CN101643508A - 一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体，由具有SEQ NO.1序列的重链基因和SEQ NO.2序列的轻链基因编码。本发明还提供其制备方法，步骤依次包括：利用PCR技术扩增人总RNA全套重链可变区和轻链可变区及恒定区基因，拼接构建全长单链抗体cDNA文库；利用体外耦连的转录/翻译系统表达cDNA文库得到抗体一核糖体一mRNA复合物；特异性抗原包被的磁珠对所述复合物进行亲和筛选及洗脱；原位PCR技术富集筛选出的目的抗体基因；再次利用体外耦连的转录/翻译系统表达富集的抗体基因即可获得该单链抗体。该抗体适用于制备治疗卵巢癌的药物。

Description

一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体

技术领域

本发明涉及人源性抗胎盘生长因子单链抗体。

背景技术

胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)最早于1991年由Maglione等从人的胎盘cDNA文库中分离纯化而得，它是VEGF(血管内皮生长因子)的一个亚型，独立于VEGF作用在主要表达VEGFR-1的内皮细胞、巨噬细胞、骨髓干祖细胞和肿瘤细胞。研究表明，血清和肿瘤内的PIGF水平与肿瘤的分级、血管分布、复发、转移以及生长状态有关。在接受αVEGF(抗VEGF抗体)治疗的癌症病人体内，其水平未见下降，在接受放疗的病人体内也是如此，表明PIGF在血管新生营救机制(angiogenic rescue program)中扮演着某种关键的角色。

最新的研究表明，抗胎盘生长因子抗体具有抑制肿瘤生长的作用。Fischer等在Cell，2007，131(3)：463-475报道制备成功一种中和性鼠单克隆抗体，利用高表达PlGF的小鼠黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌、恶性淋巴瘤细胞系，证明在原位和异位的小鼠肿瘤模型中，αPlGF都能抑制肿瘤生长。αPlGF还能抑制这些肿瘤向胆总管和淋巴管的转移，同时也能抑制原位胰腺癌时腹水的形成。此外，在小鼠黑色素瘤模型和胰腺癌模型中，αPlGF还能增强化疗药物环磷酰胺、吉西他滨的疗效。因为PIGF刺激内皮细胞生长和迁移，动员感受态血管(angiocompetent)骨髓前体细胞，并且作为已存在的血管的生存因子。αPlGF抗肿瘤机制为，一、抑制血管新生，诱使已经存在的肿瘤血管消退；二，αPlGF消弱肿瘤的淋巴管生成，αPlGF增强αVEGF的抗淋巴管生成与巨噬细胞在病理性淋巴管生成中的角色一致，它主要是通过抑制巨噬细胞募集发挥抑制淋巴管生成；三，αPlGF抗炎与PIGF趋化VEGF-1⁺巨噬细胞相一致。肿瘤相关巨噬细胞通过分泌血管新生因子或者产生释放血管生成因子的蛋白酶直接或者间接地参与血管新生。无论在人类还是在植入或者自发形成的小鼠肿瘤模型中，肿瘤相关巨噬细胞的增加与肿瘤的生长，转移及预后相关。通过抑制它们的募集，抑制肿瘤生长。因此，通过阻断巨噬细胞浸润，αPlGF不但降低肿瘤的生长，同时也增强肿瘤对αVEGF应答。

目前尚无成功制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体的有关报道。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体，以填补现有技术中获得人源性抗胎盘生长因子单链抗体的空白。

技术方案

本发明的技术方案之一是提供一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体，由具有SEQ NO.1序列的重链基因和SEQ NO.2序列的轻链基因编码。

本发明的技术方案之二是提供一种制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体的方法，依次包括如下步骤：

(1)由卵巢癌患者的外周血淋巴细胞提取和分离细胞总RNA；

(2)利用PCR技术扩增全套重链可变区基因和轻链可变区以及恒定区基因，拼接构建全长单链抗体基因cDNA文库；

(3)利用体外耦连的转录/翻译系统，将所述的单链抗体基因cDNA文库进行表达，得到抗体一核糖体一mRNA复合物；

(4)胎盘生长因子作为抗原包被磁珠，利用包被的磁珠对抗体一核糖体一mRNA复合物进行亲和筛选及洗脱，获得抗胎盘生长因子单链抗体一核糖体一mRNA复合物，分离抗胎盘生长因子单链抗体。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之一为，所述方法还包括如下步骤：

(5)利用PCR技术对步骤(4)获得的抗胎盘生长因子单链抗体一核糖体一mRNA复合物进行扩增，以富集目的抗体基因；

(6)再次利用体外耦连的转录/翻译系统，将富集的目的抗体基因进行表达，即可获得所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之二为，所述的单链抗体基因cDNA文库的库容量的数量级为10¹³。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之三为，所述的抗原磁珠中抗原与磁珠的质量比为1∶50。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之四为，步骤(5)所述的PCR技术采用原位PCR扩增的方法。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之五为，经过步骤(1)～(6)所获得的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的产物浓度大于4μg/mL。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之六为，经过步骤(1)～(6)所获得的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的平衡常数Ka＝1.3×10⁹L/mol。

上述制备人源性抗胎盘生长因子单链抗体方法的优选方案之六为，经过步骤(1)～(6)所获得的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的效价大于1∶3200。

本发明的技术方案之三为提供一种由上述的方法所制备的源性抗胎盘生长因子单链抗体。

有益效果

本发明所提供的人源性抗胎盘生长因子单链抗体与胎盘生长因子抗原发生特异性免疫反应的平衡常数约Ka＝1.3×10⁹L/mol，与抗原之间有很高的亲和力，且所获得的单链抗体在转录翻译系统中的产物浓度大于4μg/mL，经进一步分离纯化，完全具备在人体应用的潜能。

附图说明

图1Western blot检测单链抗体及其产物浓度

图2单链抗体的亲和力测定

图3人源性抗胎盘生长因子单链抗体基因重链可变区序列与人单链抗体可变区序列GeneBank No.AY510104的同源性比较。编码区起始位为第1位。

图4人源性抗胎盘生长因子单链抗体基因轻链可变区序列与人单链抗体可变区序列GeneBank No.AB064110的同源性比较。编码区起始位为第1位。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆(第三版)，科学出版社2002；或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

提取卵巢癌患者的外周血淋巴细胞的抗体的全套遗传信息，构建单链抗体cDNA文库，免疫磁珠法筛选出目的抗体，并且通过原位PCR富集目的抗体基因，以获得高产物浓度的人源抗胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)单链抗体，具体实施方式如下：

(1)用等量的PBS将3mL的卵巢癌患者志愿者外周血稀释，加入到6mL的人淋巴细胞分离液中，2500r/min，离心20min，收集淋巴细胞层；

(2)用TRIZOL试剂(Cat.#SK1312，购自上海元象生物公司)并按照其说明书提取总RNA；

(3)以总RNA为模板，Oligo dT作引物，dNTP为原料，在MMLVReverse Transcriptase XL(MMLV RTase XL，TaKaRa.D2640A，购自上海皓嘉生物公司)催化下合成cDNA第一链；

计算单链抗体基因cDNA文库的库容量，方法为：

定义：1μg of 1000bp DNA＝1.52pmol＝9.1×10¹¹ molecules(参照He etal，2004；Lamla and Erdmann，2003的计算方法)；由于单链抗体PCR产物总量为75μg，大小为1044bp；故

计算式为：(1000/1044)×9.1×10¹¹×75＝6.5×10¹³，即所构建的库容量为6.5×10¹³。

(4)参考de Haard等(J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26)：18218-30)和He等(Methods Mol Biol.2004；248：177-89)的方法，根据全套重链可变区基因和轻链可变区基因的序列，利用软件PrimerPremier5.0进行引物设计，并按照引物设计的一般要求加以适当修改，获得的引物与下列文献公开的重链可变区引物、轻链(K链)可变区引物、轻链(λ链)可变区引物、轻链(K链)恒定区引物相同：Production of Human Single-Chain Antibodies by RibosomeDisplay；Methods Mol Biol.2004；248：177-89；

(5)采用上述的引物序列，利用PCR技术扩增全套重链可变区基因和轻链可变区及恒定区基因(反应体系见表1)，并以Methods Mol Biol.2004；248：177-89所揭示的重链可变区及轻链可变区引物序列对它们进行拼接(拼接反应体系见表2)，反应程序为94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，30 cycles，构建全长单链抗体基因cDNA文库；

表1PCR扩增抗体全套重链可变区及轻链可变区基因反应体系

表2全套重链可变区基因和轻链可变区基因进行拼接的反应体系

(6)利用体外耦连的转录/翻译系统(反应体系见表3，Promega，L5540，购自上海钰森生物公司)，30℃温浴30min，将单链抗体基因cDNA文库进行表达，得到cDNA文库对应的抗体一核糖体一mRNA复合物；

表3体外耦连的转录/翻译系统的反应体系

(7)利用人胎盘生长因子作为特异性抗原，磁珠选用Tosyl-activatedDynabeadsM-280(Dynal Biotech Cat.#142.03，购自上海钰森生物公司)并按照其说明书进行包被，抗原磁珠中抗原与磁珠的质量比为1∶50；

(8)利用特异性抗原包被的磁珠对抗体一核糖体一mRNA复合物进行亲和筛选，洗脱获得与所述特异性抗原能够发生特异性免疫反应的抗体一核糖体一mRNA复合物；

(9)利用PCR技术对获得的特异性的抗体一核糖体一mRNA复合物进行扩增，以富集目的抗体基因(采用Methods Mol Biol.2004；248：177-89所揭示的目的抗体基因扩增引物，反应体系见表4)，反应程序为50℃ 30min，1 cycle；94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 60s，72℃ 60s，28 cycles。

表4原位PCR技术富集筛选出的目的抗体基因的反应体系

(10)再次利用体外耦连的转录/翻译系统(反应体系见表3)，30℃温浴30min，将富集的目的抗体基因进行表达，即可获得人源抗胎盘生长因子单链抗体。

(11)将由获得的人源抗胎盘生长因子单链抗体经SDSq一PAGE，结果图谱见图2，蛋白条带经考马斯亮蓝染色，灰度扫描显示每50μL的核糖体展示系统一次生产大于200ng的抗体蛋白。

(12)采用非竞争酶免疫试验来测定单链抗体的亲和力。方法如下：用包被液按1∶2∶4∶8稀释目标抗原后，按相同体积加至酶标板孔中，4℃孵育24h。每孔中加入相同体积封闭液，室温孵育2h。用样品稀释液将单链抗体作系列稀释，按相同体积加入各孔中，室温孵育2h。然后加入相同体积的二抗，室温孵育2h。最后各孔中依次加入相同体积的显色液及中止液。在酶标仪上450nm处测定读数。按抗原稀释度不同，分别以OD为纵坐标，以[Ag]为横坐标，绘制OD-Ab曲线，在同一坐标内得到4条“S”形曲线。找出不同抗原稀释度下OD-Ab形曲线上1/2ODmax时所对应的抗体浓度，按公式Ka＝(n-1)/(2×(n×[Ab′]-[Ab]))，计算亲和力常数Ka。其中[Ab′]和[Ab]分别代表抗原倍比稀释中两个不同浓度([Ag′]和[Ag])下，在OD＝1/2ODmax时所对应的抗体浓度，n代表抗原[Ag′]和[Ag]间的稀释倍数。在本研究中，OD＝1/2ODmax时，对应抗体浓度有4个：[Ab].[Ab′].[Ab″]，[Ab′″]，n的值有4个：1，2，4，8，将其代入公式，每个数据可用两次，这样可得到4个Ka.取其平均值。实际测得所获人源抗胎盘生长因子单链抗体的Ka＝1.3×10⁹L/mol。

(13)利用标准胎盘生长因子抗原(bs-0281P，购自北京博奥森生物技术有限公司)测定抗体效价，结果显示，所获得的人源单链抗体的效价大于1∶3200。

(14)测序(由北京华大中生科技发展有限公司进行)结果见序列表SEQNO.1和SEQ NO.2。序列分析结果如图3和图4，显示：获得的序列与人单链抗体重链与轻链可变区序列具有高度同源性。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>同济大学附属第十人民医院

<120>一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体

<130>一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体

<160>2

<170>Patentln version 3.4

<210>1

<211>410

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

aaggtgtcca gtgtgaggtg cacctcgagg agtctggggg aggcctggtc aagcctgggg

60

ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat accatgaact

120

gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgc agtgggtctc atccattagt agtggtagtg

180

attccatata ctacgcagac tcggtgaggg gccgattcac catctccaga gacaacgcca

240

agaacttact gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact

300

gtgcgagagg cggttttgga gtggttcgct ttgactactg gggccaggga accctggtca

360

ccgtctcctc    agggagtgca   tccgccccaa    cccttttccc    cctcgtctcc

410

<210>2

<211>657

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

tctccgaaat tgtgttgaca cagtctccag ccaccctgtc tgtgtctcca ggggaaagag

60

ccaccctctc ctgcagggcc agtcagagtg ttagcagcaa cttagcctgg taccagcaga

120

aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atggtacatt caccagggcc actggcaccc

180

cagagaggtt caggggcagt gggtctggga cagacttcac tcttaccatc aacagactgg

240

agcctgaaga ttctggagta tattactgtc agcactatag tggttcacct ctgtactctt

300

ttggccaggg gaccaaacta gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct

360

tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata

420

acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt agaaggtgga taacgccctc caatcgggta

480

actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca

540

ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc

600

atcagggcct  gagctcgccc  gtcacaaaga  gcttcaacag gggagagtgt tctaatc

657

Claims (10)

1.一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体，由具有SEQ NO.1序列的重链基因和SEQ NO.2序列的轻链基因编码。

2.一种人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，依次包括如下步骤：

(1)由卵巢癌患者的外周血淋巴细胞提取和分离细胞总RNA；

(2)利用PCR技术扩增全套重链可变区基因和轻链可变区以及恒定区基因，拼接构建全长单链抗体基因cDNA文库；

(3)利用体外耦连的转录/翻译系统，将所述的单链抗体基因cDNA文库进行表达，得到抗体一核糖体一mRNA复合物；

(4)胎盘生长因子作为抗原包被磁珠，利用包被的磁珠对抗体一核糖体一mRNA复合物进行亲和筛选及洗脱，获得抗胎盘生长因子单链抗体一核糖体一mRNA复合物，分离抗胎盘生长因子单链抗体。

3.根据权利要求2所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的方法还包括如下步骤：

(5)利用PCR技术对步骤(4)获得的抗胎盘生长因子单链抗体一核糖体一mRNA复合物进行扩增，以富集目的抗体基因；

(6)再次利用体外耦连的转录/翻译系统，将富集的目的抗体基因进行表达，即可获得所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体。

4.根据权利要求2所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的单链抗体基因cDNA文库的库容量的数量级为10¹³。

5.根据权利要求2所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗原磁珠中抗原与磁珠的质量比为1∶50。

6.根据权利要求2所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的PCR技术采用原位PCR扩增的方法。

7.根据权利要求3所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所获得的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的产物浓度大于4μg/mL。

8.根据权利要求3所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的平衡常数Ka＝1.3×10⁹L/mol。

9.根据权利要求3所述的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的制备方法，其特征在于，所获得的人源性抗胎盘生长因子单链抗体的效价大于1∶3200。

10.一种由权利要求2的方法所制备的源性抗胎盘生长因子单链抗体。

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