CN101921799A - 马血清淀粉样蛋白a1制备方法及表达载体和基因工程菌 - Google Patents
马血清淀粉样蛋白a1制备方法及表达载体和基因工程菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种可溶的基因工程马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的制备方法,及其表达载体和基因工程菌。本发明提供的表达载体为含有hoSAA1基因序列的质粒载体pET28a(+),并且hSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。本发明提供的基因工程菌是大肠杆菌,为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami,可表达可溶性目的蛋白。本发明制备方法采用镍交联亲和柱一步法,且用两次不同浓度的咪唑(imidazole)进行洗涤亲和柱,操作简便、得率高、耗时短,适于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及利用DNA重组技术生产蛋白质或多肽的领域,更具体地,本发明涉及基因工程制备马血清淀粉样蛋白A1(serum amyloid A1,hoSAA1)的方法,还涉及有关的表达载体和工程菌。
背景技术
血清淀粉样蛋白A1(serum amyloid A,SAA1)是一种急性期反应载脂蛋白,是由同一簇基因编码的一组多形性蛋白。主要由肝细胞合成。其N端的特异性结合区与高密度脂蛋白(HDL)形成SAA1-HDL颗粒,进而调节高密度脂蛋白的代谢,以增强与巨噬细胞亲和力并输送脂质至炎症部位,SAA1是有效的中性粒细胞激活剂,增强中性粒细胞的抗菌作用、抑制霉菌感染。另外,SAA1还表现出细胞因子的相似特性,可以诱发白介素1b(IL1b)产生。同样,SAA1还上调T淋巴细胞分泌干扰素。SAA1能减少金属蛋白酶的产生,从而引导组织损伤修复。
一般在临床上,人和其他一些哺乳动物均采用CRP(C-反应蛋白)作为炎症的重要生物检测指标,但马的CRP在炎症反应的临床检测中并不是主要的检测指标,这是因为CRP在正常马血清中存在较高的浓度,同时CRP相对于感染时期存在着一定的滞后性,即当马被感染后4-6天才能在病马体内发现其有2-4倍的差异,并且在病马的恢复期,CRP也下降的很慢。
马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1),分子量约12KD-14KD左右;是一个多态性蛋白,由几个相关的蛋白家族(SAA1-SAA13)组成。相对于CRP而言,hoSAA1对刺激更敏感、更准确。在细菌或病毒感染早期(一般感染后48小时),SAA1受到白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)等炎症因子刺激,在肝细胞中大量合成,在病马血清中含量有时可达正常浓度的400多倍(正常值一般小于7毫克/升)。同时hoSAA1在病马体内浓度在感染后3-4天开始快速下降,5天以后基本与正常马的血清浓度相近,其中没有反馈升高。可见,SAA1更适合作为病马炎症的生物检测指标,及时准确反应病马的感染及康复情况。因此,hoSAA1的临床应用和意义受到了极大的关注。
同样在马的一些相关疾病的诊断和治疗研究中,SAA1蛋白作为重要的生物指标也有报道,如Toru ANZAI等报道了有关赛马中肺炎引起的血清中SAA1增高(肺炎是引起赛马死亡的主要原因);Thoefiner MB等报道的病马手术后因细菌感染引起的血清中SAA1增高;Nanni.S等报道的有关患关节炎病马血清SAA1的增高等,由于SAA1在应急反应中早期性、高度敏感性、以及其与多种疾病的相关性,因此在临床上检测马血清中的SAA1含量具有很高的诊断价值。
鉴于hoSAA1在临床治疗及诊断中的重要性,目前国外对hoSAA1的研究越来越重视。但是由于hoSAA1在体内大部分是与HDL结合形成脂结合蛋白,因此对体内的SAA1进行分离纯化有较大的难度。同时,关于hoSAA1蛋白的体外表达,国内外均没有相关文献及专利进行报道。
目前体外表达SAA1蛋白普遍使用两种表达系统:大肠杆菌和昆虫表达系统,分别用于表达重组人GST-SAA1及rSAA1蛋白。其次,对于体外重组表达及纯化SAA1,由于其蛋白的特性,比如容易体外聚集、表达量低等特性,存在表达获得的可溶性蛋白少,纯化方法复杂等缺点,这些缺点长期以来一直限制了SAA1体外研究的进一步开展。另外,通过以上两种方法获得的大多数重组SAA1蛋白均为包涵体,在纯化过程中必须使用6M尿素或盐酸胍对纯化目的蛋白采取变复性等复杂手段,由此纯化获得的重组蛋白生物活性较低,并且活性不稳定。此外,该纯化方法耗时长、得率低、成本高、不利于大量生产。
本发明克服以上技术缺陷,通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的hoSAA1蛋白。通过基因人工合成的方法,去除了hoSAA1前体蛋白的N-端的20个氨基酸,并在N-端加上多聚组氨酸(6x His)亲和肽标记,进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌,获得了可溶的目的蛋白。既避免纯化反应中的变复性步骤,又最大可能地还原hoSAA1蛋白在体内的折叠结构,保持其有效的生物活性。又通过使用多聚组氨酸来简化其纯化方法,且纯化得率很高。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在大肠杆菌中表达可溶,并能通过亲和柱高效制备重组hoSAA1的方法,及其有关的表达载体和工程菌。
本发明提供一种马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程表达载体,该载体含有马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)基因序列的质粒载体pET28a(+),并且hoSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。
本发明还提供一种基因工程菌,它是大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami,并被本发明所述的表达载体所转化,该基因工程菌为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami。
本发明还提供一种克隆、表达、纯化马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程方法,所述方法包括如下步骤:
(1)将hoSAA1基因克隆于pBluescriptII载体;
(2)hoSAA1基因的亚克隆:
①将获得的pBluescriptII-hoSAA1载体转化到DH5a宿主菌中,筛选并提取包含目的DNA片段的质粒;
②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段;
③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后,直接定向连接到pET-28a(+)载体上;
④将连接产物转化到DH5a宿主菌中,提取质粒,用NdeI和HindIII双酶切;
⑤得到目的基因;
(3)培养和表达基因工程菌pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami;
(4)离心收集基因工程菌;
(5)融合蛋白SAA1的亲和柱纯化;
(6)透析除盐,得到可溶性目的蛋白,鉴定目的蛋白。
本发明通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的hoSAA1蛋白。本发明的制备方法以大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami为宿主菌,所述载体选用含有hoSAA1基因序列的质粒载体pET28a(+),且hoSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。通过基因人工合成的方法,针对hoSAA1的成熟肽进行克隆重组,去除了hoSAA1前体蛋白的N-端的20个氨基酸,并在其N端加上6个多聚组氨酸(6xHis)亲和多肽标记,构成hoSAA1-6His融合蛋白,进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌,通过镍亲和柱一步纯化法,且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤,获得可溶性的目的蛋白。
本发明首次采用多聚组氨酸融合表达载体(PET28a)来表达去除信号肽后的hoSAA1蛋白的技术方案,在国内外尚未见有报道。
本发明的有益效果在于:一是可以在大肠杆菌内表达大量可溶的hoSAA1蛋白;二是可利用融合蛋白的N端的6个多聚组氨酸多肽的纯化标记,简便高效的纯化获得高纯度的重组hoSAA1,有利于后续的纯化工艺。同时,本发明利用融合蛋白N端的6个多聚组氨酸多肽的纯化标记能简便,快速制备高纯度的hoSAA1蛋白,得到纯度90%以上的hoSAA1蛋白,这一发明内容作为hoSAA1重组蛋白的纯化工艺,在国内外也属首次报道。
本发明所述的目的基因亚克隆,是指对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆,其目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改造等。基因亚克隆的基本过程包括:(1)目的DNA片段和载体的制备;(2)目的DNA片段和载体的连接;(3)连接产物的转化;(4)重组子筛选。
本发明的镍亲和柱一步纯化法,纯化步骤简单,所需时间短,纯化全程时间较短,优选的纯化全程时间为4-6小时。纯化优化全程时间与纯化的菌液体积的关系一般为:1升(1L)的表达菌液,纯化时间需4小时左右。
本发明所述的“SAA1前体蛋白”,是指由SAA 1cDNA编码,在细胞内合成的,未切除信号肽的SAA全长蛋白。本发明所述的“SAA1的成熟肽”,是指在细胞内切除信号肽,分泌到血清中,具有生物功能的SAA1蛋白。
本发明所述的“镍亲和柱一步纯化法”,是指只通过一根镍亲和柱,通过合适方法,直接从亲和柱上获得所需要的目的蛋白。不需要依赖其他方法,也不需要依赖其他试剂再进一步纯化。
本发明的亲和柱的洗涤是采用两次不同浓度洗涤液的洗涤方法,改进了常规技术中原核表达系统的一次洗涤方式,得到产物更纯。更优选的是,所述两次不同浓度的洗涤液分别为10mM咪唑,30mM咪唑。
本发明的有益效果在于:(1)采用本发明方法修饰表达的hoSAA1蛋白为可溶性成熟蛋白,避免纯化反应中的变复性步骤,且最大可能性地还原hoSAA1蛋白在体内的折叠结构,保持其有效的生物活性;(2)多聚组氨酸的使用可以简化其纯化方法,且纯化得率很高。通过镍亲和柱一步纯化的方法,在1升工程菌液中可获得高达12mg以上的可溶性重组hoSAA1蛋白。
附图说明
图1:pET28a(+)-hoSAA1重组表达质粒的酶切鉴定;其中,M:DNA ladder;1-14:双酶切鉴定的不同克隆质粒,限制性内切酶为NedI、HindIII;
图2:pET28a-hoSAA1亚克隆方法示意图;
图3:PET28a-hoSAA1重组质粒图谱;
图4:15%的SDS-PAGE检测最终获得的重组蛋白;
图5:蛋白印迹(Western blot)试验;
图6:纯化蛋白的质谱上蛋白分子量分析。hoSAA1蛋白质分子量经质谱分析仪测定为:14.2KD。
具体实施方式
以下结合实施例和附图,来进一步阐述本发明。以下各实施例是为说明本发明而非为限制本发明范围。
实施例1hoSAA1编码基因的克隆、构建重组表达质粒pET28a(+)-hoSAA1
基因克隆、质粒构建的步骤如下:
(1)hoSAA1基因,如SEQ ID NO.1所示的,由Invitrogen公司合成,并克隆于pBluescriptII载体中;
(2)hoSAA1基因的亚克隆;
①将获得的pBluescriptII-SAA1载体转化到DH5 a宿主菌中,筛选并提取包含目的DNA片段的质粒;
②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段;
③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后,直接定向连接到pET-28a(+)载体上;
④再将连接产物转化到DH5a宿主菌中,提取质粒,用NdeI和HindIII双酶切鉴定。其中,酶切片段大小与预期设计片段大小一致的,即约为300个核苷酸的片段,为阳性克隆。
hoSAA1基因的亚克隆方法,如图1所示。
反应产物用琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示,插入片段的酶切位点为:
NdeI/HindIII,酶切片段的大小约为340bp,图2中所示得到的基因片段与预期设计的基因大小相符。以上常规实验方法,见Sambrooks等编著的《分子克隆实验指南》第二版,科学出版社1998年出版。
(3)将阳性克隆进行DNA序列测定。
将筛选得到的阳性克隆进行测序,如序列1,SEQ NO.1所示。SEQ NO.1序列为hoSAA1(from nt 61 to stop code),该序列中已经除去信号肽的序列部分。全长PET28a-hoSAA1重组质粒图谱,见图3所示。全长PET28a-hoSAA1重组质粒核甘酸序列,如序列2,SEQ NO.2所示,其中,SEQ NO.2中的黑体划线部分为插入hoSAA1基因序列。其测序结果与其基因库已报道hoSAA1序列的比较(NM_001081853),序列比较一致,如序列3,SEQ NO.3所示。
实施例2基因重组菌的大规模表达及纯化方法
重组hoSAA1-多聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌宿主中的表达
1)将PET28a-hoSAA1转化到Rosetta-gami大肠杆菌中在带有卡那霉素抗性(50ng/ml)的LB培养板上,37℃培养过夜;
2)挑取一个单菌落在50ml含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中,在37℃,250转/分钟的条件下,培养过夜;
3)2%接种培养到1L LB培养基中(包括50ug/ml卡那霉素),在37℃250转/分钟的条件下培养细菌至A600,O.D值为0.5;
4)加入IPTG至终浓度1mM然后在37℃,300转/分钟条件下诱导培养3小时;
5)高速离心4000rpm 20分钟,收集沉淀并保存在-80℃。
纯化重组hoSAA1-多聚组氨酸融合蛋白的试剂
(1)裂解液:50mM Tris-HCl pH 8.0,400mM NaCl,5mM imidazole,1mM PMSF,10mM 2-Me
(2)洗涤液1:50mM Tris-HCl pH 8.0,400mM NaCl,10mM imidazole,1mM PMSF,10mM 2-Me
(3)洗涤液2:50mM Tris-HCl pH 8.0,400mM NaCl,30mM imidazole,1mM PMSF,10mM 2-Me
(4)洗脱液2:50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,200mM imidazole,1mM PMSF,10mM 2-Me
纯化步骤:
1.将1升LB培养基表达的hoSAA1重组融合蛋白的大肠杆菌悬浮在50ml裂解液中;
2.在冰上超声4-5次,30秒/次;
3.10000g高速离心30分钟;
4.取上清上柱到3ml镍柱中;
5.用60ml洗涤液1清洗镍柱;
6.用60ml洗涤液2清洗镍柱;
7.用6ml洗脱液2从镍柱上洗脱目的蛋白,每11滴收集一个试管;
8.将洗脱的样品混合在一起,并用1XPBS,4℃透析三次过夜;
9.将透析好的样品保存在-80℃。
通常情况下,镍亲和柱纯化蛋白时往往使用一种浓度imidazole洗涤液洗涤亲和柱,而本发明纯化方法在裂解菌液离心过柱后,对亲和柱用两次不同浓度imidazole洗涤,从而获得高纯度hoSAA1重组蛋白。基因重组菌的表达及纯化结果,如附图4所示,其中,lane1:IPTG诱导以前总菌裂解液,lane2:IPTG诱导以后总菌裂解液,lane3:镍柱纯化后的产物。
实施例3蛋白印迹法对重组蛋白的证明
1)15%丙稀酰胺胶,90V,3小时;
2)通过Tris-glycine缓冲液将丙稀酰胺胶上的蛋白片段电转到PVDF膜上,条件为1X Tris-glycine缓冲液,20%甲醇,70V电压室温下转移3小时;
3)将电转后的PVDF膜取出,用1X PBST清洗30分钟;
4)用含有5%脱脂奶粉的PBST封闭45分钟;
5)用1X PBST漂洗PVDF膜3次,10分钟/次;
6)加入含1∶2000稀释的抗His抗体的PBST 8mL,室温反应1小时;
7)用1X PBST洗涤PVDF膜三次,15分钟/次;
8)加入含1∶1000稀释的抗小鼠的抗体,室温反应40分钟;
9)用1X PBST洗涤PVDF膜三次,15分钟/次;
10)用含0.3%H2O2和6mg二氨基联苯胺的显色液,显色15秒。
实验结果如图5所示,其中,lane1:镍柱纯化后的产物,M:标准分子量蛋白。
实施例4质谱对纯化蛋白的蛋白分子量进行分析
将以上实施例中所获得的纯化蛋白在质谱上进行分子量分析,按常规质谱分析方法,重组hoSAA1蛋白质分子量经质谱分析仪测定为:14.2KD,其结果如附图6所示,与从氨基酸序列计算得到的分子量相吻合。
序列表
<110>德赛诊断系统(上海)有限公司
<120>马血清淀粉样蛋白A1制备方法及表达载体和基因工程菌
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测序序列 82 TTGTTATCGTTCCTTGGAGAGGCTGCTCGAGGGACTTGGGACATGCTAAGAGCTTACAAT 141
报道序列 124 GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGAACTAT 183
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测序序列 142 GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGAACTAT 201
报道序列 184 GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATGCCAGA 243
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测序序列 202 GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATGCCAGA 261
报道序列 244 GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAGCAGAG 303
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测序序列 262 GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAGCAGAG 321
报道序列 304 GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCAATCAC 363
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测序序列 322 GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCAATCAC 381
报道序列 364 TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGAAGCTT 401
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测序序列 382 TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGA-GCTT 418
Claims (6)
1.一种马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程表达载体,其特征在于,该载体含有血清淀粉样蛋白A1基因序列的质粒载体pET28a(+),并且血清淀粉样蛋白A1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。
2.一种基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami,宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami,被权利要求1所述的表达载体所转化。
3.一种制备马血清淀粉样蛋白A1的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)将人工合成的SEQ ID NO.1所示的马血清淀粉样蛋白A1基因克隆于pBluescriptII载体;
(2)马血清淀粉样蛋白A1基因的亚克隆:
①将获得的pBluescriptII-hoSAA1载体转化到DH5a宿主菌中,筛选并提取包含目的DNA片段的质粒;
②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段;
③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后,直接定向连接到pET-28a(+)载体上;
④将连接产物转化到DH5a宿主菌中,提取质粒,通过用NdeI和HindIII双酶切筛选鉴定;
⑤得到重组目的基因的表达载体;
(3)培养和表达基因工程菌pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami;
(4)离心收集基因工程菌;
(5)融合蛋白SAA1的亲和柱纯化;
(6)透析除盐,得到可溶性目的蛋白。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中以大肠杆菌Escherichia coliRosetta-gami为宿主菌,以含有马血清淀粉样蛋白A1基因序列的质粒载体pET28a(+)为载体。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)是通过镍亲和柱一步纯化法,并且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述两次不同浓度的洗涤液分别为10mM咪唑,30mM咪唑。
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