PT1458856E - Fagos isolados e sua utilização em produtos alimentares ou produtos alimentares para animais de estimação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "FAGOS ISOLADOS E SUA UTILIZAÇÃO EM PRODUTOS ALIMENTARES OU PRODUTOS ALIMENTARES PARA ANIMAIS DE ESTIMAÇÃO"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a isolados de fago possuindo uma forte actividade litica contra Enteriobacteriaceae patogénicas tais como Escherichia coli e estirpes de Salmonella e sua utilização em vários produtos alimentares para humanos ou animais de estimação, para utilização no tratamento ou prevenção de doenças bacterianas causadas por Enteriobacteriaceae patogénicas tais como Escherichia coli ou Salmonella, em particular para terapia de fagos de gastroenterite pediátrica. Refere-se também aos seus produtos alimentares para humanos ou animais de estimação preparados a partir desses fagos.

Antecedentes da invenção

No passado, os antibióticos foram utilizados para tratar várias infecções. 0 trabalho Selman Waksman na introdução e produção de Streptomycetes e a descoberta da penicilina pelo Dr. Fleming, assim como o trabalho de vários outros no campo dos antibióticos, são bem conhecidos. Ao longo dos anos, existiram adições e modificações químicas aos antibióticos "básicos" em tentativas para os tornar mais poderosos ou para tratar pessoas alérgicas a estes antibióticos. 1

Contudo, quanto mais antibióticos foram prescritos ou utilizados numa taxa sempre crescente para uma variedade de doenças, os números de bactérias que desenvolveram uma resistência a antibióticos aumentou. Doses maiores de antibióticos mais fortes são agora utilizadas para tratar estirpes ainda mais resistentes de bactérias. Consequentemente, foram desenvolvidas múltiplas bactérias resistentes a antibiótico e algumas infecções adquiridas no hospital com bactérias Gram-positivas tornaram-se já intratáveis. A utilização de mais antibióticos e o número de bactérias que apresenta resistência levou a aumentos na quantidade de tempo em que os antibióticos necessitam ser utilizados. Os antibióticos de largo espectro, não específicos, alguns dos quais possuem efeitos prejudiciais no doente, são agora utilizados mais frequentemente. Adicionalmente, o número de pessoas que apresentam reacções alérgicas a antibióticos parece estar a aumentar.

Consequentemente, foram feitos outros esforços para primeiro identificar e depois matar bactérias.

Foram feitas tentativas para tratar doenças bacterianas com a utilização de bacteriófagos. Estes são um grupo heterogéneo de vírus que infecta bactérias que foi primeiro descoberto na primeira parte do século XX (d'Herelle, F., "The bacteriophage. Its role in immunity", traduzido por Smith, G. H., Williams & Wilkins Co., Baltimore (1922)). Os bacteriófagos são presentemente vastamente utilizados em investigação científica, tais como em biologia molecular (e. g. como vectores genéticos) e em diagnósticos médicos (e. g. tipagem de bactérias com 2 fagos). Até agora, como os fagos infectam naturalmente e matam as bactérias, foi tradicionalmente sugerido que estes pudessem ser utilizados em terapêuticas médicas, porque as bactérias são uma das principais causas de doença.

De facto, as potenciais utilizações terapêuticas de fago em sistemas experimentais foram reportadas extensivamente na literatura.

Por exemplo, o documento US 5688501 (Merril, et al.) divulga um método para tratar uma doença bacteriana infecciosa com bacteriófagos liticos ou não liticos que são específicos para bactérias particulares.

Também, o documento US 4957686 (Norris) divulga um processo de higiene dentária melhorado que compreende a introdução na boca de bacteriófagos parasiticos para bactérias que possuem a propriedade de rapidamente aderir à película salivar.

Apesar do reconhecido valor e importância de novas terapias antimicrobianas, o potencial da terapia fágica não foi conseguido em nenhum sentido prático dos que são utilizados na terapêutica moderna, nem tem métodos, composições, ou foram definidas outras utilizações para terapias não tóxicas e eficazes deste tipo com distribuição prática e eficaz. Em particular para prevenção eficiente e tratamento de infecções relacionadas com E. coli, tal como doenças de diarreia.

De facto, a E. coli é uma bactéria extremamente bem investigada, com dois membros completamente sequenciados, a estirpe não patogénica K-12 (Blattner, F.R., et al., 1997 3

Science 277, 1453-1474) e a estirpe patogénica 0157:H7 (Perna, N.T. et al., 2001, Nature 409, 529-533; Hayaslis et al., 2001, ADN Research 8, 11-22) que se parece com as estirpes enteropatogénicas de E. coli (EPEC).

Embora, dois fagos de E. coli (lambda e T4) sejam os sistemas biológicos mais cuidadosamente caracterizados (Karam, J.D., 1994, Molecular biology of bacteriophage T4. ASM Press,

Washington, DC), existe ainda a necessidade de desenvolver terapêuticas fágicas novas e úteis que possam ser utilizadas para prevenir ou para tratar distúrbios infecciosos provocadas por estes microrganismos bacterianos, tal como serotipos de E. coli associados com a diarreia de crianças e do viajante.

Existe também uma necessidade de desenvolver composições incluindo terapêuticas fágicas em veículos aceitáveis que possam ser administradas a indivíduos infectados com microrganismos bacterianos.

Finalmente, existe uma necessidade de desenvolver uma preparação de bacteriófago que seja virulenta e não tóxica tornando-a deste modo útil no tratamento de infecções bacterianas relacionadas com as E. coli ou Salmonella patogénicas.

Sumário da invenção É deste modo um objectivo da presente invenção desenvolver terapêuticas fágicas novas e úteis que podem ser utilizadas para prevenir ou para tratar distúrbios infecciosos causados por 4

Enteriobacteriaceae patogénicas tais como infecções de E. coli, em particular doenças com diarreia ou urinárias em humanos ou animais, ou infecções com Salmonella.

Outro objectivo da invenção é proporcionar preparações de bacteriófago isolado para esta utilização com potencial litico substancial contra Enteriobacteriaceae patogénicas, tais como E. coli e/ou estirpes de Salmonella que são virulentas e não tóxicas. É também um objectivo da presente invenção proporcionar a utilização destas preparações de bacteriófago em várias composições nutricionais, produtos alimentares para animais de estimação, suplementos ou composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de infecções provocadas por E. coli e/ou Salmonella patogénicas em humanos ou animais. É ainda outro objectivo proporcionar uma composição nutricional, um produto alimentar para animais de estimação, um suplemento, ou uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um fago como acima descrito. É ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar uma utilização para prevenção ou tratamento de infecções provocadas por Enteriobacteriaceae patogénicas tais como E. coli e/ou Salmonella em humanos ou animais utilizando a terapêutica de fagos em composições nutricionais, alimento para animais de estimação, suplementos ou preparações farmacêuticas.

Uma vantagem principal da presente invenção é que as preparações de bacteriófago seleccionadas de acordo com a 5 invenção têm um largo espectro de hospedeiros nas estirpes de E. coli que causam diarreia, estas não são tóxicas, de modo que estas podem ser utilizadas com segurança em composições alimentares para uma prevenção ou tratamento eficiente de infecções causadas por E. coli patogénicas. Os fagos de acordo com a invenção podem também ser utilizados para aplicações industriais. Estas podem ser eficientemente propagadas numa estirpe de E. coli não patogénica enquanto retendo um largo espectro de hospedeiros. Os fagos matam eficientemente a célula hospedeira e os fagos podem ser altamente purificados através de um método de isolamento de virus convencional.

Os objectivos estão resolvidos nas reivindicações em anexo.

Descrição Detalhada da Invenção

Com a descrição que se segue, "NCC" designa Nestlé Culture Collection (Nestlé Research Center (NRC), Vers-chez-les-Blanc, Lausanne, Suiça).

De acordo com um primeiro aspecto, um isolado de fago Myoviridae de largo espectro de hospedeiros com potencial litico substancial para as Enteriobacteriaceae patogénicas, tais como as estirpes de E. coli e/ou Salmonella foram isoladas a partir de amostras de fezes humanas e do ambiente.

Amostras de fezes de crianças hospitalizadas com diarreia aguda foram pesquisadas com o ensaio de placas para a presença de bacteriófagos direccionados contra E. coli. Diferentes fontes de água foram também pesquisadas para a presença de 6 bacteriófagos. Estas águas (torneira, esgoto, drenagem, lagoas, canais, águas da rua e mercados) são de Dhaka/Bangladesh e de Lausanne (água de esgoto). Cerca de 45 fagos myoviridae foram isolados e amplificados na E. coli K-12 não patogénica de laboratório. Estes isolados apresentaram um largo espectro de hospedeiros numa grande colecção de estirpes patogénicas de E. coli. Os fagos podem ser purificados através de métodos convencionais de purificação de vírus. Todos os fagos investigados em detalhe acabaram por ser fagos do tipo T4 (fagos virulentos obrigatórios com cauda contráctil). 0 diagnóstico baseou-se no grande tamanho do genoma (170 kb) , modificação do ADN (resistência contra digestão com endonucleases de restrição) e morfologia.

Estes podem ser eficientemente propagados numa estirpe de E. coli não patogénica enquanto retêm um largo espectro de hospedeiros em estirpes de E. coli que provocam diarreia. Os fagos do tipo T4 matam eficientemente a célula hospedeira. Estes são o protótipo de fagos virulentos que destroem o genoma bacteriano durante o processo de infecção. Esta propriedade aumenta substancialmente a segurança da abordagem de terapia fágica.

Os fagos aqui identificados sao selecionados a partir do grupo compreendendo NCC-JS9, NCC-JS31, NCC-JS102.2, NCC-JS150, NCC-JS1, NCC-JS10 (renomeado NCC-JS4) (CNCM 1-2763), NCC-JS22, NCC-JS32, NCC-JS114.1, NCC-JS 140.1, NCC-JS146.1, NCC-JS65.1, NCC-JS65.2 ' , NCC-JS76.2', NCC-JS12, NCC-JS152, NCC-JS66, NCC-JS102.1, NCC-JS14 0.2, NCC-JS146.2, NCC-JS61.2, NCC-JS61.3, NCC-JS114.3, NCC-JS35 (renomeado NCC-JS94.1) (CNCM 1-2764), NCC-JS 9 4.2, NCC-JS 9 8, NCC-JS10 4, NCC-JS94.3, NCC-JS110.1, 7 NCC-JS110.2, NCC-JS110.3, NCC-JS1.4 (renomeado NCC-JSD.l) (CNCM 1-2765), NCC-JSD.3, NCC-JSD.2, NCC-JSD.4, NCC-JSD.5, NCC-JS142, NCC-JS148 e NCC-JSL.l, NCC-JSL.2, NCC-JSL.3, NCC-JSL.4, NCC-JSL.5, NCC-JSF (renomeado NCC-JSL.6) (CNCM 1-2766).

Numa forma de realização inventiva mais preferida, os fagos NCC-JS10, NCC-JS35, NCC-JS1.4 e NCC-JSF foram depositados a titulo de exemplo no Instituto Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cédex 15, FRANÇA, em 11 de Dezembro de 2001, sob o número de depósito CNCM 1-2763, CNCM 1-2764, CNCM 1-2765 e CNCM 1-2766.

Vantajosamente, os fagos depositados, são, por exemplo, capazes de lisar 42 porcento das E. coli que provocam diarreia da colecção da Nestlé Research Center composta por 50 estirpes. Esta colecção representa os principais serotipos de E. coli da diarreia na infância em países em desenvolvimento e diarreia do viajante. Com o material de fago de acordo com a invenção, pode ser obtida uma cobertura de 6 0 porcento com um aumento de isolados de fago individual incluídos no cocktail. Não existe, contudo, risco para outras bactérias comensais do intestino para além das espécies E. coli. O equilíbrio ecológico do intestino é mantido (ver exemplo 3, figura 2) . Após um tratamento com fago de murganhos, os fagos não estão mais presentes no intestino. Com o material de fago de acordo com a invenção, apenas menos do que 50 porcento de serotipos de E. coli não patogénica do intestino humano são ligados.

Deste modo, de acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se à utilização de, pelo menos, um isolado de fago como acima descrito, em qualquer produto alimentar ou farmacêutico, ou um suplemento nutricional ou uma composição para administração oral. Os exemplos para produtos alimentares ou farmacêuticos são leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, leite à base de produtos fermentados, gelados, produtos à base de cereais fermentados, pós à base de leite, fórmulas infantis ou comprimidos, suspensões líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral húmido, alimentação seca por tubo, produtos alimentares para animais de estimação. A composição para administração oral pode estar em cápsulas, cápsulas moles, comprimidos, pastas ou pastilhas, gomas, ou soluções ou emulsões bebíveis. Os métodos para os preparar são do conhecimento comum. A composição utilizada de acordo com a invenção pode também compreender excipientes habituais, em particular adoçantes, agentes aromatizantes ou conservantes. Podem ainda compreender um microrganismo pré-biótico e/ou um probiótico. As composições utilizadas de acordo com a invenção podem ser formuladas de acordo com qualquer uma de um número de técnicas que são bem conhecidas nesta técnica.

Numa forma de realização, pode ser proporcionada uma composição farmacêutica contendo, pelo menos, um dos bacteriófagos inventivos numa quantidade suficiente para conseguir o efeito desejado num indivíduo. Esta composição pode ser um comprimido, um líquido, um suplemento oral seco, um suplemento oral húmido, alimentação seca por tubo, alimentação húmida por tubo etc. A composição farmacêutica irá ainda conter veículos e excipientes que são adequados para a distribuição da respectiva molécula activa de natureza diferente da do tecido 9 alvo. 0 tipo do veículo/excipiente e a sua quantidade dependerá da natureza da substância e o modo de distribuição e/ou administração do fármaco contemplado. Deve ser entendido que o especialista seleccionará, com base no seu próprio conhecimento, os componentes apropriados e forma galénica.

Em outra forma de realização, é preparada uma composição alimentar para consumo humano. Esta composição pode ser uma fórmula nutricional completa, um produto lácteo, uma bebida gelada ou estável em armazenamento, água, uma sopa, um suplemento dietético, um substituto de refeição, uma barra nutricional ou confeitaria. A fórmula nutricional é, de um modo preferido, administrável de modo entérico; por exemplo na forma de um pó, um concentrado liquido, ou uma bebida pronta a consumir. Se se desejar produzir uma fórmula nutricional em pó, a mistura homogeneizada é transferida para um dispositivo de secagem adequado, tais como um secador por aspersão ou liofilizador, e convertido em pó.

Num exemplo específico, os fagos podem ser adicionados a uma fórmula de leite com água morna e pode ser benéfico para crianças que sofrem de infecções de gastroenterite de E. coli ou Salmonella, ou estão em risco de adquirir estas infecções. A diarreia pediátrica por E. coli é rara em países industrializados do hemisfério Norte, contudo, estas infecções são ainda muito prevalentes em países como México, Brasil, índia e China. Também, os fagos podem ser utilizados na prevenção ou tratamento da diarreia do viajante. Os turistas Europeus que passam as suas férias no Norte de África ou os turistas dos EU da América que viajam para a América Central ou para as Caraíbas 10 estão em risco elevado de aquisição de infecções ETEC.

Também, as infecções de E. coli são uma causa frequente de infecções urinárias em humanos, incluindo os países industrializados. Os serotipos 0 de isolados de E. coli extra-intestinais diferem dos das estirpes intestinais de E. coli. Contudo, o largo espectro de hospedeiros de muitos fagos do tipo T4 não deixa dúvida que muitas das estirpes urinárias de E. coli podem ser lisadas com fagos T4 isolados de amostras de fezes.

Em outra forma de realização, um produto alimentar normal pode ser enriquecido com, pelo menos, um isolado de fago de acordo com a presente invenção. Por exemplo, um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco, um leite coagulado, artigo de confeitaria, por exemplo, um doce ou bebida açucarada, uma barra de confeitaria, flocos ou barras de cereais de pequeno-almoço, bebidas, pós de leite, produtos à base de soja, produtos fermentados não de leite ou suplementos nutricionais para nutrição clínica.

Os bacteriófagos de acordo com a presente invenção podem deste modo ser utilizados numa quantidade de, pelo menos, 1,104 pfu (unidade formadora de placa)/mL e, de um modo mais preferido, 106 pfu/mL.

Ainda, numa outra forma de realização, podem ser preparados produtos alimentares para animais de estimação. De facto, a E. coli é a principal causa de diarreia em cães. Os serotipos das estirpes EPEC e ETEC isoladas de cães sobrepõem-se parcialmente aos dos humanos. Os cães são portadores, no seu intestino, de 11 serotipos de E. coli que frequentemente levam a infecções espalhadas para o tracto urinário. Estes isolados de E. coli do tracto urinário canino apresentaram relações genéticas próximas com isolados de E. coli extra-intestinal de humanos. A formulação de alimentos para animais de estimação é, de um modo preferido, um alimento para animais de estimação completo e nutricionalmente equilibrada. Podem também ser um suplemento dietético para animais de estimação ou na forma de uma composição farmacêutica. A formulação de alimentos para animais de estimação nutricionalmente completa de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma adequada, por exemplo, um pó, uma seca esmagada, ou granulado ou outra forma seca, forma extrudada, forma semi-húmida ou húmida, tais como um naco ou rolo ou pudim. Pode ser gelado ou proporcionado como um produto de estável ao armazenamento. Este alimento para animais de estimação pode ser produzido por métodos convencionais.

Em outro exemplo, os adjuntos dietéticos podem ser preparados de modo a melhorar a qualidade do alimento para animais de estimação. Como adjuntos dietéticos, estes podem ser encapsulados ou podem ser proporcionados na forma de pó e empacotados em conjunto com ou separadamente de uma refeição principal, seja húmida ou seca. Como exemplo, um pó contendo bacteriófagos de acordo com a invenção, podem ser empacotados em saquetas numa forma de pó ou num gel ou lípido ou outro veículo adequado. Estas unidades empacotadas separadamente podem ser proporcionadas em conjunto com uma refeição principal ou em pacotes multi-unidade para utilização com uma refeição principal ou mimo, de acordo com as instruções do utilizador.

Também, aplicação oral de fagos de acordo com a invenção ou 12 aspersao de fagos no alojamento pode deste modo beneficiar tanto o cão como o seu dono.

Numa última forma de realização, os fagos podem ter valor na produção de alimentos para diminuir o grau de contaminação de carne com E. coli e/ou Salmonella.

Os exemplos que se seguem são dados apenas como ilustração e não devem ser de todo entendidas como limitantes da matéria do presente pedido. Todas as percentagens são dadas em peso a menos que seja indicado o contrário. Os exemplos são precedidos por uma breve descrição das figuras.

Figura 1: curva de crescimento (leituras de DO) de E. coli K12 na presença do fago tipo T4 NCC-J146.1 e NCC-JS94.1. As culturas de E. coli K12 foram cultivadas até uma DO de 0,1 e infectados com 1% dos fagos acima. As amostras foram tiradas a cada 10 minutos.

Figura 2: estudos in vivo em murganhos. A flora de E. coli de quatro murganhos foi monitorizada durante 42 dias. Uma mistura de bacteriófago (NCC-JS94.1, NCC-JS4, NCC-JSD.l e NCC-JSL.6) foi adicionada à água três vezes em diferentes concentrações (com três mudas de água). Um murganho de controlo recebeu a mesma água (com as mesmas mudas) sem a mistura de fagos. As fezes foram recuperadas uma ou duas vezes ao dia. A mistura de bacteriófago foi isolada, titulada e a flora de E. coli foi determinada. A barra linear representa a média da flora normal.

Figura 3: Infecção de fago em murganhos axénicos. Dois 13 murganhos axénicos foram alimentados à força com E. coli K-12 e o fago NCC-JS94.1 foi adicionado à água para uma concentração final de 105 pfu/mL durante uma semana. A flora normal e a presença de fagos nas fezes foi monitorizada sempre ao longo do ensaio. Na terceira semana, os murganhos foram de novo alimentados à força com EC0R5 que é resistente ao fago. NCC-JS94.1 foi de novo adicionado à água e as fezes foram recuperadas e testadas para a presença de E. coli e o fago.

Figura 4: As autópsias foram efectuadas após um tratamento com fago de quatro murganhos, quando não foram recuperados mais fagos das fezes (Fig 4A) e enquanto quatro outros murganhos foram tratados com fagos (fig 4B) . Diferentes partes do intestino (duodeno, jejuno, íleo, cólon), o fígado e os nódulos linfáticos foram recolhidos e testados para a presença de E. coli e fagos. A coluna representa a média para cada grupo de murganhos.

Exemplos

Exemplo 1: Selecção de fagos de acordo com a invenção

MATERIAL E MÉTODOS

Preparação das amostras de fezes

As amostras de fezes foram armazenadas congeladas a -20 °C no hospital e foram transportadas em gelo seco para Lausanne. A amostra de fezes (~10g) descongelada foi ressuspensa em TS (8,5 g/L NaCl, 1 g/L triptona) para um volume final de 30 mL. As 14 amostras de fezes ressuspensas foram depois centrifugadas durante 15 minutos a 10000 rpm em tubos Falcon de 50 mL. Um mL de cada amostra de fezes foi filtrado através de um pré-filtro Millex AP20 seguido por um filtro Minisart de 0,45 pm. Após a ressuspensão todas as amostras de fezes foram armazenadas a +4 °C uma vez que os fagos T4 são sensíveis aos ciclos repetidos de congelação-descongelação.

Cultura Bacteriana

Todas as estirpes de E. coli foram propagadas em caldo de Hershey contendo 2 mL de tiamina (2 mg/mL) por litro num tubo de vidro num volume final de 5 mL sob agitação (240 rpm) a 37 °C para incubação de um dia para o outro. Após crescimento, as estirpes foram espalhas numa placa de Petri (agar de Hershey) de modo a obter colónias únicas. Para evitar passagens seriadas em caldo (que pode seleccionar mutantes), uma nova cultura foi iniciada a partir de 3 colónias únicas de cada vez quando necessário. As culturas stock foram mantidas como culturas de propagação a 4 °C.

Ensaio em placa

As placas de fago foram obtidas em agar de Hershey suplementadas com tiamina coberto com 3,5 mL de top-agar de Hershey inoculado com 200 pL de uma cultura fresca cultivada de um dia para o outro e 100 pL de amostra de fezes ou lisado de células. As placas de Petri foram incubadas de um dia para o outro a 37 0 C. 15

Isolamento de placas e amplificação de fagos

Placas únicas foram picadas com palitos e inoculadas em 5 mL de caldo de Hershey suplementado com tiamina foram inoculados com 1% de uma cultura cultivada de fresco e 1% de lisado de fago. A incubação foi efectuada sob agitação a 240 rpm a 37 °C durante aproximadamente 5 horas. Quando a lise ocorreu, foram adicionadas 3 gotas de clorofórmio com mistura suave. O lisado foi deixado de um dia para o outro à temperatura ambiente seguida por uma centrifugação a 10000 rpm durante 10 minutos.

Para obter stocks de fago o sobrenadante foi recuperado evitando cuidadosamente o clorofórmio e transferido para um tubo de vidro com tampa de rosca. Foram adicionadas três gotas de clorofórmio fresco e o stock de fago foi armazenado a 4 °C. As estirpes utilizadas para amplificação de fago foram K-12 ou 0127:K63 (B74-9). Foi utilizada a seguinte nomenclatura para os diferentes isolados de fagos: JS (as iniciais de Josette Sidoti que conduziu a pesquisa dos fagos) seguido pelo número ID do doente, no caso de isolados múltiplos a partir do mesmo doente, este número foi seguido por um outro número (e. g. JS61.2).

Quando o segundo isolado vem de uma segunda amostra de fezes (convalescente) do doente, ao segundo número foi colocada uma aspa (e. g. JS65.2'). Para fagos isolados a partir de água ambiental as iniciais foram seguidas por um D (Dhaka) ou L (Lausanne), respectivamente, e um identificador para o fago isolado (e. g. JSL.4). 16

Teste de Mancha

Uma mistura de 3,5 mL de top-agar de Hershey com 200 pL de uma cultura de E. coli cultivada de fresco foi vertida numa camada inferior de agar de Hershey suplementado com tiamina. Quando o top-agar foi solidificado, 10 pL de fezes extraídas filtradas foram nele colocados como 8 manchas numa distribuição na direcção dos ponteiros do relógio. A incubação foi efectuada de um dia para o outro a 37 °C.

Lise em tubos

Foram inoculados 5 mL de caldo de Hershey com 1% de uma cultura cultivada de fresco. A incubação foi continuada durante 3 a 5 horas quando as células de controlo não infectadas atingiram a fase estacionária de crescimento. A densidade óptica na célula inoculada com fago foi comparada visualmente com a densidade óptica das células de controlo infectadas de modo simulado.

Purificação de fagos

Para a purificação dos fagos do tipo T4, um litro de meio de Hershey contendo tiamina foi inoculado com 1% de K-12, as células foram cultivadas até uma DO de 0,1 e depois infectadas com um moi (multiplicidade de infecção) em excesso de 1. Foi adicionado NaCl ao lisado produzindo uma concentração final de 0,5 M e incubados uma hora a 4 °C. Após centrifugação a 10000 rpm (16 min a 4 °C) numa centrífuga Sorvall RC5B, foi 17 adicionado polietilenoglicol PEG-6000 ao sobrenadante para uma concentração final de 10%. O lisado foi incubado de um dia para o outro a 4 °C sob agitação suave. Os fagos precipitados com PEG foram recolhidos por centrifugação a 10000 rpm durante 16 min, os sedimentos resultantes foram ressuspensos em 3 mL de tampão de fagos (20 mM de Tris-HCl pH 7,4, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgS04) . O sedimento de fago ressuspenso foi aplicado num gradiente descontinuo de CsCl (1,35 g/mL CsCl, 1,53 g/mL, 1,65 g/mL). Os gradientes foram centrifugados num rotor SW55 a 40000 rpm durante 3 h a 4 °C com a ultracentrí f uga Beckman L8-60M. RESULTADOS Isolamento de fagos

Os fagos de E. coli podem ser isolados a partir de material clínico (e. g. fezes) ou amostras ambientais (e. g., esgoto).

Trabalho anterior sugeriu gue os fagos são apenas raramente isolados a partir de amostras de fezes de indivíduos saudáveis, os títulos de fago foram baixos e a maior parte dos isolados foram os fagos temperados (Furuse, K., 1987, Distribution of coliphages in the environment: general considerations. In: Phage Ecology, pp. 87-124, J.Wiley, Nova Iorque). As amostras de fezes de diarreia de doentes, em contraste, produziu fagos com elevada incidência e título mais elevado do que em amostras de fezes de controlos saudáveis e a maior parte dos isolados foram fagos virulentos. Para aumentar a probabilidade do isolamento de fagos do tipo T4 trabalhou-se com amostras de fezes de crianças hospitalizadas com diarreia aguda em enfermaria geral de uma 18 grande clínica de diarreia em Dhaka/Bangladesh. Os aspectos estatísticos da pesquisa dos fagos estão resumidos na Tabela 1. N° de doentes consecutivos com diarreia aguda incluídos no programa de pesquisa 157 N° de doentes com pares de amostras de fezes agudas e coalescentes (subconjunto do acima) 52 N° de amostras de fezes excluídos da análise 17 Razão para exclusão Cólera confirmada ou infecções com Shigella Período da amostra 6.2.2000 a 25.2.2000 Local Dhaka/ Bangladesh Idade do doente (intervalo) 1 mês a 4 anos Sexo (M:F) 96:61 N° de doentes que produziu placas de fago nas células indicadoras K12/não testadas (% positiva) 26/140 (19) Intervalo de título de fagos (pfu/g de fezes) 30*-5xl04 N° de doentes com título> 103/>104 pfu/g 10/6 N° de amostras de fezes que produzem placas de fagos em B74-9/não testados (% de positivos) 18/129 (14) Intervalo de título de fagos (pfu/g de fezes) 30*-2xl04 N° de amostras de fezes testadas em K12 e B74-9 para a presença de fagos 118 -negativo em ambos 86 -positivo em ambos 4 -positivo apenas em K12 14 -positivo apenas em B74-9 14

Tabela 1. Estatística da pesquisa de fagos

Notas: *Limite de detecção do teste

Etiologia média das doenças de diarreia em crianças do Bangladeshi < 3 anos: rotavírus 26%, Campylobacter 26 %, E. coli 19 15%, V. cholerae 01 Ί%, outros Vibrios 9%, Shigella 4%, Salmonella <1%.

As amostras de fezes de 157 doentes com diarreia aguda foram tiradas durante um periodo de tempo de três semanas. Os doentes foram não seleccionados e a amostragem foi efectuada de acordo com a disponibilidade das enfermeiras para tirar e armazenar uma amostra de fezes. Para 52 doentes foi obtida uma segunda amostra de fezes a expensas do hospital. Setenta amostras de fezes foram excluídas uma vez que uma diarreia de E. coli podia ser excluida: 5 doentes tinham cólera (como demonstrado por microscopia de campo escuro de vibrios em fezes de arroz) e 12 tinham disenteria por Shigella (diagnosticada com bases clinicas: fezes com sangue, mucosas). Em conjunto ambos os patogénicos contribuem com 11 porcento dos doentes hospitalizados. Este número corresponde à taxa média de detecção destes patogénicos em doentes com diarreia deste hospital (Vibrio cholerae 7 %, Shigella spp. 4%).

Com um limite de detecção de 30 pfu (unidades formadoras de placas)/g de fezes, 19 porcento das amostras de fezes foram classificadas como positivas quando testadas na estirpe de laboratório de E. coli não patogénica K-12. A maior quantidade de fago espalhado nas fezes em qualquer dos doentes foi 5 x 104 pfu/g de fezes. Contudo, apenas 4 porcento dos doentes apresentaram este elevado titulo de fago nas fezes. Uma percentagem um pouco inferior de doentes apresentou fagos que podiam ser detectados na estirpe patogénica EPEC 0127:K63 (14% de taxa de detecção). Apenas quatro amostras de fezes foram duplamente positivas para fagos na estirpe de laboratório e patogénica de E. coli, enquanto 14 foram positivas apenas para 20 K-12 e 14 outras apenas para a estirpe EPEC 0127 :K63. Aparentemente detectou-se com as duas diferentes células indicadoras de E. coli duas populações de fagos distintas com sobreposição mínima no espectro de hospedeiros. De modo interessante, a taxa de detecção do fago de 14 % na célula indicadora de E. coli patogénica correspondeu de forma próxima à taxa de detecção média das estirpes patogénicas de E. coli nas amostras de fezes de doentes com diarreia no Bangladesh (15%).

Diferentes fontes de água (água de torneira, saneamento, água residual, canais, lagoas, esgoto, mercados, ruas, rios, valas) de Dhaka/Bangladesh foram também pesquisadas para a presença de fagos. De quase uma centena de amostras (cerca de 10 de cada fonte de água), foram obtidos seis diferentes bacteriófagos e amplificados. Um deles foi de água da torneira, três de água de saneamento e um de água de esgoto. As águas de esgoto de Lausanne (Suíça) produziram também até seis isolados de fago.

Na estirpe de laboratório de E. coli, a taxa de detecção de fagos foi mais baixa no convalescente do que na amostra de fezes aguda (4 vs. 11 amostras positivas, 52 pares de amostras de fezes estudadas). Na estirpe patogénica de E. coli foram isolados números de fagos comparáveis em amostras de fezes convalescentes e agudas (5 vs. 4 amostras positivas, 16 amostras de fezes estudadas).

Todas as placas detectadas em células K-12 podem ser amplificadas por crescimento em cultura líquida de K-12. Os títulos de fago variaram de 2xl04 a 4xl010 pfu/mL. 0 título médio foi de 109 pf/mL. Não existe correlação entre o título 21 amplificado e o tamanho das placas (largas, médias, pequenas ou pontos), transparência da placa (túrbida, límpida) ou título inicial de fezes. Do mesmo modo, as placas detectadas na estirpe EPEC 0127:K63 podem ser amplificadas até l-5xl08 pfu/mL nesta estirpe patogénica de E. coli.

População alvo das estirpes de E. coli que provocam diarreia

Os isolados de fago foram seleccionados com o mais largo espectro de hospedeiros em 50 estirpes patogénicas de E. coli dos principais serotipos isolados em todo o mundo a partir de doentes pediátricos com diarreia. A Tabela 2 mostra algumas destas estirpes. Este conjunto de estirpes cobre 14 diferentes antigénios 0 somáticos que reflectem distintas cadeias laterais de hidrato de carbono do antigénio lipopolissacárido (LPS) e também 14 diferentes antigénios K capsulares que reflectem de novo as diferentes composições de polissacárido do material capsular bacteriano. Além disso, possui-se uma colecção dos principais serotipos de E. coli enterotoxigénica (ETEC) isoladas em todo o mundo a partir de doentes pediátricos com gastroenterite e adultos com diarreia do viajante (Tabela 2) . Estas estirpes ETEC representam 14 outros distintos antigénios O e 13 diferentes antigénios H. 0 último antigénio é uma proteína antigénio dos flagelos bacterianos. As estirpes ETEC podem ser ainda subdivididas de acordo com a sua produção de enterotoxinas. Oito estirpes produziram enterotoxinas lábeis ao calor (LT) e estáveis ao calor (ST) . Duas estirpes produziram apenas o lábil ao calor; quatro estirpes apenas a enterotoxina estável ao calor. 22 Código Nestec Serotipo 0:K (H) Tipo de patogenicidade: Factores de virulência Fagos de fezes B74-20 018:K77 EPEC 16 B74-24 020:K84 EPEC 4 B74-7 026:K6 0 EPEC 10 B74-26 044:K74 EPEC - B75-45 055:K59 EPEC 7 B74-10 086:K61 EPEC 13 B7 4-1 0111:K58 EPEC 10 B74-28 0112:K66 EPEC 6 L74-30 0119:K6 9 EPEC 5 B75-46 0124:K72 EPEC 0 B74-14 0125:K70 EPEC 5 B74-16 0126:K71 EPEC - B7 4-9 0127:K63 EPEC - M75-53 0128:K67 EPEC - R81-116 06:Hl6 ETEC: LT+/ST+ 15 R81-117 08 :H9 ETEC: LT+/ST+ 0 R81-118 015:H11 ETEC: LT+/ST+ 12 R81-119 025:H42 ETEC: LT+/ST+ 12 R81-120 078:H12 ETEC: LT+/ST+ 11 R81-121 0115:H51 ETEC: LT+/ST+ 8 R85-141 0128:H18 ETEC: LT+/ST+ 0 R85-145 0148:H28 ETEC: LT+/ST+ 14 R85-147 0114:H49 ETEC: LT+/ST- - R85-149 0159:H21 ETEC: LT+/ST- - R85-137 020:H11 ETEC: LT-/ST+ 7 23 (continuação) Código Nestec Serotipo 0:K (H) Tipo de patogenicidade: Factores de virulência Fagos de fezes R85-138 02 7:H7 ETEC: LT-/ST+ 1 R85-144 063:H- ETEC: LT-/ST+ — R85-152 0153:H12 ETEC: LT-/ST+ 9

Tabela 2. Tipo de patogénico, serotipos O, K e H das estirpes de E. coli que provocam diarreia da colecção Nestec

Nota: A primeira coluna dá o código interno NRC para a estirpe de E. coli; a segunda coluna proporciona o serotipo 0 somático, o K capsular ou H flagelar da estirpe, os serotipos 0 a negrito indicam as estirpes de E. coli também isoladas a partir de diarreia canina (Sancak, 1997); a terceira coluna indica que o tipo de patogénico (EPEC: enteropatogénica; ETEC: E. coli enterotoxigénica; LT, ST são enterotoxina lábil ao calor e estável ao calor); a quarta coluna indica o número de isolados de fago de fezes que Usavam a estirpe de E. coli indicada (foram testados 32 isolados de fago de fezes).

Pesquisa do espectro de hospedeiros dos fagos isolados

Na primeira ronda foram isolados 32 fagos a partir das amostras de fezes dos doentes com diarreia. Estes fagos foram sistematicamente testados nas 50 estirpes de E. coli que provocam diarreia da nossa colecção de células combinadas. Numa segunda ronda foram obtidos outros isolados de fago com largo espectro de hospedeiros. 24

Como o teste do espectro de hospedeiros envolve um grande número de combinações de fago-células (n=32 x 50=1600 em 50 estirpes de E. coli) , utilizou-se o teste da mancha para a pesquisa. Neste teste, oito lisados diferentes de fago amplificados podem ser testados ao mesmo tempo colocando uma gota do lisado do fago amplificado nas camadas bacterianas numa placa de Petri. Os resultados são lidos após incubação de um dia para o outro e são classificados como positivos quando o crescimento das bactérias foi comprometido ou impedido na área da mancha. Os resultados de alguns isolados de fago são apresentados na Tabela 3 e são resumidos na Tabela 4.

Tabela 3. Susceptibilidade da estirpe de E. coli indicada para infecção com isolados de fago de fezes JS1 a JS16 propagados em K-12 (K) ou 0127 :K63 (B) conforme avaliado pelo ensaio de mancha

Fago JS T 146.1 146.2 65.1 1 65.2 61.1 77.1 83.1 114.2 \—1 \—1 \—1 to 76.2 CM i—1 E. coli-l K K K K B B B B K K K K K ETEC: LT+/ST+ X X X X X X X X X ETEC: LT+/ST+ ETEC: LT+/ST- X X X X X X X X X ETEC: LT+/ST- ETEC: LT+/ST- X X X X X X X X X ETEC: LT+/ST+ X X X X X X X X X ETEC: LT+/ST+ ETEC: LT+/ST- X X X X X X ETEC: LT+/ST- ETEC: LT+/ST- X X X X X X X X X 25 (continuação)

Fago JS 146.1 146.2 65.1 CNI LO LO 61.1 77.1 83.1 114.2 114.1 LO LO 76.2 CNI \—1 EPEC:A/E+ X X X X X X X X X EPEC:A/E+ X X X X X EPEC:A/E+ X X X X X X X X X X EPEC:A/E+ EPEC:A/E+ ETEC: LT+/ST+; CFA1 X X X X ETEC: LT-/ST+; CS4; CS6 X X X X X X X X ETEC: LT-/ST+; CS6 X X ETEC: LT-/ST+; PCF 0166 X X X X X X X X X ETEC: LT+/ST+; CS1; CS3 X X X X X X X X X ETEC: LT-/ST+; CFA1 X X X X X X X X X ETEC: LT-/ST+; CS4; CS6 X X X X X X ETEC: LT+/ST+; CS1; CS3 X X X X X X X X X ETEC: LT + /ST+; CS5; CS6 ETEC: LT + /ST+; CS4; CS6 EPEC X X X X X X X X X EPEC X X X X X X X X X X EPEC X X X X X X X X X ETEC 06:H16 X X X X X X X X X ETEC 08:H9 ETEC 015:Hl1 X X X X X X X X X ETEC 025:H42 X X X X X X X X 26 (continuação)

Fago JS t 146.1 146.2 65.1 CNI LO 61.1 77.1 83.1 114.2 114.1 CD CO 76.2 CNI \—1 ETEC 078:H12 X X X X X X ETEC 0115:H51 X X X X X X ETEC 020:H11 X X X X X X ETEC 02 7:H7 X ETEC 0128:H18 ETEC 063:H- X X X X X ETEC 0148:H28 X X X X X X X X X ETEC 0153:H12 X X ETEC 018:K77 X X X X X X X X X ETEC 020:K84 X X X X ETEC 026:K6 0 X X X X X X ETEC 055:K59 X X X ETEC 086:K61 X X X X X X X ETEC 0111:K58 X X X X X X X ETEC 0112:K66 X X X X X ETEC 0119:K69 X X X X ETEC 0124:K72 ETEC 0125:K70 X X X X

Notas para a Tabela 3: Susceptibilidade da estirpe de E. coli indicada na primeira coluna à infecção com a estirpe de fago indicada na primeira linha. Ver Tabela 5 para posterior caracterização das estirpes de fago. A segunda linha proporciona informação sobre a estirpe de E. coli na qual o fago foi propagado (K: K-12 não patogénica; O: 0:127:K63 patogénica). "X" indica a inibição do crescimento no teste de mancha, branco significa crescimento como controlo de mancha spot (infecção simulada). 27

Quando fagos distintos isolados do mesmo doente foram comparados, foram obtidos resultados praticamente idênticos. Por exemplo, duas placas diferentes foram amplificadas a partir da amostra de fezes do doente 146. 0 fago NCC-JS 146.1 foi positivo em 35 células, enquanto o fago NCC-JS 146.2 infectou 36 dos 50 fagos testados. Com uma excepção, existiu uma sobreposição perfeita entre os fagos no que respeita à gama de hospedeiros (Tabela 3) . Foram observadas sobreposições semelhantes para dois fagos isolados a partir de amostras de fezes aguda e convalescente de um único doente: fagos NCC-JS65.1 e NCC-JS65.2' do doente 65 infectaram 26 e 25 estirpes de E. coli, respectivamente. Novamente com uma excepção, houve uma sobreposição perfeita na gama de hospedeiros (Tabela 3) . Esta correlação elevada de resultados entre isolados de fagos independentes do mesmo doente prova a fiabilidade do teste da mancha. A gama de hospedeiros foi drasticamente diferente para os fagos propagados na estirpe laboratorial não patogénica K-12 ou na estirpe patogénica 0127:K63. Os fagos anteriores podem crescer num mediano de 26 diferentes estirpes patogénicas de E. coli, enquanto os últimos cresceram apenas numa mediana de 1 estirpe patogénica adicionalmente à célula propagada (Tabela 4). Isto é ilustrado para a amostra de fezes do doente 114 que foi uma das poucas amostras de fezes (n=3) que produziu fagos em ambas K-12 e 0127 :K63. 0 fago amplificado por K-12 infectou 24 estirpes patogénicas, enquanto o fago amplificado 0127:K63 infectou apenas uma única estirpe (Tabela 4). 28 Código Estirpe de propagação Tamanho da placa Teste de mancha positivo NCC-JS9 K m 33 NCC-JS31 K g 27 NCC-JS102.2 K m 9 NCC-JS150 K s 3 NCC-JS61.1 B s 5 NCC-JS77.1 B pp, t 0 NCC-JS83.1 B s, t 1 NCC-JS20 B s 7 NCC-JS1 K m 28 NCC-JS4 K m 35 NCC-JS22 K m 17 NCC-JS32 K s 21 NCC-JS114.1 K m, t 24 NCC-JS K m 6 NCC-JS146.1 K s 35 NCC-JS65.1 K s 26 NCC-JS65.2 ' K m 25 NCC-JS 8 9 B m 1 NCC-JS114.2 B s, t 1 NCC-JS124 B m 2 NCC-JS 7 6.1 B s 4 NCC-JS 7 7.2 ' B PP 0 NCC-JS83.2 B m 1 NCC-JS86 B m 1 NCC-JS 76.2 ' K m 28 NCC-JS12 K s 29 NCC-JS152 K s 14 29 Código Estirpe de Tamanho da Teste de mancha propagação placa positivo NCC-JS66 K m 33 NCC-JS102.1 K s 0 NCC-JS140.2 K s 2 NCC-JS146.2 K m 36 NCC-JS61.2 B m 3 NCC-JS114.3 B s n. t. NCC-JS94.1 K m n. t. NCC-JS98 K s n. t. NCC-JS122.1 K g, t n. t.

Tabela 4: Caracterização dos 36 fagos isolados a partir das amostras de fezes dos doentes pediátricos com diarreia em Dhaka

Nota: Primeira coluna, número de código de NRC do fago isolado; segunda coluna, proporciona informação sobre a estirpe de E. coli na qual o fago foi propagado (K: Kl2 não patogénica; B: 0127:K63 patogénica), terceira coluna, identificação do doente através de um código NRC (nomes, sexo, idade, número de identificação do doente de Dhaka estão disponíveis, mas não são proporcionados por razões de confidencialidade); quarta coluna, amostra de fezes a, aguda e c, convalescente; quinta coluna, tamanho da placa: g, grande, m, médio, s, pequeno, pp, apontar, t, turvo em contraste com placas límpidas; sexta coluna, número de estirpes infectadas como avaliadas pelo teste de mancha spot a partir de 50 estirpes de E. coli testadas. Vários fagos isolados a partir de diferentes doentes estavam intimamente relacionados em relação à gama de hospedeiros (e. g. isolados NCC-JS4, NCC-JS146.1 e NCC-JS66 infectaram até 35 células com uma diferença máxima de 4 células; os isolados NCC- 30 JS76.2' e NCC-JS12 apresentam apenas 4 diferenças). Contudo, os fagos com gama idêntica de hospedeiros foram apenas encontrados nos fagos gue possuem uma gama de hospedeiros muito restrito (isolados NCC-JS83.1, NCC-JS89, NCC-JS114.2, NCC-JS83.2 e NCC-JS86 infectando apenas as estirpes AD-24304 e 0127:K63).

Potencial lítico dos fagos isolados A lise celular foi avaliada visualmente como falta de turvação no tubo incubado com a estripe de E. coli e o fago. 0 teste foi lido quando a estirpe de E. coli não infectada tinha alcançado a turvação máxima. Por exemplo, os isolados dos fagos NCC-JS4, NCC-JS146.1, NCC-JS66 e NCC-JS146.2 que apresentaram no teste de mancha uma gama de hospedeiros vasta e muito semelhante nas estirpes patogénicas de E. coli, diferiram significativamente na sua capacidade para lisar as estirpes (Tabela 5) . 0 fago NCC-JS4 lisou 13 das 50 células de E. coli testadas, enquanto os fagos NCC-JS 146.1, NCC-JS66 e NCC-JS 146.2 lisaram apenas 4 a 5 estirpes E. coli que eram um subgrupo das estirpes lisadas pelo fago NCC-JS 10.

Fago JS -► E. coli i ϊ—1 Q 146.1 KD KO 146.2 vo 1-1 94.1 122.1 Lise ETEC LT+ST+ 0 ETEC LT+ST+ 0 ETEC LT+ST- + 1 ETEC LT+ST- 0 ETEC LT+ST- 0 31 (continuação)

Fago JS -► E. coli i ϊ—1 Q 146.1 tO to 146.2 to ϊ—1 94.1 122.1 Lise ETEC LT+ST+ 0 ETEC LT+ST+ 0 ETEC LT+ST- + + + + 4 ETEC LT+ST- 0 ETEC LT+ST- + + 2 EPEC : A/E + + ( + ) 2 EPEC : A/E + + 1 EPEC : A/E + + + 2 EPEC : A/E + 0 EPEC : A/E + 0 ETEC LT+/ST+; 0 CFA 1 ETEC LT-/ST+; 0 CS 4; CS6 ETEC LT-/ST+; 0 CS6 ETEC LT-/ST+; 0 PCF 0166 ETEC LT+/ST+; 0 CS1; CS3 ETEC LT-/ST+; + 1 CFA 1 ETEC LT-/ST+; 0 CS 4; CS6 ETEC + (+) 2 LT+/ST+;CS1;CS3 32 (continuação)

Fago JS -► E. coli i ϊ—1 Q 146.1 tO to 146.2 to ϊ—1 94.1 122.1 Lise ETEC LT+/ST+; CS5; CS6 0 ETEC LT+/ST+; CS5; CS6 0 EPEC ( + ) + 2 EPEC ( + ) 1 EPEC 0 ETEC 06:H16 ETEC 08:H9 + 1 ETEC 015:Hl1 0 ETEC 025:H42 + + + + 4 ETEC 078:H12 0 ETEC 0115:H51 ( + ) 1 ETEC 020:Hl1 0 ETEC 02 7:H7 0 ETEC 012 8:Hl8 0 ETEC 063:H- 0 ETEC 0148:H2 8 + 1 ETEC 0153:H12 0 EPEC 018:K77 + 1 EPEC 02 0:K8 4 + + + + + 5 EPEC 018:K77 + 1 EPEC 020:K8 4 + + + + + 5 EPEC 026:K6 0 + 1 EPEC 055:K59 + + + + + 5 EPEC 086:K61 0 33 (continuação)

Fago JS ->· E. coli j. 1—1 Q 146.1 146.2 ϊ—1 94.1 122.1 Lise EPEC 0111:K58 + 1 EPEC 0112:K66 + + + 3 EPEC 0119:K69 + 1 EPEC 0124:K72 + 1 EPEC 0125:K70 0

Tabela 5: Lise das estirpes de E. coli patogénicas indicadas em caldo de cultura através fagos de fezes (códigos NCC-JS) com gama de hospedeiros mais vasto no teste de mancha.

Nota: Na primeira coluna, os isolados NRC de E. coli são apresentados com os seus códigos NRC (ver Tabelas 3 e 2, respectivamente, para posterior informação sobre as estirpes). Colunas 2 —9: " + " e "(+)" significa lise e lise parcial, respectivamente, da estirpe de E. coli indicada na linha correspondente pelo fago da coluna indicada. Coluna 10: número de diferentes fagos isolados que lisam a estirpe de E. coli indicado (número total de fagos testados: 8). 0 crescimento de células K-12 infectadas por fagos e não infectadas foi seguido por leituras de DO (Figura 1) . Foram observados dois tipos distintos de desenvolvimentos de DO. No primeiro tipo, as células infectadas seguiram o desenvolvimento da DO de células não infectadas até cerca de 70 a 90 minutos pós infecção. Esta fase foi seguida por um declínio da DO nas células infectadas e a DO de fundo foi alcançada a cerca de 150 minutes pós infecção. Num segundo tipo de infecção, demonstrado pela maioria dos fagos as células infectadas pelo 34 fago apresentaram um desvio muito mais precoce a partir do desvio de desenvolvimento de DO da célula de controlo não infectada. 0 declínio nos níveis de fundo foi observado a cerca de 190 min pós infecção (Figura 1).

Purificação dos fagos

Volumes de um litro de culturas de K-12 foram inoculados com seis fagos diferentes que produziram títulos de fagos entre 6xl07 e IO10 unidades formadoras de placas (pfu)/mL. Os fagos do lisado foram precipitados com polietilenoglicol e o sedimento de fagos resultantes foi ainda purificado por centrifugação em gradiente de densidade de CsCl. As bandas de fago localizadas no gradiente de CsCl foram recuperadas e dialisadas para as libertar da solução de sal. A seguinte Tabela documenta a eficiência do processo da purificação de fago como monitorizado pela quantidade da infectividade virai recuperada. Os títulos de partida mais elevados da infectividade de fagos foram observadas com o fago NCC-JS10, contudo este fago foi também o mais difícil de purificar. A recuperação de fago variou apenas desde 0,3 a 5% do material infeccioso de partida. Para os outros fagos, pelo menos, 10% de recuperação foi a regra e a recuperação pode ser tão elevada como 40% da infectividade inicial no lisado bruto. 35

Fago Lisado PEG CsCl NCC-JS146.1 (1) 6X101ϋ 3X10y(5%) 1, 8X101U (30%) NCC-JS146.1 (2) 6X101ϋ 2X10y (3%) 9X10y (15%) NCC-JS114.3 (1) 1X101^ 6X1011 (60%) 4X1011 (40%) NCC-JS114.3 (2) 1X101^ 4X1011 (40%) 2X1011 (20%) NCC-JS94.1 (1) 4X1011 3X101U (8%) 6X101U (15%) NCC-JS94.1 (2) 4X1011 2X101U (5%) 3X101U (8%) NCC-JS4 (1) 1X101J 2X1011 (2%) 8X10y (0,8%) NCC-JS4 (2) 1X101J 1X1011 (1%) 3X10y (0,3%) NCC-JS4 (3) 1X1011 2X10y (2%) 5X10y (5%)

Tabela 6: Recuperação de fagos de tipo T4 após precipitação com polietilenoglicol (PEG) e diálise após centrifugação em gradiente de densidade em CsCl (CsCl).

Nota: a primeira coluna identifica o isolado de fago, os resultados de experiências independentes são diferenciados pelo número em parêntesis, a segunda coluna indica a quantidade total de fagos em 1 L de Usado celular como expresso em unidades formadoras de placas, a terceira coluna proporciona a quantidade total de unidades formadoras de placas no sedimento de PEG com a percentagem de recuperação em relação à quantidade no Usado em parêntesis, a quarta coluna proporciona a quantidade total de unidades formadoras de placas na banda de fagos dialisados isolados a partir do gradiente de densidade em CsCl com a percentagem de recuperação em relação à quantidade no Usado em parêntesis. 36

Exemplo 2: Caracterização de fagos com vim tamanho de genoma de 170-kb

MATERIAL E MÉTODOS

Electroforese em campo pulsado (PFGE)

Blocos de PFGE de agarose a 1% contendo 106 unidades

formadoras de placas do fago indicado foram incubados de um dia para o outro num tampão de lise (EDTA a 0,05 M, Tris a 10 mM pH 8,0, SDS a 1% e 50 pg de proteinase K) e lavados três vezes durante uma hora em 10 mL de TE (Tris a 10 mM pH 8,0, EDTA a 1 mM). Estes blocos foram analisados através de electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (TBE a 0,5%:

Tris-borato a 45 mM, EDTA a 1 mM) durante 20 horas a 6 N/cm, 14 °C com a um tempo de pulso de 1-20 s. O gel foi corado durante 30 min. com brometo de etidio (0,5 pg/mL).

Purificação de ADN

Os fagos purificados foram tratados com proteinase K a uma concentração final de 1 mg/mL durante 2 h a 37 °C e foi adicionado acetato de sódio a 3 M pH 4,3. O ADN foi extraido duas vezes por fenol-clorofórmio e precipitado com 2 volumes de etanol. Após centrifugação, os sedimentos foram lavados com etanol a 70% e ressuspensos em 50 pL de TE. O ADN foi digerido com enzimas de restrição de acordo com as indicações fornecidas pelo fabricante. 37

Microscopia Electrónica

Foi aplicada uma gota da suspensão de fagos a grelhas de cobre revestidas com formvar-carbono durante 5 min, a suspensão foi removida com uma pipeta e substituída imediatamente por uma mistura de soluções A e B (A: 2% molibdato de amónio a pH 7,0, B: 7,5 mg de bacitracina em água destilada) . Após 1 min o líquido foi removido com papel de filtro. As grelhas foram examinadas num microscópio electrónico de transmissão Philips CM12 a 80 kN (amplificação: 176'000x ou 224'000x).

Resultados

Foram seleccionadas doze amostras de fezes de doentes diferentes que apresentaram fagos com um genoma de 170 kb para posterior caracterização. Foi investigada a morfologia destes fagos através de microscopia electrónica e eram todos Myoviridae com longas caudas contrácteis. A forte semelhança morfológica com o colifago T4 bem conhecido é óbvia. Por exemplo, a cabeça alongada media cerca de 110 nm por 75 nm. Um colar separava a cabeça da bainha da cauda. A bainha da cauda através de uma subestrutura anular media cerca de 95 nm de comprimento e 18 nm de largura. A bainha é terminada por uma estrutura de placa de base à qual os picos da cauda curta e as fibras longas da cauda estão ligados. As fibras da cauda têm cerca de 150 nm de comprimento e são torcidas numa articulação no joelho aproximadamente no meio da fibra. Foram observados fagos com uma bainha da cauda contráctil de 40 nm. Nestes fagos, o tubo interno da cauda estende-se agora para além da bainha da cauda contraída. Diferentes processos de coloração negativa revelaram 38 selectivamente várias características morfológicas destes fagos. Por exemplo, a estrutura anular da bainha da cauda e as suas alterações estruturais após a contracção da cauda foi melhor visualizada através de coloração com acetato de uranilo, enquanto as fibras da cauda foram melhor observadas com contraste negativo de ácido fosfotúngstico. Ocasionalmente, foi possível observar bigodes no colar.

Foram utilizadas técnicas à base de ADN para diferenciar os fagos de tipo T4 isolados na presente pesquisa. 0 fago T4 contém hidroximetilcitosina glucosilada em vez de citosina. Esta modificação torna o ADN de T4 resistente à digestão com a maioria das enzimas de restrição. São conhecidas apenas algumas enzimas que cortam o ADN de T4 (PcoRV, Nde I, PacI, SwaI, SspI e Sphl) . Contudo, dos nove isolados de fago tipo T4 seleccionados de doentes diferentes, nenhum foi digerido por EcoRV, NdeI, SwaI ou Sphl, e apenas dois foram digeridos por SspI, embora todos tivessem sido, pelo menos, cortados parcialmente por PacI.

No passo seguinte, analisamos o ADN de fago digerido com PacI com uma sonda em transferências de Southern com ADN de T4 marcado. Alguns isolados apresentaram uma hibridação cruzada extensa com a sonda de T4, enquanto outros apresentaram uma hibridação cruzada mais fraca ou não tiveram homologia de ADN com T4 nas condições de hibridação e restringência elevada.

Estas hibridações de Southern foram confirmadas por PCR utilizando um par de iniciadores (FR60 e FR61) da sequência do gene 32 de T4 que são diagnósticos (Repoila et al 1994 genomic polymorphism in the T-even bacteriophages. EMBO J 13:4181-4192) para o subgrupo T-par do fago tipo T4. Os fagos que hibridam de 39 forma cruzada com o ADN de T4 nas transferências produzem um resultado de PCR claramente positivo neste ensaio, enquanto os fagos isolados que não hibridam de forma cruzada com T4 ou não produziram bandas de PCR, ou eram fracas. Os isolados de fago negativos para o produto de PCR para o gene 32 foram então testados de novo com um ensaio de PCR com base num conjunto de iniciadores (iniciador Mzial e caps8) da sequência do gene 23 de T4 que permite a detecção dos subgrupos pseudo T-par e schizo T-par do fago tipo T4, assim como, os T-pares (Tetard et al 2001, Phylogeny of the major head and tail genes of the wide-ranging T4-type bacteriophages. J. Bacteriol. 183 (1): 358-366.

Todos menos os dois isolados de fago produziram o produto de amplificação g23 de diagnóstico (Tabela 7). As excepções foram o isolado JS98 de fezes e o isolado JSL.3 do esgoto Suiço. Ambos os fagos apresentaram uma morfologia do tipo T4 convencional em microscopia electrónica. Em transferências de Southern, o JSL.3 hibridaram fortemente de forma cruzada com outro isolado JSL.5 do esgoto Suíço, mas apenas fracamente com alguns outros fagos, incluindo T4. JSL.5 reagiu fracamente de forma cruzada com vários isolados, mas nomeadamente não com T4. 40

Tabela 7 Sumário dos ensaios de diagnóstico por PCR do gene 32 e gene 23

Fagos N° (%) Diagnóstico N° total de fagos testados 47(100) N° de positivos do PCR do gene 32 24(51) Fagos T-par N° de negativos no gene 32, mas positivos no PCR do gene 23 21(45) Pseudo e Schizo T-par N° de negativos em ambos os PCR do gene 32 e 23 2(4) Morfologia de T4, relacionados geneticamente mais distantes

Exemplo 3: Experiências in vivo com fagos de acordo com a invenção

MATERIAL E MÉTODOS

Animais experimentais:

Foram utilizados murganhos machos C3H com oito semanas de idade (em grupos de 5, a menos que indicado) para experiências de infecção. Cada murganho foi mantido numa gaiola com um topo com filtro. A água de beber utilizada foi Vittel® estéril. As fezes foram retiradas uma vez por dia e ressuspensas em um mL de PBS (solução salina tamponada com fosfato). Para contar a E. coli, foram plaqueadas diluições decimais das fezes ressuspensas em agar Drigalski (Biorad). Os fagos foram adicionados à água de beber. Foram filtrados 0,5 mL de fezes ressuspensas e os fagos foram contados. Os murganhos foram sacrificados quando os fagos estavam ainda presentes na água e foi efectuada uma autópsia. Foram retirados diferentes órgãos (cólon, duodeno, ileo, jejuno, 41 nódulos linfáticos e fígado) e testados para a presença de E. coli e fagos.

Actividade mista de fagos in vivo num modelo de murganho:

Nas primeiras duas semanas, foi utilizada a água normal, depois Vittel® estéril. Na terceira semana, foi adicionada uma mistura de guatro fagos do tipo T4 (JS94.1, JSD.l, JS4 e JSL.6) à água de beber a uma concentração final de 103 unidades formadoras de placas (pfu)/mL nos primeiros dois dias, depois 105 pfu/mL até o final da semana. Na guarta semana foi dada água estéril Vittel®. Os fagos foram adicionados uma segunda vez à água a uma concentração final de 105 pfu/mL, depois foi dada água estéril, depois finalmente 107 pfu/mL fagos. Os fagos foram monitorizados ao longo do ensaio.

Efeito de resposta a dose dos fagos

Como anteriormente, os mesmos fagos foram dados alternativamente com água, foram utilizados quatro murganhos, recebendo cada um deles uma única concentração de fagos. 0 primeiro murganho recebeu fagos a uma concentração final de 103 pfu/mL, o segundo teve a concentração de 104 pfu/mL, o terceiro recebeu 105 pfu/mL e o último 106 pfu/mL fagos. Os fagos foram monitorizados ao longo do ensaio. 42

Infecção com fagos utilizando murganhos axénicos

Foram utilizados murganhos machos axénicos C3H com oito semanas de idade. Foi utilizada Sterile-Vittel® ao longo do ensaio como água de beber. Foram utilizados quatro murganhos. Dois deles foram alimentados à força com E. coli K12 (0,5 mL a uma concentração de 10s cfu/mL). As fezes foram retiradas uma vez por dia e as células de E. coli foram contadas em placas de

Drigalski. Uma semana depois, os fagos foram dados a uma concentração de 105 pfu/mL. As fezes foram recuperadas quatro vezes por dia. As diluições das fezes ressuspensas foram plaqueadas em Drigalski e após filtração, os fagos foram contados. Três dias mais tarde, foi dada água e no inicio da semana seguinte, foi efectuada uma segunda alimentação forçada com a E. coli ECOR5. Os fagos foram dados nas mesmas condições e as fezes ressuspensas foram tratadas como anteriormente.

Resultados

Num primeiro passo, a E. coli da flora normal foi investigada. A água normal foi dada a cinco murganhos durante duas semanas, depois foi utilizada a Vittel® estéril. As fezes foram recuperadas todos os dias e após ressuspensão, as células de E. coli foram contadas num meio selectivo. Em murganhos convencionais verificou-se que a flora normal de E. coli varia de 105 a 107 cfu/g (fig.3). A média apresentada com a linha preta é linear (R2= 0,0002) e é de 106 cfu/g, o que está de acordo com os resultados obtidos por Poulsen et al. (1994, Spatial distribution of Escherichia coli in the mouse large intestine inferred from rRNA in situ hybridisation. Infect. Immun. 62(11): 43 5191-5194) . Após duas semanas, foi dada uma mistura de fagos tipo T4 diluída directamente na água de beber. Durante um par de dias, foi adicionada uma concentração de 103 pfu/mL à água e os fagos foram recuperados a partir das fezes a uma concentração de 103 pfu/g que mostra que os fagos podem sobreviver através do tracto intestinal. A E. coli da flora normal não é afectada pela presença de fagos. Mesmo se a concentração for elevada para 105 pfu/mL durante uma semana, a E. coli é ainda cerca de 106 cfu/g e os fagos recuperados das fezes estão entre 105 a 106 pfu/g.

Quando apenas água estéril Nittel® foi dada, não foram recuperados mais fagos das fezes. As mesmas observações foram feitas quando os fagos foram dados duas vezes, de novo a murganhos, a uma concentração final de 105 pfu/mL e 107 pfu/mL (respectivamente). A quantidade de fago recuperada das fezes é proporcional ao fago recebido mostrando que só ocorreu alguma ou nenhuma amplificação dos fagos no intestino de murganho. À medida que o murganho bebe água pura, nenhum fago pode ser recuperado das fezes. A E. coli da flora normal permaneceu inalterada, significando que a presença de fagos no intestino não afectou a flora. Foi efectuada uma autópsia quando os fagos estavam presentes no intestino e os resultados são apresentados na figura 4B. Diferentes órgãos foram colhidos. Os fagos foram principalmente encontrados no cólon e no duodeno enquanto não foram encontrados fagos nos nódulos linfáticos ou no fígado. Isto sugere que os fagos não passam através do sistema sanguíneo. A E. coli está presente num nível muito baixo em murganhos convencionais, uma vez que apenas um par de células foram observadas no cólon e o íleo. 44

Actividade litica em murganhos axénicos A infecciosidade dos fagos foi testada num modelo de murganho axénico. Dois murganhos machos axénicos C3H de oito semanas de idade foram colonizados com E. coli K12. Foi obtido um nível de 108 cfu/g que é maior do que em murganhos convencionais mas normal para murganhos axénicos (Poulsen et al). Quando se adicionam fagos à água de beber a uma concentração de 105 pfu/mL, em metade de um dia, os fagos foram recuperados nas fezes a uma concentração realmente elevada, mostrando que os fagos lisaram K-12 no intestino e multiplicaram. Nesta metade do dia, o nível de E. coli caiu dramaticamente. Um dia mais tarde, os fagos estavam ainda a um nível elevado mas a E. coli podia ainda sobreviver e mantinha uma concentração de 105 cfu/g. Mesmo quando os fagos foram removidos da água estes estavam ainda presentes nas fezes e foi observado um declínio de dois logs em 3 dias.

Após uma alimentação forçada com EC0R5, que é uma E. coli isolada a partir da flora normal humana, os murganhos foram colonizados de novo a um nível elevado de E. coli (cerca de IO10 cfu/g). A EC0R5 não é afectada pelo fago JS94.1 já utilizado neste teste, e por esta razão, a colonização foi rápida e estável. Mesmo quando os fagos foram de novo adicionados à água de beber, a contagem de células permaneceu a mesma enquanto o título de fago atingiu a concentração dada aos murganhos na água.

Quando os fagos não estavam presentes no intestino, foi efectuada uma autópsia e os resultados são apresentados na figura 4A. A E. coli parece colonizar principalmente o cólon e a 45 parte pequena do intestino. 0 titulo do fago foi também determinado e não foi encontrado nenhum fago (dados não apresentados) em qualquer dos órgãos testados.

Diferentes fagos sobrevivem o tracto intestinal

Alternativamente, água estéril Vittel® foi dada uma semana e os fagos a uma concentração final de 107 pfu/mL foram dados na semana seguinte. Foram testados quatro fagos diferentes (JS4, JSD.l, JSL.6 e JS94.1 respectivamente). Foram tratados quatro murganhos com fagos e o último murganho foi deixado como um controlo e receberam apenas água estéril Vittel®. Os fagos foram monitorizados ao longo do ensaio.

Nesta experiência, deu-se a cinco murganhos os fagos do tipo T4 compondo a mistura do ensaio anterior uma por uma. Todos os fagos reagiram do mesmo modo. Os fagos foram adicionados à água e um dia depois, estes foram recuperados nas fezes à mesma concentração conforme dados. Quando os fagos foram removidos da água, não se encontraram mais fagos nas fezes após 24 horas. Quando o fago foi utilizado na água de beber, foram obtidos os mesmos resultados.

Se quatro concentrações diferentes destes fagos são dados a quatro murganhos diferentes, pode ser notado um efeito de resposta a dose. Quando é utilizada uma concentração muito baixa (103 pfu/mL), os fagos estão presentes nas fezes mas não de uma forma estável. Quando se aumenta esta concentração de um log, os fagos estavam presentes nas fezes sempre ao longo do tratamento e recuperados a um nível mais elevado. Foram feitas as mesmas 46 observações com mais um e dois log.

Exemplo 4: Alimento seco para animais de estimação

Uma mistura alimentar é preparada com cerca de 58% em peso de milho, cerca de 5,5% em peso glúten de milho, cerca de 22% em peso de carne de galinha, 2,5% chicória seca, cocktail de bacteriófago a 106 pfu/mL, sais, vitaminas e minerais perfazem o restante. A mistura alimentar é colocada num pré-condicionador e molhada. 0 alimento húmido é depois colocado num dispositivo de extrusão-fogão e gelatinizada. A matriz gelatinizada que deixa o dispositivo de extrusão é forçado através de um molde e extrudada. 0 extrudado é cortado em pedaços adequados para alimentação de cães, seca a cerca de 110 °C durante cerca de 20 minutos, e arrefecida para formar sedimentos.

Este alimento seco para cão é capaz de prevenir ou tratar distúrbios infecciosos provocadas por Enteriobacteriaceae patogénicas, tais como infecções por E. coli ou Salmonella, tais como gastroenterite, diarreia ou doenças urinárias em animais de estimação.

Exemplo 5: Fórmula nutricional É preparada uma composição nutricional e que contém 100 g de pó: 15% de hidrolisado de proteína, 25% de gorduras, 55% de hidratos de carbono (incluindo 37% de maltodextrina, 6% de amido, 12% de sacarose), vestígios de vitaminas e oligoelementos para incorporar as necessidades diárias, 2% de minerais e 3% de 47 humidade e cocktail bacteriófago de 106 pfu/mL. É misturado 13 g deste pó em 100 mL de água. A fórmula obtida é particularmente pretendida para a prevenção de gastroenterite, diarreia ou doenças urinárias em humanos.

Lisboa, 29 de Junho de 2012 48

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Preparação de fagos isolados com potencial litico contra Enteriobacteriaceae patogénicas para utilização na prevenção ou tratamento de infecções provocadas por Enteriobacteriaceae patogénicas em humanos e animais, em que as Enteriobacteriaceae patogénicas são selecionadas a partir de estirpes de E. coli e/ou Salmonella e, em que a preparação é um fago Myoviridae virulento e não tóxico do tipo T4 seleccionado do grupo compreendendo CNCM 1-2763, CNCM 1-2764, CNCM 1-2765 e CNCM 1-2766.
2. 2. Isolado de fago de acordo com a reivindicação 1, em que as infecções são gastroenterites, diarreia ou doenças urinárias em humanos ou animais.
3. 3. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que a quantidade do isolado de fago tem pelo menos 1.104 pfu (unidade formadora de placas)/mL.
4. 4. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma preparação de isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 ou uma composição que a contém.
5. 5. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento ou prevenção de gastroenterite por E. coli em crianças, que compreende a administração de uma composição compreendendo, pelo menos, um isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3. 1
6. 6. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento ou prevenção de diarreia do viajante ou infecções ETEC num indivíduo, que compreende administração de uma composição compreendendo, pelo menos, um isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 .
7. 7. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento ou prevenção de infecções urinárias em humanos ou animais, que compreende a administração de uma composição compreendendo, pelo menos, um isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 .
8. 8. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento ou prevenção de diarreia por E. coli em animais de estimação, que compreende a administração de uma composição compreendendo, pelo menos, um isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 3.
9. 9. Isolado de fago de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, em que o isolado de fago está na forma de um produto alimentar ou de produto alimentar para animais de estimação, uma composição nutricional, um suplemento ou uma composição farmacêutica.
10. 10. Utilização de uma preparação de isolado de fago com potencial lítico contra as Enteriobacteriaceae patogénicas para a preparação de um produto alimentar ou produto alimentar para animais de estimação, uma composição nutricional ou um suplemento, em que as Enteriobacteriaceae 2 patogénicas são selecionadas de estirpes de E. coli e/ou Salmonella e em que a preparação é um isolado de um fago Myoviridae virulento e não tóxico do tipo T4 seleccionado do grupo compreendendo CNCM 1-2763, CNCM 1-2764, CNCM 1-2765 e CNCM 1-2766.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a quantidade do isolado de fago é de, pelo menos lxlO4 pfu (unidade formadora de placas)/mL.
12. 12. Produto alimentar ou produto alimentar para animais d estimação, uma composição alimentar, um suplemento ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um isolado de um fago Myoviridae virulento e não tóxico do tipo T4 seleccionado a partir do grupo compreendendo CNCM 1-2763, CNCM 1-2764, CNCM 1-2765 e CNCM 1-2766.
13. 13. Produto alimentar ou produto alimentar para animai de estimação de acordo com a reivindicação 12, compreendendo uma quantidade do isolado de fago ou uma mistura de isolados de fago de pelo menos cerca de lxlO4 pfu (unidade formadora de placas)/mL.
14. 14. Produto alimentar ou produto alimentar para animais de estimação de acordo com uma das reivindicações 12 ou 13, em que a quantidade do isolado de fago é de, pelo menos, lxlO4 pfu (unidade formadora de placas)/mL. Lisboa, 29 de Junho de 2012 3