CN110903357B

CN110903357B - 一种Rta蛋白优势表位抗原及其应用

Info

Publication number: CN110903357B
Application number: CN201911292183.8A
Authority: CN
Inventors: 张贺秋; 冯晓燕; 张玲; 危利; 王超男; 车志远
Original assignee: Oriental Ocean Beijing Medical Research Institute Co ltd
Current assignee: Oriental Ocean Beijing Medical Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110903357A

Abstract

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种Rta蛋白优势表位抗原及其应用。本发明的Rta蛋白优势表位抗原，其序列为序列表中SEQ ID NO.1‑4任一所示氨基酸序列。本发明的Rta优势表位抗原产量高、纯度高、活性好、特异性显著提高，完全适用于研制抗Rta抗体免疫检测试剂的需求。

Description

一种Rta蛋白优势表位抗原及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Rta蛋白优势表位抗原及其应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是能普遍感染人类且与多种恶性肿瘤发病有密切关系的DNA疱疹病毒，主要通过唾液、飞沫传播，也可经输血液传播，EB病毒易感染B淋巴细胞，并可在口咽部上皮细胞内增殖。机体感染EB病毒后，可以产生传染性单核细胞增多症、EB病毒相关性噬血细胞综合征及X连锁淋巴组织增生性疾病等多种疾病。EBV相关的恶性肿瘤包括血液系肿瘤和非血液系恶性肿瘤。前者如Burkitt淋巴瘤、移植后B细胞淋巴增殖性疾病、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴增殖性疾病和NK细胞淋巴瘤/白血病、霍奇金病等，后者包括鼻咽癌、胃腺癌、平滑肌肉瘤等。

在国际癌症研究中心1999年致癌因子的分类标准中，EB病毒已经被明确列为第1类致癌物，尤其是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)。NPC是发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，是第一个被发现与EB病毒感染密切相关的人类癌症，在大部分角化鳞状细胞癌和几乎所有未分化的鳞状细胞癌都有EB病毒的存在。据世界卫生组织统计，约80％的鼻咽癌发生在中国，尤其是广东省，成为一种区域性的高发肿瘤，发病率高达(15～50)/10万，每年最少有80 000例新患者，死亡率达(10～13)/10万，因此我国已经将鼻咽癌列为重点预防和治疗的恶性肿瘤之一。晚期鼻咽癌患者病死率极高，5年生存率仅20％左右。即使生存，也因多次放疗和化疗带来的严重不良反应而使患者无法同健康人一样生活。早期鼻咽癌治疗效果好，放疗和化疗周期可以缩短而使患者少受不良反应之苦，5年生存率高于85％，可见鼻咽癌早期诊断是提高治疗效果、争取良好预后的关键。提高早期无症状鼻咽癌检出率是医务人员追求的目标，抓住最佳治疗时机，定期体检和筛查是提高鼻咽癌早诊率、降低病死率的最好方法。

根据我国流行病学资料和EB病毒感染后产生抗体的基础理论证实，几乎所有40岁以上的人群均感染过EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒携带者。与健康成人比较，鼻咽癌患者血清中各种EB病毒抗体水平普遍较高，并呈持续升高或保持高滴度，这一血清学特征在鼻咽癌临床症状出现之前即可检出。

Rta蛋白是EB病毒由潜伏期到裂解期转变时，由立即早期基因BRLF1编码的605个氨基酸产物，是EB病毒由潜伏期转向裂解期的关键性调控因子，它能引起一系列的裂解早期基因的相继表达，最终引发EB病毒裂解感染。Rta蛋白血清抗体主要有IgA和IgG，IgA抗体能反映病毒近期感染的情况，但IgG抗体的半衰期比IgA抗体更长，为保证足够的灵敏度对于周期时间较短的立即早期蛋白应选择IgG抗体，故目前临床上常采用Rta/IgG抗体作为筛查指标，且一致认为血清Rta/IgG抗体是较为适合NPC初期筛查及诊断的指标之一。Rta蛋白在淋巴细胞中的表达相对稳定，鼻咽癌患者血清中Rta/IgG抗体水平在不同的T、N、M分期以及临床分期均无明显区别。Feng等在大肠杆菌中表达了Rat融合蛋白，并用Western blot方法鉴定出Rat蛋白的表位主要位于蛋白的c端2/3部分。任军等在大肠杆菌中表达并纯化了不含任何外源标签的Rat蛋白的C端部分(179-605位氨基酸，Rta C 2/3)，用纯化的蛋白作为抗原建立间接EILSA法检测人血清中的特异性抗体。Feng等又进一步研究了BRLF1基因中抗原决定簇丰富且抗原性高、与人类蛋白质没有同源性的区域，即BRLF1-185I(187-356aa)和BRLF1-150I(384-534aa)两个片段，并用分子克隆的方法构建出融合的原核表达载体。获得两种重组融合蛋白质，将两种融合蛋白混合作为抗原，以间接ELISA的方法，分别检测了51例鼻咽癌病人和47例正常对照组血清样品中Rta-IgG，结果在51例鼻咽癌病人血清中，有42例表现为Rta-IgG阳性，灵敏度为82.3％。而在47例正常人血清中，只有5例(10.6％)表现为Rta-IgG阳性，特异性为89.4％。

2012年卫生部临床检验中心新增EB病毒Rta蛋白抗体IgG检测项目，用于辅助鼻咽癌的早期诊断。联合检测Rta-IgG、VCA-IgA和EBNA1-IgA三种抗体能够明显提高临床对NPC患者的早期筛查与诊断效能，具有重要的临床应用价值。但是目前缺乏商品化的诊断用Rta抗原，且已报道Rta抗原的的性能还不能很好的应用于临床检测。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的首先在于，提供一种Rta蛋白优势表位抗原，其序列为序列表中SEQ ID NO.1-4任一所示氨基酸序列，在本发明的实施例中，分别称为Rta1、Rta2、Rta3和Rta4。

同时，本发明的目的还在于提供编码上述Rta蛋白优势表位抗原的核酸序列。

进一步的，所述核酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

另外，本发明的目的还在于提供表达上述Rta蛋白优势表位抗原的表达载体和微生物或细胞。

进一步的，所述微生物为细菌，例如，大肠杆菌。

另外，本发明的目的还在于提供上述抗原、核酸序列、表达载体或微生物或细胞在制备检测Rta抗体试剂中的应用。

以及，在制备检测EB病毒试剂中的应用。

同时，本发明的目的还在于提供一种Rta抗体检测试剂盒，包括上述Rta蛋白优势表位抗原。

同时，本发明的目的还在于提供一种EB病毒感染检测试剂盒，包括上述Rta蛋白优势表位抗原。用于检测是否有EB病毒感染或感染过。

上述试剂盒，可以为抗Rta蛋白IgG抗体检测试剂盒，其包括：包被上述Rta优势表位抗原的酶联板、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgG抗体、样品稀释液、洗涤液、TMB显色底物A液、TMB显色底物B液和反应终止液。

其中，可选的，各溶液为：

样品稀释液：含0.25％酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液。

洗涤液：5.63％Na₂HPO₄·12H₂O，0.672％NaH₂PO₄·2H₂O，17％NaCl，1％Tween-20；其中百分比为质量比。

TMB显色底物A液：0.32％柠檬酸(一水合物)，0.06％过氧化氢溶液，2.72％NaAc·3H₂O。

TMB显色底物B液：0.04％EDTA-Na2，0.04％TMB，0.19％柠檬酸(一水合物)，10％丙三醇(甘油)。

反应终止液：2mol/L H₂SO₄。

上述试剂盒采用酶联免疫间接ELISA方法检测人血清样本中抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体。在微孔板上包被重组EB病毒Rta抗原，与血清中抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体结合，再加入HRP标记的抗人IgG酶结合物与其反应，然后加入TMB底物显色，再加入终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度，根据产品提供的判断方式，判断待测样品中是否存在抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体。

本发明的有益效果：

本发明的Rta优势表位抗原产量高、纯度高、活性好、特异性显著提高，完全适用于研制抗Rta抗体免疫检测试剂的需求。该抗原在对抗Rta蛋白抗体检测中，Rta优势表位抗原Rta1和Rta2的灵敏度和特异性均为100％。另外，Rta优势表位抗原Rta 3的灵敏度为76.5％，特异性为100％；Rta优势表位抗原Rta 4的灵敏度为35.3％，特异性为100％。

附图说明

图1为Rta优势表位抗原的SDS-PAGE电泳图，其中各标号为：M-Marker；1-Rta1抗原；2-Rta2抗原；3-Rta3抗原；4-Rta4抗原。

图2为Rta优势表位抗原表达率分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。

实施例1Rta优势表位抗原的制备

1、Rta优势表位抗原氨基酸序列和编码序列

本申请的Rta优势表位抗原设置4个，分别命名为Rta1、Rta2、Rta3和Rta4，其序列分别为SEQ ID NO.1-4所示。其中Rta2、Rta3和Rta4分别为Rta1的一部分。Rta1含有140个氨基酸，其氨基酸序列如序列1所示；由长度为420bp的基因编码，通过基因优化，本实施例中，使用的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2、Rta优势表位抗原的表达与纯化

由中美泰和公司合成Rta优势表位抗原Rta1的编码基因，采用XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，通过双酶切，将Rta1的编码基因插入同样经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的pBVIL1质粒中，获得PBVIL1/Rta1重组质粒。

将测序正确的重组表达质粒转化入HB101感受态细胞，挑取单菌落于3ml含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于新鲜的LB液体培养基中培养至对数期后，42℃温度过夜诱导。超声破碎法提取包涵体，并采用亲和层析Ni柱纯化蛋白，用含25mM咪唑、250mM咪唑的25mMTris-HCl(pH＝8.5)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析纯化产物，取25mM咪唑洗脱蛋白作为纯化的Rta优势表位抗原，如图1所示。

3、Rta1主要抗原表位的表达与纯化

为了进一步确定Rta1中主要的抗原表位，以Rta1的编码基因为模板，设计引物分别扩增不同表位区段25-125aa(Rta2，SEQ ID NO.2)、55-100aa(Rta3，SEQ ID NO.3)和55-80aa(Rta4，SEQ ID NO.4)。通过常规分子生物学方法获得PBVIL/Rta2、PBVIL/Rta3和PBVIL/Rta4重组质粒。将测序正确的重组表达质粒转化入HB101感受态细胞，挑取单菌落于3ml含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于新鲜的LB液体培养基中培养至对数期后，42℃温度过夜诱导。超声破碎法提取包涵体，并采用亲和层析Ni柱纯化蛋白，用含25mM咪唑、250mM咪唑的25mM Tris-HCl(pH＝8.5)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析纯化产物，取25mM咪唑洗脱蛋白作为纯化的Rta优势表位抗原主要的抗原表位，如图1所示。

4、Rta表位抗原的表达量与纯度分析

经过用电泳胶数字化检测系统对诱导后全菌体蛋白SDS-PAGE电泳图进行扫描测定，根据各个条带的灰度值计算目的蛋白所占全部菌体蛋白的比率，即表达率。结果显示Rta优势表位抗原Rta1，以及其主要表位抗原Rta2、Rta3和Rta4的表达率分别为41.7％、62.6％、49.8％和45.2％，如图2所示，由此可以判定经过基因优化和表位筛选后Rta优势表位抗原Rta1，以及其主要表位抗原Rta2、Rta3和Rta4在大肠杆菌中得到高效表达。

然后用Gel-ProR Analyzer Version 3.0for WindowsTM软件分析纯化后的蛋白的纯度，结果显示Rta优势表位抗原Rta1，以及其主要表位抗原Rta2、Rta3和Rta4纯化后蛋白的纯度分别为95.17％、98.36％、94.21％和97.54％，除Rta3外，其它三种纯化蛋白的纯度均在95％以上，纯度高，完全可以满足研制检测试剂盒的需求。

5、Rta表位抗原的活性和特异性分析

将纯化后所获得的Rta系列抗原按常规进行10％SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h。分别用封闭液稀释的Rta抗体阳性血清、Rta抗体阴性血清和非特异性抗体(抗actin抗体)于4℃孵育过夜。TBST室温洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜1h。TBST室温洗膜3次，以ECL法显示阳性条带。

结果显示Rta抗体阳性血清孵育时，Rta优势表位抗原Rta1，以及其主要表位抗原Rta2、Rta3和Rta4均可以被特异性识别；Rta抗体阴性血清和非特异性抗体(抗actin抗体)孵育时，Rta优势表位抗原Rta1，以及其主要表位抗原Rta2、Rta3和Rta4均不被识别，说明所表达的Rta系列抗原具有很好的抗原活性和特异性。

实施例2利用不同Rta优势表位抗原制备Rta抗体检测试剂盒

抗Rta蛋白IgG抗体检测试剂盒(此试剂盒为检测Rta蛋白试剂盒，检测Rta蛋白的同时，也是在检测是否存在EB病毒感染)包括：包被Rta优势表位抗原的酶联板、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgG抗体、样品稀释液、洗涤液、TMB显色底物A液、TMB显色底物B液和反应终止液。其中，各溶液为：

样品稀释液：含0.25％酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液。

反应终止液：2mol/L H₂SO₄。

本试剂盒采用酶联免疫间接ELISA方法检测人血清样本中抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体。在微孔板上包被重组EB病毒Rta抗原，与血清中抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体结合，再加入HRP标记的抗人IgG酶结合物与其反应，然后加入TMB底物显色，再加入终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度，根据产品提供的判断方式，判断待测样品中是否存在抗EB病毒Rta蛋白IgG抗体。

其中，包被Rta优势表位抗原的酶联板的制备方法如下：用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释Rta优势表位抗原，浓度为2.5μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗涤液洗板2次，200μl/孔；加入110μl/孔封闭液(0.01mol/mL PBS，1％BSA，pH 7.2)室温封闭6小时；用洗涤液洗板5次，200μl/孔；真空干燥4-6小时，用包装袋封装包被Rta优势表位抗原的酶联板，2℃-8℃保存。

实施例3不同Rta优势表位抗原在Rta抗体检测中的应用

利用实施例2制备的试剂盒，每孔加入200μl样品稀释液后，分别加入10μl待测血清，室温孵育30min，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入100μl/孔HRP标记的抗人IgG抗体，室温孵育20min；用洗液洗板5次，200μl/孔；加入TMB显色底物A液50μL，TMB显色底物B液50μl，充分混匀，室温(18-25℃)避光反应10分钟；加入50μl/孔2M H₂SO₄终止反应，采用酶标仪双波长OD450nm/630nm测定各孔的吸光值，结果如表1所示。

根据30例健康对照血清样本的测定值分别计算临界值(cutoff值)，计算公式为cutoff值＝平均值+3SD。Rta优势表位抗原Rta1的Cutoff为0.054，Rta 2的Cutoff为0.039，Rta表位抗原Rta3的Cutoff为0.042，Rta表位抗原Rta4的Cutoff为0.069。当样本的OD值/Cutoff值≥1时，判定为阳性；当样本的OD值/Cutoff值<1时，判定为阴性。

对17例EB鼻咽癌患者阳性血清样本和30例健康体检者阴性血清样本的检测结果如表1所示，Rta优势表位抗原Rta1的灵敏度为100％，特异性为100％；Rta优势表位抗原Rta2的灵敏度为100％，特异性为100％；Rta优势表位抗原Rta 3的灵敏度为76.5％，特异性为100％；Rta优势表位抗原Rta 4的灵敏度为35.3％，特异性为100％。

表1.Rta优势表位抗原活性鉴定(S/C值)

根据上述结果，说明本申请中的Rta优势表位抗原具有非常高的灵敏度和特异性，适合临床诊断需求。

序列表

<110> 东方海洋（北京）医学研究院有限公司

<120> 一种Rta蛋白优势表位抗原及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys

1 5 10 15

Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg

35 40 45

Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg

50 55 60

Pro Asn Arg Gly Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Gln Pro Trp Ile Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile

85 90 95

Phe Pro His Pro Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys

100 105 110

Lys Gly Leu Arg Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu

115 120 125

Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg

130 135 140

<210> 2

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu

1 5 10 15

Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala

20 25 30

Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gln Thr Pro Cys

35 40 45

Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile Ala Ala Val His

50 55 60

Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro Ser Lys Pro Thr

65 70 75 80

Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg Asp Ser Arg Glu

85 90 95

Gly Met Phe Leu Pro

100

<210> 3

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gln Thr

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile Ala Ala

20 25 30

Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro

35 40 45

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gln Thr

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ser Asn Ala Glu Glu Pro Glu

20 25

<210> 5

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttactgatg aactcgaaag tctcccgagc ccgaccatgc cactgaagcc aggtgctcaa 60

agtgccgact gtggtgacag cagttccagc agcagtgact cgggtaacag tgacaccgag 120

caaagcgagc gggaagaggc acgtgcagag gctccacgcc ttcgtgctcc aaagtctcgc 180

cgtacttctc ggccaaaccg tggtcaaact ccatgtccat ccaacgcgga ggaaccagaa 240

cagccatgga ttgcagcggt ccaccaagag agcgatgagc ggccaatctt cccacaccca 300

tctaagccaa cctttcttcc accggttaaa cggaagaagg gcctccggga tagccgggaa 360

ggtatgttcc tgccaaagcc ggaagcgggc agtgccatct ctgacgtgtt cgagggtcgc 420

Claims

1.一种Rta蛋白优势表位抗原肽，其序列为序列表中SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述Rta蛋白优势表位抗原肽的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

4.表达权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽的表达载体。

5.表达权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽的微生物。

6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物为细菌，所述细菌为大肠杆菌。

7.权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽、权利要求2-3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5-6所述的微生物在制备检测Rta抗体试剂中的应用。

8.权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽、权利要求2-3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5-6所述的微生物在制备检测EB病毒感染试剂中的应用。

9.一种Rta抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽。

10.一种EB病毒感染检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的Rta蛋白优势表位抗原肽。