CN104013958B - 抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物及其制剂 - Google Patents
抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物及其制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，其由如下方法制备而成：复合抗原制备；对鸡进行强化免疫；粗提物制备；纯化。本发明还涉及该组合物制成的制剂，其按照质量百分含量及包括：抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物或其粗提物为0.15-0.3％；聚维酮K30为0.3-0.6％；丙三醇为1.0-2.0％；聚山梨酯80为0.3-0.5％；清凉醇香精为0.10-0.30％；食用香精为0.05-0.1％；蒸馏水加至100％。本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物及其制剂的抗体活性高、专一性强，特异性杀菌、效果好，不影响微生态平衡，对人体无不良刺激，安全性能高。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性卵黄免疫球蛋白及其制剂，尤其是涉及一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物及其制剂。
背景技术
抗生素的应用，在一定程度上给人们的健康带来了福音，但是由于抗生素的大量应用，也带来了一系列的问题：如耐药菌的产生、副作用的产生以及广谱抗生素对有益菌的灭杀作用等。为了解决这一问题，寻求一种针对性的、安全性好的杀菌药，人们发现了卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of yolk，简称IgY)，该物质能够与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变该抗原的状态和活性，通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌的吞噬。
公开号为CN1207057C的发明专利申请文件公开了一种抗咽喉炎特异性复合IgY及其制剂，公开了一种抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备，包括如下步骤：选取具有高免疫应答能力强的良种鸡；复合抗原的制备；分别对特种鸡进行强化免疫；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备。该文件制备的抗咽喉炎复合IgY，对咽喉炎有着良好的作用，但是由于该IgY仅对三种菌种具有灭杀作用，而现有的一些炎症部分通常具有更多致病菌，因此该IgY的应用具有一定的局限。
发明内容
为了解决现有技术灭菌范围小、应用局限性大等问题，本发明提供了一种安全性好、应用广泛的一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物及其制剂。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，所述六种致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、A簇B型溶血性链球菌，绿脓杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，其特征在于由如下方法制成：
复合抗原制备：选取A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，在37℃环境下用Luria-Bertani培养基在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养24h，所述恒温振荡培养箱的转速为200rpm，然后灭活备用；将培养好并经灭活处理的细菌按A簇B型溶血型链球菌25-40％，金黄色葡萄球菌15-20％，绿脓杆菌10-15％，大肠杆菌10-15％，变异链球菌10-15％，白色念珠菌10-15％的比例混合匀制得菌株混合体；然后将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/L的PBS溶液中制得菌株混合体溶液，所述菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml；按1∶1的比例将弗氏佐剂加入混合好的菌株混和体溶液中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；
对鸡进行强化免疫：将制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋；本发明中，优选的方案为所述进行强化免疫的鸡为海兰褐鸡、京红鸡、伊莎白鸡和白来航蛋鸡中的一种；为了使制得的特异性卵黄免疫球蛋白质量更好，进行强化免疫的鸡通过如下方法选择：用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出鸡种，待其长大至2-3个月，作为进行强化免疫的鸡。
粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的4-6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.0-6.0之间；然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品；
纯化：将粗提物干粉成品通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，得到抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物。
本发明中，优选的方案为所述制备菌株混合体的各菌落比例为：A簇B型溶血型链球菌40％，金黄色葡萄球菌15％，绿脓杆菌10％，大肠杆菌10％，变异链球菌15％，白色念珠菌10％。
本发明中，优选的方案为所述粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.0；然后将其冷却至4℃，静置24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品。
本发明中，优选的方案为所述LB培养基包括1％的胰蛋白胨、0.5％的酵母提取物、1％的氯化钠和1.5％的琼脂。
本发明中，优选的方案为所述肉汤培养基包括0.3％的牛肉提取物、1％的胰蛋白胨、0.5％的氯化钠、1.5％的琼脂。
为了解各种炎症、感染部位的发病机制，发明人对398个志愿者的不同部位利用棉签擦拭采集样本，然后对采集到的样本进行菌落检测并统计A簇B型溶血性链球菌(GSA)、金黄色葡萄球菌(SA)、绿脓杆菌(PA)、大肠杆菌(EC)、变异链球菌(SM)和白色念珠菌(CA)的样本量，结果如下表1：
表1：六种病原菌检测数据图
通过表中数据，发明人发现，在牙龈、咽喉、阴道等部位的炎症或感染中均大都存在上述六中致病菌，为了对这些菌种起到灭杀的作用，同时减少给药次数、减轻患者痛苦，需要一种同时能够对上述六种致病菌有灭杀作用的药物。现有的卵黄免疫球蛋白(IgY)，在制备时由于受到技术的限制以及各菌落免疫物质表达之间的相互影响，通常只能复合不超过4种致病菌进行复合卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备。
为了说明本发明方案，发明人从市面上购买了上述六种菌种进行实验，所述六种菌种具体见表2：
表2：微生物来源、编码表
将上述六种菌种在37℃环境下用Luria-Bertani培养基(包括1％的胰蛋白胨、0.5％的酵母提取物、1％的氯化钠和1.5％的琼脂)在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基(包括0.3％的牛肉提取物、1％的胰蛋白胨、0.5％的氯化钠、1.5％的琼脂)中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养24h，所述恒温振荡培养箱的转速为200rpm；然后将上述培养的一部分各菌种繁殖的菌落分别用PH7.2的无菌磷酸盐缓冲液稀释，然后分别接种于胰蛋白酶大豆琼脂(Becton & Dickinson，Co.)上，以确定细菌的浓度；将余下的一部分细胞在4℃、10000g的条件下离心处理15min，然后将收集的细菌聚集物用无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次；将悬浮液在100℃的谁问下进行水浴灭活5min；最后，将浓缩得到的菌落用无菌磷酸盐缓冲液调节浓度为1.19×109CFU/ml，并在4℃的环境下储存备用；
选取20周大的白来航蛋鸡(Shavers SX288)，将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌40％，金黄色葡萄球菌15％，绿脓杆菌10％，大肠杆菌10％，变异链球菌15％，白色念珠菌10％的比例混合匀制得菌株混合体；然后将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/L的PBS溶液中制得菌株混合体溶液，所述菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml；按1∶1的比例将弗氏佐剂加入混合好的菌株混和体溶液中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；
将制得的复合抗原注射在上述白来航蛋鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗式不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋；
选取20只上述20周大的鸡，从第一次注射符合抗原开始收集所产的鸡蛋，然后SDS-PAGE(十二万基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行间接竞争ELISA方法检测鸡蛋中的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白含量，具体结果见附图1，从图中可以看出，首次注射第二周后抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白含量开始增加，第二周到第四周增幅最明显，第四周到第八周增幅较小，可以看出自第四周开始鸡蛋内的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白含量趋向平稳，从注射开始到第四周的时间与本发明方案的工四次注射、每次间隔十天所用的一个月时间相对应。采用本发明的对鸡进行免疫的步骤，可以使鸡蛋中的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白含量能够保持在一个较高的水平上。
用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.0；然后将其冷却至4℃，静置24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品；
将粗提物干粉成品通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，得到抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物。
选取上述方法培养的6种细菌各100CFU，然后将其与制得的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物进行混合，在37℃的环境下在Luria-Bertani培养基中进行培养，然后再0min、1min、2min、5min、10min和20min时对6个菌种分别进行菌种存活量检测，具体检测结果见附图2，从图中可以看出在1min时，菌种存活量明显降低，到2min时，各菌种存活量为0，可以看出，本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物对这六种致病菌有着很好的灭杀作用。
从上文提到的398个志愿者中分别挑选出患有口腔溃疡和阴道炎症的患者，然后在这些患者的病灶处擦拭本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，然后分别在第1天、第2天、第4天、第8天、第10天和第14天对这六中致病菌的增长率进行检测，口腔溃疡患者的检测结果见附图3，阴道炎症患者的检测结果见附图4，从图中结果可以看出，第1天对六种致病菌产生了抑制作用，在第2天作用更为明显，到第4天时上述六种致病菌的增长率基本为零，可以看出本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物这六种致病菌有着很好的灭杀作用，对炎症和溃疡的治疗有着很好的效果。
本发明中，还包括一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂，按照重量百分含量计其包括如下组分：
经过发明人的大量实验，经过对组分以及配方的筛选，发明人发现上述组分的选择和配比杀菌效果和安全性最好。
与传统的卵黄免疫球蛋白相比，本发明的优点是：本发明的选用独特比例的六中致病菌的复配，解决了现有技术中用于制备卵黄免疫球蛋时所用菌落不超过4种的这一难题，制得的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物能够对六种致病菌均能起到很好的灭杀作用；对鸡进行强化免疫时，采用弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂的配合使用，使得经受强化免疫的鸡产的鸡蛋中的特异性卵黄免疫球蛋白含量稳定并且处在一个很高的水平上；此外，本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物安全性良好、对人体无刺激。此外，本发明的一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白制成的制剂，安全性高、杀菌效果良好。
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图
图1：鸡蛋中IgY含量数据图
图2：IgY体外灭杀细菌数据图
图3：口腔患者病灶处菌落增长率示意图
图4：阴道炎患者病灶处菌落增长率示意图
图5：口腔中细菌分布图
图6：阴道中细菌分布图
附图说明：图5中，A为轻微口腔溃疡患者口腔擦拭物样本的细菌分布图；B为健康人员口腔擦拭物样本的细菌分布图；C为严重口腔溃疡患者口腔擦拭物样本的细菌分布图；D为严重口腔溃疡患者在使用本发明的IgY后的口腔擦拭物样本的细菌分布图；
图6中，A为阴道炎患者阴道擦拭物样本的细菌分布图；A为阴道炎患者使用本发明的IgY组合物后阴道擦拭物样本的细菌分布图；C为霉菌性阴道炎患者阴道擦拭物样本的细菌分布图；D为霉菌性阴道炎患者使用本发明的IgY组合物后阴道擦拭物样本的细菌分布图。
具体实施方式
实施例1
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，由如下方法制成：
复合抗原制备：选取A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，在37℃环境下用Luria-Bertani培养基(包括1％的胰蛋白胨、0.5％的酵母提取物、1％的氯化钠和1.5％的琼脂)在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基(包括0.3％的牛肉提取物、1％的胰蛋白胨、0.5％的氯化钠、1.5％的琼脂)中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养24h，所述恒温振荡培养箱的转速为200rpm，然后灭活备用；将培养好并经灭活处理的细菌按A簇B型溶血型链球菌25％，金黄色葡萄球菌15％，绿脓杆菌15％，大肠杆菌15％，变异链球菌15％，白色念珠菌15％的比例混合匀制得菌株混合体；然后将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/L的PBS溶液中制得菌株混合体溶液，所述菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml；按1∶1的比例将弗氏佐剂加入混合好的菌株混和体溶液中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；
对白来航蛋鸡(为描述方便，在本实施例下文中简称鸡)进行强化免疫：将制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋；
粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的4倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.5；然后将其冷却至6℃，静置12小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品；
纯化：将粗提物干粉成品通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，得到抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物。
实施例2
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，由如下方法制成：
复合抗原制备：选取A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，在37℃环境下用Luria-Bertani培养基在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养24h，所述恒温振荡培养箱的转速为200rpm，然后灭活备用；将培养好并经灭活处理的细菌按A簇B型溶血型链球菌40％，金黄色葡萄球菌15％，绿脓杆菌10％，大肠杆菌10％，变异链球菌15％，白色念珠菌10％的比例混合匀制得菌株混合体；然后将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/L的PBS溶液中制得菌株混合体溶液，所述菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml；按1∶1的比例将弗氏佐剂加入混合好的菌株混和体溶液中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；
对海兰褐鸡(为描述方便，在本实施例下文中简称鸡)进行强化免疫：将制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗式不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋；
粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至6.0；然后将其冷却至4℃，静置24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品；
纯化：将粗提物干粉成品通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，得到抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物。
实施例3
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，由如下方法制成：
进行强化免疫的鸡通过如下方法选择：用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出鸡种，待其长大至2-3个月，作为进行强化免疫的鸡。其余步骤参数与实施例1相同。
实施例4
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂，按照重量百分含量计其包括如下组分：
实施例5
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂，按照重量百分含量计其包括如下组分：
一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂，按照重量百分含量计其包括如下组分：
实施例7
选取一个含有上述六种致病菌的菌落(金黄色葡萄球菌为1861×103，大肠杆菌为1771×103，A簇B型溶血性链球菌为1195×103、绿脓杆菌2588×103、变异链球菌1687×103和白色念珠菌893×103，单位/cfu)然后分别选择实施例1制得的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物的粗提物，以及实施例5制得的制剂，分别选取与特异性卵黄免疫球蛋白组合物的粗提物等质量对应的制剂，然后分别在第2、5、10和20min测试菌落中各种细菌的个数并计算灭杀率，实施例1的粗提物灭杀具体数据见下表三：
表三：实施例1制得的粗提物灭杀细菌数据表
实施例5制剂的灭杀具体数据详见下表四：
表四：实施例5制得制剂灭杀细菌数据表
从表三、表四数据可以看出，二者对上述6种致病菌均有较好的灭杀作用，但从见效时间来看，实施例5制得的制剂在2min的灭杀吕达到99.99％；而实施例1制得的粗提物在2min的灭杀率均未超过50％，20min时灭杀率达到95％左右。可以看出，本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂杀菌效果良好、杀菌速度明显优于单纯的特异性卵黄免疫球蛋白组合物。
实施例8
分别取实施例4-6制得的制剂，分别涂抹在新西兰家兔的一只眼睛上，后用生理盐水冲洗，另一只眼作为对照，分别在1h、24h、48h观看其眼镜是否产生红肿、黏膜是否充血等状况，结果新西兰家兔均无不良反应；将新西兰家兔背部剪出相同的两块露出皮肤的部位，一块涂抹实施例4-6制得的制剂，一块作为空白对照，每天涂抹一次，连续14天，每天观察家兔的皮肤否产生水肿和红斑，发现新西兰家兔均无不良反应；别取实施例4-6制得的制剂，分别涂抹在雌性SD大鼠的阴道黏膜上，然后24h后处死，取出整个阴道观察是否有组织充血和红肿的现象，发现均无上述症状。可以看出，本发明的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂对人体无不良刺激作用。
采用GB15979-2002附录C《消毒技术法规》所在的方法测试上述制剂的稳定性，在37℃的恒温箱放置2个月(对应存放时间为2年)，分别取实施例4-6制得的制剂，采用过滤冲洗法的除药方式，作用1min，发现上述制剂对A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变异链球菌和白色念珠菌的灭杀率均未100％，可以看出上述制剂稳定性良好。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，所述六种致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、A簇B型溶血性链球菌，绿脓杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，其特征在于由如下方法制成：
复合抗原制备：选取A簇B型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变异链球菌和白色念珠菌，在37℃环境下用Luria-Bertani培养基在三气培养箱中培养18h；然后将上述菌种分离并分接种到肉汤培养基中，在37℃环境下在恒温双层振荡培养箱中培养24h，所述恒温振荡培养箱的转速为200rpm，然后灭活备用；将培养好并经灭活处理的细菌按A簇B型溶血型链球菌25-40％，金黄色葡萄球菌15-20％，绿脓杆菌10-15％，大肠杆菌10-15％，变异链球菌10-15％，白色念珠菌10-15％的比例混合匀制得菌株混合体；然后将混合好的菌株混合体溶解在0.1mol/L的PBS溶液中制得菌株混合体溶液，所述菌株混合体溶液的浓度为1mg/ml；按1∶1的比例将弗氏佐剂加入混合好的菌株混和体溶液中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；
对鸡进行强化免疫：将制得的复合抗原注射在20周大的鸡的胸肌和大腿处，每处分别注射0.5ml；然后每隔10天强化注射一次，共免疫四次；首次注射时所用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂，第二次到第四次所采用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，在最后一次注射后收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋；
粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的4-6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.0-6.0之间；然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品；
纯化：将粗提物干粉成品通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，得到抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物；
所述进行强化免疫的鸡通过如下方法选择：用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出鸡种，待其长大至2-3个月，作为进行强化免疫的鸡；
所述进行强化免疫的鸡为海兰褐鸡、京红鸡、伊莎白鸡和白来航蛋鸡中的一种。
2.根据权利要求1所述的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，其特征在于：所述制备菌株混合体的各菌落比例为：A簇B型溶血型链球菌40％，金黄色葡萄球菌15％，绿脓杆菌10％，大肠杆菌10％，变异链球菌15％，白色念珠菌10％。
3.根据权利要求1所述的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，其特征在于：所述粗提取物制备：用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，除去蛋清，留取蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀；调试pH至5.0；然后将其冷却至4℃，静置24小时；然后经高速离心分离机离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，将质量浓度为14％的硫酸钠溶液加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再经高速离心机离心分离，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得粗提物干粉成品。
4.根据权利要求1所述的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，其特征在于：所述LB培养基包括1％的胰蛋白胨、0.5％的酵母提取物、1％的氯化钠和1.5％的琼脂。
5.根据权利要求1所述的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物，其特征在于：所述肉汤培养基包括0.3％的牛肉提取物、1％的胰蛋白胨、0.5％的氯化钠、1.5％的琼脂。
6.根据权利要求1所述的抗六种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白组合物制成的制剂，其特征在于按照重量百分含量计包括如下组分：
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