CN101153059A - 用于鼻咽癌筛查、诊断和治疗效果预测的elisa试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鼻咽癌特异基因BRLF1的蛋白产物Rta的两个抗原性蛋白片段，其编码基因，重组载体，融合蛋白(GST－R185和GST－R150)，含有它们的鼻咽癌诊断试剂和ELISA试剂盒，以及它们在体外检测EB病毒的方法中的应用。本发明的ELISA试剂盒可以用于鼻咽癌筛查、早期诊断和治疗效果预测，优点是简单、灵敏、特异、适用于鼻咽癌的早期诊断和预后，以及高危人群的大规模筛查，易于大范围推广应用，使用安全而且无污染，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域。具体地，本发明涉及含有EB病毒裂解复制期立即早期基因BRLF1部分序列基因工程菌株的建立，其中两种重组质粒表达蛋白的纯化、其单克隆抗体的制备及应用。
背景技术
EB病毒是一种γ疱疹病毒，全球接近95％的成人感染有该病毒。EB病毒感染可分为潜伏感染期和裂解复制期两种状态，在初次感染后，该病毒可在宿主体内建立起终身潜伏感染，持续性的EB病毒裂解复制状态感染可导致一系列的人类恶性肿瘤(Rickinson AB，Lee SP，Steven NM.Cytotoxic T lymphocyte responses to Epstein-Barr virus.Curr Opin Immunol.1996 Aug；8(4)：492-7)。BRLF1基因位于EB病毒基因组ORF50，是EB病毒进入裂解复制状态早期表达的立即早期基因。BRLF1基因编码转录激活蛋白Rta(又称EB1)，长度为1818bp。有研究表明BRLF1基因能够在B淋巴细胞以及上皮细胞中有效的激活EB病毒进入裂解复制状态(Zalani S，Holley-Guthrie E，Kenney S.Epstein-Barr viral latency is disrupted by theimmediate-early BRLF1 protein through a cell-specific mechanism.Proc NatlAcad Sci U S A.1996 Aug 20；93(17)：9194-9；Ragoczy T，Heston L，Miller G.The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cycle genes and can disruptlatency in B lymphocytes.J Virol.1998 Oct；72(10)：7978-84)。Rta蛋白可以激活多种病毒基因的启动子，如BMLF1，BaRF1，BALF5等(Ragoczy T，Heston L，Miller G.The Epstein-Barr virus Rta protein activates lytic cyclegenes and can disrupt latency in B lymphocytes.J Virol.1998Oct；72(10)：7978-84)。因此由BRLF1基因表达的Rta蛋白是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件。
EB病毒终生在口咽部产生并通过口腔传染，初始感染可引起传染性单核细胞增多症，多发于儿童和年轻成人。经多年研究发现EB病毒与鼻咽癌、胃癌、肺癌以及一系列常见淋巴瘤均有相关。其中鼻咽癌与EB病毒关系最为密切，近年来通过对肿瘤上皮细胞中的病毒基因组与抗原的检测证实了二者的密切相关性(zur Hausen H，Schulte-Holthausen H，Klein G，Henle W，Henle G，Clifford P，Santesson L.EBV DNA in biopsies of Burkitttumours and anaplastic carcinomas of the nasopharynx.Nature.1970 Dec12；228(5276)：1056-8；Yeung WM，Zong YS，Chiu CT，Chan KH，Sham JS，Choy DT，Ng MH.Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma insitu.Int J Cancer.1993 Mar 12；53(5)：746-50)。鼻咽癌是东南亚地区常见肿瘤，与食道癌、肝癌并称中国三大肿瘤，且高发于我国南方数省，在南方各种恶性肿瘤中占第一位。对于EB病毒相关肿瘤控制的主要策略为：1、早期检测诊断后进行治疗，2、将疾病的发生理想的推迟至平均寿命之外，3、预防。由于EB病毒无法单独在体外培养，而大量细胞培养以及纯化带来的困难和不安全因素使直接从形态学检测EB病毒很难在临床上实现，更无法应用于大规模筛查工作。因此早期诊断多应用病毒特异性的抗原、抗体或遗传物质对EB病毒相关肿瘤进行早期诊断是目前控制EB病毒相关肿瘤行之有效的方法，现在诊断EB病毒相关疾病的主要指标为EB病毒壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗体。其中EBNA1在EB病毒潜伏期和裂解期均有表达，而VCA与EA虽然在鼻咽癌(Nasopharngeal carcinoma)(NPC)病人中检出率高，但其特异性不好，在健康人群中仍有较高的检出率。因此选择灵敏度与特异性好的检测指标是现在本研究领域急需解决的问题之一。
发明内容
本发明针对上述本领域急需解决的问题，利用EB病毒裂解复制期立即早期基因BRLF1的生物学特性，提供了具有高灵敏度和特异性的，可应用于诊断EB病毒相关疾病以及大规模人群筛查的新型检测指标及方法。
本发明的技术方案为：
提供2种重组有部分EB病毒裂解复制期立即早期基因BRLF1序列的质粒。提供两种由重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150表达的蛋白质分子，通过对序列进行软件抗原性分析获得上述两种蛋白质分子含有大部分由BRLF1基因编码Rta蛋白的表面抗原决定簇。将重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150转染至大肠杆菌BL21中进行表达，纯化后获得GST-R185和GST-R150融合蛋白。该融合蛋白可以单独或组合用于EB病毒抗体的检测。
技术效果：使用GST-R185和GST-R150融合蛋白分别及混合作为抗原以一定浓度包被ELISA反应板，检测抽取自人体的未抗凝静脉血血清中EBV BRLF1蛋白的抗体，检测鼻咽癌病人血清和正常人群血清。使用GST-R185蛋白与GST-R150蛋白的等比混合物作为诊断抗原组合进行ELISA检测后，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为：94％；正常人群检测的阴性率为92.7％，均高于常规使用的EBNA、EA、VCA抗体的检测。这两种蛋白质分子为鼻咽癌诊断提供新的高特异性的检测指标。因此，本检测试剂盒适用于对鼻咽癌病人进行辅助诊断以及正常人群的大规模筛查之用。
更详细地，本发明提供下列各项：
1.一种含有EB病毒抗原决定簇的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示。
2.一种含有EB病毒抗原决定簇的融合抗原蛋白，其含有如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.根据以上2的融合抗原蛋白，其为GST融合蛋白。
4.编码以上1的抗原蛋白的核苷酸序列。
5.根据以上4的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
6.含有根据以上4或5的核苷酸序列的重组质粒，优选为pGEX-R185或pGEX-R150。
7.一种鼻咽癌诊断试剂，其含有根据以上1-3中任何一项的抗原蛋白。
8.一种用于检测EB病毒抗体的组合诊断试剂，其包含
1)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的融合抗原蛋白；和
2)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的融合抗原蛋白。
9.一种用于鼻咽癌诊断的试剂盒，其包括根据以上7或8的诊断试剂。
10.一种体外检测EB病毒的方法，包括以下步骤：
(1)使用以上7或8所述的诊断试剂包被ELISA反应孔板；
(2)洗净反应孔板，用封闭液封闭；
(3)洗净反应孔板，加入待测血清并孵育；
(4)洗净反应孔板，加入标记二抗；
(5)洗净反应孔板，通过二抗相应检测方法判定结果。
更具体地，本发明包括以下内容：
1.一种含有EB病毒裂解状态早期基因BRLF1部分序列的质粒，其特征在于它具有附图1所述B95-8细胞源EB病毒BRLF1基因序列中514～1068bp的碱基序列，并重组于pGEX-5X-3质粒中。
2.一种含有EB病毒裂解状态早期基因BRLF1部分序列的质粒，其特征在于它具有附图1所述B95-8细胞源EB病毒BRLF1基因序列中1153～1603bp的碱基序列，并重组于pGEX-5X-3质粒中。150
3.一种适用于EB病毒相关疾病诊断的含有EB病毒抗原决定簇的重组蛋白，其特征在于由权利要求书1所述质粒的碱基序列所编码的GST融合蛋白。
4.一种适用于EB病毒相关疾病诊断的含有EB病毒抗原决定簇的重组蛋白，其特征在于由权利要求书2所述质粒的碱基序列所编码的GST融合蛋白。
5.一种以上1所述重组质粒的构建方法，其特征在于依次包括以下步骤：
将用TPA刺激过的B95-8细胞株内感染的EBV基因组进行RT-PCR扩增，获得BRLF1全长序列；
将上述BRLF1基因序列用末端补平连接法与质粒载体重组；
转染至感受态细菌中扩增，筛选含有插入片段的阳性克隆；
限制性内切酶酶切图谱分析阳性克隆，筛选出含有插入片段顺序正确的质粒的阳性克隆；
以所得阳性克隆所含重组质粒为模板，用PCR法扩增获得位置为514～1818bp的碱基序列。测序法检测序列的正确性；
将上述获得的碱基序列用末端补平连接法与质粒载体重组；
转染至感受态细菌中扩增，筛选含有插入片段顺序正确的阳性克隆；
限制性内切酶酶切图谱分析阳性克隆，筛选出含有插入片段顺序正确的阳性克隆；
以所述重组质粒为模板，用限制性内切酶酶切法获得位置为514～1068bp的碱基序列。测序法验证序列的正确性；
将上述获得的碱基序列用末端补平连接法与表达型质粒载体重组；
转染至感受态细菌中扩增，筛选含有插入片段的阳性克隆；
限制性内切酶酶切图谱分析阳性克隆，筛选出含有插入片段顺序正确的阳性克隆；
获得阳性克隆中所含质粒即为以上1所述质粒。
6.一种以上2所述重组质粒的构建方法，其特征在于依次包括以下步骤：
将用TPA刺激过的B95-8细胞株内感染的EBV基因组进行RT-PCR扩增，获得BRLF1全长序列。
以所得BRLF1全长为模板，用PCR法扩增获得位置为1153～1818bp的碱基序列。测序法检测序列的正确性。
将上述获得的碱基序列用末端补平连接法与质粒载体重组。
转染至感受态细菌中扩增，筛选含有插入片段顺序正确的阳性克隆。
限制性内切酶酶切图谱分析阳性克隆，筛选出含有插入片段顺序正确的阳性克隆。
以所述重组质粒为模板，用限制性内切酶酶切法获得位置为1153～1068bp的碱基序列。测序法验证序列的正确性。
将上述获得的碱基序列用末端补平连接法与表达型质粒载体重组。
转染至感受态细菌中扩增，筛选含有插入片段的阳性克隆。
限制性内切酶酶切图谱分析阳性克隆，筛选出含有插入片段顺序正确的阳性克隆。
获得阳性克隆中所含质粒即为以上2所述质粒。
7.根据以上3、4所述的适用于EB病毒相关疾病诊断的含有EB病毒抗原决定簇的蛋白的制备方法，其特征在于：
(1)制备重组质粒转染所用工程菌的具体步骤：
A、制备感受态细菌。
B、将以上1、2所述的重组质粒分别转入感受态细菌的细胞中。
C、通过Amp抗性培养平皿筛选转染成功的工程菌。
(2)上述适用于EB病毒相关疾病诊断的含有EB病毒抗原决定簇的蛋白表达与纯化的具体步骤：
A、将含有重组质粒的工程菌接种于Amp抗性的培养基中扩大培养。
B、加入适用于该工程菌的蛋白表达诱导试剂。
C、收集高效表达的工程菌菌落，进行破菌处理后获得以上4、5所述蛋白的粗提物，
D、用Glutahione Sepharose 4B或亲和层析柱对上述粗提物进行纯化。获得以上4、5所述蛋白质。
E、测定含有重组质粒的工程菌的表达效率。
8.一种用于检测EB病毒抗体的诊断抗原组合，其特征在于含有至少一种以上3、4所述重组蛋白。
9.一种用于检测EB病毒抗体，诊断EB病毒相关疾病的检测方法，其特征在于使用以上8所述的诊断抗原组合通过ELISA法检测EB病毒抗体。其特征在于依次包括以下步骤：
(1)使用以上8所述诊断抗原组合包被ELISA反应孔板。
(2)洗净反应孔板，用封闭液封闭。
(3)洗净反应孔板，加入待测血清，37℃孵育至少30分钟。
(4)洗净反应孔板，加入标记二抗。
(5)洗净反应孔板，通过二抗相应检测方法判定结果。
本发明公开了一种以鼻咽癌特异基因BRLF1的蛋白产物Rta为抗原，用于鼻咽癌筛查、早期诊断和治疗效果预测的ELISA试剂盒NPC-TARCINETM。试剂盒内设有Rta抗原检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其中，抗原检测板为吸附两个特异性基因重组Rta抗原(GST-R185和GST-R150)的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，阳性对照Rta抗体阳性的血清，阴性对照为牛血清白蛋白溶液。本发明的优点为：简单，敏感，特异，适用于鼻咽癌的早期诊断和预后，以及高危人群的大规模筛查，易于大范围推广应用，使用安全而且无污染，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1.BRLF1的cDNA全序列(SEQ ID NO：5)；
图2.BRLF1基因表达产物Rta蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)；
图3.pGEX-5X-3质粒结构示意图；
图4.重组质粒的酶切鉴定及电泳观察(M：标记；1：pGEX-R185原核表达载体；2：pGEX-R185原核表达载体Sal I酶切结果；3：pGEX-R185原核表达载体Sal I与EcoR I双酶切结果；4：pGEX-R185原核表达载体；5：pGEX-R150原核表达载体SalI酶切结果；6：pGEX-R185原核表达载体SalI与EcoRI双酶切结果)；
图5.重组质粒的PCR扩增鉴定(重组BRLF-R185I及BRLF-R150I序列扩增产物电泳图M：标记；1：BRLF1-R185I扩增产物；2：BRLF1-R150I扩增产物)；
图6.pGEX-R185原核表达载体重组部分的测序鉴定结果；
图7.pGEX-R150原核表达载体重组部分的测序鉴定结果；
图8.pGEX-R185原核表达载体插入序列在GeneBank中Blast比较结果(图为查询结果的截屏图，图中Query为提交的测序序列，Sbjct为基因库中收存序列，结果显示插入序列的碱基与GeneBank中的B95-8细胞株中EBV基因组104116～104670序列的匹配率为100％，基因库号为GI：59074。结果表明本研究构建的pGEX-R185为正确的重组载体)；
图9.GST-R185.重组蛋白诱导前后的时序性表达(M：标记；1：pGEX-R185诱导前细菌蛋白组；2：pGEX-R185诱导后1h细菌蛋白组；3：pGEX-R185诱导2h细菌蛋白组；4：pGEX-R185诱导3h细菌蛋白组；5：pGEX-R185诱导4h细菌蛋白组。白色三角所在条带为诱导后出现的重组蛋白；白色方形所在条带为诱导后出现的GST条带)；
图10.GST-R150.重组蛋白诱导前后的时序性表达(M：标记；1：pGEX-R150诱导前细菌蛋白组；2：pGEX-R150诱导后1h细菌蛋白组；3：pGEX-R150诱导2h细菌蛋白组；4：pGEX-R150诱导3h细菌蛋白组；5：pGEX-R150诱导4h细菌蛋白组。白色三角所在条带为诱导后出现的重组蛋白；白色方形所在条带为诱导后出现的GST条带)；
图11.GST抗体Western Blot检测R185I诱导前后的时序性表达(1：pGEX-R185诱导后1h；2：pGEX-R185诱导2h；3：pGEX-R185诱导3h；4：pGEX-R185诱导4h；5：pGEX-R185诱导前细菌蛋白组。细箭头所指条带为诱导后出现的重组蛋白；空心箭头所指条带为诱导后出现的GST条带)；
图12.GST抗体Western Blot检测R150I诱导前后的时序性表达(1：pGEX-R150诱导后1h；2：pGEX-R150诱导2h；3：pGEX-R150诱导3h；4：pGEX-R150诱导4h；5：pGEX-R150.诱导前细菌蛋白组。细箭头所指条带为诱导后出现的重组蛋白；空心箭头所指条带为诱导后出现的GST条带)；
图13.R185I亲和层析前后电泳图(M：标记；1：pGEX-R185破菌后离心上清；2：空白对照；3：pGEX-R185洗脱时收集的前3ml；4：pGEX-R185洗脱时收集的4～6ml；5：pGEX-R185洗脱时收集的前7～9ml。细箭头所指条带为目的重组蛋白；空心箭头所指条带为降解后剩余的GST条带)；
图14.R185I亲和层析前后电泳图(M：标记；1：pGEX-R185洗脱时收集的前3ml.；2：pGEX-R185破菌后离心上清)；
图15.R185I、R150I纯化后的GST抗体Western Blot检测(1：pGEX空质粒诱导检测；2：R150I纯化后检测；3：R185I纯化前检测；4：R185I诱导前检测；5：R185I纯化后检测；6：pGEX空质粒诱导检测。细箭头所指条带为纯化前后目的蛋白；空心箭头所指条带为纯化前后的GST条带)；
图16.R185I、R150I HPLC-分子筛纯化后电泳图(M：标记；1：R185IHPLC-分子筛纯化前；2：空白对照；3：R185I HPLC-分子筛纯化后峰尖部分；4：R185I HPLC-分子筛纯化后峰尖后下降部分；5：R150I HPLC-分子筛纯化后峰尖后下降部分；6：R150I HPLC-分子筛纯化后峰尖部分；7：R185I、R150I HPLC-分子筛纯化后等比混合检测。细箭头所指条带为目的重组蛋白；空心箭头所指条带为降解后剩余的GST条带)；
图17.GST-R150不同浓度包板检测NPC及正常血清结果；
图18.GST-R150不同浓度包板检测NPC及正常血清结果(图为均数曲线图，上部曲线表示NPC血清检测结果均数，下部曲线表示正常血清检测结果均数)；
图19.不同包板浓度时NPC病人血清同正常血清检测结果比值图(图A：GST-R185在不同包板浓度时NPC同正常血清检测结果比值曲线；图B：GST-R150在不同包板浓度时NPC同正常血清检测结果比值)；
图20.正常组同NPC病人组之间检测结果(图为两组人群检测结果的散点图，横坐标为两组组内的随机分组，左，NPC组，右，正常组)；
图21.被测样本的EA抗体浓度(图为被测样本中EA抗体浓度的检测结果绘制的散点图)；
图22.被测样本的VCA抗体浓度(图为被测样本中VCA抗体浓度的检测结果绘制的散点图，横坐标为被测样本的随机分组)。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1、重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150的获得
1、BRLF1基因的获得
(1)引物的设计与合成：根据已知BRLF1序列(GenBank号gi：94734074)设计的PCR引物序列为：
F：5′-CCGGAATTCATGAGGCCTAAAAAGGATGGCTT-3′；
R：5′-TGCTCTAGACTAAAATAAGCTGGTGTCAAAAATAG-3′
(2)RT-PCR扩增：
使用12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA)诱导B95-8细胞(ATCC Number：CRL-10624TM)中的EBV进入裂解期(Feng.P，Chan.SH，Soo.MY，etc.Antibody response to Epstein-Barr virus Rta protein in patientswith nasopharyngeal carcinoma：a new serologic parameter for diagnosis.Cancer 2001 Oct 1；92(7)：1872-80.)，采用RT-PCR方法获得BRLF1基因的cDNA，具体方法如下：
PCR反应管、吸头、扩增用水等均按常规进行DEPC处理。
采用TaKaRa公司两步法RT-PCR试剂盒(商品目录中的商品号TAK_RR019A)，以B95-8细胞总RNA为模板(提取方法见上述参考文献)，先进行反转录(RT)反应，反应体系如下：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 总RNA5×缓冲液寡dT(0.2μM)dNTP(10mM)rRNasinM-MLV无RNA的H2O | 341.51.5118 |
| 总共 | 20 |
混合均匀，置于PCR仪((Bio-Rad公司，my cyclerTM thermal cycle))中，30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。
再进行PCR反应，扩增反应体系如下：
| 试剂 | 体积(μl) |
| Pre-Taq混合物引物P1(0.2μM)引物P2(0.2μM)cDNAddH2O | 101126 |
| 总共 | 20 |
PCR扩增条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，扩增32个循环；72℃延伸10min。使用Omega公司的PCR产物纯化试剂盒按试剂盒说明回收并纯化上述扩增产物。使用TOPO TACloning Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，将1818bp全长BRLF1 cDNA片段克隆到质粒pTOPO-R605(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。
2.BRLF1基因表达产物Rta蛋白的基本信息分析结果
2.1氨基酸序列：
使用Vector NT VI软件对获得的基因序列进行密码子翻译，获得BRLF1基因表达产物Rta蛋白的氨基酸序列(GenBank号gi：94734074)：
MRPKKDGLEDFLRLTPEIKKQLGSLVSDYCNVLNKEFTAGSVEITLRSYKICKAFINEAKAHGREWGGLMATLNICNFWAILRNNRVRRRAENAGNDACSIACPIVMRYVLDHLIVVTDRFFIQAPSNRVMIPATIGTAMYKLLKHSRVRAYTYSKVLGVDRAAIMASGKQVVEHLNRMEKEGLLSSKFKAFCKWVFTYPVLEEMFQTMVSSKTGHLTDDVKDVRALIKTLPRASYSSHAGQRSYVSGVLPACLLSTKSKAVETPILVSGADRMDEELMGNDGGASHTEARYSESGQFHAFTDELESLPSPTMPLKPGAQSADCGDSSSSSSDSGNSDTEQSEREEARAEAPRLRAPKSRRTSRPNRGQTPCPSNAAEPEQPWIAAVHQESDERPIFPHPSKPTFLPPVKRKKGLRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF
2.2Rta蛋白的基本理化性质分析结果：
数据库Swiss-Prot中查询Rta蛋白氨基酸序列，分析其基本理化性质，得到以下初步结果：
等电点理论值：6.14
Ala(A) 52 8.6％ Arg(R) 39 6.4％ Asn(N) 19 3.1％
Asp(D) 32 5.3％ Cys(C) 12 2.0％ Gln(Q) 16 2.6％
Glu(E) 46 7.6％ Gly(G) 33 5.5％ His(H) 17 2.8％
Ile(I) 24 4.0％ Leu(L) 55 9.1％ Lys(K) 31 5.1％
Met(M) 17 2.8％ Phe(F) 20 3.3％ Pro(P) 53 8.8％
Ser(S) 55 9.1％ Thr(T) 36 6.0％ Trp(W) 5 0.8％
Tyr(Y) 10 1.7％ Val(V) 33 5.5％ Asx(B) 0 0.0％
Glx(Z) 0 0.0％ Xaa(X) 0 0.0％
在NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov域名下Neucleotide选项中查找EBV BRLF1基因cDNA全序列，应用软件Vector NTI Suit9进行整理并分析其基本构成及性质。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/域名下进行BLAST分析。
全BRLF1基因表达的蛋白的氨基酸数目达600多个，分子量大于60kDa，这么大的蛋白质在水溶液中的可溶性差，纯化难，从技术角度上看，不适合作为ELISA检测试剂使用。为此，可以选择该蛋白序列中较小的含不同抗原决定簇的蛋白质片段来用作ELISA检测试剂。将这些片段用于重组表达，不仅目标蛋白的产量高，而且容易纯化。
根据BLAST分析结果了解到在BRLF1基因序列中365-386同人类Ras干扰蛋白(RASIP1)mRNA中1315-1336部分序列相匹配，且该部位经抗原性分析发现有抗原决定簇，因此我们在筛选重组抗原时没有选择这一段，以免在检测人血清时发生交叉反应。在发明人的先前研究中，对BRLF1基因不同部分进行体外表达产生含不同抗原决定簇的蛋白质片段，对多个BRLF1基因扩增阳性病人的血清进行免疫沉淀反应检测，筛选抗原决定簇较好的蛋白质片段，发现BRLF1基因514～1068位置(SEQ ID NO：1)及1153～1602位置(SEQ ID NO：2)经过体外表达后同上述血清的反应性最好。因此根据上述两种原因，我们选择了514～1068位置及1153～1602位置进行重组融合蛋白质的构建，以求获得较好的抗原。
3、重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150的获得。
3.1引物合成：
根据以BRLF1的cDNA序列设计合成引物，在514～1068bp位置(编码Rta蛋白第171～356位氨基酸)(SEQ ID NO：3)以及1153～1602bp位置(编码Rta蛋白第384～594位氨基酸)(SEQ ID NO：4)中设计引物，分别在上游引物中导入限制性内切酶EcoR I酶切位点，在下游引物中导入限制性内切酶Sal I酶切位点。以克隆在pTOPO-R605中的BRLF1基因为模板分别进行PCR扩增，获得目的基因BRLF1-R185I和BRLF1-R150I。引物序列如下：
BRLF1-R185I
F1：5′-
gtagtggaacacctgaacaggat-3′
(引物全长30bp，方框内为酶切位点及保护碱基)
R1：5′-
ggcccgcaggcgcggggcctc-3′
(引物全长31bp，方框内为酶切位点及保护碱基)
BRLF1-R150I
F2：5′-
gcagcggtccaccaagagagcg-3′
(引物全长29bp，方框内为酶切位点及保护碱基)
R2：5′-
ggctgcttcctccttctgg-3′
(引物全长29bp，方框内为酶切位点及保护碱基)
3.2PCR扩增目的基因：
两种插入片段的扩增体系相同
| 试剂 | 体积(μl) |
| Pre-Taq混合物引物F(0.2μM)引物R(0.2μM)cDNAddH2O | 101126 |
| 总共 | 20 |
3.3PCR扩增条件如下：
BRLF1-R185I：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；扩增32个循环；72℃延伸10min。
BRLF1-R150I：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸40s；扩增32个循环；72℃延伸10min。
使用Omega公司的PCR产物纯化试剂盒按试剂盒说明回收并纯化上述扩增产物。
3.4载体构建：
3.4.1PCR扩增产物的酶切处理
参照Takara公司使用说明，采用双酶切方法，用限制性内切酶EcoR I和Sal I(NewEngland公司)酶切载体目的基因。
反应体系如下：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×缓冲液限制性内切酶EcoR I限制性内切酶Sal IR185I/R150IddH2O | 211151 |
| 总共 | 20 |
3.4.2原核表达载体pGEX-5X-3的酶切处理：
pGEX-5X-3质粒(商购自Amersham Biosciences，商品号27-4586-01，GenBank Accession No.U13858，GST(glutathione S-transferase)GeneFusion System)(附图3)是一个含tac启动子，能够进行化学诱导的高表达质粒载体，诱导剂可选用IPTG。该质粒含有lac Iq基因，能够以各种大肠杆菌为宿主菌进行高效表达，并可以用Glutathione Sepharose 4B对表达产物进行纯化。该质粒系统的纯化条件非常温和，能够将纯化时对所表达融合蛋白的抗原性及功能活性的影响降至最低。而且能够通过凝血酶或Xa蛋白酶对相应位置的识别剪切作用获得非融合的目的蛋白。本发明选用该质粒作为重组BRLF1基因表达蛋白的原核表达载体，能够将体外表达所产生的抗原性损失降到最低。
用限制性内切酶EcoR I和Sal I酶切载体pGEX-5X-3。反应体系如下：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×缓冲液限制性内切酶EcoR I限制性内切酶Sal IpGEX-5X-3ddH2O | 211106 |
| 总共 | 20 |
上述酶切产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统(Bio-Rad公司)的紫外灯照射下，按胶回收试剂盒(Takara公司D601)的说明回收目的片段。
3.4.3重组质粒的连接反应
上述酶切产物经凝胶回收纯化后在T4 DNA连接酶(Takara公司D2011A)作用下进行连接反应，插入片段与载体分子摩尔数比3～10∶1的比例16℃反应过夜，连接产物按照常规步骤转化感受态大肠杆菌JM109(商购Promega L2001)，挑阳性克隆(抗Amp)扩增，提质粒。连接反应设立阴性对照。连接反应体系如下：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×T4连接缓冲液pGEX-5X-3片段R185I片段/R150I片段T4连接酶ddH2O | 210413 |
| 总共 | 20 |
将在EcoR I和Sal I酶切位点插入R185I片段/R150I片段的pGEX-5X-3的重组载体分别命名为pGEX-R185和pGEX-R150。将pGEX-R185和pGEX-R150表达的重组融合蛋白分别命名为GST-R185蛋白和GST-R150蛋白。
3.4.4重组质粒的鉴定
3.4.4.1重组质粒的酶切鉴定及电泳观察：
用本实验室常规酶切方法将提取的重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150酶切。分别采用内切酶Sal I和EcoR I将质粒DNA进行单酶切及双酶切鉴定。
通过内切酶Sal I和EcoR I对重组质粒pGEX-R185进行双酶切后在555bp左右应该产生一条带，对重组质粒pGEX-R150进行双酶切后在450bp左右应该产生一条带。实验结果与预计相符。见图4。
对pGEX-R185重组表达载体进行内切酶Sal I单酶切，未见有酶切产物条带产生，而对其进行内切酶Sal I和EcoR I双酶切后发现在555bp左右位置出现条带。
pGEX-R150重组表达载体进行内切酶Sal I单酶切，未见有酶切产物条带产生，而对其进行内切酶Sal I和EcoR I双酶切后发现在450bp左右位置出现条带。
3.4.4.2重组质粒的PCR扩增鉴定
将获得的重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150经1∶1000倍稀释后作为模板，用上述R185与R150特异性的引物F1、R1和F2、R2进行PCR扩增反应。
pGEX-R185扩增产物位于BRLF1基因514～1068位置，应为555bp长。pGEX-R150扩增产物位于BRLF1基因1153～1602位置，应为450bp长。扩增产物经1g/L琼脂糖凝胶电泳分析，分别在400～500bp中间及500～600bp中间各出现了一条片段(图5)。根据电泳图中两个片段的大小推测，可以认为获得的重组质粒pGEX-R185与pGEX-R150包含需要的BRLF-R185I及BRLF-R150I片段。
3.4.4.3重组BRLF-R185I及BRLF-R150I原核表达载体的测序鉴定
用质粒提取试剂盒提取两种质粒pGEX-R185与pGEX-R150后将重组质粒送往上海博亚生物技术公司进行测序鉴定(图6，图7)。测序结果通过Chromas软件的查询功能找到引物设计部位，其间序列即为本研究中的插入序列，将插入序列提交基因数据库GeneBank进行BLAST比较，证实两个插入质粒pGEX-5X-3的片段是我们设计的引物所扩增的二种BRLF1基因中的514～1068及1153～1602片段(图8)。上述结果提示，我们获得了正确的目的基因，同时正确的构建了EB病毒BRLF1基因中的514～1068及1153～1602片段的原核表达载体。
实施例2、GST-R150与GST-R185蛋白的制备与纯化
1重组融合蛋白的诱导表达及鉴定
分别将上述pGEX-R185和pGEX-R150重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(商购Promega L1191)后，LB平板筛选单克隆，挑选单克隆小量培养过夜，37℃150rpm过夜，按1∶500扩大，1∶1000加入100mg/mlAMP，37℃，180rpm(台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司))，4h培养(全温振荡培养箱(哈尔滨东联厂，HZQ-F))。1mmol/L IPTG(TaKaRa公司)按1∶1000比例加入培养基，诱导4h。取诱导前、诱导后1h、2h、3h、4h的菌体经13000rpm离心取沉淀，加入变性Loading Buffer(商购Promega)沸煮后，做SDS-PAGE电泳分析。结果显示：转化有PGEX-R185和PGEX-R150重组质粒的大肠杆菌在诱导后分别有分子量为49.2kDa、45kDa左右的蛋白质高表达，诱导后4h可达到表达高峰期(图9，10)。用抗GST抗体(GST单克隆抗体的制备见Amersham Biosciences，GST GeneFusion System说明手册)做Western-Blot，检测GST-R185蛋白质，在高表达蛋白质条带处出现染色条带，另外有GST条带出现(图11，12)。
2重组表达融合蛋白的纯化
2.1重组融合蛋白的亲和层析纯化
纯化步骤为：
上清为纯化的GST-R185与GST-R150融合蛋白。
使用SDS-PAGE电泳及WesternBlot检测获得的蛋白。
结果发现分别在GST-R185蛋白和GST-R150蛋白均出现了同Western-Blot带型类似的条带，使用抗GST抗体做WesternBlot，检测GST-R185蛋白质，在蛋白质条带处出现染色条带，以及一些GST蛋白条带，分子量49.2kDa的条带为目的重组融合蛋白质。同样，GST-R150重组融合蛋白质也出现同样的现象，分子量45kDa的条带为目的重组融合蛋白质(图13，14，15)。
2.2HPLC-分子筛纯化
纯化步骤：
选用层析柱为Sephorose-100已装柱(Amersham Biosciences公司)。
A260nm波长观察柱内流出液体的蛋白含量。
用SDS-PAGE电泳观察纯化后蛋白。结果见图16。
实施例3应用ELISA法检测血清中EB病毒BRLF1基因表达抗原的抗体
检测原理：利用本发明制备的重组抗原(浓度用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定)包板，加入待检测血清，待检测血清中抗体与包板抗原结合后，应用辣根过氧化物酶标记抗人二抗与血清抗体结合，显色测定结果。检测步骤如下：
(1)将以上HPLC-分子筛纯化的GST-R185，GST-R150或GST-R185与GST-R150的等比(体积比1∶1)混合物作为不同的三种抗原组合分别进行ELISA检测。
(2)抗原包被：用包被稀释液(pH 9.6碳酸钠缓冲液)分别将上述不同诊断抗原或其等比组合稀释十倍。ELISA酶标板上每孔加入100μl，37℃反应2h。PBST洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(3)封闭：加入1％牛血清白蛋白(BSA)(成都溶海公司)封闭液(PBST配制)100μl/孔，37℃封闭1h，PBST(0.1M磷酸盐缓冲液+0.05％吐温-20，pH7.0)洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(4)待测血清：血清1∶80稀释后加入反应孔中，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板五次，每次每孔300μl，洗5min。
(5)酶标物：加入酶标羊抗人工作液(Amersham Biosciences公司)100μl/孔，37℃反应1h，，每次每孔300μl，洗5min。
(6)显色：加入TMB(四甲基联苯胺，武汉博士德公司)显色工作液(1ml TMB原液加9ml去离子水和250μl双氧水)，100μl/孔，显色10min。
(7)中止：加入1滴中止液(1N浓硫酸)中止显色。
(8)结果检测：使用450nm波长检测各孔吸光度(OD)值。
根据上述检测步骤，分别对确诊的鼻咽癌(NPC)患者的血清91例和健康人血清49例(这些血清样品来源于四川大学华西医院)进行血清中EB病毒BRLF1基因表达抗原的抗体的检测。
GST-R185以浓度2.67μg/ml、1.335μg/ml、0.6675μg/ml、0.334μg/ml、0.167μg/ml分别包被酶联免疫反应板，GST-R150以浓度2.31μg/ml、1.155μg/ml、0.578μg/ml、0.289μg/ml、0.144μg/ml分别包被酶联免疫反应板，检测数个NPC血清和正常血清，结果见图17、18。GST-R185和GST-R150在不同包板浓度时NPC病人血清同正常血清检测结果比值图如图19。可以明显看出，GST-R185和GST-R150蛋白分别作为抗原可以用于检测血清中EB病毒BRLF1基因表达抗原的抗体的检测，并且能够显著区分正常人和鼻咽癌患者。
通过上述检测方法，对上述确诊的鼻咽癌(NPC)患者的血清91例和健康人血清49例中Rta抗体检测结果进行统计学分析，认为在检测抗原浓度为1μg/ml下，OD450nm值大于0.49为阳性，小于0.49为阴性(P＜0.05)。即C.O.(cut-off value，阳性分界值)值为0.49。
另外，分别将GST-R185(1μg/ml)、GST-R150(1μg/ml)以及二者的等体积混合包被酶联免疫反应板，检测7个鼻咽癌未治疗组病人血清(1∶80稀释)，结果见(表1)。从表中结果可以看出，每组病人血清中的Rta抗体含量通过两种重组融合蛋白混合包板检测结果最好，单独使用一种重组融合蛋白检测值均较低。
表1 NPC病人血清初步检测结果
| 样本 | G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | G7 |
| 185单包150单包双包 | 0.8310.7260.939 | 0.6390.5390.673 | 0.6460.560.693 | 0.6990.5570.703 | 0.6770.5550.689 | 0.9390.5130.967 | 0.7070.5850.764 |
185单包-GST-R185单独包被；
150单包-GST-R150单独包被；
双包-GST-R185和GST-R150组合包被
按照上述方法，使用两种重组融合蛋白(1μg/ml)等比混合包板方式对收集的所有49例正常人血清和所有91例NPC病人的血清中Rta抗体进行检测。正常人血清的检测结果中，有一例明显偏移了全组的整体趋势，检测值为0.9，除此值以外，最高值为0.435，最低值为0.11，检测值主要分布于0.1～0.4之间，小于C.O.(cut-off value，阳性分界值)值0.49。正常人血清和NPC病人血清的检测结果的平均值分别为：0.278和0.571。用t检验对正常组和NPC病人组进行假设检验，结果为，T值＝8.334，P值＜0.005，说明两组数据间有差异(图20)。鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为：94％；正常人群检测的阴性率为92.7％。
部分样本血清中VCA及EA抗原的检测
为进一步确立本研究建立检测方法的诊断价值，使用临床上常用的EBV检测指标EA抗体和VCA抗体对本研究中部分样本进行了检测。
被检测样本有NPC样本中随机抽取的50例，正常样本中随机抽取的6例。
上述样本中EA抗体的检测结果：
根据EA抗体检测试剂盒(商购自中国预防医学研究院病毒学研究所)使用说明书操作步骤对标准样本及上述样本血清进行检测。根据试剂盒中5个标准样本的检测结果绘制标准曲线，并出计算标准曲线公式。标准曲线公式为Abs＝(-0.0145-2.44)/[1+(Conc/41.8)0.909]+2.44。用标准曲线公式计算出所有被测样本中的EA抗体浓度(图21)，得到以下结果。说明书中的判定值范围：小于8U/ml为阴性结果，8U/ml～12U/ml为可疑结果，大于12U/ml为阳性结果。根据上述结果对被测样本进行分析。共有22个样本为阳性，其中22个样本大于12U/ml，为阳性结果，一例为正常人样本，其余21例均为NPC样本，占所有NPC样本的约40％。有7例样本介于8U/ml～12U/ml间，其中有2例为NPC样本，占所有NPC样本的约4％。剩余36例样本均小于8U/ml。
上述样本中VCA抗体的检测结果：
根据VCA抗体检测试剂盒(商购自中国预防医学研究院病毒学研究所)使用说明书操作步骤对标准样本及上述样本血清进行检测。根据试剂盒中5个标准样本的检测结果绘制标准曲线，并出计算标准曲线公式。标准曲线公式为Abs＝(0.0482-2.45)/(1+[Conc/52.1)0.996]+2.45。用标准曲线公式计算出所有被测样本中的VCA抗体浓度(图22)，得到以下结果。说明书中的判定值范围：小于8U/ml为阴性结果，8U/ml～12U/ml为可疑结果，大于12U/ml为阳性结果。根据上述结果对被测样本进行分析。发现所有被测样本中的VCA浓度均小于8U/ml，分布于1～7.778之间，无阳性结果发现。
结论：使用GST-R185蛋白与GST-R150蛋白的等比混合物作为诊断抗原组合进行ELISA检测后，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为：94％；正常人群检测的阴性率为92.7％，均高于常规使用的EBNA、EA、VCA抗体的检测。因此，本检测试剂盒适用于对鼻咽癌病人进行辅助诊断以及正常人群的大规模筛查之用。
序列表
<110>同昕生物技术(北京)有限公司
<120>用于鼻咽癌筛查、诊断和治疗效果预测的ELISA试剂盒
<130>IB065546
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>555
<212>DNA
<213>1
<400>1
gtagtggaac acctgaacag gatggagaag gaaggcctcc taagctccaa gttcaaggcc 60
ttttgcaagt gggtgttcac ctatcccgtc ctcgaggaga tgttccagac tatggtctcg 120
tccaagacag gccatctgac ggacgatgtt aaggatgtca gggctctgat taagacactg 180
ccccgggcct cctactccag ccacgccgga cagaggagct acgtgagcgg cgtgcttccc 240
gcgtgcctgc tgtcaaccaa gtccaaggca gtggaaactc ctatcctcgt gtccggagcc 300
gacaggatgg acgaggagct catggggaat gatgggggtg cctctcacac cgaggcccgc 360
tactcggagt ccggacagtt tcatgctttt acagatgaac tcgaaagtct cccgagcccg 420
accatgcccc tgaagcccgg tgcccaaagc gccgactgcg gtgacagcag ttccagcagc 480
agtgactcgg gcaacagtga caccgagcag agcgagcggg aagaggccag ggccgaggcc 540
ccgcgcctgc gggcc 555
<210>2
<211>450
<212>DNA
<213>2
<400>2
gcagcggtcc accaagagag cgatgagaga cccatattcc cccacccctc aaagcccacc 60
tttcttcctc ccgttaaaag gaagaagggc ctcagggata gccgggaagg tatgttcctg 120
ccaaagccgg aagcgggcag tgccatatct gacgtgttcg aggggcgaga ggtgtgtcag 180
ccaaagagga tcaggccctt ccatccaccc ggatccccgt gggccaaccg gcccctgcct 240
gcctctttgg ctcccacccc cacaggacct gtccatgaac cggtcggatc cctaacgcca 300
gccccggtgc cccagccact tgacccggcc cccgcagtaa cccccgaggc aagtcatctg 360
ttggaggacc ctgatgaaga aaccagtcag gccgtgaagg ccctaaggga gatggctgac 420
actgttattc cccagaagga ggaagcagcc 450
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>3
<400>3
Val Val Glu His Leu Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Lys Phe Lys Ala Phe Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu
20 25 30
Glu Met Phe Gln Thr Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp
35 40 45
Asp Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser
50 55 60
Tyr Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro
65 70 75 80
Ala Cys Leu Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu
85 90 95
Val Ser Gly Ala Asp Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly
100 105 110
Gly Ala Ser His Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His
115 120 125
Ala Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala
180 185
<210>4
<211>150
<212>PRT
<213>4
<400>4
Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg
20 25 30
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
35 40 45
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
50 55 60
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
65 70 75 80
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
85 90 95
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
115 120 125
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
130 135 140
Gln Lys Glu Glu Ala Ala
145 150
<210>5
<211>1818
<212>DNA
<213>5
<400>5
atgaggccta aaaaggatgg cttggaagac tttctgaggc taactcctga aatcaaaaag 60
cagctgggct ctctggtctc tgactactgc aacgtcctca acaaggaatt tacagccggg 120
agtgtggaga ttactctgag atcctacaaa atatgcaagg catttataaa tgaggccaag 180
gcccacgggc gagaatgggg cgggctaatg gccacgctca acatctgcaa tttttgggcc 240
attctccgaa acaacagggt aagaagacgg gctgagaatg ccggcaacga cgcatgttcc 300
atcgcgtgcc ctatagtgat gcgctacgtg ttagaccacc tgatagtggt cactgacaga 360
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tacaagctcc taaaacacag tcgggtgcgg gcctacacct acagcaaggt gctgggcgtg 480
gaccgcgcgg ccatcatggc ctccggcaag caggtagtgg aacacctgaa caggatggag 540
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gtcctcgagg agatgttcca gactatggtc tcgtccaaga caggccatct gacggacgat 660
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<213>6
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Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val
20 25 30
Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser
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Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg
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Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp
100 105 110
His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn
115 120 125
Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu
130 135 140
Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val
145 150 155 160
Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu
165 170 175
Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe
180 185 190
Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr
195 200 205
Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val
210 215 220
Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala
225 230 235 240
Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser
245 250 255
Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp
260 265 270
Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr
275 280 285
Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn
325 330 335
Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro
340 345 350
Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly
355 360 365
Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Ala Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile
370 375 380
Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro
385 390 395 400
Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg
405 410 415
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
420 425 430
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
435 440 445
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
450 455 460
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
465 470 475 480
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
485 490 495
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
500 505 510
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
515 520 525
Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro
530 535 540
Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met
545 550 555 560
Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu
565 570 575
Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His
580 585 590
Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe
595 600 605
Claims (10)
1.一种含有EB病毒抗原决定簇的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示。
2.一种含有EB病毒抗原决定簇的融合抗原蛋白，其含有如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的融合抗原蛋白，其为GST融合蛋白。
4.编码权利要求1的抗原蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求4的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
6.含有根据权利要求4或5的核苷酸序列的重组质粒，优选为pGEX-R185或pGEX-R150。
7.一种鼻咽癌诊断试剂，其含有根据权利要求1-3中任何一项的抗原蛋白。
8.一种用于检测EB病毒抗体的组合诊断试剂，其包含
1)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的融合抗原蛋白；和
2)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的抗原蛋白或含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的融合抗原蛋白。
9.一种用于鼻咽癌诊断的试剂盒，其包括根据权利要求7或8的诊断试剂。
10.一种体外检测EB病毒的方法，包括以下步骤：
(1)使用权利要求7或8所述的诊断试剂包被ELISA反应孔板；
(2)洗净反应孔板，用封闭液封闭；
(3)洗净反应孔板，加入待测血清并孵育；
(4)洗净反应孔板，加入标记二抗；
(5)洗净反应孔板，通过二抗相应检测方法判定结果。
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