CN101247823A - 牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途 - Google Patents

牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101247823A
CN101247823A CNA2006800150873A CN200680015087A CN101247823A CN 101247823 A CN101247823 A CN 101247823A CN A2006800150873 A CNA2006800150873 A CN A2006800150873A CN 200680015087 A CN200680015087 A CN 200680015087A CN 101247823 A CN101247823 A CN 101247823A
Authority
CN
China
Prior art keywords
purposes
escherichia coli
preparation
bovine lactoferrin
bacterial pathogens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800150873A
Other languages
English (en)
Inventor
R·J·麦马洪
T·克利里
T·奥乔亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TAXAS SYSTEM, University of, Regents of, Bristol Myers Squibb Co filed Critical TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Publication of CN101247823A publication Critical patent/CN101247823A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物抑制个体中表达III型分泌系统的细菌病原体及肠凝集性大肠杆菌的生长和/或预防或治疗其引起的感染。

Description

牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途
发明背景
本申请要求2005年5月5日提交的美国临时申请60/677,969的优先权，其在此以全文引入作为参考。
发明领域
本发明一般涉及牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途。
相关技术的描述
出生之后数小时内，婴儿的胃肠(GI)道被细菌所寄居。细菌是通过食物或者水摄入或者可以直接由于个人手摸婴儿获得。常常存在于人胃肠道内的一个细菌家族是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，其是由容许的厌氧的革兰氏阴性杆菌构成。这个家族中的很多属可以认为是人类肠病原体包括大肠杆菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)和耶尔森菌(Yersinia)。
大肠杆菌(E.coli)是存在于温血动物的肠下部的一个主要细菌种。作为人肠道的正常菌群的部分，大肠杆菌在食物消化中具有重要作用，从大肠中未消化的物质中产生维生素K。一旦确定，大肠杆菌菌株可存留在胃肠道中数月乃至数年。只要这些细菌不带来编码致病因子的遗传要素，其仍是良性共生的。
然而，存在多种类型的大肠杆菌，其可以引起不同严重性的感染和疾病。例如，称为致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenic E.coli)(UPEC)的一类大肠杆菌可以引起尿路感染，是最常见的肠外大肠杆菌感染。大肠杆菌造成约80％的所有简单的尿路感染，其说明在美国每年超过7,000,000的大夫诊所出诊。相似地，与脑膜炎有关的大肠杆菌(MNEC)是造成应对脑膜炎负责的最常见的病原体，特别是在新生儿时期。新生儿脑膜炎可以侵袭每2-4千万之一的婴儿。
大肠杆菌菌株还可以引起其他疾病。例如，如果大肠杆菌是通过肠上的穿孔或撕裂易位进腹膜腔，其可能引起腹膜炎，潜在性的致命感染。大肠杆菌还可以引起败血病，其是由于细菌进入血流引起的感染。细菌一般是由一些远端感染位点如肾、皮肤或肺引入血流。美国每年大约有500,000个败血症病例，尽管大量研究致力于治疗这种病症，死亡率依然是20％-50％。大约45％的败血症病例是归因于革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
大肠杆菌的某些有毒菌株还可以引起多种腹泻疾病。腹泻疾病的严重性变化相当大且可以是致命的。甚至当没有致命时，腹泻疾病是对于发展中国家婴儿和儿童最重要的公共健康问题之一，尽管在对潜在的病因和疾病机理的理解上有了最新的进步。
对于儿童和婴儿而言，腹泻是特别危险的疾病。在5岁以下的儿童中，其是最主要的死亡原因，世界每年占3-4百万的死亡。急性腹泻或持久腹泻的多次发作还可以严重地影响生长、营养状态和认知。Steiner，T.S.，等人.Enteroaggregative Eshcherichia Coli ProduceIntestinal Inflammation and Growth Impairment and Cause lnterleukin-8Release from Intestinal Epithelial Cells，J.Infect.Dis.177：88-96页(1998年)。
基于其流行病学和临床特征、特定的毒力决定子、及伴随的确定的血清型，产生腹泻的大肠杆菌菌株已经分成至少六种主要的分类：产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)(ETEC)、肠侵染性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli)(EIEC)、弥散粘附性大肠杆菌(diffuselyadherent E.coli)(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli)(EHEC)和肠凝集性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli)(EAEC)。Nataro，J.，等人.，Diarrhagenic Escherichia coli，Clin.Microbio.Rev.11：142-201页(1998年1月)；Trung Vu Nguyen等人，Detection and Characterizationof Diarrheagenic Escherichia coli from Young Children in Hanoi，Vietnam，J.Clin.Microbio.43：755-760，755页(2005年2月)。
ETEC是产生肠毒素的特定大肠杆菌菌株。一些肠毒素是细胞毒性的，损坏胃肠道的粘膜细胞，然而其他只是细胞毒性的，包括分泌水和电解质类。ETEC认为是旅行者腹泻的主要病因。与此相反，EIEC是产生发病因子并引起结肠组织distruction和炎症的菌株。EIEC接近地类似志贺菌并在人群中引起侵袭的痢疾型的腹泻。根据其扩散地粘附细胞表面的能力，识别DAEC菌株。EPEC是最早公认的产生腹泻的大肠杆菌的类型，常造成大量的水样腹泻疾病。EPEC是发展中国家中婴儿腹泻的最重要的病因。与ETEC或EIEC不同，EPEC产生不认识的毒素或发病因子。另一类大肠杆菌菌株是EHEC，也称为产生志贺毒素的大肠杆菌(Shiga toxin-producing E.coli)(STEC)。EHEC排泄有力的verotoxins或志贺毒素，常常引起出血性大肠炎或出血性腹泻。最近，EAEC，已知其以聚集形式依附组织培养物的能力，已经是与持久腹泻相关，特别是在发展中国家。
志贺菌属，也是肠杆菌科家族的一员，密切相关于埃希杆菌属，但是不产气和不能够使乳糖发酵。因此，其通常是可辨别于大肠杆菌。在该属中有四种分类：志贺痢疾菌(S. dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexneri)、波伊德志贺菌(S.boydii)和宋内志贺菌(S.sonnel)。很多菌株，包括M90T、E22383和E23507存在于弗氏志贺菌种类内。
弗氏志贺菌的感染，通常称为志贺菌病或杆状痢疾，是发展中国家婴儿死亡率的主要原因。每年大约有165百万的志贺菌病的发病，导致约1.5百万死亡。志贺菌病特征在于腹泻、发热、呕吐和胃绞痛。在罕见的病例中，患病的幼儿可能经历癫痫发作。志贺菌病是特别常见的，而且在卫生状况差的地方可以引起复发的问题。疾病的传播主要是由于食用了受感染个体的粪便污染的水而发生。传染是非常有效力的，因为摄食少于10个细菌细胞就能够引起感染。儿童，特别是2-4岁的初学走路的孩子是最可能感染志贺菌病。
EPEC、EHEC和志贺菌各自使用相似的机制侵入和传染eurkaryotic细胞，并引起腹泻。这种机制称为III型分泌系统(TTSS)。使用这种机制的病原体包括特征性组织病理学损害、末端吸附/消除(termedattaching/effacing)(A/E)损害、由直接使细菌附着于上皮表面而确定和宿主细胞微绒毛的随后的消失。Sekiya，K.，等人，SupermolecularStructure of the Enteropahtogenic Escherichia Coli Type III SecretionSystem and its Direct Interaction with the EspA-Sheath-like Structure，PNAS，98：11，638-11，643页(2001年)。TTSS能够使病原体直接注射毒力蛋白进入其感染的真核宿主细胞的细胞质。Yip，Calvin，等人，Structural Characterization of a Type-Ill Secretion System FilamentProtein in Complex with its Chaperone，Nat.Structural & MoI.Biol.12：75-81页(2005年)。
TTSS装置是由两个分开的部分组成：(1)伸长的中空细胞外的结构，常常终端是针状物，(2)圆筒状的基座，与鞭毛基体相似，其交叉两个细胞膜并确保细胞外膜上整个结构的稳定。据信，针状物是物理上连接于基体。Tampakaki，A等人，Conserved Features of Type IIISecretion，Cell.Microbio.6：805-816页(2004年)。
当病原体进入接近接触宿主细胞，触发TTSS的机制。同时下述的机制特异性符合EPEC，据认为表达TTSS的所有病原体存在相似的机制。Sekiya，PNAS 98：11，638；Ebel，F.，等人，Temperature-andMedium-Dependent Secretion of Proteins by Shiga Toxin-ProducingEscherichia coli，Infect.Imm.64：4472-4479页(1996年11月)。
TTSS认为是导致最终感染的多级机制。首先，装配一对位于细菌的内膜和外膜上的环状结构。然后，细菌产生由大肠杆菌分泌的成分(EscF)构成的注入口，其锚入细菌内膜和外膜。Multiper大肠杆菌分泌的蛋白质A(EspA)然后附着于EscF的顶端。EspA随后开始从EscF的顶端聚合，聚集成鞘状结构，称为针状物。针状物是可张开的，通过EspA分泌的量控制其延长。针状物构造细菌和宿主细胞膜之间的一物理桥。
在针状物的末端，两个大肠杆菌分泌的蛋白质B(EspB)和D(EspD)，杂-寡聚体化成复合物，其形成真核靶细胞上的孔隙。这些孔允许蛋白质注入上皮细胞的细胞质室。EspB和EspD，以及已易位的intimin受体(Tir)，然后易位进入宿主细胞。已知，对于致病细菌成功使用III型分泌系统，EspB的自身功能是关键的。通过把细菌蛋白引入宿主细胞，细菌强迫细胞在其自身感染下合作。此外，由于Tir是易位的，其伸出超过肠细胞表面并直接结合细菌粘附分子intimin。肌动蛋白和其他细胞支架成分在连接位点的Intimin-Tir结合触发聚合，其分裂正常的肠细胞微绒毛，形成特征的基座。这种变化常常涉及为A/E损害。在很多细菌以这种方式粘着于肠细胞衬里之后，开始感染的症状如腹泻。参见图16，典型的TTSS的简图。
对比EPEC，EHEC和志贺菌、EAEC是一类不表达III型分泌系统的大肠杆菌。而不是，EAEC菌株的区别特征是其以聚集方式粘附组织培养物细胞的能力。相对于组织细胞。细菌自身平行排列成排。聚集描述为“聚积的砖样”。
EAEC发病机制由三个阶段：(1)通过聚集粘附菌毛(AAF)或其他粘附因子附着于肠粘膜；(2)由于细菌和宿主细胞增加产生粘液，其储存为肠细胞表面上的粘液生物被膜；和(3)具有细胞因子释放、粘膜毒性和肠分泌的炎症反应。Huang，D.B等，EnteroaggregativeEscherichia coli：An Emerging Enteric Pathogen，Am.J.Gastroenterol.99(2)：383-389页(2004年)。EAEC包括大肠杆菌的多种菌株，包括大肠杆菌042，O4，O：H10和O44：H18。
同幼儿的持久腹泻有关的EAEC菌株是造成儿童中10％腹泻病例的原因。在发展中国家，EAEC菌株是与8％-32％的所有急性儿科腹泻病例及20％-30％的所有持久腹泻有关。菌株还同旅行者腹泻及伴随获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的腹泻有关。少于3岁的儿童中伴随EAEC的腹泻病例的持续时间平均是17天，其更长于伴随任何其他病原体的病例。
作为保护小于5岁的儿童免受多种腹泻疾病的手段，人乳喂养认为是最有效的介入。多方面的研究已经显示，对于较少范围，全部的人乳喂养和部分的人乳喂养可以防止免于急性和持久腹泻。Victoria，CG等人，Risk Factors for Deaths Due to Respiratory Infections AmongBrazilian Infants，Int.J.Epidemiol.18：918-25页(1989年)。作为防护介入的人乳喂养的功效可以归因于多方面的抗感染、抗炎以及由人乳递送的免疫调节因子。Newburg，D.S.Human Milk Glycoconjugaes thatInhibit Pathogens，Curr.Med.Chem.6：117-127页(1999年)。
乳铁蛋白，一种结合铁的糖蛋白，是存在于人乳中的一种主要的多功能药物。其还在外分泌的分泌物如眼泪、唾液和来自特定细胞型如中性白细胞的那些中发现。已报道人乳铁蛋白以多种方式防护免于革兰氏阴性细菌。
虽然不希望束缚于这种或任何理论，据认为人乳铁蛋白通过夺去微生物生长必需的铁，发挥了抑制细菌的活力。因此，通过隔离致病微生物必需的周围的铁，人乳铁蛋白有效地抑制这些微生物的生长。
据认为，人乳铁蛋白还可以产生杀菌的活性，由于其直接结合微生物的膜。人乳铁蛋白结合细菌细胞表面上的脂多糖(LPS)的脂质A部分，其破裂细菌细胞膜并改变其通透性。据推测，人乳铁蛋白结合LPS可以干扰III型分泌结构，引起分泌的蛋白被释放，然后消化。Ochoa，TJ.等人，Lactoferrin Impairs Type III Secretory System Function inEnteropathogenic Escherichia coli，Infect.Immun.71：5149-5155页(2003年)。
若干研究已经调查了人乳铁蛋白对于多种细菌种的作用。例如，2003个研究调查了重组体人乳铁蛋白对于TTSS的作用。重组体人乳铁蛋白已知是在氨基酸序列上与天然的人乳铁蛋白非常相似，但是描述具有不同的糖基化模式。研究证明重组体人乳铁蛋白可以损伤肠致病性大肠杆菌中III型分泌系统的功能。然而，研究还发现人乳铁蛋白不损伤EPEC.Id的生长。
2001个研究证明人乳铁蛋白可以抑制EPEC粘着于HeLa细胞。Nascimento de Araujo，A等人，Lactoferrin and Free Secretory Componentof Human Milk Inhibit the Adhesion of Enteropathogenic Esherichia toHeLa Cells，BMC Microbiol.1：25页(2001年)。此研究没有提出人乳铁蛋白抑制微生物生长的能力。
同时人乳铁蛋白似乎对腹泻疾病的症状具有正性作用，一些妇女不愿意或不能够母乳喂养。就此点而言，相对于有效地预防或消除腹泻感染的人母乳提供选择性方案将是有用的。在抑制引起腹泻感染的细菌病原体的生长中，这样的选择还应该是有效的。
发明概述
因此，简要地讲，本发明涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物抑制个体中表达III型分泌系统的细菌病原体的生长。
本发明还涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物抑制个体中表达III型分泌系统的细菌病原体的生长和/或预防或治疗由表达III型分泌系统的细菌病原体引起的感染。在某些实施方案中，这些病原体可以选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌、假单胞菌(Pseudomonas)和大肠杆菌。
此外，本发明涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物用于抑制表达III型分泌系统的细菌病原体粘着于人肠细胞。
本发明又涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物用于引起表达III型分泌系统的细菌病原体中EspB的过早释放，以及造成表达III型分泌系统的细菌病原体中EspB降解。
进一步，本发明涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物用于抑制个体中肠凝集性大肠杆菌的生长，以及预防或治疗肠凝集性大肠杆菌引起的感染。
本发明还涉及牛乳铁蛋白在制备药物中的新用途，所述药物用于抑制肠凝集性大肠杆菌粘着于肠细胞。
此外，本发明涉及含牛乳铁蛋白的新的肠用制剂或婴儿配方品，牛乳铁蛋白已经从全脂奶中分离出并具有低体细胞计数。在某些实施方案中，肠用制剂进一步包含酪蛋白糖巨肽(glycomacropeptide)。
本发明的好处是其可以容易添加入肠组合物或婴儿配方品以预防这种疾病的发作或治疗这种疾病。选择性地，本发明的药物可以给药食品表面或混入食品以抑制细菌病原体的生长。
附图简述
就本发明更完全的理解而言，结合附图参考以下说明。
图1说明了bLF对于EPEC生长的抑菌效果。
图2说明了bLF对于EAEC生长的抑菌效果。
图3说明了bLF对于志贺菌生长的抑菌效果。
图4说明了不同浓度的bLF对于EPEC生长抑制的效果。
图5说明了不同浓度的bLF对于EAEC生长抑制的效果。
图6说明了不同浓度的bLF对于志贺菌生长抑制的效果。
图7说明了饱和浓度的铁对于bLF抑制EPEC生长的能力的作用。
图8说明了饱和浓度的铁对于bLF抑制EAEC生长的能力的作用。
图9说明了饱和浓度的铁对于bLF抑制志贺菌生长的能力的作用。
图10说明了多种bLF制剂对于EPEC生长抑制的效果。
图11说明了多种bLF制剂对于EAEC生长抑制的效果。
图12说明了多种bLF制剂对于志贺菌生长抑制的效果。
图13说明了在缺乏bLF时，EAEC对于HEp-2细胞的粘着。
图14说明了bLF对于EAEC粘着HEp-2细胞的作用。
图15说明了饱和浓度的铁对于bLF抑制EAEC粘着HEp-2细胞的能力的影响。
图16是III型分泌系统的简图。
图17是STEC HW1和STEC 306-7的蛋白质印迹，单独或存在牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白。
图18是STEC TWO 8023和C600的蛋白质印迹，单独或存在牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白。
优选实施方案的详述
对于本发明的实施方案将详细作出参考，以下提出一个或多个实施例。提供各个实施例为了说明本发明，而不是限制本发明。事实上，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明的范围和精神的情况下本发明可以进行多种修改和变化将是显而易见的。举例而言，作为实施方案的部分的图解或叙述的特征可在另一个实施方案中使用，然而以得到进一步的实施方案。
因此，预期的是本发明涵盖了这样的修饰和变形，因为在附加的权利要求和其等同的范围之内。本发明的其他目的、特征和方面是公开于或得自以下详细说明或。本领域技术人员理解的是，此讨论仅仅是描述示例性的实施方案，不意欲限制本发明较宽的方面。
术语“益生菌”指的是对于宿主的健康产生了有益的效果的微生物。
术语“益菌素(prebiotic)”，如本文所用，指的是刺激益生菌生长和/或活性的不可消化的食物成分。
术语“个体”指的是任何哺乳动物，优选是人。在某些实施方案中，个体需要预防或治疗表达TTSS的肠杆菌或细菌病原体引起的感染。在其他实施方案中，个体需要抑制表达TTSS的细菌病原体的生长。在特定的实施方案中，个体需要抑制EAEC的生长或者需要预防或治疗EAEC引起的感染。在某些实施方案中，个体是儿童或婴儿。在一些实施方案中，个体是没有接受人母乳的婴儿。
术语“抑制”是指减少、限制或阻止一种或多种生物的生长或活动。
如本文所用，术语“治疗”是指改进、改善或补救疾病、病症，或疾病或病症的症状。
术语“预防”是指通过一些活动停止或阻止疾病、病症，或疾病或病症的症状。
术语“有效量”是指产生抑制致病生物的生长或者改善或补救此生物引起的疾病、病症或疾病或病症的症状的量。
术语“感染”是指个体中致病的微生物的侵入或增加，其可能产生随后的组织损伤并由于多种细胞或毒性机理发展成明显的疾病。
术语“体细胞计数”是指测量奶中白细胞的数。
术语“肠用制剂”是指肠内给药于个体的组合物，优选是通过摄食。
如在此所用，术语“婴儿配方品”是指通过替代人乳满足婴儿的营养需要的组合物。在美国，婴儿配方品的内含物是由联邦规定在21C.F.R.部分的100、106和107提出的要求。这些规程定义了努力促进人母乳的营养和其他性质的常量营养物、维生素、矿物和其他成分水平。
根据本发明，已经发现了牛乳铁蛋白(bLF)在制备药物中的新用途，所述药物抑制个体中肠杆菌的生长。牛乳铁蛋白是一种属于铁运载体或运铁蛋白家族的糖蛋白。其是从牛奶中分离得，在这里其发现为乳清的成分。
已知人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在氨基酸序列、糖基化模式和铁结合能力上存在显著的差异。此外，在从奶牛的乳中分离牛乳铁蛋白涉及复杂和连续的加工步骤，所述加工步骤期望是得到获得的牛乳铁蛋白制剂的生理化学性质。还报道，人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在其结合人肠内发现的乳铁蛋白受体的能力上具有差异。特别地，牛乳铁蛋白已知具有差的结合人肠的乳铁蛋白受体的能力。因为人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白在这些方面是如此不同，本发明获得的结果，使用牛乳铁蛋白是意外和令人吃惊的。
如上讨论的，据认为人乳铁蛋白及推测的牛乳铁蛋白抑菌效果下面的主要机制是病原体的铁隔离。与此相反，本发明显示了，牛乳铁蛋白的抑菌效果是与铁饱和度无关的。因此，牛乳铁蛋白的抑菌效果认为是通过不同于人乳铁蛋白的机制产生。
这里有多种研究解决bLF的抑菌效果。例如，某研究发现bLF对小鼠体内多种梭菌的增殖具有抑菌效果。Teraguchi，S等人，Bacteriostatic Effect of Orally Administered Bovine Lactoferrin onProliferation of Clostridium Species in the Gut of Mice Fed Bovine Milk，Appl.Environ.Microbiol.61：501-506页(1995年)。BLF还证明对小鼠肠内的肠杆菌具有抑菌效果。Teraguchi，S.，等人，The BacteriostaticEffect of Orally Administered Bovine Lactoferrin on IntestinalEnterobacteriaceae of SPF Mice Fed Bovine Milk，Biosci.Biotech.Biochem.58：482-487页(1994年)。虽然研究中分离出的主要肠杆菌科的种类是大肠杆菌，研究没有提供bLF对于具有III型分泌系统的细菌病原体或特定的大肠杆菌分类如EAEC的抑制生长效果的证据。
然而，对比以上研究，类似进行的研究发现bLF对产肠毒素性大肠杆菌没有生生长抑制效应。Sarelli，L.，等人，Lactoferrin to PreventExperimental Escherichia coli Diarrhea in Weaned Pigs，Intl.J.Appl.Res.，从http://www.jarvm.com/articles/Vol1lss4/Heinonen.htm得到。研究还证实实验诱导的腹泻的出现或粪便中溶血大肠杆菌计数没有显著的减少。
若干专利还涉及bLF对于多种细菌和/或疾病的作用。例如，Kruzel等人的美国专利申请号20030203839涉及bLF治疗全身炎症反应综合征(SIRS)发展成败血病、严重败血病、感染性休克和多器官衰竭的用途。
Naidu的美国专利申请号20040043922和Braun的美国专利申请号20030229011涉及一种减少食品上微生物污染的方法。该方法涉及用固定乳铁蛋白处理食品。同时本发明有用于治疗EPEC和志贺菌spp.，其需要固定的乳铁蛋白是有效的。
Varadhachary等人的美国专利申请号20040152624涉及一种通过向个体给予有效量的bLF治疗菌血症的方法。根据参考，该方法还引起循环细菌水平的降低。然而，这些参考没有一个公开了bLF对于具有III型分泌系统的细菌病原体的益处。类似地，没有一个参考公开了bLF对于EAEC的益处。因此，本发明较以上讨论的参考提供了令人吃惊的益处。
在本发明的特定实施方案中，肠杆菌科可包括大肠杆菌和志贺菌。在本发明的另一个实施方案中，肠杆菌科可包括肠致病性大肠杆菌、肠凝集性大肠杆菌和志贺菌。而在本发明的另一个实施方案，肠杆菌科可包括大肠杆菌E2348/69、大肠杆菌042和弗氏志贺菌M90T。菌株大肠杆菌E2348/69、大肠杆菌042和弗氏志贺菌M90T是非常重要的，因为其引起婴儿和儿童的多种有害的感染。
在本发明的另一个实施方案中，表达III型分泌系统的细菌病原体的生长是通过有效量的bLF抑制。在某些实施方案中，表达III型分泌系统的细菌病原体可包括沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌、假单胞菌和大肠杆菌。在一实施方案中，大肠杆菌病原体可包括肠致病性大肠杆菌或肠出血性大肠杆菌。EPEC包括大肠杆菌的多种菌株，包括大肠杆菌E2348/69，026，055，0157，0111，O114:H2，O119:H6，0126，O127-.H6，O128:H2和O142:H6。类似地，EHEC可包括菌株STEC TWO8023、STEC HW1、STEC 306-7、O157:H7、O111:H8、O104:H21，O111、O26或O26:H11。
在本发明的分开的实施方案中，本发明预防或治疗个体中肠杆菌引起的感染。这包括本领域已知的肠杆菌科引起的任何感染。更特别地，这包括本领域已知的肠致病性大肠杆菌、肠凝集性大肠杆菌或弗氏志贺菌引起的任何感染。还包括本领域已知的表达III型分泌系统的细菌病原体引起的感染。在本发明的一实施方案中，感染可包括尿路感染、新生儿脑膜炎、腹膜炎、志贺菌病或任何胃肠感染或疾病。
在本发明另一个实施方案中，抑制了致病的细菌的生长而没有相应增加细菌产生的毒性水平。已知，生长抑制是诱导的携带Stx基因噬菌体的触发器。很多抗生素已知是通过诱导噬菌体裂解周期，增加毒素产生。本发明是令人吃惊的，因为在生长抑制时，其不会诱导增加产生毒性的水平。因此，本发明可以抑制致病的细菌的生长，没有同时增加毒性产生。意外的益处是在实施例4中进一步讨论。
在本发明的某些实施方案中，已经从全脂奶分离出bLF。在某些其他实施方案中，bLF具有低的体细胞计数。在一些实施方案中，bLF已经从全脂奶分离出并具有低的体细胞计数。
虽然不希望被这个或任何理论束缚，据认为同从奶粉中分离出的bLF相比，从全脂奶中分离出的bLF具有更少的最初结合的脂多糖(LPS)。此外，据认为低体细胞计数的bLF具有更少最初结合的LPS。因为这种形式的bLF具有更少最初结合的LPS，更多结合位点是在其表面获得。这认为是有助于bLF结合适当的位置并断裂感染过程。
本发明某些实施方案中所用的bLF可以是从全脂奶分离出和/或具有低体细胞计数的任何bLF。根据实施例，适合的bLF是从TatuaCo-operative Dairy Co.，Ltd.得到，在Morrinsville，New Zealand。
在本发明的实施方案中，bLF的生生长抑制效应是剂量依赖性的。当bLF的剂量增加时，bLF的生生长抑制效应也是增加的。
在本发明的另一个实施方案中，bLF的生生长抑制效应取决于个体肠中存在的铁的浓度。本发明的bLF在用铁饱和之后降低了其抑菌能力。
在本发明中，bLF对具有III型分泌系统的细菌病原体和EAEC、及缺乏III型分泌系统的病原体具有生长抑制效应。本发明说明了，当bLF对表达III型分泌系统的细菌病原体有效时，对于III型分泌系统其不是必需特异性的。BLF还有效地抑制非-TTSS病原体的生长。虽然不希望束缚于这个或其他理论，据认为对于粘着是重要的EAEC的膜-锚固定的毒力蛋白可能由于bLF于细菌表面的相互干扰而断裂。这里有多种粘着蛋白，其可能是造成bLF对EAEC粘着作用的原因，包括AAF/I和AAF/II。因此，通过防止EAEC粘着于肠上皮细胞，bLF可以保护婴儿免受胃肠感染，并借此保护其免受病原体的集群。
在本发明的特定实施方案中，bLF可以抑制EAEC粘着于肠细胞。在这个实施方案中，抗粘着效果不受存在于个体肠内铁的浓度的影响。
本发明所用的bLF的有效量可以是约0.001mg-约100g/天。在一实施方案中，bLF的有效量可以是约0.1mg-约10g/天。在另一个实施方案中，bLF的有效量可以是约10mg-1500mg/天。在本发明的特定实施方案中，bLF可以是每日三次剂量给药。
在多个实施方案中，bLF可以通过溶液、胶囊、片剂或小胶囊给药。BLF的载体可具有约0.01％-约100％的bLF浓度。
本发明还包括牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物抑制食品中EPEC、EAEC或志贺菌的生长。在此实施方案中，bLF可以喷雾在食物的表面，或者可以混入食品的成分。
在本发明的另一个实施方案中，本发明是包含酪蛋白糖巨肽和牛乳铁蛋白的肠用制剂，牛乳铁蛋白已经从全脂奶中分离出并具有低的体细胞计数。
在实施方案中，肠用制剂还包含长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。适宜的LCPUFAs可包括，但不限于α-亚油酸、γ-亚油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)及二十二碳六烯酸(DHA)。在本发明的一实施方案中，LCPUFA的有效量可相当于约3mg/kg体重/天-约150mg/kg体重/天。在本发明的一实施方案中，量是约6mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天。在另一个实施方案中，所述量是约10mg/kg体重/天-约60mg/kg体重/天。
肠用制剂还可以含益生菌。本领域已知的任何益生菌将是此实施方案接受的。在特定实施方案中，益生菌是选自乳酸杆菌(Lactobacillus)和双岐杆菌(Bifidobacterium)。在此实施方案中，益生菌可以是Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)或Bifidobacteriumlactis(Bb-12)。
而在本发明的另一个实施方案中，肠用制剂可包含益菌素。本领域已知的任何益菌素将是此实施方案所接受的。益菌素可包括乳果糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚乳果糖、低聚木糖和低聚龙胆糖(gentio-oligosaccharide)。
在另一个实施方案中，本发明是含bLF的婴儿配方品，bLF已经从全脂奶中分离出，并具有低体细胞计数。婴儿配方品可包含酪蛋白糖巨肽。婴儿配方品还可包含至少一种LCPUFA。而在另一个实施方案中，婴儿配方品可包含至少一种益生菌和/或益菌素。在一特定实施方案中，婴儿配方品包含已从全脂奶中分离出并具有低体细胞计数的bLF、酪蛋白糖巨肽、至少一种LCPUFA、至少一种益生菌及至少一种益菌素。
本发明所用的婴儿配方品是营养完全的，并包含适合类型和量的脂质、糖类、蛋白质、维生素和矿物质。脂质或脂肪的量通常可以从约3-约7g/100 kcal。蛋白质的量通常可以从约1-约5g/100kcal。糖类的量通常可以从约8-约12g/100kcal。蛋白质源可以是本领域所用的任何，例如脱脂奶，乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白质、水解蛋白、氨基酸等。糖类来源可以是本领域所用的任何，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆固体、糊精-麦芽糖复合剂、蔗糖、淀粉、米糖浆固体等。脂质来源可以是本领域所用的任何，例如植物油类如棕榈油、大豆油、棕榈油精、椰子油、中链甘油三酯油、高油的向日葵油、高油的红花油等。
便利地，可以使用商业上可购得的婴儿配方品。例如，Enfamil、EnfamilPremature Formula、Enfamilwith Iron、Lactofree、Nutramigen、Pregestimil、和ProSobee(从Mead Johnson &Company，Evansville购得，在美国)可以补充适合水平的bLF、酪蛋白糖巨肽、LCPUFA、益生菌和/或益菌素并用于本发明的实践。
以下实施例描述了本发明的多个实施方案。考虑到本文公开的说明书或实施，本文权利要求范围之内的其他实施方案对本领域技术人员将是显而易见的。预期是，说明书连同实施例，认为是仅仅示例性的，具有实施例之后的权利要求指出的本发明的保护范围和精神。在实施例中，给出的所有百分比是基于重量计，除非另外指出。
实施例1
此实施例描述了显示牛乳铁蛋白对具有III型分泌系统的细菌病原体具有效应所需的原料和方法。三种菌株的细菌在本发明中使用。菌株包括STEC HW1、STEC 306-7和STEC TWO 8023。这些菌株各自是不同的利用TTSS感染细胞的生物。细菌菌株C600是一种不利用TTSS的病原体，用作试验中的阴性对照。
来自Luria Broth整夜生长的细菌是在1∶50稀释度的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中孵育，培养基中含有25mM HEPES，pH为7.4，并在37℃的5％CO2的不振摇的培养箱中孵育。称量5mL等分部分进标记的试管，用分光光度计在OD600下每小时监测细菌生长至7小时。在所有不含bLF的对照样品中，在对数生长期(4小时)评价菌落形成单位(cfu)。
为了消除由于铁隔离观察到牛乳铁蛋白的抗-TTSS活性的可能性，此实施方案中所用的牛乳铁蛋白用铁饱和，通过用饱和所需的铁孵育乳铁蛋白5次，所有铁结合乳铁蛋白制剂上的位点。
在实验的每个小时，样品在13200rpm下离心10-15分钟以分离伴随释放成分的细胞。上清液，代表无细胞缔合的物质(其从细菌中释放的)，放置且固定于0.1ml的SDS样品缓冲液并在100℃下加热5分钟。来自此离心步骤中的片状沉淀使用磷酸盐缓冲的盐水洗，再悬浮于0.1ml SDS样品缓冲液中并在100℃下加热5分钟。上清液和片状沉淀，均在样品缓冲液中，然后通过使用常规方法的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解析。所得的凝胶然后使用常规的方法转移至膜如聚氟乙烯或硝基纤维素。然后通过使用EspB的特异性抗体的蛋白质印迹法探测上清液(释放的蛋白质)和片状沉淀(细胞缔合蛋白质)中EspB的存在。
在此实施例中，bLF是Tatua Co-operative Dairy Co.，Ltd，Morrinsville，New Zealand购得。除非另外指出，所有实验是使用10mg/mL(0.125mM)或1mg/mL浓度的bLF进行，其大约是分别存在于人初乳和成熟乳汁中的浓度。
除非另外指出，数据表达为均值±标准差(SD)。就乳铁蛋白的生长抑制效应分析而言，计算两条回归线，然后使用t统计检验两个回归斜面之间的差异(Armitage P，1980)。然后通过用于中值差异的Wilcoxon Rank-Sum检验分析成对的数据。对于不同乳铁蛋白制剂的铁含量及其生长抑制效应的分析而言，计算线性回归并表达为各个细菌的R-平方。
实施例2
这个实施例说明了牛乳铁蛋白对于细菌病原体粘着真核细胞的效应。特别地，这个实施例说明了牛乳铁蛋白对III型分泌系统中蛋白质EspB的作用。
图17中所示的蛋白质印迹说明了牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白对于STEC HW1和STEC 306-7作用。泳道L1表示分子量标记。泳道L2表示纯化的EspB以指出此蛋白质在蛋白质印迹中适合的位置。在各个凝胶图象中，泳道L3表示菌株HW1在2、3、4或5小时培养生长之后的上清液(释放后)中EspB的量。泳道L4表示已经在1mg/mL的人重组体乳铁蛋白中生长的菌株HW1在2、3、4或5小时培养的上清液中EspB。泳道L5表示在2、3、4或5小时培养的菌株HW1的上清液中EspB，菌株HW1已经在1mg/mL的牛乳铁蛋白中生长。泳道L6表示在2、3、4或5小时培养的菌株306-7的EspB上清液。泳道L6表示在2、3、4或5小时培养的菌株306-7的EspB上清液，所述菌株306-7已在1mg/mL的人重组体乳铁蛋白中生长。泳道L6表示在2、3、4或5小时培养的菌株306-7的EspB上清液，所述菌株306-7已在1mg/mL的牛乳铁蛋白中生长。
图17中所示的蛋白质印迹说明了，缺乏bLF(泳道L3和L6)时，直到生长4小时才在上清液(不是从细菌中释放)中观察到EspB。这说明了在细菌的安稳生长时，TTSS组分的产生和释放的正常过程。与此相反，同缺乏bLF相比，存在bLF时，在上清液早期(3小时，泳道L5和L8)检测到EspB，表明EspB的过早释放。此发现是重要的，因为EspB是必需的成功使用TTSS的所需组件，而且过早释放将限制感染的TTSS的有效性。对于人乳铁蛋白制剂(泳道L4和L7)未发现相同的效果。除了EspB的过早释放之外，这个实验还提供了bLF用作降解EspB的蛋白酶的证据(而且因此不允许其再利用配制促分泌的针状复合物)。这是通过这样表明，在凝胶中未受损的EspB蛋白的位置(指出产生更小的EspB肽类)很多的带状的中性粒细胞(bands)立即鉴别为EspB(因为其是被抗-EspB抗体识别)。对于表达TTSS的所有菌株观察到此现象，而不是C600，其是TTSS阴性病原体。已知的是，不同的病原体利用TTSS表达EspB的变体，假如来自各个病原体的这种蛋白质由于bLf的可变的降解。
图18所示的蛋白质印迹是以与图17的蛋白质印迹相同的方式有机化，除了试验的菌株是STEC TWO 8023和C600，阴性对照。图18中所示的蛋白质印迹的结果还是与图17中所示的那些相似。EspB在乳铁蛋白中生长3小时出现在培养基中，同时其直至4小时才在对照中出现。在4小时和5小时的时间点，牛乳铁蛋白引起EspB降解。此外，对于在3小时时间点评估的三种STEC菌株，同重组体人乳铁蛋白相比，牛乳铁蛋白引起EspB释放进入培养基更快。此外，这个图提供了由于bLF的EspB降解的另外的证据，如先前图所讨论的。
因此，认为牛乳铁蛋白的存在引起EspB的过早释放和降解。对于穿过极化的肠上皮细胞的短路环电流的变化以及Caco-2细胞中的膜去极化，EspB是需要的。对于NF-κB活性的诱导、白细胞介素-8的分泌、中性白细胞的经皮迁移、经皮电阻的降低，EspB也是必需的，所有这些可能有助于腹泻疾病。如所指的，EspB的过早释放和/或降解可能减轻或消除腹泻疾病的症状。
实施例3
对于这个实验的有效性，此实验所用的bLF是铁饱和的是关键的，而且因此不不细菌抑制地作用于抑制细菌菌株的生长。这将改变各个泳道中EspB的量，可能混淆数据的解释。
这个实施例说明了存在或不存在用铁饱和的牛乳铁蛋白时，相当的细菌生长速率。因为，存在或不存在bLF时，在此实施中各个培养物的生长是相似地早，观察到的对于EspB的效果是由于bLF的新活性，而不是由于早的生长抑制或铁隔离。
实施例4
这个实施例说明了STEC生长抑制时，牛乳铁蛋白对于志贺毒素(Stx)产物的增量调节的作用。除了III型分泌系统之外，EHEC菌株具有有助于其致病个性的另外的致病因子。主要的致病因子之一是Stx的产生，一种抑制蛋白质合成的毒素。存在两种形式的Stx：Stx1，其几乎等同于来自志贺菌痢疾I型的毒素；而Stx2，其与Stx1仅分享了50-60％的氨基酸同源性。Stx1和Stx2都与非常严重的疾病有关。据认为，由存在于肠内腔的细菌释放的Stx是造成腹泻疾病、出血性大肠炎及溶血性尿毒症的原因。毒素通过肠上皮障碍，进入血流，损伤结肠的血管细胞、肾和中枢神经系统。
已知是，生长抑制是诱导携带Stx基因的噬菌体的触发器。例如，多种抗生素包括环丙沙星、诺氟沙星、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异  唑、氨苄西林、磷霉素、呋喃唑酮、丝裂霉素、头孢吡肟及四环素，已知是通过诱导噬菌体裂解周期增加毒素产生。动物模型和人类的临床数据揭示了，这种毒素诱导对于人疾病的发病机制是重要的。
因此，这个研究评价了牛乳铁蛋白对于毒素产生的作用。研究了STEC的20个菌株。测定在乳铁蛋白的生长抑制条件下产生的毒素的量，并同环丙沙星比较，其是一种已知的毒素产生的诱导物。缺乏乳铁蛋白或环丙沙星时，STEC产生的Stx毒素的量是35±14ng/孔。存在环丙沙星时，产生的Stx毒素的量是682±193ng/孔，几乎20倍的增加。然而，存在牛乳铁蛋白时，产生的Stx毒素的量是仅仅是35±14ng/孔。因此，牛乳铁蛋白，不同于损害细菌生长的许多其他试剂，没有那样诱导Stx毒性产生。经历同不含牛乳铁蛋白的细菌病原体相同的条件时，牛乳铁蛋白不通过细菌病原体增加毒素的生成。同样地，在噬菌体诱导测定中，无STEC菌株可以诱导进入裂解周期，此时宽范围的牛乳铁蛋白浓度的生长。
实施例5
这个实施例说明了牛乳铁蛋白对肠杆菌生长的作用。
本发明利用了三种菌株的细菌。菌株包括EPEC E2348/69、EAEC042和弗氏志贺菌M90T。来自Luria Broth中整夜生长的细菌是在1∶50稀释度的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中孵育，培养基中含有25mM HEPES，pH为7.4，并在37℃的5％CO2的不振摇的培养箱中孵育。细菌生长是用分光光度计在OD600下每小时监测至7小时。在所有不含bLF的对照样品中，在对数生长期(4小时)评价菌落形成单位(cfu)。
在这个实施例中，bLF是购买自Tatua Cooperative Dairy Co.，Ltd，Morrinsville，New Zealand。除非另外指出，所有实验是使用10mg/mL(0.125mM)或1mg/mL浓度的bLF进行，其大约是分别存在于人初乳和成熟乳汁中的浓度。
除非另外指出，数据表达为均值±标准差(SD)。就乳铁蛋白的生长抑制效应分析而言，计算两条回归线，然后使用t统计检验两个回归斜面之间的差异(Armitage P，1980)。然后通过用于中值差异的Wilcoxon Rank-Sum检验分析成对的数据。对于不同乳铁蛋白制剂的铁含量及其生长抑制效应的分析而言，计算线性回归并表达为各个细菌的R-平方。
bLF-治疗的细菌(EPEC E2348/69、EAEC 042和弗氏志贺菌M90T)最初具有显著的生长抑制(OD600 0.149对0.831，乳铁蛋白对对照，分别地)。从培养基中除去bLF之后，细菌具有正常的生长(OD600 0.911对0.828，乳铁蛋白比对照，分别地)。这个结果表明，bLF对EPEC、EAEC和志贺菌的生长具有抑制效果。这个结果还表明，bLF对EPEC、EAEC和志贺菌具有抑菌效果而不是杀菌效果，因为从培养基中除去bLF之后细菌恢复正常生长。这些结果是如图1-3中所示。
实施例6
这个实施例说明了，浓度和时间关于bLF对于EPEC、EAEC和志贺菌的生长抑制效应的影响。在这个实施例中，bLF是购自TatuaCo-operative Dairy Co.，Ltd，Morrinsville，New Zealand。细菌是在存在1mg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的bLF制剂的DMEM培养基中孵育。图4-6显示了，bLF以剂量依赖方式抑制EPEC、EAEC和志贺菌生长。当bLF的浓度增加，其生生长抑制效应也增加。
实施例7
这个实施例说明了铁饱和度对于bLF生长抑制效应的影响。为了比较各个乳铁蛋白制剂的铁饱和度，样品(10mg/mL)在0.1M Tris，pH8.5下稀释，固定于烤肉器(rotisserie)中2小时。通过465nm下的吸光度测定的铁含量判断铁饱和度(Mazurier and Spik，1980)。通过280nm下的吸光度评估蛋白质含量。不同乳铁蛋白制剂的铁/蛋白质比例是与生长有关。在这个实施例中，铁的饱和量逆转bLF对细菌的生生长抑制效应(图7-9)。
实施例8
这个实施例说明了bLF的有效性，通过从奶粉中分离的且不具有低的体细胞计数的bLF制剂相比，所述bLF是从全脂奶分离出并具有低的体细胞计数。使用商业上购得的乳铁蛋白制剂进行比较研究，如表1所示。
表1
研究编号  类型  商品名 生产商
bLF-Tatua  Bovine  Bovine lactoferrin Tatua Co-operative Dairy Co.，Ltd，Morrinsville，New Zealand
bLF-BF20  Bovine  BioferrinTM 2000 Glanba Nutritional，Inc，Monre，WI
bLF-BF10  Bovine  BioferrinTM1000 Glanba Nutritional，Inc，Monre，WI
bLF-FD  Bovine  LF-FD domesticlactoferrin DMW international nutritional，Delhi，New York
bLF-NZMP  Bovine  Bovine lactoferrinNZMP Fonterra Ltd，Auckland，NewZealand
bLF-Sigma  Bovine  Bovine lactoferrin Sigma-Aldrich CO，St Louis，MO
这些乳铁蛋白制剂大约是10-20％的铁饱和的。乳铁蛋白制剂是在在最终1mg/mL的浓度的样品缓冲液(2-mercapthoethanol、十二烷基硫酸钠和0.1％溴酚蓝)中稀释。样品然后溶解于10％十二烷基聚丙烯酰胺钠凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用考马斯蓝或银染色剂染色。
不同的乳铁蛋白制剂在其对EPEC、EAEC和志贺菌生长的抑制效应中是不同的(图10-12)。各个bLF制剂在抑制EPEC、EAEC和志贺菌的生长时是有效的。然而在各个实施例中，LF-Tatua对EPEC、EAEC和志贺菌具有最高的生长抑制效应。LF-Tatua是从全部牛奶中分离出并具有低的体细胞计数。
这种差异性可能通过其铁含量的差异解释。评估5种乳铁蛋白制剂的铁含量：bLF-BF20、bLF-BF10、bLF-Tatua和bLF-NZMP。对于每个乳铁蛋白制剂，通过测量其在280(对于蛋白质含量)和465(对于铁含量)下的OD，我们评估每克蛋白质的铁含量。根据其在6小时对于EPEC、EAEC和志贺菌的作用，比较各个制剂的铁/蛋白质的比例。如期望的，具有最高生长抑制(低OD)的制剂具有最低的铁含量。线性回归分析表明EAEC的R-平方为0.58，EPEC为0.55，志贺菌为0.81。
实施例9
这个实施例说明了bLF对于EAEC粘着的作用。在HEp-2-细胞测定系统中，评估bLF阻止EAEC粘着的能力。在细菌：靶点的比例约是100∶1下，HEp-2细胞(大约5×104个细胞/孔，在24-孔板中)的亚汇合层是用EAEC感染。来自整夜培养的细菌是在bLF下生长4小时，离心、洗涤并再悬浮于粘附培养基(DMEM1 100mM HEPES，pH7，含1％D-甘露糖)。这个细菌悬浮液，含有或不含bLF(10、1、0.1、0.01mg/mL)，采用HEp-2细胞在37℃和5％CO2下孵育4小时。然后，剧烈洗涤单细胞层以除去非粘着的细菌。通过显微术和cfu评估EAEC粘着。对于显微术而言，细胞使用100％甲醇固定，用结晶紫染色。对于cfu评估而言，HEp-2细胞是用Triton X-100处理，在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中连续稀释，在MacConkey盆中培养。
通过显微术和特征性的“聚积的砖块”聚集模式，按仪表操纵的观测器定性地评估细菌/HEp-2细胞(0-3+)的数量。缺乏bLF时，有3+细菌/HEp-s细胞具有特征性的聚集模式(图13)。在10mg/mL(图14)和1mg/mL存在bLF时，视野里无细菌。在0.1和0.01mg/mL下存在bLF时，一些细菌扩散地粘着于HEp-2细胞，但是无特有的聚集模式。为了定量地表征这种效应，测量了通过cfus粘着于HEp-2细胞的细菌的量。BLF将粘着于HEp-2细胞减少了82％和73％，对于10和1mg/mL，没有铁饱和(两者p＜0.05)。
实施例10
这个实施例说明了铁饱和度对于EAEC粘着于HEp-2细胞的影响。在10mg/mL的bLF时，EAEC的粘着几乎是完全抑制的。包含饱和量的铁不影响抗-粘着效应。在1mg/mL时，获得相同的结果。
用铁饱和的bLF降低了与HEp-2细胞的粘着，10和1mg/mL分别降低了71％和60％(对于两者的p＜0.05)(图15)。有铁饱和度或无铁饱和度的bLF制剂中的cfu不是显著差异的：7.1±5.8×104cfu/mL(bLF 10mg/mL，含有铁)比4.0±5.1×104cfu/mL(bLF 10mg/mL不含铁)(p＝0.386)；9.8±5.9×104 cfu/mL(bLF 1mg/mL含有铁)比6.3±5.1×104cfu/mL(bLF 1mg/mL不含铁)(p＝0.386)。因此，在非抑菌条件下bLF降低EAEC粘着于组织培养细胞，这种效应不是铁依赖性的。
这个说明书中引用的所有参考文献，包括没有限制，所有文章、出版物、专利、专利申请、简报、文件、报告、手稿、小册子、书、因特网邮寄品、杂志、文章、期刊等，在此以全文引入说明书作为参考。本文参考的讨论仅仅是意欲概述其作者的主张，不是承认人所有构成了现有技术。申请人保留挑战引用的参考文献的准确度和适当性的权利。
发明的这些和其他修饰和变形，可以有本领域技术人员作出，不背离本发明的精神和范围，其更特别是在附加的权利要求书中提出。此外，应当理解，不同实施方案的方面可以是整体或部分互换。进一步，本领域普通技术人员将理解上述说明书仅仅是作为实施例，不意欲限于在这样附加的权利要求中如此进一步所述的本发明。因此，附加权利要求的精神和范围不应当限于在此包含的优选译文的说明书。

Claims (63)

1.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于抑制个体中表达III型分泌系统的细菌病原体的生长。
2.根据权利要求1的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌、假单胞菌和大肠杆菌。
3.根据权利要求1的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。
4.根据权利要求3的用途，其中肠致病性大肠杆菌是大肠杆菌E2348/69。
5.根据权利要求3的用途，其中肠出血性大肠杆菌是选自STECTWO 8023、STEC HW1和STEC 306-7。
6.根据权利要求1的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是弗氏志贺菌。
7.根据权利要求6的用途，其中弗氏志贺菌是弗氏志贺菌M90T。
8.根据权利要求1的用途，其中药物中bLF的量是约0.001mg-约100g。
9.根据权利要求1的用途，其中药物中bLF的量是约0.1mg-约10g。
10.根据权利要求1的用途，其中药物中bLF的量是约10mg-约1500mg。
11.根据权利要求1的用途，其中药物是以每日一次剂量提供。
12.根据权利要求1的用途，其中牛乳铁蛋白已经从全脂奶分离。
13.根据权利要求1的用途，其中牛乳铁蛋白具有低的体细胞计数。
14.根据权利要求1的用途，其中细菌病原体的毒素产生没有增加。
15.根据权利要求1的用途，其中药物是喷雾在食品的表面。
16.根据权利要求1的用途，其中药物是与食品的成分混合。
17.根据权利要求1的用途，其中个体需要表达III型分泌系统的细菌病原体的生长抑制。
18.根据权利要求1的用途，其中个体是儿童或婴儿。
19.根据权利要求1的用途，其中个体是没有喂养人母乳的婴儿。
20.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗个体中由表达III型分泌系统的细菌病原体引起的感染。
21.根据权利要求20的用途，其中感染是选自尿路感染、新生儿脑膜炎、腹膜炎、志贺菌病及胃肠感染。
22.根据权利要求20的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌和大肠杆菌。
23.根据权利要求20的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。
24.根据权利要求20的用途，其中个体是需要预防或治疗由表达III型分泌系统的细菌病原体引起的感染。
25.根据权利要求20的用途，其中个体是儿童或婴儿。
26.根据权利要求20的用途，其中个体是没有喂养人母乳的婴儿。
27.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于抑制表达III型分泌系统的细菌病原体粘着于个体的肠道壁。
28.根据权利要求27的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌和大肠杆菌。
29.根据权利要求27的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。
30.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于引起表达III型分泌系统的细菌病原体中EspB的过早释放。
3 1.根据权利要求30的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌和大肠杆菌。
32.根据权利要求30的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。
33.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于引起表达III型分泌系统的细菌病原体中EspB的降解。
34.根据权利要求33的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自沙门氏菌、志贺菌、耶尔森菌和大肠杆菌。
35.根据权利要求33的用途，其中表达III型分泌系统的细菌病原体是选自肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。
36.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于抑制个体中肠凝集性大肠杆菌的生长。
37.根据权利要求36的用途，其中牛乳铁蛋白已从全脂奶分离。
38.根据权利要求36的用途，其中牛乳铁蛋白具有低的体细胞计数。
39.根据权利要求36的用途，其中牛肠凝集性大肠杆菌是大肠杆菌O42。
40.根据权利要求36的用途，其中个体需要肠凝集性大肠杆菌的生长抑制。
41.根据权利要求36的用途，其中个体是儿童或婴儿。
42.根据权利要求36的用途，其中个体是没有喂养人母乳的婴儿。
43.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗个体中肠凝集性大肠杆菌引起的感染。
44.根据权利要求43的用途，其中牛乳铁蛋白已从全脂奶分离。
45.根据权利要求43的用途，其中牛乳铁蛋白具有低的体细胞计数。
46.根据权利要求43的用途，其中感染是选自尿路感染、新生儿脑膜炎、腹膜炎、志贺菌病和胃肠感染。
47.根据权利要求43的用途，其中肠凝集性大肠杆菌是大肠杆菌O42。
48.根据权利要求43的用途，其中个体需要预防或治疗由肠凝集性大肠杆菌引起的感染。
49.根据权利要求43的用途，其中个体是儿童或婴儿。
50.根据权利要求43的用途，其中个体是没有喂养人母乳的婴儿。
51.牛乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肠凝集性大肠杆菌粘着于肠细胞。
52.根据权利要求51的用途，其中牛乳铁蛋白已从全脂奶分离。
53.根据权利要求51的用途，其中牛乳铁蛋白具有低的体细胞计数。
54.根据权利要求51的用途，其中肠凝集性大肠杆菌是大肠杆菌O42。
55.一种含有牛乳铁蛋白的肠用制剂，该牛乳铁蛋白已从全脂奶分离并具有低的体细胞计数。
56.根据权利要求55的制剂，其还含有酪蛋白糖巨肽。
57.根据权利要求55的制剂，其还含有至少一种长链多不饱和脂肪酸。
58.根据权利要求57的制剂，其中长链多不饱和脂肪酸是选自DHA、ARA及其组合。
59.根据权利要求55的制剂，将还含有至少一种益生菌。
60.根据权利要求59的制剂，其中益生菌是选自LGG、Bb-12及其组合。
61.根据权利要求55的制剂，其还含有至少一种益菌素。
62.根据权利要求61的制剂，其中益菌素是选自乳果糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚乳果糖、低聚木糖和低聚龙胆糖。
63.根据权利要求59的制剂，其中肠用制剂是婴儿配方品。
CNA2006800150873A 2005-05-05 2006-03-23 牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途 Pending CN101247823A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67796905P 2005-05-05 2005-05-05
US60/677,969 2005-05-05
US11/250,677 2005-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101247823A true CN101247823A (zh) 2008-08-20

Family

ID=39947854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800150873A Pending CN101247823A (zh) 2005-05-05 2006-03-23 牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101247823A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429092A (zh) * 2010-12-29 2013-12-04 Mjn美国控股有限责任公司 包含乳铁蛋白的营养组合物在支持抵抗疾病和状况中的用途
CN104994748A (zh) * 2012-12-18 2015-10-21 Mjn美国控股有限责任公司 含有乳铁蛋白的乳基营养组合物及其用途
CN106377763A (zh) * 2016-10-11 2017-02-08 方雅悯 多用途杀菌保洁喷雾剂及其应用
CN107668208A (zh) * 2017-11-13 2018-02-09 海普诺凯营养品有限公司 一种促进肠道健康的配方奶粉
TWI626893B (zh) * 2010-12-29 2018-06-21 美強生營養品美國控股公司 使用營養組成物來抑制病原體之方法
CN110655570A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法
CN111772171A (zh) * 2020-06-30 2020-10-16 东北农业大学 一种双蛋白共乳化Pickering乳液的制备方法
CN116391759A (zh) * 2023-02-17 2023-07-07 合生元（广州）健康产品有限公司 一种降低大肠杆菌引起的感染风险的组合物及其用途

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429092A (zh) * 2010-12-29 2013-12-04 Mjn美国控股有限责任公司 包含乳铁蛋白的营养组合物在支持抵抗疾病和状况中的用途
CN107668721A (zh) * 2010-12-29 2018-02-09 Mjn 美国控股有限责任公司 包含乳铁蛋白的营养组合物在支持抵抗疾病和状况中的用途
TWI626893B (zh) * 2010-12-29 2018-06-21 美強生營養品美國控股公司 使用營養組成物來抑制病原體之方法
CN104994748A (zh) * 2012-12-18 2015-10-21 Mjn美国控股有限责任公司 含有乳铁蛋白的乳基营养组合物及其用途
CN106377763A (zh) * 2016-10-11 2017-02-08 方雅悯 多用途杀菌保洁喷雾剂及其应用
CN106377763B (zh) * 2016-10-11 2020-11-10 方雅悯 多用途杀菌保洁喷雾剂及其应用
CN107668208A (zh) * 2017-11-13 2018-02-09 海普诺凯营养品有限公司 一种促进肠道健康的配方奶粉
CN110655570A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法
CN110655570B (zh) * 2018-06-29 2022-05-03 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法
CN111772171A (zh) * 2020-06-30 2020-10-16 东北农业大学 一种双蛋白共乳化Pickering乳液的制备方法
CN116391759A (zh) * 2023-02-17 2023-07-07 合生元（广州）健康产品有限公司 一种降低大肠杆菌引起的感染风险的组合物及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sonnenborn et al. The non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917–features of a versatile probiotic
Mullineaux-Sanders et al. Sieving through gut models of colonization resistance
Bernet-Camard et al. The human Lactobacillus acidophilus strain LA1 secretes a nonbacteriocin antibacterial substance (s) active in vitro and in vivo
RU2399380C2 (ru) Применение бычьего лактоферрина для создания лекарственного средства, предназначенного для ингибирования роста бактерий
Lievin et al. Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity
Beumer et al. Campylobacter jejuni non-culturable coccoid cells
ES2435065T3 (es) Cepas de lactobacilos probióticos para mejorar la salud vaginal
Roselli et al. Alternatives to in-feed antibiotics in pigs: Evaluation of probiotics, zinc or organic acids as protective agents for the intestinal mucosa. A comparison of in vitro and in vivo results
US20230226139A1 (en) Probiotic bacterial molecules and their use in methods to treat/prevent infection by harmful bacteria and to provide nutritional health
CN101247823A (zh) 牛乳铁蛋白在制备抑制细菌生长的药物中的用途
Meng et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli
Vallance et al. Enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli infections: emerging themes in pathogenesis and prevention
Ganguly et al. Effect of whey-pearl millet-barley based probiotic beverage on Shigella-induced pathogenicity in murine model
US20080063666A1 (en) New lactic bacteria useful as probiotics
US20200129571A1 (en) New strain of lactobacillus reuteri with probiotic characteristics, its use and compositions containing said strain
Roussel et al. Foodborne enterotoxigenic Escherichia coli: from gut pathogenesis to new preventive strategies involving probiotics
US20210330719A1 (en) Probiotic combination for treatment of inflammatory-related gastrointestinal disorders
US9055763B2 (en) Probiotics for use in relieving symptoms associated with gastronitestinal disorders
KR20150093172A (ko) 설사의 치료 및/또는 예방을 위한 생균제 균주들
Reid et al. Ability of Lactobacillus GR-1 and RC-14 to stimulate host defences and reduce gut translocation and infectivity of Salmonella typhimurium
Bettelheim Escherichia coli in the normal flora of humans and animals
Kassaify et al. Effect of food protein supplements on Salmonella Enteritidis infection and prevention in laying hens
Penna et al. Up-to-date clinical and experimental basis for the use of probiotics
Giacchi et al. Multistrain probiotics: the present forward the future
Sanderson et al. Colonization of streptomycin-treated mice by Aeromonas species

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20080820