CN101455235A - 一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂、制备方法及应用 - Google Patents
一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂、制备方法及应用，属于生物技术领域。其特征是取水果致腐细菌或真菌中的一种或多种作为免疫原，或将菌体与相应孢子混合作为免疫原，对蛋鸡进行注射免疫(初免和加强免疫，共三次)，收集免疫后鸡蛋，分离纯化，制备出单价或多价特异性卵黄抗体制剂。制备时经过菌体来源和培养、免疫原制备、免疫、抗体制备等程序。本发明的有益效果是0.02－80％的特异性卵黄抗体配以99.98－20％辅料(水、壳聚糖、乙酸、甘油、丙二醇)制成喷雾剂、浸泡液、涂抹液，对水果保鲜效果好且不影响水果原有的口感和色泽，无毒副作用，制备方法易于规模化生产，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体(IgY)制剂、制备方法及其应用，该特异性卵黄抗体制剂具有显著的保鲜水果的功效。
背景技术
水果是世界性的主要农产品，是人们日常生活中不可缺少的副食品，并且是食品工业重要的加工原料。我国加入WTO以后，水果生产和水果贮藏加工业的发展已经成为水果生产和经营者关注的焦点。中国是最大的水果生产和消费国家，我国水果因采后处理技术落后，作为产量第一大国，水果腐烂损失也高居全球榜首，每年在贮藏、运输上市销售及消费中变质的水果占总产量的20％～30％，造成巨大浪费和经济损失。目前水果的主要致腐原因有物理损伤(20％)、细菌致腐(30％)、真菌致腐(50％)，像樱桃等水果主要的致腐真菌有扩展青霉菌(Penicillium expansum)、葡萄孢属灰质菌(Botrytis.sp)、念珠球菌(Moniliniafructicola)、链格孢属菌(Alternaria spp)、酒曲霉菌(Rhizopusnigricans)、囊孢菌属(Physalospora)(焦中高等；甜樱桃采后生理与贮藏保鲜.水果学报.2003.206：498～502)灰霉菌(Botrytis Cinerca)、漏病真菌(Mucorpiriformis)、根霉菌(Rhizopus spp)、毛霉菌(Mucor)、粘盘孢菌(G.album)、多生盘长孢菌(G.percnnans)、果镰刀丛梗孢菌(Moniliafructigena)(R.T.Burchill，R.B.Maude；鲜果在贮藏中的微生物腐烂.Outlook on Agriculture.1986.Vol.15，No.4)；致腐细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、醋酸杆菌属(Acetebacter)、节杆菌属(Arthrgacter)(杨坚；苹果腐烂菌群分析.食品科学.1922.11)等。目前采后水果防腐保鲜的主要措施有：降低温度，由于低温贮藏不能完全阻止采后病害的发展，多种菌种比较耐低温在冷藏情况下仍能够在水果上生长，并造成水果腐烂(张红印；罗伦隐球酵母对水果采后病害的生物防治及其防治机理研究.浙江大学博士学位论文.2004.6)；气调贮藏，虽然采用气调冷藏的方法在果蔬防腐保鲜方面能取得很好的效果，但是气调库建筑投资大、运行成本高等因素制约了在发展中国家的应用和普及；热处理，水果采后热处理虽可有效地控制腐烂，保持果实硬度，但对很多水果处理作用不明显，并且所处理的产品易发生伤害是热处理使用中的严重限制因素；辐照处理，然而采用辐照处理有时会有负面作用，主要有颜色破坏、维生素损失和使果品表面变软(Salunkhe，D.K.，Bolin，H.R.；Storage processing andnutritional quality of fruits andvegetables.Storage Methods.1991.Vol I.(2nd ed.)，43～294.)化学杀菌剂处理，化学杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康，1991年欧洲议会决定，一旦可行就全部禁用化学农药处理采后的果蔬(Wisniewski，M.E.，Wilson，C.L；Biological control of postharvest diseases offruits and vegetables：recent advance.HortScience.1992.27：94～98.)；微生物性防腐保鲜物质，利用拮抗性微生物来控制病害是一项新技术，但由于其拮抗菌种数量有限以及防治效果不明显不能成为有效的防腐剂，也不利于工业化生产。植物性防腐保鲜物质，植物源防腐保鲜剂由于其见效慢、作用较小，多针对一种或几种水果防腐贮藏，使用时具有一定的局限性，有的价格昂贵，使用技术不容易掌握等缺点而不能得到广泛应用(郭松年；丁香提取液对水果防腐保鲜效果研究.西北农林科技大学硕士论文.2006.6)。
卵黄免疫球蛋白(Yolk Immunoglobulin，IgY)，亦称卵黄抗体，是富集在禽类卵黄中的活性抗体分子，因其在抗菌、抗病毒方面的优良特性，近年来引起各国研究者的广泛关注。IgY的热稳定性与贮藏稳定性非常好，将制剂贮存于4℃5年或置室温下6个月经免疫扩散法检测，抗体活性没有降低。研究表明，口服IgY可为人或动物提供有效的被动免疫保护，防止由细菌或病毒引起的消化道或非消化道感染，如抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)IgY能预防和治疗胃溃疡(Shin J.H.etal.；Use of egg yolk-derived immunoglobulin as an alternative toantibiotic treatment for control of Helicobacter pylori infection.Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002，9(5)：1061-1066)，抗产肠毒素型大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichia coli)IgY可防治新生及断奶仔猪腹泻(LiX.Y.etal.；Chitosan-AlginateMicrocapsules for Oral Delivery of Egg Yolk Immunoglobulin(IgY).J.Agric.FoodChem.2007，55：2911-2917；尤建嵩等；鸡卵黄抗体在防治家畜疾病中的应用.中国饲料，2003，19：8-9；Yokoyama H.et al.，Passive protective effect of chicken egg yolkimmunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection inneonatal piglets.Infect.Immun.1992，60(3)：998-1007)，抗奶牛乳腺炎IgY能明显抑制奶牛乳腺炎致病菌的体外增殖(Zhen Y.H.etal.，Charcterization of specific eggyolk immunoglobulin(IgY)against mastitis-causing Escherichia coli.Vet.Microbiol.2008.130(1-2)：126-133；王宇等，抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体的制备及活性研究.辽宁师范大学学报.2006.29：90-91)并减轻乳腺炎症状(StadelmanW.J.etal.，The incredibly functional egg.Poult.Sci.1999.78(6)：807-811)。并且IgY能抑制白色念珠球菌等真菌的体外生长(El-Sayed Moustafa Ibrahim.et al.，In vitroand in vivo effectiveness of egg yolk antibody against Candida albicans(anti-CAIgY).Vaccine.2008.26，2073—2080)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体(IgY)制剂、制备方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
特异性卵黄抗体(IgY)制剂：对于要进行保鲜处理的水果，取该水果致腐细菌或真菌中的一种或多种菌体作为免疫原或者将一种或多种菌体与其相应的孢子混合后作为免疫原；对蛋鸡进行注射免疫(初免和加强免疫，共计三次)；收集免疫后鸡蛋，分离并纯化特异性卵黄抗体(IgY)；制备出单价或多价的特异性卵黄抗体(IgY)制剂。
该特异性卵黄抗体(IgY)制剂的制备方法如下：
A、菌体的来源和培养：选择来自腐烂部位分离的细菌或真菌，用培养基分离培养和扩增培养，经鉴定确认。
B、免疫原制备：前一步骤A得到的菌体制成菌液后经处理与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗。
C、免疫：初免为弗氏完全佐剂疫苗，二、三免为弗式不完全佐剂疫苗；初免每只鸡胸肌注射2到6点，颈部皮下注射1到3点，每点0.1-0.3ml；初免后2周进行二免，方法同初免，每点免疫剂量增加至0.2-0.4ml；二免后2周进行三免，每点免疫剂量增加至0.3-0.5ml。
D、特异性卵黄抗体(IgY)的制备：定期收集免疫后的鸡蛋，分离纯化特异性卵黄抗体。
该特异性卵黄抗体(IgY)制剂可以制成喷雾剂、浸泡液、涂抹液；喷雾剂、浸泡液、涂抹液采用0.02-80％的特异性卵黄抗体配以99.98-20％辅料制成。辅料包括水、壳聚糖、乙酸、甘油、丙二醇等。
本发明的效果和益处是：
本发明得到的各种特异性卵黄抗体(IgY)对水果保鲜的效果好；不会影响水果的口味、色泽，无毒副作用，安全可靠；本发明所述的方法易于规模化生产，且成本低廉，是一种安全的水果保鲜制剂，卵黄抗体(IgY)本身为一种蛋白质具有很高的营养价值。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
下面我们以抗樱桃主要致腐菌扩展青霉菌(Penicillium expansum)为例；其他水果主要致腐菌如葡萄孢属灰质菌(Botrytis.sp)、念珠球菌(Moniliniafructicola)、链格孢属菌(Alternaria spp)、酒曲霉菌(Rhizopus nigricans)、囊孢菌属(Physalospora)、灰霉菌(Botrytis Cinerca)、漏病真菌(Mucorpiriformis)、根霉菌(Rhizopus spp)、毛霉菌(Mucor)、粘盘孢菌(G.album)、多生盘长孢菌(G.percnnans)、果镰刀丛梗孢菌(Moniliafructigena)、芽孢杆菌属(Bacillus)、醋酸杆菌属(Acetebacter)、节杆菌属(Arthrgacter)等都可参照下述方法进行实施。
实施例1：抗樱桃主要致腐菌扩展青霉菌(Penicillium expansum)特异性卵黄抗体(IgY)的制备方法，步骤如下：
A、菌体种类：扩展青霉菌
菌体的来源和培养：扩展青霉菌，来自樱桃腐烂部位分离的扩展青霉菌，PDA培养基分离培养和扩增培养，并经鉴定确认为扩展青霉菌。
B、免疫原制备
将25℃条件下PDA培养的扩展青霉菌用磷酸缓冲液悬浮制成菌液于4℃8000r/min离心15min，收集菌体，再用磷酸缓冲液悬浮，调节菌体浓度至108-1012cfu/ml，悬液在80℃下热激30分钟灭活，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等量弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成扩展青霉菌灭活疫苗。
C、免疫
初免为弗氏完全佐剂疫苗，二、三免为弗氏不完全佐剂疫苗。初免每只鸡胸肌注射4点，颈部皮下注射1点，每点0.2ml。初免后2周进行二免，方法同初免，每点免疫剂量增加至0.3ml。二免后2周进行三免，每点免疫剂量增加至0.4ml。
D、抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)的制备
三免后收集鸡蛋，先用清水洗净蛋表污物，再用0.5％新洁尔灭溶液浸泡消毒20min，晾干。使用卵黄分离器分离卵黄，去除卵清蛋白和卵黄膜，收集卵黄，加6倍于卵黄体积的蒸馏水，用0.1M盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，4℃ 10000r/min离心25min，取上清，经直径0.45μm滤膜过滤，收集的滤液即为WSF(水溶性组分，Water Soluble Fraction)。在WSF中缓慢加入(NH4)2SO4至饱和度为50％，混匀，待完全溶解后置4℃过夜。4℃ 10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，再加入Na2SO4至饱和度为14％，混匀，置室温过夜。25℃ 10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，即为卵黄抗体(IgY)的提取液。经凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE测得卵黄抗体(IgY)的纯度达90％以上，用单向琼脂扩散法测得卵黄抗体(IgY)含量超过33％，采用ELISA(酶联免疫吸附实验)测得特异性卵黄抗体(IgY)效价达1：200000。
实施例2：抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)喷雾剂应用于樱桃保鲜
抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)提取物1.0％，壳聚糖6.0％，乙酸0.75％，甘油2.0％，丙二醇2.0％，加蒸馏水补充至100％，经微孔滤膜过滤除菌，装入消毒的喷剂灌中；使用时喷洒在水果表面，晾干贮藏即可。
实施例3：抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)浸泡液应用于樱桃保鲜
用含抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)提取物1.5％的无菌水溶液浸泡水果，再用含壳聚糖7.0％，乙酸0.75％，甘油2.5％，丙二醇2.5％的无菌水溶液浸泡水果，晾干贮藏即可。
实施例4：抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)涂抹液应用于樱桃保鲜
抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体(IgY)提取物2.0％，壳聚糖5.0％，乙酸0.65％，甘油2.0％，丙二醇3.0％，加蒸馏水补充至100％，经微孔滤膜过滤除菌，装入消毒的涂抹灌中，使用时直接涂抹在水果表面，晾干贮藏即可。
实施例5：抗扩展青霉菌特异性IgY制剂的实际应用实验
1.实验对象：没有机械损伤及腐烂迹象的优质樱桃
2.实验目的：研究抗扩展青霉菌特异性IgY制剂的保鲜效果
3.检查指标或采用指数
(1)果实硬度(kg·cm)
(2)可溶性固形物(％)
(3)可滴定酸(TA)(％)
(4)果实中维生素C(mg/100g)
(5)果实腐烂率及腐烂指数
根据果实腐烂面积分为4级，0级为未腐烂；1级腐烂面积小于整个果实的1级腐烂面积小于整个果实的2/3大于整个果实的1/3；3级为整个果完全腐烂。
(6)果梗褐变率和褐变指数：果梗褐变率％＝褐变的果数/总果数×100，根据果梗褐变程度分为4级，0级为未褐变；1级果梗褐变程度小于整个果梗的1/3；2级果梗褐变程度小于整个果梗的2/3大于整个果梗的1/3；3级为整个果梗完全褐变。
(7)鲜食品质感官品评
鲜食品质根据品评组人员的口感打分，分为五个等级。5分：风味浓郁，与采收时的口感相当或更好；4分：风味正常，接近采收时的口感；3分：风味较正常，比采收时的口感差；2分：风味淡，与采收时的口感差异较大；1分：风味很淡或有异味。
4.结果分析
1.IgY的浸泡液：将樱桃先浸泡在IgY溶液中再浸泡在壳聚糖溶液中，晾干，贮藏于0℃，50天后观察。
2.IgY的喷雾剂：将喷剂液直接喷洒在樱桃表面，晾干，贮藏于0℃，50天后观察。
3.IgY的涂抹液：将IgY涂抹液直接涂抹在樱桃上，贮藏于0℃，50天后观察。
4.对照组：不做处理，贮藏于0℃，50天后观察。
Claims (8)
1.一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂，其特征在于：对于要进行保鲜处理的水果，取该水果致腐细菌或真菌中的一种或多种菌体作为免疫原或者将一种或多种菌体与其相应的孢子混合后作为免疫原；对蛋鸡进行注射免疫，初免和加强免疫，共计三次；收集免疫后鸡蛋，分离并纯化特异性卵黄抗体，制备出单价或多价的特异性卵黄抗体制剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂，其特征在于：所述的水果致腐细菌或真菌为扩展青霉菌、葡萄孢属灰质菌、念珠球菌、链格孢属菌、酒曲霉菌、囊孢菌属、灰霉菌、漏病真菌、根霉菌、毛霉菌、粘盘孢菌、多生盘长孢菌、果镰刀丛梗孢菌、芽孢杆菌属、醋酸杆菌属、节杆菌属。
3.权利要求1或2所述制剂的制备方法，其特征在于如下步骤：
A、菌体的来源和培养：选择来自腐烂部位分离的细菌或真菌，用培养基分离培养和扩增培养，经鉴定确认；
B、免疫原制备：前一步骤A得到的菌体制成菌液后经处理与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗；
C 免疫：初免为弗氏完全佐剂疫苗，二、三免为弗式不完全佐剂疫苗；初免每只鸡胸肌注射2到6点，颈部皮下注射1到3点，每点0.1-0.3ml；初免后2周进行二免，方法同初免，每点免疫剂量增加至0.2-0.4ml；二免后2周进行三免，每点免疫剂量增加至0.3-0.5ml；
D、特异性卵黄抗体的制备：定期收集免疫后的鸡蛋，分离纯化特异性卵黄抗体。
4、权利要求1或2所述制剂的应用，其特征在于：采用0.02-80％制剂配以99.98-20％辅料制成喷雾剂、浸泡液、涂抹液，辅料包括水、壳聚糖、乙酸、甘油和丙二醇，所述的制剂采用权利要求1所述的用于水果保鲜的特异性卵黄抗体制剂。
5、抗樱桃致腐菌扩展青霉菌特异性卵黄抗体的制备方法，其特征在于如下步骤：
A、菌体的来源和培养：扩展青霉菌来自樱桃腐烂部位分离的扩展青霉菌，PDA培养基分离培养和扩增培养，并经鉴定确认为扩展青霉菌；
B、免疫原制备：将25℃条件下PDA培养的扩展青霉菌用磷酸缓冲液悬浮制成菌液于4℃ 8000r/min离心15min，收集菌体，再用磷酸缓冲液悬浮，调节菌体浓度至108-1012cfu/ml，悬液在80℃下热激30分钟灭活，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等量弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成扩展青霉菌灭活疫苗；
C、免疫：初免为弗氏完全佐剂疫苗，二、三免为弗氏不完全佐剂疫苗；初免每只鸡胸肌注射4点，颈部皮下注射1点，每点0.2ml；初免后2周进行二免，方法同初免，每点免疫剂量增加至0.3ml；二免后2周进行三免，每点免疫剂量增加至0.4ml；
D、抗扩展青霉菌特异性IgY的制备：三免后收集鸡蛋，先用清水洗净蛋表污物，再用0.5％新洁尔灭溶液浸泡消毒20min，晾干；使用卵黄分离器分离卵黄，去除卵清蛋白和卵黄膜，收集卵黄，加6倍于卵黄体积的蒸馏水，用0.1M盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，4℃ 10000r/min离心25min，取上清，经直径0.45μm滤膜过滤，收集的滤液即为水溶性组分；在WSF中缓慢加入(NH4)2SO4至饱和度为50％，混匀，待完全溶解后置4℃过夜；4℃10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，再加入Na2SO4至饱和度为14％，混匀，置室温过夜；25℃ 10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，即为IgY的提取液；经凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE测得IgY的纯度达90％以上，用单向琼脂扩散法测得IgY含量超过33％，采用酶联免疫吸附实验测得特异性IgY效价达1：200000。
6、抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体喷雾剂应用于樱桃保鲜的方法，其特征在于：抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体提取物1.0％，壳聚糖6.0％，乙酸0.75％，甘油2.0％，丙二醇2.0％，加蒸馏水补充至100％，经微孔滤膜过滤除菌，装入消毒的喷剂灌中，使用时喷洒在水果表面，晾干贮藏即可。
7、抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体浸泡液应用于樱桃保鲜的方法，其特征在于：用含抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体提取物1.5％的无菌水溶液浸泡水果，再用含壳聚糖7.0％，乙酸0.75％，甘油2.5％，丙二醇2.5％的无菌水溶液浸泡水果，晾干贮藏即可。
8、抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体涂抹液应用于樱桃保鲜的方法，其特征在于：抗扩展青霉菌特异性卵黄抗体提取物2.0％，壳聚糖5.0％，乙酸0.65％，甘油2.0％，丙二醇3.0％，加蒸馏水补充至100％，经微孔滤膜过滤除菌，装入消毒的涂抹灌中，使用时直接涂抹在水果表面，晾干贮藏即可。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121226 Termination date: 20160107 |