CN102115779B - 一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其中，包括联吡啶钌标记寡核苷酸探针的步骤、构建标准曲线的步骤和样品检测的步骤，具体为：将联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)与目标藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经核酸S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的Bio-NPA-Ru探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的Bio-NPA-Ru探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合，磁珠被工作电极下面的磁极吸附于电极表面，缓冲液去除多余成分后，加入三丙胺溶液液，在电极加压的情况下启动电致化学发光反应。从而建立定量关系实现对目标藻的定量检测。本发明灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短。

Description

一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法

技术领域：

本发明涉及海洋浮游植物种类和/或数量检测的技术领域，特别涉及一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法。

背景技术：

浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均匀的情况。浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性增殖或聚集在一起而已发赤潮现象。海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物，在四千多种海洋浮游微藻中有260多种能够形成赤潮，其中70多种能够产生毒素，赤潮发生时会有大量的鱼类和贝类死亡，导致重大的经济损失和严重的海洋生态灾难，毒素还会富集在贝类和鱼类的图内，人类使用后会引发疾病。

在我国海域中，赤潮发生的区域分布很不均匀，浙江沿海及长江口临近海域的赤潮灾害最为严重，此外发生赤潮比较集中的海区还有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域发生一次特大面积米氏凯伦藻赤潮，所影响到的海区养殖鱼类几乎全部死亡，造成了珠江口海域三地(深圳、珠海和香港)水产养殖业损失逾4亿元之多；2000年长江口海域发生大面积具齿原甲藻赤潮，危害面积达7000平方千米，2004年5月东海长江口海域发生大规模东海原甲藻赤潮，面积达10000平方千米，世界罕见。近年来，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆发越来越频繁，且涉及的范围也越发广泛。赤潮严重破坏了海洋生态平衡，给渔业及旅游业等造成了巨大的损失。除此之外，有些赤潮生物体内或代谢产物中含有生物毒素，通过食物链富集，会严重危害人类的健康。

如果能够实时监控海水中浮游微藻的种类和数量，获得大量的检测市局，就可能为预报赤潮提供必要的条件，及时对养殖区的鱼、贝类采取措施，避免重大经济损失，保证沿海地区经济和社会稳定发展。

目前鉴定微藻的方法主要通过光学显微镜和电子显微镜，训练有素的专家通过电子显微镜能够轻易鉴定大多数的微藻，但有些属内的藻很难在种水平上通过光学显微镜区分开，虽然有一些特殊的荧光染料配以荧光显微镜可以区分它们，但这种方法对技术要求高，费时费力还极易出现检测错误。因此，迫切需要发展出针对分析鉴定赤潮等藻类的简单、可靠的鉴定方法。一般认为微藻的核糖体RNA(rRNA)与藻的进化和分类有密切的关系，GenBank上有关微藻的数据主要集中在这个区域。通过比较相近的微藻的rRNA，找出每个种特有的核酸作为寡核苷酸引物和探针，利用份子杂交技术进行定性定量鉴定。目前用的主要有定量PCR、全细胞杂交和夹心杂交技术。定量PCR技术是一种高灵敏度高特异性的核酸检测技术，PCR技术要求高纯度的DNA或者RNA作为检测样本，因此，该项技术对仪器和操作人员的要求较高，导致定量PCR技术在微藻检测中普及受到限制，全细胞杂交的原理是通过滤膜和过滤收集装置来收集藻细胞，然后利用含有荧光素标记的特异性探针与藻细胞内的rRNA杂交，对相应的藻种作出鉴定和定量计数。该方法操作繁琐，费时费力，而且某些藻的自发荧光会影响检测的准确性，此项技术对设备和人员要求也比较高。PCR-ELISA是一项核酸快速诊断技术，塔通过PCR扩增待检测的目的DNA片段，扩增时掺入地高辛或荧光素等标记物，然后与固定在96孔板上的特异性寡核苷酸探针杂交，将未杂交的片段洗去，加入标记了辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶的地高辛或荧光素抗体，再加入显色底物后，即可通过96板孔读出数据，但是由于普通PCR扩增对检测定量的准确性有很大影响且费时，因此对该项技术不太适合应用到海洋样品中的微藻实时监控。

为解决上述问题，本领域内出现了一种对藻类进行定性和定量的分析方法，如中国专利申请200410053531.3的专利中，使用S1酶保护分析探针与待检测样品混合得混合溶液，并对溶液进行变性处理，释放出S1酶保护分析探针，再用带有可检测信号的专一探针与S1酶保护分析探针杂交，最后检测科检测信号，从而确定待检测样品中的种类和/或数量的方法。此方法基本克服了夹心杂交技术中rRNA不稳定，特异性不好的缺点，但是如果提高检测来的灵敏度、如何简化步骤，如何缩短分析时间等却一直没有得到很好的解决。鉴于这种技术问题，迫切需要出现一种灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短的用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短的用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法。

为实现本发明目的，本发明提供了一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其中，包括构建标准曲线的步骤和样品检测的步骤，其中，所述构建标准曲线的步骤进一步包括如下步骤：

a、选择一种赤潮藻藻种-微小原甲藻；微小原甲藻细胞收集与裂解：收集已知细胞浓度的藻细胞于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50％占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液，按梯度进行稀释；

b、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：分别吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时；

c、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液，核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为2U/μl和0.1mg/ml，于42℃处理1小时；

d、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

e、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

f、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

g、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号；以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，以光纤将光子信号连接至光子计数探头，计算机记录检测信号，建立光信号值，即得到细胞数量标准曲线，得到回归方程。

所述样品检测的步骤进一步包括如下步骤：

h、微小原甲藻细胞收集与裂解：取待检测的微小原甲藻样品于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50％占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液于离心管；

i、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时，得杂交液；

j、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S 1酶酶切缓冲液(核酸S 1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为1U/μl和0.1mg/ml)，于42℃处理1小时；

k、中止消化反应并变性溶液中的DNA/R A杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

1、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

m、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

n、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号。以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，将光信号值代入标准曲线中，根据回归方程即可计算出藻细胞数量和种类。

所述裂解杂交液为：20mM 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)，400mM氯化钠，5mM乙二胺四乙酸二钠，80％甲酰胺(formamide)，1％SDS，pH 6.4；使用前加入固体酵母tRNA，使其终浓度为1mg/ml；

所述S1酶酶切缓冲液为：25mM硫酸锌，150mM氯化钠，250mM醋酸钠，pH 4.0；

所述S1酶中止缓冲液为：30mM乙二胺四乙酸二钠，62.5M氢氧化钠，350mM磷酸氢二钠，150mM磷酸二氢钠；

所述磷酸盐缓冲液为：0.2M磷酸氢二钠，0.2M磷酸二氢钠，pH 7.4。

所述步骤b或步骤i中进一步包括制备Bio-NPA-Ru探针的步骤，具体如下：

(1)Bio-NPA-Ru探针溶解于磷酸盐缓冲液中，浓度为0.1μM，

(2)Origen试剂溶解于二甲基亚砜中，浓度为5mM，

(3)将步骤(1)和步骤(2)两种溶液按1∶4比例在室温黑暗处过夜反应，

(4)加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀后-20℃静置过夜，

(5)12000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用70％酒精洗两次，室温干燥后即为联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)，

(6)将步骤(5)所得Bio-NPA-Ru探针溶解于25μl纯水中，-20℃保存备用。

所述Bio-NPA-Ru探针为微小原甲藻标记探针(B-NPA-NH2)：5’Biotin-acagtccgcaaatgagttctgccaaggctattcactcaccc-gtagacgagctaccatga-NH2。

所述Origen试剂为：

Bis(2，2’-bipyridine)-4’-methyl-4-carboxybipyridine-rutheniumN-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate)(Simga Cat.#96631)。

本发明的优点在于：

将联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)与微小原甲藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经核酸S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的Bio-NPA-Ru探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的Bio-NPA-Ru探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合，磁珠被工作电极下面的磁极吸附于电极表面，缓冲液去除多余成分后，加入三丙胺溶液液，在电极加压的情况下启动电致化学发光反应。该过程在电极表面周而复始地进行，不断产生光信号，采用高灵敏度光子计数探头检测光强度，光强度与联吡啶钌的浓度呈线性关系，从而建立定量关系实现对目标藻的定量和定性检测。这种检测方法灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短。

附图说明：

图1为联吡啶钌[Ru(bpy)32+]体系电致化学发光原理示意图。

图2为双特异分子探针技术原理图。

图3为本发明探针检测技术原理图。

图4为本发明检测体系示意图。

具体实施方式：

本发明将联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)与微小原甲藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经核酸S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的Bio-NPA-Ru探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的Bio-NPA-Ru探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合，磁珠被工作电极下面的磁极吸附于电极表面，缓冲液去除多余成分后，加入三丙胺溶液液，在电极加压的情况下启动电致化学发光反应。该过程在电极表面周而复始地进行，不断产生光信号，采用高灵敏度光子计数探头检测光强度，光强度与联吡啶钌的浓度呈线性关系，从而建立定量关系实现对目标藻的定量和定性检测。这种检测方法灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短

双特异分子探针技术克服了夹心杂交技术中rRNA不稳定、特异性不好的缺点，从根本上解决了探针种属特异性的难题。如何进一步在该技术基础上提高检测的灵敏度、简化步骤、缩短分析时间呢？我们发现对信号的检测是一个值得研究的方向。这是因为，抗体探针和核酸探针的分析方法中信号检测方式有显色、荧光、化学发光和电致化学发光等几种方式，其中由于电致化学发光技术(Electrochemiluminesence，ECL)灵敏度高、重现性好、连续可测、操作简便、易于控制，在生化分析、药物分析和免疫分析等方面得到了越来越广泛的应用。这样运用电致化学发光技术对双特异分子探针技术进行改进就是一条值得探索的新途径。电致化学发光在实际应用中的发光体系主要是联吡啶钌[Ru(bpy)32+]体系，其化学发光是基于三氯联吡啶钌[Ru(bpy)32+]络合物和三丙胺(TPA)两种电化学活性底物在反应中引起的光子发射。

如图1所示，联吡啶钌[Ru(bpy)32+]体系电致化学发光原理示意图。图2所示，为双特异分子探针技术原理图。在工作电极上加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)32+]发生氧化反应释放电子而成为三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)33+]，与此同时，反应体系中的TPA也在电极表面发生氧化而成为阳离子自由基TPA+·，并迅速自发脱去一个质子而形成自由基TPA·。由于[Ru(bpy)33+]是强氧化剂而TPA·是强还原剂，两者即发生氧化还原反应，其结果使[Ru(bpy)33+]还原成激发态的[Ru(bpy)32+*]，其能量来源于[Ru(bpy)33+]与TPA·之间的电势差，激发态[Ru(bpy)32+*]以荧光机制衰变并同时释放出一个波长为620nm的光子，而成为基态的[Ru(bpy)32+]继续参与发生在电极表面的化学发光反应，使电极表面的氧化还原反应循环进行，由于每秒内可发生几万次这样的循环过程，测定信号不断放大，从而使检测灵敏度大大提高。由于Ru(bpy)32+具有水溶性好，试剂稳定，发光效率高等优点，已用于测定氨基酸、肽、醇类等。

用电致化学发光物质标记核酸探针进行检测是近年来刚刚发展起来的新技术。Ru(bpy)32+首先与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或亚磷酰胺化合物反应生成活性Ru(bpy)32+NHS酯或Ru(bpy)32+亚磷酰胺化合物，Ru(bpy)32+NHS酯再与核酸的氨基反应形成Ru(bpy)32+标记的核酸探针，产率可达80％以上。在DNA合成仪上可采用Ru(bpy)32+亚磷酰胺直接合成核酸探针进行标记，产率大于90％，无需分离提纯可直接使用。同时，Ru(bpy)32+标记的核酸探针还具有下列优点：(1)核酸-Ru(bpy)32+标记的探针在水中溶解度好，稳定性高，在室温下半衰期大于一年，2℃～5℃可保持一年以上，克服了酶标记的不稳定性；(2)与酶标记物相比，Ru(bpy)32+的分子量小得多(约1000Da，酶分子量HRP约40KD，AP约100KD，GAL约500KD)，可在核酸分子上进行多个标记(大于20个)而不影响核酸的杂交性能和特异性；(3)Ru(bpy)32+在ECL反应中能发生再生循环反应，使得Ru(bpy)32+标记的分析灵敏度很高，标记物检测限可达200fmol·L-1。(4)可通过改变施加的电位控制和调节化学发光反应的发生和反应速度。目前Ru(bpy)32+标记的核酸探针已被应用于测定DNA的PCR产物、病毒HPV、HIV、细菌DNA分析、癌基因分析等方面。

将电致化学发光技术与双特异分子探针技术相结合可以用下面两幅图来说明。在S1酶保护分析阶段，两种方法步骤大致相同，电致化学发光分子探针检测技术只是用联吡啶钌对常规的NPA探针进行了标记。在对信号的检测方面，双特异分子探针技术利用常规的杂交及酶标显色反应获得信号，而本发明则利用磁珠分选和电化学发光反应，迅速捕捉目标探针并发出光信号，这样就可以大大简化试验步骤、缩短分析时间。

具体过程

①特异性探针的获得

对目标藻rRNA进行测序分析，设计特异性探针并进行验证，保证该探针具有种特异性。

②建立[Ru(bpy)32+]标记寡核苷酸探针的方法

钌螯合物经N-羟基琥珀酰胺或磷酸酰胺活化后形成活性的[Ru(bpy)32+]NHS酯(Origen)或[Ru(bpy)32+]NHS磷酰胺基团(Origen phoshporamidite)，能与合成的寡核苷酸引物结合，生成[Ru(bpy)32+]标记的寡核苷酸引物或探针。

③建立磁性微球分离探针的方法

由于生物素可以与链霉亲和素特异性结合，二者间具有牢固的结合力，所以可将[Ru(bpy)32+]标记的寡核苷酸探针同时标记上生物素，就能很容易地与链霉亲和素包被的磁性微球的结合，从而实现游离相和结合相的分离。

④ECL检测的实现

通过在工作电极和参比电极之间的触发电压引发ECL反应，电极表面的氧化还原反应循环进行，测定信号不断的放大，通过光电倍增管测量ECL的光度实现光信号的准确测定。

⑤建立赤潮藻电致化学发光分子探针检测新技术

将NPA探针标记生物素和[Ru(bpy)32+]后与藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的NPA探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的NPA探针与链霉亲和素包被的磁球相结合；接着，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面，在含三丙胺(TPA)的缓冲液中，同时电极加压的情况下启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，不断产生光信号，采用高灵敏度光电倍增管检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，从而建立定量关系实现对目标藻的定量检测。

具体实施例：

一、.制备联吡啶钌标记寡核苷酸探针，本发明以赤潮藻中的微小原甲藻为例，故探针选用B-NPA-NH2探针。

(1)B-NPA-NH2探针溶解于磷酸盐缓冲液中，浓度为0.1μM。

(2)Origen试剂溶解于二甲基亚砜中，浓度为5mM。

(3)上述两种溶液按1∶4比例在室温黑暗处过夜反应。

(4)加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀后-20℃静置过夜。

(5)12000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用70％酒精洗两次，室温干燥后即为联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)。将其溶解于25μl纯水中，-20℃保存备用。

二、构建标准曲线：

a、选择一种赤潮藻藻种-微小原甲藻；微小原甲藻细胞收集与裂解：收集已知细胞浓度的藻细胞于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50％占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液，按梯度进行稀释；

b、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：分别吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时；

c、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液，核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为2U/μl和0.1mg/ml，于42℃处理1小时；

d、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

e、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

f、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

g、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号；以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，以光纤将光子信号连接至光子计数探头，计算机记录检测信号，建立光信号值，即得到细胞数量标准曲线，得到回归方程。

三、进行样品检测(样品选用赤潮藻中的微小原甲藻)：

h、微小原甲藻细胞收集与裂解：取待检测的微小原甲藻样品于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50％占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液于离心管；

i、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时，得杂交液；

j、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液(核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为1U/μl和0.1mg/ml)，于42℃处理1小时；

k、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

1、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

m、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

n、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号。以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，将光信号值代入标准曲线中，根据回归方程即可计算出藻细胞数量和种类。

上述所有步骤如图3所示，为本发明探针检测技术原理图。

本发明中所需试剂如下：

1.裂解杂交液：20mM 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)，400mM氯化钠，5mM乙二胺四乙酸二钠，80％甲酰胺(formamide)，1％SDS，pH 6.4；使用前加入固体酵母tRNA，使其终浓度为1mg/ml。

2.S1酶酶切缓冲液：25mM硫酸锌，150mM氯化钠，250mM醋酸钠，pH 4.0

3.S1酶中止缓冲液：30mM乙二胺四乙酸二钠，62.5M氢氧化钠，350mM磷酸氢二钠，150mM磷酸二氢钠。

4.Origen试剂：

Bis(2，2’-bipyridine)-4’-methyl-4-carboxybipyridine-rutheniumN-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate)(Simga Cat.#96631)

5.二甲基亚砜溶液。

6.三丙胺溶液。

7.无水乙醇。

8.磷酸盐缓冲液：0.2M磷酸氢二钠，0.2M磷酸二氢钠，pH 7.4。

9.核酸S1酶。

10核糖核酸酶A。

11.链霉亲和素包被磁珠。

12.微小原甲藻标记探针(B-NPA-NH2)：

5’Biotin-acagtccgcaaatgagttctgccaaggctattcactcaccc-gtagacgagctaccatga-NH2

图4为本发明检测体系示意图。主要过程为：将联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)与微小原甲藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经核酸S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的Bio-NPA-Ru探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的Bio-NPA-Ru探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合，磁珠被工作电极下面的磁极吸附于电极表面，缓冲液去除多余成分后，加入三丙胺溶液液，在电极加压的情况下启动电致化学发光反应(图2)。该过程在电极表面周而复始地进行，不断产生光信号，采用高灵敏度光子计数探头检测光强度，光强度与联吡啶钌的浓度呈线性关系，从而建立定量关系实现对目标藻的定量检测。

Claims (4)

1.一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其特征在于，包括构建标准曲线的步骤和样品检测的步骤，其中，所述构建标准曲线的步骤进一步包括如下步骤：

a、选择一种赤潮藻藻种-微小原甲藻；微小原甲藻细胞收集与裂解：收集已知细胞浓度的藻细胞于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50%占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液，按梯度进行稀释；

b、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：分别吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时;

c、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液，核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为2U/μl和0.1mg/ml，于42℃处理1小时；

d、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

e、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

f、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

g、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号；以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，以光纤将光子信号连接至光子计数探头，计算机记录检测信号，建立光信号值，即得到细胞数量标准曲线，得到回归方程；

所述样品检测的步骤进一步包括如下步骤：

h、微小原甲藻细胞收集与裂解：取待检测的微小原甲藻样品于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50%占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液于离心管；

i、Bio-NPA-Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：吸取细胞裂解液，加入Bio-NPA-Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时，得杂交液；

j、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液（核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为1U/μl和0.1mg/ml），于42℃处理1小时；

k、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；

l、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；

m、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；

n、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号。以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，将光信号值代入标准曲线中，根据回归方程即可计算出藻细胞数量和种类；

所述Bio-NPA-Ru探针为微小原甲藻标记探针（B-NPA-NH2）：5’Biotin-acagtccgcaaatgagttctgccaaggctattcactcaccc-gtagacgagctaccatga-NH2。

2.根据权利要求1所述用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其特征在于，

所述裂解杂交液为：20mM 3-（N-吗啉）丙磺酸（MOPS），400mM氯化钠，5mM乙二胺四乙酸二钠，80%甲酰胺（formamide），1%SDS，pH 6.4；使用前加入固体酵母tRNA，使其终浓度为1mg/ml；

所述S1酶酶切缓冲液为：25mM硫酸锌，150mM氯化钠，250mM醋酸钠，pH 4.0；

所述S1酶中止缓冲液为：30mM乙二胺四乙酸二钠，62.5M氢氧化钠，350mM磷酸氢二钠，150mM磷酸二氢钠；

所述磷酸盐缓冲液为：0.2M磷酸氢二钠，0.2M磷酸二氢钠，pH 7.4。

3.根据权利要求1所述用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其特征在于，所述步骤b或步骤i中进一步包括制备Bio-NPA-Ru探针的步骤，具体如下：

探针选用B-NPA-NH2探针；

(1)B-NPA-NH2探针溶解于磷酸盐缓冲液中，浓度为0.1μM；

(2)Origen试剂溶解于二甲基亚砜中，浓度为5mΜ；

(3)上述两种溶液按1:4比例在室温黑暗处过夜反应；

(4)加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀后-20℃静置过夜；

(5)12000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，沉淀用70%酒精洗两次，室温干燥后即为联吡啶钌标记探针（Bio-NPA-Ru）；将其溶解于25μl纯水中，-20℃保存备用。

4.根据权利要求3所述用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其特征在于，所述Origen试剂为：

Bis(2,2’-bipyridine)-4’-methyl-4-carboxybipyridine-rutheniumN-succinimidylester-bis(hexafluorophosphate)(Simga Cat.# 96631)，

此试剂的中文名称为：双(2,2′-联吡啶)-4′-甲基-4-羧基联吡啶钌N-羟基琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸盐。

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