CN105784657A - 利用tr-fret高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在单克隆抗体制备过程中，利用TR‑FRET，高效率筛选阳性克隆的方法，步骤：1)在96孔板中培养杂交瘤细胞单克隆或表达目的抗体的细胞单克隆。2)37℃培养细胞至孔面积80％时换液，再培养1天。3)在384孔板内加入带Tag的目的抗原，再加入上清、Anti‑Human/mouse IgG‑Acceptor、Non‑human/Non‑mouse Anti‑Tag‑Donnor，以同型IgG为标准品，空白样品为阴性对照，孵育2‑4h，检测A665nm/A620nm荧光比值。样品的荧光比值是阴性对照的1.2倍以上，为阳性克隆。本发明操作简单、效率高，在科研单克隆抗体制备、抗体药物开发方面，可有效加快进程。

Description

利用TR-FRET高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法
技术领域
本发明是一种在单克隆抗体制备过程中，高效率、高阳性率筛选阳性克隆的方法。TR-FRET(Time-ResolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，时间分辨荧光共振能量转移)技术是一种均相检测方法，无需包被微孔板，无需洗板，极大节省工作量和时间。
背景技术
目前，国内外生物科研试剂和生物制药相关行业，在制备单克隆抗体时，主要利用ELISA(酶联免疫吸附实验)或者FACS(流式细胞术)筛选阳性克隆。ELISA的实验原理本身存在着一些难以克服的缺点：1.需要包被微孔板、封闭，需要多次洗板；2.步骤多，容易引起误差，实验重复性低；时间长，需要一天时间；3.包被抗原蛋白容易破坏蛋白构象，屏蔽部分抗原表位，导致假阳性率、假阴性率较高。FACS因为通量较低，实验步骤多，操作复杂，也不利于高通量、高效率的进行克隆筛选。
TR-FRET中文全称时间分辨荧光共振能量转移，该技术结合了荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和时间分辨荧光(TRF，Time-ResolvedFluorescence))两种技术。FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor，有铕或铽两种)和能量受体(Acceptor，有XL665或d2两种)，前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。Donor被外来能源激发(例如闪光灯或激光)，如果它与Acceptor在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到Acceptor上。Acceptor受到激发，发出特定波长的发射光。
将Donor和Acceptor分别偶联在相互作用的两个生物分子上，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉近距离，产生能量转移。由于Acceptor分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中无需将未结合与已结合的分子分开，可实现均相检测。
TRF技术是利用稀土元素中镧系元素铕(Eu)或铽(Tb)的独特性质，其荧光比普通荧光持续时间更长。普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。所以在检测时，TRF有一个时间延迟～100微秒，从而使反应体系内普通背景荧光信号几乎为零。因此TRF的背景非常低，反映样品实际情况。
TR-FRET技术的Donor有两种，一种是铕穴状化合物(Eu3+cryptate)或Lumi4TM铽穴状化合物(Tb2+cryptate)，另一种是铕螯合物(Eu3+Chelate)或Lumi4TM铽螯合物(Tb2+Chelate)。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是XL665，为6个APC铰链复合体，分子量大于100kD，另外一种是d2，是个小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2受激后会在665nm处形成一特异波峰。
TR-FRET技术优势：
a)操作简单：加入样品和检测试剂，孵育后即可上机读值；
b)省时省力：无需包被、洗板，2个小时内完成实验；
c)灵敏度高，线性范围广：检测下限可达pg/mL级别，上限可达ug/mL级别；
d)实验数据稳定可靠：7天内可随时检测，荧光信号无明显下降；
e)假阳性、假阴性率较低：均相检测，无需包被，不破坏蛋白构象；
f)通量高，易小型化：384孔板操作，反应体系最小可达4uL。
发明内容
本发明开发了一种在单克隆抗体制备过程中，利用TR-FRET技术进行阳性克隆筛选的方法，可以替代传统的ELISA和FACS方法，实现了短时间内高通量筛选，而且有效降低了假阳性率和假阴性率，为单克隆抗体生产提供了一种简单、快速、高效的筛选方法。
本发明的利用TR-FRET高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法，实验步骤如下：
1)在96孔微孔板中培养经过亚克隆筛选的单克隆杂交瘤细胞株或已经转染表达目的抗体的单克隆细胞株。
2)37℃培养5-10天，当细胞铺满孔板面积80％时，进行换液，继续培养一天。
3)第二天，预先在96孔或384孔筛选微孔板内加入带有Tag的目的抗原蛋白，然后在该微孔板内加入培养上清、Anti-Human/mouseIgG-Acceptor、Non-human/Non-mouseAnti-Tag-Donnor，以同型IgG作为标准品制作标准曲线，另设置空白样品孔作为阴性对照，室温孵育2-4h或4℃过夜孵育，用多功能酶标仪读数，检测A665nm/A620nm的荧光比值。样品的A665nm/A620nm比值是阴性对照的A665nm/A620nm的1.2倍以上，可认为该样品为阳性克隆，A665nm/A620nm比值越大，表明阳性克隆表达的抗体越多。
步骤3)中用到的Anti-Human/mouseIgG-Acceptor购自Cisbio公司，Non-Human/Non-mouseAnti-Tag-Donnor(非人或小鼠来源的偶联Donnor的标签抗体)由Cisbio公司进行定制标记。
步骤3)中用384孔微孔板时，反应体系为20uL，其中5uL带Tag的目的抗原蛋白、5uL上清样品、5uLAnti-Human/MouseIgG-Acceptor、5uLNon-Human/Non-mouseAnti-Tag-Donnor。
本发明采用夹心结合分析法。实验原理为：偶联Donnor的标签抗体能与带Tag的目的抗原蛋白结合，加入样品后，样品中的目的抗体与抗原蛋白结合，Anti-Human/MouseIgG-Acceptor与目的抗体结合，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donnor和Acceptor的距离，能量能够从Donnor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光。根据标准品做出的标准曲线，可以换算出样品中抗体的含量。
本发明的特殊效益如下：
大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，孵育一下就可以读值，实验时间由原来的1天时间缩短到2-4个小时。
极大提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔，提高到384孔或者1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选。
提高了阳性克隆筛选效率：均相检测，抗原蛋白在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性。
荧光持续时间久，可以过夜孵育，甚至在保证反应体系不挥发的情况下，可以在7天内随时检测，荧光信号没有明显下降，极大提高了实验安排的灵活性。
试剂具有通用性，能够大大降低筛选成本：本方法中采用Anti-Tag标签抗体和Anti-SpeciesIgG的二抗，理论上可以用于筛选相同种属来源，能够识别带有相同Tag的任何目的蛋白的抗体阳性克隆。
综上所述，本发明采用的TR-FRET技术，操作简单、耗时短、节省工作量、结果稳定、效率高，可以在短时间内高效率、高阳性率的筛选出表达目的抗体的细胞阳性克隆。此方法应用在科研单克隆抗体制备、抗体药物开发方面，能够有效节省人力、物力和时间成本，加快单克隆抗体制备的进程。
附图说明
图1是TR-FRET阳性克隆筛选的实验原理
图2是实施案例中TR-FRET筛选的标准曲线图
图3是实施案例中TR-FRET筛选的实验结果图
具体实施方式
实施案例
1)传统杂交瘤法制备单克隆抗体，在杂交瘤融合细胞亚克隆最后一步，按照常规方法，将单克隆细胞铺在96孔板中；
2)细胞培养5天后，进行3/4换液，换液第二天，预先在384孔板中加入5uL带HIS标签的重组人血清白蛋白(Albumin)，然后在孔内加入5uL培养上清、5uLanti-mouseIgG-XL665抗体、5uLRabbitanti-HIS-Cryptate抗体，并以mouseIgG作为标准品制作标准曲线，另设置空白样品孔作为阴性对照，室温孵育2h，用TecanF200Pro多功能酶标仪读取665nm和620nm的荧光信号值。样品的A665nm/A620nm比值是阴性对照的A665nm/A620nm的1.2倍以上，可认为该样品为阳性克隆，A665nm/A620nm比值越大，表明阳性克隆表达的抗体越多。

Claims (9)

1.一种利用TR-FRET高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法，其特征在于：在96孔或384孔筛选微孔板内加入带有Tag的目的抗原蛋白，然后在该微孔板内加入样品、Anti-SpeciesIgG-Acceptor和Anti-Tag-Donnor(或者Anti-SpeciesIgG-Donnor和Anti-Tag-Acceptor)，以同型IgG作为标准品制作标准曲线，另设置空白样品孔作为阴性对照，室温孵育2-4h或4℃过夜孵育，用多功能酶标仪读数，检测A665nm/A620nm的荧光比值。样品的A665nm/A620nm比值是阴性对照的A665nm/A620nm的1.2倍以上，可认为该样品为阳性克隆，A665nm/A620nm比值越大，表明阳性克隆表达的抗体越多。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于筛选的微孔板，包括：96孔板、384孔板和1536孔板。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：目的抗原蛋白所带的Tag，包括且不仅限于：HIS、GST、Flag、HA、cMYC、MBP、DNP、SNAP、CLIP、GFP、CFP、YFP、ACP、MCP和Halo。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：Donnor有两种，Eu(铕)或者Tb(铽)；Donnor的载体有两种，Cryptate(穴状化合物)或者Chelate(螯合剂)；Acceptor有两种，XL665(APC)或者d2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：Anti-speciesIgG二抗的种属包括且不仅限于：Human(人)、Mouse(小鼠)、Rat(大鼠)和Rabbit(兔)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：Anti-Tag抗体所抗标签种类包括且不仅限于：HIS、GST、Flag、HA、cMYC、MBP、DNP、SNAP、CLIP、GFP、CFP、YFP、ACP、MCP和Halo。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：Anti-Tag抗体的种属来源，包括且不仅限于：Rabbit、Goat、Sheep、Donkey、Chicken、Rat、Mouse和Hamster。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：样品的A665nm/A620nm比值是阴性对照的A665nm/A620nm的1.2倍以上，可认为该样品为阳性克隆。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：A665nm/A620nm比值越大，表明阳性克隆表达的抗体越多。
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