CN111676320B - 一种猪流行性腹泻病毒s基因全序列扩增方法及其应用 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒s基因全序列扩增方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开提供了一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，包括以下步骤:步骤一、提取病毒RNA；步骤二、cDNA合成；步骤三、PCR扩增；步骤四、基因片段检测及测序。本公开还提供了一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法的应用，用于对猪流行性腹泻病毒S基因全序列的检测与分析。本公开的扩增方法，无需采用常规多对引物进行拼接的方案，通过设计1对引物即实现了猪流行性腹泻病毒S基因全序列的扩增，不仅操作便捷，还可以避免在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。

Description

一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法及其应用
技术领域
本发明公开涉及猪流行性腹泻病的领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的一种猪急性、感染性肠道疾病，临床上以患病仔猪呕吐、水样腹泻、脱水、消瘦为典型症状。在我国，2010年前主要以散发为主。2010年后该病全面爆发，并呈现新的流行特征：患病仔猪出现更加严重的腹泻、呕吐和脱水症状，死亡率高达80-100％。
PEDV属于α-冠状病毒，呈现典型的冠状病毒结构。基因组全长约为28kb，由至少7个开放阅读框(ORFs)构成，分别编码4个结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b、ORF3)。作为一种基因组较大的RNA病毒，PEDV容易发生核酸变异，导致新的变异株甚至基因型的出现。研究指出，目前不同PEDV毒株基因组的差异主要集中在S基因。
S基因编码病毒粒子表面的纤突糖蛋白，包含S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个部分。其中，S1区包含多个中和表位和受体结合域，与病毒抗原性和吸附入侵密切相关；S2区在病毒与宿主细胞膜融合的信号转导过程中发挥重要作用。根据我国2014-2017年间各地报道的PEDV流行株的报道，发现近年来PEDV流行毒株遗传变异主要有以下特点：(1)变异情况往往涵盖基因缺失、插入和基因突变等多种情况，大部分变异为随机发生，无规律可循；(2)突变区域主要分布在S1区，部分变异发生在PEDV毒株抗原保护位点，从而导致PEDV流行株免疫原性的改变。因此，对猪流行性腹泻病毒S基因序列的监测和分析不仅有利于掌握PEDV的进化规律，还能指导生产实践进行疫苗的选择和开发。
现有技术是通过将猪流行性腹泻病毒S基因分成多个相互重叠的基因片段进行引物设计和扩增，拼接后获得S基因全长序列，不仅工作量大，而且还存在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本公开提供了一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法及其应用，仅通过1对引物实现猪流行性腹泻病毒S基因全序列序列的扩展，操作便捷，避免在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
根据本公开的一个方面，一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，包括以下步骤:
步骤一、提取病毒RNA：取适量猪流行性腹泻病毒阳性病料，加入5倍体积的无菌PBS，匀浆后于-20℃保存；反复冻融3次，采用Trizol试剂法提取病毒RNA；
步骤二、cDNA合成：采用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒对提取的病毒RNA进行反转录，获得cDNA；
步骤三、PCR扩增：设计上游引物SA1，其序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示；设计下游引物SA2,其序列如SEQ ID NO:3所示,使用上游引物SA1及下游引物SA2，对cDNA进行PCR扩增，得到含有S全基因片段的PCR扩增产物；
步骤四、基因片段检测及测序：将所述PCR扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测；将目的片段纯化后，进行测序。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤一中，所述Trizol试剂法的具体方法为：a、取1ml组织悬液，于4℃，经5000rpm离心10min，获得第一上清液；b、取300μL第一上清液于无RNA酶的灭菌1.5ml EP管中，加入500μL Trizol，充分混匀，室温静置10min；c、加入500μL三氯甲烷，充分混匀，室温静置10min，于4℃，经12000rpm离心10min，获得第二上清液；d、取500μL第二上清液至新的1.5mL EP管中，加入1.0ml异丙醇，充分混匀，-20℃静置20min，于4℃，经12000rpm离心10min；e、弃掉上清，倒置于吸水纸上，室温自然风干；f、加入20μL无RNase ddH2O，溶解沉淀，即为病毒RNA，将样品保存于-70℃。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤三中，所述PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002550603850000031
上游引物SA1的浓度为10pmol/μL，下游引物SA2的浓度为10pmol/μL；
所述PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，设置30个循环；72℃终延伸10min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤四中，所述目的片段采用FastPureGel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化。
根据本公开的一个方面，一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法的应用，用于对猪流行性腹泻病毒S基因全序列序列的检测与分析。
根据本公开的至少一个实施方式，将所述扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的猪流行性腹泻病毒进行分类。
根据本公开的至少一个实施方式，所述同源性比对为将测序获得的序列与NCBI上已知的猪流行腹泻病毒S基因进行比对。
采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
1、本公开仅仅使用1对引物扩增包含S基因全序列的片段，较之前使用2对、3对引物进行扩增和拼接，更加便捷、节约成本。
2、本公开使用的引物设计位置位于PEDV全基因保守区域，能够有效的提高扩增的成功率，降低因位于高变区引物造成的扩增失败。
3、本公开能够更加快捷的获得S基因的全序列，有利于对所扩增的PEDV进行分类，掌握病毒进化规律，同时指导临床疫苗的使用及开发。
4、本公开上游引物SA1距离S基因起始位点403bp，下游引物SA2距离S基因终止位点200bp，可以有效避免因测序起始阶段不准确所导致的序列信息不准确，在测序时，确保在序列信息准确的基础上减少构建T载体的步骤。
附图说明
附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
图1是本公开引物设计示意图。
图2是本公开PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中M：Marker 5000；1：PEDV临床样品LY-201901；3：PEDV临床样品LY-201803；5:PEDV临床样品LY-201805；2,4,6:阴性对照。
图3是本公开对3个病样进行同源比对的分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，包括以下步骤:
步骤一、提取病毒RNA：取适量猪流行性腹泻病毒阳性的粪便病料，加入5倍体积的无菌PBS，匀浆后于-20℃保存；反复冻融3次，采用Trizol试剂法提取病毒RNA；
所述Trizol试剂法的具体方法为：所述Trizol试剂法的具体方法为：a、取1ml组织悬液，于4℃，经5000rpm离心10min，获得第一上清液；b、取300μL第一上清液于无RNA酶的灭菌1.5ml EP管中，加入500μL Trizol，充分混匀，室温静置10min；c、加入500μL三氯甲烷，充分混匀，室温静置10min，于4℃，经12000rpm离心10min，获得第二上清液；d、取500μL第二上清液至新的1.5mL EP管中，加入1.0ml异丙醇，充分混匀，-20℃静置20min，于4℃，经12000rpm离心10min；e、小心弃掉上清，倒置于吸水纸上，室温自然风干；f、加入20μL无RNase ddH2O，溶解沉淀，即为病毒RNA，将样品保存于-70℃；
步骤二、cDNA合成：采用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒对提取的病毒RNA进行反转录，获得cDNA；
步骤三、PCR扩增：根据猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777(GeneBank登录号为AF353511.1)全基因组序列设计S基因全基因扩增引物，S基因全长从20638nt至24789nt；设计上游引物SA1，SA1位于20246～20263nt，其序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示；设计下游引物SA2,SA2位于24971～24988nt，其序列如SEQ ID NO:3所示,使用上游引物SA1及下游引物SA2，引物序列覆盖整个S基因，且位于猪流行腹泻病毒保守区域；对cDNA进行PCR扩增，得到含有S基因全序列片段的PCR扩增产物；
所述PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002550603850000051
上游引物SA1的浓度为10pmol/μL，下游引物SA2的浓度为10pmol/μL；
所述PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，设置30个循环；72℃终延伸10min；
步骤四、基因片段检测及测序：将所述PCR扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测，电泳结果如图1中的泳道1所示；将目的片段采用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化，再送至上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO:4所示。命名该病料样品中含有的PEDV毒株为LY-201901。
实施例2
一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为猪流行性腹泻病毒阳性的小肠病料，其余步骤同实施例1，在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道3所示，测序结果如SEQ ID NO:5所示。命名该病料样品中含有的PEDV的毒株为LY-201803。
实施例3
一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为猪流行性腹泻病毒阳性的小肠病料，其余步骤同实施例1，在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道5所示，测序结果如SEQ ID NO:6所示。命名该病料样品中含有的PEDV毒株为LY-201805。
实施例4
将上述实施例1-实施例3分离得到的LY-201901，LY-201803，LY-201805毒株的S基因序列与NCBI上已知的猪流行腹泻病毒S基因进行比对，同源性比对毒株的名称、GeneBank登录号、来源及年份如表1所示。
表1：同源性比对毒株
Figure BDA0002550603850000061
Figure BDA0002550603850000071
同源性比对分析结果如图3所示，LY-201901，LY-201803，LY-201805毒株的S基因序列均与PEDV经典毒株CV777进化距离较远，与我国最近三年分离的PEDV毒株H1-SD2017、CH/SCCZ/2018、swun-H3-CH-SCYA-2019等进化距离较近。
本公开相对于现有技术的S基因全序列扩增方法，无需采用多对引物的扩增及拼接方案，仅仅1对引物即可实现对猪流行性腹泻病毒S基因全序列的扩增，扩增方法操作便捷，并有利于节约成本；将引物设计位置设于PEDV保守区域，降低因位于高变区引物造成的扩增失败，提高了扩增的成功率；本公开便捷的操作步骤，可以更加快捷地获得猪流行性腹泻病毒S基因的全序列，有利于对所扩增的PEDV进行分类，掌握病毒进化规律，同时指导临床疫苗的使用及开发。由于本公开上游引物SA1距离S基因起始位点403bp，下游引物SA2距离S基因终止位点200bp，因而，测序时，在减少构建T载体步骤情况下，同样确保了测序序列信息的准确性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法及应用
<130> 2020
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial )
<400> 1
acggagttta gttggaat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial )
<400> 2
acggagctta gttggaat 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial )
<400> 3
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<210> 4
<211> 4149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial )
<400> 4
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cagggtgcag ctttgactca acttactgta cagctgcaac acaacttcca agccatttct 3180
agttctattg atgacattta ctctcgactg gacattcttt cagctgatgt tcaggttgac 3240
cgtctcatca ccggcagatt atcagcactt aatgcttttg ttgctcaaac cctcactaag 3300
tatactgagg ttcaggctag caggaagcta gcacagcaaa aggttaatga gtgcgttaaa 3360
tcgcaatctc agcgttatgg tttttgtggt ggtgatggcg agcacatttt ctctctggta 3420
caggcagcac ctcagggtct gctgttttta catacagtac ttgtaccggg tgattttgta 3480
gatgttattg ccatcgctgg cttatgcgtt aacgatgaaa ttgccttgac tctacgtgag 3540
cctggcttag tcttgtttac gcatgaactt caaaatcata ctgcgacgga atattttgtt 3600
tcatcgcgac gtatgtttga acctagaaaa cctaccgtta gtgattttgt tcaaattgag 3660
agttgtgtgg tcacctatgt caatttgact agagaccaac taccagatgt aatcccagat 3720
tatatcgatg ttaacaaaac acttgatgag attttagctt ctctgcccaa tagaactggt 3780
ccaagtcttc ctttagatgt ttttaatgcc acttatctta atctcactgg tgaaattgca 3840
gatttagagc agcgttcaga gtctctccgt aatactacag aggagctcca aagtcttata 3900
tataatatca acaacacact agttgacctt gagtggctca accgagttga gacatatatc 3960
aagtggccgt ggtgggtttg gttgattatt ttcattgttc tcatctttgt tgtgtcatta 4020
ctagtgttct gttgcatttc cacgggttgt tgtggatgct gcggctgctg ctgtgcttgt 4080
ttttcaggtt gttgtagggg tcctagactt caaccttacg aagtttttga aaaggtccac 4140
gtgcagtga 4149
<210> 5
<211> 4158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial )
<400> 5
atgaagtctt taacttactt ctggttgttc ttaccagtac tttcagcact cagcctacca 60
caagatgtca ccaggtgctc agctaaaact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120
gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180
gttaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240
tttcttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcaca agagcctttt 300
gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta atggtaacac taatgctact 360
gcgcgattgc gcatttgcca gtttcccagc attgaaacat tgggccccac tgctgataac 420
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catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540
tatcattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600
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ggtgaggatg gtatttctta tcaactctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720
gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780
cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840
gtcaattgtc ttttggccat gcctaagatt tatggactag gccaattttt ctccttcaat 900
caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960
tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcacactgct 1020
ttaggaacaa atctttcttt tgtttgcagt aattcttcag atcctcattt agctactttt 1080
accatacctc tgggtgctac ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140
aactccactg tttataaatt tttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200
accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggatact tgcatctcgg tttgttggat 1260
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atagcatcga ctaattttgt tgatgcactc atcgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380
attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440
gacgatggtt tttatcctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500
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tatggttatg tgtctcactc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740
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tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttttacca ttctaatgat 2220
ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280
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aaggtccacg tgcagtga 4158

Claims (7)

1.一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法，其特征在于，包括以下步骤:
步骤一、提取病毒RNA：取适量猪流行性腹泻病毒阳性病料，加入5倍体积的无菌PBS，匀浆后于-20℃保存；反复冻融3次，采用Trizol试剂法提取病毒RNA；
步骤二、cDNA 合成：采用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNAwiper)试剂盒对提取的病毒RNA进行反转录，获得cDNA；
步骤三、PCR扩增：设计上游引物SA1，其序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示；设计下游引物SA2, 其序列如SEQ ID NO:3所示,使用上游引物SA1及下游引物SA2，对cDNA进行PCR扩增，得到含有S全基因片段的PCR扩增产物；
步骤四、基因片段检测及测序：将所述PCR扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测；将目的片段纯化后，进行测序。
2.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法，其特征在于，所述步骤一中，所述Trizol试剂法的具体方法为：a、取1ml组织悬液，于4℃，经5000rpm离心10min，获得第一上清液；b、取300μL第一上清液于无RNA酶的灭菌1.5ml EP管中，加入500μL Trizol，充分混匀，室温静置10min；c、加入500μL三氯甲烷，充分混匀，室温静置10min，于4℃ ，经12000rpm 离心10min，获得第二上清液；d、取500μL第二上清液至新的1.5mL EP管中，加入1.0ml 异丙醇，充分混匀，-20℃静置20min，于4℃，经12000rpm 离心10min；e、弃掉上清，倒置于吸水纸上，室温自然风干；f、加入20μL 无RNase ddH2O，溶解沉淀，即为病毒RNA，将样品保存于-70℃。
3.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法，其特征在于，所述步骤三中，所述PCR扩增反应体系为：
2×Taq Plus Master Mix  12.5μL
上游引物SA1             1μL
下游引物SA2             1μL
cDNA                    1μL
ddH2O                   9.5 μL；
上游引物SA1的浓度为10pmol/μL，下游引物SA2的浓度为10pmol/μL；
所述PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，设置30个循环；72℃终延伸10min。
4.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法，其特征在于，所述步骤四中，所述目的片段采用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化。
5.一种如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法的应用，其特征在于，用于对猪流行性腹泻病毒S基因全序列的检测与分析，该应用为非诊断目的。
6.如权利要求5的应用，其特征在于，将扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的猪流行性腹泻病毒进行分类。
7.如权利要求6的应用，其特征在于，所述同源性比对为将测序获得的序列与NCBI上已知的猪流行腹泻病毒S基因进行比对。
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