岛细胞肿瘤，卡波西肉瘤，肾癌（肾母细胞瘤，乳头状肾细胞癌），白血病，脂肪瘤/良性脂肪性肿瘤，脂肉瘤/恶性脂肪性肿瘤，肝癌（肝母细胞瘤，肝细胞癌），淋巴瘤，肺癌（小细胞癌，腺癌，鳞状细胞癌，大细胞癌等），髓母细胞瘤，黑色素瘤，脑膜瘤，多发性内分泌瘤形成，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，神经母细胞瘤，神经内分泌肿瘤，卵巢癌，胰腺癌，甲状腺乳头状癌，甲状旁腺肿瘤，儿科癌症，外周神经鞘肿瘤，嗜铬细胞瘤，垂体肿瘤，前列腺癌，posterious unveal melanoma，罕见的血液病症，肾转移性癌，横纹肌样瘤，rhabdomysarcoma，肉瘤，皮肤癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，胃癌，滑膜肉瘤，睾丸癌，胸腺癌，胸腺瘤，甲状腺转移癌，子宫癌（子宫颈癌，子宫内膜癌，子宫肌瘤）。在某些优选的实施方案中，癌变细胞选自实体肿瘤，包括但不限于乳腺癌，非小细胞肺癌（NSCLC），小细胞肺癌，胰腺癌，结肠癌，前列腺癌，肉瘤，肾转移癌，甲状腺转移性癌和透明细胞癌。
关于血液恶性肿瘤，还将理解本发明的化合物和方法在治疗各种 B细胞淋巴瘤中可以是特别有效的，这包括低级/NHL滤泡细胞淋巴瘤（FCC），套细胞淋巴瘤（MCL），弥漫性大细胞淋巴瘤（DLCL），小淋巴细胞（SL）NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级免疫母细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小无裂细胞NHL，大肿块疾病NHL，华氏巨球蛋白血症，淋巴浆细胞样淋巴瘤（LPL），套细胞淋巴瘤（MCL），滤泡性淋巴瘤（FL），弥漫性大细胞淋巴瘤（DLCL），伯基特淋巴瘤（BL），AIDS相关淋巴瘤，单核细胞B细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性淋巴结肿大，小淋巴细胞，滤泡性，弥漫性大细胞，弥漫性小裂细胞，大细胞免疫母细胞淋巴细胞瘤，小，无裂，伯基特和非伯基特，滤泡，主要是大型细胞；滤泡，主要是小裂细胞；和滤泡，混合的小裂及大细胞淋巴瘤。见Gaidono等人，"Lymphomas"，IN CANCER：PRINCIPLES&PRACTICE OF ONCOLOGY，Vol.2：2131-2145(DeVita等人，eds.，5.sup.th ed.1997)。对本领域技术人员将是清楚的是，由于分类系统的改变这些淋巴瘤将通常具有不同的名称，并且患有根据不同的名称分类的淋巴瘤的患者也可受益于本发明的组合治疗方案。
在其它优选的实施方案中，所述EFNA调节子可被用于有效地治疗某些骨髓和血液恶性肿瘤，这包括白血病，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL或B-CLL)。CLL主要是老年人的疾病，其发病率在年龄为五十岁之后开始增加并且在近七十岁时到达峰值。其一般包括肿瘤性外周血淋巴细胞的增殖。CLL的临床发现包括淋巴细胞增多，淋巴结病，脾肿大，贫血和血小板减少。CLL的特征是单克隆B细胞增殖和被阻止在分化的中间状态的B-淋巴细胞的积聚，其中所述B细胞表达表面IgM(sIgM)或sIgM和sIgD二者，以及密度比正常B细胞上的密度低的单一轻链。然而，如上文中所讨论的和所附的实施例中所示的，所选的EFNA表达(例如EFNA)在B-CLL细胞上被上调从而为所公开的调节子提供有吸引力的靶标。
本发明还提供对呈现良性或癌症前期肿瘤的受试者的防止性或预防性治疗。不认为任何特定的肿瘤或肿瘤性病症类型应当从使用本发 明进行的治疗中被排除。然而，肿瘤细胞的类型可与将本发明与第二治疗剂（特别是化学治疗剂和靶向抗癌试剂）组合使用相关。
本发明的其它优选实施方案包括使用EFNA调节子来治疗患有实体肿瘤的受试者。在这些受试者中，许多这些实体肿瘤包含显示出各种遗传突变的组织，所述遗传突变可使得所述组织特别易受用所公开的效应子进行的治疗的影响。例如，KRAS，APC和CTNNB1及CDH1突变在患有结肠直肠癌的患者中相对常见。此外，患有具有这些突变的肿瘤的患者通常对目前的疗法最为顽固；特别是具有KRAS突变的那些患者。KRAS活化突变（其通常引起单氨基酸置换）也在其它难以治疗的恶性肿瘤中被牵涉，这包括肺腺癌，粘液腺癌和胰腺的导管癌。
目前，对于结肠直肠癌患者是否将响应于EGFR或VEGF抑制性药物的最可靠的预测是例如测试某些KRAS“活化”突变。KRAS在35-45%的结肠直肠癌中被突变，并且其肿瘤表达突变的KRAS的患者不很好地响应于这些药物。例如，KRAS突变预示着在结肠直肠癌中缺乏对帕尼单抗和西妥昔单抗治疗的应答(Lievre等人Cancer Res66:3992–5；Karapetis等人NEJM359:1757-1765)。大约85%患有结肠直肠癌的患者在APC基因中具有突变(Markowitz&Bertagnolli.NEJM361:2449-60)，并且在患有家族性腺瘤息肉病和结肠直肠癌的患者中表征了超过800种APC突变。这些突变中的大多数产生具有降低的介导破坏β连环蛋白的功能性能力的截短的APC蛋白。β连环蛋白基因中的突变CTNNB1也能引起所述蛋白的增加的稳定性，这引起核输入和随后对数个致癌转录程序的活化，这也是由经突变的APC不能适当地介导β连环蛋白破坏（这是保持正常的细胞增殖和分化程序受控制所需的）而引起的致癌基因的机制。
失去CDH1(E-钙粘素)表达是结肠直肠癌中的另一个常见的事件，这通常在所述疾病的更晚期阶段被观察到。E-钙粘素是连接和组织上皮层中的细胞的粘附连接的中心成员。通常，E-钙粘素物理地螯合质膜处的β连环蛋白(CTNNB1)；在结肠直肠癌中失去E-钙粘素的表达 引起β连环蛋白位于核处和β连环蛋白/WNT通路的转录激活。异常的β连环蛋白/WNT信号传导是致癌的中心并且癌症的干性（stemness）中牵涉到了核β连环蛋白(Schmalhofer等人，2009PMID19153669)。EphA2（上皮细胞中EFNA配体的已知结合伴侣）的表达和功能需要E-钙粘素(Dodge Zantek等人，1999PMID10511313；Orsulic S和Kemler R，2000PMID10769210)。使用结合EFNA配体并且激动或拮抗Eph受体结合的调节子可修饰，中断或回复原致癌过程。备选地，EFNA调节子可基于EFNA调节子的结合优先性而优先结合具有异常的Eph/肝配蛋白相互作用的肿瘤细胞。因此，患有携带上述遗传特点的癌症的患者可受益于用前述EFNA调节子进行的治疗。
XIV.制品
提供了包括一个或多个包含一个或多个剂量的EFNA调节子的容器的药物包和试剂盒。在某些实施方案中，提供了单位剂量，其中所述单位剂量含有预先确定量的包含例如抗EFNA抗体的组合物，含有或不含一种或多种其它的试剂。对于其它的实施方案，以用于注射的单次使用预装注射器供应此种单位剂量。在其它的实施方案中，包含在所述单位剂量中的组合物可含有盐水、蔗糖等；缓冲剂，例如磷酸盐等；和/或在稳定且有效的pH范围内被配制。备选地，在某些实施方案中，所述组合物可被提供为冻干的粉末，其可在加入适当的液体（例如无菌水）后被重构。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含一种或多种抑制蛋白聚集的物质，这包括但不限于蔗糖和精氨酸。所述容器上或与之结合的任何标签指示所含的组合物用于诊断或治疗所选择的的病况。
本发明还提供试剂盒，其用于产生EFNA调节子的单剂量或多剂量施用单位以及任选地，一种或多种抗癌试剂。所述试剂盒包含容器以及所述容器上或与之结合的标签或说明书。合适的容器包括例如，瓶子、小管、注射器等。所述容器可由各种材料形成，例如玻璃或塑 料。所述容器承载有效治疗所述病况的组合物并且可具有无菌接触端口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。此类试剂盒将一般地在适当的容器中含有所述EFNA调节子的药学上可接受的制剂，和任选地在相同或不同的容器中含有一种或多种抗癌试剂。所述试剂盒还可含有其它药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的EFNA调节子之外，所述试剂盒可含有一系列抗癌试剂（例如化学治疗或放射治疗药物）中的任意一种或多种；抗血管生成剂；抗转移试剂；靶向抗癌试剂；细胞毒性试剂；和/或其它抗癌试剂。此类试剂盒也可提供适当的试剂用于将所述EFNA调节子与抗癌剂或诊断剂相缀合(例如见美国专利号7,422,739，在此以其全部通过引用而并入)。
更具体地，所述试剂盒可具有含有所述EFNA调节子的单一的容器，其含有或不含有其它组分，或者所述试剂盒可具有不同的容器用于每一种所需的试剂。当提供组合治疗用于缀合时，单一的溶液可经预混合，这是以摩尔等量组合或者以一种组分超过其它组分。备选地，在向患者施用前，所述EFNA调节子与所述试剂盒的任何任选的抗癌剂可在不同的容器内被分开保存。所述试剂盒还可包含第二/第三容器工具用于含有无菌的、药学上可接受的缓冲剂或其它稀释剂，例如用于注射的抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲液(PBS)，Ringer's溶液和右旋糖溶液。
当在一种或多种液体溶液中提供所述试剂盒的组分时，所述液体溶液优选为水性溶液，特别优选的是无菌水性溶液。然而，所述试剂盒的组分可作为干燥的粉末被提供。当所述试剂或组分作为干燥粉末被提供时，可通过加入合适的溶剂来重构所述粉末。预期了所述溶剂也可在另一个容器中被提供。
如上文中所简要显示的，所述试剂盒也可含有介由其向动物或患者施用所述抗体和任何任选组分的工具，例如一个或多个针或注射器，或甚至滴眼管，移液管或其它此类装置，由其可将制剂注射到或引入到动物中或应用至患病的身体区域。本发明的试剂盒还将通常包括将 小管之类以及其它组分包含在封闭的限定空间中用于商业出售的工具，例如其中放置和保留了所需的小瓶和其它装置的注射或吹模塑料容器。任何标签或说明书表明所述EFNA调节子组合物是用于治疗癌症，例如结肠直肠癌。
XV.研究试剂
本发明的其它优选的实施方案还利用所公开的调节子的特性作为可用于通过例如荧光活化细胞分选(FACS)，磁活化细胞分选(MACS)或激光介导的分级来鉴别、分离、分级或富集肿瘤引发细胞群或亚群的手段。本领域技术人员将理解，所述调节子可被用于数种相容的技术中用于表征和操纵TIC，包括癌症干细胞(例如见美国系列号12/686,359，12/669,136和12/757,649其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入)。
XVI.杂项
除非本文中另有定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数且复数术语应当包括单数。更具体地，如本说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一个（an）”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文清楚地另有所指。因此，例如指代“蛋白”包括蛋白的复数；指代“细胞”包括细胞的混合物等。此外，本说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点以及端点之间的所有点。因此，2.0至3.0的范围包括2.0，3.0和2.0与3.0之间的所有点。
一般地，与本文中所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白及核酸化学以及杂交技术相关而使用的命名是本领域中熟知且通常所使用的那些。除非另行指出，本发明的方法和技术一般是根据本领域中熟知的常规方法以及如贯穿本说明书所引用和讨论的各种一般性及更具体的参考文献中所描述的来进行 的。见例如Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，John&Sons，Inc.(2002)；Harlow and LaneUsing Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1998)；和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons，Inc.(2003)。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明进行的，如本领域中所通常实现的或如本文中所描述的。与本文中所描述的分析化学，合成有机化学及医疗和药物化学实验室程序和技术相关所使用的命名是本领域中所熟知和通常所使用的。
本说明书中所公开或引用的所有参考文献或文件在此不受限制地以其全部通过引用而并入。此外，本文中所使用的任何部分标题仅是为了组织的目的且不应被解释为限制所描述的主题。
实施例
因此，通过参考下面的实施例将更容易地理解上文中一般性地描述的本发明，所述实施例是以阐释的方式提供的且不意在限制本发明。所述实施例不意在表示下面的实验是所有且仅进行的实验。除非另行指出，部分是重量部分，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，且压力为大气压或接近大气压。
实施例1
肿瘤引发细胞群的富集
为了表征实体肿瘤的细胞异质性（如它们在癌症患者中存在），使用特定的表型标记物阐明肿瘤永存细胞(TPC；即癌症干细胞：CSC)的标识，并鉴别临床相关的治疗靶标，使用本领域中所认可的技术开发和维持了大型非传统异种移植物(NTX)肿瘤库。所述NTX肿瘤库（包含许多分立的肿瘤细胞系）是通过起初从受到各种恶性实体肿瘤 折磨的众多癌症患者获得的异质肿瘤细胞的多次传代而在免疫受损的小鼠中繁殖的。可持续获得具有明确的细胞谱系的许多分立的早期传代NTX肿瘤细胞系极大地促进了TPC的鉴别和分离，因为它们允许对从所述细胞系纯化的细胞进行可再现的和重复的表征。更具体地，根据它们在小鼠中产生表型和形态上异质的肿瘤（其重现细胞所源自的患者肿瘤样品）的能力追溯性地最准确地定义所分离或纯化的TPC。因此，使用小的分离细胞群来在小鼠中产生完全异质的肿瘤的能力强烈地表明了所述分离的细胞包含TPC的事实。在这一工作中，使用经最少传代的NTX细胞系极大地简化了体内实验并且提供可容易地验证的结果。此外，NTX肿瘤的早期传代也响应于治疗剂例如伊立替康(即)，这提供了对于驱使肿瘤生长、对目前疗法的抗性和肿瘤复发的根本机制的临床相关的洞察。
当建立了NTX肿瘤细胞系时，使用流式细胞术分析了构成的肿瘤细胞表型以鉴别可被用于表征、分离、纯化或富集肿瘤引发细胞(TIC)以及分离或分析此类群体中的TPC和TProg细胞的分立的标记物。在这方面，发明人采用了基于蛋白质组学的专有权平台(即PhenoPrintTM阵列)，其提供基于蛋白表达的快速细胞表征以及相伴的对潜在有用的标记物的鉴别。PhenoPrint阵列是专有权的蛋白质组学平台，其包含数百个分立的结合分子，许多是从商业来源获得的，它们被排列在96孔板中，其中每个孔含有藻红蛋白荧光通道中的区别性抗体和排列在所述板上每孔中的不同荧光染料中的多种其它抗体。这允许了通过经由非藻红蛋白通道快速包括相关细胞或清除不相关细胞而确定所选的肿瘤细胞亚群中目的抗原的表达水平。当将所述PhenoPrint阵列与本领域中熟知的组织解离，移植和干细胞技术组合使用时(Al-Hajj等人，2004，Dalerba等人，2007和Dylla等人，2008，均见上，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入)，有可能有效地鉴别相关的标记物并随后以很高的效率分离和移植特定的人肿瘤细胞亚群。
因此，在严重免疫受损的小鼠中建立了各种NTX肿瘤细胞系（如 对于人肿瘤所通常进行的）后，在达到800-2,000mm3后从小鼠中切除所述肿瘤，并使用本领域中认可的酶促消化技术(见例如美国专利号2007/0292414，在此将其并入)使细胞解离成为单细胞悬浮物。使用所述PhenoPrint阵列从这些悬浮物获得的数据在逐个细胞的基础上提供了绝对(每个细胞)和相对(相对于群体中的其它细胞)的表面蛋白表达，引起对细胞群更复杂的表征和层次化。更具体地，使用PhenoPrint阵列允许了快速鉴别蛋白或标记物，其预期性地将TIC或TPC与NTG大块肿瘤细胞及肿瘤基质区分开，并且当从NTX肿瘤模型中分离时，所述蛋白或标记物提供相对快速的对表达不同水平的特定细胞表面蛋白的肿瘤细胞亚群的表征。特别地，在肿瘤细胞群中异质性表达的蛋白允许分离表达高和低水平的特定蛋白或标记物的不同的且高度纯化的肿瘤细胞亚群并将其移植到免疫受损的小鼠中，从而促进评估TPC是否在一个亚群或另一个亚群中富集。
术语富集与分离细胞同义地使用，并且是指与起始或起初的细胞群相比，一种类型的细胞产率（部分）增长超过了其它细胞类型的部分。优选地，富集是指与起始的细胞群相比，细胞群中一种类型的细胞增加的百分比为约10%，约20%，约30%，约40%，约50%或大于50%。
如本文中所使用的，在细胞或组织的情境中，标记物是指可鉴别地缔合或特异性结合在特定细胞、细胞群或组织之中或之上的化学或生物学实体形式的任何特征，这包括在受疾病或病症影响的组织或细胞群之中或之上鉴别的那些。如所显现的，标记物在性质上可以是形态性、功能性或生物化学的。在优选的实施方案中，所述标记物是细胞表面抗原，其被特定的细胞类型（例如TPC）或某些条件下的细胞(例如在细胞生命周期的特定点中或特定小生境的细胞中)差异性或优先表达。优选地，此类标记物为蛋白，并且更优选地，其具有用于抗体、适配子或本领域中已知的其它结合分子的表位。然而，标记物可由在细胞表面上或细胞之内发现的任何分子组成，这包括但不限于蛋白(肽和多肽)，脂，多糖，核酸和类固醇。形态标记物特征或特性的 实例包括但不限于形状，大小及核与胞质的比例。功能性标记物特征或特性的实例包括但不限于附着至特定基质的能力，掺入或排除特定染料（例如但不限于排除亲脂性染料）的能力，在特定条件下迁移的能力以及沿着特定的谱系分化的能力。标记物也可以是由报告子基因表达的蛋白，例如细胞所表达的报告子基因，其是由将编码所述报告子基因的核酸序列引入细胞以及引起产生可被用作标记物的报告子蛋白的其转录产生的。可被用作标记物的所述报告子基因为例如但不限于荧光蛋白酶，染色粒蛋白，抗性基因等。
在相关的意义中，在组织、细胞或细胞群的情境中，术语标记物表型(例如稳定的TPC表型)是指可被用于表征、鉴别、分开、分离或富集特定细胞或细胞群(例如通过FACS)的任何标记物或标记物的组合。在特定的实施方案中，所述标记物表型是可通过检测或鉴别细胞表面标记物组合的表达而确定的细胞表面表型。
本领域技术人员将认可，已将众多标记物(或其不存在)与癌症干细胞的各种群体相关联并用于分离或表征肿瘤细胞亚群。在这方面，示例性的癌症干细胞标记物包括OCT4，Nanog，STAT3，EPCAM，CD24，CD34，NB84，TrkA，GD2，CD133，CD20，CD56，CD29，B7H3，CD46，转铁蛋白受体，JAM3，羧肽酶M，ADAM9，制瘤素M，Lgr5，Lgr6，CD324，CD325，巢蛋白，Sox1，Bmi-1，eed，easyh1，easyh2，mf2，yy1，smarcA3，smarckA5，smarcD3，smarcE1，mllt3，FZD1，FZD2，FZD3，FZD4，FZD6，FZD7，FZD8，FZD9，FZD10，WNT2，WNT2B，WNT3，WNT5A，WNT10B，WNT16，AXIN1，BCL9，MYC，(TCF4)SLC7A8，IL1RAP，TEM8，TMPRSS4，MUC16，GPRC5B，SLC6A14，SLC4A11，PPAP2C，CAV1，CAV2，PTPN3，EPHA1，EPHA2，SLC1A1，CX3CL1，ADORA2A，MPZL1，FLJ10052，C4.4A，EDG3，RARRES1，TMEPAI，PTS，CEACAM6，NID2，STEAP，ABCA3，CRIM1，IL1R1，OPN3，DAF，MUC1，MCP，CPD，NMA，ADAM9，GJA1，SLC19A2，ABCA1，PCDH7，ADCY9，SLC39A1，NPC1，ENPP1，N33，GPNMB，LY6E，CELSR1，LRP3， C20orf52，TMEPAI，FLVCR，PCDHA10，GPR54，TGFBR3，SEMA4B，PCDHB2，ABCG2，CD166，AFP，BMP-4，β-连环蛋白，CD2，CD3，CD9，CD14，CD31，CD38，CD44，CD45，CD74，CD90，CXCR4，核心蛋白聚糖，EGFR，CD105，CD64，CD16，CD16a，CD16b，GLI1，GLI2，CD49b和CD49f。见例如，Schulenburg等人，2010，PMID：20185329，美国专利号7,632,678和美国专利号2007/0292414，2008/0175870，2010/0275280，2010/0162416和2011/0020221，其中的每一篇都在此通过引用而并入。将理解的是，许多这些标记物被包括在上文所述的PhenoPrint阵列中。
类似地，与某种肿瘤类型的癌症干细胞相关的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44hiCD24low，ALDH+，CD133+，CD123+，CD34+CD38-，CD44+CD24-，CD46hiCD324+CD66c-，CD133+CD34+CD10-CD19-，CD138-CD34-CD19+，CD133+RC2+，CD44+α2β1 hiCD133+，CD44+CD24+ESA+，CD271+，ABCB5+，以及本领域中已知的其它癌症干细胞表面表型。见例如，Schulenburg等人，2010，见上，Visvader等人，2008，PMID：18784658和美国专利号2008/0138313，其中的每一篇都在此以其全部通过引用而并入。本领域技术人员将理解，标记物表型（例如上面所列举的那些）可与标准流式细胞计数分析和细胞分选技术结合使用以表征、分离、纯化或富集TIC和/或TPC细胞或细胞群用于进一步的分析。关于本发明感兴趣的是，CD46，CD324和任选地CD66c在许多人结肠直肠(“CR”)，乳腺(“BR”)，非小细胞肺(NSCLC)，小细胞肺(SCLC)，胰腺(“PA”)，黑素瘤(“Mel”)，卵巢(“OV”)，和头颈癌(“HN”)肿瘤细胞的表面上高度或异质性地表达，无论被分析的肿瘤样本是原发患者肿瘤样本还是源自患者的NTX肿瘤。
具有阴性表达(即“-”)的细胞在本文中被定义为下述细胞：在其它荧光发射通道中标记其它目的蛋白的完全抗体染色混合物的存在下，其表达小于或等于在荧光通道中用同种型的对照抗体所观察到的表达的百分之95。本领域技术人员将理解，用于定义阴性事件的这一程序 被称作“荧光减一”或“FMO”染色。使用上述FMO染色程序，表达大于用同种型对照抗体所观察到的表达的百分之95的细胞在本文中被称为“阳性”(即”+”)。如本文中所定义的，有各种细胞群被广泛地定义为“阳性”。首先，具有低表达的细胞(即“lo”)一般被定义为下述细胞：对其所观察到的表达为使用FMO染色以同种型对照抗体确定的表达的百分之95以上并且在使用上文所述的FMO染色程序、用同种型对照抗体观察到的表达的百分之95的一个标准偏差之内。具有“高”表达的细胞(即“hi”)可被定义为下述细胞：对其所观察到的表达为使用FMO染色以同种型对照抗体确定的表达的百分之95以上并且为使用上文所述的FMO染色程序、用同种型对照抗体观察到的表达的百分之95之上一个标准偏差以上。在其它实施方案中，可优选地使用百分之99作为阴性和阳性FMO染色之间的确定点并且在特别优选的实施方案中，所述百分比可为大于99%。
使用例如上文所述的技术，基于在来自结肠直肠癌患者的数个NTX肿瘤间的表达强度和异质性来快速鉴别结肠直肠肿瘤抗原并对其进行排序，并通过将肿瘤与正常的相邻组织进行比较然后至少部分地基于恶性细胞中特定抗原的上调或下调来进行选择而进一步评估候选TPC抗原。此外，就其提高向小鼠移植完全异质的肿瘤的能力(即肿瘤发生性能力)的能力对各种细胞表面标记物进行系统分析并随后将这些标记物进行组合，这显著改进了所述方法的分辨率并改进了定制荧光活化细胞分选(FACS)技术来鉴别和表征不同的、高度富集的肿瘤细胞亚群的能力，所述肿瘤细胞亚群在移植后唯独地含有所有的肿瘤发生能力(即肿瘤引发细胞)。为了重申，术语肿瘤引发细胞(TIC)或肿瘤发生性(TG)细胞涵盖肿瘤永存细胞(TPC；即癌症干细胞)和高度增殖的肿瘤祖细胞(TProg)，其一般共同构成大块肿瘤或团块的独特亚群(即0.1-25%)；其特征在上文中定义。以这种方式表征的大部分肿瘤细胞缺乏这种肿瘤形成能力，并因此可被表征为非肿瘤发生性(NTG)。令人惊讶地，观察到了使用专有权PhenoPrint阵列所鉴别的大多数区别性标记物不显示富集结肠直肠肿瘤中的肿瘤引发细胞群的 能力（当使用标准的FACS方案时），而区别性标记物组合可被用于鉴别肿瘤引发细胞的两个亚群：TPC和TProg。本领域技术人员将认识到，TPC和TProg之间的决定性区别（虽然二者在原发移植物中均为肿瘤引发性的）在于TPC在以低细胞数进行一系列移植之后永久地激起肿瘤生长的能力。此外，虽然其他人定义了可类似地被用于富集肿瘤发生性细胞的细胞表面标记物或酶促活性(Dylla等人2008，见上)，在当前发明人的发现之前并不已知被组合使用以富集TPC和TProg的标记物/蛋白与任何组织或肿瘤中含有此类活性的细胞相关。如下文中所示，然后使用全转录组下一代测序来分析使用上文所述的细胞表面标记物组合分离的特定肿瘤细胞亚群，以鉴别和表征差异性表达的基因。
实施例2
分离和分析来自富集的肿瘤引发细胞群的RNA样品
如实施例1中所述经产生和传代的数个已建立的结肠直肠NTX细胞系(SCRX-CR4，CR11，CR33，PA3，PA6&PA14)被用于在免疫受损的小鼠中引发肿瘤。对于携带SCRX-CR4，PA3或PA6肿瘤的小鼠，一旦平均肿瘤负荷达到了～300mm3，小鼠被随机化并在安乐死之前每周两次用15mg/kg伊立替康，25mg/kg吉西他滨或媒介物对照(PBS)进行处理，处理至少二十天。移除从所有六个NTX系产生的肿瘤（包括来自正在进行化学治疗的小鼠的那些）并从新鲜切除的结肠直肠NTX肿瘤中分别分离TPC，TProg和NTG细胞并且类似地，从胰腺NTX肿瘤中分离TG和NTG细胞，其中一般使用实施例1中所示的技术。更具体地，通过FACS分离细胞群，使其立即沉淀并在Qiagen RLTplus RNA裂解缓冲液中裂解(Qiagen，Inc.)。然后将裂解物储存在-80℃直至使用。融化后，按照供应商的指导使用Qiagen RNeasy分离试剂盒(Qiagen，Inc.)提取总的RNA并再次使用供应商的方案和推荐的设备设置在Nanodrop(Thermo Scientific)和Bioanalyzer2100(Agilent Technologies)上进行定量。所产生的总RNA制备物适于 遗传测序和分析。
制备由如上文所述从经媒介物或化学治疗剂处理的小鼠中分离的各细胞群中获得的总RNA样品用于全转录组测序，其中从5ng的总RNA/样品开始、使用AppliedBiosystems SOLiD3.0(通过寡核苷酸连接/检测的测序)下一代测序平台(LifeTechnologies)。通过SOLiD平台产生的数据被定位至来自人基因组的34,609个基因并且能够在大多数样品中检测肝配蛋白-A配体（包括EFNA4）且提供可验证的对ENFA水平的测量。
一般地，所述SOLiD3下一代测序平台使得能够对与珠子相连的克隆性扩增的RNA/DNA片段进行平行测序。然后将通过与经染料标记的寡核苷酸连接而进行的测序用于产生对于样品中存在的每个片段的50碱基读取，总共有大于5千万的读取，这产生了对基因组中蛋白的mRNA转录物水平的表达的准确得多的代表。所述SOLiD3平台不仅能够捕获表达，还能仅基于读取覆盖(独特地定位于基因组位置的读取)而捕获SNP，已知和未知的可变剪接事件，以及潜在的新外显子发现。因此，使用这种下一代平台允许了确定转录物水平表达中的差异以及那些所表达的mRNA转录物中特定剪接变体的差异或偏好。此外，使用来自Applied Biosystems的经修饰的全转录组方案、以SOLiD3平台进行的分析仅要求大约5ng的起始材料预扩增。这由于是从经分选的细胞群中提取总RNA而是显著的，在所述经分选的细胞群中TPC细胞亚组例如数量比NTG或大块肿瘤小得多，并因此产生很少量的可用起始材料。
如同标准的工业操作，对来自SOLiD3平台的重复运行的测序数据进行归一化、转化并计算倍数比率。如在图2中所见，测量了来自肿瘤的EFNA1，EFNA3和EFNA4水平以及Eph受体EPHA1，EPHA2和EPHA10的水平。对于所述数据的分析显示出相对于NTG群体，在SCRx-CR4NTX肿瘤TPC中EFNA4在转录物水平上被上调了1.9–3倍，相对于TProg群体其在TPC中被上调了1.2-1.4倍，无论细胞是从经媒介物处理(图2A)还是从经15mg/kg伊立替康(图2B)处理的 小鼠中获得的。还将理解的是，分别相对于TProg和NTG细胞，EFNA1在TPC中也上升了，虽然比EFNA4的程度小。此外，当通过SOLiD3全转录组测序分析其它的结肠直肠(SCRx-CR11&CR33)和胰腺(SCRx-PA3，PA6&PA14)肿瘤样品时，在结肠直肠的TPC中（相对于TProg和NTG细胞）(图3A)以及在来自胰腺肿瘤的TIC(或TG)细胞亚群中(图3B)EFNA4基因的表达类似地升高了，这是使用如上文所示而发现的独特的细胞表面标记物组所确定的(TPC和TProg细胞亚组，其构成胰腺肿瘤中还未被定义的TIC群)。
还观察到了EPHA2受体（EFNA4和EFNA1配体均与其相互作用）的表达，其反向地反映出在从TPC到NTG细胞的分化进程中EFNA4和EFNA1的表达。EFNA1/EFNA4配体与EPHA2受体的这种相反的表达模式表明这些配体/受体对之间的串扰（crosstalk）可能在结肠直肠癌症干细胞分化过程中的细胞命运决定中起作用，并且中和这些反应可能负面地影响肿瘤生长。具体地，通过使用抗后者肝配蛋白-A配体对的中和性抗体来阻断EphA2与EFNA1和/或EFNA4的相互作用，可使TPC对化学治疗剂敏化，或例如可迫使其分化。此外，通过使用EFNA1和/或EFNA4内化抗体来靶向TPC，可直接通过裸露的调节子或通过使用毒素或抗体药物缀合物而杀伤TPC。
上文详述的观察结果显示出EFNA1和/或EFNA4表达一般在TPC群中升高，并表明这些膜系留的配体可在肿瘤发生和肿瘤维持中起重要作用，因此构成了用于新的治疗方法的出色靶标。
实施例3
对富集的肿瘤引发细胞群中肝配蛋白-A配体的实时PCR分析
为了验证通过全转录组测序观察到的结肠直肠癌中TPC群相对于TProg和NTG细胞、以及胰腺癌中TG相对于NTG细胞的差异性肝配蛋白-A配体表达，使用了定量实时PCR来测量如上文所示从各种NTX系中分离的各细胞群中的基因表达水平。将理解的是，这种实时PCR分析允许利用特异于特定目的基因的引物和探针组 更直接和快速地测量分立的靶标的基因表达水平。在Applied Biosystems7900HT仪器(Life Technologies)上进行了实时定量PCR，其是用于在多个源自患者的NTX系细胞群和相应的对照中测量EFNA4基因表达。此外，如在与TaqMan系统一同提供的说明书中所指明的、并且使用商业上可得的EFNA4引物/探针组(Life Technologies)进行了分析。
如在图4中所见到的，对从3个区别性结肠直肠NTX肿瘤系(SCRx-CR4，CR5&CR14)分离的NTG，TProg和TPC群中的基因表达进行的定量实时PCR查询显示出相对于NTG细胞，EFNA4基因表达在TIC亚群(TPC和/或TProg)中升高了超过1.4倍。在正在经受伊立替康处理的小鼠的TIC群中以及在胰腺肿瘤的TG细胞群(例如SCRx-PA3)中，EFNA4也升高了大约1.8倍。使用被更加广泛接受的实时定量PCR方法观察到在来自源自结肠直肠和胰腺患者的NTX肿瘤的NTX TIC细胞制备物中（与NTG细胞对照相比）升高的EFNA4表达，这证实了之前的实施例的更加灵敏的SOLiD3全转录组测序数据，并且支持所观察到的EFNA4与肿瘤发生、对治疗的抗性和复发所基于的细胞之间的关联。
实施例4
肝配蛋白-A配体在未分级结肠直肠肿瘤样本中的表达
鉴于与来自结肠直肠肿瘤的TProg和NTG细胞相比，发现来自相同肿瘤的TPC群体中的肝配蛋白-A配体基因的表达升高这一事实，进行了实验来确定相对于正常的相邻组织(NAT)，在未分级的结肠直肠肿瘤样品中是否也可检测到升高的肝配蛋白-A配体(即，EFNA4)表达。类似地，也进行了测量来确定肿瘤中的肝配蛋白-A配体表达与正常组织样品中的水平相比如何。使用本领域中已知的技术设计和制造了含有110种结肠直肠患者肿瘤样本、正常相邻组织和48种正常组织的定制肿瘤扫描qPCR(Origene Technologies)384孔阵列。使用实施例3中详述的程序以及相同的EFNA4特异性引物/探针组，在所述定制 板的孔中进行了TaqMan实时定量PCR。
图5A和5B以图形的形式显示了相对于正常结肠和直肠组织中的平均表达归一化的所述表达数据的结果。更具体地，图5A总结了使用从110名结肠直肠癌患者获得的168个组织样本(其中的35个组织样本是来自结肠直肠癌患者的正常(NL)相邻组织)和来自其它位置的48个正常的组织(其它NL)产生的数据。在图表中，以点表示来自每个组织样本/患者的数据，其中每个群体的几何平均值被标定在以线表示的X轴上。类似地，图5B含有来自24个匹配的结肠直肠患者样本的数据，所述样本是从处于所述疾病的各时期(I-IV)的肿瘤(T)或正常相邻组织(N)获得的。在此，作图的数据是基于逐个样品呈现的，其中在来自单个患者的相应肿瘤与正常相邻组织之间有联系。相对于正常的相邻组织，在大多数匹配的肿瘤中EFNA4的表达明显更高，其中在2，3和4期中，差异性表达达到统计学上的显著性(n≥4，P≤0.047)。图5A和5B均显示出在所呈现的所有四个时期中，EFNA4基因的表达水平在大多数结肠直肠肿瘤中且在匹配的肿瘤样本中（相对于正常相邻组织）均升高了。此外，结肠直肠癌的任何时期中的平均EFNA4基因表达似乎至少等于（如果不大于）在这些实验中所查询的任何正常组织中EFNA4基因表达的最高水平(图5A)。这些结果显示出，EFNA4的表达在结肠直肠癌中增加了，当与上面所观察到的EFNA4的表达在结肠直肠TPC和胰腺TIC中最高相联系时，这表示治疗性靶向表达EFNA4的肿瘤发生性细胞可向癌症患者提供很大的治疗益处。
实施例5
肝配蛋白-A配体在示例性肿瘤样品中的差异性表达
为了进一步评估在其它结肠直肠癌患者肿瘤样品和来自被诊断患有17种其它不同实体肿瘤类型之一的患者的肿瘤样本中肝配蛋白-A配体的基因表达，使用TissueScanTMqPCR(Origene Technologies)384孔阵列（其如实施例4中所述被定制制造）进行了Taqman qRT-PCR。测量的结果呈现在图6中并且显示出EFNA4的基因表达在许多肿瘤样品中被显著升高或抑制。
在这方面，图6A和6B分别显示了来自患有十八种不同实体肿瘤类型之一的患者的全肿瘤样本(灰点)或匹配的正常相邻组织(NAT；白点)中的人EFNA4的相对和绝对基因表达水平。在图6A中，对于所分析的每种肿瘤类型，相对于NAT中的平均基因表达对数据进行了归一化。在图6B中，在各组织/肿瘤中评估了EFNA4的绝对表达，其中所述数据作为达到通过定量实时PCR进行的指数扩增所需的循环数(Ct)来作图。向未被扩增的样本分配了45的Ct值，其代表实验方案中最后的扩增循环。每个点代表单个组织样本，其中平均值被表示为黑线。
使用所述定制的阵列，观察到了被诊断患有结肠直肠癌的大多数患者和被诊断患有子宫内膜，食管，肝，肺，前列腺，膀胱和子宫癌的大多数患者在其肿瘤中（相对于NAT）具有显著更多的EFNA4基因表达，这表示在这些肿瘤中，EFNA4可能在肿瘤发生和/或肿瘤进展中起作用。相反，在来自患有肾上腺和胰腺癌的患者的肿瘤中，EFNA4的表达显现出被显著抑制。从这些研究中还清楚的是，在大多数NAT样品中，EFNA4基因表达一般是低至中等的；其中在肾上腺、乳腺、宫颈和卵巢中观察到了最高的表达。再次地，这些数据表示差异性的EFNA4表达(高或低)关于呈现所选过度增生性病症的患者中的肿瘤发生或永存化是指示性的和潜在决定性的。
还使用专有权的非传统异种移植(NTX)，如上文所讨论地评估了EFNA4表达并相关于正常的组织表达进行了定量。在商业正常组织RNA样品(乳腺、结肠、食管、心脏、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、骨骼肌、小肠)和来自乳腺癌(BR)，结肠直肠癌(CR)，肾癌(KDY)，肝癌(LIV)，黑素瘤(MEL)，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌(OV)，胰腺癌(PA)和小细胞肺癌(SCLC)的NTX肿瘤上进行了定量实时PCR。结果（显示在图6C中）表明，相对于正常组织中的表达，在乳腺、结肠和肝NTX系中有升高的EFNA4表达。相反地，图6D记载了相关家族成员EFNA1在许多相同的正常和NTX系中的表达并且显示了在正 常组织和肿瘤组织之间有很少的差异性表达。尽管有这种表达谱，与EFNA1反应的本发明的EFNA调节子(包括与其它EFNA反应的那些)可有效地被用于消除肿瘤发生性细胞，如随后的实施例中所示。
在任何情况下，为了证实通过定量实时PCR检测的升高的mRNA表达也转化成EFNA4的升高的蛋白水平，进行了蛋白质印迹分析。使用总蛋白提取试剂盒(Bio ChainInstitute#K3011010)按照所提供的方案产生了NTX和细胞系(293幼稚和293EFNA4过表达细胞)的细胞裂解物，以匹配商业上可得的正常组织裂解物(Novus Biologicals)。使用BCA蛋白测定(Pierce/Thermo Fisher#23225)确定了所述裂解物的蛋白浓度。在还原条件下，在MES缓冲液中、使等量的细胞裂解物在NuPAGE Novex4-12%Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)上跑胶。使用抗人EFNA4A的商业上可得的抗体(R&D Systems-AF369)来检测EFNA4蛋白表达。在图6E的顶栏中，相较于幼稚293细胞，经工程化以过表达EFNA4的293细胞显示出高的表达。此外，在顶栏中，数种乳腺、结肠和非小细胞肺癌NTX显示出相对高的EFNA4的表达。在相似的条件下，图6E的底栏中的蛋白质印迹显示出当与NTX细胞系CR11中的高EFNA4表达相比时，正常的组织表达低的或不可检测的水平的EFNA4。使用了抗GAPDH对照抗体来显示两栏中相等的细胞裂解物加载。
实施例6
使用EFNA免疫原产生抗EFNA抗体
根据本文中的教导，通过用hEFNA4-ECD-Fc，hEFNA4-ECD-His，hEFNA1-ECD-His接种过表达EFNA4或如本文所示制备的胞质制备物(ECD–细胞外结构域)的全细胞BALB/c3T3细胞产生了鼠抗体形式的EFNA调节子。免疫原都是使用商业上可得的起始材料(例如重组人肝配蛋白-A4Fc嵌合体，CF R&D系统#369-EA-200)和/或本领域技术人员熟知的技术制备的。
更具体地，通过用EFNA4或EFNA1抗原的各种制备物免疫接种 9只雌性小鼠(Balb/c，CD-1，FVB每种三只)产生了鼠抗体。免疫原包括Fc构建体或加了His标签的人EFNA4或EFNA1，从107个过表达EFNA4的293细胞或在表面上过表达人EFNA4的全3T3细胞提取的膜级分。对于所有的注射，通过足垫途径免疫接种小鼠。使用10μg的EFNA4或EFNA1免疫原或1X106细胞或用等体积TITERMAXTM或铝佐剂乳化的细胞等同物进行免疫接种。免疫接种后，使小鼠安乐死，切割出引流淋巴结（腘的和腹股沟的，如果增大的话)并用作产生抗体的细胞的来源。通过使用组织研磨器机械破坏所述淋巴结而释放淋巴细胞。
使用了两个融合方案之一。在第一种中，用Genetronic设备进行了电融合，随后对多克隆杂交瘤进行铺板和筛选，之后进行亚克隆以产生单克隆杂交瘤。在第二种中，用BTX设备进行电融合，随后以杂交瘤的大量和单细胞沉积培养杂交瘤文库，随后对克隆进行筛选。
Genetronic设备融合方案：通过将B细胞的单细胞悬浮物与购自（ATCC CRL-1580；Kearney等人，J.Immunol.123:1548-1550(1979))的非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以1:1的比例相混合而进行融合。通过以800g离心而轻柔地沉淀所述细胞混合物。在完全去除上清液后，用2-4mL链酶蛋白酶溶液处理所述细胞不超过2分钟。使用融合产生仪型号ECM2001(Genetronic，Inc.)进行了电融合。
在平底微量滴定板上以2X104/孔将细胞涂板，继而在选择性HAT培养基(Sigma，CRL P-7185)中孵育两周。然后对于抗人EFNA4单克隆IgG抗体通过ELISA和FACS筛选单个的孔。
用来自经转染的293细胞的纯化的重组EFNA4His融合蛋白（100ng/孔，在碳酸盐缓冲液中）涂覆ELISA微量滴定板。在4℃下过夜孵育所述平板，然后用200μl/孔的3%BSA（在PBS/Tween(0.05%)中）进行封闭。将来自杂交瘤平板的上清液加入每个孔中并在环境温度下孵育1-2小时。用PBS/Tween清洗所述平板，然后用山羊抗小鼠IgG（与辣根过氧化物酶(HRP)特异性缀合的Fc片段）（Jackson ImmunoResearch)在室温下孵育一小时。清洗后，用TMB底物 (Thermo Scientific34028)使平板显色并用分光光度计在OD450处进行分析。
对来自阳性孔的EFNA4分泌杂交瘤进行再筛选并通过有限稀释或单细胞FACS分选对其进行亚克隆。
使用有限稀释涂板在所选的抗原阳性孔上进行亚克隆。就单集落生长的存在目测观察平板，然后通过上文所述的抗原特异性ELISA和下文描述的FACS证实筛选来自单集落孔的上清液。扩增所产生的克隆性群体并在冷冻介质(90%FBS，10%DMSO)中冷冻保存，且存储在液氮中。使用上文所述的ELISA方案，从用EFNA4免疫接种的小鼠进行的这种融合产生了159种对EFNA4有反应活性的鼠单克隆抗体。
BTX设备融合方案：通过电融合将B细胞的单细胞悬浮物与非分泌性的P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以1:1的比例相融合。使用Hybrimune系统型号47-0300(BTXHarvard Apparatus)进行了电融合。将融合的细胞重悬于补充了重氮丝氨酸(Sigma#A9666)的杂交瘤选择培养基中(DMEM(Cellgro cat#15-017-CM)培养基，其含有15%胎克隆I血清(Hyclone)，10%BM Condimed(Roche Applied Sciences)，1mM丙酮酸钠，4mM L-谷氨酰胺，100IU青霉素-链霉素，50μM2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤)，然后以90ml选择培养基/摇瓶涂布在四个T225摇瓶中。然后，将所述摇瓶置于含有5%CO2和95%空气的潮湿的37℃培养箱中6-7天。
在生长6-7天时，使用Aria I细胞分选仪以1个细胞/孔将所述文库涂布在48个Falcon96孔U-底板中。简要地，将含有15%胎克隆I血清(Hyclone)，10%BM-Condimed(RocheApplied Sciences)，1mM丙酮酸钠，4mM L-谷氨酰胺，100IU青霉素-链霉素，50μM2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤的培养基以200μl/孔涂布在48个Falcon96孔U-底板中。使用Aria I细胞分选仪将存活的杂交瘤以1个细胞/孔放置并培养10-11天，并通过FACS或ELISA就对EFNA4或EFNA1的抗体反应活性测定上清液。
使用与上文所述的相似的ELISA测定就对鼠EFNA4的特异性筛选分泌小鼠免疫球蛋白的生长阳性杂交瘤孔。简要地，用碳酸钠缓冲液中1μg/mL的鼠EFNA4-His在4℃涂覆96孔板(VWR，610744)过夜。清洗所述平板并用2%FCS-PBS将其在37℃下封闭1小时，并且立即使用或保存在4℃下。将未稀释的杂交瘤上清液在平板上于RT下孵育1小时。清洗所述平板，并用经HRP标记的山羊抗小鼠IgG（以1:10,000在1%BSA-PBS中稀释）在RT下探测一小时。然后用如上文所述的底物溶液孵育所述平板并在OD450处读取。
如下文所述还使用FACS测定就对人EFNA1的特异性筛选分泌小鼠免疫球蛋白的生长阳性杂交瘤孔。简要地，用25-100μl杂交瘤上清液将1x105/孔表达人EFNA1的Jurkat细胞孵育30分钟。用PBS/2%FCS将细胞清洗两次，然后用50μl/样品经DyeLight649标记的山羊-抗小鼠IgG（在PBS/2%FCS中以1:200稀释的Fc片段特异性二抗）进行孵育。在孵育15分钟之后，用PBS/2%FCS将细胞清洗两次并在含有DAPI的PBS/2%FCS中重悬，且使用HTS连接在标准条件下通过FACS Canto II(BD Biosciences)进行分析。扩增所产生的EFNA1特异性克隆性杂交瘤并在CS-10冷冻培养基(Biolife Solutions)中冷冻保存且存储在液氮中。这种来自以EFNA1免疫接种的小鼠的融合产生了1个与EFNA4反应的杂交瘤，如使用FACS分析所确定的。此外，FACS分析证实了从大多数或所有这些杂交瘤中纯化的抗体以浓度依赖性的方式结合EFNA4或EFNA1。
实施例7
肝配蛋白-A配体调节子的测序和人源化
7(a)测序:
基于前述，选择了许多示例性的区别性单克隆抗体，其以明显高的亲和力结合经固定的人EFNA4或EFNA1。如以表格形式在图7A中所显示的，对编码来自实施例6的mAb的DNA进行的序列分析证实了许多具有独特的VDJ重排并展示出新型互补决定区。应注意，图 7A中所示的互补决定区(SEQ ID NO：8–59和70–95)源自VBASE2分析。
为了起始测序，TRIZOL试剂购自Invitrogen(Life Technologies)。一步RT PCR试剂盒和QIAquick PCR纯化试剂盒购自Qiagen，Inc，其中RNA酶抑制剂来自Promega。定制的寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。
在TRIZOL试剂中裂解杂交瘤细胞用于RNA制备。将104μL至105细胞重悬于1mlTRIZOL中。在加入了200μl氯仿后剧烈地摇动管子。在4℃下将样品离心10分钟。将含水相转移到新鲜的微量离心管中并加入等体积的异丙醇。剧烈摇动管子并允许其在室温下孵育10分钟。然后在4℃下将样品离心10分钟。用1ml70%的乙醇将粒状沉淀清洗一次并在室温下简短干燥。用40μL经DEPC处理的水重悬所述RNA粒状沉淀。通过在1%琼脂糖凝胶中对3μL进行分级而确定RNA制备物的质量。将RNA储存在-80℃的冷冻箱中直至使用。
使用可变结构域引物的混合物获得了用特异于鼠免疫球蛋白重链和κ轻链的共有引物对扩增的杂交瘤的可变DNA序列。使用了一步RT-PCR试剂盒来扩增来自每个RNA样品的VH和VK基因区段。Qiagen一步RT-PCR试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript反转录酶，HotStarTaq DNA聚合酶，Qiagen一步RT-PCR缓冲液，dNTP混合物和Q溶液（使得能够对“困难的”(例如富含GC)模板进行有效扩增的新型添加剂）的掺合物。
制备了反应混合物，其包括3μL的RNA，0.5的100μM重链或κ轻链引物，5μL的5×RT-PCR缓冲液，1μL的dNTP，1μL的酶混合物（含有反转录酶和DNA聚合酶）以及0.4μL的糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)。所述反应混合物含有反转录和PCR所需的所有试剂。热循环程序为：RT步骤50℃进行30分钟，95℃进行15分钟，继以30个下列循环：95℃进行30秒，48℃进行30秒，72℃进行1.0分钟。然后最后在72℃下孵育10分钟。
为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，根据制造商的方案使 用QIAquickTMPCR纯化试剂盒对它们进行纯化。使用50μL的无菌水从旋转柱上洗脱DNA然后直接从两条链进行测序。直接对PCR片段进行测序并且使用VBASE2(Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674，2005)对DNA序列进行分析。
如上文中简述的，若干示例性抗hEFNA4/hEFNA1抗体的遗传排布和所衍生的CDR(来自VBASE2分析)以表格形式在图7A中显示(SEQ ID NO：8–59和70-95)。此外，这些相同的示例性抗体重链和轻链可变区的核酸和氨基酸序列在图7B–7N中显示(SEQ ID NO：96-147)。
7(b)人源化:
使用互补决定区(CDR)接枝对来自实施例6的鼠抗体中的四种进行人源化。基于相关于功能性人种系基因的序列和结构相似性选择了用于重链和轻链的人框架。在这方面，通过将小鼠常规CDR结构与具有相同常规结构（源自VBASE2分析）的人候选物进行比较来评价结构相似性。
更具体地，使用计算机辅助的CDR接枝方法(Abysis数据库，UCL Business Plc.)和标准的分子工程化技术将鼠抗体SC4.5，SC4.15，SC4.22和SC4.47人源化，以提供hSC4.5，hSC4.15，hSC4.22和hSC4.47调节子(注意：在克隆或抗体名称之后添加随后的数字（即SC4.47.3）是指特定的亚克隆并且对于本公开的目的而言不是关键性的，除非上下文另行指出或要求)。基于它们与小鼠框架序列及其常规结构的最高序列同源性选择了可变区的人框架区。为了分析的目的，将氨基酸分配至每个CDR结构域是根据Kabat等人的编号。制造了数个人源化抗体变体，以产生最佳的人源化抗体，其中所述人源化抗体一般保留与人框架区相结合的、来自小鼠杂交瘤的抗原结合性互补决定区(CDR)。人源化SC4.15，SC4.22和SC4.471mAbs以与其鼠对应物相似的亲和性结合EFNA4抗原，而hSC1.5以略低的亲和性结合，如使用Biacore系统所测量的。
使用本领域认可的技术进行了分子工程化程序。为此，根据制造商的方案(Plus RNA纯化系统，Life Technologies)从杂交瘤中提取了总mRNA。将包含三十二种小鼠特异性5'前导序列引物（被设计为靶向完整的小鼠储库）的引物混合物与3'小鼠Cγ1引物组合使用来对抗体重链的可变区进行扩增和测序。类似地，将与特异于小鼠κ恒定区的单一反向引物相组合的三十二种5'Vk前导序列引物混合物（被设计用于扩增Vk小鼠家族中的每一个）用于对所述κ轻链进行扩增和测序。使用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。
对于每种杂交瘤总共进行八个RT-PCR反应：四个用于Vκ轻链，四个用于Vγ重链(γ1)。使用QIAGEN一步RT-PCR试剂盒来进行扩增(Qiagen，Inc.)。使用特异性V区域引物对所提取的PCR产物进行直接测序。使用IMGT分析核苷酸序列以鉴别具有最高的序列同源性的种系V，D和J基因成员。使用V-BASE2(Retter等人，见上)并通过将VH和VL基因与小鼠种系数据库进行比对，而将所衍生的序列与Ig V和J区域的已知种系DNA序列进行比较。
从核苷酸序列信息，获得了关于SC4.5，SC4.15，SC4.22和SC4.47的重链和轻链的V，D和J基因区段的数据。基于所述序列数据，设计了特异于抗体的Ig VH和VK链的前导序列的新引物组用于克隆重组的单克隆抗体。随后，将V-(D)-J序列与小鼠Ig种系序列进行比对。将SC4.5的重链基因鉴别为IGHV2-6(V)和JH3。分析E5单克隆抗体重链的短CDR3没有鉴别出特定的小鼠D基因。将SC4.15的重链基因鉴别为IGHV5-6(V)，DSP2.9(D)和JH3。将SC4.22的重链基因鉴别为VHJ558(V)，将D区段鉴别为DFL16.1e和JH4(J)。将SC4.47的重链基因鉴别为IGHV1-26(V)，P1inv(D)和JH2(J)。所有四个轻链都是K类。将轻链基因鉴别为IGKV6-15，JK2（对于SC4.5mAb），IGKV6-b和JK5（对于SC4.15mAb），IGKV1-110和JK1种系序列（对于SC4.22mAb）以及IGKV21-7，JK1种系序列（对于SC4.47κ轻链）。这些结果被总结在下面的表1中。
表2
克隆 小鼠同种型 VH DH JH VL JL
SC4.5 IgG1/K IGHV2-6 无 JH3 IGKV6-15 JK2
SC4.15 IgG1/K IGHV5-6 DSP2.9 JH3 IGKV6-b JK5
SC4.22 IgG2b/K VHJ558 DFL16.1e JH4 IGKV1-110 JK1
SC4.47 IgG1/K IGHV1-26 P1inv JH2 IGKV21-7 JK1
将从所有四个克隆获得的重链和轻链序列与功能性的人可变区序列进行比对并评价同源性和常规结构。重链和轻链分析的结果分别显示在下面的表3和表4中。
表3
表4
克隆 人VK 人JK 与人种系序列的同源性% 与小鼠序列的同源性%
SC4.5 L1 JK2 86 79
SC4.15 A27 JK4 89 76
SC4.22 A18b JK1 89 91
SC4.47 L6 JK4 87 84
由于种系选择和CDR接枝过程似乎提供了一般保留它们的结合特征的抗体，显然几乎不需要在大多数构建体中插入鼠残基。然而，在hSC4.15中，将重链残基68从Thr(T)回复突变为Lys(K)以改进抗体特征。
所有四种抗体的人源化重链可变区和人源化κ轻链的氨基酸序列（以及相关的核酸序列）显示在图7O–7R中(SEQ ID NO：148-163)，其中对氨基酸序列中的CDR(如Kabat等人所定义的，见上)加了下划线。
更具体地，人源化SC4.5重链(SEQ ID NO：148和149)和人源化轻链(SEQ ID NO：150和151)的核酸序列和相应的氨基酸序列显示在图7O中。类似地，人源化SC4.15重链(SEQID NO：152和153)和人源化轻链(SEQ ID NO：154和155)的核酸序列和相应的氨基酸序列显示在图7P中。本发明的另一个实施方案在图7Q中被阐明，其中显示了人源化SC4.22重链(SEQ ID NO：156和157)和人源化轻链(SEQ ID NO：158和159)的核酸序列和相应的氨基酸序列。在另一个实施方案中，图7R显示了人源化SC4.47重链(SEQ ID NO：160和161)和人源化轻链(SEQ ID NO：162和163)的核酸序列和相应的氨基酸序列。如下面的实施例中所示，每种前述人源化抗体都根据本文中的教导作为有效的EFNA调节子起作用。
在任何情况下，使用本领域中认可的技术表达和分离所公开的调节子。为此，将两条重链的合成的人源化可变DNA片段(Integrated DNA Technologies)克隆到人IgG1表达载体中。将可变轻链片段克隆到人C-κ表达载体中。通过将重链和轻链共转染到CHO细胞中而表达抗体。
更具体地，为了产生抗体，进行了将鼠和人源化可变基因PCR产物直接克隆到人免疫球蛋白表达载体中。Ig基因特异性PCR中使用的所有引物都包括限制性位点(AgeI和XhoI用于IgH，XmaI和DraIII用于IgK，这允许分别直接克隆到含有人IgG1和IGK恒定区的表达载体中。简要地，用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化PCR产物，随后分别用AgeI和XhoI(IgH)，XmaI和DraIII(IgK)进行消化。纯化经消化的PCR产物，然后连接到表达载体中。用200U T4-DNA连接酶(New England Biolabs)，7.5μL经消化和纯化的基因特异性PCR产物以及25ng线性化的载体DNA在10μL的总体积中进行连接反应。通过热激在42℃下、用3μL连接产物转化感受态大肠杆菌DH10B细菌(Life Technologies)并将其涂布在氨苄青霉素平板上(100μg/mL)。然后将VH区域的AgeI-EcoRI片段插入到pEE6.4HuIgG1表达载体的相同位点中而将合成的XmaI-DraIII VK插入物克隆到相应pEE12.4Hu-Kappa表达载体的XmaI-DraIII位点。
通过使用293fectin、用适当的质粒转染HEK293细胞而产生了生产人源化抗体的细胞。在这方面，用QIAprep旋转柱(Qiagen)纯化了质粒DNA。在标准条件下，在补充了10%热灭活的FCS、100μg/mL链霉素，100U/mL青霉素G(均来自Life Technologies)的Dulbecco的改良Eagle's培养基(DMEM)中，在150mm平板(Falcon，Becton Dickinson)上培养胚胎肾(HEK)293T(ATCC No CRL-11268)细胞。
对于瞬时转染，使细胞生长至80%汇合。将等量的IgH和相应的IgL链载体DNA(12.5μg的每种载体DNA)加入1.5mL Opti-MEM（其与1.5mL opti-MEM中的50μL HEK293转染试剂相混合）中。在室温下将所述混合物孵育30min并平均分配到培养板中。转染后3天收获上清液，用20mL补充了10%FBS的新鲜DMEM替代，并在转染后6天再次收获。通过在800×g下离心10min而清除培养物上清液中 的细胞碎片并存储在4℃。用蛋白G珠子(GE Healthcare)纯化重组的嵌合和人源化抗体。
实施例8
EFNA调节子的特征
8(a)一般的调节子特征
使用了各种方法来分析如上文所述产生的所选肝配蛋白-A4调节子的结合特征。具体地，通过就亲和性、动力学、分箱及关于猕猴和小鼠同源物(内部产生的)的交叉反应性表征了许多EFNA4抗体。还测量了Western反应活性并对于在还原条件下结合的两种抗体(SC4.22和SC4.91)确定了表位。此外，就其中和(即阻断受体配体相互作用)、内化的能力测试了所述抗体，并且使用这些实施例(例如见实施例12和16)中所示的程序通过体外细胞毒性测定对它们杀伤的相对EC50进行了基准化。这一表征的结果以表格形式显示在图8A中。
关于所述数据，以三种方式测量了亲和力来确保准确性。首先，在ELISA中对于固定量的抗体（针对抗原的系列稀释物探测的）测量了结合信号，以确定相对调节子活性(仅对于cyno结合显示了数据)。第二，然后用标准的抗原浓度系列、使用生物层干涉测量法分析在ForteBIO RED(ForteBIO，Inc.)上测量了所选调节子的亲和性及动力学常数kon和koff。最后，通过表面等离子体共振(Biacore System，GE Healthcare)测量了所选调节子的亲和性。基于标准的抗原浓度系列并使用1:1的Langmuir结合模型，确定了抗体结合抗原的Kd及动力学常数kon和koff。一般地，所选的调节子在纳摩尔的范围内显示出相对高的亲和性。
至于抗体分箱，根据制造商的指导，使用ForteBIO来鉴别抗体，其结合相同或不同的箱（bin）。简要地，将抗体(Ab1)捕获到抗小鼠捕获芯片上，然后使用高浓度的非结合抗体来封闭所述芯片并收集基线。然后通过特异性抗体(Ab1)捕获单体、重组肝配蛋白-A4-His并将 头部浸入含有作为对照的相同抗体(Ab1)的孔中或浸入含有不同抗体抗体(Ab2)的孔中。如果用新抗体观察到了另外的结合，则确定Ab1和Ab2是在不同的箱中。如果没有发生其它结合，类似于对照Ab1，则确定Ab2是在相同的箱中。这个过程可被扩展以在96孔板中使用代表独特箱的全行抗体来筛选大的独特抗体的文库。此实验显示了所筛选的抗体至少结合三个不同的箱或EFNA4蛋白上的表位。
为了确定肝配蛋白-A4调节子识别的表位是包含连续的氨基酸还是由通过抗原的二级结构并置的非连续氨基酸形成的，在还原性和非还原条件下进行了蛋白质印迹分析。更具体地，使用本领域中熟知的标准电泳技术，使两种状态下的肝配蛋白-A4抗原均暴露于所选的调节子。如图8A中所示，大多数肝配蛋白-A4调节子仅在二硫键完整(NR)时与抗原进行实质反应，而两种调节子与非还原和还原的抗原(NR/R)均反应。对于这些抗体，使用了Pepspot(JPT)膜来确定通过所述肽识别所述抗体的限制。发现SC4.22和SC4.91分别识别序列QRFTPFSLGFE(SEQ ID NO：164)和RLLRGDAVVE(SEQ ID NO：165)。通过ELISA重新测试这些肽结合目的肽的能力证实了所述抗体对于这些表位的确是特异性的。
最后，使用重组表达的单体肝配蛋白-A4抗原的浓度系列、在ForteBIO中评价了相关于猕猴肝配蛋白-A4同源物的交叉反应性。如图8A中所示，所选的调节子与所述同源物反应。特别地，SC4.5，SC4.15，SC4.91和SC4.105与小鼠肝配蛋白-A4交叉反应，而所有的抗体均与高度相似的猕猴肝配蛋白-A4交叉反应。表格中的ND表示所述数据未被确定。
8(b)人源化调节子特征
使用本实施例中上文所示的技术，分析了人源化构建体hSC4.15，hSC4.22和hSC4.47以确定它们的结合特征。此外，对于所述两种抗体均将人源化抗体结合与亲本鼠抗体进行了直接比较以鉴别由人源化过程带来的速率常数方面的任何细微变化。
更具体地，使用表面等离子体共振(SPR)通过Biacor确定了鼠SC4.47的亲和性，以提供图8B中所示的结果。基于浓度系列25，12.5和6.25nM(产生了图8B和8C中从顶部到底部的曲线)并使用1:1Langmuir结合模型，估算了抗体结合抗原的Kd为1.1nM。然后用人源化构建体进行的类似实验显示出等同的结果(图8C)，这表明人源化过程没有不利地影响亲和性。在这方面，测量表明所述人源化构建体具有的Kd为<1x10-10，这与亲本鼠抗体基本相同。
与此实施例中所示的其它技术一起，这些测量显示出来自实施例7的所有人源化肝配蛋白-A4效应子具有所需的品质。如图8D中所示，SC4.15与鼠肝配蛋白-A4同源物强烈地交叉反应，从而促进毒理学研究。通过ELISA，所有抗体对于猕猴抗原的反应活性不能与人EFNA相区别，并因而被预期是非常相似的。
实施例9
肝配蛋白-A配体调节子显示出细胞表面结合
如在流式细胞计数测定中所测量的，就细胞表面结合筛选来自如上文所示产生针对hEFNA4-Fc的抗体的杂交瘤的上清液。为了显示所述抗体的结合特性，采用了两个细胞系JurkatE6细胞和Z138细胞（其中的每一个都已知表达高水平的表面肝配蛋白-A4）。更具体地，将六百万Jurkat E6细胞（用细胞标记染料CFSE染色的(为了简单的鉴别)）和四百万未标记的Z138细胞（用20μg/ml Fc封闭试剂(Trueblock，Biolegend，Inc.)孵育的）混合至1百万细胞/mL的终浓度。在每个孔中将50μL的这种细胞混合物加入50μL含有抗体的上清液中并在4℃下孵育60分钟。用含有2%FBS，2mM EDTA和0.05%叠氮化钠的PBS(清洗缓冲液)清洗所述细胞一次，然后在4℃下、在黑暗中用与DyLight649相缀合的、Fc区域特异性的山羊-抗小鼠IgG多克隆抗体的F(ab)2片段(Jackson Immuno Research)染色60分钟。用清洗缓冲液将细胞清洗两次，并用2μg/ml的DAPI进行复染。阴性对照样品是小鼠IgG1同种型抗体(10μg/ml，Biolegend，Inc.)和来自已 知不分泌小鼠IgG的杂交瘤(H13.2)的上清液。使用10μg/ml经纯化的抗体(SC4.76.2aka E76.2)（之前通过ELISA被鉴定为是EFNA4特异性的(图9的左侧)）制备了阳性对照样品。在标准条件下、使用HTS连接在FACS Canto II(BDBiosciences)上收集了样品。一百一十四(114)个中的八十四(84)个克隆被判定显示显著的细胞表面结合（通过对两个细胞系均进行染色而由流式细胞术显示的），显著高于阴性对照样品。在这方面，图9显示了五十种示例性杂交瘤上清液的相对结合能力。
实施例10
所选的EFNA4调节子中和肝配蛋白-A4配体结合
就其阻断可溶性hEFNA4-Fc与HEK293Td细胞表面上它的受体(EphAs)相结合的能力测试来自产生已知结合表达ENFA4的细胞的抗体的杂交瘤(实施例9)的上清液。起初，如在图10A中所见到的，当与阴性对照抗体相比时，显示了HEK293Td细胞以剂量依赖性的方式结合hEFNA4-Fc。为了显示对这种结合的中和，用200ng/mlhEFNA4-Fc（在清洗缓冲液中稀释的）与60μL抗EFNA4杂交瘤上清液在4℃下孵育2小时。然后将所述混合物加入五万HEK293Td细胞中并在4℃下孵育1小时。在清洗缓冲液中将所述细胞清洗一次，然后在黑暗中、在4℃下用与DyLight649相缀合的、Fc区域特异性的山羊-抗小鼠IgG多克隆抗体的F(ab)2片段(Jackson Immuno Research)染色45分钟。然后用清洗缓冲液将细胞清洗两次，并用2μg/mlDAPI进行复染。阴性对照样品是未染色的细胞，用来自非IgG产生性杂交瘤(H13.2)的上清液染色的细胞和用人IgG Fcγ1片段染色的细胞。阳性对照样品是在不存在杂交瘤上清液时用hEFNA4-Fc染色的细胞和在存在非-IgG产生性杂交瘤上清液时用hEFNA4-Fc染色的样品(图10B的左侧)。如之前所讨论的，在FACS Canto II上测量样品。如图10B所示，当使用流式细胞计数进行测量时，八十三(83)个所测试的克隆中的六十二(62)个显示出一些中和hEFNA4-Fc与其细 胞表面受体的结合的能力。
实施例11
EFNA调节子以浓度依赖性的方式阻断细胞表面EFNA结合
为了进一步测量本发明的肝配蛋白-A配体调节子中和EFNA活性的能力，纯化了来自所选杂交瘤的抗EFNA4抗体并将其作为PBS缓冲液中的无菌试剂使用。起初，平行建立了单独的人和鼠EFNA4-Fc(重组鼠肝配蛋白-A4Fc嵌合体，CF R&D系统)的全剂量应答曲线，以显示剂量限制的EFNA4-Fc与HEK293Td细胞的结合(图11A)。一旦建立了这一对照，在4℃下，分别用清洗缓冲液中有限浓度(0.1μg/ml和1.0μg/ml)的hEFNA4-Fc和mEFNA4-Fc孵育从三个示例性杂交瘤(即SC4.15.3，SC4.47.3和SC4.76.2)获得的抗EFNA4抗体的系列稀释物1hr。然后，将所产生的试剂混合物转移到五万HEK293Td细胞中并在4℃下孵育1小时。在清洗缓冲液中将所述细胞清洗一次，然后在4℃下、在黑暗中用与DyLight649相缀合的、Fc区域特异性的山羊-抗小鼠IgG多克隆抗体的F(ab)2片段(Jackson Immuno Research)染色45分钟。用清洗缓冲液将细胞清洗两次，并用2μg/mlDAPI进行复染。阴性对照样品是未染色的细胞和用人IgG Fcγ1片段染色的细胞。如前文所述，在FACS Canto II上收集样品。图11B显示了mAb SC4.15.3的活性，其以相对高的浓度部分抑制人和小鼠EFNA4-Fc结合细胞的能力。图11C阐释了mAb SC4.47.3的活性，其几乎完全阻断hEFNA4-Fc结合细胞的能力，但不阻断mEFNA4-Fc的能力。类似地，图11D显示了肝配蛋白-A配体调节子mAb SC4.76.2的下述能力：其显著抑制hEFNA4-Fc结合细胞的能力但不显著影响mEFNA4-Fc结合细胞的能力。这些结果强烈地表明本发明的所选调节子抑制肝配蛋白-A配体与细胞表面受体结合的能力并因而抑制任何与肿瘤发生性相关的活性。
实施例12
EFNA调节子以浓度依赖性的方式阻断EFNA与EphA受体的结合
如上文所讨论的，EphA2是EFNA4的已知结合伴侣。为了利用这一已知的关系，使用标准技术将EphA2的细胞外结构域与人IgG的Fc部分相融合，使其在HEK293Td细胞中瞬时表达并使用蛋白A亲和层析从培养物的上清中将其纯化。如在图12A中所见到的，EphA2-Fc同源二聚体以剂量依赖性的方式结合Jurkat细胞(已知表达EFNA)而单独的人IgG的Fc部分不显示任何结合。可使用本发明的肝配蛋白-A调节子，特别是通过使用肝配蛋白-A4的单克隆抗体来抑制EphA2-Fc与Jurkat细胞的这种结合。为此，用清洗缓冲液中10μg/ml的四种所选抗ENFA4抗体(即SC4.22，SC4.31.3，SC4.47.3和SC4.73，均如上文所述制备)在4℃下孵育五万Jurkat细胞/孔1hr。小鼠IgG以及无抗体(数据未显示)作为阴性对照。清洗之后，在清洗缓冲液中，将EphA2-Fc的系列稀释物加至细胞，在4℃下进行1hr以提供图12B中以图形显示的结果。审视图12B显示出，调节子SC4.31.3和SC4.47.3显著抑制EphA2-Fc与EFNA4的结合，而调节子SC4.22和SC4.73显示出相对更少的抑制。为了进一步阐释所公开的调节子抑制与受体相互作用的能力，首先用抗体的系列稀释物孵育Jurkat细胞，随后用10μg/ml EphA2-Fc进行孵育。然后用清洗缓冲液将所述细胞清洗两次，用2μg/ml DAPI进行复染，然后在标准条件下、使用HTS连接在FACS Canto II(BD Biosciences)上进行分析，以提供图12C中所示的数据。如同图12B，图12C显示了调节子mAbSC4.47.3是相对强效的抑制剂并且有效地阻断EphA2-Fc与Jurkat细胞上表达的EFNA4的结合。通过比较，其它调节子显示出某种程度上更少的活性，其中SC4.31.3在更高的浓度下提供中等量的抑制。
为了扩展这些发现，探究了其它EFNA4调节子与EphA受体之间的相互作用。与上文所述类似地进行了实验，除了使用的是通过反转录病毒转导过表达EFNA4的HEK293T细胞(称作HEK293T.hEFNA4细胞)(图12D)或通过反转录病毒转导过表达 EFNA1的HEK293T细胞(图12E)。此外，在单一EphAx-Fc浓度(10μg/ml)下进行了所述测定。数据显示出，SC4.2，SC4.31和SC4.47能够阻断所有所测试的EphA受体结合伴侣与肝配蛋白-A4配体(即EphA2，EphA3，EphA4，EphA6，EphA7，EphA8和EphA10)的结合。此外，建立了EFNA4调节子SC9.65（其是在针对EFNA1的免疫接种运动中产生的(如根据实施例6)）具有干扰EphA1，EphA2，EphA4和EphA7与肝配蛋白-A1配体结合的能力。这些数据（当与本文中其它实施例的结果相组合时）表明拮抗各种受体的结合的这种调节子能力在提供所观察到的本发明的治疗效果中可以是显著的。
实施例13
人肝配蛋白-A的调节子与小鼠直系同源物交叉反应
鉴于人和小鼠肝配蛋白-A4配体的细胞外结构域在蛋白质水平上共享80%序列一致性的事实，测试了所公开的人EFNA4的调节子以观察他们是否与小鼠同源物结合。更具体地，使用了抗体夹心ELISA来确定hEFNA4特异性单克隆抗体与其小鼠同源物的交叉反应性水平。用0.5μg/ml特异于IgG分子的Fc部分的驴抗人IgG多克隆抗体分子涂覆高蛋白结合96孔测定板。使用50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)，以100μL体积/孔，在4℃下孵育16小时的过程中使所述板的蛋白涂覆发生。在含有2%(w/v)牛血清白蛋白的PBS缓冲液(PBSA)中系列稀释与人IgG分子的Fcγ1部分融合的人和小鼠EFNA4分子(EFNA4-Fc)。在含有0.05%Tween20的PBS缓冲液(PBST)中清洗经涂覆的板后，将100μL/孔在PBSA中稀释的小鼠或人EFNA4-Fc加入孔中，在环境温度下持续3小时。然后用PBST再次清洗所述板并将100μL/孔含有10%用过的杂交瘤上清液或1μg/ml纯化的单克隆抗体(作为阳性对照)的PBSA加入所述板，在环境温度下持续1小时。在用PBST清洗所述板后，将100μL/孔PBSA（含有1:5000稀释的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，其特异于小鼠IgG的Fc部分并且与辣根过氧化物酶缀合(Jackson ImmunoResearch)）加至所述板，在环境温度 下进行30分钟。在用PBST充分清洗所述板后，将100μL/孔TMB底物(Thermo Fisher)加入所述孔进行15分钟。通过加入100μL/孔2M硫酸而终止酶促反应。使用Victor平板读取器(Perkin Elmer)在450nm处测量此比色测定的吸光度。使用两次重复测定，将数据呈现为平均吸光度读取加上标准偏差。图13A显示了示例性的单克隆抗体SC4.31.3，其识别hEFNA4但不识别mEFNA4。相反地，图13B显示了示例性单克隆抗体SC4.91.4的结合，其识别人和小鼠EFNA4。
为了证实这些结果，使用人源化肝配蛋白-A4调节子hSC4.15进行了测定。更具体地，在PBS中将滴定量的人和小鼠肝配蛋白-A4-His涂覆在高蛋白结合性96孔板上，在4℃下进行16小时。在PBSA中于环境温度下将所述板封闭2hr后，将0.5μg/ml的hSC4.15调节子在PBSA中加入，进行2小时。如上文所述，使用与辣根过氧化物酶缀合的驴抗人IgG多克隆抗体(Jackson Immuno Research)来使ELISA显色。图13C显示了，hSC4.15调节子同等良好地识别人和小鼠肝配蛋白-A4配体，这表明所公开的人源化调节子与本文的教导完全相容。
实施例14
肝配蛋白-A配体在示例性肿瘤样品，肿瘤细胞亚群和造血细胞中的表达
在之前的实施例中记录了升高的基因表达水平及产生了抗EFNA4的抗体之后，对于所选细胞群中相应的EFNA4蛋白表达寻找了证据。在这方面，提供了反相癌蛋白裂解物阵列(ProteoScan阵列；OriGene Technologies)，其包含来自11个肿瘤类型或者它们各自正常的相邻组织的432种组织裂解物的4种稀释物，还一起提供了由HEK293细胞（没有或具有通过外源启动子驱动的TP53过表达）组成的对照。使用本发明的识别EFNA4蛋白的小鼠单克隆EFNA4抗体(例如克隆E47.3aka SC4.47.3)通过蛋白质印迹检测了此阵列上所述裂解物中的EFNA4蛋白表达。比色检测试剂和方案是由ProteoScan阵列的制造商提供的，使用平板扫描仪（利用BZScan2Java软件 (INSERM-TAGC)）将所制造的阵列上的点转化为数字图像以定量点强度。
此类测定的所选结果显示在图14中，并且显示出EFNA4蛋白的表达在结肠直肠肿瘤样品中被上调了。更具体地，图14A显示出，EFNA4蛋白表达在结肠直肠肿瘤样本的亚组中似乎显著升高；特别是在患有IV期疾病的患者中（当与正常的相邻组织或来自从更早疾病阶段获得的样本的肿瘤组织相比时）。如上文所述产生了数据，并且呈现为平均像素强度/点(点强度)。每种样品中的水平黑色条表示每个相应类别中样本的平均值。
在证实了EFNA4蛋白在某些结肠直肠全肿瘤细胞裂解物中被上调之后，进行了测试以建立相同的靶标在肿瘤引发细胞上表达。更具体地，为了确定EFNA4蛋白表达是否能够在肿瘤引发细胞的细胞表面上被检测到，如上文所述使肿瘤解离用于流式细胞计数分析。在将肿瘤样品(例如结肠直肠细胞系CR33，如根据实施例2)解离为单细胞悬浮物后，在37℃下将它们孵育24小时以促进抗原再表达(由于EFNA4抗原对胶原酶/透明质酸酶的酶促敏感性)，然后用能够识别EFNA4的、与藻红蛋白(PE)缀合的单克隆抗体进行染色。然后，如之前的实施例中的，在标准条件下、使用HTS连接用FACS Canto II(BD Biosciences)分析所述细胞。在进行这些实验时，观察到了与NTG细胞上的表达相比，EFNA4在TIC细胞亚群(如通过用识别TIC-确定性细胞表面标记物的抗体对所述细胞进行共染色所确定的；例如46+，324+，66-)上的表达显著更高。来自使用SCRx-CR33结肠直肠NTX肿瘤细胞和EFNA4调节子SC4.47.3的实验的代表性结果显示，与NTG细胞上的相比，EFNA4的表达在TIC上是超过2倍更高(图14B)。
为了进一步证实EFNA4在TIC细胞上相对高地表达，将LU86和LU64细胞在体外培养10天并如本文所示的使用PE缀合的SC4.47抗体通过流式细胞术测量表达。收获所产生的集落并如上文所述进行染色。如图14D中所示，LU86细胞的TIC群(黑色实线)远高于同种型对照（灰色阴影）和来自相同肿瘤系的NTG群(黑色虚线)而表达 EFNA4。此外，在体内培养的LU86细胞可被EFNA4抗体杀伤(如下面的实施例16中所示)。相反地，发现LU64细胞不表达升高水平的EFNA4(图14D)并且随后不被抗EFNA抗体杀伤。
虽然相信在本公开之前未在实体肿瘤样本中评估过EFNA4蛋白表达，报道了所述蛋白在B细胞上以相对低的水平表达并在来自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的B细胞上升高。为了证实EFNA4蛋白在正常的外周血单核细胞(PBMC)上的表达，如本实施例中之前所述进行了测定以提供图14C中所示的数据。审视图14C中呈递的图表显示出，当判定来自正常供体的PBMC上EFNA4的表达时，仅有CD19+B细胞是微弱阳性的，证实了文献中关于EFNA4在何处表达的报道。
这些数据支持上面的实施例中观察到的EFNA4过表达与结肠直肠癌中的TIC和/或TPC相关，并且可涉及增殖和/或存活。所述数据还显示出EFNA4不在大多数正常的PBMC上表达，且在正常B细胞上的表达是最小程度的。鉴于前述实施例显示了a)EFNA4基因表达与结肠直肠癌中的TPC细胞亚群以及胰腺肿瘤中的肿瘤发生性细胞亚群相关；b)EFNA4蛋白表达在TIC细胞亚群上更高；c)EFNA4蛋白表达在来自晚期结肠直肠癌的全肿瘤样本中升高；和d)一般性的观察是TIC在晚期肿瘤中更频繁，似乎EFNA4与作为肿瘤生长、对治疗的抗性和肿瘤复发的基础的那些细胞相关，主张EFNA4可在支持上述肿瘤中的TPC和/或TIC方面起重要作用。
实施例15
肝配蛋白-A配体调节子被K562细胞内化
鉴于之前的实施例中所建立的肝配蛋白-A配体的表达谱，进行了测定来观察本发明的调节子在结合细胞表面抗原后是否被内化。在这方面，就其在K562细胞中内化的能力筛选来自实施例中产生抗EFNA4-Fc抗体的杂交瘤的上清液，所述K562细胞在细胞表面上以低水平表达EFNA4。在室温下用人TruStain(BioLegend，Inc.)封闭起始浓度为106/ml(单细胞悬浮物)的K562细胞10分钟，然后稀释至 5x104细胞/孔。然后在冰上用终体积为50μl的抗EFNA抗体（含有上清液）对一式两份的样品进行30分钟的染色，之后用FACS染色培养基(FSM；2%胎牛血清/Hank's缓冲盐溶液/25mM HEPES[pH7.4])清洗细胞以去除未结合的抗体。这之后用驴抗小鼠Alexa647(Life Technologies)进行第二次染色，在冰上进行30分钟。再次清洗样品以去除未结合的抗体，然后重悬在内化培养基(2%胎牛血清/Iscove's改良Dulbecco's培养基)中。为了允许内化，将样品在37℃下(或对于对照在4℃下)在5%CO2中孵育1小时。通过将样品转移到冰上并加入过量冰冷的FSM而终止内化。为了去除任何没有内化而保留在细胞表面上的抗体，用低pH磷酸缓冲盐溶液(PBS[pH2.0])在冰上将样品处理10分钟。在此“酸去除(strip)”程序之后，用FSM充分清洗样品，将其重悬于150μl含有2μg/ml DAPI的FSM中，并通过流式细胞术进行分析(还是使用FACS Canto II(BDBiosciences)，在标准条件下，使用HTS连接)。所检测到的任何超过背景的信号是由抗体内化产生的，所述抗体内化是保护荧光缀合物在酸去除过程中不从细胞表面被移除的过程。所有的孵育都是在FSM中进行的，除非另行声明。
使用上文所述的酸去除方案筛选159个含有EFNA4抗体的杂交瘤上清液克隆显示出与IgG阴性对照抗体相比，许多上清液显示出荧光的阳性偏移(数据未显示)。例如，示例性的SC4.5，SC4.22和SC4.73克隆就下述显示出内化：来自这些克隆的上清液能够内化并保护Alexa647二抗不被酸去除(图15A)。与IgG对照相比，大约15%含有EFNA4抗体的上清液以不同的程度诱导内化，其中前十九(19)个显示出超过150的δ平均荧光强度(MFI在37℃vs.4℃)(图15B)。这一数据表示，抗人EFNA4ECD产生的调节子亚组在细胞上被呈递时结合抗原并且能够内化。这样的结果强调了肝配蛋白-A配体作为本发明的调节子的靶标（带有或没有细胞毒性有效负荷）的潜在治疗价值。
使用所选的经纯化的EFNA4调节子（浓度为10μg/ml）并使用HEK293T(图15C)和HEK293T.hEFNA4(图15D)细胞作为靶细胞重复了所述测定。亲本HEK293T在它们的细胞表面上表达低水平的肝配 蛋白-A4配体。按照上文所述的方案，数据显示出所有所测试的肝配蛋白-A4调节子在结合表达在细胞表面上的肝配蛋白-A4配体后都被内化。将对于每个样品所记录的平均荧光强度(MFI)与含有八种不同的已知量的被封装荧光团的标准珠子(Becton Dickenson Spherotech8色彩虹珠)进行了比较(数据未显示)。这允许将MFI值转化成为线性值并计算相对受体数目/细胞。
实施例16
EFNA4调节子作为靶向部分
与抗体稳定连接的细胞毒性药物的靶向代表可能对患有实体肿瘤的患者有很大治疗益处的强化(empowered)抗体方法。为了确定上文所述的EFNA4特异性抗体是否能够介导细胞毒性试剂向肝细胞的递送，进行了体外细胞杀伤测定，其中与核糖体-灭活性蛋白皂素(Advanced Targeting Systems)相缀合的链霉抗生物素蛋白与生物素化的EFNA4抗体相结合，并且在72小时之后通过测量细胞存活性而测量这些皂素复合物内化和杀伤细胞的能力。
具体地，将105Z138细胞/孔涂布在96孔板的孔中。从上清液中纯化上文所述的抗EFNA4抗体，将其生物素化，然后稀释至20μg/mL。所述Z138细胞系(ATCC CRL-3001)源自患有套细胞淋巴瘤的患者并且表达适中量的EFNA4。将每种抗体的等份分别与链霉抗生物素蛋白-ZAP(Advanced Targeting Systems)1:1混合，涡旋振荡5秒，然后在室温下孵育1小时。然后制备所述抗体-皂素复合物的两种另外的系列10倍稀释物，将50μL的各混合物分别加入含有Z138细胞的孔中。然后在37℃/5%CO2下将所述细胞/抗体-皂素混合物孵育24小时。所述孵育之后，将细胞离心沉降在圆底的96孔板中，去除上清液，并向每个孔加入100μL新鲜的培养基。然后将所述细胞再孵育72小时，然后使用CellTiter-Glo(Promega Corp.)按照制造商的方案计数存活的细胞数目。
使用这一方案，数种如之前的实施例中所述能够内化的抗体也能 够在体外介导细胞杀伤(数据未显示)，而生物素化的同种型对照抗体不能够杀伤细胞。也即，这些内化调节子中的数种能够介导引起细胞死亡的皂素毒素内化。图16A表明了对于示例性内化调节子SC4.5.3的这种细胞杀伤能力，其中所述曲线的下行坡表示以浓度依赖性方式的细胞死亡（与对照相比）。这些数据清楚地表明了所公开的调节子在表达肝配蛋白-A配体的肿瘤发生性细胞中作为用于细胞毒性有效负荷的选择性内化的载体时的有效性。
为了使这些结果相互印证并确定EFNA4效应子是否能够介导毒素内化和原发人肿瘤细胞的细胞杀伤，将小鼠谱系-耗尽的NTX细胞(即在免疫受损的小鼠中作为低传代异种移植物繁殖的人肿瘤细胞)涂板并使其随后暴露于抗EFNA4抗体和Fab-ZAP。
具体地，如本领域中已知的，将代表肺和皮肤肿瘤样本的NTX肿瘤解离成为单细胞悬浮物并将其涂布在BD PrimariaTM平板上(BD Biosciences)，其在补充了生长因子的无血清培养基中。在37℃/5%CO2/5%O2下培养了3-5天后，使细胞与对照(IgG1或IgG2b)或鼠EFNA4调节子(1nM的SC4.5，SC4.22，SC4.47或SC4.91)及Fab-ZAP(为40nM)接触。在5-7天后，通过使用CellTiter Glo定量剩余的细胞数而评估调节子介导的皂素细胞毒性。如在图16B中所见到的，暴露于EFNA4抗体引起减少的LU86细胞数目，而IgG2b和IgG1同种型对照抗体没有影响处理后活细胞的数目。在图16C中，暴露于SC4.5，SC4.47，SC4.91抗体产生减少的SK19细胞数目，而同种型对照和SC4.22是无效的。这一数据不仅显示出本文所描述的示例性抗体特异于EFNA4、能够结合细胞表面上的EFNA4抗原且促进产生细胞死亡的细胞毒性有效负荷的递送，上述数据还显示出多种抗EFNA4抗体能够介导多种NTX肿瘤细胞的杀伤。
在前述杀伤测定的变体中，对于其它抗体且在其它细胞中显示了通过EFNA调节子递送细胞毒性有效负荷。在添加抗体和毒素的前一天，在它们各自的培养基中将2000细胞/孔的下述细胞类型涂布在96孔组织培养板中：HEK293T细胞(图16C)，HEK293T.hEFNA4细胞(图 16D)。将各种浓度的纯化的(“裸露的”)小鼠单克隆抗体和固定浓度的10nM与皂素共价连接的抗小鼠IgG Fab片段(Advanced Targeting Systems，#IT-48)加至培养物中72hr。如上文所述计数存活的细胞数。将含有具有所述皂素Fab片段的细胞的培养物的原始发光度设置为100%参照值，且相应地计算所有其它的计数(称作“归一化的RLU”)。
使用这种测定，我们能够显示出所有所测试的EFNA抗体（而非同种型对照抗体）能够杀伤靶细胞。这一测定还显示出内化仅因为所述EFNA4抗体与细胞表面的结合、而无需另外的交联而发生。最后，所述数据显示出仅仅是在其表面上表达足够的数目的EFNA的细胞被EFNA调节子杀伤。亲本HEK293T细胞在其细胞表面上表达低数目的EFNA，而HEK293T.hEFNA4细胞强烈地表达此配体(见来自之前的实施例的图15C和15D)。下面的表5列出了所有所测试的抗体/靶细胞组合的半-最大有效浓度(通常称作“EC50)。除了前述细胞系PC3细胞(ATCC CRL-1435)外，使用了源自人腺癌的细胞系作为靶细胞。
表5
EFNA调节子递送细胞毒性有效负荷
EC50(pM) HEK293T HEK293T.hEFNA4 PC3 Z138
同种型 无杀伤 无杀伤 无杀伤 无杀伤
SC4.2.1 无杀伤 10.1 N.T. N.T.
SC4.5.1 无杀伤 15.0 N.T. 4.6
hSC4.15 N.T. 13.7 5.4 N.T
SC4.22.1 无杀伤 28.6 5.4 18.7
SC4.31.3 无杀伤 14.2 N.T. 33.8
SC4.47.3 201 23.2 2.5 9.6
SC4.91.4 无杀伤 7.8 N.T. 15.8
SC4.105.4 无杀伤 17.3 N.T. 65.2
SC9.65 无杀伤 28.9 N.T. N.T.
(N.T.=未测试)
在体外杀伤测定的另一个变体中，就其内化和递送细胞毒性有效负荷的能力测试了人源化EFNA调节子。正如上文所述进行了所述测定，除了仅涂布了500细胞/孔且将与皂素共价连接的抗人IgG Fab片段(Advanced Targeting Systems，#IT-51)加入培养物中之外。图16E显示了，实施例7中所描述的人源化(图16E中的Hz)EFNA调节子能够结合在靶细胞表面上表达的肝配蛋白-A4配体并诱导EFNA与所结合的抗体及细胞毒性有效负荷一起内化。
在所述体外杀伤测定的另一个变体中，就其内化和向过表达人或小鼠EFNA的HEK293T细胞递送细胞毒性有效负荷的能力测试了显示出同等良好地结合小鼠和人EFNA的人源化EFNA调节子hSC4.15(见图13C)。为了确保直接可比性，用hSC4.15对经慢病毒转导的细胞进行染色并就人或小鼠肝配蛋白-A4的适度表达通过FACS进行分选(数据未显示)。正如上文所述进行所述杀伤测定。图16F表明了人源化SC4.15调节子同等良好地杀伤表达小鼠或人EFNA的细胞。
实施例17
EFNA调节子检测分泌的肝配蛋白-A配体
如上文中比较详细地讨论的，EFNA4可作为与细胞膜相结合的GPI-连接的分子或作为被分泌的截短的配体或同种型存在。检测生物材料（例如体液或细胞培养基）中这些分泌的化合物可用于诊断目的或作为患者管理中的辅助（作为生物标记物的用处)。例如，显示了在B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)患者中可以升高的浓度发现分泌的EFNA4(Alonso-C LM等人，2009，Leukemia Research33：395-406)。为了显示本发明的这种优选的方面，使用了所公开的调节子来识别纯化的EFNA4的非重合表位并一般性地检测及定量所选的肿瘤发生性样品中分泌的EFNA配体。关于本发明的这后一特征，使用了EFNA调节子来检测和定量从B-CLL患者获得的人血清（数据未显示）和人血浆中的、以及来自携带人肿瘤异种移植物的小鼠的血 清的分泌的肝配蛋白-A配体(例如，如上文的实施例1中所述)。在每种情形中，所述调节子均能够有效地测量配体水平，如下面所描述的。
为了检测可溶性人EFNA4，使抗体SC4.91以5μg/ml、在50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中、在4℃下孵育过夜的过程中吸附至高-蛋白结合性微量滴定板(Greiner BioOneMicrolon plates)。在含有0.05%(v/v)Tween20的磷酸缓冲液(PBS)(PBST)中清洗所述板之后，在含有2%(w/v)牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中将所述板在环境温度下封闭2小时。将纯化的肝配蛋白-A4-His（在CHO-S细胞中瞬时表达且相继使用镍NTA树脂和凝胶过滤纯化的）在PBSA中系列稀释并加入至所述板中2小时。用PBST清洗后，将生物素化的抗体SC4.47以1μg/ml（在PBSA中）加至所述板1小时。然后用PBST清洗平板，之后以1:5000的稀释将链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物(例如Jackson Immuno Research)加入PBSA中30分钟。然后再次在PBST中清洗经处理的平板并加入TMB底物溶液(例如Thermo Fisher)30分钟。通过加入等体积的2M硫酸使颜色反应终止，之后在标准平板读取仪中利用450nm的吸光度读取来读取平板。实验的结果显示在图17A-C中。
使用上面所述的技术，将可溶性h肝配蛋白-A4-His的浓度相对于吸光度值作图以提供图17A中所示的曲线。更具体地，原始的曲线显示了在可溶性EFNA4浓度为0-40pg/ml处吸光度测量的结果，而所述插入物在0–1000pg/ml的浓度处显示出相同的曲线。本领域技术人员将理解，图17A中显示的标准曲线可被用于提供用来测量生物学样品中EFNA4浓度的极度灵敏的测定。
利用前述测量并使用非线性回归(Prism5，Graphpad软件)，计算了未知样品中肝配蛋白-A4的浓度。在这方面，就其分泌的肝配蛋白-A4浓度分析了四名健康成年人、四名被诊断患有B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的患者和四名被诊断患有多发性骨髓瘤(MM)的患者的血浆样品。所获得的数据表明，与健康成年人或其它所选的源自B细胞的肿瘤相比，hEFNA4分析物在CLL患者中显著更高(图 17B)。此外，如之前所表明的和图17C中所示的，分泌的hENFA4在带有人结肠直肠癌异种移植物的小鼠中也是可检测的。特别地，在图17C中每个点都表示从不同小鼠获得的血清中经分泌的hEFNA4的水平。相反地，非异种移植的小鼠中分泌的hEFNA4的血清水平是基本上不可检测的(数据未显示)。甚至更令人惊讶地，将肿瘤体积相对于血清样品中hEFNA4的浓度作图时，观察到了显著的相关性，这表明所分泌的分析物对于在体内监控某些人实体肿瘤的肿瘤生长可能是特别有用的。更一般地，这些结果强烈地指示了本发明在治疗和诊断设置中的可应用性。
使用上述方法，将来自从血液库中获得的23名正常人供体的血浆样品用于确定健康成年人中此分析物的浓度范围。如图17D中所示，发现了332pg/ml EFNA4(6.2pg/ml的标准偏差)的平均浓度。这表示EFNA以非常低和被紧密调控的浓度被分泌或散布并且使得EFNA成为理想的生物标记物或诊断标记物用于监控疾病进展或诊断EFNA相关病症。
为了进一步探索这种可能性，将来自患有结肠直肠癌的17名患者的商业上获得的血清样品和来自患有非小细胞肺癌的患者的10个样品与来自健康成人的12个样品进行比较，并使用上文所述的方法测试EFNA4浓度。如图17E中所示，患有结肠直肠癌和非小细胞肺癌的患者都在他们的血液中具有显著升高的循环EFNA4水平。使用未配对t测试，健康成年人与结肠直肠癌患者之间的比较达到了0.0002的p值，而健康成年人与非小细胞肺癌患者之间的比较达到了0.01的p值。这些数据表明，分泌的或散布的EFNA4在患有实体肿瘤的患者中升高并且表明了使用所公开的调节子在分析测试或临床诊断中的价值。
实施例18
EFNA4调节子能够靶向表达相关EFNA配体的细胞
相对于相关的EFNA配体测试了EFNA4调节子的配体特异性， 以评价交叉反应性的程度。作为示例，使用过表达EFNA4(图17A)，EFNA3(图17B)和EFNA1(图17C)的HEK293T细胞在体外杀伤测定中测试了SC4.2.1和SC9.65。应注意，调节子SC9.65是通过用EFNA1免疫原免疫接种小鼠而产生的(如按照实施例6)。所述杀伤测定是正如实施例16中所描述的进行的。图17显示出除了表达EFNA4的细胞之外，SC4.2.1能够杀伤表达EFNA3的细胞，并且SC9.65能够杀伤表达EFNA1和EFNA4的细胞。这些数据表明，针对特定EFNA家族成员产生的所选调节子能够足够好地结合其它家族成员，从而结合表达配体的细胞、诱导内化并向表达配体的细胞递送细胞毒性有效负荷。鉴于EFNA家族成员之间低程度的同源性(人EFNA1，2，3和4之间有大约34–45%的氨基酸序列同一性)，这一发现在某种程度上是出人预料的，并且其示例了（如本文中所述）泛-EFNA调节子可被产生而用于诊断或治疗目的。
实施例19
EFNA配体与多种EphA受体选择性地相互作用
如上文所讨论的，已知肝配蛋白-A配体结合众多EphA受体。为了探索哪种EphA受体具有与EFNA4相互作用的潜能，开发了与实施例9中所描述的相似的流式细胞计数结合测定。更具体地，通过在4℃下、在染色缓冲液中进行1小时而介由反转录病毒转导将表达为人IgG1Fc融合构建体的可溶性EphA受体加至五万HEK293T细胞/孔(图19A)或过表达EFNA4的HEK293T细胞(图19B)(称作HEK293T.hEFNA4细胞)。清洗后，加入与Dylight649缀合的第二抗人IgG多克隆抗体(Jackson Immuno Research)，进行1小时。清洗两次后，将样品重悬于含有2μg/ml DAPI的染色缓冲液中并在标准条件下、使用HTS连接在FACS Canto II(BDBiosciences)上进行分析。图19A和19B显示出，EphA2，EphA3，EphA4，EphA6，EphA7和EphA10而非EphA1结合肝配蛋白-A4配体。这再次指出了本发明的调节子所固有的优势和多方面作用的潜能。
实施例20
EFNA4结合EphB2但不结合EphB3和EphB4受体
扩展实施例20中所显示的发现，探索了肝配蛋白-A4配体结合EphB受体的能力。EFNA4起初被鉴别为CSC结合靶标，如上文的实施例2-4中所示。在正常小鼠结肠隐窝的组织层次结构中，EphB2和EphB3受体被位于结肠隐窝基部的细胞高度表达而不被位于所述隐窝顶部的细胞表达，这表示EphB表达和通过EphB受体的向前或反向信号传导在组织结构和单个细胞的命运决定中是重要的(Batlle等人；2002PMID:12408869)。最近，已将EphB2被结肠直肠癌细胞表达与肿瘤引发和长期增殖能力相联系，表示EphB2可作为结肠癌干细胞的表型标记物(Merlos-Suarez等人，2011PMID：21419747)。因此，肝配蛋白-A4配体结合任何差异性表达的EphB受体的能力对于结肠直肠癌干细胞可能有生物学的重要性。
使用本领域中认可的技术，通过在染色缓冲液中、在4℃下进行1小时，而将作为人IgG1Fc融合构建体表达的可溶性EphB受体以及EphA1-Fc(其不结合EFNA4)和EphA2-Fc(其不强烈结合EFANA4配体)加至五万HEK293T细胞/孔(图20A)或HEK293T.hEFNA4细胞(图20B)。清洗后，将与Dylight649缀合的第二抗人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch)加入，进行1小时。清洗两次后，将样品重悬于含有2μg/ml DAPI的染色缓冲液中并在标准条件下、使用HTS连接在FACS Canto II(BD Biosciences)上进行分析。图20A和20B显示出，EphB2但非EphB3和EphB4结合EFNA4配体，这再次强调了可被所公开的调节子有利影响的治疗途径的潜在多样性。
本领域技术人员还将理解，可以其它具体形式实施本发明而不偏离其精神或中心特点。鉴于前文对本发明的描述仅公开了其示例性的实施方案，要理解预期其它的变体在本发明的范围内。因此，本发明不限于已在本文中详细描述的特定实施方案。而是，应参考所附的权利要求作为对本发明的范围和内容的指示。

Claims (46)

1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人EFNA4并且包含：
(a)如SEQ ID NO:113所示的重链可变区的三个CDR以及如SEQ ID NO:115所示的轻链可变区的三个CDR；
(b)如SEQ ID NO:161所示的重链可变区的三个CDR以及如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区的三个CDR；或
(c)如SEQ ID NO:137所示的重链可变区的三个CDR以及如SEQ ID NO:139所示的轻链可变区的三个CDR。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为CDR-接枝的抗体。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体。
5.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为重组人抗体。
6.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为中和性抗体。
7.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中为内化抗体。
8.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为耗竭性抗体。
9.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:12、25和38中所示的三个重链可变区CDR，并且包含如SEQ ID NO:51、74和87中所示的三个轻链可变区CDR。
10.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:113的残基31-35所示的CDR-H1，SEQ ID NO:113的残基50-65所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:113的残基95-102所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:115的残基24-34所示的CDR-L1，SEQ ID NO:115的残基50-56所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:115的残基89-97所示的CDR-L3，其中所述残基根据Kabat进行编号。
11.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:113的残基26-32所示的CDR-H1，SEQ ID NO:113的残基53-55所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:113的残基96-101所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:115的残基26-32所示的CDR-L1，SEQ ID NO:115的残基50-52所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:115的残基91-96所示的CDR-L3，其中所述残基根据Chothia进行编号。
12.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:113的残基30-35所示的CDR-H1，SEQ ID NO:113的残基47-58所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:113的残基93-101所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:115的残基30-36所示的CDR-L1，SEQ ID NO:115的残基46-55所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:115的残基89-96所示的CDR-L3，其中所述残基根据MacCallum进行编号。
13.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:157所示的重链可变区和如SEQ ID NO:159所示的轻链可变区。
14.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:14、27和40中所示的三个重链可变区CDR，并且包含如SEQ ID NO:53、76和89中所示的三个轻链可变区CDR。
15.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:161的残基31-35所示的CDR-H1，SEQ ID NO:161的残基50-65所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:161的残基95-102所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:163的残基24-34所示的CDR-L1，SEQ ID NO:163的残基50-56所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:163的残基89-97所示的CDR-L3，其中所述残基根据Kabat进行编号。
16.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:161的残基26-32所示的CDR-H1，SEQ ID NO:161的残基53-55所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:161的残基96-101所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:163的残基26-32所示的CDR-L1，SEQ ID NO:163的残基50-52所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:163的残基91-96所示的CDR-L3，其中所述残基根据Chothia进行编号。
17.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含下述三个重链可变区CDR，即SEQ IDNO:161的残基30-35所示的CDR-H1，SEQ ID NO:161的残基47-58所示的CDR-H2，和SEQ IDNO:161的残基93-101所示的CDR-H3；并且包含下述三个轻链可变区CDR，即SEQ ID NO:163的残基30-36所示的CDR-L1，SEQ ID NO:163的残基46-55所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:163的残基89-96所示的CDR-L3，其中所述残基根据MacCallum进行编号。
18.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:161所示的重链可变区和如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区。
19.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)如SEQ ID NO:113或157所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:115所示的轻链可变区的三个CDR；
(b)如SEQ ID NO:161所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区的三个CDR；或
(c)如SEQ ID NO:137所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:139所示的轻链可变区的三个CDR。
20.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)如SEQ ID NO:113所示的重链可变区的三个CDR，以及如SEQ ID NO:115或159所示的轻链可变区；
(b)如SEQ ID NO:161所示的重链可变区的三个CDR，以及如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区；或
(c)如SEQ ID NO:137所示的重链可变区的三个CDR，以及如SEQ ID NO:139所示的轻链可变区。
21.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)如SEQ ID NO:113所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:115所示的轻链可变区；
(b)如SEQ ID NO:161所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区；或
(c)如SEQ ID NO:137所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:139所示的轻链可变区。
22.权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段，其与细胞毒性试剂缀合、连接或以其它方式结合。
23.药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段。
24.抗体缀合物，其包括权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒性试剂缀合、连接或以其它方式结合。
25.药物组合物，其包含权利要求24的抗体缀合物。
26.核酸，其编码如SEQ ID NO:113、121、137、157或161所示的重链可变区，或如SEQ IDNO:115、123、139、159或163所示的轻链可变区。
27.载体，其包含权利要求26的核酸。
28.宿主细胞，其包含权利要求27的载体。
29.特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在具有过度增生性病症的患者中靶向肿瘤引发细胞。
30.权利要求29的用途，其中所述特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段与细胞毒性试剂缀合、连接或以其它方式结合。
31.权利要求29的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段为权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段。
32.权利要求29的用途，其中所述过度增生性病症为肿瘤性病症。
33.权利要求32的用途，其中所述肿瘤性病症包括实体肿瘤。
34.权利要求32的用途，其中所述肿瘤性病症为乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌或肺癌。
35.权利要求32的用途，其中所述肿瘤性病症包括恶性血液病。
36.权利要求35的用途，其中所述恶性血液病为白血病。
37.特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在具有过度增生性病症的受试者中检测肿瘤引发细胞。
38.权利要求37的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段为权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段。
39.特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在具有过度增生性病症的患者中靶向肿瘤细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段为权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段。
40.权利要求39的用途，其中所述特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段与细胞毒性试剂缀合、连接或以其它方式结合。
41.权利要求39的用途，其中所述过度增生性病症为肿瘤性病症。
42.权利要求41的用途，其中所述肿瘤性病症包括实体肿瘤。
43.权利要求41的用途，其中所述肿瘤性病症为乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌或肺癌。
44.权利要求41的用途，其中所述肿瘤性病症包括恶性血液病。
45.权利要求44的用途，其中所述恶性血液病为白血病。
46.特异性结合EFNA4的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于在具有过度增生性病症的受试者中检测肿瘤细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段为权利要求1-21中任一项的抗体或其抗原结合片段。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2648749A2 (en) 2010-12-08 2013-10-16 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
US10323081B2 (en) * 2011-07-06 2019-06-18 Genmag A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the C-terminus of antibody heavy chains
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
WO2014124326A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Stem Centrx, Inc. Novel multispecific constructs
EP2986627B1 (en) * 2013-04-18 2019-04-10 Carmel Haifa University Economic Corporation Ltd. Inhibitors of the eph-a receptor and uses thereof
EP3003368A4 (en) 2013-05-24 2017-05-03 Biogen MA Inc. Anti-gpiib/iiia antibodies or uses thereof
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3065780A1 (en) * 2013-11-04 2016-09-14 Pfizer Inc. Anti-efna4 antibody-drug conjugates
US10538591B2 (en) * 2014-03-10 2020-01-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Anti-fibulin-3 antibodies and uses thereof
CN105504049B (zh) * 2014-09-26 2019-07-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
US10556959B2 (en) 2014-11-07 2020-02-11 Xencor, Inc. Anti-CD39 antibodies and uses thereof
CA2929542A1 (en) 2015-05-13 2016-11-13 Pfizer Inc. Treatment with anti-efna4 antibody-drug conjugates
CN114796520A (zh) * 2016-01-27 2022-07-29 苏特罗生物制药公司 抗cd74抗体偶联物，包含抗cd74抗体偶联物的组合物以及抗cd74抗体偶联物的使用方法
MX2018010445A (es) 2016-03-01 2019-10-17 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Anticuerpos especificos del receptor de poliovirus humano (rvp).
TWI752012B (zh) 2016-03-04 2022-01-11 美商Ｊｎ生物科學有限責任公司 針對tigit之抗體
CN109453382A (zh) * 2018-11-08 2019-03-12 浙江大学 EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭、转移的药物中的应用
JP2022507295A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 アーチ オンコロジー，インコーポレイテッド 治療用ＳＩＲＰα抗体
EP3976793A4 (en) * 2019-05-27 2023-06-21 The University of British Columbia CONFORMATION-SPECIFIC EPITOPES IN TAU, ANTIBODIES AGAINST IT AND METHODS RELATED THERETO
AU2021284273A1 (en) 2020-06-02 2022-12-15 Arcus Biosciences, Inc. Antibodies to TIGIT
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
CN113278075B (zh) * 2021-06-18 2021-12-14 芜湖森爱驰生物科技有限公司 一种炎症检测试剂盒
KR20230142330A (ko) 2022-03-31 2023-10-11 주식회사 에스알이엔지 일체형 수배전반 열화 방지 시스템 및 이를 이용한 열화 방지 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005048917A2 (en) * 2003-06-06 2005-06-02 Medimmune, Inc. Use of epha4 and modulator or epha4 for diagnosis, treatment and prevention of cancer
WO2009052830A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Genmab A/S Novel antibody therapies

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ES2096749T3 (es) 1990-12-14 1997-03-16 Cell Genesys Inc Cadenas quimericas para vias de transduccion de señal asociada a un receptor.
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
EP0749475A4 (en) 1992-08-26 1997-05-07 Harvard College USE OF THE CYTOKIN IP-10 AS AN ANTI-TUMOR AGENCY
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5516658A (en) 1993-08-20 1996-05-14 Immunex Corporation DNA encoding cytokines that bind the cell surface receptor hek
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
US5919905A (en) * 1994-10-05 1999-07-06 Immunex Corporation Cytokine designated LERK-6
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK0859841T3 (da) 1995-08-18 2002-09-09 Morphosys Ag Protein/(poly)peptidbiblioteker
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP2000508522A (ja) 1996-03-22 2000-07-11 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド アポトーシス誘導分子ｉｉ
CA2259157A1 (en) 1996-07-05 1998-01-15 Mount Sinai Hospital Corporation Oligomerized receptors which affect pathways regulated by transmembrane ligands for elk-related receptor tyrosine kinases
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US5994076A (en) 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6864227B1 (en) 1998-04-13 2005-03-08 California Institute Of Technology Artery-and vein-specific proteins and uses therefor
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AUPP674898A0 (en) 1998-10-27 1998-11-19 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A method of treatment
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
JP2003517816A (ja) 1999-08-11 2003-06-03 イオス バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 新脈管形成の診断の新規方法、新脈管形成調節因子についてのスクリーニングの組成物および方法
US6927203B1 (en) 1999-08-17 2005-08-09 Purdue Research Foundation Treatment of metastatic disease
US20050100542A1 (en) * 1999-10-08 2005-05-12 Young David S. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6992170B2 (en) * 1999-10-15 2006-01-31 Curagen Corporation Polypeptides and polynucleotides homologous to thymosin, ephrin a receptors, and fibromodulin
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
WO2001029224A2 (en) 1999-10-20 2001-04-26 Zymogenetics, Inc. Granulocyte peptide homolog zgpa1
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
EP1333032A4 (en) 2000-10-06 2005-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR PURIFYING ANTIBODIES
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
AU2002365216A1 (en) 2001-01-23 2003-09-02 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040043928A1 (en) 2001-08-02 2004-03-04 Ramesh Kekuda Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
WO2003004057A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 The Hospital For Sick Children Ephrin and eph receptor mediated immune modulation
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003040304A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Neuronova Ab Method of proliferation in neurogenic regions
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040001835A1 (en) 2002-03-04 2004-01-01 Medimmune, Inc. Prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
US20040091486A1 (en) 2002-05-10 2004-05-13 Kinch Michael S. EphA2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
EP1852441B1 (en) 2002-09-24 2012-03-28 The Burnham Institute Agents that modulate EPH receptor activity
EP1553963A4 (en) 2002-09-24 2006-05-03 Burnham Inst NOVEL AGENTS MODULATING EPH RECEPTOR ACTIVITY
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
WO2004029218A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Incyte Corporation Receptors and membrane-associated proteins
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004048938A2 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
WO2004072266A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
EP1633784B1 (en) 2003-05-09 2011-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
US20050153923A1 (en) 2003-12-04 2005-07-14 Kinch Michael S. Targeted drug delivery using EphA2 or EphA4 binding moieties
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
US7659374B2 (en) 2004-08-16 2010-02-09 Medimmune, Llc Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
WO2006047298A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 The Penn State Research Foundation Eph receptor tumor biomarkers
US8222253B2 (en) 2004-10-23 2012-07-17 Case Western Reserve University Peptide and small molecule agonists of EphA and their uses
EP2422811A2 (en) 2004-10-27 2012-02-29 MedImmune, LLC Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
KR20080080482A (ko) 2005-09-07 2008-09-04 메디뮨 엘엘씨 독소가 컨쥬게이트된 ｅｐｈ 수용체 항체
US7807459B2 (en) 2005-09-27 2010-10-05 Reneuron, Inc. EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
EP2004228A1 (en) 2006-02-28 2008-12-24 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector functions of anti-epha4 antibodies
JP5167155B2 (ja) 2006-03-09 2013-03-21 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム ペプチド結合に基づく多数の細胞株のプロファイリングに関連した組成物および方法
US20080003210A1 (en) 2006-03-13 2008-01-03 Medimmune, Inc. Non-human primate receptor tyrosine kinases
EA015992B1 (ru) 2006-03-17 2012-01-30 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела
EP2032694A4 (en) 2006-06-06 2010-09-15 Univ Tennessee Res Foundation COMPOSITIONS ENRICHED IN NEOPLASTIC STEM CELLS AND METHODS INVOLVING THEM
KR101571027B1 (ko) 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
MX2009000709A (es) * 2006-07-18 2009-02-04 Sanofi Aventis Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.
JP2010501596A (ja) * 2006-08-31 2010-01-21 エー・シー・エヌ・１３５ ４９３ ３９１・プロプライエタリー・リミテッド・アズ・トラスティー・フォー・コンカ・ユニット・トラスト 抗体含有組成物を用いた非感染性の病状の処置および／または予防
CA3007075C (en) 2006-09-07 2019-10-15 Arthur E. Frankel Methods and compositions based on diphtheria toxin-interleukin-3 conjugates
US8907065B2 (en) 2006-12-15 2014-12-09 Ablynx N.V. Polypeptides that modulate the interaction between cells of the immune system
JP2010516259A (ja) 2007-01-22 2010-05-20 レイベン バイオテクノロジーズ ヒトがん幹細胞
EP3199180B1 (en) * 2007-03-08 2022-01-05 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of solid tumors
US9289492B2 (en) 2007-07-17 2016-03-22 The General Hospital Corporation Collecting ovarian cancer stem cells from ovarian cancer cells
EP2022848A1 (en) 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
CA2699394C (en) * 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
US20100113415A1 (en) * 2008-05-29 2010-05-06 Rajapakse Hemaka A Epha4 rtk inhibitors for treatment of neurological and neurodegenerative disorders and cancer
US20100162416A1 (en) 2008-09-29 2010-06-24 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
WO2010066835A2 (en) 2008-12-10 2010-06-17 Ablynx Nv Eph receptor and ephrin ligand interaction
US8788213B2 (en) 2009-01-12 2014-07-22 Intrexon Corporation Laser mediated sectioning and transfer of cell colonies
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
WO2010141974A1 (en) 2009-06-10 2010-12-16 The University Of Melbourne Therapeutic applications
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2689787A1 (en) 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2446895A1 (en) 2010-10-01 2012-05-02 Stemgen S.P.A. EPH receptor expression in tumor stem cells
EP2648749A2 (en) 2010-12-08 2013-10-16 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
AU2014312215B2 (en) 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
US20190209704A1 (en) 2014-10-20 2019-07-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions and methods of use
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005048917A2 (en) * 2003-06-06 2005-06-02 Medimmune, Inc. Use of epha4 and modulator or epha4 for diagnosis, treatment and prevention of cancer
WO2009052830A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Genmab A/S Novel antibody therapies

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Ephrin A4 expression in osteosarcoma，impact on prognosis，and patient outcome";Abdou AG et.al.;《Indian Journal of Cancer》;20100112;第47卷(第1期);摘要部分；第46页左栏倒数第1自然段至右栏第2自然段 *
"Expression profile of Eph receptors and ephrin ligands in healthy human B lymphocytes and chronic lymphocytic leukemia B-cells";Luis M. Alonso-C et.al.;《LEUKEMIA RESEARCH》;20080926;第33卷(第1期);摘要部分；第404页右栏第1-4自然段 *
"抗EphA4多肽单克隆抗体的制备及初步应用";杨俊杰;《中南大学学报（医学版）》;20051031;第30卷(第5期);第529-532页 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ728016A (en) 2020-06-26
AU2011360938A8 (en) 2013-05-16
NZ611428A (en) 2015-07-31
RU2013128444A (ru) 2015-01-20
SG190990A1 (en) 2013-07-31
MX2013006569A (es) 2014-01-31
NZ705008A (en) 2017-05-26
WO2012078813A3 (en) 2012-08-02
RU2016123839A (ru) 2018-11-30
WO2012078813A2 (en) 2012-06-14
CA2819861A1 (en) 2012-06-14
EP2648749A2 (en) 2013-10-16
WO2012118547A1 (en) 2012-09-07
SG10201601792UA (en) 2016-04-28
US20160264653A1 (en) 2016-09-15
AU2011360938B2 (en) 2016-07-28
US20140093495A1 (en) 2014-04-03
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