CN103323436A - 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,包括步骤:1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;2)吸取经培养后的细胞上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入Human-IGg-XL665和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate,以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量。本发明耗时短,通量高,操作简单,结果稳定,可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆,加快了生物制药行业的进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选细胞株的方法,特别是涉及一种利用HTRF(均相时间分辨荧光技术)筛选高产量稳定细胞株的方法。
背景技术
现阶段,国内外生物制药行业使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白,在筛选高产细胞株时,主要通过ELISA的方法。ELISA作为常规的蛋白表达量鉴定方法,在检测哺乳动物工程细胞株单抗或者FC融合蛋白的表达量存在一些难以克服的缺点,如:1)实验步骤多耗时长;2)实验需要经过包被,洗板,封闭,一抗结合,洗板,二抗结合,洗板,显色等多次操作,步骤较复杂,需要一天的时间;3)由于步骤较多容易引起实验误差,导致结果重复性差,不稳定。
是均相时间分辨荧光技术的简称,技术是对TR-FRET技术的进一步改良,提供了更高的灵敏度和稳定性。其中,均相(Homogeneous)是指所有参与反应的试剂或化合物无需经过吸除处理,反应体系内的各成分互不影响。时间分辨荧光(TRF)即TR-FRET,时间分辨荧光共振能量转移。时间分辨(Time Resolved)指依靠时间来去除那些寿命较短的荧光,从而分辨目标荧光。F是荧光共振能量转移(FRET)的意思,指在供体和受体相互靠得很近时,光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体),并使后者发出荧光。
技术结合了荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF,Time Resolved Fluorescence)两种技术,其检测原理如图1所示。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体(Donor),是基于Eu穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中,受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长,所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光,受体激发后产生的荧光便能持续较长时间,这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光,这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
HTRF技术特点有:
a)荧光持续时间更久
b)时间选择(时间延迟读取测量)
c)低背景校正干扰因素
d)耗时短,实验仅需3h左右。
e)均质式检测,不需要经过多次的洗板和孵育。
然而,目前还未有利用HTRF技术进行筛选高产量稳定细胞株的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法。通过采用HTRF的方法代替ELISA法,实现了在短时间内高通量筛选,为快速高效的筛选高表达的细胞株提供一种简洁有效的方法。
为解决上述技术问题,本发明的利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,包括步骤:
1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;
2)当细胞铺满孔板后(约培养7-10天)进行3/4换液,换液一天后吸取上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入Human-IGg-XL665(XL665连接的人IgG)和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate(穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体),以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度(OD)比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,以筛选出高产量稳定的细胞株。
其中,Human-IGg-XL665和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate,使用的是Cisbio公司的试剂盒。
所述步骤1)中的微孔板,包括:96孔板。
所述步骤2)中的筛选微孔板,包括:384孔板;细胞上清的用量为10μL,Human-IGg-XL665的用量为5μL,Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate的用量为5μL。
所述步骤2)中,当A665nm/A615nm的吸光度比值越低,表明目标抗体或融合蛋白产量越高。
本发明中,采用竞争分析法。通过实验设计了能与目标测定物相结合的特异抗体(含有HTRF荧光团供体)和能与抗体结合的竞争性抗原(含有HTRF荧光团受体)。目标测定物与抗体结合并不会发出荧光,抗体与竞争抗原结合会发出荧光。目标测定物和竞争抗原共同竞争与特异抗体的结合,待稳定后测定荧光值的变化便可量化待测物的浓度。
本发明的有益效果如下:
1)大大缩短了检测时间和检测步骤,提高了检测通量,检测时间由原来的一天缩短到3小时,并且可以用384孔板进行操作,通量远远超过了ELISA的96孔板;
2)能快速的通过OD值的高低判断出细胞株克隆表达量,去除低表达量的克隆,减少了人力物力成本;
3)荧光持续时间久,可以过夜后再进行检测,不影响检测结果,而ELISA的检测结果受到时间限制,时间过长或者过短都会影响检测结果。
因此,本发明采用的均向时间分辨荧光(HTRF)技术,耗时短,通量高,操作简单,结果稳定,可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆。此方法应用在细胞株筛选方面,有效的节省了人力物力成本,缩短了时间,加快了生物制药行业的进程。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:
图1是HTRF检测原理图;
图2是实施例1中的HTRF方法筛选结果图;
图3是实施例2中的HTRF方法筛选结果图;
图4是实施例3中的HTRF方法筛选结果图。
具体实施方式
实施例1
1)在96孔板中,按常规方法,培养表达目标抗体(Avastin)的细胞株单克隆(DG44);
2)细胞培养10天后进行3/4换液,换液一天后吸取10μL上清,加入384孔筛选微孔板内,并在该孔内加入5μL Human-IGg-XL665(Cisbio公司)和5μLAnti-Human-IGg-Fc-Cryptate(Cisbio公司),并以10μL所要检测的Avastin目标抗体作为标准品进行对照,在室温反应2.5h或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,当该比值越低,表明目标抗体产量越高,结果见图2。
实施例2
对表达目标抗体(Rituxin)的细胞株(DG44)单克隆,培养8天后进行3/4换液,换液一天后吸取上清,按照实施例1的方法,进行检测,结果见图3。
实施例3
对表达目标抗体(Humira)的细胞株(CHO-M)单克隆,培养7天后进行3/4换液,换液一天后吸取上清,按照实施例1的方法,进行检测,结果见图4。
由图2-4可知,不同的细胞株OD比值高低不等,比值越低抗体表明产量越高。其中,对于实施例3,选取产量较高的前26株克隆进行扩大培养和工艺优化,最终挑选出一株表达量高达2.5g/l的细胞株以及多个产量高于1.5g/l的细胞株,实验证明采用本发明的方法进行细胞株筛选方案简单可行。
综上所述,目前的HTRF技术主要用于药物研究和新药筛选中的化合物筛选,而本发明首次将HTRF技术用于筛选高产稳定细胞株,解决了ELISA方法操作步骤繁琐,时间长,通量低的问题,实现了低成本,高通量,高灵敏度和稳定性,操作简单,耗时短克隆筛选方法,为挑选高产细胞株提供了更加稳定实用的方案。
Claims (7)
1.一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,其特征在于,包括步骤:
1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;
2)吸取经培养后的细胞上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入XL665偶联的人IgG和穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体,以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,以筛选出高产量稳定的细胞株。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中的微孔板,包括:96孔板。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,细胞上清是指:细胞铺满孔板后进行3/4换液,换液一天后吸取上清。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述细胞铺满孔板的时间为细胞培养7-10天。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中的筛选微孔板,包括:384孔板。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,细胞上清的用量为10μL,XL665连接的人IgG的用量为5μL,穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体的用量为5μL。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,当A665nm/A615nm的吸光度比值越低,表明目标抗体或融合蛋白产量越高。
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