CN1411378A - 含有抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋及含有该IgY的酸乳和冰淇淋的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过同时采用引起肠炎的大肠杆菌、引起胃炎的幽门螺杆菌以及引起食物中毒的肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗原蛋白免疫雏鸡以生产含有抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋来防止胃炎、腹泻和食物中毒的方法。本发明也涉及含有如上所述特异IgY抗体的组合物，和含有抗病原体IgY的食物如酸乳和冰淇淋。另外，本发明提供了从蛋黄中分离含IgY蛋白粉的方法。具体地，该分离方法包括用水以1∶1比例稀释蛋黄，加入适当量的硫酸铵，其能使水溶性蛋白和磷脂分离。

Description

含有抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋及含有该IgY 的酸乳和冰淇淋的生产方法
技术领域
本发明提供了通过同时采用引起肠炎的大肠杆菌、引起胃炎的幽门螺杆菌和引起食物中毒的肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗原蛋白免疫雏鸡以产生含有抗病原菌的特定抗体(IgY)的鸡蛋防止胃炎、腹泻和食物中毒的方法，还提供了以适当比例混合如上所述的特异抗体的蛋白粉的组合物，该组合物是用四种抗原单独免疫产生的，以及提供用牛奶加工的食物，如酸乳和冰淇淋，其中含有抗病原菌的特异抗体(IgY)。
另外，对于分离特异抗体蛋白粉的方法，分离蛋白和磷脂的方法尤其用蒸馏水以1∶1比例稀释蛋黄，加入适当量的硫酸铵，其使水溶性蛋白和磷脂分离，以及分离蛋黄和水溶性蛋白的方法用蒸馏水稀释分离溶液，在一定温度下放置，从而沉淀和纯化蛋白。
背景技术
根据有关肠产毒性大肠杆菌的报道，一种肠致病性大肠杆菌寄居在人或动物的肠道中，引起腹泻和腹痛，它在成人和儿童中都是肠炎病原体。迄今，报道有5种腹泻病原体；即肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵染性大肠杆菌(EIEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠粘附性大肠杆菌(EAEC)。Adam在1923年从儿童腹泻病人中分离出大肠杆菌并且报道了它们是导致肠炎的病原体。在上世纪40年代中期，由大肠杆菌导致的腹泻在英格兰的托儿所经常成批发生。由于Neter第一次将它们命名为肠病原性大肠杆菌，后来人们就将该组大肠杆菌称为病原性大肠杆菌。
涉及大肠杆菌专利的现有技术概括如下。
Kim jungwoo等(1999)提交了专利，其目的是提供利用猪中产生的ETEC K88菌株，从蛋黄免疫球蛋白(IgY)中产生蛋黄抗体并有效分离的方法。同样，Kim jungwoo等(1999)又提交了专利，其目的是提供利用猪中产生的ETEC K99菌株和K88菌株从蛋黄免疫球蛋白(IgY)中生产蛋黄抗体并有效分离的方法。另外，Kim jungwoo等(1999)提交了专利，其目的是利用猪中产生的ETEC987p菌株和K88菌株，从蛋黄免疫球蛋白(IgY)中产产蛋黄抗体并有效分离的方法。GodamaYoshikashi(1998)提交了专利，其利用从肠出血性大肠杆菌(EHEC)的全部和vero细胞毒素免疫的母鸡中得到的蛋黄抗体(IgY)，预防和治疗肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染。另外，一些专利已经概括如下，其涉及到预防幽门螺杆菌感染引起十二指肠炎的药物。
利用抗原-抗体的反应治疗胃炎和十二指肠炎的工作仍在继续，Coler等分离了免疫球蛋白治疗来自哺乳动物乳汁的幽门螺杆菌引起的胃炎和肠炎(1992)。Taiyo gakakusha通过用抗原化幽门螺杆菌抗原化和免疫产蛋的母鸡来分离特定的抗体。利用的抗原是幽门螺杆菌菌株ATCC 43504、43506、43579和43629。近来，在动物和哺乳动物中常见的感染性疾病，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠致病性大肠杆菌正日益产生巨大的社会问题。发生频率最高的是食物中毒，即可归于细菌的食物中毒。引起食物中毒的主要病原体是沙门氏菌、霍乱弧菌或葡萄球菌，在人中，对肠细菌引起的食物中毒，沙门氏菌的发生频率最高。因为沙门氏菌引起的食物中毒病人是总数的37.7％。沙门氏菌是食物中毒的主要原因，霍乱引起的食物中毒在夏天发生，而沙门氏菌引起的食物中毒常年都有报道。所以控制非常重要。可归于沙门氏菌的食物中毒除了北美以外连续发生在南美和欧洲。而且病原体的发生和存在的比例在增高，这是因为牛的集体运输、环境污染和集体用餐如学校的自助食堂的情况多了起来。完全消除沙门氏菌是不可能的，因为沙门氏菌有2400种血清型，除了鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum，Salmonella gallmarum)，都能在任何条件下感染一个以上的动物，而没有寄主限制。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌已报道是食物中毒的主要原因(KFDA，the journal of epidermicoccurrence information，Kim，Hohoon(1997))。通常，感染的主要过程是在鸡蛋外面感染上，但鸡蛋里面感染可以是沙门氏菌的感染过程。特别对于肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，有报道说，在鸡蛋的感染中，感染是从卵巢转移到蛋黄的，这样可以看出鸡蛋内感染的重要性。所以，鸡蛋感染的预防可能是阻止传染过程预防可归于沙门氏菌食物中毒的关键。
作为涉及沙门氏菌的现有技术，Song Kyungbin(2000)提交的专利是关于麦芽糖结合蛋白与肠炎沙门氏菌的ATFA亚基的融合蛋白在大肠杆菌的表达。本发明目的是用于制造诊断试剂盒，并开发针对鸡的主要疾病沙门氏菌感染的疫苗。正如上文提到，各种方法如利用抗生素和天然资源已试图用于阻止螺杆菌和沙门氏菌的生长，但药效评估还没有定论。正如食物中毒的问题每年都在上升，生产含有针对沙门氏菌的抗体和其他抗体可能是更有效的和根本的预防方法。通常，生产针对一些病原体的抗体和利用抗体进行治疗已知是最理想的治疗方法。生产和分离每个病原体的特定抗体仍然有待在工业规模中解决。
作为涉及其他发明的现有技术，有一些发明涉及从含有一种特异免疫蛋白IgY的蛋黄中分离蛋白和磷脂的方法。蛋白占整个蛋黄的15-17％，含有主要种类α、β和γ-卵黄蛋白。IgG类的γ-卵黄蛋白是卵黄中存在的特异免疫蛋白(Poson等，1980)，通常已知是IgY。IgY是可以口服的特异免疫蛋白(McBee等，1979)。对于IgY的分离，第一步是除去蛋黄中的脂和脂蛋白。
对于除去脂和脂蛋白的方法，有通过超离心分离脂蛋白的方法(Bade，1984)、利用有机溶剂除去脂的方法(Polson等，1980)以及利用聚乙二醇(PEG)和葡聚糖硫酸钠(SDS)(Hachida，1993)沉淀脂蛋白的方法。尤其是利用天然多糖“角叉藻聚糖”的方法，其已广泛用作食物的增稠稳定剂，并且强烈地激活鸡蛋黄脂蛋白的凝结(Hansen等，1998)。
上述的现有技术尽管已经用于分离来自蛋黄的水溶性蛋白和脂，但在工业规模上纯化和分离大量产物有低效和高成本的限制。
发明内容
为了解决上述现有技术的问题，本发明目的提供了生产含有抗致病菌特异抗体(IgY)的鸡蛋的方法，即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和鼠伤寒沙门氏菌IgY，并且提供用奶加工的食物，如酸乳和冰淇淋，其中含有抗病原菌特异抗体(IgY)的混合物。
另外，对于从蛋黄分离水溶性蛋白的方法，本发明允许利用非毒性硫酸铵和蒸馏水大规模地分离和纯化，而不需要超离心和沉淀，这和现有技术有所不同。
为了实现上述的技术主题，本发明涉及：
(1)含有抗致病菌特异抗体(IgY)的鸡蛋的生产方法，所述IgY包含抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY，所述生产方法是注射1ml的经氢氧化铝以一定比例乳化的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白由大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌组成；然后每次注射1ml的经乳化佐剂ISA25乳化的各混合抗原蛋白继续免疫雏鸡两次，两次之间间隔一周；再每次用0.5ml经乳化佐剂ISA25以相同比例乳化的混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，两次免疫间隔3个月。总共免疫5次。
详细地说，含有抗混合致病菌特异抗体(IgY)的鸡蛋的生产方法包括如下步骤：给雏鸡施用1ml的大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白以一定比例与氢氧化铝乳化，其中含有大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用0.3ml氢氧化铝乳化。大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌∶乳化佐剂＝1.5∶1∶1∶3.5∶3；对第二次和第三次注射，施用1ml经乳化佐剂ISA25以比例1∶1稀释的混合抗原蛋白两次，两次免疫间隔一周；再每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，两次免疫间隔3个月，所述乳化混合抗原蛋白含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，并以相同比例用0.3ml氢氧化铝乳化。总共免疫5次。
(2)含有抗混合致病菌特异抗体(IgY)的鸡蛋的另一生产方法，其施用1ml的经完全弗氏佐剂以一定比例乳化的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白由大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和大鼠伤寒沙门氏菌组成；然后每次用1ml的经不完全弗氏佐剂乳化的混合抗原蛋白两次，两次免疫间隔两周；每次用0.5ml以相同比例乳化的混合抗原蛋白再免疫已成熟的产蛋母鸡两次，两次免疫间隔3个月。总共免疫5次。
(3)含有抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋的另一生产方法的不同点在于：只用大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌免疫，而不是四种病原体，所采用的鸡蛋生产方法与(1)和(2)相同。
(4)另一发明涉及特异免疫蛋白的分离方法包括下列步骤：收集从同时含有抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋中分离的35g蛋黄，放入250ml的瓶中，与35ml碱离子水(pH9)混合，5-10C放置24小时，加入18倍体积的碱离子水(pH10)(1260ml)，放置48小时，分离含有水溶性特异免疫蛋白的上清液，用超滤系统浓缩上清液，并冷冻干燥浓缩的上清液。
另一分离特异免疫蛋白的方法包括下列步骤：用蒸馏水以一定比例稀释从含有混合抗病原菌特异抗体(IgY)的鸡蛋中分离的蛋黄，在蒸馏水和蛋黄的的稀释液中加入硫酸铵，以分离水溶性特异免疫蛋白和磷脂，放置一段时间，在除去除上层脂后，稀释收集的上清液，放置一段时间，然后分离/纯化特异免疫蛋白，更优选地，其中蛋黄和蒸馏水的稀释比例是1∶1，或其中加入的硫酸铵量是3～10％，优选5～6％。
(5)另一发明涉及抗病原体特异免疫蛋白粉的混合组合物，其制备方法是将从分别含有特异免疫蛋白的鸡蛋中分离出的各个水溶性特异免疫蛋白(粗IgY)(大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠沙门氏菌∶幽门螺杆菌)混合。含有特异免疫蛋白的鸡蛋的生产方法如下：首次用1ml(108/ml)大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的各个抗原蛋白，所述抗原蛋白分别与乳化佐剂以1∶1比例乳化；然后每次用1ml经完全弗氏佐剂乳化的各抗原蛋白再免疫两次，两次免疫间隔两周，这些乳化的各抗原蛋白含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和0.5ml完全弗氏佐剂，幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，相应的比例都是1∶1；每次用0.5ml的各乳化抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，两次免疫间隔3个月，所述抗原蛋白含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，相应比例都是1∶1。总共免疫5次。
另一发明涉及抗病原体特异免疫蛋白粉的混合组合物，其生产方法是将从分别含有特异免疫蛋白的鸡蛋中分离的各个水溶性特异免疫蛋白(粗IgY)(大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌)混合。含有特异免疫蛋白的鸡蛋的生产方法如下：首次用1ml(108/ml)大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的各抗原蛋白免疫不同雏鸡，所述各抗原蛋白分别用乳化佐剂以1∶1比例乳化；然后再每次用1ml经乳化佐剂ISA25乳化的各抗原蛋白继续免疫两次，两次免疫间隔两周，这些抗原蛋白包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，相应比例都是1∶1；每次用0.5ml各种乳化抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，两次免疫间隔3个月，其含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA250.5ml，和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA250.5ml，相应比例都为1∶1。总共免疫5次。
(6)另一方法涉及用牛奶加工的食物的生产，如酸乳、冰淇淋和食物添加剂，其同时含有由(1)、(2)、(3)和(4)中所述方法生产的抗病原菌特异抗体(IgY)以及含有(5)中所述的抗病原体特异免疫蛋白粉的混合组合物。
按照上面所述的方法，本发明的优点是：
用奶加工的食物，如酸乳、冰淇淋和食物添加剂，其含有抗病原菌特异抗体(IgY)，通过摄食能有效地预防胃炎和肠炎。同样，利用含有抗沙门氏菌IgY的鸡蛋，可将灭菌减到最少，沙门氏菌的二次感染也可以预防。甚至在部分发生污染时，抗沙门氏菌IgY将能够缓解食物中毒的问题。
对于另一发明有关特异免疫蛋白的分离方法的效果，IgY的效价的损失可降到最少，在大量生产中只需要小量的硫酸铵，这比现有技术利用有机溶剂和沉淀剂分离脂和水溶性蛋白更具优势。用蒸馏水稀释并在4℃放置过夜后获得97％的回收率，可以完全除去蛋黄的颜色，并且不需要利用超速离心而完全分离，这样可以降低成本，本发明使之成为可能。
下文中，通过工作实施例、附图和表格可以更详细地叙述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
附图的简要说明
图1a是在用含有大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗幽门螺杆菌的特异IgY的效价的变化。
图1b是在用含有大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和大鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗沙门氏菌特异IgY的效价的变化。
图1c是在用含有大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗幽门螺杆菌特异IgY的平均效价。
图1d是在用含有大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗沙门氏菌特异IgY的平均效价。
图1e是用含有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗幽门螺杆菌特异IgY的效价的变化。
图1f是用含有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗大肠杆菌特异IgY的效价的变化。
图1g是用含有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗沙门氏菌特异IgY的平均效价。
图1h是在用含有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物免疫后，抗大肠杆菌特异IgY的平均效价。
图2a是从蛋黄中分离和纯化水溶性性特异免疫蛋白的方法的图解。
图2b表示经过硫酸铵处理蛋黄的水溶性特异免疫蛋白和脂蛋白的分离。
图2c是硫酸铵处理后水溶性特异免疫蛋白IgY的效价的变化。
图2d是按照稀释系数稀释的水溶性特异免疫蛋白IgY的效价变化。
图2e是在匀浆后，按照稀释系数稀释的水溶性特异免疫蛋白IgY的效价的变化。
图2f是通过浓缩和透析，水溶性特异免疫蛋白IgY的效价的变化。
图2g是在产产蛋黄酱后，水溶性特异免疫蛋白IgY的效价的变化。
图2h是在纯化后利用PAGE分析的水溶性特异免疫蛋白IgY的纯度。
本发明的最佳实施方式实施例11.分离肠致病性大肠杆菌和生产抗原a.分离和鉴定人的肠产毒性大肠杆菌(ETEC)
用于本发明的病原性大肠杆菌是从人中分离的。用作抗原的肠产毒性大肠杆菌(ETEC)是从儿童的腹泻物中分离的。大肠杆菌的分离过程如下。将儿童的腹泻物在血清琼脂平板上划线。在37℃温育18小时后，选择表现出α-溶血的肠产毒性大肠杆菌的菌落。在MacConkey琼脂中选择的菌落生长成粉红色菌落，并且在EMB琼脂中它生长成金属绿色菌落，这是大肠杆菌的特征。b.检测肠毒素生产能力
通过聚合酶链式反应(PCR)检测大肠杆菌的肠毒素生产能力。将特异于热稳定毒素(ST)的STa1基因和热标记毒素(LT)的LTh基因的引物用于多重PCR扩增。
ST毒素的引物是
有义引物：CCCCTCTTTTAGTCAGTC
反义引物：CCAGCACAGGCAGGATTACA
这些引物设计生成165bp的产物。
LT毒素的引物是
有义引物：CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
反义引物：TTCATACTGATTGCCGCA
这些引物设计生产417bp产物。
PCR条件如下：预变性95℃，5分钟，变性94℃1分钟，退火56℃1分钟，延伸72℃1分钟，循环结束后再延伸72℃10分钟。在2％的琼脂凝胶上电泳检测PCR产物。检测了用于本发明分离的大肠杆菌生产毒素的情况，该大肠杆菌菌株命名为EB-E01。c.肠产毒素大肠杆菌(ETEC)抗原的生产
在胰胨豆胨琼脂上接种肠产毒素大肠杆菌(ETEC)，37℃培养箱中温育18小时。选择一个菌落，接种到5ml的胰胨豆胨培养液中，生长2小时。将培养物接种到大量的胰胨豆胨培养液中，在37℃不振摇温育48小时。按总体积的6％在培养物中加入甲醛，并且在室温下永生24小时。在4000rpm下离心永生的培养物20分钟。用磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)洗涤回收的沉淀物3次。在PBS中悬浮回收的培养物，达到410nm处O.D.(Oculus Dexter)为1.2～1.3，备用。2.生产幽门螺杆菌抗原a)幽门螺杆菌
从美国典型培养物保藏中心取得幽门螺杆菌(ATCC43504)。在胰胨豆胨琼脂上培养该测试培养物；用含有10％羊血清的BBL进行传代培养，每3到5星期传代一次，在10％CO2的培养箱中于37℃下进行温育培养。通过显微镜方法和脲酶活性试验检测测试培养物。b)检测脲酶活性
利用含有脲和酚红的脲酶实验培养液进行脲酶活性的检测。通过在410nm处检测脲培养液的混合物，培养基的O.D.和540nm处实验处理物的O.D.可以确定脲酶的活性。c)细菌的形态学试验
裸眼观察培养3-5天的细菌的形态变化，在载玻片上将菌落划线，用革兰氏染色，并且在显微镜下(×1000)测定细菌的形态是否保持了曲线形态或者变化成球形。d)生产幽门螺杆菌抗原
用细胞收集器回收培养的幽门螺杆菌，悬浮在盐水中，通过在60℃的水浴加热30分钟永生化。在10,000×g离心15分钟，回收培养物，悬浮和离心步骤重复3次以除去培养基。用血细胞计数器计数永生化细菌的数目。3.生产肠炎沙门氏菌抗原和鼠伤寒沙门氏菌抗原
从韩国微生物保藏中心取得肠炎沙门氏菌No.12021(KCCM12021)，以及从韩国微生物保藏中心得到鼠伤寒沙门氏菌No.11863(KCCM 11863)。
在胰胨豆胨琼脂上接种肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，在37℃的培养箱中温育18小时。选择一个菌落，接种到大量的胰胨豆胨培养液中，在37℃不振摇温育48小时。在培养基中加入甲醛，其量为总体积的0.2％，在室温下永生化24小时。将永生化培养物在4000rpm离心20分钟。用盐水(pH7.2)洗涤回收的沉淀物3次。将收集的培养物储藏在-70℃，待用。4.通过在雏鸡中注射混合的4种抗原并且在产蛋的母鸡中加强注射
a)在1两周龄的雏鸡中注射细菌，数目是108/ml。其中的比例为大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌∶乳化佐剂＝1.5∶1∶1∶3.5∶3。详细地说，第一次注射采用混合抗原蛋白进行，其含有大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml，和幽门螺杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用0.3ml的氢氧化铝乳化。作为加强注射的第二次注射，混合抗原采用乳化佐剂ISA25乳化。对雏鸡进行两次注射，两次之间间隔两周，每次1ml。用0.5ml的各个乳化混合抗原注射28周龄的产蛋母鸡两次，两次之间间隔为3个月。总共免疫5次。
b)当利用的乳化佐剂是ISA25时，在用含有2个以上的抗原的抗原混合物免疫的组中，抗沙门氏特异IgY和抗幽门螺杆菌特异IgY的平均效价比只用一个抗原免疫的对照组明显地高(图1a，1b，1c，1d)。
c)在12周龄的雏鸡中注射的细菌数目是108/ml。其中的比例为大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌∶乳化佐剂＝1.5∶1∶1∶3.5∶3。详细地说，第一次注射采用混合抗原蛋白，其含有大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用0.3ml的完全弗氏佐剂乳化。作为加强注射的第二次注射，混合抗原采用不完全弗氏佐剂乳化。对雏鸡进行两次注射，两次之间间隔两周，每次1ml。用0.5ml的各个乳化混合抗原注射28周龄产蛋母鸡两次，两次之间间隔为3个月，总共免疫5次。结果是，从用乳化抗原的混合物免疫的母鸡中产生了同时含有抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠沙门氏菌IgY的鸡蛋。5.通过给雏鸡注射混合的3种抗原并在产蛋的母鸡中加强注射进行免疫
给12周龄雏鸡注射的抗原和乳化剂的比例是大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶乳化剂＝3.5∶1.8∶1.7∶3。详细地说，第一次注射采用1ml乳化混合抗原，其含有大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用0.3ml氢氧化铝乳化。对作为加强注射的第二次，混合抗原采用乳化佐剂ISA25乳化。对雏鸡中进行两次注射，两次之间间隔两周，每次用1ml同样比例的抗原混合物。然后，每次用0.5ml的各个乳化混合抗原蛋白注射已成熟的产蛋母鸡两次，两次之间间隔3个月，所述乳化混合抗原含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.18ml，鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用0.3ml的乳化佐剂ISA25乳化。总共注射5次。结果是：从用乳化的抗原混合物免疫的产蛋母鸡中生产了同时含有抗大肠杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋。
作为本发明的另一特征，给雏鸡第一次注射是用1ml混合抗原蛋白在一个鸡腿上进行的，所述混合抗原蛋白含有大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，用一定比例的完全弗氏佐剂乳化。对于作为加强注射的第二次，利用了与不完全弗氏佐剂乳化的混合抗原。对雏鸡进行两次注射，两次之间间隔两周，每次1ml相同比例的抗原混合物。然后，用0.5ml各个的乳化混合抗原蛋白注射已成熟产蛋母鸡两次，两次之间间隔为3个月。总共注射5次。结果是产生了同时含有抗大肠杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋。
详细地说抗原混合物的比例是大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶完全弗氏佐剂＝3.5∶1.8∶1.7∶3。第一次注射采用混合抗原蛋白，其含有大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.18ml，和鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用完全弗氏佐剂0.3ml乳化。对作为加强注射的第二次，利用与不完全弗氏佐剂乳化的混合抗原。给雏鸡1ml注射两次，两次之间间隔两周。然后，在产蛋母鸡的腿上注射0.5ml乳化混合抗原蛋白两次，两次之间间隔3个月，其含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用完全弗氏佐剂0.3ml乳化。总共注射5次。然后，生产了同时含有抗大肠杆菌IgY，抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋。
本发明的另一特征是水溶性抗菌特异免疫蛋白和含有抗混合细菌特异抗体(IgY)的特异免疫蛋白的生产方法，步骤如下。在某容器中加入如上生产的20g同时含有抗大肠杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的蛋黄，和同样量的碱离子水(pH9)(20ml)搅拌并且在5～10℃放置24小时。加入18倍体积(720ml)的碱离子水(pH10)，放置48小时，分离水溶性蛋白。通过中空纤维柱方法在超滤系统中浓缩上清液，并且冻干。6.分离蛋黄、分离蛋黄粉末、分离免疫蛋白和检测效价。a)分离蛋黄将根据上述方法生产的鸡蛋黄分离出来，并收集在烧瓶或瓶中。b)分离蛋黄粉
通过离心并且冻干分离的蛋黄产产蛋黄粉。c)分离免疫蛋白和测量效价
分离免疫蛋白的方法如下，采用常用方法进行效价的测量。
在250ml的瓶中收集35g没有膜的蛋黄，搅拌加入35ml的碱离子水(pH9)。在5～10℃放置24小时后，加入碱离子水(pH10)，其量为18倍体积(1260ml)的蛋黄上清液和碱离子水(1∶1)，放置48小时分离。利用中空纤维柱方法，在超滤系统中浓缩上清液，并冻干。
如下测量上述过滤产生的水溶性蛋白中的特异抗体的含量。用三明治ELISA方法进行特异抗体的含量测量。用缓冲溶液稀释幽门螺杆菌，直到660nm处的O.D.为0.05。将稀释的病原体包被到微量培养板，放置过夜。洗涤微量培养板，和过滤的水溶性蛋白温育，再次洗涤，用1/10,000稀释的兔抗鸡IgG Ab-HRP温育。将TMB用作HRP的底物，利用2N H2SO4终止反应。测量在450nm处的吸光值(图2a，2b，2c，2d)。7.生产含有四种抗体的酸乳a)提取水溶性的特异免疫蛋白
如下进行水溶性特异免疫蛋白的提取
在250ml的瓶中收集35g无膜的蛋黄，并且搅拌加入35ml的碱离子水(pH9)。在5～10℃放置24小时后，加入碱离子水(pH10)，其量为18倍体积(1260ml)的蛋黄上清液和碱离子水，放置48小时分离。利用中空纤维柱方法，在超滤系统中浓缩上清液，并冷干。a)生产含有新鲜蛋黄的酸乳
用幽门螺杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫生产的蛋黄生产酸乳(表3，4)。酸乳生产中的灭菌是严重问题。将销售限制于短的时期中，因为灭菌过程只是在65℃下1分钟，而这对病原体的灭菌是不合适的。在本发明中，通过开发含有抗沙门氏菌IgY的鸡蛋解决灭菌问题，因为其能用于酸乳生产而无需灭菌。b)生产含有已抽提的水溶性特异免疫蛋白的酸乳和冰淇淋
将幽门螺杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌抗原蛋白的混合抗原免疫产生的蛋黄分离，并与水溶性蛋白(粗提IgY)混合。表1，2，3和4中给出了冰淇淋和酸乳的混合比例。
表1
           含有抗四种细菌特异免疫蛋白的冰淇淋混合比例的例子
          材料     比例A     比例B     比例C
黄油牛奶乳清粉全脂奶粉脱脂奶粉白糖淀粉糖浆(70％白利)溶菌酶稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     5.0％36.0-15.6-5.014.50.50.65.0--若干17.8     5.0％23.0-14.6-5.013.50.50.6--15.0若干17.8     8.0％40.03.011.04.05.514.50.50.6-0.6-若干12.3
*混合细菌表示用混合的四种细菌免疫产生的蛋黄
表2
       含有抗四种细菌特异免疫蛋白的冰淇淋混合比例的例子
         材料     比例A     比例B     比例C
奶油(奶脂35％)脱脂浓奶(固形物30％)脱脂奶(固形物8％)脱脂奶粉玉米糖浆(80％白利)高果糖玉米糖浆(67％白利)溶菌酶稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     34.3％25.010.02.05.014.50.50.65.0--若干3.1     34.3％10.010.02.05.014.50.50.6--15.0若干3.1     34.0％25.011.04.05.514.50.50.6-0.6-若干4.3
*混合细菌表示用混合的四种细菌免疫产生的蛋黄
表3
        含有抗四种细菌特异免疫蛋白的酸乳混合比例的例子
       材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶白糖抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄水     0.496.100.602.50--0.40     0.493.600.60--5.000.40     3.0595.940.34-0.42-0.25
*混合细菌表示用混合的四种细菌免疫产生的蛋黄
表4
        含有抗四种细菌特异免疫蛋白的酸乳混合比例的例子
       材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶水果糖浆抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄水稳定剂     4.4078.1014.102.50--0.400.50     4.4080.609.10--5.000.400.50     8.0575.7715.01-0.42-0.250.50
*混合细菌表示用混合的四种细菌免疫产生的蛋黄
8.生产含有三种(大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)抗体的酸乳a)提取水溶性特异免疫蛋白
如下进行水溶性特异免疫蛋白的提取。
在250ml的瓶中收集35g无膜的蛋黄，并且搅拌加入35ml的碱离子水(pH9)。在5～10℃放置24小时后，加入碱离子水(pH10)，其量为18倍体积(1260ml)的蛋黄上清液和碱离子水，放置48小时分离。利用中空纤维柱方法，在超滤系统中浓缩上清液，并冷干。b)生产含有新鲜的蛋黄酸乳
通过利用大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫所生产的蛋黄用于生产酸乳(表7，8)。酸乳生产中的灭菌是严重问题。将销售限制于短期，因为灭菌过程是在65℃进行1分钟，而这对于病原体灭菌是不合适的。在本发明中，通过开发含有抗沙门氏菌IgY的鸡蛋解决了灭菌问题，因其能用于酸乳生产而无需灭菌。c)生产含有已抽提的水溶性特异免疫蛋白的酸乳和冰淇淋
分离通过大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫产生的蛋黄并且与水溶性蛋白(粗提IgY)粉混合。表5，6，7和8中给出了生产冰淇淋和酸乳的混合比例。
表5
    含有抗三种细菌特异免疫蛋白的冰淇淋混合比例的例子
       材料     比例A     比例B     比例C
黄油牛奶乳清粉全脂奶粉脱脂奶粉白糖淀粉糖浆(70％白利)溶菌酶稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     5.0％36.0-15.6-5.014.50.50.65.0--若干17.8     5.0％23.0-14.6-5.013.50.50.6--15.0若干17.8     8.0％40.03.011.04.05.514.50.50.6-0.6-若干12.3
*混合细菌表示用混合的三种细菌免疫产生的蛋黄
表6
    含有抗三种细菌特异免疫蛋白的冰淇淋混合物比例的例子
        材料     比例A     比例B     比例C
奶油(奶脂35％)脱脂浓奶(固形物30％)脱脂奶(固形物8％)脱脂奶粉玉米糖浆(80％白利)高果糖玉米糖浆(67％白利)溶菌酶稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     34.3％25.010.02.05.014.50.50.65.0--若干3.1     34.3％10.010.02.05.014.50.50.6--15.0若干3.1     34.0％25.011.04.05.514.50.50.6-0.6-若干4.3
*混合细菌表示用混合的三种细菌免疫产生的蛋黄
表7
    含有抗三种细菌特异免疫蛋白的酸乳混合比例的例子
      材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶白糖抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提取粉抗混合细菌*蛋黄水     0.4096.100.602.50--0.40     0.4093.600.60--5.000.40     3.0595.940.34-0.42-0.25
*混合细菌表示用混合的三种细菌免疫产生的蛋黄
表8
    含有抗三种细菌特异免疫蛋白的酸乳混合比例的例子
      材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶水果糖浆抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄水稳定剂     4.4078.1014.102.50--0.400.50     4.4080.609.10--5.000.400.50     8.0575.7715.01-0.42-0.250.50
混合细菌表示用混合的三种细菌免疫产生的蛋黄
实施例2
实施例2涉及通过混合单独制取的各个抗体而产生的特异免疫蛋白的混合物，和涉及含有从以相同方法生产的鸡蛋中提取的特异免疫蛋白的酸乳和冰淇淋。1.分离和鉴定肠致病性大肠杆菌及抗原生产
从人中分离用于本发明的肠致病性大肠杆菌。如实施例1所述进行肠致病性大肠杆菌(ETEC)的分离和鉴定及抗体的生产。2.幽门螺杆菌抗原的生产
如实施例1所述进行幽门螺杆菌抗原的生产。3.肠炎沙门氏菌抗原和鼠伤寒沙门氏菌抗原的生产。
如实施例1所述进行肠炎沙门氏菌抗原和鼠伤寒沙门氏菌抗原的生产。4.给雏鸡分别注射4种抗原并且给产蛋的母鸡加强注射进行免疫
a)用分别经乳化佐剂以1∶1的比例乳化的大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌各1ml(108/ml)免疫12周龄雏鸡，其相应含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和氢氧化铝0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和氢氧化铝0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和氢氧化铝0.5ml和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和氢氧化铝0.5ml，混合的比例都是1∶1。从第二个星期开始，施用1ml与乳化佐剂ISA25乳化的各个抗原蛋白，注射两次，两次之间间隔2星期。用0.5ml各个乳化抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡，其相应含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml，混合的比例都是1∶1，注射两次，每次之间间隔3个月。总共5次。四种抗原(大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)没有混合，而是各自注射。
b)用乳化佐剂以1∶1的比例分别乳化的大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌各1ml(108/ml)免疫12周龄的雏鸡，其相应含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，混合的比例是1∶1。从第二个星期开始，用1ml与不完全弗氏佐剂乳化的各个抗原蛋白免疫两次，两次之间间隔2星期。已成熟的产蛋母鸡用0.5ml各个乳化抗原蛋白免疫，其相应含有大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，混合的比例是1∶1，免疫两次，两次之间间隔3个月。四种抗原(大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)没有混合使用，而是分开注射的，总共注射5次。结果是从用乳化的单独抗原免疫的产蛋母鸡中产生了分别含有抗大肠杆菌的IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋。5.分离蛋黄、分离蛋黄粉、分离免疫蛋白和测量效价
按照实施例1进行蛋黄的分离、蛋黄粉的分离、免疫蛋白的分离和效价的测量。6.生产含有混合免疫蛋白的酸乳和冰淇淋。
如上所述，将水溶性特异免疫蛋白粉(粗提IgY)、新鲜蛋黄、和干蛋黄用作食品添加剂，比例为1∶1∶1∶1，2∶1∶1∶1，3∶1∶1∶1，4∶1∶1∶1，和5∶1∶1∶1(幽门螺杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)，表9，10，11和12给出了冰淇淋和酸乳的混合比例。
表9
                    冰淇淋混合比例的例子
        材料     比例A     比例B     比例C
黄油牛奶乳清粉全脂奶粉脱脂奶粉白糖淀粉糖浆(70％白利)稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     5.0％36.0-15.6-5.014.50.65.5--若干17.8     5.0％31.0-14.6-5.013.50.6--12.5若干17.8     8.0％40.03.011.04.05.514.50.6-1.1-若干12.3
*混合细菌表示四种单独生产的干(或新鲜)蛋黄的混合物
表10
                   冰淇淋混合比例的例子
         材料     比例A     比例B     比例C
奶油(脂35％)脱脂浓奶(固形物30％)脱脂奶(固形物8％)脱脂奶粉玉米糖浆(80％白利)高果糖玉米糖浆(67％白利)稳定剂抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄香料水     34.3％25.510.02.05.014.5-0.65.0--若干3.1     34.3％20.510.02.05.014.5-0.6--10.0若干3.1     34.0％25.011.04.05.514.5-0.6-0.6-若干4.8
*混合细菌表示四种单独产生的干(或新鲜蛋黄)的混合物
表11
                   酸乳混合比例的例子
       材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶白糖抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄水稳定剂     0.4095.500.602.55--0.400.55     0.4093.050.60--5.000.400.55     3.0595.620.10-0.43-0.250.55
*混合细菌表示四种单独产生的干(或新鲜蛋黄)的混合物
表12
                     酸乳混合比例的例子
       材料     比例A     比例B     比例C
脱脂奶粉牛奶水果糖浆抗混合细菌*蛋黄粉抗混合细菌*蛋黄IgY抽提粉抗混合细菌*蛋黄水稳定剂     4.4078.0514.102.55--0400.50     4.4080.609.10--5.00.400.50     8.1075.6315.01-0.51-0.250.50
*混合细菌表示四种单独产生的干(或新鲜蛋黄)的混合物
实施例3
图2a中给出了本实施例的实验方法。
详细的说明如下。为了分离含有IgY、脂和脂蛋白的蛋黄，用同样量的蒸馏水稀释蛋黄。制备了10个稀释蛋黄的处理物，在处理物中慢慢加入1％-10％的硫酸铵，搅拌直到完全溶解。10个处理物5℃温育一天后，根据浓度差异分离上层和底层。在上层漂了一些脂和蛋白，在底层能看到可忽略的沉淀(图2b)。
正如图2c中可以看到的，在加入1％硫酸铵的处理物中，可看到无分离和少量的沉淀，这和加入2％硫酸铵的处理物相似。在加入3％硫酸铵的处理物中，在上层看到了脂层，并且观察到了如1％处理物中的相似沉淀。在加入4％硫酸铵的处理物中，观察到了较多一点的脂层和沉淀的分离。在加入5％-6％硫酸铵的处理物中，在上层形成了厚的脂层，并且看到了少量的沉淀。在加入7-9％硫酸铵的处理物中其结果非常好，但加入10％硫酸铵的处理物的结果没有7-9％的处理物的好。换句话说，除去脂的最佳条件是加入5-6％硫酸铵。根据IgY效价，加入4％硫酸铵的处理物能给出IgY效价的最好结果，正如图2c所见。加入5％硫酸铵的处理物中厚的脂层表明对除脂最好。从底部回收底层可以得到没有脂的溶液。实验结果
对于现有技术中常用的硫酸铵分离蛋白的方法(Mathews，1990)，所用的硫酸铵浓度越高，观察到的蛋白沉淀越多，但还需要纯化沉淀物。通常，为得到高纯度的蛋白，在处理物中加入10-20％的硫酸铵，离心后丢弃沉淀，而可用的是加入20％的硫酸铵后沉淀的蛋白。
本发明利用了脂的飘浮特性和借助硫酸铵的凝结特性来分离蛋黄、脂蛋白和特异免疫蛋白的脂，这如果不利用许多溶剂和沉淀诱导剂是难以分离的。实施例4
为了除去与脂分离的溶液中留下的蛋黄中的脂、水溶性蛋白和色素，进行了如下的实验。
用蒸馏水以×6、×12、×18、×30、×42、×48和×60的系数稀释7个处理物，并在5℃温育一天。小心分离上清液，使其不带沉淀物。×6的稀释处理物中含有沉淀，蛋黄的黄色仍保留在上清液中，并且不久沉淀就与上清液混合了。在×12、×18和×30的稀释处理物中，沉淀物不易和上清液混合。而×42、×48和×60的稀释处理物中，含有沉淀，但容易和上清液混合。所以，沉淀适当的稀释系数是×12和×18，其沉淀很粘，以致于需要利用自来水才能冲去。同时，测量了上清液的IgY效价，稀释液的IgY效价回收率对6和60倍系数分别是109％和110％，高于标准。所以，IgY效价在稀释液中更高，增高是由于水溶性免疫蛋白的影响。其他稀释的处理物的IgY效价大于100％，但×12和×18的稀释处理物除外。可以选择稀释系数18，因为这样不会导致沉淀溶解，并且可以完全除去色素。
因为用蛋白酶降解蛋白快和成本低，Mathews，1990和Stryer，1998年提出，为了破坏细胞，采用混合器和匀浆器有利于匀浆，所以，利用匀浆器破坏细胞和组织，并以×6、×12、×18、×30、×42，×48和×60的系数稀释，在5℃温育过夜，重复同样实验。对于分离方法，沉淀和上清液都混合，一起出来，得到的数据表示在表14和图2c中。由于根据IgY效价，没有更好的匀浆方法，所以考虑到方法简便和经济，决定不利用混合器或匀浆器。
表13
                              依据稀释系数特异免疫蛋白IgY的效价变化
  稀释系数(无匀浆)匀浆)   稀释前   ×6   ×12   ×18   ×30   ×42   ×48   ×60
    效价   17.48   19.08   14.40   17.10   18.00   18.06   18.24   19.20
表14
                               依据匀浆特异免疫蛋白IgY的效价变化
稀释系数(匀浆)   稀释前   ×6   ×12   ×18   ×24   ×36   ×48   ×60
  效价   17.48   17.82   15.72   15.30   16.32   17.64   18.24   13.20
Akida，1993利用了蒸馏水的稀释方法，其中包括在稀释后加入葡聚糖、黄原胶、PEG(聚乙二醇)、乙醇硫酸钠作为沉淀诱导剂，然后离心分离，而本发明为了除去脂利用了少量的硫酸铵在上层中凝结一些脂和蛋白，这与利用硫酸铵分离蛋白的方法是相反的。现有技术利用硫酸铵来沉淀，而本发明利用硫酸铵来飘浮和凝结，这两者是不同的。在本发明中，利用5％硫酸铵、蛋黄和蒸馏水(1∶1)分离脂和蛋白，过程是首先借助重力差异凝结成团，然后借助蒸馏水的稀释凝结沉淀蛋黄色素和水溶性蛋白。本发明生产产物的实验
为了生产含有高含量IgY的产物，将分离上清液稀释×18倍，并且用带有amicon-2000的中空滤器：M.W 100K，HIP100-43的浓缩器浓缩。另外，用TOYO2号滤纸，2～3层过滤和浓缩一部分相同浓度的上清液，用10倍体积的蒸馏水稀释浓缩的溶液，并透析浓缩。
图2e给出了上述两个方法产生并冻干的处理物中IgY的效价。生产步骤包括：18倍稀释、浓缩、10倍稀释、浓缩和透析，所得产物的回收率是70.8％，比18倍稀释和浓缩步骤产生的产物的回收率(53.8％)更高，并且因为纯化较好，所以纯度也比其他更高。产生的蛋黄酱的IgY的效价。
作为实验，利用pH3、pH5和pH7的条件从本发明产生的蛋黄中生产蛋黄酱。pH7时，IgY的回收率是92.3％，这是最好的回收率，在图2g中表示，pH3和pH5的回收率分别是85.8％和85.3％。所以，可以得出结论：由于利用本发明产生的蛋黄所生产的蛋黄酱，IgY的效价没有损失。本发明产生的产物的纯化实验
上清液经分离和冻干后是白色的，图2h给出了SDS-PAGE对纯化前后的冻干产物的纯度比较。如图8中看到的，在本发明中产生的产物比其他产品纯得多。已有报道，不利用离心产量就低，不利用沉淀诱导剂难于纯化，并且会导致分离上清液的IgY效价的降低。但是就产量和纯度而言，本发明产生的产物是优越的，这表明本发明对于节省生产成本和时间以及规模生产是有利的。
本发明不局限于上述的优选实施方案和附图的详细说明。本技术领域的普通技术人员可以根据各种修改方案实施本发明，但修改应该包括在所述的权利要求中。

Claims (19)

1.含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌(E.coli)IgY、抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)IgY、抗肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)IgY的鸡蛋的生产方法，其包括如下步骤：
用1ml大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白已用氢氧化铝以一定比例乳化，然后每次用1ml经乳化佐剂ISA25乳化的乳化混合抗原蛋白继续免疫两次，该两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml经乳化佐剂ISA25以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，结果总共免疫5次。
2.根据权利要求1所述的含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋的生产方法，其包括下列步骤：
给雏鸡首次用1ml大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用氢氧化铝以一定比例乳化，其包含大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用氢氧化铝0.3ml乳化，其中混合比例为大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌∶乳化佐剂＝1.5∶1∶1∶3.5∶3，对于第二和第三次注射免疫，每次用1ml经乳化佐剂ISA25以1∶1比例稀释的混合抗原蛋白，两次注射间隔一周，和
每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述乳化混合抗原蛋白包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用乳化佐剂ISA25 0.3ml以相同比例乳化，结果总共免疫5次。
3.含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋的生产方法，其包括如下步骤：
通过用1ml大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐剂以一定比例乳化，然后每次用1ml经不完全弗氏佐剂乳化的混合抗原继续免疫两次，该两次免疫间隔一周，再每次用0.5ml以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，结果总共免疫5次。
4.根据权利要求3所述的含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗幽门螺杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋的生产方法，其包括如下步骤：
给雏鸡首次用1ml大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐剂以一定比例乳化，其包含大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用不完全弗氏佐剂0.3ml乳化，其中混合比例为大肠杆菌：肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌∶乳化佐剂＝1.5∶1∶1∶3.5∶3，对于第二和第三次注射免疫，每次用1ml经不完全弗氏佐剂以1∶1比例稀释的混合抗原蛋白，两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述乳化混合抗原蛋白包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.15ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.10ml和幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml，用不完全弗氏佐剂0.3ml以相同比例乳化，结果总共免疫5次。
5.含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋的生产方法，其包括如下步骤：
通过用1ml大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白已用氢氧化铝以一定比例乳化，然后每次用1ml经乳化佐剂ISA25乳化的混合抗原继续免疫两次，该两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml经乳化佐剂ISA25以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，结果总共免疫5次。
6.根据权利要求5所述的鸡蛋的生产方法，包括下列步骤：
给雏鸡用1ml大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用乳化剂以3.5∶1.8∶1.7∶3比例乳化，其包含大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用氢氧化铝0.3ml乳化，对于第二和第三次注射免疫，每次用1ml经乳化佐剂ISA25以1∶1比例稀释的混合抗原蛋白，两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述乳化混合抗原蛋白包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，并用乳化佐剂ISA250.3ml以相同比例乳化，结果总共免疫5次。
7.含有抗混合细菌特异蛋白即同时含有抗大肠杆菌IgY、抗肠炎沙门氏菌IgY和抗鼠伤寒沙门氏菌IgY的鸡蛋的生产方法，其包括如下步骤：
通过用1ml大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐剂以一定比例乳化，然后每次用1ml经不完全弗氏佐剂乳化的乳化混合抗原继续免疫两次，该两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml经不完全弗氏佐剂以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，结果总共免疫5次。
8.根据权利要求7所述的鸡蛋的生产方法，其包括下列步骤：
给雏鸡用1ml大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用不完全弗氏佐剂以3.5∶1.8∶1.7∶3比例乳化，其包含大肠杆菌4.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌4.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，用完全弗氏佐剂0.3ml乳化，对于第二和第三次注射免疫，每次用1ml经不完全弗氏佐剂以1∶1比例稀释的混合抗原蛋白，两次免疫间隔一周，和
每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述乳化混合抗原蛋白包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.35ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.18ml和鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.17ml，并用不完全弗氏佐剂0.3ml以相同比例乳化，结果总共免疫5次。
9.根据权利要求1-8所述的方法生产的含有抗混合细菌特异免疫蛋白的鸡蛋。
10.生产抗混合细菌特异免疫蛋白的方法，包括如下步骤：
将35g含有抗混合细菌特异免疫蛋白的鸡蛋的蛋黄收集到250ml的瓶中，加入35ml碱离子水(pH9)搅拌，5～10℃温育24小时，加入碱离子水(18倍体积的蛋黄上清液和碱离子水(1260ml))，温育48小时后分离，通过中空纤维柱方法在超滤系统中浓缩上清液，然后冻干。
11.根据权利要求10所述的方法生产的抗混合细菌特异免疫蛋白。
12.由水溶性特异免疫蛋白(粗提IgY)(大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌)组成的抗混合细菌特异免疫蛋白粉的混合组合物，所述水溶性特异免疫蛋白分别从含有特异免疫蛋白的鸡蛋中分离，所述混合组合物的生产方法包括下列步骤：
通过用1ml大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的各个抗原蛋白首次免疫雏鸡，所述各个抗原蛋白分别已用乳化佐剂以1∶1比例乳化，其相应包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和完全弗氏佐剂0.5ml，然后每次用1ml经不完全弗氏佐剂乳化的各个抗原蛋白继续免疫两次，该两次免疫间隔二周，和
每次用0.5ml的各个乳化抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述各个乳化抗原蛋白相应包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和不完全弗氏佐剂0.5ml，结果总共免疫5次。
13.由水溶性特异免疫蛋白(粗提IgY)(大肠杆菌∶肠炎沙门氏菌∶鼠伤寒沙门氏菌∶幽门螺杆菌)组成的抗混合细菌特异免疫蛋白粉的混合组合物，所述水溶性特异免疫蛋白分别从含有特异免疫蛋白的鸡蛋中分离，所述混合组合物的生产方法包括下列步骤：
通过用1ml(108/ml)大肠杆菌、幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的各个抗原蛋白免疫雏鸡，所述抗原蛋白分别已用乳化佐剂以1∶1比例乳化，其相应以1∶1比例包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和硫酸铝0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和硫酸铝0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和硫酸铝0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和硫酸铝0.5ml，
每次用1ml相应经乳化佐剂ISA25以1∶1比例乳化的所述抗原蛋白免疫雏鸡两次，该两次免疫间隔二周，和
每次用0.5ml的各个乳化抗原蛋白免疫已成熟的产蛋母鸡两次，该两次免疫间隔3个月，所述各个乳化抗原蛋白相应包含大肠杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml、肠炎沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml、鼠伤寒沙门氏菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml以及幽门螺杆菌2.0×108/ml的灭活抗原0.5ml和乳化佐剂ISA25 0.5ml。结果总共5次免疫。
14.用牛奶加工的食物，其含有权利要求11-13中任一项所述的抗混合细菌特异免疫蛋白。
15.食品添加剂，其含有权利要求11-13中任一项所述的抗混合细菌特异免疫蛋白。
16.分离含有IgY的水溶性蛋白的方法，其包括如下步骤：
用蒸馏水以一定比例稀释从含有混合抗致病菌特异抗体(IgY)的鸡蛋中分离的蛋黄，第一次在蛋黄稀释液中加入硫酸铵，第二次加入蒸馏水，以便分离水溶性特异免疫蛋白和磷脂，放置一定时间，除去上层脂，再次稀释收集的上清液，放置一定时间，从而分离/纯化特异免疫蛋白。
17.根据权利要求16所述的分离含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述硫酸铵的量是3％-10％。
18.根据权利要求16所述的分离含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述第一次稀释比例为1∶1。
19.根据权利要求16所述的分离含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述第二次稀释比例为1∶12、1∶18、1∶30、1∶42、1∶48和1∶60。
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