CN112063600A - 源自鸡蛋的热启动酶及阻断活性的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源自鸡蛋的热启动酶及其阻断活性的方法，所述的热启动酶，包括Taq聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。本发明选择衍生自鸡蛋的多克隆抗体IgY结合Taq聚合酶，实现了对于热启动IgY不会抑制聚合酶活性，而是可逆地阻止它，且价格低廉，适于大面积推广。

Description

源自鸡蛋的热启动酶及阻断活性的评价方法

技术领域

本发明涉及一种源自鸡蛋的热启动酶及其阻断活性的评价方法。

背景技术

热启动可以大大提高PCR的特异性，灵敏度和产率。在室温下制备反应混合物时，PCR中会发生非特异性扩增，因为Taq聚合酶具有活性，引物可以非特异性杂交。 热启动Taq聚合酶在室温下保持无活性，并在95°C加热后被激活，从而防止了非特异性扩增。 针对Taq聚合酶的单克隆抗体是用于将常规Taq聚合酶打开为热启动试剂的第一线试剂。

蛋黄衍生的抗体（IgY）是众所周知的最便宜的来源，其质量与哺乳动物IgG抗体相同，并且比过去有一些突出的优势。 与IgY的开发和使用相关的这些优势包括对哺乳动物抗原的更好的免疫应答，与持续效价的更高亲和力，无创采样，简单且低成本的分离过程，高产量和可扩展的生产性。 自1996年以来，IgY技术已成为描述IgY生产和使用的国际公认术语。 欧洲替代方法验证中心（ECVAM）研讨会建议使用IgY代替哺乳动物IgG，以最大程度地减少有创抗体采样引起的痛苦，并促进鸡IgY的更广泛实施，因为这种方法满足了科学和商业利益 以及对动物福利的关注。

Taq DNA聚合酶的单克隆抗体是聚合酶链反应（PCR）中的核心酶，在环境温度下会使其失活。 在随后的加热中，反应混合物引起聚合酶的活化，并且扩增以特定且有效的方式进行。 这就是抗体介导的所谓热启动PCR。 对于复杂DNA背景中低拷贝数模板的可靠检测，它尤其有用。 但是最近的研究表明，许多商业上以“热启动”形式销售的Taq酶制剂在热激活之前就表现出聚合酶活性。 许多热启动酶不能按预期发挥作用具有深远的意义。

如何生产和评估一种价格低廉、有效的热启动酶是本领域技术人员研究的对象。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，通过使用单克隆抗体作为热启动试剂来解决上述问题，并提出研究使用多克隆抗体的可行性。 选择的模型是衍生自鸡蛋的多克隆抗体IgY。

一种源自鸡蛋的热启动酶，所述的热启动酶，包括Taq 聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。

一种源自鸡蛋的热启动酶制备方法：

步骤一：将两只20周大的母鸡关在笼子里，进食和饮水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中进行混合，形成混合液，混合液在相同体积的弗氏完全佐剂（FCA）中乳化，用于首次针对母鸡注射，而后混合液在相同体积的弗氏不完全佐剂（FIA）中乳化又进行两次注射，实现免疫接种；

步骤二：每隔10天进行步骤一条件下的注射；

步骤三：在3个月内每月进行一次弗氏不完全佐剂（FIA）的免疫接种，每天收集鸡蛋；

步骤四：完成步骤三的鸡蛋黄中分离IgY的第一步涉及从脂质和脂蛋白中提取可溶性蛋白，该方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果胶水溶液中通过5倍稀释的蛋黄沉淀不溶物；

步骤五：通过用35％（w / v）硫酸铵混合经过步骤一的蛋黄沉淀不溶物，饱和沉淀出水溶性蛋白质（包括IgY）

步骤六：为了亲和步骤二的水溶性蛋白质，以琼脂糖凝胶4B为基质，以Taq聚合酶作为配体相结，获得热启动酶。

作为优选方法，以0.1 ml / min的流速将总水溶性蛋白质在PBS中稀释至1.0 mg/ ml，并加到在磷酸缓冲盐溶液中平衡的以琼脂糖凝胶4B为基质的Taq聚合酶形成的亲和树脂，直到流槽A280的光密度达到基本水平，获得热启动酶。

另一种优选方法为，用0.1 M甘氨酸缓冲液（pH2.3）洗脱结合的热启动酶并分离，加入相同体积的0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 8.0）中和洗脱的热启动酶，合并洗脱的分离，并在磷酸缓冲盐溶液中透析过夜获得热启动酶，获得高纯度的热启动酶。

我们进行了鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）的亲和纯化，并获得了多克隆热启动抗体（Hot start IgY）。 特异性抗体的产量为每个鸡蛋0.2 mg，或总卵黄抗体的0.33％。 开发了用于实时测量和热启动IgY活性评估的协议。我们发现，热启动IgY可以可逆地阻止42℃下的Taq聚合酶活性，并且对变性后的Taq聚合酶活性没有负面影响。 我们估计0.2微克的热启动IgY有效阻止了Taq聚合酶的1.5 U活性。 因此，我们配制并冷冻干燥了热启动酶，并在实时PCR中进行了测试。

一种源自鸡蛋的热启动酶阻断活性的评价方法：

步骤一：配制两种预混液：热启动酶 PCR预混液和逆转录抗体PCR预混液，每个预混液均包含Taq聚合酶缓冲液，Taq聚合酶缓冲液包括50 mM Tris-HCl，pH 9.9，50 mM KCl，3 mMMgCl2，1 mM DTT，1 mM EDTA，将两种预混液用5％海藻糖和0.5％聚乙二醇作为冷冻保护添加剂冻干；

步骤二：使用从疫苗菌株中分离出总猪瘟病毒，逆转录抗体 PCR预混液首先使用来自鼠白血病逆转录酶和随机六聚体引物3μg在Taq缓冲液中于42℃进行20分钟的逆转录PCR5μl猪瘟病毒（20 ng），然后在95℃失活10分钟，使用以下循环条件：95℃ 2分钟；在20μl热启动酶主混合物中扩增5μlcDNA（1000、250和62个拷贝），进行40个循环，40个循环包括95℃热启动持续10 s和58℃持续20 s，在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据；

步骤三：对于热启动酶 PCR预混液，将5μl猪瘟病毒直接加入一管抗体PCR Master Mix中，并在以下条件下运行：42 ℃进行20分钟； 95 ℃ 2分钟； 40个循环包括95 ℃持续10 s和58 ℃持续20 s，在每个循环之后在580℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据。

附图说明

图1为本发明中通过间接ELISA检测到蛋黄中存在抗体示意图；

图2为本发明中通过10％SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）估算IgY纯度示意图；

图3为本发明中ELISA检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，附图和描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

一种源自鸡蛋的热启动酶，包括Taq 聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。

一种根据权利要求1所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法：

步骤一：将两只20周大的母鸡关在笼子里，进食和饮水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中进行混合，形成混合液，混合液在相同体积的弗氏完全佐剂（FCA）中乳化，用于首次针对母鸡注射，而后混合液在相同体积的弗氏不完全佐剂（FIA）中乳化又进行两次注射，实现免疫接种；

步骤二：每隔10天进行步骤一条件下的注射；

步骤三：在3个月内每月进行一次弗氏不完全佐剂（FIA）的免疫接种，每天收集鸡蛋；

步骤四：完成步骤三的鸡蛋黄中分离IgY的第一步涉及从脂质和脂蛋白中提取可溶性蛋白，该方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果胶水溶液中通过5倍稀释的蛋黄沉淀不溶物；

步骤五：通过用35％（w / v）硫酸铵混合经过步骤一的蛋黄沉淀不溶物，饱和沉淀出水溶性蛋白质（包括IgY）

步骤六：为了亲和步骤二的水溶性蛋白质，以琼脂糖凝胶4B为基质，以Taq聚合酶作为配体相结，获得热启动酶。

第一次免疫（15 dpi）后十五天观察到针对Taq聚合酶的IgY抗体的发展，并在22dpi达到最高水平。 在整个免疫过程中，通过间接ELISA检测到蛋黄中存在抗体如图1

根据图1可以看出母鸡能很好地耐受免疫，第一次免疫后最多4个月便产卵，未观察到卵的产量下降，这证明Taq聚合酶作为抗原无毒且不影响卵的生产率。

步骤五、六两步IgY纯化方案使我们能够以高收率和纯度从蛋黄中分离IgY。 每个鸡蛋中分离出的总IgY的平均产量高达60.0±5.0 mg。 在还原条件下，通过10％SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）估算IgY纯度如图2所示。

结果显示，IgY抗体包含27kDa和65kDa蛋白的两个主要条带，分别对应于轻链和重链。

为了亲和纯化分离的IgY，我们已经合成了以琼脂糖凝胶4B为基质的亲和树脂，以及Taq聚合酶作为配体。在亲和树脂的合成过程中，我们测量得到了环氧活化的琼脂糖胺胺化后的氨基含量，该组分组成接近24μM/ g的湿重凝胶。我们发现2.5 ml的亲和基质使我们能够分离接近2.0 mg的热启动酶。

作为优选结构为了亲和纯化分离的IgY，我们已经合成了以琼脂糖凝胶4B为基质的亲和树脂，以及Taq聚合酶（大亚基，KlenTaq聚合酶）的核酸外切酶缺陷型作为配体。 我们选择KlenTaq用于亲和树脂合成，以仅分离聚合酶结构域特异性IgY，从而增加封闭酶活性中心的可能性。 在亲和基质的合成过程中，我们估计了环氧活化的琼脂糖胺胺化后的氨基含量，该组分组成接近24μM/ g的湿重凝胶。 我们发现2.5 ml的亲和基质使我们能够分离接近2.0 mg的Taq聚合酶特异性抗体，其特异性已通过ELISA证实如图3所示。

一种根据权利要求2所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法：以0.1 ml / min的流速将总水溶性蛋白质在PBS中稀释至1.0 mg / ml，并加到在磷酸缓冲盐溶液中平衡的以琼脂糖凝胶4B为基质的Taq聚合酶形成的亲和树脂，直到流槽A280的光密度达到基本水平，获得热启动酶。

一种源自鸡蛋的热启动酶制备方法：用0.1 M甘氨酸缓冲液（pH2.3）洗脱结合的热启动酶并分离，加入相同体积的0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 8.0）中和洗脱的热启动酶，合并洗脱的分离，并在磷酸缓冲盐溶液中透析过夜获得热启动酶。

本发明通过间接ELISA证实本发明源于鸡蛋的IgY对Taq聚合酶的比活性。用在50mg碳酸氢钠缓冲液（pH 9.6）中的100μl Taq聚合酶（5μg / ml）涂布高结合力聚苯乙烯Stripwell Microplate（Costar，USA）孔，并在4 ℃下孵育过夜。在用含0.05％（v / v）Tween 20（PBS-T）的PBS洗涤（HydroFlex微孔板洗衣机，瑞士Tecan）三次后，非特异性结合位点被PBS中的5％（w / v）脱脂奶粉封闭-37 ℃下1小时。洗涤3次后，将100μL的PBS-T中的总IgY（1μg/ mL）作为一抗加入孔中，然后在37 ℃下孵育1小时。再次洗涤板，并在37 ℃与100μLHRP标记的山羊抗鸡IgG（1：6000）作为二抗孵育0.5 h。最后，在室温下，以100μL3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（1％TMB，w / v）为底物检测活性15分钟。通过加入50μL2 mol/ LH2SO4至终止反应。在微量滴定板读数器（Infinite F50，Tecan，瑞士）上测定450nm处的光密度（OD）

为了测试对Taq聚合酶的IgY阻断活性，我们使用了“ EvaEZTM荧光聚合酶活性测定试剂盒”（美国Biotum），并使用了我们的修改说明手册。 将不同量的IgY（0.05-0.2μg）与1.5U Taq聚合酶在10μl2x Taq缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.8，100 mM氯化钾，0.2 mM EDTA，2 mM 二硫苏糖醇）中预孵育15分钟 ）在室温下。 反应混合物用0.5 x Taq缓冲液（10 mMTris-HCl，pH 8.8，25 mM KCl，0.05 mM EDTA，0.5 mM DTT）稀释十倍至Taq聚合酶终浓度为12 mU /μl和5μl（75 mU 将Taq聚合酶用于荧光聚合酶活性测定，该测定使用第一步实时PCR系统（Applied Biosystem）。热循环在42℃下进行15分钟，然后在95℃下进行2分钟，最后在72℃下进行10分钟。 在FAM通道（发射520 nm）上于42℃和72℃收集数据。

一种源自鸡蛋的热启动酶阻断活性的评价方法：

步骤一：配制两种预混液：热启动酶 PCR预混液和逆转录抗体PCR预混液，每个预混液均包含Tax聚合酶缓冲液，Tax聚合酶缓冲液包括50 mM Tris-HCl，pH 9.9，50 mM KCl，3 mMMgCl2，1 mM DTT，1 mM EDTA，将两种预混液用5％海藻糖和0.5％聚乙二醇作为冷冻保护添加剂冻干；

步骤二：使用从疫苗菌株中分离出总猪瘟病毒，逆转录抗体 PCR预混液首先使用来自鼠白血病逆转录酶和随机六聚体引物3μg在Taq缓冲液中于42℃进行20分钟的逆转录PCR5μl猪瘟病毒（20 ng），然后在95℃失活10分钟，使用以下循环条件：95℃ 2分钟；在20μl热启动酶主混合物中扩增5μlcDNA（1000、250和62个拷贝），进行40个循环，40个循环包括95℃热启动持续10 s和58℃持续20 s，在每个循环之后在580℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据；

步骤三：对于热启动酶 PCR预混液，将5μl猪瘟病毒直接加入一管抗体PCR Master Mix中，并在以下条件下运行：42 ℃进行20分钟； 95 ℃ 2分钟； 40个循环包括95 ℃持续10 s和58 ℃持续20 s，在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据。

对于功能性抗体测试，我们基于“ EvaEZTM荧光聚合酶活性测定试剂盒”（美国Biotum）进行了改进，开发了一种简单的方案，主要功能包括实时监测Taq聚合酶活性，同时在不允许的温度下用亲和纯化的IgY阻断在最初的15分钟内达到42 ℃，然后在95 ℃下“热启动”变性2分钟，最后在72 ℃的可接受温度下测量聚合酶活性10分钟。我们已经滴定了不同数量的IgY，它们在42 ℃时完全阻断Taq聚合酶的活性，而不会影响热启动后的聚合酶活性。发现0.2μg热启动IgY有效阻断了Taq聚合酶的1.5 U活性，而0.05和0.1μg热启动IgY则部分阻断了Taq聚合酶。本发明源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY也称为热启动IgY ，热启动IgY0.2μg可逆阻断Taq聚合酶（1.5 U）； 0,1和0,05μg分别为畅通的Taq聚合酶（1.5 U）曲线。 在FAM通道上在42℃（循环1-25）和72℃（循环26-50）连续监测荧光。

根据试剂盒手册，荧光的增加速率与聚合酶的活性呈正相关。未封闭的Taq聚合酶在动力学曲线的第一部分（占封闭的0％）具有最高的斜率，证实了Taq聚合酶在42 ℃的活性。相反，由Taq聚合酶与IgY 0.2μg孵育产生的曲线为水平线（封闭的100％），确认了在42℃缺乏聚合酶活性。同时0.05和0.1μg的热启动IgY部分阻断了Taq聚合酶活性，随着IgY量的增加而向下倾斜，与预期值一致（分别为80％和40％阻断） 。然而中间以95 ℃变性2分钟后反映为荧光减弱，在72 ℃温育期间聚合酶活性得以恢复。Taq聚合酶被0.2μg封闭热启动IgY的活动度与其未受阻的对应活动相似。因此，我们得出结论，本发明热启动IgY不会抑制聚合酶活性，而是可逆地阻止它。

使用小鼠单克隆热启动抗体（TCP-101，Toyobo，大阪，日本）已在42℃达到了类似的阻断作用。 至少0.4μg的抗体完全可逆地阻断1.5 U的Taq聚合酶，而0.2μg不足以阻断42℃的聚合酶活性。1μg单克隆热启动抗体可阻断5 U Taq聚合酶，效率为99.3％，这与我们的发现是一致的。

我们已经配制并测试了热启动预混液：热启动IgY PCR预混液和一管反转录IgYPCR预混液，用于开发的热启动IgY Taq聚合酶的质量评估。我们选择了经典猪病毒模型（疫苗株），因为它是没有DNA阶段的单株RNA病毒，我们可以在一个试管反应中通过逆转录同时评估扩增效率。我们发现，用IgY Taq聚合酶封闭不会抑制PCR性能，PCR效率估计为95.3％。我们已经在42 ℃进行了阻断实验，特别是为了避免在一次试管反应中反转录过程中Taq聚合酶和来自鼠白血病逆转录酶之间的干扰， Taq聚合酶在42 ℃时具有很高的活性。一管RTPCR结果表明，在存在热启动IgY封闭的Taq聚合酶的情况下，病毒RNA可以很容易地逆转录和扩增，并且IgY不会抑制MMLV RT的活性。

我们还提出并调整了协议，以使用市售的《 EvaEZTM荧光聚合酶活性测定试剂盒》实时监测热启动抗体的封闭效率。 这与之前使用的终点测量方法不同，例如发夹延伸，放射性同位素标记延伸的DNA和引物二聚体扩增系统。 提出的方法使我们能够以最简单，最快的方式直观地确定抑制百分比。 该过程的简单性使得该技术对于热启动Taq聚合酶的阻断活性商业制备的质量控制以及避免与Taq酶的不完全阻断相关的不良后果非常有吸引力。 此外，我们发现本发明的IgY还可以可逆地阻断Pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的活性，证实了使用本发明的IgY作为热启动试剂的实用性。

最后，我们生产并鉴定了鸡蛋衍生的热启动IgY抗体的功能。 据计算，一个免疫的卵可以产生足够的热启动IgY，以阻断至少3000 U的Taq聚合酶，足以进行2000次测试，是一种热启动酶的廉价来源，并且有潜力与小鼠单克隆抗体一起使用，以产生热启动Taq聚合酶。本发明Taq聚合酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，这在需要高温环境的PCR反应中有着重要意义。因此本发明Taq聚合酶可以取代之前常用于PCR反应的大肠杆菌中的DNA聚合酶。PCR反应中应用本发明Taq聚合酶，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

本发明中涉及的物质如下：PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要PBS还可以补加1 mmol/LCaCl2和0.5 mmol/L MgCl2，以提供双价阳离子。

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。

IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。近来许多研究者分析了IgY的基因组成和生物学功能，而且证实其为哺乳动物IgG和IgE的直接起源。

PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2ⁿ倍。PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件：（①变性：加热使模板DNA在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火；使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，③延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5'一3’方向复制出互补DNA。

弗氏体即弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。一般首次注射时用1/2体积FCA加上1/2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。

Master Mix是一种优化的可以立即使用的PCR预混液,含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料，适合于常规的PCR应用。

U是活力单位.1个酶活力单位是指在特定条件（25℃,其它为最适条件）下,在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量,或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量.

EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广,可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液,染色助剂,纤维处理助剂,化妆品添加剂,血液抗凝剂,洗涤剂,稳定剂。

cDNA 是指互补(有时称拷贝)DNA。特指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。与平常我们所称谓的基因组DNA不同，cDNA没有内含子而只有外显子的序列 。真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

Tris-HCl，中文别名：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷。

二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称为DTT）是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖）。DTT的异构体为二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向异构体。

PCR Master Mix作为一种预混液由赛默飞公司生产。

Claims (5)

1.一种源自鸡蛋的热启动酶，其特征在于：所述的热启动酶，包括Taq 聚合酶以及源自鸡卵黄免疫球蛋白的抗体IgY。

2.一种根据权利要求1所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法：

步骤一：将两只20周大的母鸡关在笼子里，进食和饮水，用0.2 mg的Taq 聚合酶在0.5ml PBS中进行混合，形成混合液，混合液在相同体积的弗氏完全佐剂（FCA）中乳化，用于首次针对母鸡注射，而后混合液在相同体积的弗氏不完全佐剂（FIA）中乳化又进行两次注射，实现免疫接种；

步骤二：每隔10天进行步骤一条件下的注射；

步骤三：在3个月内每月进行一次弗氏不完全佐剂（FIA）的免疫接种，每天收集鸡蛋；

步骤四：完成步骤三的鸡蛋黄中分离IgY的第一步涉及从脂质和脂蛋白中提取可溶性蛋白，该方案包括在0.1％（w / v）的柑橘果胶水溶液中通过5倍稀释的蛋黄沉淀不溶物；

步骤五：通过用35％（w / v）硫酸铵混合经过步骤一的蛋黄沉淀不溶物，饱和沉淀出水溶性蛋白质（包括IgY）

步骤六：为了亲和步骤二的水溶性蛋白质，以琼脂糖凝胶4B为基质，以Taq聚合酶作为配体相结，获得热启动酶。

3.一种根据权利要求2所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法：以0.1 ml / min的流速将总水溶性蛋白质在PBS中稀释至1.0 mg / ml，并加到在磷酸缓冲盐溶液中平衡的以琼脂糖凝胶4B为基质的Taq聚合酶形成的亲和树脂，直到流槽A280的光密度达到基本水平，获得热启动酶。

4.一种根据权利要求3所述的源自鸡蛋的热启动酶制备方法：用0.1 M甘氨酸缓冲液（pH2.3）洗脱结合的热启动酶并分离，加入相同体积的0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 8.0）中和洗脱的热启动酶，合并洗脱的分离，并在磷酸缓冲盐溶液中透析过夜获得热启动酶。

5.一种根据权利要求1至2任一所述源自鸡蛋的热启动酶阻断活性的评价方法：

步骤一：配制两种预混液：热启动酶 PCR预混液和逆转录抗体PCR预混液，每个预混液均包含Taq聚合酶缓冲液，Taq聚合酶缓冲液包括50 mM Tris-HCl，pH 9.9，50 mM KCl，3 mMMgCl2，1 mM DTT，1 mM EDTA，将两种预混液用5％海藻糖和0.5％聚乙二醇作为冷冻保护添加剂冻干；

步骤二：使用从疫苗菌株中分离出总猪瘟病毒，逆转录抗体 PCR预混液首先使用来自鼠白血病逆转录酶和随机六聚体引物3μg在Taq缓冲液中于42℃进行20分钟的逆转录PCR 5μl猪瘟病毒（20 ng），然后在95℃失活10分钟，使用以下循环条件：95℃ 2分钟；在20μl热启动酶主混合物中扩增5μlcDNA（1000、250和62个拷贝），进行40个循环，40个循环包括95℃热启动持续10 s和58℃持续20 s，在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据；

步骤三：对于热启动酶 PCR预混液，将5μl猪瘟病毒直接加入一管抗体PCR Master Mix中，并在以下条件下运行：42 ℃进行20分钟； 95 ℃ 2分钟； 40个循环包括95 ℃持续10 s和58 ℃持续20 s，在每个循环之后在58℃下在ROX通道发射610nm，并记录数据。

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