CN111228482B - 一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，包括高抗体效价、对于犬细小病毒病具有良好的防治作用的卵黄抗体以及对于大肠杆菌ETEC具有良好裂解作用的噬菌体，一方面可以有效的治疗CPV感染，另一方面可以杀灭肠道内致病的大肠杆菌ETEC，避免了幼犬腹泻进展为出血性肠炎，能够有效的治疗由CPV和大肠杆菌ETEC导致的腹泻，其相比抗生素治疗，能够缩短腹泻的天数，同时提高动物的存活率。

Description

一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂及其应用
技术领域：
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂及其应用。
背景技术：
犬腹泻通常是由病毒或病菌感染导致的，其中CPV和致病性大肠杆菌感染是常见的原因。其中犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus , CPV) 感染引起的以呕吐、腹泻、白细胞减少和出血性肠炎为特征的具有高度接触性的急性烈性传染病，犬细小病毒（CPV）病自发现以来一直是危害犬类健康的最严重的传染病之一，尤其对 2～6 月龄的幼犬危害最大，发病率高达70%-100% , 死亡率高达50%。CPV 感染是全身性的，但主要通过消化道感染，途径和复制位点在口咽和鼻，通过血液循环到达其他器官，CPV 可杀死动物的肠腺上皮细胞，造成上皮的脱落、绒毛的变短，引起严重的坏死性的出血性肠炎，造成白细胞总数下降，继而引起剧烈的拉稀和吐逆，进而肠道继发细菌感染。肠道致泻性大肠杆菌依其致病机制、临床表现、流行病学特征和血清学分型，可分为５个群：肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）。产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）是幼龄动物腹泻中常见而且重要的致病菌之一，初生仔猪感染 ETEC 后，常因剧烈水样腹泻而迅速脱水死亡，ETEC引起仔猪腹泻的主要毒力因子包括具有宿主特异性的黏附素和肠毒素，通过细菌表面的黏附素吸附到宿主小肠上皮细胞，然后在小肠内定居和增殖，当由 ETEC产生的肠毒素作用于小肠上皮细胞表面时，改变小肠吸收、分泌的功能，蓄积大量水、电解质，从而导致小肠上皮细胞的代谢功能发生紊乱，导致急性腹泻、脱水，最后衰竭死亡。ETEC主要有不耐热性肠毒素（LT）和耐热性肠毒素（ST）。
对于幼犬腹泻，在临床治疗中以抗生素治疗为主，辅以疫苗接种预防，而近年来，对于动物腹泻的临床治疗工作中使用抗生素方面往往不谨慎不合理，使得大肠杆菌具有耐药性且耐药现象越来越严重，大肠杆菌病的防治越来越难，同时疫苗也不能有效的预防CPV的感染，尤其是毒株的变异等导致疫苗防治出现了不确定性。因此，在现有幼犬腹泻中，如何避免CPV感染导致的幼犬腹泻进展为出血性肠炎是亟需解决的技术问题。
发明内容：
基于现有幼犬腹泻治疗过程中存在的问题，本发明旨在提供一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，其包括高抗体效价、对于犬细小病毒病具有良好的防治作用的卵黄抗体以及本人分离的对于大肠杆菌ETEC具有良好裂解作用的噬菌体，一方面可以有效的治疗CPV感染，另一方面可以杀灭肠道内致病的大肠杆菌ETEC，避免了幼犬腹泻进展为出血性肠炎。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，其特征在于：所述复合制剂由犬细小病毒卵黄抗体、噬菌体制备而成，其中所述噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19，分类为：T4-like 噬菌体T-evens 亚群，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.17584。
所述犬细小病毒卵黄抗体是采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述犬细小病毒CPV-HuN1703株，其微生物保藏编号为CGMCC No.17583；分类命名：犬细小病毒；保藏时间是2019 年04 月24 日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所。
所述犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法包括：
（1）制备犬细小病毒卵黄抗体；
（2）噬菌体悬液的培养；
（3）药物制剂的制备。
所述制备犬细小病毒卵黄抗体的方法包括如下步骤：
（1）制备犬细小病毒抗原；
步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基；
步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞，37℃吸附1 小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养；
步骤c，接毒后，每日观察3 次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm 离心15min，收集上清液，即为病毒液；
步骤d，将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；
步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂案1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小病毒抗原；
所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/mL；
其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；
（2）免疫蛋鸡：
采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原，免疫剂量为1ml/只；首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备；
（3）从免疫鸡蛋中制备抗体原液：
将收集的免疫鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS 缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后，置于温度为54～60℃的环境中，保持8～20小时，进行病毒的灭活，获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体。
所述噬菌体悬液的培养方法为：噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19 按最佳MOI 加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19（分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli，保藏号为CGMCC No.17622，保藏时间是2019 年04 月24 日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所）培养液中，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm 摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm 的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×108pfu/mL，得到噬菌体悬液。
所述药物制剂的制备方法包括：
步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；
步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；
步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的CaCl2溶液（质量浓度为5%），充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。
本发明还请求保护所述犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂在制备用于治疗犬腹泻药物中的应用。
所述犬优选为幼犬。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，包括高抗体效价、对于犬细小病毒病具有良好的防治作用的卵黄抗体以及对于大肠杆菌ETEC具有良好裂解作用的噬菌体，一方面可以有效的治疗CPV感染，另一方面可以杀灭肠道内致病的大肠杆菌ETEC，避免了幼犬腹泻进展为出血性肠炎，能够有效的治疗由CPV和大肠杆菌ETEC导致的腹泻，其相比抗生素治疗，能够缩短腹泻的天数，同时提高动物的存活率。
具体实施方式：
实施例1：一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，其特征在于：所述复合制剂由犬细小病毒卵黄抗体、噬菌体制备而成，其中所述噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19，分类为：T4-like 噬菌体T-evens 亚群，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17584。
所述犬细小病毒卵黄抗体是采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述犬细小病毒CPV-HuN1703株，其微生物保藏编号为CGMCC No.17583；分类命名：犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）；保藏时间是2019年04 月24 日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所。
所述犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法包括：
（一）制备犬细小病毒卵黄抗体的方法包括：
（1）制备犬细小病毒抗原；
步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清的MEM（含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL），在37℃，5%CO2培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基；
步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞，37℃吸附1 小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养；
步骤c，接毒后，每日观察3 次，记录细胞病变（CPE）情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm 离心15min，收集上清液，即为病毒液；
步骤d，将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；
步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂案1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小病毒抗原；
所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/mL；
其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；
（2）免疫蛋鸡：
采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原，免疫剂量为1ml/只；首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备；
（3）从免疫鸡蛋中制备抗体原液：
将收集的免疫鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS 缓冲液（0.01M，pH7.2）和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35% 硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后，置于温度为54～60℃的环境中，保持8～20小时，进行病毒的灭活，获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体。
（二）噬菌体悬液的培养：
噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19 按最佳MOI 加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19（分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli，保藏号为CGMCCNo.17622）培养液中，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm 摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm 的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×108pfu/mL，得到噬菌体悬液。
（三）药物制剂的制备：
步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；
步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；
步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的CaCl2溶液（质量浓度为5%），充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。
本发明所涉及的犬细小病毒CPV-HuN1703株、噬菌体菌株Phage-HY19以及E.coli-HuNHY19均已申请相关专利，相关专利申请号为：（1）201911081141X，一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用；（2）2019110811354 一株猪致病性大肠杆菌菌株及其灭活疫苗；（3）2019112131637 一株噬菌体及其应用。本发明采用引述的方式引用以上发明专利申请中的全部内容。
实施例2：动物试验
取经CPV病原检测和抗体检测均为阴性、无腹泻状况的50-70日龄的杂交幼犬15只，随机分为3组，每组5只，分别口服CPV-HuN1703毒株培养液1mL，病毒含量均≥1×105TCID50/mL和浓度为108cfu/ml的E.coli-HuNHY19培养液1mL；待出现腹泻症状后，组1口服实施例1步骤（一）制备的卵黄抗体，剂量为1.0ml/kg体重，同时配合抗生素治疗；组2服用实施例1制备得到的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，剂量为0.2g/kg体重；组3按照1.0ml/kg体重口服生理盐水，记录各组服药后腹泻平均持续天数、攻毒7天后的腹泻率以及攻毒14天后的存活率，具体结果见下表1：
表1 试验期间的腹泻犬数量及14天后存活率
平均腹泻天数 攻毒7天后的腹泻数量 攻毒14天后的存活数量
组1 5.6天 2/5 4/5
组2 2.2天 0/5 5/5
组3 直到死亡 2/2（死亡3只） 0/5
基于以上试验可知，本发明的口服制剂能够有效的治疗由CPV和大肠杆菌ETEC导致的腹泻，其相比抗生素治疗，能够缩短腹泻的天数，同时提高动物的存活率。

Claims (4)

1.一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，其特征在于：所述复合制剂由犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体制备而成，其中所述噬菌体为噬菌体Phage-HY19，其保藏号为CGMCCNo.17584;
所述犬细小病毒卵黄抗体是采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述犬细小病毒CPV-HuN1703株微生物保藏编号为CGMCC No.17583;
所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒卵黄抗体；（2）噬菌体悬液的培养；（3）药物制剂的制备;
所述药物制剂的制备的方法包括：步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的质量浓度为5% 的CaCl2 溶液，充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。
2.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒卵黄抗体；（2）噬菌体悬液的培养；（3）药物制剂的制备；
所述制备犬细小病毒卵黄抗体的方法包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒抗原；步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清、含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL的MEM，在37℃，5%CO2 培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基；步骤b，取含量为5×104TCID50/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞，37℃吸附1 小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养；步骤c，接毒后，每日观察3 次，记录细胞病变情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm 离心15min，收集上清液，即为病毒液；步骤d，将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂按1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小病毒抗原；所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×105TCID50/mL；其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；（2）免疫蛋鸡：采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原，免疫剂量为1ml/只；首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备；（3）从免疫鸡蛋中制备抗体原液：将收集的免疫鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的0.01M，pH7.2 PBS 缓冲液和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后，置于温度为54～60℃的环境中，保持8～20小时，进行病毒的灭活，获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体；
所述噬菌体悬液的培养方法为：噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19 按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19培养液中，所述宿主菌E.coli-HuNHY19为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号为CGMCC No.17622；再加入CaCl2 至终浓度1mM，37℃，150rpm 摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm 的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4 溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×108pfu/mL，得到噬菌体悬液；
所述药物制剂的制备的方法包括：步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的质量浓度为5%的CaCl2 溶液，充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。
3.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂在制备用于治疗犬腹泻药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述犬为幼犬。
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