CN100336902C - 分离的噬菌体及其在食品或宠物食品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及噬菌体分离物，该噬菌体分离物对诸如大肠杆菌和/或沙门氏菌株系等致病性肠杆菌科的细菌具有强烈的裂解活性。本发明还涉及所述的噬菌体分离物用于各种人类或宠物食品中以治疗或预防由诸如大肠杆菌或沙门氏菌等致病性肠杆菌科细菌引起的细菌性疾病的用途，尤其是用于儿科肠胃炎或沙门氏菌感染的噬菌体治疗。本发明还涉及由所述的噬菌体分离物制备的人类或宠物食品。

Description

分离的噬菌体及其在食品或宠物食品中的用途
发明领域
本发明涉及噬菌体分离物，该噬菌体分离物对诸如大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)株系等致病性肠杆菌科(Enteriobacteriaceae)的细菌具有强烈的裂解活性，本发明还涉及所述的噬菌体分离物用于各种人类或宠物食品中以治疗或预防由诸如大肠杆菌或沙门氏菌等致病性肠杆菌科细菌引起的细菌性疾病的用途，尤其用于儿科肠胃炎的噬菌体治疗。本发明还涉及由所述的噬菌体分离物制备的人类或宠物食品。
发明背景
过去，使用抗生素来治疗各种感染。熟知Selman Waksman在引入和生产链霉菌方面的工作和Fleming博士发现青霉素以及其他人在抗生素领域的工作。多年来，为了使这些“基本”抗生素更有效或为了对这些抗生素敏感的人们进行治疗，已对所述的“基本”抗生素进行添加和化学修饰。
然而，随着更多的抗生素以不断增加的速度处方应用或使用在各种疾病中，越来越多数量的细菌对抗生素产生了抗性。如今使用更多剂量的更有效的抗生素来治疗更具抗性的细菌株。结果，产生了对多种抗生素具有抗性的细菌而且一些在医院中获得的革兰氏阳性细菌感染已变得不能治疗。由于更多抗生素的使用和显示抗性的细菌的数量增加，已导致需要使用抗生素的时间增长。如今更频繁使用广谱、非特异性抗生素，而其中的一些会对患者产生有害效果。此外，对抗生素显示过敏反应的人的数量似乎在增加。
因此，已寻求其他尝试方法以首先鉴别细菌然后将其杀死。
已尝试使用噬菌体来治疗细菌性疾病。
在20世纪初期首先发现了感染细菌的异质性病毒群体。(d′HERELLE，F.，《噬菌体，其免疫作用》(The BACTERIOPHAGE.ITS rolein immunity)，由Smith，G.H.翻译，Williams & WILKINS公司，Baltimore(1922))。目前在科学研究例如分子生物学(例如基因载体)和医学诊断(例如细菌的噬菌体分型)中广泛使用噬菌体。由于噬菌体天然感染并杀死细菌，且细菌是疾病的主要病因，所以传统上认为在医学治疗上可使用噬菌体。
的确，在文献中已大量报道了在实验系统中噬菌体的潜在治疗用途。
例如，US5,688,501(Merril，等)公开了一种采用对特定细菌具有特异性的裂解性或非裂解性噬菌体治疗感染性细菌疾病的方法。
同样，US4,957,686(Norris)公开了一种改良的牙齿卫生方法，该方法包括将寄生于细菌的噬菌体引入口中，而所述细菌具有很容易粘附于唾液薄膜的特性。
尽管认识到新型的抗微生物治疗的价值和重要性，然而在现代疗法中，还没有实现任何实际意义上的噬菌体治疗的潜力，也没有确定用于这种无毒和有效治疗的方法、组合物或其他用途，以及实际有效的递送方式。特别是对于有效地预防和治疗与大肠杆菌相关的感染，例如腹泻。
事实上，大肠杆菌是研究非常充分的细菌，具有两个完全测序的成员：非致病性株系K-12(Blattner，F.R.，等，1997 Science 277，1453-1474)和致病性株系O157:H7(Perna，N.T.等，2001，Nature 409，529-533；Hayaslis等，2001，DNA Research 8，11-22)，其与肠致病性大肠杆菌(EPEC)株系相似。
尽管两种大肠杆菌噬菌体(λ和T4)是描述得最仔细的生物学系统(Karam，J.D.，1994，Molecular biology of bacteriophage T4.ASM Press，Washington，DC)，但还需要开发新型和有用的噬菌体治疗剂，该治疗剂可用于预防或治疗由细菌性微生物引起的感染性病症，所述的细菌性微生物例如与儿童和旅行者的腹泻相关的大肠杆菌血清型。
还需要开发在可接受的载体中包含噬菌体治疗剂的组合物，可将所述的组合物施用于受细菌性微生物感染的患者。
最后，还需要开发烈性但非毒性的噬菌体制品，由此使其可用于治疗与致病性大肠杆菌或沙门氏菌相关的细菌性感染。
发明简述
因此，本发明的一个目的是开发新型和有用的噬菌体疗法，该疗法可用于预防或治疗由致病性肠杆菌科细菌引起的感染，该致病性肠杆菌科细菌引起的感染为例如大肠杆菌感染，特别是人或动物的腹泻或泌尿疾病或沙门氏菌感染。本发明的另一目的是提供分离的烈性非毒性噬菌体制品，该制品对致病性肠杆菌科细菌例如大肠杆菌和/或沙门氏菌的株系具有实质性的裂解潜力。
本发明的另一目的是提供所述的噬菌体制品在各种营养组合物、宠物食品、增补剂或药物组合物中的用途，用于治疗或预防人类或动物中由致病性大肠杆菌和/或沙门氏菌引起的感染。
本发明的另一目的是提供一种包含至少一种如上所述的噬菌体的营养组合物、宠物食品、增补剂或药物组合物。
本发明的另一目的是提供一种采用营养组合物、宠物食品、增补剂或药物制品中包含的噬菌体治疗剂，治疗或预防人类或动物中由致病性肠杆菌科细菌例如大肠杆菌和/或沙门氏菌引起的感染的方法。
本发明的一个主要优点是根据本发明选择的噬菌体制品对引起腹泻的大肠杆菌株系具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，所以可将其安全地用于食品组合物中，以有效地预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染。
根据本发明的噬菌体也可用于工业应用。
它们可以有效地在非致病性的大肠杆菌株系上繁殖，却保持广泛的宿主范围。该噬菌体有效地杀死宿主细胞，而且可通过标准的病毒分离方法将噬菌体高度纯化。
发明详述
在下列描述中″NCC″指Nestl éCulture Collection(Nestl é ResearchCenter(NRC)，Vers-chez-les-Blanc，洛桑，瑞士)。
根据第一方面，从人类粪便样品和环境中分离了对致病性肠杆菌科细菌例如大肠杆菌和/或沙门氏菌株系具有实质上裂解潜力的宿主范围广的肌尾病毒科(Myoviridae)噬菌体。
对患急性腹泻入院治疗的儿童的粪便样品用噬斑分析进行筛查以检测针对大肠杆菌的噬菌体的存在。还对不同来源的水进行筛查以检测噬菌体的存在。这些水(自来水、下水道的水、排水沟的水、池塘中的水、沟渠中的水、街道上的水和市场上的水)来自达卡/孟加拉国和洛桑(下水道的水)。分离并在非致病性实验室大肠杆菌K-12上扩增了约45种肌尾病毒科的噬菌体。这些分离物对大量致病性大肠杆菌株系显示了广泛的宿主范围。可通过标准病毒纯化方法纯化噬菌体。结果显示被详细研究的全部噬菌体均是T4样噬菌体(具有可收缩尾的专性烈性噬菌体)。所述的鉴别是在大基因组(170kb)、DNA的修饰(对限制性内切酶的消化具有抗性)和形态学的基础上确定的。
它们可以有效地在非致病性的大肠杆菌株系上繁殖，却对引起腹泻的大肠杆菌株系保持广泛的宿主范围。T4样噬菌体有效地杀死宿主细胞。它们是原型(prototype)烈性噬菌体，在感染过程中破坏细菌的基因组。这种特性实质上增加了噬菌体治疗方法的安全性。
在一个优选的实施方式中，所述的噬菌体选自：NCC-JS9、NCC-JS31、NCC-JS102.2、NCC-JS150、NCC-JS1、NCC-JS10(再命名为NCC-JS4)(CNCMI-2763)、NCC-JS22、NCC-JS32、NCC-JS114.1、NCC-JS140.1、NCC-JS146.1、NCC-JS65.1、NCC-JS65.2′、NCC-JS76.2′、NCC-JS12、NCC-JS152、NCC-JS66、NCC-JS102.1、NCC-JS140.2、NCC-JS146.2、NCC-JS61.2、NCC-JS61.3、NCC-JS114.3、NCC-JS35(再命名为NCC-JS94.1)(CNCMI-2764)、NCC-JS94.2、NCC-JS98、NCC-JS104、NCC-JS94.3、NCC-JS110.1、NCC-JS110.2、NCC-JS110.3、NCC-JS1.4(再命名为NCC-JSD.1)(CNCMI-2765)、NCC-JSD.3、NCC-JSD.2、NCC-JSD.4、NCC-JSD.5，、NCC-JS142、NCC-JS148和NCC-JSL.1、NCC-JSL.2、NCC-JSL.3、NCC-JSL.4、NCC-JSL.5、NCC-JSF(再命名为NCC-JSL.6)(CNCMI-2766)。
在一个最优选的实施方式中，作为例子在Institut Pasteur，28 rue duDocteur Roux，F-75024 Paris c édex 15，法国国立微生物保藏中心，于2001年12月11日，以保藏号CNCMI-2763、CNCMI-2764、CNCMI-2765和CNCMI-2766保藏了噬菌体NCC-JS10、NCC-JS35、NCC-JS1.4和NCC-JSF。
有利地，例如，所保藏的噬菌体能够裂解42％的引起腹泻的如下大肠杆菌，该大肠杆菌为Nestl é研究中心(Nestl éResearch Center)的保藏物并由50个株系组成。所述的保藏物代表了引起发展中国家儿童腹泻和旅行者腹泻的大肠杆菌的主要血清型。就本发明的噬菌体材料而言，随着包括在此混合物(cocktail)中的单个噬菌体分离物的增加，可获得60％的覆盖率。
然而，对除了大肠杆菌种类外的其他共生的肠道细菌没有威胁。肠道的生态平衡得以维持(参见实施例3，图2)。
在噬菌体处理小鼠后，在肠道中不再存在噬菌体。
采用本发明的噬菌体材料，只附着少于50％的非致病性人肠道大肠杆菌血清型。
因此，根据本发明的另一方面，本发明涉及至少一种上述的噬菌体分离物在任何食品或药品或营养增补剂或口服组合物中的用途。食品或药品的例子是乳、酸乳酪、凝乳、干酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、乳粉、婴儿制剂或片剂、液体悬浮液、干口服增补剂、湿口服增补剂、干管喂食食品(dry-tube-feeding)和宠物食品。口服的组合物可以为胶囊剂、软胶囊剂、片剂、糊剂、锭剂、胶(gum)、可饮用的溶液或乳剂形式。制备它们的方法是公知常识。
本发明的组合物还可包含常用的赋形剂，特别是增甜剂、调味剂或防腐剂。它还可包含益生元(prebiotic)和/或益生微生物。本发明的组合物可按照大量本领域熟知的技术中的任何一种技术配制。
在一个实施方式中，可制备含有至少一种噬菌体的药物组合物，所述噬菌体的含量为足以在个体中获得期望效果的量。所述的组合物可以是片剂、液体或干口服增补剂、湿口服增补剂、干管喂食食品、湿管喂食食品等。所述的药物组合物还将含有载体和赋形剂，该载体和赋形剂适用于将不同性质的相应活性分子递送至靶组织。这种类型的载体/赋形剂和其量取决于所述物质的性质和所考虑的药物的递送形式和/或施用方式。应意识到，本领域的技术人员将基于其自身的知识选择合适的组分和盖伦制剂形式。
在另一实施方式中，制备人类食用的食物组合物。该组合物可以是全营养制剂、乳品、冷冻或耐贮存饮料、水、汤、饮食增补剂、肉类替代品、营养棒或糖果。
所述的营养制剂优选可肠内施用；例如为粉末、液体浓缩物或即食饮料的形式。如果期望制备粉末型营养制剂，将均化的混合物转移到合适的干燥器，例如喷雾干燥器、冷冻干燥器中并转变为粉末。
在一个优选实施方式中，可将噬菌体与温水一起加到乳制剂中，并可对患有大肠杆菌肠胃炎或沙门氏菌感染或有可能患这种感染的儿童有好处。在北半球的工业国家，儿科大肠杆菌腹泻很少见，然而，在诸如墨西哥、巴西、印度和中国等国家却仍十分普遍。
此外，可将噬菌体用于预防或治疗旅行者的腹泻。
在北美度假的欧洲旅行者或到中美或Carribean的美国旅行者有高危险性患上ETEC感染。
此外，大肠杆菌感染是人类泌尿系感染的常见病因，在工业国家也是如此。肠外大肠杆菌分离物的O血清型与肠内大肠杆菌株系的O血清型不同。然而，许多T4样噬菌体的广泛的宿主范围使得勿庸置疑地许多泌尿系大肠杆菌菌株可被分离自粪便样品的T4噬菌体裂解。
在另一实施方式中，可用本发明的至少一种噬菌体分离物来丰富一般食品。例如发酵乳、酸乳酪、鲜干酪、凝乳、糖果制品例如甜的或增甜的饮料、糖果棒、早餐谷类薄片或棒、饮料、乳粉、豆制品、非乳发酵品或用于临床营养的营养增补剂。
因此，本发明的噬菌体的使用量可以为至少1.104pfu(噬斑形成单位)/ml，更优选106pfu/ml。
在另一实施方式中，可制备宠物食品。事实上，大肠杆菌是狗类腹泻的主要病因。从狗类分离的EPEC和ETEC株系的血清型与人类的部分重合。狗的肠道中含有的大肠杆菌血清型常引起尿道成片感染(smearinfection)。这种犬类的尿道大肠杆菌分离物与人类肠道外大肠杆菌分离物显示遗传关系紧密。宠物制剂优选为完全和营养平衡的宠物食品。其还可为宠物的食品增补剂或为药物组合物。根据本发明的全营养宠物食品制剂可以采用任何适宜形式，例如粉末、干的粗磨食品或小丸或其他干燥形式、挤出形式、半潮湿或湿形式，例如块状或条状或似布丁样。可将其冷冻或以耐贮存产品形式提供。可通过常规方法生产这种宠物食品。
在另一实施方式中，可制备食物辅助剂以提高宠物食品的质量。可将食物辅助剂装入胶囊中或以粉剂形式提供并与主食包装在一起或与主食分别包装，并且食物辅助剂可为湿的或干的。作为实例，可将含有本发明的噬菌体的粉末以粉末形式包装入小袋内或置于凝胶或液体或其他合适的载体中。根据使用说明，可将这些分别包装的单元与主食一起提供或以多单元包形式提供以与主食一起使用或用于治疗。
此外，口服应用本发明的噬菌体或在家庭中喷洒噬菌体可由此对狗和宠物的主人都有利。
在最后的实施方式中，噬菌体可在食品生产中有益处以减少肉类被大肠杆菌和/或沙门氏菌污染的程度。
以下的实施例只是作为举例说明目的，且无论如何不应理解为限制本申请的主题。除非另有说明，所有的百分比以重量百分比的形式给出。在实施例之前为附图简述。
附图简述
图1：在T4样噬菌体NCC-J146.1和NCC-JS94.1.存在下，大肠杆菌K12的生长曲线(OD读数)。将大肠杆菌K12的培养物培养至OD为0.1并用1％的上述噬菌体感染。每10分钟采样。
图2：对4只小鼠的小鼠大肠杆菌菌群进行体内研究，监测42天。以不同浓度将混合噬菌体(NCC-JS94.1，NCC-JS4，NCC-JSD.1和NCC-JSL.6)加至水中3次(换水3次)。给对照小鼠使用相同的水(同样换水)但不含有混合噬菌体。每天收集粪便一次或两次。分离噬菌体混合物并测定滴度，测定大肠杆菌菌群。线条代表正常菌群的平均值。
图3：对无菌小鼠的噬菌体感染。给2只无菌小鼠强迫喂食大肠杆菌K-12并持继一周将噬菌体NCC-JS94.1以终浓度105pfu/ml加至水中。在整个实验中始终监测粪便中的正常菌群和噬菌体的存在。在第三周，再次给小鼠强迫喂食抗噬菌体的ECOR5。再次将NCC-JS94.1加至水中，收集粪便并检测大肠杆菌和噬菌体的存在。
图4：在用噬菌体处理4只小鼠后当从粪便中不再收集到噬菌体时(图4A)对小鼠进行尸体解剖，且对噬菌体处理的4只另外的小鼠进行尸体解剖(图4B)。采集不同部位的肠(十二指肠、空肠、回肠、结肠)、肝脏和淋巴结并检测大肠杆菌和噬菌体的存在。柱形代表每组小鼠的平均值。
实施例
实施例1选择本发明的噬菌体
材料和方法
粪便样品的制备
在医院中在-20℃冷冻保存粪便样品并在干冰上运送至洛桑。将融化的粪便样品(约10g)重悬在TS(8.5g/1 NaCl，1g/1胰蛋白胨)中至终体积30ml。然后将重悬的粪便样品在50ml Falcon管中以10.000rpm离心15分钟。将1ml每种粪便通过Millex AP20预过滤器过滤随后用0.45umMinisart滤器过滤。由于T4噬菌体对反复冻融敏感，所以在重悬后将所有的粪便样品保存在+4℃。
细菌的培养
将所有的大肠杆菌株系在含有每升2ml硫胺素(2mg/ml)的Hershey液体培养基上增殖，玻璃管中终体积为5ml并在37℃振荡(240rpm)过夜培养。培养后，在培养皿(Hershey琼脂培养基)中划线以获得单菌落。为了避免在液体培养基中系列传代(这可选择出突变体)，当需要时，每次从3个单菌落起始新培养物。在4℃以穿刺培养物的形式保藏原种培养物。
噬斑分析
用200μl新生长的过夜培养物和100μl粪便样品或细胞裂解物接种，在添加有硫胺素的Hershey琼脂培养基(该培养基上覆盖有Hershey顶层琼脂3.5ml)上获得噬斑。在37℃过夜培养培养皿。
分离噬斑和噬菌体扩增
用牙签挑取单个噬斑，并接种到添加有硫胺素的5ml Hershey液体培养基中，接种1％新鲜生长的培养物和1％噬菌体裂解物。在240rpm振荡下在37℃进行培养约5小时。当发生裂解时，加入3滴氯仿并轻轻混合。在室温下将裂解物放置过夜然后在10000rpm下离心10分钟。为了获得噬菌体原种，通过小心避开氯仿回收上清液并转入带有螺旋帽的玻璃管中。加入3滴新鲜的氯仿并将噬菌体原种保存在4℃。用于噬菌体扩增的株系为K-12或O127:K63(B74-9)。对于不同的噬菌体分离物使用下述命名法：JS(进行噬菌体研究的Josette Sidoti的首字母)其后为患者的ID号码。对于从同一个患者获得的多个分离株，该号码后为另外的数字(例如JS61.2)。当从患者的第二(康复期)粪便中获得第二分离物时，在第二数字上加上标(例如JS65.2′)。对于分离自环境水中的噬菌体，首字母后分别为D(达卡)或L(洛桑)和噬菌体分离物的标识符(例如JSL.4)。
斑点试验
将3.5ml Hershey顶层琼脂和200μl新生长的大肠杆菌培养物的混合物倾倒在添加有硫胺素的底层Hershey琼脂上。当顶层琼脂固化后，在其上以顺时针方向点8个10μl过滤并提纯后的粪便点。在37℃过夜培养。
在试管中裂解
5ml的Hershey液体培养基接种1％新生长的培养物。连续培养3至5小时，此时未感染的对照细胞达到稳定生长期。对用噬菌体接种的细胞中的光密度与模拟感染的对照细胞中的光密度进行目测比较。
噬菌体纯化
为纯化T4样噬菌体，在含有硫胺素的1升Hershey培养基中接种1％K-12，将细胞培养至OD为0.1，然后用大于1的moi(感染复数)感染。向裂解物中加入NaCl达到终浓度为0.5M并在4℃孵育1小时。在Sorvall RC5B离心机中以10000rpm(在4℃离心16分钟)离心后，向上清液中加入聚乙二醇PEG-6000至终浓度为10％。在4℃轻轻搅动下过夜孵育裂解物。通过以10000rpm离心16分钟回收用PEG沉淀的噬菌体，将得到的沉淀在3ml噬菌体缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM Mg2SO4)中重悬。将重悬的噬菌体沉淀施加到不连续CsCl梯度(1.35g/ml CsCl，1.53g/ml，1.65g/ml)上。将梯度在SW55转子中用Beckman L8-60M超速离心机以40000rpm在4℃离心3小时。
结果
噬菌体的分离
可从临床材料(例如粪便)或环境样品(例如下水道水)中分离大肠杆菌噬菌体。以前的工作显示从健康个体的粪便样品仅能很少地分离到噬菌体，噬菌体滴度低，而且大部分分离物是温和噬菌体(Furuse，K.，1987，环境中的大肠杆菌噬菌体分布：一般考虑，《Phage Ecology》PP.87-124，J.Wiley，纽约)。与此相反，腹泻患者的粪便样品中存在噬菌体高发率，而且比从健康个体的粪便样品中获得的噬菌体具有高滴度，而且大部分噬菌体是烈性噬菌体。为了增加分离T4样噬菌体的可能性，我们对来自急性腹泻住院的儿童的粪便样品进行了研究，所述儿童住在达卡/孟加拉国一个大规模的腹泻门诊部的普通病房中。在表1中总结了噬菌体筛查的统计学方面。
表1噬菌体筛查统计学
入选筛查项目的连续急性腹泻患者数目 157
具有成对的急性和康复期粪便样品的患者数目(以上的子集) 52
没有列入分析的粪便样品数目 17
没有列入分析的原因 确认患有霍乱或志贺氏菌(Shigella)感染
取样期 2000年2月6日至2000年2月25日
地点 达卡/孟加拉国
患者年龄(范围) 1个月至4岁
性别(男性∶女性) 96∶61
在K12指示细胞上产生噬斑的患者数目/检测的数目(阳性％) 26/140(19)
噬菌体滴度的范围(pfu/g粪便) 30*-5×104
滴度大于103pfu/g的患者数目/大于104pfu/g的患者数目 10/6
在B74-9上产生噬斑的粪便样品的数目/检测的数目(阳性％) 18/129(14)
噬菌体滴度的范围(pfu/g粪便) 30*-2×104
为了检测噬菌体的存在，在K12和B74-9都进行检测的粪便样品数目 118
-在两者上都为阴性 86
-在两者上都为阳性 4
-仅在K12上为阳性 14
-仅在B74-9上为阳性 14
注：试验的检测限
在小于3岁的孟加拉国儿童中腹泻疾病的平均病因：轮状病毒(rotavirus)26％，弯曲菌属(Campylobacter)26％，大肠杆菌15％，霍乱弧菌O1(V.cholerae O1)7％，其他弧菌9％，志贺氏菌4％，沙门氏菌＜1％。
在3周内从157例急性腹泻患者采集粪便样品。患者是非选择的并根据护士能够采集并保存粪便样品来完成采样。对于52个患者获得了出院后第二粪便样品。由于能够排除大肠杆菌引起的腹泻，排除了其中17个粪便样品：5个患者患有霍乱(通过米泔汁样粪便中暗视野显微镜观察弧菌而证实)和12个患有志贺氏菌痢疾(以临床基础来诊断：带血的、粘液状粪便)。这两种病原体合起来占住院患者的11％。该数据与这些病原体在该医院腹泻患者中的平均检出率一致(霍乱弧菌7％，志贺氏菌属4％)。
当在非致病性实验室大肠杆菌株系K-12上检测时，19％的粪便样品被标为阳性，检测极限为30pfu(噬斑形成单位)/g粪便。在所有患者中排泄到粪便中的噬菌体的最大量为5×104pfu/g粪便。然而，仅有4％的患者显示这么高的粪便噬菌体滴度。稍低百分比的患者显示能在致病性EPEC株系O127:K63上检测出的噬菌体(14％的检出率)。仅有4个粪便样品在实验室和致病性大肠杆菌株系上为噬菌体双阳性，而14个只对K-12为阳性，14个只对EPEC株系O127:K63为阳性。很明显，我们用两种不同的大肠杆菌指示细胞检测到两种明显不同的噬菌体群体，该两种噬菌体群体在宿主范围上极少重叠。令人感兴趣地，在致病性大肠杆菌指示细胞上14％的噬菌体检出率与孟加拉国腹泻患者的粪便样品中的致病性大肠杆菌株系的平均检出率密切相应(15％)。
还筛查了达卡/孟加拉国的不同来源的水(自来水、排水沟的水、垃圾中的水、运河中的水、池塘中的水、下水道的水、市场上的水、街道上的水、河流中的水、和沟渠水)以检测噬菌体的存在。从约100个样品(每种水来源各约10个)，获得了6种不同的噬菌体并进行了扩增。其中一个来自自来水、3个来自排水沟的水、1个来自下水道的水。洛桑(瑞士)的下水道中的水也产生了6个噬菌体分离物。
在实验室大肠杆菌株系上，在康复期粪便样品中的噬菌体检出率比在急性粪便样品中的低(在所研究的52对粪便样品中，阳性样品为4比11)。在致病性大肠杆菌株系上，从康复期和急性粪便样品中分离到数量相当的噬菌体(在16个研究的粪便样品中，阳性样品为5比4)。
在K-12细胞上检测到的所有噬斑均可在液体培养中生长在K-12上进行扩增。噬菌体滴度从2×104至4×1010pfu/ml。中值滴度为109pfu/ml。扩增的滴度与噬斑大小(大、中、小或极微小)、噬斑透明度(浑浊、清澈)、或起始粪便滴度无关。类似地，在EPEC株系O127:K63上检测到的噬斑可在该致病性大肠杆菌株系上扩增到1-5×108pfu/ml。
引起腹泻的大肠杆菌株系的靶群体
在50个致病性大肠杆菌株系上选择具有最广泛宿主范围的噬菌体分离物，所述的大肠杆菌株系来自从世界范围内的儿童腹泻患者分离的主要血清型。表2显示一些所述的株系。这一组株系涵盖了14种不同的菌体O抗原(菌体O抗原反映脂多糖抗原(LPS)的不同的糖链)，以及14种不同的荚膜抗原K。荚膜抗原K亦反映细菌荚膜物质的不同多糖组成，另外，我们还具有许多主要的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)血清型，其分离自世界各地的儿童胃肠炎患者和成人旅行者腹泻患者(表2)。这些ETEC株系代表了另14种不同的O抗原和13种不同的H抗原。H抗原为来自细菌鞭毛的蛋白质抗原。根据ETEC株系产生的肠毒素，可对它们进一步细分。8个株系产生热不稳定性(LT)和热稳定性(ST)肠毒素。2个仅产生热不稳定性肠毒素；4个仅产生热稳定性肠毒素。
表2：来自Nestec保藏中心的引起腹泻的大肠杆菌株系的致病性类型，O-、K-和H-血清型
    Nestec编号     O:K(H)血清型   致病性类型：毒力因子   粪便噬菌体
    B74-20     O18:K77     EPEC     16
    B74-24     O20:K84     EPEC     4
    B74-7     O26:K60     EPEC     10
    B74-26     O44:K74     EPEC     -
    B75-45     O55:K59     EPEC     7
    B74-10     O86:K61     EPEC     13
    B74-1     O111:K58     EPEC     10
    B74-28     O112:K66     EPEC     6
    L74-30     O119:K69     EPEC     5
    B75-46     O124:K72     EPEC     0
    B74-14     O125:K70     EPEC     5
    B74-16     O126:K71   EPEC   -
    B74-9     O127:K63   EPEC   -
    M75-53     O128:K67   EPEC   -
    R81-116     O6:H16   ETEC:LT+/ST+   15
    R81-117     O8:H9   ETEC:LT+/ST+   0
    R81-118     O15:H11   ETEC:LT+/ST+   12
    R81-119     O25:H42   ETEC:LT+/ST+   12
    R81-120     O78:H12   ETEC:LT+/ST+   11
    R81-121     O115:H51   ETEC:LT+/ST+   8
    R85-141     O128:H18   ETEC:LT+/ST+   0
    R85-145     O148:H28   ETEC:LT+/ST+   14
    R85-147     O114:H49   ETEC:LT+/ST-   -
    R85-149     O159:H21   ETEC:LT+/ST-   -
    R85-137     O20:H11   ETEC:LT-/ST+   7
    R85-138     O27:H7   ETEC:LT-/ST+   1
    R85-144     O63:H-   ETEC:LT-/ST+   -
    R85-152     O153:H12   ETEC:LT-/ST+   9
注：第一列给出了大肠杆菌株系的内部NRC编号；第二列提供了株系的菌体O、荚膜K或鞭毛H的血清型，黑体O血清型表示该大肠杆菌株系也分离自犬的腹泻(Sancak，1997)；第三列显示致病性类型(EPEC：致肠病性大肠杆菌；ETEC：产肠毒素大肠杆菌；LT、ST为热不稳定性和热稳定性肠毒素)；第四列显示裂解所示大肠杆菌株系的粪便噬菌体分离物的数目(检测了32个粪便噬菌体分离物)。
分离的噬菌体的宿主范围筛查
在第一轮，从腹泻患者的粪便样品中分离出32个噬菌体。在来自我们的合并细胞保藏物的50个引起腹泻的大肠杆菌株系上对这些噬菌体进行系统检测。在第二轮，获得具有广泛宿主范围的进一步的噬菌体分离物。
宿主范围检测涉及大量的噬菌体-细胞组合(N＝32×50＝1600，在50个大肠杆菌株系上)，我们使用斑点试验来筛查。在这个试验中，通过在培养皿中的菌苔上点上一滴扩增的噬菌体裂解物，可一次同时检测8个不同的扩增的噬菌体裂解物。在过夜培养后读取结果并且当所点区域上的细菌的生长受到危害或阻止时，将其记为阳性。表3中显示一些噬菌体分离物的结果并总结在表4中。
噬菌体JS↑ 146.1 146.2 65.1 65.2 61.1 77.1 83.1 114.2 114.1 4 66 76.2 12
E.coli↓  K  K  K  K  B  B  B  B  K  K  K  K  K
ETEC LT+/ST+  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+
ETEC LT+/ST-  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST-
ETEC LT+/ST-  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+
ETEC LT+/ST-  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST-
ETEC LT+/ST-  X  X  X  X  X  X  X  X  X
EPEC:A/E+  X  X  X  X  X  X  X  X  X
EPEC:A/E+  X  X  X  X  X
EPEC:A/E+  X  X  X  X  X  X  X  X  X  X
EPEC:A/E+
EPEC:A/E+  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+；CFA1  X  X  X  X
ETEC LT-/ST+；CS4；CS6  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT-/ST+；CS6  X  X
ETEC LT-/ST+；PCF O166  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+，CS1；CS3  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT-/ST+；CFA1  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC LT-/ST+；CS4；CS6  X  X  X  X  X  X
ETEC LT+/ST+；CS1；CS3 X X X X X X X X X
ETEC LT+/ST+；CS5；CS6
ETEC LT+/ST+；CS5；CS6
EPEC  X  X  X  X  X X X X X
EPEC X X X X X X X X X X
EPEC  X  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC O6:H16 X X X X X X X X X
ETEC O8:H9
ETEC O15:H11 X X X X X X X X X
ETEC O25:H42  X  X  X  X  X  X  X  X
ETEC O78:H12 X X X X X X
ETEC O115:H51 X X X X X X
ETEC O20:H11  X  X  X  X  X  X
ETEC O27:H7  X
ETEC O128:H18
ETEC O63:H- X X X X X
ETEC O148:H28  X  X  X  X  X  X  X  X X
ETEC O153:H12 X X
EPEC O18:K77  X  X  X  X  X  X  X  X  X
EPEC O20:K84  X  X  X  X
EPEC O26:K60 X X X X X X
EPEC O55:K59 X X X
EPEC O86:K61  X  X  X  X  X  X  X
EPEC O111:K58  X  X  X  X  X X X
EPEC O112:K66  X  X  X X X
EPEC O119:K69 X X X X
EPEC O124:K72
EPEC O125:K70  X  X  X  X
表3：用斑点试验进行评估的所示大肠杆菌株系对在K-12(K)或O127:K63(B)上增殖的粪便噬菌体分离物JS1至JS16感染的敏感性。
表3注：第一列中显示的大肠杆菌株系对第一行中显示的噬菌体株系的感染的敏感性。噬菌体株系的进一步表征参见表5。第二行提供用于增殖噬菌体的大肠杆菌株系的信息(K：非致病性K-12；O：致病性O:127:K63)。“X”指示在斑点试验中生长抑制，空白意味着如对照点(模拟感染)一样生长。
当比较来自同一患者的不同的噬菌体分离物时，获得了近乎相同的结果。例如，从患者146的粪便样品中扩增到2个不同的噬斑。噬菌体NCC-JS146.1在35个细胞上评定为阳性，而噬菌体NCC-JS 146.2感染50个检测细胞中的36个。除了一个例外，两个噬菌体在宿主范围上完全重叠(表3)。在从同一患者的急性和康复期粪便样品中分离到的2个噬菌体上也可看到类似的重叠：患者65的噬菌体NCC-JS 65.1和NCC-JS 65.2’分别感染26和25个大肠杆菌株系。同样除了一个例外，在宿主范围上完全重叠(表3)。来自同一患者的独立噬菌体分离物间的这种高度的相关性结果证明了斑点试验的可靠性。
对于在非致病性实验室株系K-12或致病性株系O127:K63上繁殖的噬菌体，宿主范围显著不同。前者噬菌体可以在26种(中值)不同的致病性大肠杆菌株系上生长，而后者除了在繁殖细胞上外，仅在一种(中值)致病性株系上生长(表4)。这从患者114的粪便样品中可得到说明，该样品为同时在K-12和O127:K63上产生噬菌体的少数粪便样品(n＝3)之一。K-12上扩增的噬菌体感染24个致病性株系，而O127:K63上扩增的噬菌体仅感染一个株系(表4)。
表4：在达卡的儿童腹泻患者的粪便样品中分离的36个噬菌体的特性
编号 增殖菌株 噬斑大小 斑点试验阳性
NCC-JS9  K  m  33
NCC-JS31  K  g  27
NCC-JS102.2  K  m  9
NCC-JS150  K  s  3
NCC-JS61.1  B  s  5
NCC-JS77.1  B  pp，t  0
NCC-JS83.1  B  s，t  1
NCC-JS20  B  s  7
NCC-JS1  K  m  28
NCC-JS4  K  m  35
NCC-JS22  K  m  17
NCC-JS32  K  s  21
NCC-JS114.1  K  m，t  24
NCC-JS  K  m  6
NCC-JS146.1  K  s  35
NCC-JS65.1  K  s  26
NCC-JS65.2′  K  m  25
NCC-JS89  B  m  1
NCC-JS114.2  B  s，t  1
NCC-JS124  B  m  2
NCC-JS76.1  B  s  4
NCC-JS77.2′  B  pp  0
NCC-JS83.2  B  m  1
NCC-JS86  B  m  1
NCC-JS76.2′  K  m  28
NCC-JS12  K  s  29
NCC-JS152  K  s  14
NCC-JS66  K  m  33
NCC-JS102.1  K  s  0
NCC-JS140.2  K  s  2
NCC-JS146.2  K  m  36
NCC-JS61.2  B  m  3
NCC-JS114.3  B  s  n.t.
NCC-JS94.1  K  m  n.t.
NCC-JS98  K  s  n.t.
NCC-JS122.1  K  g，t  n.t.
注：第一列为：分离的噬菌体的NRC编号；第二列提供用于繁殖噬菌体的大肠杆菌株系的信息(K：非致病性K-12；B：致病性O:127:K63)；第三列，用NRC编号标识的患者(可获得姓名、性别、年龄、达卡的患者标识号，但由于保密性的原因，没有提供)；第四列，a：急性粪便样品，c：康复期粪便样品；第五列，噬斑大小：g：大，m：中，s：小，pp：极微小，t：与清澈的噬斑相反为浑浊；第六列，在50个检测的大肠杆菌株系上用斑点试验评价的受感染的株系数目。
在宿主范围方面，从不同患者分离到的许多噬菌体紧密相关(例如分离物NCC-JS4、NCC-JS146.1和NCC-JS66感染多达35种细胞，不同的最大数目是4种细胞；分离物NCC-JS76.2’和NCC-JS12只显示4种不同)。然而，具有相同的宿主范围的噬菌体只在宿主范围非常窄的噬菌体中找到(分离物NCC-JS83.1、NCC-JS89、NCC-JS114.2、NCC-JS83.2和NCC-JS86只感染株系AD-24304和O127:K63)。
分离的噬菌体的裂解潜力
在培养大肠杆菌株系和噬菌体的试管中以缺乏浑浊度来目测评估细胞裂解。当未感染的大肠杆菌株系达到最大混浊度时，读取实验结果。例如噬菌体分离物NCC-JS4、NCC-JS146.1、NCC-JS66和NCC-JS146.2在斑点试验中对致病性大肠杆菌株系显示广泛且非常相似的宿主范围，但在裂解株系的能力方面却显著不同(表5)。噬菌体NCC-JS4裂解50种检测的大肠杆菌细胞中的13种，而噬菌体NCC-JS146.1、NCC-JS66和NCC-JS146.2仅裂解4至5种大肠杆菌株系，所述株系是被噬菌体NCC-JS10裂解的株系的子集。
表5：用在斑点试验中具有最广泛宿主范围的粪便噬菌体(NCC-JS编号)裂解在液体培养物中的所示致病性大肠杆菌株系。
噬菌体JS→大肠杆菌↓ 4 D.1 146.1 66 146.2 1.6 94.1 122.1 裂解
ETEC LT+/ST+   0
ETEC LT+/ST+   0
ETEC LT+/ST-   +   1
ETEC LT+/ST-   0
ETEC LT+/ST-   0
ETEC LT+/ST+   0
ETEC LT+/ST+   0
ETEC LT+/ST-   +   +   +   +   4
ETEC LT+/ST-   0
ETEC LT+/ST-  +   +   2
EPEC:A/E+   +   (+)   2
EPEC:A/E+   +   1
EPEC:A/E+   +   +   2
EPEC:A/E+   0
EPEC:A/E+   0
ETEC LT+/ST+；CFA1   0
ETEC LT-/ST+；CS4；CS6   0
ETEC LT-/ST+；CS6   0
ETEC LT-/ST+；PCF O166   0
ETEC LT+/ST+；CS1；CS3   0
ETEC LT-/ST+；CFA1  +   1
ETEC LT-/ST+；CS4；CS6   0
ETEC LT+/ST+；CS1；CS3  +   (+)   2
ETEC LT+/ST+；CS5；CS6   0
ETEC LT+/ST+；CS5；CS6   0
EPEC  (+)   +   2
EPEC  (+)   1
EPEC   0
ETEC O6:H16
ETEC O8:H9   +   1
ETEC O15:H11   0
ETEC O25:H42   +   +   +   +   4
ETEC O78:H12   0
ETEC O115:H51 (+)   1
ETEC O20:H11   0
ETEC O27:H7   0
ETEC O128:H18   0
ETEC O63:H-   0
ETEC O148:H28   +   1
ETEC O153:H12   0
EPEC O18:K77   +   1
EPEC O20:K84   +   +   +   +   +   5
EPEC O26:K60   +   1
EPEC O55:K59   +   +   +   +   +   5
EPEC O86:K61   0
EPEC O111:K58   +   1
EPEC O112:K66   +   +   +   3
EPEC O119:K69   +   1
EPEC O124:K72   +   1
EPEC O125:K70   0
注：在第一列中，以NRC编号给出NRC大肠杆菌分离物(对这些株系的其它信息，分别参见表3和表2)。列2至9：“+”和“(+)”分别表示所示列的噬菌体可以裂解和部分裂解相应行的所示大肠杆菌株系。列10：可以裂解所示大肠杆菌株系的不同噬菌体分离物的数目(检测的全部噬菌体数目：8)。
在未感染的和被噬菌体感染的K-12细胞生长后进行OD读数(图1)。观察到两种不同类型的OD发展。在第一种类型中，感染的细胞跟随未感染细胞的OD发展直至感染后70至90分钟。在此相之后，感染细胞的OD降低且在感染后约150分钟达到背景OD。在第二种类型的感染中(其由大部分噬菌体显示)，噬菌体感染的细胞显示出很早就偏离了未感染对照细胞的OD发展。在感染后约190分钟观察到下降至背景水平(图1)。
噬菌体的纯化
用6种不同的噬菌体接种1升体积的K-12培养物产生噬菌体滴度约6×107至1010噬斑形成单位(pfu)/ml。用聚乙二醇沉淀来自裂解物的噬菌体，用CsCl密度梯度离心进一步纯化所获得的噬菌体沉淀。回收位于CsCl梯度中的噬菌体带，进行透析以从其中除去盐溶液。
下表以监测病毒感染力的回收量的方式记载了所述噬菌体纯化方法的效率。用噬菌体NCC-JS10观察到噬菌体感染力的最高起始滴度，然而，这种噬菌体几乎是最难纯化的。噬菌体回收率仅为起始感染物质的0.3-5％。对于其他噬菌体，常规为至少10％回收率。回收率可高达粗裂解物中起始感染力的40％。
表6：在聚乙二醇沉淀(PEG)后及在Cs密度梯度离心(CsCl)及透析后T4样噬菌体的回收
噬菌体   裂解物     PEG     CsCl
NCC-JS146.1(1)   6×1010     3×109(5％)     1.8×1010(30％)
NCC-JS146.1(2)   6×1010     2×109(3％)     9×109(15％)
NCC-JS114.3(1)   1×1012     6×1011(60％)     4×1011(40％)
NCC-JS114.3(2)   1×1012     4×1011(40％)     2×1011(20％)
NCC-JS94.1(1)   4×1011     3×1010(8％)     6×1010(15％)
NCC-JS94.1(2)   4×1011     2×1010(5％)     3×1010(8％)
NCC-JS4(1)   1×1013     2×1011(2％)     8×109(0.8％)
NCC-JS4(2)   1×1013     1×1011(1％)     3×109(0.3％)
NCC-JS4(3)   1×1011     2×109(2％)     5×109(5％)
注：第一列标识噬菌体分离物，独立实验的结果以括号中的数字区分开；第二列显示以噬斑形成单位表示的1升细胞裂解物中的噬菌体总量；第三列提供了PEG沉淀中的噬斑形成单位的总量，在括号中显示相对于裂解物中的量的百分比回收率；第四列提供在从CsCl密度梯度离心分离的经透析的噬菌体带中的噬斑形成单位的总量，括号中显示相对于裂解物中的量的百分比回收率。
实施例2：具有170-kb基因组大小的噬菌体的表征
材料和方法
脉冲场电泳(PFGE)
将含有106噬菌体形成单位的所示噬菌体的1％琼脂糖的PFGE块在裂解缓冲液(0.05M EDTA，10mM Tris pH8.0，1％SDS和50μg蛋白酶K)中孵育过夜并在10ml TE(10mM Tris pH8.0，1mM EDTA)中洗涤3次，1小时。通过在1％琼脂糖低溶点胶(0.5％TBE：45mM Tris-硼酸盐，1mMEDTA)中电泳来分析所述的块，所述的电泳条件为6V/cm，14℃，电泳20小时，脉冲时间为1-20秒。所述的胶用溴化乙锭(0.5μg/m1)染色30分钟。
DNA纯化
纯化的噬菌体在37℃用终浓度为1mg/ml的蛋白酶K处理2小时并加入3M乙酸钠pH4.3。DNA用苯酚-氯仿提取两次并用2倍体积的乙醇沉淀。在离心后，用70％乙醇洗涤所述的沉淀并在50ml TE中重悬。按照生产商提供的说明用限制性酶消化DNA。
电子显微镜法
将一滴噬菌体悬液滴加到formvar-碳包被的铜载网上5分钟，用移液器移走悬液并立即用溶液A和B的混合液代替(A：2％钼酸铵，pH7.0，；B：溶于蒸馏水的7.5mg杆菌肽)。1分钟后，用滤纸去除液体。于80kV在Philips CM12透射电子显微镜中检测所述的载网(放大倍数：176′000×或224′000×)。
结果
选择来自不同患者的12个粪便样品用于进一步特性描述，所述样品显示具有170-kb基因组的噬菌体。我们通过电子显微镜研究了这些噬菌体的形态学，所有的噬菌体都属于具有长的可收缩尾的肌尾病毒科。明显与熟知的大肠杆菌噬菌体T4在形态学上非常相似。例如，伸长的头部约110nm乘75nm。颈部将头与尾鞘分开。尾鞘由环状亚结构构成，长约95nm，宽约18nm。尾以基板结构结束，该基板结构上结合有短的尾刺和长的尾丝。尾丝约150nm长并且约在纤维中部的关节处弯折。观察到具有40nm可收缩尾鞘的噬菌体。在这些噬菌体中，内部尾管延伸超出可收缩的尾鞘。不同的负染色法选择性地揭示出这些噬菌体的各种形态学特征。例如，尾鞘的环状结构和尾收缩后其结构的改变用乙酸双氧铀染色最宜观察，而尾丝用磷钨酸负对比染色看得更好。偶尔，在颈部可见颈须。
使用基于DNA的技术来区分在当前调查中分离的T4样噬菌体。T4噬菌体含有葡糖基化羟甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶。这种修饰使T4噬菌体对多数限制性酶消化具有抗性。已知仅有少数酶可剪切T4 DNA(EcoRV、NdeI、PacI、SwaI、SspI和SphI)。然而，在从不同患者选择的9个T4样噬菌体分离物中，没有一个被EcoRV、NdeI、SwaI或SphI消化，仅有2个被SspI消化，而所有的至少部分被PacI消化。
在下面的步骤中，我们用标记的T4 DNA作为探针在Southern印迹上检测了PacI消化的噬菌体DNA。在高严格杂交条件下，一些分离物与T4探针显示了广泛的交叉杂交，而其他的显示较弱的交叉杂交或与T4缺乏DNA同源性。
使用引物对(FR60和FR61)利用PCR确认了这些Southern杂交，所述的引物对来自用于诊断T4-型噬菌体的T-偶数亚群(Repoila et al 1994genomic polymorphism in the T-even bacteriophages.EMBO J 13：4181-4192)的T4基因32序列。在所述印迹上与T4 DNA交叉杂交的噬菌体在PCR分析中显示清晰的阳性PCR结果，而不与T4交叉杂交的噬菌体分离物不显示PCR带，或PCR带微弱。然后针对基因32的PCR产物为阴性的噬菌体分离物用基于一组引物(引物MziaI和caps8)的PCR分析法再次进行检测，所述的引物位于T4基因23序列中，可用于检测T4型噬菌体的pseudo T-偶数和schizo T-偶数亚群以及T-偶数(Tetard等2001，多样的T4型噬菌体的主要头尾基因的系统发生，J.Bacteriol.1 83(1)：358-366)。除了2种噬菌体分离物外，其余的所有噬菌体分离物都产生鉴别性g23扩增产物(表7)。所述的例外为粪便分离物JS98和瑞士下水道水分离物JSL.3。在电子显微镜下，两种噬菌体都显示相当传统的T4样形态学。在Southern印迹中，JSL.3与另一瑞士下水道水分离物JSL.5强烈交叉杂交，但是与其他几种噬菌体(包括T4)仅微弱交叉杂交。JSL.5与许多分离物起微弱反应，但明显不与T4起反应。
表7：基因32和基因23鉴别性PCR试验的总结
噬菌体     数量(％) 鉴定结果
检测的噬菌体的全部数目     47(100)
基因32PCR中的阳性数目     24(51) T-偶数噬菌体
在基因32中为阴性但在基因23PCR中为阳性的数目，     21(45) pseud和schizo T-偶数
在基因32和23PCR中都为阴性的数目     2(4) T4的形态学，遗传上较远的亲缘物种
实施例3：用本发明的噬菌体进行的体内实验
材料和方法
试验动物
使用8周龄的C3H雄性小鼠(除了另有提示，5个一组)用于感染实验。把每只小鼠放在具有过滤盖(filtered-top)的笼子中。饮用的水使用无菌Vittel。每天收集一次粪便并将其重悬在1ml PBS(磷酸缓冲盐水)中。为了对大肠杆菌进行计数，将10进制稀释的重悬粪便放在Drigalski琼脂(Biorad)上。将噬菌体加入饮用的水中。过滤0.5ml重悬粪便并对噬菌体进行计数。当在水中还存在噬菌体时处死小鼠并进行尸体解剖。取出不同的器官(结肠、十二指肠、回肠、空肠、淋巴结和肝脏)并检测大肠杆菌和噬菌体的存在。
在小鼠模型中体内噬菌体混合物的活性
在前两周，先使用正常的水然后使用无菌Vittel。在第三周，在前2天，以终浓度为103噬斑形成单位(pfu)/ml向饮用水中加入4种T-4样噬菌体(JS94.1、JSD.1、JS4和JSL.6)的混合物，然后以105pfu/ml加入直至本周结束。在第四周，提供无菌Vittel。以终浓度105pfu/ml第二次向水中加入噬菌体，然后提供无菌水，最后为107pfu/ml噬菌体。在整个实验中始终监测噬菌体。
噬菌体的剂量反应效果
如前所述，交替地给予水和同样的噬菌体。使用4只小鼠，每只接受单一浓度的噬菌体。第一只小鼠接受的噬菌体终浓度为103pfu/ml，第二只小鼠接受的噬菌体终浓度为104pfu/ml，第三只小鼠接受的为105pfu/ml，最后一只接受的为106pfu/ml。在整个实验中始终监测噬菌体。
使用无菌小鼠的噬菌体感染
使用8周龄的C3H无菌雄性小鼠。在整个实验中使用无菌Vittel作为饮用水。使用4只小鼠，其中2只被迫食用大肠杆菌K12(0.5ml，浓度为108cfu/ml)。每天收集一次粪便并在Drigalski平板上对大肠杆菌细胞进行计数。1周后，以浓度105pfu/ml喂给噬菌体。每天采集4次粪便。重悬的粪便稀释液放在Drigalski上并在过滤后对噬菌体进行计数。3天后，喂给水并在接下来那周的开始，第二次强迫喂食大肠杆菌ECOR5。在同样的情况下，喂给噬菌体并用与上述相同的方法处理重悬的粪便。
结果
在第一步中，研究了大肠杆菌的正常菌群。给5只鼠喂食正常的水两周然后使用无菌Vittel。每天收集粪便然后重悬，在选择性培养基中对大肠杆菌细胞进行计数。在常规小鼠中，我们发现大肠杆菌的正常菌群在105至107cfu/g之间变化(图3)。黑线显示的平均值是线性的(R2＝0.0002)，为106cfu/g，这与Poulsen等获得的结果是一致的(1994，从rRNA原位杂杂推出的小鼠大肠中大肠杆菌的空间分布，Infect.Immun.62(11)：5191-5194)。两周后，喂给直接在饮用水中稀释的T4样噬菌体混合物。持继几天，向水中加入的浓度为103pfu/ml并以103pfu/ml的浓度从粪便中回收到噬菌体，显示噬菌体可以通过肠道而存活。大肠杆菌正常菌群没有受噬菌体的存在影响。甚至如果将浓度提高到105pfu/ml持继一周，大肠杆菌还约为106cfu/g并且从粪便中回收的噬菌体在105至106pfu/g之间。当仅喂给无菌Vittel水时，从粪便中不再回收到噬菌体。当将噬菌体分别以终浓度105pfu/ml和107pfu/ml两次再喂给小鼠时，也获得了同样的观察结果。从粪便中回收的噬菌体的量与接受的噬菌体成比例，显示噬菌体在小鼠肠道中几乎不或没有发生扩增。当小鼠一旦饮食纯水，从粪便中不能回收到噬菌体。大肠杆菌正常菌群未改变，意味着在肠道中存在的噬菌体没有影响该菌群。当在肠道中存在噬菌体时，进行了尸体解剖，在图4B中显示了这些结果。采集不同的器官。发现噬菌体主要在结肠和十二指肠，而在淋巴结和肝脏中没有发现噬菌体。这提示：噬菌体不进入血液系统。在常规小鼠中，大肠杆菌的存在水平非常低，因为仅在结肠和回肠中观察到几个细胞。
在无菌小鼠中的裂解活性
在无菌小鼠模型中检测了噬菌体的感染性，使大肠杆菌K12在2个8周龄的C3H无菌雄性小鼠中建群。获得水平为108cfu/g，该水平比在常规小鼠中的水平高，但对于无菌小鼠是正常的(Poulsen等)。在饮用水中以105pfu/ml的浓度加入噬菌体时，在半天内，在粪便中回收到的确高的噬菌体浓度，显示噬菌体在肠道中裂解K-12并扩增。在该半天内，大肠杆菌的水平剧烈下降。一天后，噬菌体仍处于高水平，而大肠杆菌还能存活并保持在浓度为105cfu/g。甚至如果从水中去除噬菌体，在粪便中还存在噬菌体，在3天内观察到降低2个对数(log)。
在强迫喂食ECOR5后(该ECOR5为从人类正常菌群中分离的大肠杆菌)，高水平的大肠杆菌再次在小鼠中建菌(约1010cfu/g)。ECOR5不受在本实验中已使用的噬菌体JS94.1的影响，鉴于该原因，建菌快并且稳定。甚至当将噬菌体再次加入饮用水中，细胞计数保持相同但噬菌体滴度达到喂给小鼠的水中的浓度。
当在肠道中不再存在噬菌体时，进行尸体解剖，图4A显示了结果。大肠杆菌似乎主要定居在结肠和肠道的一小部分。还测定了噬菌体滴度且在检测的任何器官中均没有发现噬菌体(未显示数据)。
在消化道-肠道中存活的不同噬菌体
交替地，喂给无菌Vittel一周，在接下来的一周喂给终浓度为107pfu/ml的噬菌体。检测了4种不同的噬菌体(分别为JS4、JSD.1、JSL.6和JS94.1)。用噬菌体处理4只小鼠。将最后一只小鼠作为对照，并只接受无菌Vittel水。在整个实验中始终监测噬菌体。
在本实验中，我们将组成前面试验的混合物的T4样噬菌体一个接一个喂给5只小鼠。以相同的方式处理所有的噬菌体。向水中加入噬菌体并在1天后以喂给的相同浓度在粪便中回收到噬菌体。当从水中去除噬菌体后时，在24小时后，在粪便中不再发现噬菌体。无论在饮用水中使用何种噬菌体，均获得了相同的结果。
如果给4只不同的小鼠喂给4种不同浓度的这些噬菌体，可观察到剂量反应效果。当使用的浓度非常低(103pfu/ml)时，在粪便中存在噬菌体，但是不稳定。当将该浓度提高1个对数时，在整个处理过程中粪便中始终存在噬菌体且以较高的水平被回收。当再多1个和2个对数时，获得相同的观察结果。
实施例4干宠物食品
饲料混合物由下列物质构成：约58重量％的玉米、约5.5重量％玉米面筋、约22重量％鸡肉粗粉、2.5％干菊苣、106pfu/ml噬菌体混合物、盐、维生素和构成其余部分的矿物质。将所述的饲料混合物装入预处理器(preconditioner)并使其润湿。然后将变湿的饲料装入挤出机-蒸煮机并使其胶化。迫使离开挤出机的胶化基质通过模具并被挤出。将挤出物切成适于喂给狗的块，在约110℃干燥约20分钟，并冷却以形成块。
这种干燥的狗食能够预防或治疗宠物中由诸如大肠杆菌或沙门氏菌等致病性肠杆菌科细菌引起的感染性疾病，例如胃肠炎、腹泻或泌尿疾病。
实施例5营养制剂
制备一种营养组合物，其中每100g粉末包含：15％蛋白水解物、25％脂肪、55％碳水化合物(包括麦芽糖糊精37％、淀粉6％、蔗糖12％)、痕量维生素和少量元素以满足每日需要、2％矿物质和3％水分和106pfu/ml噬菌体混合物。将13g这种粉末在100ml水中混合。获得的制剂特别旨在用于预防人类中的胃肠炎、腹泻或泌尿疾病。

Claims (17)

1、宿主范围广泛的噬菌体分离物制品，该制品对致病性肠杆菌科的细菌具有实质性的裂解潜力，该制品是烈性和非毒性T4样肌尾病毒科噬菌体的分离物或其混合物。
2、根据权利要求1的噬菌体分离物制品，其中致病性肠杆菌科细菌选自大肠杆菌和/或沙门氏菌。
3、根据权利要求1或2的噬菌体分离物制品，其中噬菌体选自：NCC-JS10，再命名为NCC-JS4，保藏号为CNCM I-2763；NCC-JS35，再命名为NCC-JS94.1，保藏号为CNCM I-2764；NCC-JS1.4，再命名为NCC-JSD.1，保藏号为CNCM I-2765；和NCC-JSF，再命名为NCC-JSL.6，保藏号为CNCM I-2766。
4、至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品在制备用于预防或治疗人类或动物中由致病性肠杆菌科细菌引起的感染的食品或宠物食品、营养组合物、增补剂或药物组合物中的用途。
5、根据权利要求4所述的用途，其中所述的感染为人类或动物中的胃肠炎、腹泻、ETEC感染或泌尿疾病。
6、根据权利要求4或5所述的用途，其中致病性肠杆菌科细菌选自大肠杆菌和/或沙门氏菌。
7、根据权利要求4或5所述的用途，其中所述噬菌体分离物制品的量至少为1×104pfu/ml。
8、一种食品，其包含至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品。
9、根据权利要求8所述的食品，其中所述噬菌体分离物制品的含量至少为约1×104pfu/ml。
10、一种宠物食品，其包含至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品。
11、根据权利要求10所述的宠物食品，其中所述噬菌体分离物制品的含量至少为约1×104pfu/ml。
12、一种营养组合物，其包含至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品。
13、根据权利要求12所述的营养组合物，其中所述噬菌体分离物制品的含量至少为约1×104pfu/ml。
14、一种增补剂，其包含至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品。
15、根据权利要求14所述的增补剂，其中所述噬菌体分离物制品的含量至少为约1×104pfu/ml。
16、一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1至3任一项所述的噬菌体分离物制品。
17、根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述噬菌体分离物制品的含量至少为约1×104pfu/ml。
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