CN1899308A - 一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过添加同时含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉和生产免疫乳的方法。包括制冻干免疫蛋黄粉和向牛奶中添加步骤；制冻干免疫蛋黄粉，是向净免疫蛋黄中添加2～6倍重量的免疫球蛋白保护剂，搅匀；于63～65℃，灭菌30～32min；10MPa，－35℃冷冻干燥，获冻干免疫蛋黄粉；向牛奶中添加步骤是60～70℃，向牛奶中加免疫蛋黄粉，添加比例为：净原料奶∶蛋黄粉∶免疫球蛋白保护剂＝100∶根据效价折算成50U/mL∶蛋黄粉量的2～6倍，高速剪切乳化5min，经18～20MPa压力均质，70～75℃，15～20s灭菌，迅速将含特异抗体免疫牛奶的半成品，降温至2～4℃贮存。
Description
技术领域
本发明属于含有抗原或抗体的医药配制品范畴，特别涉及通过添加同时含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉和生产免疫乳的方法。
背景技术
免疫球蛋白是一类具有抗体活性，能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。它们有很多生理功能，因此开发免疫球蛋白用作食品添加剂受到高度重视。
现有技术中，对卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of yolk，简称IgY)的被动免疫保护作用进行了大量的研究。例如，Bartz等(1988)通过口服IgY成功地预防了鼠轮状病毒的感染；Yokoyama等(1992)研究表明，口服IgY可预防由E.coli引起的仔猪肠道感染和腹泻；Yolken等(1988)及Ebi-na等(1990)以小鼠为实验动物，通过口服IgY可显著地预防由人轮状病毒引起的肠道感染与腹泻。
鸡蛋黄中IgY的含量很高，国内已经有给母鸡免疫而由鸡蛋黄中提取出高含量的特异性IgY制品。鸡蛋物产丰富，来源广泛，蛋鸡经过特异性免疫所产蛋中免疫球蛋白具有相应免疫特异性，是理想的免疫类产品的原料。
目前，对免疫乳研究主要集中在牛初乳和奶牛免疫及其利用的研究，但是通过给奶牛免疫产生免疫球蛋白，以生产含特异抗体的免疫牛奶，并非良策。通过对牛体进行免疫获取免疫原料乳进行加工，获取的免疫乳量较低，因此成本很高；再是这种方式对牛体的损伤较大，缺乏工业化价值。
发明内容
本发明的目的，是研制生产含有足够效价的抗大肠杆菌K88和抗幽门螺杆菌免疫蛋黄粉，以其为添加料，添加到牛乳中制成对大肠杆菌K88和幽门螺杆菌有特异性免疫作用的免疫乳制品。
本发明的技术方案如下：
研制一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是：
所述的含特异抗体免疫牛奶是指含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫牛奶；
所述的上述牛奶的生产方法，包括准备冻干免疫蛋黄粉和向牛奶中添加步骤；
(1)所述的免疫蛋黄粉，是指含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉；
所述的准备冻干免疫蛋黄粉步骤，是指向前期制备的净免疫蛋黄中添加2～6倍重量的免疫球蛋白保护剂，搅匀；至少于63～65℃，灭菌30～32min；于10mpa，-35℃冷冻干燥获得冻干免疫蛋黄粉；
(2)所述的向牛奶中添加步骤是：
①于60～70℃，向在制品牛奶中添加含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉，添加比例为：
净原料牛奶重量∶免疫蛋黄粉重量∶免疫球蛋白保护剂重量
＝100∶根据效价折算成50U/mL∶免疫蛋黄粉重量的2～6倍，
②至少高速剪切乳化5分钟，
③再经18～20MPa压力均质，至少70～75℃，15～20s灭菌，
④5min内迅速将含特异抗体免疫牛奶的半成品，降温至2～4℃贮存。
上述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是：
所述的制备免疫蛋黄粉时，向净免疫蛋黄中添加免疫球蛋白保护剂，
添加比例是：免疫蛋黄kg∶免疫球蛋白保护剂kg＝1∶2～6
所述的免疫球蛋白保护剂含有如下重量比例组成：
食糖kg∶脱脂奶粉kg∶磷酸盐mol/L∶柠檬酸钠mol/L＝1∶1∶0.1∶0.075。
上述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的免疫蛋黄粉的制备包括：
(1)大肠杆菌K88抗原的制备
活化、培养
大肠杆菌K88菌种，用灭菌肉汤37℃、培养24h，活化后的菌种接种于琼脂平板，37℃、培养24h；鉴定为目的菌后，接种于大培养瓶，37℃、培养24h；
提取及纯化
用磷酸盐缓冲溶液离心洗碟分离法，提取和纯化菌毛黏附素蛋白，并于灭菌生理盐水中，-30℃保存；
(2)幽门螺旋杆菌抗原蛋白的制备
活化、培养、失活
活化的菌株在37℃、液体培养基中培养48h；添加体积分数为0.5％的福尔马林溶液，37℃保温过夜，4℃、24h使之失活；
提取及纯化
用磷酸盐缓冲溶液离心洗碟分离法，1500g，10min离心收集菌体，并用离心洗涤，将富集到的菌体加消毒盐水制成浓度为2×109个/mL的悬浮液，作为水剂疫苗；
(3)通过定期对鸡进行免疫获得免疫鸡蛋
将两种疫苗按1∶1比例混合，对产蛋鸡进行注射免疫，每次1mL，每10天免疫一次，共免疫4次。收集免疫鸡蛋；
(4)免疫蛋黄粉的制备
免疫蛋→清洗、晾干→分离蛋黄→搅拌→添加保护剂→63℃，30min灭菌→10Mpa，-35℃冷冻干燥→免疫蛋黄粉。
上述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的磷酸盐是磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
上述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的大肠杆菌K88抗原的制备时，在水剂疫苗中加入弗氏不完全佐剂乳化大肠杆菌K88抗原，佐剂与抗原比例为1∶1。
本技术的优点是，克服了现有技术对牛体进行免疫获取免疫乳生产的缺陷，降低了免疫乳的生产成本，扩大了免疫乳的消费人群。
附图说明
图1是混合疫苗制备流程示意图；
图2是免疫乳的制备流程示意图；
图3是冻干免疫蛋黄粉的制备流程示意图。
具体实施方式
图1中，1-1大肠杆菌K88菌种的活化培养；1-2大肠杆菌K88菌毛的提取及活化；1-3大肠杆菌K88菌种毛的预处理；1-4用弗氏不完全佐剂乳化大肠杆菌K88抗原；2-1幽门螺杆菌的活化培养；2-2用福尔马林溶液灭活菌体；2-3幽门螺杆菌灭活菌体收集；2-4制成幽门螺杆菌疫苗；51∶1混合疫苗的制备。
图2中，6原料乳收购，净乳；72～4℃存贮；8配料、高速剪切乳化；9均质；10免疫乳灭菌；11免疫乳降温；12灌装；13免疫奶成品入库；21冻干免疫蛋黄粉。
图3中，14 1∶1混合疫苗；15对产蛋鸡进行免疫；16收集免疫鸡蛋；17分离蛋黄；18添加免疫球蛋白保护剂搅匀；19蛋黄粉灭菌；20冷冻干燥；21冻干免疫蛋黄粉。
实施例1
(1)大肠杆菌K88抗原的制备
菌株：产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)K88(以下简称K88)，由中国兽药监察所购买；
a.菌种的活化用灭菌肉汤活化K88菌种，置于37℃温箱中，培养24h。活化后的菌种接种于琼脂平板，置于37℃温箱中，培养24h。
b.镜检及生化试验
取出平板，挑取孤立的可疑菌落，制片，进行革兰氏染色，100倍油镜观察。挑取镜下观察到的革兰氏阴性短小杆菌的菌落，做生化试验(葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、甘露醇发酵试验、蔗糖发酵试验、M.R.试验、V.P.试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、H2S生成试验)，24h后观察结果。
c.目的菌的培养
经镜检及生化试验鉴定为目的菌后，接种于大培养瓶，37℃温箱培养24h。
d.K88菌毛的提取及纯化
取出大培养瓶，用0.1M PH7.2的磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，简称PBS)完全悬浮培养瓶中的菌苔，悬浮液在3000g、4℃下离心15min。离心后去掉上清液，沉淀用0.1M PBS(pH7.2)完全悬浮，同样在3000g、4℃下离心15min，如此反复二次，最后得到的沉淀仍悬浮在0.1M pH7.2PBS中。悬浮液置于60℃水浴加热30min，维持此温度高速搅拌10min，然后在14000g、4℃下离心15min，弃掉沉淀，取上清液。上清液用0.45um的微孔滤膜过滤，滤液用2.5％柠檬酸调pH值至4.0，4℃下放置2h。取出滤液，在14000g、4℃下离心15min，弃掉上清液，所得沉淀物悬浮到0.1M PBS(pH7.2)中。重复沉淀抽提步骤三次。最后得到的沉淀溶于灭菌生理盐水中，-30℃保存。
(2)幽门螺杆菌抗原的制备
标准幽门螺杆菌(购自中国医学细菌保藏中心)。病原性幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，活化后的菌株在37℃的条件下于液体培养基中培养48h，之后添加体积分数为0.5％的福尔马林溶液，37℃保温10-12小时。在4℃的条件下24h使之失活。离心收集菌体(1500g，10min)，并用磷酸盐缓冲溶液离心洗涤4次，将富集得到的菌体加消毒盐水制成浓度为2×109个/mL的悬浮液，作为水剂疫苗。在水剂疫苗中加入佐剂和适量的乳化剂搅拌乳化，制成乳剂疫苗。
试验用市售商品弗氏不完全佐剂(Freund’s Incomplete Adjuvant，简称FIA)美国SIGMA公司产品，产品号F5506或型号：PI1-9规格10ml，10×10ml。
弗氏不完全佐剂(FIA)是最经典的油乳佐剂，能刺激非特异性的免疫反应产生。它和抗原混合使用，不但有助于注射物质的沉积或汇集，而且能很大的增强抗体反应，其高度活性是其他佐剂难以比拟的。
(3)免疫鸡蛋的制备
a.将上述两种疫苗进行混合(1∶1混合比例)对产蛋鸡进行注射免疫(每次1mL)，每隔10天进行一次免疫，共免疫4次。收集免疫鸡蛋。
b.免疫蛋黄粉的制备
免疫蛋→清洗、晾干→分取蛋黄→搅拌→添加保护剂(见附表)→杀菌(63℃，30min)→冷冻干燥(10Mpa，-35℃)→免疫蛋黄粉。
制备免疫蛋黄粉时，向净免疫蛋黄中添加的免疫球蛋白保护剂，
添加比例是：免疫蛋黄kg∶免疫球蛋白保护剂kg＝1∶2～6
所述的免疫球蛋白保护剂含有如下重量比例组成：
食糖kg∶脱脂奶粉kg∶磷酸盐mol/L∶柠檬酸钠mol/L＝1∶1∶0.1∶0.075。
根据我们试验结果蔗糖、磷酸盐、柠檬酸钠均可提高鸡蛋蛋黄中活性物质IgY抗热变性能力，减少其在灭菌加热时变性；脱脂粉可以做为免疫蛋制品的载体。
(4)鸡蛋免疫乳的生产：
利用本技术生产的抗幽门螺杆菌免疫蛋黄粉进行免疫乳的生产。
鸡蛋免疫乳的生产工艺：
原料乳验收→净乳→配料(添加蔗糖、NaH2PO4后，加入免疫蛋黄粉)(根据效价折合成50U/mL)→均质(18～20MPa)→热处理(75℃，20s)→冷却(2～4℃)→灌装→入库(2～4℃)
最终免疫奶产品主要指标：
项目指标
脂肪(％) ≥3.1
蛋白质(％) ≥2.9
非脂乳固体(％) ≥8.1
酸度(°T) ≤18.0
免疫活性物质(U/ml) ≥50.0
杂质度(mg/kg) ≤2
硝酸盐(以NaNO3计，mg/kg) ≤11.0
亚硝酸盐(以NaNO2计，mg/kg) ≤0.2
黄曲霉素M1(μg/kg) ≤0.5
菌落总数(cfu/mL) ≤30000
大肠菌群(MPN/100mL) ≤90
致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)不得检出
*黄曲霉素M1(Aflatoxin M1)
**CFU菌落形成单位(Colony Forming Units)
***MPN为最大可能数(Most Probable Number)的简称
****总干物质含量≥27％
实施例2
食糖采用甜菜糖，其余同实施例1。
Claims (5)
1.一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是：
所述的含特异抗体免疫牛奶是指含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫牛奶；
所述的上述牛奶的生产方法，包括准备冻干免疫蛋黄粉和向牛奶中添加步骤；
(1)所述的免疫蛋黄粉，是指含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉；
所述的准备冻干免疫蛋黄粉步骤，是指向前期制备的净免疫蛋黄中添加2～6倍重量的免疫球蛋白保护剂，搅匀；至少于63～65℃，灭菌30～32min；于10mpa，-35℃冷冻干燥获得冻干免疫蛋黄粉；
(2)所述的向牛奶中添加步骤是：
①于60～70℃，向在制品牛奶中添加含抗大肠杆菌和幽门螺旋杆菌特异抗体的免疫蛋黄粉，添加比例为：
净原料牛奶重量∶免疫蛋黄粉重量∶免疫球蛋白保护剂重量
＝100∶根据效价折算成50U/mL∶免疫蛋黄粉重量的2～6倍，
②至少高速剪切乳化5分钟，
③再经18～20MPa压力均质，至少70～75℃，15～20s灭菌，
④5min内迅速将含特异抗体免疫牛奶的半成品，降温至2～4℃贮存。
2.按照权利要求1所述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是：
所述的制备免疫蛋黄粉时，向净免疫蛋黄中添加免疫球蛋白保护剂，
添加比例是：免疫蛋黄kg∶免疫球蛋白保护剂kg＝1∶2～6
所述的免疫球蛋白保护剂含有如下重量比例组成：
食糖kg∶脱脂奶粉kg∶磷酸盐mol/L∶柠檬酸钠mol/L＝1∶1∶0.1∶0.075。
3.按照权利要求1所述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的免疫蛋黄粉的制备包括：
(1)大肠杆菌K88抗原的制备
活化、培养
大肠杆菌K88菌种，用灭菌肉汤37℃、培养24h，活化后的菌种接种于琼脂平板，37℃、培养24h；鉴定为目的菌后，接种于大培养瓶，37℃、培养24h；
提取及纯化
用磷酸盐缓冲溶液离心洗碟分离法，提取和纯化菌毛黏附素蛋白，并于灭菌生理盐水中，-30℃保存；
(2)幽门螺旋杆菌抗原蛋白的制备
活化、培养、失活
活化的菌株在37℃、液体培养基中培养48h；添加体积分数为0.5％的福尔马林溶液，37℃保温过夜，4℃、24h使之失活；
提取及纯化
用磷酸盐缓冲溶液离心洗碟分离法，1500g，10min离心收集菌体，并用离心洗涤，将富集到的菌体加消毒盐水制成浓度为2×109个/mL的悬浮液，作为水剂疫苗；
(3)通过定期对鸡进行免疫获得免疫鸡蛋
将两种疫苗按1∶1比例混合，对产蛋鸡进行注射免疫，每次1mL，每10天免疫一次，共免疫4次。收集免疫鸡蛋；
(4)免疫蛋黄粉的制备
免疫蛋→清洗、晾干→分离蛋黄→搅拌→添加保护剂→63℃，30min灭菌→10Mpa，-35℃冷冻干燥→免疫蛋黄粉。
4.按照权利要求1所述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的磷酸盐是磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
5.按照权利要求3所述的含特异抗体免疫牛奶的生产方法，其特征是所述的大肠杆菌K88抗原的制备时，在水剂疫苗中加入弗氏不完全佐剂乳化大肠杆菌K88抗原，佐剂与抗原比例为1∶1。
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|---|---|---|---|
| CN 200610045245 CN1899308A (zh) | 2006-06-30 | 2006-06-30 | 一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法 |
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| CN 200610045245 CN1899308A (zh) | 2006-06-30 | 2006-06-30 | 一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1899308A true CN1899308A (zh) | 2007-01-24 |
Family
ID=37655418
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| CN 200610045245 Pending CN1899308A (zh) | 2006-06-30 | 2006-06-30 | 一种含特异抗体免疫牛奶的生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1899308A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101411362B (zh) * | 2008-10-14 | 2012-05-30 | 大连韩伟企业集团有限公司 | 抗幽门螺杆菌蛋黄免疫球蛋白酸奶 |
| CN112640954A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-13 | 临沂友康生物科技有限公司 | 一种将dha鸡蛋和酸奶乳化混合的配方和方法 |
-
2006
- 2006-06-30 CN CN 200610045245 patent/CN1899308A/zh active Pending
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