JP7014725B2 - チオールベースの深共融溶媒 - Google Patents
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Description
深共融溶媒(DES)は、100℃未満の融点を有する、水を含まない溶液である。DESは水素結合に基づく。DESにおいては、水および有機溶媒の特性が組み合わせられる。大部分のDESは、生体触媒のために適当な温度において液体である。DESは、水より疎水性であるが、いくつかの場合において、疎水性によって誘導される生体触媒の不活化をもたらさない(Gorke, J. et al., Biotechnol. Bioprocess E 15(2010)40-53(非特許文献1))。さらに、深共融溶媒は、水を含まずに作製され得、従って、加水分解に関して不活性である。イオン溶液は、DESと類似した特性を有するが、作製するのがより困難であり、環境にとってより有害である。プロテアーゼは、DESにおいて活性を示した(Zhao, H. et al., J. Mol. Catal. B-Enzym 72(2011)163-167(非特許文献2))。
(a)少なくとも1種の水素結合アクセプターと、
(b)(i)少なくとも1個のチオール基および(ii)少なくとも1個のヒドロキシ基もしくは陰性荷電酸素原子またはそれらの塩を含む少なくとも1種の脂肪族水素結合ドナーと
を含む混合物/深共融溶媒である。
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含む、第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に含むか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に含むか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に含む、第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する、第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法である。
は、0%超~最大10%(v/v)の水性共溶媒を含む。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、深共融溶媒は、1%~10%(v/v)の水性共溶媒を含む。一つの態様において、水性共溶媒は水性緩衝液である。一つの態様において、水性共溶媒は水である。
[本発明1001]
1:2~1:3のモル比の(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドおよびジチオスレイトール、ならびに0%超~10%の共溶媒からなる、深共融溶媒。
[本発明1002]
(a)約1:2のモル比の、
(i)(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリド、および
(ii)4-メルカプト-1-ブタノールまたは1-メルカプト-2-プロパノール;ならびに
(b)0%超~約10%の共溶媒
からなる、深共融溶媒。
[本発明1003]
約1:1のモル比の(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドおよび2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、ならびに0%超~約10%の共溶媒からなる、深共融溶媒。
[本発明1004]
共溶媒が水性共溶媒である、本発明1001~1003のいずれかの深共融溶媒。
[本発明1005]
0%超~最大約5%(v/v)の水性共溶媒を含む、本発明1004の深共融溶媒。
[本発明1006]
本発明1001~1005のいずれかの深共融溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含む、第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に含むか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に含むか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に含む、第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する、第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法。
[本発明1007]
第2のポリペプチドが、アミノ酸配列GGG、AAA、CGG、CAA、KGG、またはKAA(SEQ ID NO:29、162~166)をN末端に有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
第2のポリペプチドが、アミノ酸配列GGGまたはAAAをN末端に有する、本発明1006または1007の方法。
[本発明1009]
第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端の25アミノ酸残基内に含む、本発明1006~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端に含む、本発明1006~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPETG(SEQ ID NO:04)またはLPETA(SEQ ID NO:108)をC末端に有する、本発明1006~1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、およびアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含むペプチド、リンカー、および非ソルターゼモチーフ部分から選択される、本発明1006~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
第3のポリペプチドが、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、またはSEQ ID NO:161のアミノ酸配列を含む、本発明1006~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
第3のポリペプチドが、SEQ ID NO:05またはSEQ ID NO:06のアミノ酸配列を有する、本発明1006~1013のいずれかの方法。
本発明は、深共融溶媒が、アミド基転移反応、具体的には、ソルターゼによって触媒される反応を実施するために使用され得るという所見に少なくとも一部分基づく。
「に由来する」という用語は、それぞれのアミノ酸配列が、同一のアミノ酸配列を含むか、またはアミノ酸配列の変化を含有しているか、または親アミノ酸配列の短縮バリアントもしくは融合バリアントであることを示す。
「深共融溶媒」(DES)という用語は、本明細書において使用されるように、その個々の成分の各々より有意に低い融点を有する共融系を形成する化合物の混合物によって形成されるイオン性溶媒を示す。DESは、一般に、特定の適用された比で共融点を形成する、水素結合アクセプターとしての窒素または金属の塩(第1の成分)と、水素結合ドナー(第2の成分)とを含む混合物である。
インビボでは共有結合で会合していない2種の要素を含む共有結合コンジュゲート(すなわち、融合ポリペプチド)を、酵素ソルターゼ、特に、ソルターゼAを使用することによって、インビトロで入手することができる。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される深共融溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含む、第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に有するか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に有するか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に有する、第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する、第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法である。
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の20アミノ酸残基内に)含む、第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に有するか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に有するか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に有する、第2のポリペプチド、および
(iii)SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:159、またはSEQ ID NO:161のアミノ酸配列を有し、任意で、SEQ ID NO:32のC末端タグを含む、可溶性ソルターゼ
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ソルターゼAによって触媒されるポリペプチドの作製のための方法であって、
ここで、チオールベースの深共融溶媒が、
(a)1:2.5~1:3のモル比の塩化コリンおよびジチオスレイトール、または
(b)約1:2のモル比の塩化コリンおよび2-メルカプトエタノール、または
(c)約1:2のモル比の塩化コリンおよび4-メルカプト-1-ブタノール、または
(d)約1:2のモル比の塩化コリンおよび1-メルカプト-2-プロパノール、または
(e)約1:1のモル比の塩化コリンおよび2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、ならびに
0%超~最大約10%(v/v)の水性共溶媒を含む。
ソルターゼモチーフ(アミノ酸配列)は、これらの分子、治療剤(薬)、細胞傷害性薬剤(例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素のような毒素)、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素のようなフルオロフォア、イメージングもしくは放射線治療のための金属のキレート剤、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識、タグ、またはポリエチレングリコールの様々な異性体のようなクリアランス修飾剤、第3の成分に結合するペプチド、もう一つの炭水化物もしくは親油性薬剤、または、例えば、合成低分子(例えば、アセチルサリチル酸)のような低分子のうちの一つに直接含まれていない場合、コンジュゲートされてもよいしまたは組み入れられてもよい。モチーフがコンジュゲーションを介して組み入れられる場合、コンジュゲーションは、直接的であってもよいしまたは介在リンカーを介していてもよい。さらに、第1および/または第2のポリペプチドは、組換えによって作製されてもよいし、または合成であってもよいし、または半合成、即ち、組換えによって作製され、その後、化学的に修飾されたものであってもよい。
治療剤は、例えば、抗体、細胞傷害性もしくは細胞分裂阻害性の化合物のような、治療効果を有する任意の化合物、部分、または基であり得る。抗体は、全長のもしくは完全な抗体であってもよいしまたはそれらの抗原結合断片であってもよい。
非ソルターゼモチーフ部分は、標識であり得る。ソルターゼアミノ酸配列に共有結合で付着し得る任意の標識部分が使用され得る(例えば、Singh et al(2002)Anal.Biochem.304:147-15;Harlow E.and Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,2nd ed.CRC Press,Boca Raton,Fla.を参照すること)。標識は、(i)検出可能なシグナルを提供するか;(ii)第1もしくは第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するため、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)を与えるため、第2の標識と相互作用するか;(iii)電荷、疎水性、形、もしくはその他の物理的パラメータによって、移動度、例えば、電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与えるか、または(iv)例えば、イオン複合体化をモジュレートするため、キャプチャー部分を提供するよう、機能し得る。
(i)過酸化水素が色素前駆物質(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する、過酸化水素を基質として用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP);
(ii)発色性基質としてパラニトロフェニルリン酸を用いるアルカリホスファターゼ(AP);および
(iii)発色性基質(例えば、p-ニトロフェニル-(3-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光発生性基質4-メチルウンベリフェリル-(3-D-ガラクトシダーゼを用いる(3-D-ガラクトシダーゼ((3-D-Gal)。
「リンカー」という用語は、第1の部分を第2の部分とコンジュゲート(連結)するために使用され得る二官能性または多官能性の部分を意味する。2種の反応官能性を有するリンカーを使用して、連結されたコンジュゲートを便利に調製することができる。
例えばオリゴグリシンモチーフ(GG(SEQ ID NO: 28)、GGG(SEQ ID NO: 29)、GGGG(SEQ ID NO: 30)、GGGGG(SEQ ID NO: 31))などの求核性アミノ酸配列をN末端に含む任意のポリペプチドドメイン(例えば、scFv、scFab、もしくはdarpinのような単鎖抗原結合ポリペプチド、またはdsFvもしくはFabのような多鎖抗原結合ポリペプチド)を、発現させ、真核細胞(例えば、HEK293細胞、CHO細胞)の上清から精製することができる。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドであるか、それとも多量体またはヘテロマーの要素に含まれているかは、重要でない。
Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用された。
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH(Regensburg,Germany)において、化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増大/増幅のため、大腸菌プラスミドへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、またはPCRによって、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)によって調製された。
所望の遺伝子/タンパク質(例えば、全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有しているFc鎖)の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を使用する:
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-発現させるべき遺伝子/タンパク質(例えば、黄色ブドウ球菌の短縮型ソルターゼA)、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学濃度(OD)を決定することによって、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
可溶性ソルターゼAのための発現プラスミドの生成
黄色ブドウ球菌由来ソルターゼA
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼA(60~206)分子(SEQ ID NO:05のアミノ酸配列)をコードする。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮されたスタフィロコッカス・ピオゲネスソルターゼA分子(SEQ ID NO:156のアミノ酸配列)をコードする。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端が短縮されたS.ピオゲネスソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮されたリステリア・モノサイトゲネスソルターゼA(73-222)分子(SEQ ID NO:06のアミノ酸配列)をコードする。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端短縮型L.モノサイトゲネスソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
一過性発現および分析的特徴決定
F17培地(Invitrogen Corp.)において培養されたHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞株293由来)の一過性トランスフェクションによって、組換え作製を実施した。トランスフェクションのため、「293-Fectin」トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用した。製造業者の説明書に指定されたように、トランスフェクションを実施した。細胞培養上清をトランスフェクションの3~7日後に採集した。上清を低温(例えば、-80℃)で保管した。
チオールベースの深共融溶媒の作製
ジチオスレイトールおよび塩化コリン
塩化コリンおよびジチオスレイトールを、1:2.5のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.25モルのジチオスレイトールに添加した。透明な均一な溶液が形成されるまで、混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。
塩化コリンおよびβ-メルカプトエタノールを、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルのβ-メルカプトエタノールに添加した。透明な均一な溶液が形成されるまで、混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。
塩化コリンおよび4-メルカプト-1-ブタノールを、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルの4-メルカプト-1-ブタノールに添加した。均一な溶液が形成されるまで、混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。
塩化コリンおよび1-メルカプト-2-プロパノールを、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルの1-メルカプト-2-プロパノールに添加した。透明な均一な溶液が形成されるまで、混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。
塩化コリンおよび2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを、1:1のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.1モルの2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムに添加した。均一な溶液が形成されるまで、混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。
塩化コリンおよび4-メルカプトフェニル酢酸を、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルの4-メルカプトフェニル酢酸に添加した。混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。共融混合物は形成されなかった。
塩化コリンおよび2-メチル-2-プロパンチオールを、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルの2-メチル-2-プロパンチオールに添加した。混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。共融混合物は形成されなかった。
塩化コリンおよび2-,3-,10-メルカプトピナンを、1:2のモル比で混合した。塩化コリン(0.1モル)を、乾燥粉末として利用し、0.2モルの2-,3-,10-メルカプトピナンに添加した。混合物を、火炎上で徐々に加熱し、振とうした。共融混合物は形成されなかった。
チオールベースの深共融溶媒におけるソルターゼによって媒介されるアミド基転移
分子LCR640-ULPETGGRRC(βアラニン(U)へコンジュゲートされたLCR640フルオロフォア; SEQ ID NO:33)およびGGG-ビオチンを、10%(v/v)の水を含む、チオールベースのDES(1:3のモル比の塩化コリン:ジチオスレイトール)に、2mMの最終濃度で溶解させた。純水中で、LCR640-ULPETGGRRCは、0.1mM未満の濃度に可溶化する。
Claims (13)
- (a)1:2のモル比の、
(i)(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリド、および
(ii)4-メルカプト-1-ブタノールまたは1-メルカプト-2-プロパノール;ならびに
(b)0%超~10%の共溶媒
からなる、深共融溶媒。 - 1:1のモル比の(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウムクロリドおよび2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、ならびに0%超~10%の共溶媒からなる、深共融溶媒。
- 共溶媒が水性共溶媒である、請求項1~2のいずれか一項記載の深共融溶媒。
- 0%超~最大5%(v/v)の水性共溶媒を含む、請求項3記載の深共融溶媒。
- 請求項1~4のいずれか一項記載の深共融溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(配列番号101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含む、第1のポリペプチド、
(ii)アミノ酸配列GGG(配列番号29)、AAA(配列番号162)、CGG(配列番号163)、CAA(配列番号164)、KGG(配列番号165)、またはKAA(配列番号166)をN末端に含む、第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する、第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法。 - 第2のポリペプチドが、アミノ酸配列GGG(配列番号29)またはAAA(配列番号162)をN末端に有する、請求項5記載の方法。
- 第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(配列番号101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端の25アミノ酸残基内に含む、請求項5~6のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(配列番号101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端に含む、請求項5~7のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドが、アミノ酸配列LPETG(配列番号04)またはLPETA(配列番号108)をC末端に有する、請求項5~8のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドが、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、ならびに、アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(配列番号101、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含むペプチド、リンカー、および非ソルターゼモチーフ部分からなるコンジュゲートから選択される、請求項5~9のいずれか一項記載の方法。
- 第2のポリペプチドが、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、ならびに、アミノ酸配列GGG(配列番号29)、AAA(配列番号162)、CGG(配列番号163)、CAA(配列番号164)、KGG(配列番号165)、またはKAA(配列番号166)をN末端に含むペプチド、リンカー、および非ソルターゼモチーフ部分からなるコンジュゲートから選択される、請求項5~10のいずれか一項記載の方法。
- 第3のポリペプチドが、配列番号05、配列番号06、配列番号27、配列番号156、配列番号159、配列番号160、または配列番号161のアミノ酸配列を含む、請求項5~11のいずれか一項記載の方法。
- 第3のポリペプチドが、配列番号05または配列番号06のアミノ酸配列を有する、請求項5~12のいずれか一項記載の方法。
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