CN106939041B - 应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法 - Google Patents

应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，包括以下步骤：将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF‑多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；所述NGF‑多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激发动物产生能蛇毒NGF的多克隆抗体，进而规模化制备NGF‑多克隆抗体亲和柱，利用免疫亲和的特异性及高效性；对天然蛇毒神经生长因子纯化，得到天然的、高活性的蛇毒神经因子。减少生产成本，适应规模化生产。

Description

应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法。
背景技术
神经生长因子(Never growthfactor,NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，是一种可由多种细胞产生的能促进神经修复的多肽类因子。它与周围神经和中枢神经的存活及发育密切相关,在神经系统、内分泌系统和免疫系统的网络调控中起重要的作用。NGF生物学功能的实现是通过NGF与效应细胞表面的NGF受体结合而介导。它能够维持并促进外周及中枢神经系统中部分神经元的发育和分化，营养成熟的神经元，维持其存活及正常的生理功能，并且在它们受到损伤后，促进其修复和再生。它在外周神经系统的病变及一些神经元退行性疾病，例如早老年性痴呆症、帕金森症的治疗方面显示了良好的应用前景。
蛇毒是分离NGF的最初来源之一,1956年Cohen和Levi-Montalcini研究干燥的噬鱼蝮蛇毒中发现具有磷酸二酯酶活性,粗蛇毒与肉瘤匀浆同样能促进脊髓神经节的生长。后来,从蛇毒中发现了NGF，蛇毒NGF常常重组同质多聚体或单体形式,与其它已知的NGF有类似的结构和生物学活性。眼镜蛇毒神经生长因子作为药物的主要活性成分，疗效好、起效快、毒副作用小，是预防和治疗神经系统疾病的理想药物。
现在眼镜蛇毒NGF作为药物的难点包括天然分离纯化步骤繁多且NGF纯度达不到临床用药要求。现有的眼镜蛇毒NGF分离纯化主要采用凝胶柱层析法与离子交换层析法的组合，不仅柱效的影响因素繁多，很难加以控制、重复性差，而且纯化步骤较多、得到的NGF的活性较低，纯度一般在90％以下。现有报道也有用单克隆抗体进行免疫柱层析进行分离纯化，即使该方法纯化得到的NGF纯度能达到要求但该方法的弊端是单克隆抗体制作成本高，程序复杂且抗体制备量少、周期长。
虽然基因重组的技术使眼镜蛇毒NGF的来源更为方便和广泛，但是重组型的神经生长因子只能复制蛇毒神经因子的一级结构，在立体结构上与天然神经生长因子存在较大差异。而蛋白质在发挥活性是通过空间结构与受体之间的结合，因此造成了重组型的神经生长因子的活性较差,达不到临床用药要求。
本发明利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激发动物产生能有效吸附天然蛇毒NGF的多克隆抗体，进而利用免疫亲和的特异性及高效性；对天然蛇毒神经生长因子纯化，得到高纯度、高活性的蛇毒神经因子。减少纯化步骤和过程，减少生产成本，适应规模化生产。目前，尚未有相关的文献和报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，能够得到天然的、高活性的蛇毒神经因子，减少纯化步骤和过程，有效控制生产成本，适应规模化生产。
本发明提供的技术方案：
应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，包括以下步骤：
将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF-多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；
所述NGF-多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF多克隆抗体与载体结合交联所得。
进一步的，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的菌株为大肠杆菌JM101。
进一步的，所述眼镜蛇毒NGF基因原核表达的方法为：
将眼镜蛇毒NGF基因用核酸内切酶EcoRI和HindIII酶切合成基因，用凝胶回收试剂盒回收NGF基因片段酶切产物，同时用EcoRI和HindIII酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；将构建的重组质粒pET-32a-ngf转化入大肠杆菌JM101，构建表达NGF蛋白的重组菌株。
进一步的，所述的眼镜蛇毒NGF基因，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。
进一步的，所述眼镜蛇毒预处理的方法为：将蛇毒溶液加入缓冲液中，调节pH值为6.8～7.2，加40-50％硫酸铵，在0～4℃的环境中放置10～15小时，离心取沉淀，加超纯水复溶。
进一步的，所述的NGF多克隆抗体的纯化方法为：
将抗血清通过重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱进行吸附、洗脱和纯化，得到眼镜蛇毒NGF多克隆抗体；
所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱为：将重组眼镜蛇毒NGF与载体结合交联得到的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱。
进一步的，所述的载体为琼脂糖凝胶、纤维素、壳聚糖、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶、蛋白质A-琼脂糖凝胶、蛋白质G-琼脂糖凝胶、中的一种或多种。
进一步的，所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制作方法为：
将重组眼镜蛇毒NGF抗原或NGF-多克隆抗体与生物素进行结合得到结合生物素，再将结合生物素与链亲和素琼脂糖凝胶进行结合交联；即得到所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱。
生物素可以与抗原及抗体分别进行结合且不影响抗原及抗体之间的结合及生物活性，能快速结合，具有高度肥特异性和稳定性。两者的亲和常数比抗原-抗体高10-100万倍。一个抗原或抗体可以偶联十个生物素或亲和素分子；而生物素与亲和素分子的结合虽不属于免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定，由于1个亲和素有4个生物素分子的结合位点，因此可以连接更多的生物素化的抗原或抗体，且也能间接的提高抗原或抗体与免疫亲和柱的结合力，有效的增强免疫亲和柱的灵敏度和结合力。且生物素与亲和素结合快，且呈不可逆反应，而且在pH，温度，有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在。
进一步的，所述重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备方法为：
(1)链亲和素与活化的琼脂糖凝胶的偶联
用偶联缓冲液分别溶解琼脂糖凝胶及链亲和素，在琼脂糖凝胶溶液中加入链亲和素溶液；在室温下偶联4h；用PBS洗涤，得到链亲和素琼脂糖凝胶；
所述的偶联缓冲液为0.1mM碳酸氢钠，0.8mM氯化钠，pH8.9；
(2)结合生物素的制备
将重组眼镜蛇毒NGF抗原或NGF-多克隆抗体用0.1mM pH 8.0碳酸氢钠缓冲液溶解后，添加生物素进行混合、搅拌，保温2～4h后，再加入1mM氯化铵溶液，在室温下搅拌10min，并用PBS透析，得到结合生物素；
(3)重组眼镜蛇毒NGF抗原免疫亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备
用结合缓冲液分别溶解链亲和素琼脂糖凝胶及结合生物素；在室温的条件下，不断搅拌链亲和素琼脂糖凝胶，逐滴加入结合生物素溶液；搅拌反应20～22h后填充于萃取柱中加入结合缓冲液进行沉淀和洗涤；所述的结合缓冲液为：20-50mM磷酸二氢钠，100-150mM氯化钠，pH7.4-8.0。
进一步的，所述重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的纯化方法为：
(1)使用结合缓冲液进行平衡；
(2)将抗血清或蛇毒缓慢上样；
(3)使用结合缓冲液进行洗脱；
(4)使用洗脱缓冲液进行洗脱并收集；
所述的结合缓冲液为20-50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH 7.4-8.0；
所述的洗脱缓冲液为80-100mM甘氨酸并用盐酸调节pH为2.5-3.0。
本发明利用基因重组技术，使用产量较高的重组神经生长因子，激发动物产生能蛇毒NGF的多克隆抗体，进而规模化制备NGF-多克隆抗体亲和柱，利用免疫亲和的特异性及高效性；对天然蛇毒神经生长因子纯化，得到高纯度、高活性的蛇毒神经因子。减少纯化步骤和过程，减少生产成本，适应规模化生产。
本发明至少具有以下优点之一：
(1)本发明利用NGF多克隆抗体免疫亲和柱从蛇毒中提取天然蛇毒神经生长因子，纯化周期较短、生物活性强，且纯度较高。避免了传统方方法周期长、步骤多、试剂多对蛇毒神经生长因子造成的损失和影响。
(2)本发明采用原料方便、易生产规模化的重组蛇毒神经生长因子作为免疫原制备多克隆抗体的抗血清；得到的多克隆抗体及多克隆抗体免疫亲和柱能有效的吸附天然蛇毒神经生长因子，特异性好，结合性高。
(3)本发明利用原料方便、易生产规模化的重组蛇毒神经生长因子作为原料制备重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱分离多克隆抗体，特异性好，结合性高，操作方便，成本低，有利于规模化及生产化。
(4)本发明利用生物素与亲和素系统，提高抗原或抗体与免疫亲和柱的结合力，有效的增强免疫亲和柱的灵敏度和结合力。
(5)本发明提供的NGF多克隆抗体免疫亲和柱和重组蛇毒NGF抗原免疫亲和柱的柱容量高、特异性好、回收率较高。
具体实施方式
粗毒制备
中华眼镜蛇(Naja atra)，产地为云南、广东、广西、湖南、海南、江西、浙江、安徽。
采用咬皿法取眼镜蛇蛇毒后，用1000转/分离心10min，除去杂质，并冰冻干燥，保存在-4℃的冰冻环境中。
蛇毒神经因子的原核表达
(1)眼镜蛇NGF基因改造及合成
眼镜蛇NGF基因原始序列来源于申请人自己克隆，对原始序列进行去信号肽并在成熟肽前端加入起始密码子(atg)，并在序列两端各加一个上酶切位点(下划线标出段，用于构建表达载体)，5’端酶切位点为EcoRI(序列为GAATTC),3’端酶切位点为HindIII(序列为AAGCTT)。改造后具体序列如下：
CGGAATTCATGGAAGATCATCCTGTGCATAACCTAGGGGAACATTCTGTGTGTGACAGTGTCAGTGCCTGGGTTACCAAAACTACCGCAACAGACATCAAAGGCAATACGGTGACTGTGATGGAAAATGTAAATCTTGATAACAAAGTCTACAAGCAGTACTTCTTTGAAACCAAGTGCAAAAATCCAAATCCAGAACCGAGTGGTTGCAGGGGCATTGATTCCAGCCATTGGAATTCTTATTGTACCACAACAGACACATTTATCAAGGCATTAACCATGGAAGGCAATCAGGCATCCTGGCGCTTCATCCGGATTGAAACTGCCTGTGTGTGTGTAATCACTAAAAAAAAAGGAAAAAGCTTGG
并将上述序列合成由武汉金开瑞生物工程有限公司完成。
(2)原核表达载体的构建：用核酸内切酶EcoRI和HindIII酶切合成基因，用凝胶回收试剂盒回收NGF基因片段酶切产物，同时用EcoRI和HindIII酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；
(3)重组表达菌株的构建：将构建的重组质粒pET-32a-ngf转化入大肠杆菌JM101，构建表达NGF蛋白的重组菌株；
(4)NGF蛋白的诱导表达：将pET-32a-ngf阳性单菌落接种于5mL Kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取过夜培养物按1％体积接种于2管250mL新鲜LB培养基中，37℃振荡培养3h至OD600nm为0.6后，加IPTG至终浓度为0.4mmM，培养5h，离心收集菌体。
重组眼镜蛇毒NGF抗原的纯化
(1)将收集的NGF蛋白的诱导表达菌体重悬于5ml裂解缓冲液中，超声波破碎，条件为功率200-300W，超声3s停5s，总计20min，至菌悬液变澄清后12000r/min离心15min，重复3次，去除不溶性细胞碎片，获得含有NGF蛋白的上清液。
(2)镍柱层析：菌体裂解液的上清液用0.45μm滤膜过滤确保澄清，用镍亲和层析柱纯化，同时样品及Binding buffer中加适量NaCl。相关操作过程参照GE公司提供的操作指南进行：转移树脂到柱子，待完全沉降后，用双蒸水洗涤5个柱体积，加3个柱体积Ni2+溶液；用ddH2O洗涤，除尽未挂柱的Ni2+；10×柱体积的Binding buffer平衡→上样→10×柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液→Elution buffer洗脱→得到重组蛋白NGF(由SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列组成)。
重组眼镜蛇毒NGF抗体亲和柱的制备
(1)琼脂糖凝胶sepHarose2B的活化
取2％的琼脂糖凝胶sepHarose2B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇。用漏斗过滤掉水分。称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入0.8mM的氢氧化钠7.5ml，30％的环氧氯丙烷2ml，2mg/ml的硼氢化钠5ml，在25℃下摇床反应8h。反应后，用50ml蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
(2)链亲和素与活化的琼脂糖凝胶的偶联
取1克活化后的琼脂糖凝胶，用偶联缓冲液(0.1mM碳酸氢钠，0.8mM氯化钠，pH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的链亲和素20ml，室温下偶联4h。将偶联好的琼脂糖载体用20mmM、pH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次，得到链亲和素琼脂糖凝胶。
(3)重组眼镜蛇毒NGF抗原与生物素的偶联
将重组眼镜蛇毒NGF抗原用0.1mM pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/ml，用0.1mM pH 8.0碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析。用1ml二甲基亚砜溶解生物素1mg。取1mlNGF抗原溶液与120μl生物素溶液混合；在室温下持续搅拌，保温2～4h。再加入9.6μl1mM氯化铵溶液，在室温下搅拌10min。用PBS充分透析，以除去游离的生物素；得到重组眼镜蛇毒NGF抗原-生物素。
可将上述制得样品加入0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存。
(4)重组眼镜蛇毒NGF抗原免疫亲和柱的制备
称取1.0g链亲和素琼脂糖凝胶，放入锥型瓶中，量取5mL结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)溶解链亲和素琼脂糖凝胶；
室温25℃搅拌混匀10min，逐滴加入用1mL结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)溶解的重组眼镜蛇毒NGF抗原-生物素溶液(浓度为2mg/mL)进行结合，搅拌反应20～22h后，得到重组眼镜蛇毒NGF抗原-生物素-链亲和素琼脂糖凝胶。
将上述制备的重组眼镜蛇毒NGF抗原-生物素-链亲和素琼脂糖凝胶(0.2mL)填充于固相萃取柱中，加入结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)进行自然沉淀和洗涤，并保存于含0.02％叠氮钠结合缓冲液中，得到NGF多克隆抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用。
多克隆抗体抗血清的制备
用1ml的弗氏完全佐剂(Sigma–Aldrich Inc.)分别溶解500μg纯化的重组眼镜蛇毒NGF，充分混合后通过背部皮下多点注射的方法分别注射到新西兰大白兔的皮下。在上述兔子首次免疫后的第14、28、42天时再分别用同样的方式给兔子进行加强免疫，此三次加强免疫抗原用弗氏不完全佐剂(Sigma–Aldrich Inc.)溶解，且抗原的剂量减半。在最后一次加强免疫结束后的第七天将兔子麻醉后(3％戊巴比妥，静脉注射1ml/kg)通过颈静脉插管的方法获取兔子血液，新鲜血液4℃过夜静置后2000g离心30min得到含有NGF多克隆抗体的抗血清。
采用间接酶联免疫方法测定抗血清效价，抗血清效价达到160000以上。
NGF多克隆抗体的纯化
在重组眼镜蛇毒NGF抗原免疫亲和柱中，使用结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)平衡5个柱体积，流速为80～120cm/h。将含有NGF多克隆抗体的抗血清缓慢上柱，流速为15～50cm/h，为保证抗原与多克隆抗体的充分结合，上样后用结合缓冲液平衡10个柱体积以上，或平衡至基线，洗去杂质，流速为80～120cm/h。使用洗脱缓冲液(80mM甘氨酸-盐酸，pH 2.5)洗10～20个柱体积，流速为100cm/h。收集的洗脱液调节pH值为5.5，在0～4℃的环境中放置10～15h，离心取沉淀，得到NGF多克隆抗体。
洗脱后的柱子用结合缓冲液平衡，并保存于含0.02％叠氮钠结合缓冲液中，或进行下一次纯化。
NGF多克隆抗体免疫亲和柱的制备
(1)NGF多克隆抗体与生物素的偶联
将NGF多克隆抗体用0.1mM pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/ml，用0.1mM pH8.0碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析。用1ml二甲基亚砜溶解生物素1mg。取1mlNGF多克隆抗体溶液与120μl生物素溶液混合；在室温下持续搅拌，保温2～4h。再加入9.6μl1mM氯化铵溶液，在室温下搅拌10min。用PBS充分透析，以除去游离的生物素；得到NGF多克隆抗体-生物素。
可将上述制得样品加入0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存。
(2)NGF多克隆抗体免疫亲和柱的制备
称取1.0g链亲和素琼脂糖凝胶，放入锥型瓶中，量取5mL结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mmM氯化钠，pH7.4)溶解链亲和素琼脂糖凝胶；
室温25℃搅拌混匀10min，逐滴加入用1mL结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)溶解的NGF多克隆抗体-生物素溶液(浓度为2mg/mL)进行结合，搅拌反应20-22h后，得到NGF多克隆抗体-生物素-链亲和素琼脂糖凝胶。
将上述制备的NGF多克隆抗体-生物素-链亲和素琼脂糖凝胶(0.2mL)填充于固相萃取柱中，加入结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)进行自然沉淀和洗涤，并保存于含0.02％叠氮钠结合缓冲液中，得到NGF多克隆抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用。
眼镜蛇毒神经生长因子NGF的纯化
眼镜蛇毒预处理：将蛇毒溶液加入结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠)调节pH值为6.8-7.2，加40-50％硫酸铵，在0～4℃的环境中放置10～15h，离心取沉淀，用超纯水复溶后离心并弃沉淀。将上清用结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)稀释(v/v 1:5)，制得浓度为2mg/mL的眼镜蛇毒上样液待用。
在NGF多克隆抗体免疫亲和柱中，使用结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)平衡5个柱体积，流速为80～120cm/h。将预处理后的眼镜蛇毒上样液缓慢上柱，流速为15～50cm/h，为保证抗原与多克隆抗体的充分结合，上样后用结合缓冲液平衡10个柱体积以上，或平衡至基线，洗去杂质，流速为80～120cm/h。使用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-盐酸，pH3.0)洗10～20个柱体积，流速为100cm/h。收集洗脱液并用50mM Tris-HClph8.0缓冲液稀释5倍，备用。
将重组眼镜蛇毒NGF通过上述的NGF多克隆抗体免疫亲和柱，亦能有效的富集纯化重组眼镜蛇毒NGF。
洗脱后的柱子用结合缓冲液平衡，并保存于含0.02％叠氮钠结合缓冲液中，或进行下一次纯化。
最后运用蛋白全自动纯化系统进行最终纯化得到纯度≥98％的NGF。具体操作：
缓冲液A液为50mM Tris-HCl ph8.0，B液为1M NaC、l50mM Tris-HCl ph8.0；纯化柱为GE公司的Mono Q；
洗浴程序为0-30分钟，NaCl浓度变化0-0.6M。NGF洗脱时间为21.5分钟。
重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱的柱容量的测定：
取1g重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱用结合缓冲液冲洗，将10mL结合缓冲液溶解的NGF多克隆抗体标准品溶液(浓度为50ng/mL，NGF多克隆抗体的含量总计为500ng)过柱，用10个柱体积结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)冲洗柱子去除未结合的NGF多克隆抗体，最后用10个柱体积洗脱缓冲液(80mM甘氨酸-盐酸，pH 2.5)，1mL/管分管收集，用HPLC检测洗脱液中NGF多克隆抗体含量。结果表明，1g重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱的柱容量为220～250ng。
HPLC的检测方法：采用waters公司的2695液相色谱系统、2487紫外检测仪，色谱柱为TOSOH的TSKG3000SWXL(7.8mm×30cm),流动相为0.25mol/L磷酸盐缓冲液(称取磷酸氢二钠54.65g、磷酸二氢钠15.25g、氯化钠8.5g溶解于1L水中，pH 6.8),流动相的流速为0.8ml/min,进样体积20μl,检测波长214nm。采集后用Empower 2对各谱图进行积分及分析。
重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱的加标回收率的测定：
取20mL不含NGF多克隆抗体的血清置于50mL离心管中，分别加入NGF多克隆抗体标准品浓度至2、10、20μg/kg，加入20mL结合缓冲液振荡10min得到样品提取液待用。
取1g重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱用10个柱体积结合缓冲液洗脱，分别加入10mL样品提取液，用10个柱体积结合缓冲液(50mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH8.0)洗脱，最后用10个柱体积洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液用HPLC上机检测NGF多克隆抗体含量。上述实验重复进行5次，血液中的多克隆抗体NGF的回收率都在92～97％之间，RSD(相对标准偏差)均小于6％，其结果表明：本发明的方法满足抗血清中NGF多克隆抗体的纯化。
NGF多克隆抗体免疫亲和柱的柱容量的测定：
取1g NGF多克隆抗体免疫亲和柱用结合缓冲液冲洗，将10mL结合缓冲液溶解的NGF标准品溶液(浓度为50ng/mL，NGF多克隆抗体的含量总计为500ng)过柱，用结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)冲洗柱子去除未结合的NGF，平衡10个柱体积，最后用10个柱体积洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-盐酸，pH3.0)，1mL/管分管收集，用HPLC检测洗脱液中NGF的含量。结果表明，1g NGF多克隆抗体免疫亲和柱的柱容量为240～260ng。
NGF多克隆抗体免疫亲和柱的加标回收率的测定：
取20mL不含NGF的蛇毒置于50mL离心管中，分别加入NGF多克隆抗体标准品浓度至2、10、20μg/kg，加入20mL结合缓冲液振荡10min得到样品提取液待用。
将1g NGF多克隆抗体免疫亲和柱用10mL结合缓冲液洗脱，分别加入10mL样品提取液，用10个柱体积结合缓冲液(20mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH7.4)洗脱，最后用10个柱体积洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液用HPLC上机检测NGF含量。上述实验重复进行5次，蛇毒中的NGF的回收率都在94～99％之间，RSD(相对标准偏差)均小于4％，其结果表明：本发明的方法满足蛇毒中NGF的纯化。
纯化眼镜蛇毒神经生长因子NGF的生物学活性测试
(1)测试样品：将眼镜蛇NGF基因(SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，用核酸内切酶EcoRI和HindIII酶切，用凝胶回收试剂盒回收NGF基因片段酶切产物，同时用EcoRI和HindIII酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；将构建的重组质粒pET-32a-ngf分别转化入①大肠杆菌JM101、②大肠杆菌BL21、③大肠杆菌JM83、④大肠杆菌ED8767构建表达NGF蛋白的重组菌株；并将上述重组菌株获得的重组眼镜蛇毒纯化后作为免疫原，免疫家兔获得NGF多克隆抗体并按上述方法分别制作多克隆抗体免疫柱。蛇毒预处理后，分别通过以上的多克隆抗体柱，进行眼镜蛇毒神经生长因子NGF的富集和蛋白全自动纯化系统纯化，得到测试样品。
(2)活性测试的方法：用1ml基础培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640)溶解各测试样品，使测试样品的起始浓度为250U/ml,用基础培养基稀释至起始浓度，在96空板中倍比稀释，完成稀释后50ul/孔转移至新的96孔细胞培养板中。TF1细胞用完全培养基(基础培养基假加入10ng/ml GM-CSF)培养24-48h，收获细胞，1000rpm离心5min，细胞沉淀用RPMI1640清洗，重悬，计数，调整细胞浓度，50ul/孔加入已加有不同浓度NGF的96孔板中,37℃、5％CO2条件下培养一定时间后，加入MTT染色液20ul/孔，37℃放置5h后，加入MTT裂解液(异丙醇450ml，SDS 2.5mg,浓盐酸25μmol/L，补水至500ml)100ul/孔，吹打使其完全溶解，放入酶标仪，以630nm为参比波长，记录测定结果，结果取2个复孔的平取值，并进行样品活性测试。其中样品的生物学活性与其蛋白浓度之比为其比活性。
(3)纯度检测方法：NGF标准品为本公司纯化备用，采用waters公司的2695液相色谱系统、2487紫外检测仪，色谱柱为TOSOH的TSKG3000 SWXL(7.8mm×30cm),流动相为0.25mol/L磷酸盐缓冲液,流动相的流速为0.8ml/min,进样体积20μl,检测波长214nm。采集后用Empower 2对各谱图进行积分及分析。
表1.不同菌株表达蛋白获得的多克隆抗体免疫亲和柱得到的蛇毒NGF的活性测试
测试样品 比活性(10<sup>3</sup>U/mg) 纯度
①大肠杆菌JM101 14.8 98％
②大肠杆菌BL21 6.2 60％
③大肠杆菌JM83 8.6 71％
④大肠杆菌ED8767 5.0 56％
NGF标准品 15.0 100％
通过上表说明，菌株选择对眼镜蛇毒NGF基因的重组表达具有关键性作用，眼镜蛇毒NGF蛋白质二级结构、三级结构及立体结构主要通过菌种内部的生物化学修饰，使其获得不同的立体构型，从而具有不同的生物活性。本申请中通过大肠杆菌菌株JM101表达获得与天然结构相似的重组蛋白,同时免疫动物获得的多克隆抗体能与天然眼镜蛇毒NGF有效的进行结合，特异性高。将其制备的多克隆抗体免疫亲和柱与蛇毒进行分离，能对眼镜蛇毒NGF高效结合，使其得到高纯度、高活性的眼镜蛇毒NGF。
SEQUENCE LISTING
<110> 奔驰生物科技（云南）有限公司
<120> 应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> Naja atra
<220>
<221> NGF-conding-DNA
<222> (12)..(355)
<400> 1
CGGAA TTCAT GGAAG ATCAT CCTGT GCATA ACCTA GGGGA ACATT CTGTG 50
TGTGA CAGTG TCAGT GCCTG GGTTA CCAAA ACTAC CGCAA CAGAC ATCAA 100
AGGCA ATACG GTGAC TGTGA TGGAA AATGT AAATC TTGAT AACAA AGTCT 150
ACAAG CAGTA CTTCT TTGAA ACCAA GTGCA AAAAT CCAAA TCCAG AACCG 200
AGTGG TTGCA GGGGC ATTGA TTCCA GCCAT TGGAA TTCTT ATTGT ACCAC 250
AACAG ACACA TTTAT CAAGG CATTA ACCAT GGAAG GCAAT CAGGC ATCCT 300
GGCGC TTCAT CCGGA TTGAA ACTGC CTGTG TGTGT GTAAT CACTA AAAAA 350
AAAGG AAAAA GCTTG G 366
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Naja atra
<220>
<221> NGF-protein
<222> (1)..(117)
<400> 1
EDHPV HNLGE HSVCD SVSAW VTKTT ATDIK 30
GENTV TVMEN VNLDN KVYKE YFFET KCKNP 60
NPEPS GCRGI DSSHW NSYCT ETDTF IKALT 90
MEGNQ ASWRF IRIDT ACVCV ITKKT GN 117

Claims (7)

1.应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将眼镜蛇毒预处理后，通过NGF-多克隆抗体亲和柱进行吸附、洗脱和进一步纯化，得到眼镜蛇毒神经生长因子；
所述NGF-多克隆抗体亲和柱为：通过眼镜蛇毒NGF 基因原核表达，纯化分离得到重组眼镜蛇毒NGF；将重组眼镜蛇毒NGF 作为免疫原，免疫动物得到抗血清，并分离纯化得到NGF多克隆抗体；将NGF 多克隆抗体与载体结合交联所得；
所述眼镜蛇毒NGF 基因原核表达的载体为大肠杆菌JM101；
所述眼镜蛇毒NGF 基因原核表达的方法为：
将眼镜蛇毒NGF 基因用核酸内切酶EcoRI 和HindIII 酶切合成基因，用凝胶回收试剂盒回收NGF 基因片段酶切产物，同时用EcoRI 和HindIII 酶切原核表达载体pET-32a，将酶切后的基因片段和载体通过T4 DNA 连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-ngf；将构建的重组质粒pET-32a-ngf 转化入大肠杆菌JM101，构建表达NGF 蛋白的重组菌株；
所述的眼镜蛇毒NGF基因，由SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1 所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述眼镜蛇毒预处理的方法为：将蛇毒溶液加入缓冲液中，调节pH 值为6.8～7.2，加40-50%硫酸铵，在0～4℃的环境中放置10～15 小时，离心取沉淀。
3.根据权利要求1 所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的NGF 多克隆抗体的纯化方法为：
将抗血清通过重组眼镜蛇毒NGF 抗原亲和柱进行吸附、洗脱和纯化，得到眼镜蛇毒NGF多克隆抗体；所述的重组眼镜蛇毒NGF 抗原亲和柱为：将重组眼镜蛇毒NGF 与载体结合交联得到的重组眼镜蛇毒NGF 抗原亲和柱。
4.根据权利要求1 或3所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的载体为琼脂糖凝胶、纤维素、壳聚糖、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶、蛋白质A-琼脂糖凝胶、蛋白质G-琼脂糖凝胶中的一种或多种。
5.根据权利要求3 所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制作方法为：
将重组眼镜蛇毒NGF抗原或NGF-多克隆抗体与生物素进行结合得到结合生物素，再将结合生物素与链亲和素琼脂糖凝胶进行结合交联；即得到所述的重组眼镜蛇毒NGF抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱。
6.根据权利要求5 所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述重组眼镜蛇毒NGF 抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备方法为：
（1）链亲和素与活化的琼脂糖凝胶的偶联用偶联缓冲液分别溶解琼脂糖凝胶及链亲和素，在琼脂糖凝胶溶液中加入链亲和素溶液；在室温下偶联4 h；用PBS 洗涤，得到链亲和素琼脂糖凝胶；所述的偶联缓冲液为0.1 mM 碳酸氢钠，0.8 mM 氯化钠，pH8.9；
（2）结合生物素的制备
将重组眼镜蛇毒NGF 抗原或NGF-多克隆抗体用0.1 mM pH 8.0 碳酸氢钠缓冲液溶解后，添加生物素进行混合、搅拌，保温2～4h 后，再加入1 mM 氯化铵溶液，在室温下搅拌10min，并用PBS 透析，得到结合生物素；
（3）重组眼镜蛇毒NGF 抗原免疫亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的制备用结合缓冲液分别溶解链亲和素琼脂糖凝胶及结合生物素；在室温的条件下，不断搅拌链亲和素琼脂糖凝胶，逐滴加入结合生物素溶液；搅拌反应20～22h 后填充于萃取柱中加入结合缓冲液进行沉淀和洗涤；所述的结合缓冲液为：20-50 mM 磷酸二氢钠，100-150 mM 氯化钠，pH7.4-8.0。
7.根据权利要求6 所述的应用多克隆抗体亲和柱纯化眼镜蛇毒神经生长因子的方法，其特征在于，所述重组眼镜蛇毒NGF 抗原亲和柱或NGF-多克隆抗体亲和柱的纯化方法为：
（1）使用结合缓冲液进行平衡；
（2）将抗血清或蛇毒缓慢上样；
（3）使用结合缓冲液进行洗脱；
（4）使用洗脱缓冲液进行洗脱并收集；
所述的结合缓冲液为20-50 mM 磷酸二氢钠，100-150 mM 氯化钠，pH 7.4-8.0；
所述的洗脱缓冲液为80-100mM 甘氨酸-盐酸，pH 2.5-3.0。
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