CN103323436A - 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法 - Google Patents

利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103323436A
CN103323436A CN2012100736410A CN201210073641A CN103323436A CN 103323436 A CN103323436 A CN 103323436A CN 2012100736410 A CN2012100736410 A CN 2012100736410A CN 201210073641 A CN201210073641 A CN 201210073641A CN 103323436 A CN103323436 A CN 103323436A
Authority
CN
China
Prior art keywords
htrf
cell
screening
cell line
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100736410A
Other languages
English (en)
Inventor
蔡洁行
徐淑荣
徐亚平
李鹃
李浩强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Apptec Co Ltd
Wuxi Apptec Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Apptec Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Apptec Biotechnology Co Ltd filed Critical Wuxi Apptec Biotechnology Co Ltd
Priority to CN2012100736410A priority Critical patent/CN103323436A/zh
Publication of CN103323436A publication Critical patent/CN103323436A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,包括步骤:1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;2)吸取经培养后的细胞上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入Human-IGg-XL665和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate,以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量。本发明耗时短,通量高,操作简单,结果稳定,可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆,加快了生物制药行业的进程。

Description

利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选细胞株的方法,特别是涉及一种利用HTRF(均相时间分辨荧光技术)筛选高产量稳定细胞株的方法。
背景技术
现阶段,国内外生物制药行业使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白,在筛选高产细胞株时,主要通过ELISA的方法。ELISA作为常规的蛋白表达量鉴定方法,在检测哺乳动物工程细胞株单抗或者FC融合蛋白的表达量存在一些难以克服的缺点,如:1)实验步骤多耗时长;2)实验需要经过包被,洗板,封闭,一抗结合,洗板,二抗结合,洗板,显色等多次操作,步骤较复杂,需要一天的时间;3)由于步骤较多容易引起实验误差,导致结果重复性差,不稳定。
Figure BDA0000144951050000011
是均相时间分辨荧光技术的简称,
Figure BDA0000144951050000012
技术是对TR-FRET技术的进一步改良,提供了更高的灵敏度和稳定性。其中,均相(Homogeneous)是指所有参与反应的试剂或化合物无需经过吸除处理,反应体系内的各成分互不影响。时间分辨荧光(TRF)即TR-FRET,时间分辨荧光共振能量转移。时间分辨(Time Resolved)指依靠时间来去除那些寿命较短的荧光,从而分辨目标荧光。F是荧光共振能量转移(FRET)的意思,指在供体和受体相互靠得很近时,光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体),并使后者发出荧光。
技术结合了荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF,Time Resolved Fluorescence)两种技术,其检测原理如图1所示。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供体(Donor),是基于Eu穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中,受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长,所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光,受体激发后产生的荧光便能持续较长时间,这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光,这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。
HTRF技术特点有:
a)荧光持续时间更久
b)时间选择(时间延迟读取测量)
c)低背景校正干扰因素
d)耗时短,实验仅需3h左右。
e)均质式检测,不需要经过多次的洗板和孵育。
然而,目前还未有利用HTRF技术进行筛选高产量稳定细胞株的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法。通过采用HTRF的方法代替ELISA法,实现了在短时间内高通量筛选,为快速高效的筛选高表达的细胞株提供一种简洁有效的方法。
为解决上述技术问题,本发明的利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,包括步骤:
1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;
2)当细胞铺满孔板后(约培养7-10天)进行3/4换液,换液一天后吸取上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入Human-IGg-XL665(XL665连接的人IgG)和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate(穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体),以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度(OD)比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,以筛选出高产量稳定的细胞株。
其中,Human-IGg-XL665和Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate,使用的是Cisbio公司的试剂盒。
所述步骤1)中的微孔板,包括:96孔板。
所述步骤2)中的筛选微孔板,包括:384孔板;细胞上清的用量为10μL,Human-IGg-XL665的用量为5μL,Anti-Human-IGg-Fc-Cryptate的用量为5μL。
所述步骤2)中,当A665nm/A615nm的吸光度比值越低,表明目标抗体或融合蛋白产量越高。
本发明中,采用竞争分析法。通过实验设计了能与目标测定物相结合的特异抗体(含有HTRF荧光团供体)和能与抗体结合的竞争性抗原(含有HTRF荧光团受体)。目标测定物与抗体结合并不会发出荧光,抗体与竞争抗原结合会发出荧光。目标测定物和竞争抗原共同竞争与特异抗体的结合,待稳定后测定荧光值的变化便可量化待测物的浓度。
本发明的有益效果如下:
1)大大缩短了检测时间和检测步骤,提高了检测通量,检测时间由原来的一天缩短到3小时,并且可以用384孔板进行操作,通量远远超过了ELISA的96孔板;
2)能快速的通过OD值的高低判断出细胞株克隆表达量,去除低表达量的克隆,减少了人力物力成本;
3)荧光持续时间久,可以过夜后再进行检测,不影响检测结果,而ELISA的检测结果受到时间限制,时间过长或者过短都会影响检测结果。
因此,本发明采用的均向时间分辨荧光(HTRF)技术,耗时短,通量高,操作简单,结果稳定,可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆。此方法应用在细胞株筛选方面,有效的节省了人力物力成本,缩短了时间,加快了生物制药行业的进程。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:
图1是HTRF检测原理图;
图2是实施例1中的HTRF方法筛选结果图;
图3是实施例2中的HTRF方法筛选结果图;
图4是实施例3中的HTRF方法筛选结果图。
具体实施方式
实施例1
1)在96孔板中,按常规方法,培养表达目标抗体(Avastin)的细胞株单克隆(DG44);
2)细胞培养10天后进行3/4换液,换液一天后吸取10μL上清,加入384孔筛选微孔板内,并在该孔内加入5μL Human-IGg-XL665(Cisbio公司)和5μLAnti-Human-IGg-Fc-Cryptate(Cisbio公司),并以10μL所要检测的Avastin目标抗体作为标准品进行对照,在室温反应2.5h或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,当该比值越低,表明目标抗体产量越高,结果见图2。
实施例2
对表达目标抗体(Rituxin)的细胞株(DG44)单克隆,培养8天后进行3/4换液,换液一天后吸取上清,按照实施例1的方法,进行检测,结果见图3。
实施例3
对表达目标抗体(Humira)的细胞株(CHO-M)单克隆,培养7天后进行3/4换液,换液一天后吸取上清,按照实施例1的方法,进行检测,结果见图4。
由图2-4可知,不同的细胞株OD比值高低不等,比值越低抗体表明产量越高。其中,对于实施例3,选取产量较高的前26株克隆进行扩大培养和工艺优化,最终挑选出一株表达量高达2.5g/l的细胞株以及多个产量高于1.5g/l的细胞株,实验证明采用本发明的方法进行细胞株筛选方案简单可行。
综上所述,目前的HTRF技术主要用于药物研究和新药筛选中的化合物筛选,而本发明首次将HTRF技术用于筛选高产稳定细胞株,解决了ELISA方法操作步骤繁琐,时间长,通量低的问题,实现了低成本,高通量,高灵敏度和稳定性,操作简单,耗时短克隆筛选方法,为挑选高产细胞株提供了更加稳定实用的方案。

Claims (7)

1.一种利用HTRF筛选高产量稳定细胞株的方法,其特征在于,包括步骤:
1)在微孔板中,培养表达目标抗体或融合蛋白的细胞株单克隆;
2)吸取经培养后的细胞上清,加入筛选微孔板内,并在该孔内加入XL665偶联的人IgG和穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体,以所要检测的目标抗体或融合蛋白作为标准品进行对照,在室温反应2.5h以上或者过夜,根据HTRF方法原理,检测A665nm/A615nm的吸光度比值,根据该比值,判断细胞株克隆的表达产量,以筛选出高产量稳定的细胞株。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中的微孔板,包括:96孔板。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,细胞上清是指:细胞铺满孔板后进行3/4换液,换液一天后吸取上清。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述细胞铺满孔板的时间为细胞培养7-10天。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中的筛选微孔板,包括:384孔板。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,细胞上清的用量为10μL,XL665连接的人IgG的用量为5μL,穴状物偶联的抗人IGg Fc片段的抗体的用量为5μL。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,当A665nm/A615nm的吸光度比值越低,表明目标抗体或融合蛋白产量越高。
CN2012100736410A 2012-03-20 2012-03-20 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法 Pending CN103323436A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100736410A CN103323436A (zh) 2012-03-20 2012-03-20 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012100736410A CN103323436A (zh) 2012-03-20 2012-03-20 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103323436A true CN103323436A (zh) 2013-09-25

Family

ID=49192321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012100736410A Pending CN103323436A (zh) 2012-03-20 2012-03-20 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103323436A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105784657A (zh) * 2016-03-25 2016-07-20 鲁延军 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
CN108593615A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 浠思(上海)生物技术有限公司 利用htrf一步法筛选pd1/pd-l1阻断剂的方法
CN108645828A (zh) * 2018-05-14 2018-10-12 上海药明生物技术有限公司 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法
CN109799353A (zh) * 2019-02-15 2019-05-24 浠思(上海)生物技术有限公司 利用htrf技术同时检测多个细胞因子的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302496A (zh) * 2007-05-08 2008-11-12 中美奥达生物技术(北京)有限公司 稳定高表达疫苗用乙肝病毒表面抗原的转基因cho细胞株
WO2010125314A1 (fr) * 2009-04-30 2010-11-04 Cis-Bio International Procede de detection de composes modulateurs de dimeres de proteines membranaires a domaine vft

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302496A (zh) * 2007-05-08 2008-11-12 中美奥达生物技术(北京)有限公司 稳定高表达疫苗用乙肝病毒表面抗原的转基因cho细胞株
WO2010125314A1 (fr) * 2009-04-30 2010-11-04 Cis-Bio International Procede de detection de composes modulateurs de dimeres de proteines membranaires a domaine vft

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUSUKE GOTOH等: "A homogeneous time-resolved fluorescence-based high-throughput screening system for discovery of inhibitors of IKKb–NEMO interaction", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
YUSUKE GOTOH等: "A homogeneous time-resolved fluorescence-based high-throughput screening system for discovery of inhibitors of IKKb–NEMO interaction", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》, vol. 405, 30 June 2010 (2010-06-30) *
周彬等: "纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的建立", 《食品工业科技》 *
周金武等: "BACE1 抑制剂分子水平高通量筛选体系的建立", 《国际药学研究杂志》 *
李旭桂等: "用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫方法的建立", 《南方医科大学学报》 *
钮伟民等: "微囊藻毒素-LR 的纳米均相时间分辨荧光免疫分析法", 《环境与健康杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105784657A (zh) * 2016-03-25 2016-07-20 鲁延军 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
CN108593615A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 浠思(上海)生物技术有限公司 利用htrf一步法筛选pd1/pd-l1阻断剂的方法
CN108645828A (zh) * 2018-05-14 2018-10-12 上海药明生物技术有限公司 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法
CN108645828B (zh) * 2018-05-14 2022-02-11 上海药明生物技术有限公司 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法
CN109799353A (zh) * 2019-02-15 2019-05-24 浠思(上海)生物技术有限公司 利用htrf技术同时检测多个细胞因子的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Koldenkova et al. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation
Urh et al. Suppl 1: HaloTag, a Platform Technology for Protein Analysis
De et al. An improved bioluminescence resonance energy transfer strategy for imaging intracellular events in single cells and living subjects
CN103323436A (zh) 利用htrf筛选高产量稳定细胞株的方法
CN105308458A (zh) 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统
US20140287952A1 (en) Protocol for identifying and isolating antigen-specific b cells and producing antibodies to desired antigens
CN103293133B (zh) 利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法
CN104569404B (zh) 直接竞争trfia法检测喹乙醇的方法
Hogue et al. Fluorescent protein approaches in alpha herpesvirus research
CN105936892A (zh) 筛选具抗原专一性融合瘤细胞的方法
CN107449771A (zh) 酶促化学发光底物
CN104502596A (zh) 一种慢性肾病诊断试剂盒
Fang et al. Absolute quantification of plasma membrane receptors via quantitative flow cytometry
CN105784657A (zh) 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
CN107064092A (zh) 一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用
CN102944672A (zh) 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法
CN104865243A (zh) 一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法
CN104280366B (zh) 一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法
CN104977408B (zh) 一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用
CN103197075B (zh) 利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法
CN103898063B (zh) 半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法
CN104459156A (zh) 一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片
CN102115779B (zh) 一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法
CN102305862A (zh) 一种检测血清中丙肝病毒抗体的方法
CN107764789A (zh) 半固体筛选培养基及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130925