CN103003305A - 癌症疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一种佐剂的疫苗，所述疫苗可用于预防和治疗血癌，例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。

Description

癌症疫苗
本发明涉及一种疫苗，其用于预防和治疗血癌，例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
癌症是一种异常的疾病状态，其中一个或多个细胞群的不受控制的增殖干扰正常的生理功能。增殖的变化通常伴随着细胞特性的其他变化，包括回复到一种组织性较差的状态。癌细胞通常被称为“转化”。转化细胞通常显示以下几种特性：球形形态、胎儿抗原的表达、非依赖性生长因子、缺乏接触性抑制、非贴附性(anchorage-independence)和高密度生长。癌细胞形成肿瘤并被称为“原发性”或“继发性”肿瘤。原发性肿瘤导致癌细胞在一个器官中生长，原发性转化细胞在该器官中发育。癌细胞从原发性肿瘤逃离并在另一个器官形成继发性肿瘤，从而导致继发性肿瘤。这一过程被称为肿瘤转移，并且这个过程可以是侵袭性的，例如就肝癌或肺癌而言。
淋巴瘤是起始于淋巴细胞并在淋巴结中形成固体肿瘤的癌症。淋巴瘤是一个分类大量起源于淋巴细胞的癌症的术语。例如B细胞肿瘤，例如慢性淋巴细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；T细胞肿瘤例如T细胞幼淋巴细胞性白血病、NK细胞白血病、T细胞大颗粒性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病。此外，淋巴瘤还包括其本身可以被细分的霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。除上述外，与免疫缺陷相关的淋巴瘤是普遍存在的，例如与HIV感染相关的淋巴瘤、移植后淋巴瘤相关的淋巴瘤和与甲氨蝶呤治疗相关的淋巴瘤。这些后面的淋巴瘤带来了特别的困难，因为疫苗接种不是一个可行的疗法。淋巴瘤的治疗通常是化学疗法和放射治疗，并根据特定的淋巴瘤和分期，这些疗法可以是有效的治疗方法。提供一种保护免疫缺陷受治疗者的疫苗是所期望的。目前，还没有被证实的和有效的接种疫苗的手段来对抗这一类癌症。
决定抗体对其抗原的结合特异性的抗体区被称为互补决定区(CDR)，也被称为“高变区”或“独特型”。由于抗体的抗原结合区由随机的氨基酸序列组成，所以其对于B细胞的单克隆或少数克隆是独特的。因此这些独特的肽序列自身是抗原性的，并且结合用来组成抗体分子的特有的独特型。正如抗原由一定数量的表位组成，于是独特型也由一定数量的“独特型”组成。用特别的独特型的纯化免疫球蛋白免疫接种可以产生抗此独特型的抗体应答。
有两个系统使用免疫球蛋白作为疫苗抗原，目的是诱导抗免疫球蛋白的免疫应答。在这两个系统中，抗体的高变区或独特型用来引发免疫应答。在两种情况下，抗体的独特型被用于产生抗独特型应答(anti-Id)。第一种情况，抗体的独特型是免疫效应应答的实际靶点。例如B细胞淋巴瘤和白血病通常都是来自B细胞的单一克隆，并且由此可以在这些细胞表面上表达对肿瘤来说是独特的或几乎独特的免疫球蛋白。抗免疫球蛋白独特型的免疫应答的产生是接种疫苗的预期效果，其可以有助于肿瘤细胞的清除。产生的抗独特型应答由抗体和T细胞介导的应答组成。免疫球蛋白独特型因此可以是肿瘤特异性抗原的最佳实例之一。第二个系统采用所谓的“内影像的抗独特型抗体”以产生抗原交叉反应的应答，其可以是肿瘤抗原或来自病原体或其他来源的抗原，由于种种原因这些抗原难以纯化或直接施用时是弱免疫原性的。
基于独特型的疫苗(包括如上所述的抗独特型疫苗)为本领域已知的。然而，这些疫苗存在相关问题。首先，对于淋巴瘤患者，疫苗必须单独地生产，因为独特型很可能是个体肿瘤所特有的，并且配制疫苗会花费数月时间，其中往往涉及生产分泌所需独特型的杂交瘤，纯化免疫球蛋白，然后与蛋白载体例如KLH偶联。其次，人免疫球蛋白在人体中是内在的弱免疫原性的，因此尽管与载体偶联增强了对独特型的免疫应答，但anti-Id抗体应答有减弱的趋势(事实上，很大比例的对偶联物的应答针对的是高免疫原性的载体蛋白)。第三，已经证明，在小鼠和人中，抗独特型蛋白的CD4+T细胞和CD8+CTL应答均可能在介导治疗应答中是重要的并且与载体例如KLH的偶联不是产生CTL应答的最有效手段。
本发明涉及预防性和治疗性治疗淋巴瘤的疫苗和治疗方案。
根据本发明的一个方面，提供了一种疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤的患者中分离出的独特型抗原；
ii)与所述独特型抗原连接的CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对所连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体佐剂的免疫应答。
CD40单克隆抗体是本领域已知的。例如，US2009/007471(其内容通过引用以其整体并入，尤其是所述抗体的可变区的氨基酸序列并入)公开了适用于根据本发明的疫苗的人源化抗人CD40和嵌合抗人CD40，并且公开的序列示于图12中。
在本发明的优选实施方案中，所述第二佐剂选自由细胞因子组成的组，细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF(转化生长因子)、TNF(肿瘤坏死因子)α和TNFβ组成的组。
在本发明的进一步替代实施方案中，所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、聚肌苷酸：聚胞苷酸[poly I:C]及其衍生物。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为poly I:C。
Poly I:C是一种佐剂，其与由B细胞和树突状细胞表达的Toll样受体TLR3结合。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂是细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(trehelosedycorynemycolate)(TDM)和/或单磷酰基脂质A[MPL]。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为MPL。
佐剂是通过调节免疫细胞活性来增强针对抗原的特异性免疫应答的物质或方法。佐剂的实例包括(仅举例而言)针对协同刺激分子的激动性抗体、弗氏佐剂、胞壁酰二肽、脂质体、明矾、QS21。因此佐剂是免疫调节剂。载体是免疫原性分子，当其与第二分子结合时增强后者的免疫应答。术语载体按下列方式解释。载体是一种免疫原性分子，当其与第二分子结合时，能够增强后者的免疫应答。一些抗原本质上是不具有免疫原性的，但当其与外源蛋白分子例如匙孔血蓝蛋白(keyhole-limpet haemocyanin)或破伤风类毒素结合时能够产生抗体应答。这种抗原含有B细胞表位，但没有T细胞表位。这类偶联物的蛋白部分(“载体”蛋白)提供了T细胞表位，其刺激辅助性T细胞，然后依次刺激抗原特异性的B细胞以分化成浆细胞并且产生针对该抗原的抗体。辅助性T细胞还可以刺激其他免疫细胞，例如细胞毒性T细胞，并且载体可以在产生细胞介导的免疫和抗体中起到类似作用。某些缺乏T细胞表位的抗原例如重复的B细胞表位(例如，细菌多糖)的聚合物，具有有限程度的本质上的免疫原性。这些被称为不依赖性T抗原。这些抗原受益于与载体(例如，破伤风类毒素)的结合，在这种情况下它们引起更强的抗体应答。
在本发明的优选实施方案中，所述独特型抗原包含独特型免疫球蛋白的Fab或F(ab)2'Fd片段或由独特型免疫球蛋白的Fab或F(ab)2'Fd片段组成。
独特型抗原可以在免疫球蛋白重链和轻链可变区内，即(Fab、F(ab)2'Fd片段)，或确实嵌合在重链和轻链可变区和另一个抗体恒定区之间。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗淋巴瘤的疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤的患者中分离出的独特型抗原；
ii)与所述独特型抗原连接的CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对所连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体佐剂的免疫应答。
在本发明的优选实施方案中，所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
在本发明的优选实施方案中，所述B细胞淋巴瘤选自由慢性淋巴细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、骨髓瘤
B细胞急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)、脾脏边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤(也被称为MALT淋巴瘤)、结性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病组成的组。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述淋巴瘤为霍奇金氏淋巴瘤。
在本发明的替代优选实施方案中，所述淋巴瘤为非霍奇金氏淋巴瘤。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述淋巴瘤为免疫缺陷相关淋巴瘤。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫缺陷相关淋巴瘤为HIV相关。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫缺陷相关淋巴瘤为移植相关。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述免疫缺陷相关淋巴瘤为甲氨蝶呤治疗的结果。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗骨髓瘤的疫苗，其包含：
i)从罹患骨髓瘤的患者中分离出的独特型抗原；
ii)与所述独特型抗原连接的CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对所连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体或其CD40结合片段的佐剂的免疫应答。
施用疫苗或包含本发明疫苗的药物组合物时，可在药学上可接受的制剂下施用。这类制剂可常规地包含药学上可接受的浓度的盐，缓冲剂、防腐剂、兼容载体、补充免疫增效剂以及任选的其它治疗剂，例如化学治疗剂，所述其它治疗剂可以与本发明的疫苗分离施用或以组合制剂施用，如果组合物是兼容的。本发明的疫苗可以通过任意常规途径施用，包括注射或随时间的渐进输注。施用可以是，例如，口服、静脉内、腹腔内、肌内、腔内、皮下或透皮。
以有效量施用本发明的组合物。“有效量”是能够单独，或连同其它剂量一起，产生所期望免疫应答的组合物的量。在治疗淋巴瘤的情况下，所期望的应答是抑制疾病的发展。其可以包括仅仅暂时减缓疾病的发展，但是更优选的是，其包括永久性地阻止疾病的发展。这可以通过常规的方法进行监测。
在上述方法中所使用的疫苗优选是无菌的，并包含用于产生所需应答的有效量，适于以重量或体积为单位施用给患者。应答，例如，可以通过肿瘤退化、疾病症状减轻、细胞凋亡调节等来测量。
疫苗施用的其它方法为本领域技术人员已知的，其中剂量、注射时间表、注射部位、施用方式(例如，肿瘤内)等等都与前述不同。向除人以外的哺乳动物施用组合物(例如，出于检测目的或兽医治疗目的)在与上述基本相同的条件下进行。如本文所用的受治疗者是哺乳动物，优选为人，且包括非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。
根据本发明的其它方面，提供了一种适用于预防或治疗淋巴瘤的疫苗的制备方法，其包括：
i)从患有或易感淋巴瘤的受治疗者分离出独特型抗原；
ii)连接所述独特型抗原与CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段以形成复合物并且任选分离所连接的复合物；及
iii)形成与至少一种附加佐剂连接的抗原/佐剂复合物的制剂。
根据本发明的其它方面，提供了一种适用于预防或治疗淋巴瘤的疫苗的制造方法，其包括：
i)提供包含淋巴瘤细胞的分离的生物样本；
ii)提供产生CD40单克隆抗体或其CD40结合片段的分离的杂交瘤细胞；
iii)形成制剂，其适用于促进淋巴瘤细胞与所述杂交瘤细胞系融合以形成杂交细胞；
iv)筛选所述杂交细胞的单克隆抗体，其中所述抗体包括至少两种免疫球蛋白或其抗原结合部分，其中一种免疫球蛋白或部分对CD40是特异的且第二种免疫球蛋白或部分是淋巴瘤独特型；及
v)形成与至少一种附加佐剂连接的抗原/佐剂复合物的制剂。
在本发明的优选方法中，所述第二佐剂选自由细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFα和TNFβ组成的组。
在本发明的进一步替代方法中，所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、poly I:C及其衍生物。
在本发明的优选方法中，所述佐剂为poly I:C。
在本发明的优选方法中，所述佐剂是细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(TDM)和/或单磷酰基脂质A[MPL]。
在本发明的优选方法中，所述佐剂为MPL。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗淋巴瘤的疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤的患者中分离出的独特型抗原；及
ii)第二佐剂，其增强对所述独特型抗原的免疫应答。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂选自由细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素β、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFα和TNFβ组成的组。
在本发明的进一步替代实施方案中，所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、poly I:C及其衍生物。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为poly I:C。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(TDM)和/或单磷酰基脂质A[MPL]。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为MPL。
在本说明书的描述和权利要求中，“包含”和“含有”以及这些词的变化形式，例如，“包含(comprising)”和“包含(comprises)”都是指“包括但不限于”，并且不意图(也没有)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。
在本说明书的描述和权利要求中，除非上下文另外要求，否则单数形式包括复数形式。具体地，当使用不定寇词时，除非上下文另外要求，否则说明书应被理解为指复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或组都应被理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与它们不相匹配。
现在仅示例性地并参考以下附图对本发明的实施方案进行说明。
图1：间隔2个月给予2个剂量的疫苗后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A]和第60天存活率[B](每组n=5)；
图2：第二次接种疫苗后14天且肿瘤攻击前的IgG抗A20抗体反应；
图3：第二次接种疫苗后14天且肿瘤攻击前的IgG抗A20抗体反应；
图4：单次接种疫苗后14天且肿瘤攻击前的IgG抗A20抗体反应；
图5：给予单次剂量的ADX40-A20偶联物疫苗的IgG1和IgG2a同种型后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A]和第60天存活率[B](每组n=5)；
图6：间隔2周给予2个剂量的疫苗后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A]和第60天存活率[B](每组n=5)；
图7：间隔2周给予2个剂量的具有或不具有MPL的疫苗[攻击5a]后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A]和第60天存活率[B](每组n=5)，；
图8：间隔2周给予2个剂量的具有或不具有poly-I:C的疫苗[攻击5b]后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A]和存活曲线[B](每组n=10)；
图9：与GM-CSF一起给予2个剂量的疫苗[攻击6和10]后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A，C]和存活曲线[B，D](每组n=10)；
图10：增加ADX40-A20或KLH-A20偶联物的剂量水平[攻击7和9]后，小鼠中A20淋巴瘤的肿瘤生长[A，C]和存活曲线[B，D](每组n=10)；
图11说明ADX40淋巴瘤疫苗的潜在作用模式，以及
图12a为结合人CD40的CD40单克隆抗体的可变重链的核苷酸序列；图12b为结合人CD40的CD40单克隆抗体的氨基酸序列；图12c为包含融合于人IgG1恒定区重链的CD40可变区的嵌合抗体；图12d为结合人CD40的CD40单克隆抗体的可变轻链的核苷酸序列；图12e为结合人CD40的CD40单克隆抗体的可变轻链的氨基酸序列；图12f为图12e中提及的全长可变轻链。
材料与方法
用于偶联的独特型蛋白的制备
掺入淋巴瘤或白血病疫苗的肿瘤独特型蛋白可以通过两种广泛的方法之一得到。在这两种情况下，肿瘤细胞首先通过活组织检查得到。
第一种方法是杂交瘤拯救，其中肿瘤细胞与人/鼠异种杂交瘤或类似无限增殖细胞系例如骨髓瘤细胞系融合以产生其它杂交瘤，然后基于肿瘤独特型蛋白的分泌进行选择。然后在组织培养中、通常在生物反应器中培养所选的杂交瘤以获得上清液，独特型蛋白从上清液中纯化123。
第二种方法是重组Id制备。在含有Id的重链和轻链可变区的cDNA序列中，肿瘤特异性免疫球蛋白是通过标准的分子生物学方法(例如PCR)克隆的。然后将两条克隆的序列插入到包含共享的免疫球蛋白恒定区序列的质粒，并且完整的质粒最终被转导入不同的活寄主例如细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或烟草植株。Id蛋白随后从培养上清液或转染细胞中纯化4。
偶联物的制备
从通过PEG融合制备的A20淋巴瘤细胞和P3X63骨髓瘤细胞之间的拯救杂交瘤的生物反应器上清液中，A20独特型蛋白(A20)通过G蛋白亲和层析法纯化。A20独特型蛋白首先与-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(sulpho-SMCC)反应来制备马来酰亚胺活化的A20。用N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)同时处理鼠IgG1或IgG2a抗CD40单克隆抗体(两种ADX40，IgG1变体和IgG2a变体)，以引入受保护的巯基。随后抗体和羟胺的脱乙酰化生成游离的巯基，其与A20上的马来酰亚胺基反应以形成稳定的偶联物。同种型-匹配的对照抗体以类似的方式与A20偶联。
交联通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹确定。
小鼠的免疫和攻击
给予6-8周龄雌性的BALB/c小鼠一或两次免疫原的腹腔内注射，随后在最后一次免疫至少2周后，使用105个A20淋巴瘤细胞进行皮下攻击。监测肿瘤生长到直径15毫米，此时对小鼠进行筛选。存活曲线显示其体内肿瘤已达到15毫米阈值的非存活小鼠。60天存活率表示其中没有出现可见肿瘤的小鼠的百分比。
对照疫苗接种包括同种型-匹配的偶联物、与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联的A20、单独A20抗原或磷酸盐缓冲液(PBS)。
体液免疫应答
通过酶联免疫吸附检测法(ELISA)采用大鼠抗小鼠IgG Fc特异性的检测抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)测定A20的抗Fab片段的IgG。
实施例1
两种疫苗接种的影响(攻击1)
小鼠(每组5只)的肿瘤体积和存活率数据分别如图1A和图1B所示，该小鼠用ADX40IgG1变体间隔2个月接种并在第二次接种后20天进行攻击。
在ADX40-A20偶联物组中的肿瘤生长晕(outgrowth)显着比用同种型对照、KLH-A20偶联物或单独A20接种的动物中的肿瘤生长晕小(P<0.01，使用Dunn后检验校正的Kruskal-Wallis检验)并且也显着低于PBS组中的肿瘤生长晕(P<0.05)。
ADX40-A20偶联物免疫组的第60天存活率显著好于同种型对照免疫组(p=0.048，Fisher精确检验)而且也高于给予KLH-A20偶联物、单独A20抗原或PBS的动物的存活率，这没有达到统计学的显著性。
图2显示在第二次疫苗接种14天后诱导的抗A-20抗体应答。同种型对照偶联物就抗体诱导而言是高免疫原性的，但这并没有转化成降低的肿瘤生长或改善的存活率。对于ADX40-A20和KLH-A20偶联物也可观察到抗体免疫应答，但应答水平低于同种型对照，表明抗体应答仅部分反映肿瘤生长晕的预防。
实施例2
单次疫苗接种的影响(攻击2)
用ADX40 IgG1变体偶联物进行单次接种并接种后14天进行攻击的小鼠(每组10只)的肿瘤体积和存活率数据如图3A-C所示。
在ADX40-A20偶联物组中的肿瘤生长晕明显比在两个对照组中的肿瘤生长晕比且生长缓慢(PBS p<0.05；对照偶联物p<0.001；Dunn检验后校正的Kruskal-Wallis检验)。然而，ADX40-A20偶联物治疗组的第60天存活率没有明显好于PBS对照组，尽管在早期时间点偶联物组的存活率比PBS对照组更好。
采用偶联物的单次疫苗接种导致ADX40-A20偶联物治疗组的抗体应答略强于对照动物的抗体应答(图4)。
实施例3
IgG1和IgG2a ADX40同种型的比较(攻击3)
比较攻击前14天分别作为单次疫苗接种给予的ADX40 IgG1变体和ADX40 IgG2a变体的肿瘤生长晕和第60天存活率数据分别如图5A和图5B所示。
在ADX40变体或对照之间的肿瘤生长晕或第60天存活率没有统计学的显着差异(Kruskal-Wallis和卡方检验)，但是与PBS对照组相比，两种ADX40偶联物变体早期有减缓肿瘤生长和增加第60天存活率的趋势。
实施例4
组合佐剂的评价(攻击4)
在一项攻击研究中，探讨了组合的佐剂MPL或poly-I:C对ADX40IgG1变体-A20偶联物疫苗的影响，其中间隔2个月对小鼠(每组5只)接种疫苗2次，然后在两周后进行攻击。图6A和图6B分别显示肿瘤生长晕和存活率数据。
与PBS组或KLH偶联物组相比，一次或两次剂量的偶联物在肿瘤生长方面均没有导致显著性差异。与KLH偶联物(p<0.01)和PBS(p<0.05)相比，ADX40加MPL显著减缓肿瘤生长。与PBS组和KLH组相比(P<0.01)相比，ADX40加poly I:C显着减缓肿瘤生长。所有比较通过Kruskal-Wallis检验和Dunn后检验来检验。
与PBS组或KLH组相比，给予一次或两次的单独ADX40没有明显改善第60天的存活率。
实施例5
采用MPL(攻击5a)和poly-I:C(攻击5b)用较大组的小鼠(每组10只)重复试验，并且数据分别如图7和图8所示。
ADX40-A20+MPL免疫小鼠与KLH-A20+MPL免疫小鼠相比显著减缓肿瘤生长(P<0.01，Kruskal-Wallis检验)。MPL和ADX40的累加效应有明显的趋势，但此时这没有统计学的显著性。
然而，与MPL不同，在第二次攻击中poly-I:C没有加强ADX40-A20的抗肿瘤效率，但是当与KLH-A20偶联物组合时有佐剂的佐剂效应的趋势。
实施例6
与“临床”方案的对比(攻击6和10a)
为比较与ADX40偶联的A20的效应与类似于使用临床独特型淋巴瘤疫苗的方案(即与KLH偶联的独特性抗原和以GM-CSF为佐剂)，每组10只小鼠给予两次注射(间隔14天)ADX40-A20、ADX40+GM-CSF和KLH-A20+GM-CSF。疫苗接种当天开始以55ng每只小鼠的剂量经皮下给予GM-CSF连续4天(即与临床方案类似)。图9A和图9B分别显示肿瘤体积和存活率数据。
在ADX40偶联物+GM-CSF组(到21天)和ADX40偶联物组(到31天)中，肿瘤生长显著延迟，表明ADX40偶联物优于“临床”疫苗类似物。
ADX40偶联物和ADX40偶联物+GM-CSF相比于PBS组(p=0.001和p<0.03)有显著的存活优势。PBS对照组的中位存活时间为17天。对于KLH偶联物+GM-CSF组增加到19.5天，并且对于在ADX40偶联物+GM-CSF组和ADX40偶联物组，分别增加到24天和31天。攻击10a的数据(图9C和图9D)支持这些观察。
实施例7
为了优化验证试验的偶联物的剂量，向小鼠(每组10只)给予10μg、20μg或50μg的ADX40-A20偶联物或KLH-A20偶联物。图10显示肿瘤体积和存活率数据。
ADX40-A20偶联物的最低剂量(10μg)和KLH-A20偶联物的中间剂量(20μg)被发现是最有效的。以10μg、5μg和2.5μg偶联物的一次或二次剂量，进行ADX40的更低剂量范围的进一步试验。5μg ADX40偶联物似乎是最有效的剂量，无论给予一次或二次(图10)。偶联物的两次剂量(不考虑剂量如何)不令人意外地产生比一次剂量更好的结果。最后，不同小鼠独特型蛋白与ADX40的对照偶联物没有诱导保护作用，显示ADX40疫苗诱导保护作用的特异性。
实施例8
进行两个治疗性的疫苗接种研究，其中在皮下肿瘤移植后，给予ADX40-A20偶联物或KLH-A20+GM-CSF 3天(第一个试验)或3和11天(第二个试验)。与对照相比，任何疫苗方案对肿瘤生长晕和存活率均没有显著性效果(数据没有显示)。这些数据不令人惊讶，因为在临床应用中，独特型疫苗接种通常用于通过化疗正在好转的最小残留病灶的患者。
实施例9
不同攻击试验的存活率数据的整合分析(meta-analysis)如表1所示。给予ADX40-A20的小鼠与给予KLH-A20的小鼠相比有显著改善的存活率(分别为26%比2.8%；p=0.007)。此外，给予ADX40-20的小鼠的60天存活率与给予KLH-A20+GM-CSF(25%)的当前临床方案的小鼠的60天存活率相似，但是采用2次注射而不是8次注射。最后，证据表明当附加佐剂与ADX40偶联物组合时，可以观察到协同效应，因为给予ADX40-A20+MPL的动物的存活率显著高于其他组。
实施例10
实施例10说明潜在作用模式。用ADX40-A20+MPL免疫小鼠，并且就在攻击前耗竭CD4 T细胞、CD8 T细胞，或两者都耗竭。仅耗竭CD4细胞对肿瘤生长或存活率没有明显效果。耗竭CD8T细胞降低了保护作用，表明CD8T细胞在介导ADX40+MPL保护方面的可能作用。耗竭CD4和CD8细胞似乎进一步降低保护作用；图11。
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Claims (27)

1.一种疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤或白血病的患者中分离出的独特型抗原；
ii)连接至所述独特型抗原的CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体或其CD40结合片段佐剂的免疫应答。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述第二佐剂选自由细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFα和TNFβ组成的组。
3.根据权利要求1所述的的疫苗，其中所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、poly I:C及其衍生物。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述佐剂为poly I:C。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述佐剂是细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(TDM)和/或单磷酰基脂质A[MPL]。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述佐剂为MPL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗，其中所述独特型抗原包含所述独特型抗原的Fab或F(ab)2'片段或由所述独特型抗原的Fab或F(ab)2'片段组成。
8.一种用于治疗淋巴瘤或白血病的疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤或白血病患者中分离出的独特型抗原；
ii)连接至所述独特型抗原的CD40的单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对所连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体或其CD40结合片段佐剂的免疫应答。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述淋巴瘤或白血病为B细胞淋巴瘤或白血病。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述B细胞淋巴瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、骨髓瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞赘生物、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤(也称为MALT淋巴瘤)、结性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病。
11.根据权利要求8所述的用途，其中所述淋巴瘤为免疫缺陷相关淋巴瘤。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相关淋巴瘤为HIV相关。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相关淋巴瘤为移植相关。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相关淋巴瘤为甲氨蝶呤治疗的结果。
15.一种用于治疗骨髓瘤的疫苗，其包含：
i)从罹患骨髓瘤的患者中分离出的独特型抗原；
ii)连接至所述独特型抗原的CD40单克隆抗体佐剂或其CD40结合片段；和
iii)第二佐剂，其增强对所连接的独特型抗原和CD40单克隆抗体或其CD40结合片段佐剂的免疫应答。
16.一种适用于预防或治疗淋巴瘤的疫苗的制备方法，其包括：
i)从患有或易感淋巴瘤或白血病的受治疗者中分离出独特型抗原；
ii)连接所述独特型抗原与CD40单克隆抗体或其CD40结合片段佐剂以形成复合物并且任选分离所连接的复合物；及
iii)形成与至少一种附加佐剂连接的抗原/佐剂复合物的制剂。
17.一种适用于预防或治疗淋巴瘤的疫苗的制备方法，其包括：
i)提供包含淋巴瘤细胞的分离的生物样本；
ii)提供产生CD40单克隆抗体的分离的杂交瘤细胞；
iii)形成制剂，其适用于促进所述淋巴瘤细胞与所述杂交瘤细胞系的融合以形成杂交细胞；
iv)筛选所述杂交细胞的单克隆抗体，其中所述抗体包含至少两种免疫球蛋白，其中一种免疫球蛋白是对CD40特异的且第二种免疫球蛋白体是淋巴瘤或白血病的独特型；及
v)形成与至少一种附加佐剂连接的抗原/佐剂复合物的制剂。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第二佐剂选自由细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFα和TNFβ组成的组。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、poly I:C及其衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述佐剂为poly I:C。
21.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述佐剂是细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(TDM)和/或单磷酰基脂质A[MPL]。
22.一种用于治疗淋巴瘤的疫苗，其包含：
i)从罹患淋巴瘤的患者中分离出的独特型抗原；和
ii)增强对所述独特型抗原的免疫应答的佐剂。
23.根据权利要求22所述的疫苗，其中所述佐剂选自由细胞因子组成的组，所述细胞因子选自由GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFα和TNFβ组成的组。
24.根据权利要求22所述的疫苗，其中所述佐剂为TLR激动剂，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、poly I:C及其衍生物。
25.根据权利要求22所述的疫苗，其中所述佐剂为poly I:C。
26.根据权利要求22所述的疫苗，其中所述佐剂是细菌细胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒状霉菌酸酯(TDM)和/或单磷酰基脂质A(MPL)。
27.根据权利要求26所述的疫苗，其中所述佐剂为MPL。
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