CN108645828A - 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法 - Google Patents

基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108645828A
CN108645828A CN201810456820.XA CN201810456820A CN108645828A CN 108645828 A CN108645828 A CN 108645828A CN 201810456820 A CN201810456820 A CN 201810456820A CN 108645828 A CN108645828 A CN 108645828A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant human
fluorescence
human protein
sample
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810456820.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108645828B (zh
Inventor
陆心远
沈旸
贾晓青
黄岗
周伟昌
陈智胜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd filed Critical Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority to CN201810456820.XA priority Critical patent/CN108645828B/zh
Publication of CN108645828A publication Critical patent/CN108645828A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108645828B publication Critical patent/CN108645828B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G01N2021/6415—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence with two excitations, e.g. strong pump/probe flash
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，包括如下步骤：一，采用以下方法中的任意两种或三种：方法一、竞争法测定一种或两种重组人蛋白；方法二、夹心法测定一种或两种重组人蛋白；方法三、夹心法测定两种重组人蛋白融合蛋白结合体；二，设置荧光波长，读取荧光值；三，数据处理：根据荧光的比值与标准品的浓度得到标准曲线，计算样品浓度；四，样品排序：将上述方法的检测值赋为样品X,Y及Z轴坐标，得样品在坐标系中位置；划定可接受标准区间，落入该区间样品皆符合要求。本发明可系统、高通量地评价共表达产生的重组人蛋白各组分的活性/滴度，以支持生产细胞株克隆筛选和纯化工艺优化。

Description

基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学 活性与滴度检测方法
技术领域
本发明涉及均质性时间分辨荧光技术(荧光)，尤其涉及一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白的生物学活性与滴度检测的方法，用于细胞克隆筛选与纯化工艺的评价。
背景技术
均质性时间分辨荧光技术(Homogeneous Time Resolved Fluorescence,荧光)能够对荧光共振能量转移进行时间延迟测量，从而能够用于均质化样品的定量检测(参考文献1：Bazin H,Trinquet E,Mathis G.Time resolved amplification of cryptateemission:a versatile technology to trace biomolecular interactions.JBiotechnol.2002；82(3):233–50.)。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光(TRF)两种技术。FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为(能量)供体和(能量)受体，将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。受体受到激发，发出特定波长的发射光。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。如果与供体和受体结合的生物分子不存在相互作用，供体和受体距离较远，不能产生能量转移。时间延迟的检测方式，是通过时间分辨荧光(TRF)技术实现的，将背景荧光去除，提高了灵敏度。
现阶段，生物制药与生物工艺行业的产品主流是使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白。均质性时间分辨荧光技术已可代替ELISA法广泛应用在筛选高产细胞株，原理主要是利用单抗或融合蛋白的Fc端来进行检测筛选(参考文献2：Idusogie EE,Castro JM,Casipit C,Sato A,Terasawa Y,Mulkerrin MG.Development of an antibodyscreening assay for selection of production cell lines.BioProcess Int.2008；6(4):20–33.)。随着生物制药目标蛋白和生产工艺复杂化，出现了在一株哺乳动物工程细胞株内同时表达两种重组人蛋白，直接形成聚合体的生产方式(共表达)。共表达产生的细胞上清液和初步纯化产品，成分较复杂，可能含有两种游离蛋白，以及不同比例结合的聚合体，且其中一个蛋白可能不含有Fc端。目前单一的荧光或者ELISA方法无法在克隆筛选以及工艺优化过程中提供全面比较各种组分含量的结果；组合使用针对不同重组人蛋白的荧光检测，也缺乏能够系统性将多个检测结果综合分析的平台方法。
中国发明专利申请(专利申请号：CN 201611230229X)公开了一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法，该申请与本发明相比，只检测单一蛋白，而不是共表达蛋白结合体；只能检测白蛋白，检测蛋白品种不同；检测蛋白所在基质为尿液，与本发明的细胞上清和蛋白生产过程基质不同。
共表达重组人蛋白的生产过程中需要一个创新的检测方法体系，可以系统地、高通量地评价共表达产生的细胞上清液和初步纯化产品中的重组人蛋白结合体的的活性/滴度以及各组分分别的活性/滴度，以此来支持生产细胞株克隆筛选和纯化工艺优化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，可以系统地、高通量地评价共表达产生的细胞上清液和初步纯化产品中的重组人蛋白各组分的活性/滴度，以此来支持生产细胞株克隆筛选和纯化工艺优化。
为了解决上述技术问题，本发明建立了共表达重组人蛋白活性评价与筛选的平台，优化了两种创新的荧光技术及其数据分析方法本发明采用的具体技术方案如下：
一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，包括如下步骤：
第一步，采用以下方法中的任意两种或三种组合：
方法一、竞争法测定其中一种或两种重组人蛋白；
方法二、夹心法测定其中一种或两种重组人蛋白；
方法三、夹心法测定两种重组人蛋白融合蛋白的结合体；
第二步，设置荧光波长，读取荧光值；
第三步，数据处理：根据荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度；
第四步，样品排序：采用坐标系将方法组合中每一个方法的检测值分别赋为样品X,Y以及Z轴坐标，得出样品在坐标系中位置；根据经验或实验结果，划定可接受标准区间，凡落入这个区间的样品，皆符合活性评价或筛选要求。
作为本发明优选的技术方案，第一步中的方法一具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入目标蛋白或其tag偶联荧光受体；
3)加入铕穴状物偶联的抗目标蛋白或其tag的抗体；
4)以单独表达纯化的目标重组人蛋白或含相同tag的其他重组蛋白作为标准品；
5)在室温孵育约2小时或以上或过夜。
作为本发明优选的技术方案，第一步中的方法二具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，作为荧光供体；
3)加入荧光信号受体偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体作为荧光受体；
4)在室温孵育2小时或以上或过夜。适合波长激发光读板。
作为本发明优选的技术方案，在上述步骤3)和步骤4)之间增加如下步骤：以单独表达纯化的重组人蛋白为标准品。
作为本发明优选的技术方案，第一步中的方法三具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，作为荧光供体；
3)加入荧光信号受体偶联的抗第二种重组人蛋白或其tag的抗体；
4)在室温孵育2小时或以上或过夜。
作为本发明优选的技术方案，在上述步骤3)和步骤4)之间增加如下步骤：以单独纯化的两种重组人蛋白的混合物为标准品。
作为本发明优选的技术方案，第二步中，所述设置荧光波长具体为：Excitation(激发波长)313nm,Emission(放射波长)665nm/620nm,cutoff(中止波长)630nm/590nm。
作为本发明优选的技术方案，第三步中，所述荧光的比值为Em650/Em620×104荧光的比值，当荧光荧光团供体或受体直接或间接结合后，有两个激发光620nm和650nm，否则只有620nm一个激发光；Em650/Em620×104荧光的比值经过产品特异性优化后与标准品的浓度成线性关系；如标准品不可得或线性关系难以优化，获得的Em650/Em620×104荧光的比值，只要证实与实际产品浓度有相关性，亦能直接用于样品的排序。
作为本发明优选的技术方案，第四步中，所述每一个方法的检测值为浓度或荧光的比值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明方法提供多个角度的活性/浓度信息，能满足蛋白共表达等复杂体系的细胞株筛选需求。
2)低反应体积，最大化节约了实验试剂成本。
3)可大范围地推广应用在上游克隆的高通量筛选以及细胞培养和下游纯化工艺条件高通量优化中。在共表达重组人蛋白细胞株的建立和筛选阶段,本发明可以筛选出重组人蛋白共表达比例合适的细胞株。在工艺优化阶段本发明可以更高效地检测重组人蛋白共表达比例合适的细胞培养条件以及纯化条件。在原料药和成品临床实验申报或商业化生产申报阶段，提供可以用于共表达重组人蛋白药物产品放行和稳定性研究的生物学活性检测方案。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明实施例1中样品排序分组示意图。
具体实施方式
现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本发明建立了共表达重组人蛋白活性评价与筛选的平台，优化了两种创新的荧光技术，以重组人蛋白A(无tag)和重组人蛋白B-tag(常用tag，包括Fc,His,Flag等)融合蛋白共表达为例，蛋白A与蛋白B共表达后形成聚合体，AB聚合体中A：B的分子摩尔比为1：n(n≥1)。平台方案由如下三个荧光方法选择性连用，并附最终结果的综合评价方法
方法1：竞争法测定重组人蛋白B-tag
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物5ul，均可用稀释缓冲液稀释；
2)加入荧光信号受体偶联tag 2.5ul；
3)加入Anti-tag-cryptate antibody(铕穴状物偶联的抗tag抗体)2.5ul；
4)以单独表达纯化的重组人蛋白B-tag作为标准品，如此标准品不可得，可省略；
5)在室温孵育约2小时或以上或过夜。适合波长激发光读板依读板。
方法2：夹心法测定重组人蛋白A(无tag)
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物5ul，均可用稀释缓冲液稀释；
2)加入Anti-A-cryptate(铕穴状物偶联的抗重组人蛋白A的抗体，荧光供体)；
3)加入荧光信号受体偶联的抗重组人蛋白A抗体
4)以单独表达纯化的重组人蛋白A为标准品，如此标准品不可得，可省略；
5)在室温孵育2小时或以上或过夜。适合波长激发光读板。
方法3：夹心法测定重组人蛋白A(无tag)和重组人蛋白B-tag融合蛋白的结合体
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物5ul；
2)加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白A的抗体，荧光供体2.5ul；
3)加入荧光信号受体偶联抗人Fc端抗体2.5ul；
4)以单独纯化的重组人蛋白A及重组人蛋白B-Fc的混合物为标准品，如此标准品不可得，可省略；
5)在室温孵育2小时或以上或过夜。适合波长激发光读板。
本发明综合评价方法：
1)方法组合：本发明中，可按照产品抗体的可获得性灵活两两组合以上三种荧光方法：因抗tag商业化抗体一般较易获得1/2，1/3，1/2/3这三种组合较2/3组合更为常用。
2)读板设置：设置荧光波长：Excitation(激发波长)313nm,Emission(放射波长)665nm/620nm,cutoff(中止波长)630nm/590nm，读取荧光值。
3)数据处理：根据Em650/Em620×104荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。本发明中，当荧光荧光团供体或受体直接或间接结合后，有两个激发光620nm和650nm，否则只有620nm一个激发光。Em650/Em620×104荧光的比值经过产品特异性优化后可与标准品的浓度成线性关系。如标准品不可得或线性关系难以优化，获得的Em650/Em620×104荧光的比值，只要与实际产品浓度有相关性，亦可直接用于样品的排序。
4)样品排序：采用坐标系将方法组合中每一个方法的检测值(浓度或荧光的比值)分别赋为样品X,Y以及Z轴坐标，得出样品在坐标系中位置。根据经验或实验结果，划定可接受标准(X,Y以及Z的值，可以是下限，上限或区间)，凡落入这个区间的样品，皆符合活性评价或筛选要求。样品排序分组示例见图1：
如图1所示，以竞争法测得重组蛋白B tag浓度为横坐标；如结合体标准品不可得，直接使用夹心法测得重组蛋白A与B结合体荧光比值为纵坐标。根据不同需求进行筛选，具体可分为以下几类：
1.对重组蛋白B浓度和AB蛋白结合体荧光比值已有规定，例如>100ng/mL，以及>100则直接曾根据数值做出两条十字交叉直线，选择交叉直线第一象限内样品，即S2,S4,S6,S8,S9,S13,S14。
2.，在筛选阶段，对信号数值无法提供具体要求，如果需两种信号都较高的样品，可选择S14,S5,S6,S9和S13；如需要中等信号，可选择S2,S8,S4.；如需重组蛋白B浓度高而AB结合体信号低的样品，可选择S10，S12。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，采用以下方法中的任意两种或三种组合：
方法一、竞争法测定其中一种或两种重组人蛋白；
方法二、夹心法测定其中一种或两种重组人蛋白；
方法三、夹心法测定两种重组人蛋白融合蛋白的结合体；
第二步，设置荧光波长，读取荧光值；
第三步，数据处理：根据荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度；
第四步，样品排序：采用坐标系将方法组合中每一个方法的检测值分别赋为样品X,Y以及Z轴坐标，得出样品在坐标系中位置；根据经验或实验结果，划定可接受标准区间，凡落入这个区间的样品，皆符合活性评价或筛选要求。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步中的方法一具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入目标蛋白或其tag偶联信号受体；
3)加入铕穴状物偶联的抗目标蛋白或其tag的抗体；
4)以单独表达纯化的目标重组人蛋白或含相同tag的其他重组蛋白作为标准品；
5)在室温孵育约2小时或以上或过夜。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步中的方法二具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，为荧光供体；
3)加入荧光信号受体偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体作为荧光受体；
4)在室温孵育2小时或以上或过夜。适合波长激发光读板。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)和步骤4)之间增加如下步骤：
以单独表达纯化的目标重组人蛋白或含相同tag的其他重组蛋白为标准品。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步中的方法三具体为：
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，作为荧光供体；
3)加入荧光信号受体偶联的抗另一重组人蛋白或其tag抗体，作为荧光受体；
4)在室温孵育2小时或以上或过夜。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)和步骤4)之间增加如下步骤：以单独纯化的两种重组人蛋白的混合物为标准品。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二步中，所述设置荧光波长具体为：Excitation 313nm,Emission 665nm/620nm,cutoff 630nm/590nm。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第三步中，所述荧光的比值为Em650/Em620×104荧光的比值，当荧光荧光团供体或受体直接或间接结合后，有两个激发光620nm和650nm，否则只有620nm一个激发光；Em650/Em620×104荧光的比值经过产品特异性优化后与标准品的浓度成线性关系；如标准品不可得或线性关系难以优化，获得的Em650/Em620×104荧光的比值，只要与实际产品浓度有相关性，亦能直接用于样品的排序。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第四步中，所述每一个方法的检测值为浓度或荧光的比值。
CN201810456820.XA 2018-05-14 2018-05-14 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法 Active CN108645828B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810456820.XA CN108645828B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810456820.XA CN108645828B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108645828A true CN108645828A (zh) 2018-10-12
CN108645828B CN108645828B (zh) 2022-02-11

Family

ID=63755260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810456820.XA Active CN108645828B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108645828B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116125074A (zh) * 2022-12-13 2023-05-16 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种IL-10-Fc融合蛋白与其受体结合活性的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103323436A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 无锡药明康德生物技术有限公司 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法
CN105784657A (zh) * 2016-03-25 2016-07-20 鲁延军 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
CN107064092A (zh) * 2017-05-08 2017-08-18 上海药明生物技术有限公司 一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用
CN107271687A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 郑州大学 利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103323436A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 无锡药明康德生物技术有限公司 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法
CN105784657A (zh) * 2016-03-25 2016-07-20 鲁延军 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
CN107064092A (zh) * 2017-05-08 2017-08-18 上海药明生物技术有限公司 一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用
CN107271687A (zh) * 2017-07-14 2017-10-20 郑州大学 利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邓春平: "均相时间分辨荧光(HTRF)法测定重组单抗含量", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116125074A (zh) * 2022-12-13 2023-05-16 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种IL-10-Fc融合蛋白与其受体结合活性的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108645828B (zh) 2022-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190391149A1 (en) Glycan arrays for high throughput screening of viruses
JP6620130B2 (ja) ハイスループット多重検出用システム、装置及び方法
Morgan et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology
Wu A selected history and future of immunoassay development and applications in clinical chemistry
Knight et al. Development of a sensitive microarray immunoassay and comparison with standard enzyme-linked immunoassay for cytokine analysis
Yin et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry
US20090253586A1 (en) Substrates for multiplexed assays and uses thereof
KR101921012B1 (ko) 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법 및 측정용 키트
JP7170782B2 (ja) 生物学的サンプルから免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）抗体アイソタイプの濃度を決定するための方法および試薬
CN103154731A (zh) 新的超灵敏的基于细胞的传感器及其应用
CN107064092B (zh) 一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用
CN108645828A (zh) 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法
Udani et al. Associating growth factor secretions and transcriptomes of single cells in nanovials using SEC-seq
Udani et al. Secretion encoded single-cell sequencing (SEC-seq) uncovers gene expression signatures associated with high VEGF-A secretion in mesenchymal stromal cells
CN118068012A (zh) 人膜性肾病相关指标检测试剂盒及其方法和应用
JP2006105803A (ja) 生体試料物質の分析方法、分析装置、マイクロアレイ及びイムノアッセイ
Vergara et al. Flow cytometry: a powerful analytical technique for characterizing the biological function of biotherapeutics and biosimilars.
CN112945919A (zh) 一种病毒中和抗体的检测方法、系统及其应用
Beck et al. Digital Protein Detection in Bulk Solutions
KR101547058B1 (ko) 마이크로스피어 비드 및 이를 이용한 단백질의 정량방법
CN106980019A (zh) Poct定量检测系统
JP2022527030A (ja) マイクロキャピラリーアレイを使用したスクリーニングのための方法およびシステム
Kriechbaumer et al. Quantification of ligand binding to G-protein coupled receptors on cell membranes by ellipsometry
US8969256B2 (en) Solution microarrays and uses thereof
KR102676276B1 (ko) 생물학적 샘플로부터 면역글로불린 감마 (IgG) 항체 아이소타입 농도를 결정하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant