CN111100843B - 一株裂解性大肠杆菌噬菌体rdp-ec-16029的分离及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑16029的分离及应用，该噬菌体宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5‑1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科；该噬菌体在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，在pH为8.0时，噬菌体效价最高；在30‑40℃效价基本不变；可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029的分离及应用。
背景技术
近年来，我国畜牧业发展迅速，规模化、集约化畜禽饲养场呈急剧上升趋势，因此导致饲养密度过大、养殖环境下降等多种问题的出现，使致病菌大量增殖，降低动物对病原菌的抵抗力。因此，抗生素的使用已非常普遍，虽然抗生素治疗有显著效果，但是使用抗生素后动物产生的耐药性也非常显著，超级细菌的出现就是抗生素滥用产生的严重结果之一。现在各国均意识到抗生素滥用产生的问题，在发达国家无抗养殖已经开始流行，瑞典早在1986年迈出第一步，全面禁止抗生素用作饲料添加剂。丹麦也陆续禁止了多种抗生素作为生长促进剂使用，欧盟在2006年全面禁止饲料中添加抗生素。随着我国出台的有关政策，无抗养殖已经成为大趋势。早在2000年，我国就有人研究无抗养殖，通过乳酸菌技术、中兽药技术等的应用，在小范围内实现无抗养殖，近年来，采用复合微生态制剂的无抗饲料有一定的使用效果，但是由于技术不成熟、养殖效益等原因，未能大规模推广。
对于细菌性疾病，噬菌体治疗有显著效果。1896年，英国科学家Ernest Hankin首次报道了微生物中存在某种抗菌活性物质的现象。两年后，俄罗斯微生物学家NikolayGamaleya在枯草芽孢杆菌中观察到了类似现象。1915年英国科学家Frederick Twort在培养金黄色葡萄球菌的过程中，首次发现菌落上有透明斑出现，并将这一现象解释为病毒感染。1917年，巴黎巴斯德研究所的法裔加拿大微生物学家Felix d’Herelle将这些抗菌活性物质解释为由寄生在细菌中的病毒引起的，并正式命名为噬菌体，噬菌体的研究也由此开始。但是由于人们对于病毒制剂的接受度较低，随着二战期间青霉素等抗生素的出现，科学家们对噬菌体疗法基本放弃研究，开始投入到抗生素研究的洪流中，从1950年-1980年，关于噬菌体治疗细菌性疾病的研究陷入了停顿。1980年后，超级细菌的出现，再加上抗生素滥用导致的问题，人们又重新将目光投回到噬菌体治疗上。
噬菌体治疗细菌性疾病具有很多优势。例如，起效快，2-4小时就能杀死病原菌，缓解症状，改善养殖动物的精神状态；对养殖动物安全，噬菌体特异性强，只能杀死相对应的病原菌，对动物肠道有益微生物不会有副作用，因此不会破坏肠道菌群，而抗生素在杀灭病原菌的同时，会导致微生态失衡，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染；环境友好，噬菌体是宿主依赖性的，只有在宿主存在时才会发生作用，随着宿主的死亡而死亡，不会在体内残留；防止细菌耐药性，噬菌体作用机制与抗生素不同，治疗效果不受细菌耐药性的影响；基本没有副作用，长期以来，噬菌体在人体、动物、食品中的应用已经有了悠久历史，很少有严重的副作用。
本发明在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，从禽粪便中分离纯化出一株裂解性大肠杆菌噬菌体，为禽大肠杆菌的防治提供更多的可能性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株治疗禽大肠杆菌病的，安全可靠的裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，噬菌体RDP-EC-16029被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年7月10日，保藏编号为CGMCC No.18196，并提供一株生产该噬菌体的病原菌E10。
本发明的另一目的在于提供该噬菌体在治疗禽大肠杆菌病中的应用，提供该病原菌在生产该噬菌体的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，其宿主为禽大肠杆菌E10，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5-1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科。
上述一种噬菌体RDP-EC-16029的分离方法，包括宿主禽大肠杆菌E10的分离和噬菌体RDP-EC-16029的分离。
优选地，宿主禽大肠杆菌E10的分离步骤如下：
从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基上划线，于37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，37℃、200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液，然后经16sRNA分子鉴定和血清型鉴定；鉴定完成后于-80℃保存。
优选地，噬菌体RDP-EC-16029的分离步骤如下：
（1）粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；
（2）制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；
（3）噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主大肠杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，即得。
优选地，该噬菌体RDP-EC-16029的保藏方式为，将噬菌体增殖液与60%的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。
优选地，噬菌体RDP-EC-16029对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源。
优选地，噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。
优选地，可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，其最佳感染复数为0.1。
本发明的有益效果体现在：
（1）本发明发现并分离了一种禽大肠杆菌E10，并以该大肠杆菌E10为宿主分离得到了噬菌体RDP-EC-16029，该噬菌体RDP-EC-16029对养殖环境中禽大肠杆菌E10具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽大肠杆菌E10的防治提供了噬菌体来源；
（2）在本发明中，噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性；
（3）本发明得到的噬菌体在30-40℃效价基本不变；可高效感染宿主菌禽大肠杆菌E10，其最佳感染复数为0.1；
（4）通过对本发明分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药物提供理论指导意义。
附图说明
本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：
图1为电镜观察本发明分离得到的噬菌斑的示意图；
图2为本发明噬菌体一步生长曲线实验的示意图；
图3为本发明噬菌体pH稳定性实验的示意图；
图4为本发明噬菌体对宿主裂解实验的示意图；
图5为本发明噬菌体热稳定性实验的示意图；
图6为本发明噬菌体稳定性遗传实验的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1 致病性禽大肠杆菌E10的分离及其鉴定
从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基（麦康凯琼脂）上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，于37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性大肠杆菌，将其命名为E10，于-80℃冰箱中保存。
实施例2 噬菌体RDP-EC-16029的分离及鉴定：
（1）粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；
（2）制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；
（3）噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主大肠杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，即得。RDP-EC-16029在双平板形成的噬菌斑直径在0.5mm-1mm。
噬菌体RDP-EC-16029的保藏方式：将噬菌体增殖液与60%的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。
实施例3 噬菌体的电镜观察
取 20 μL 含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀 15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色 10 min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。
噬菌体RDP-EC-16029有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。
噬菌体RDP-EC-16029全基因组测序及分析： 采用Illumina TruSeq™ Nano DNASample Prep Kit方法构建文库；具体步骤为：
1. 以1μg DNA起始量建库；
2. Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；
3. 补平、3’端加A、连接index接头（TruSeq™ Nano DNA Sample Prep Kit）；
4. 文库富集，PCR扩增8个cycles；
5. 2%琼脂糖胶回收目的条带（Certified Low Range Ultra Agarose）；
6. TBS380（Picogreen）定量，按数据比例混合上机；
7. cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；
8. Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。
实施例4 最佳感染复数的测定
按照感染复数为100 、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。具体参见表1。
表1 最佳感染复数的测定结果
由表1数据显示，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-EC-16029的最佳感染复数为0.1。
实施例5 噬菌体生长曲线的测定：
取对数生长期的大肠杆菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种大肠杆菌E10和噬菌体RDP-EC-16029，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。其中，平均裂解量 = 暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图2所示。噬菌体感染宿主菌后的30min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约30min，感染后40-120min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60 min。通过计算，噬菌体裂解量约为169 PFU/感染细胞，表明噬菌体具有极强的裂解和复制能力。
实施例6 噬菌体pH稳定性的测定
用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成PH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×1010pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。结果如图3所示。噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0−9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0 时，噬菌体效价最高。随着pH值的升高或降低，噬菌体的滴度下降明显；表明噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。
实施例7 噬菌体对宿主的裂解试验：
在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线；具体为，将培养6h的宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，37℃200rpm振荡培养2h（OD约0.15，约5.0×108cfu/mL）将菌悬液分装在4个灭菌的锥形瓶中，以最佳感染复数，向其中3个加入噬菌体增殖液0.2mL(约2.5×109pfu/mL，经0.22μm膜过滤），同时以不加噬菌体的作为对照，取其平均值。结果如图4所示。
由图可知，大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029加入到宿主菌E10菌悬液中，作用40分钟后出现一定的裂解效果，约40分钟后，OD600值开始下降，持续作用至180分钟，210分钟后混合菌液开始变得浑浊，持续作用6小时后，混合菌液基本与对照组OD600值相同，由于前30分钟，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，OD600在在前30分钟内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在40分钟后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以OD600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用3小时后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌群交替。因此，为获得高效价的噬菌体，应控制混合菌液在达到最高清晰度至返浊现象开始之前这一时间范围内，从而避免对噬菌体效价的影响。
实施例7 噬菌体热稳定性试验：
将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图5所示。
由图可知随着温度的升高和时间的延长，噬菌体的活性越来越低，说明RDP-EC-16029对温度比较敏感。
实施例8 噬菌体的稳定性遗传实验：
将RDP-EC-16029连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-EC-16029和E10，每代培养时间6h，然后铺双平板，将RDP-EC-16029连续传29代后，测定其效价。结果如图6所示。
由图可知，从第1代至第6代，效价逐渐下降，在传至第6代时效价最低，然后7-29代逐渐趋于稳定，说明 RDP-EC-16029遗传稳定性较好。为提高其效价，生产中用到的噬菌体选用第8代以后的。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
序列表
<110> 青岛润达生物科技有限公司
<120> 一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029的分离及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43219
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atacgcaaaa agcgacatta cgtccatgcg tgaagtgtat aagaaaatgc ctaagtgggg 60
gaattctgag ttcgaagacc gcgtgctgca cttagaccag gtgattaatg accgaggatt 120
taaggttgat gtggcattgg cggaagcagc gattgaagca gtcacgcgcc ataaagaaga 180
gttacaggaa gaagcccaac gtaaatatgg cggttcacta accggcaaag acttcttgcc 240
tattttacag gaactagcac cggcacaccg catccacaac gcacagaagt cgacgcttaa 300
cgacttgctg gcagatgagg atttaccgga cgacgcccgc actattatcg agatgcgtct 360
cggggctgct tccaccgcat cgacgaaata cgcgccgttg ctgttaggtc gttcttccga 420
tgaccgccgt cgaggttgtc tgcaatacgg cggagcgaag cgaacactgc gatgggccgg 480
gaaaggtttt cagcctcaga acctggcgcg cggatattat cacgacgatg aacttgataa 540
gggtatttcc gcattactta aaggccgtgc acaccgccgt tttgatgtgg ccaagctaac 600
ggcatccact gtccgcagct gtataatccc ggaagacggg tgtaagtttg ttgttgcgga 660
ctattccaac gtagaaggcc gtggtttagc gtggctggcg ggcgaagaaa ccgcgcttga 720
tacgttccgc gccgggctgg atatttactg cgtaacggcg ggtaagatgt ttggcatgga 780
ccccgacgat attaagaaag aacgtaaaga cttacgccag ataggtaagg cttgccttca 840
ccgtcatacc caagttttga ccgatggtgg atttaaggat attatggcgg ttacatcagc 900
agataaagta tggagtggtg aaaaatgggt gaatacaaaa ggcgcgcacc ttatggggtg 960
gaaaccggtg ataaatgtgg acggggtact aatgaccgaa gaccacaaaa tcttgacgca 1020
ttcctggaag caggcaaagc aactcgtttc aaacaaatat atgatggacc gcgccctgga 1080
gataggtatg gacgcctggt tatcctgcgc gagttaccaa aacgacaagg ccaaagacag 1140
ctactcgtcc aatgtgattg cggagagatg ccggggcggg tctattatga caatgtcagg 1200
gcaggtaaaa ccactcaatg caaccgttgc gcccttgaag caacaaaaaa atatcgtaaa 1260
caatatttct gctacgaaga cgcaatgccg gacgacgagc acagaacgcg attactcaac 1320
cgattatcag cggcgatatc acgaacaaca atccctggaa acaagagcta taaaaactac 1380
ggggccaggg gtatcacggt atttgaccag tggagggtcg ataaaaggtc gtttcttaga 1440
tatgttcaaa ctctggaagg ctgggatgac ccaaacctcg aaatggaccg aatcgacaca 1500
gacggtaact acgaacctgg aaacattcgg tttgtcagcc gttctgaaaa ctgccgtaac 1560
agacgtcgaa tacctgagct tcaacgaaag tatgatgcag ccgttgcccg cattgctgag 1620
cttgaacggg aaattaacct actgcgagcc agtttacgac ctgattgatg tggaagacgg 1680
caaccgtttt cttatagcct cagactcggg ctttcttgtg gcgcataact gcgaactggg 1740
cctcggctac gagggaggtg tcggagcgtt cgttacgttt gctaaaaacc tgggtcttga 1800
ccttattgag atggcaaaaa caatggacgg gactttcccc gaccacatct gggctgctac 1860
tgcacgtggg tatgagtggg cgcgtattca ggaagccaag agaccaccgc atcccggtga 1920
aaaggatgac aggccgtcgt atattctgga caagaaggtg tggcgcacat gtgacgcgat 1980
caagcgtatg tggcgtgagt cacaccctga aacagtagcg ttctggcgcg accttaaaga 2040
cggaatttta gctgctgttc gtaatcctgg tcgtgaattt tgggctgggg cacacttgcg 2100
ccggaatggt gaaagggcta tccgtatatg gcgtaccgta gaatttgatt cgtcgggcag 2160
gaaggttcct ggctggtggt tgtgtatgga gttgccgtca ggccgtatcc tatcgtatcc 2220
gggaatcggc gttagtgtga caaaggaaac agacgaagac ggacggataa acaccaatgt 2280
aagaattaag taccagggtg agaaccagtt aacacggcaa tggaccaccc tgtacacaca 2340
cggcggaaag gcttgtgaaa acattgttca ggcgttgtgc cgtgacttat tggcctatgc 2400
gatgcttaat gtggaagccg gtgggtatcc aatagttctt tctgttcacg atgaactggt 2460
atgcgagact ccggatactc cggaatacag tgtggctgaa ctggaaaaat taatgtgtgc 2520
attgccagaa tgggctgatg gttttcctct tgtagcggaa ggtgcggagt taaaacggta 2580
tgctaagtaa actgattatt tattatttcc gggaagaaga ctgtcgaatc tgtcctcgct 2640
gcggtattga acacacgaaa cgtgaggggt gcatagatga gtactcctga agggcgcgtg 2700
caaaaatacg caaaggagcg atttgaggcc ctgggtggcc tcgttcggaa actttcctat 2760
gaggggcgct ccggtgctcc tgacctgttg gttgttcttc ccggtggtgt catctggttc 2820
gtcgaggtga agaaagacga aagcacgaag ccagacccgc accagttacg ggagcacgag 2880
aggatgcgta agcgaggtgc aaatgttttt gttgttgggt ctaagaaaca ggttgataaa 2940
ttaatagaac actattatat ttagttcaca ccaaacacaa ataaggaatt gagaaatgaa 3000
atacgaatat gaccgcaaac cagcacgtga catcgtaccg ggtgacatga ttttcaacgt 3060
taggacacgt agccctgttg ccgttgatac ggtgttcgtc gagtcgaacg gtaaactggt 3120
tatcgaagac gtaaccggta acgttacggc gttcgggcgg aaggaattgg tgctggtggt 3180
gaaatgaaat gagtaaattc actagaagac ccgatattga ggaggcgaaa cgtcttctta 3240
actatgaccc cgaaacaggt atattcacac gaaaagtaag cataaaaggg agaaatgctg 3300
gggaggtagc cggagggcca aacgacaaag gatacatagt tattacagtc tccggtgtaa 3360
gaataaaagc ccaccatctg gcatgggctt tcgtctacgg ggaatatcac aatggtgagc 3420
ttgaccataa agaccgtaac agggccaata acgccataaa taatataagg cctgcaacaa 3480
ggagccaaca gattcagaac cgcgactgca cctcgcataa caccagcggc gcgatagggg 3540
tttaccaaat accatctggc aggtggcgcg ccagaatagg cgtcaataac agatacatcc 3600
accttggcta ttttgacact atagaagaag cgtcgcgcgt ataccaaaga gccgcagaaa 3660
tatacttcgg ggagttcaag gcatgagtaa gtttaggcgc agggaatatc agaaaataat 3720
gacgtcgttt atgctacagc accaacgttg caatatctgg tgcggtatgg gcggcggcaa 3780
gtgcctgaaa cgcgggactg aagttattat gtttgacggc acaaccaaga aagtagaaga 3840
cgttatagtc ggtgacgttc ttatgggccc ggattcaacg ccgagaaatg tactttctct 3900
cggtagaggc cgggagatga tgtatgaggt taaaccgcga aaaggagagt cttatactgt 3960
caacgaaagc cacatactat ccctgcgaac tactacaggg atagcaaaag gttcatggcc 4020
agataatacc gttttcgaca taagcgtccg cgactggctt aagttgccga aatatgtaac 4080
cgggcctaat gggtatctta agggttggcg ggtacctgtc gattttacaa ggaaagagca 4140
ggacgaggct ttattgccac cgtaccttat ggggctatgg ctgggcgacg gtacttcgtc 4200
gtctggggcc ataacatcag gagagaacga aaaggaaata agggcgtatc ttgagtcgta 4260
cgcagcacgt aatgggatgc aaatacgaaa agaaggactt acatggagta tatctcacgg 4320
caacacaggt cataagaagc acgggtttac gcacgcgctg aaatcggcgg gtgtcctgaa 4380
caataagcat ataccgcaca attacaaatg cggcgaccgg caacaacgtt tagaattgct 4440
ggcggggctt cttgatagtg acggttattg tgatttgtct aaagcaggtt ttgactggat 4500
ttcggtaagc gagcgactcg ctgatgattt ttgctatcta tgccgttctc ttggtttcgc 4560
cgcttacaag aagaaaactc gtaagcgttg cgcaaacact gatgtttggg gggattactt 4620
ccgcgtatcg gtatcaggcg atttttctga ggtgcctttc gtgcgcggcc gccaccagaa 4680
tttaccgaag cgtaatatta ataaaaacgt acttaacgtc gggatagaat ctataacccc 4740
ggtcggtgta gatgattatt acggcttcac catcgacggt gaccaccggt ttctattagg 4800
tgacttcacc gtaacgcaca acacaagctc gacaatgtgg gtgcttaacc ggttattccg 4860
taatggtcag cttaatgatg acgaccgcgt gttaatcctc gccccgttgc gcgtcgcgtc 4920
gggtacgtgg ccggcggaac aagagaaatg gggtttcccg tgccttcgtg tcatcgatgc 4980
tacgggttcg gagaagcgcc gcatagcggc gctggagtcg gacgctaatg tggtgtgcac 5040
taactacgaa gttatcgagt ggcttattga ttactacggc aaagacgact ggccttttac 5100
cgttatcgtt gccgatgaga gcacgaaact gaaatcgttc cgtagccgtt ctggcgggag 5160
caagagggcg agggcgctta gtaaggtggc gttcggtaaa gttaagcgtt tcattaacct 5220
gaccggtaca ccatcaccta acggcctcaa ggacttgtgg ggtcagaact ggttcatcga 5280
cgcaggtgaa cgccttgggt cttcatacac ggcctttacc gatagatggt ttaactcggt 5340
acagaaaggc aaatctgcga tggcgcggga gtaccatgct cgcccaggcg cggataacga 5400
gattcaccag aggatgaagg acattagtct cacgattgac gccgctgagt ggttcggttg 5460
tgaagcgcct attatagtgc cggttgaaat cgacctgccg aagaaagcgc gtcaagccta 5520
catcgatatg gaggagaagt tattcgcgga actggagagc ggagaagttg aagcggctaa 5580
cgccgccgct aaaacggcta agtgcttgca gattgcttcc ggtgccgtgt atgtgtcggg 5640
gccggatggt gaagcaacga aagactggga gaaagtgcac gacgcgaaac tcgatgcgtt 5700
agagtccatt gtcgaggagt tgcagggtgc gccgctgctg gtggcctatc agttcaagca 5760
cgaacttgag cgcattctta ggcgattccc ccaggcgcag gcgtttgcga aaggtgctaa 5820
gggtaataag cagatggaat cttggaaccg cggggaaatc gagattttgt gcgtgcaccc 5880
tgcatcggcg ggccatggtt tgaatttaca ggacggcggg catcatctgg cgtttatttc 5940
gcaaggctgg aacctggagc actatttgca ggttgtcgag cgtataggtc ctgtacgcca 6000
gaaacaggct ggccacgagc gtccagtgtt cctgtatcac atagtcgcta aagacacgct 6060
ggatgaggtc gttgccgcgc gtacggacga gaaaaaatct gtccaggaag agttgcttaa 6120
ttatatgaag agacgaggta agagatgaat aatgagtttg atatcgacgc ttgcaacgaa 6180
ttgataaaag acgccattaa ttcccgcgag caacttctag ctatgcaatt aaagcgagaa 6240
ataaaacgta tcagggaact cgaagaagag gttttacggc tacggcagca aagagacgct 6300
gctaacgcgc aacttgactg gctactagaa caacaggaag ttgacaaaga gaggggcgct 6360
aaatgaaata ctcaattggt gcgaaatgct ttttaatagg ctacggattg gctgcggtcg 6420
ctttacttat cgctgctgtg gttctgttat cataaattaa ggccccttac agggccttta 6480
ctatttatgc caaagttaat cttgtatagc ttccatcggc ccgcttaact aacgccttaa 6540
ggctatcgcc ttccagatac agtgatatag ccccgttatc cctgacagcg ttgtctggta 6600
ggacggtcac cgctaccggt atctcaacag cacgataatc gcccctgttt atttttaatg 6660
acacggcatc aggcaaggac cccgcaatag cggtaatttc ggtccatgct gaaccagaac 6720
ctggcccgcc gttaatgtgg gagtacacag aaccgctatc aagagttttt gacagtttat 6780
gtatccgtaa ccgcagcgcc gcagaatcat tattgaaact gtttatgcga gagttaccaa 6840
gaccttcctc catcaaattg gctacgttaa tccttgaggg gtctacgaag ccggttatcc 6900
cacttaccgt ggagttaggc gcgtctatcg taagaccctg ttcggtagtt gaacggatgc 6960
cgaccaaacg aaggccgttt acacggcagg cccctgagat atatatctgg ttcgcgggga 7020
agtttttagt attggtgtcg attattgcga tattagtgaa tactgtttcg tgggcaagaa 7080
tataagcccc agaaccagcg caatcctcga cggttatgtt agagacatac agacctttcc 7140
catccatgcc gaaacctacc cccagcgaac ctctaacaaa tagattgtct atcaaatggt 7200
ttaatgggag catatgtacc gggtactgag aaatggggaa atcccctggg cggtcatctt 7260
cggggttcat gtcagtatct gcgcctaaat cgaagccgtc ccatacaggg tatagcactg 7320
ctgaatcccg gaattgcagg ttgtagttac gagaggtcgt agaacctacc gtaccttgcc 7380
acgtcttaac accactttcc cccgcacgat acgaagtaaa cccgatgacc ccgccatcgc 7440
gcgcgaaacc gccattgttt cgtaagaatt gagcgctact taccgaaccg taacttgtgc 7500
gcccgccaat aacatagtta cccttgcccc aatcgccgct caggttttca aaggtaatta 7560
cgccatcttt tccgccgctc gggttgtcag cgtctaccat cttacagaaa tggcatccgc 7620
ggaacaggaa acacgccata agaccactcg cccggtgaac ctcgacgcct gtacattccc 7680
gaatttccag ggtagaagat atgctttgcc ctttagcttc cggagggaga agggattcta 7740
taccaggaaa cttggcataa tcgtttactg tcggctggta tccatctgtt ttagactgtt 7800
taagtgtggc cacgattgcc gcggggtcgg ttatccactg attatcgtcg gtccacggtt 7860
taatcaccca cggcgttgta gcactctcca taaagggggc tattacaatg gaacctttac 7920
ctaattgcgt aaataccagg tttccgtcgc cgataaactt cgctttacag tcgatggtca 7980
gggtcttccc gccgaagtta acggtctcat tgttgctgaa gttgtaatcg cggtcgataa 8040
gaacactatc aacggcggcg tctgccaatt gttgtaacgt agtaaagtca gacagcttaa 8100
cggagtactt aaatttctta tccgcttccg cacggaaggt gatatctccg aacgcgtccc 8160
aagcggaatc cgaaatgccg cctgtcgcaa gaggtgtcga cgccgcaggg ataactttcg 8220
gcagggagcc acgccatgcg tagtagttac cgtctccacc atcttctttc gaccaaagaa 8280
cagctttatc tgcgtcgttt acgccgagag tacccccggt cgtaaaatta aaagatgccg 8340
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ggttagtggc gtagtcgata tctgcaccgc cggctacacc gccttgttta ccggtgataa 8460
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catcagatac accaacaata cgacgtttaa ttacatcaac catttttatc ctcctcagga 22320
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Claims (1)
1.一株裂解性大肠杆菌噬菌体RDP-EC-16029，该噬菌体在双平板上能形成直径在0.5-1毫米的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约120nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科,保藏编号为CGMCC No.18196；
噬菌体RDP-EC-16029在pH6.0-9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为8.0时，噬菌体效价最高；可见噬菌体RDP-EC-16029能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。
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Denomination of invention: Isolation and application of a lysogenic Escherichia coli phage RDP-EC-16029 Effective date of registration: 20221212 Granted publication date: 20201124 Pledgee: Qingdao Jinling Shengtai Financing Guarantee Co.,Ltd. Pledgor: QINGDAO RUNDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022370010165 |