CN102731617A - 汉滩病毒糖蛋白特异性t细胞表位肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽及其应用，HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.75其中之一。本发明的HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，包括CD4+T细胞表位及CTL表位，可分别诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ。可应用于T细胞表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞或细胞毒性T细胞，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于汉滩病毒的防治技术领域，涉及汉滩病毒糖蛋白特异性的CD4+T细胞表位肽和CTL表位肽及其应用。
背景技术
汉滩病毒（hantaan virus，HTNV）是《禁止生物武器公约》议定书核查范围的病原微生物中一种重要的病毒，属于布尼亚病毒科汉坦病毒属（Hantavirus，HTV），是HTV的原型。HTV属病毒均为单股负链RNA有包膜病毒，基因组包括大（L）、中（M）、小（S）三个片段，其中L片段编码RNA聚合酶，M片段编码包膜糖蛋白1和2（glycoprotein 1,G1/Gn和glycoprotein 2,G2/Gc），S片段编码核蛋白（nucleocapsid protein，NP）。1978年李镐汪等首先分离出的HTNV 76-118株是HTNV的代表株，也是在我国引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）的主要病原体之一。
HFRS是一种急性自限性疾病，但发病机理尚不清楚。HFRS是一种以发热、出血和急性肾功能损害为特征的急性传染病，典型病例可有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过，同时存在有大量轻型非典型病例，并可见多种非典型的特殊临床表现。人群对HTNV有较普遍的易感性，在人口密集，带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。全球每年HFRS发病人数达10万例，死亡率在2%~10%左右，90%以上病例发生在我国，已成为我国目前死亡人数最多的传染病之一。HFRS在我国分布广，发病率和病死率较高，并且新疫区仍不断出现，在广大农村、城镇和林区部分疫点还时有爆发，严重危害我国人民的生命和健康，威胁和影响工农业生产、经济开发、外贸及旅游事业的发展，是国家重点防治的传染病之一。
在HTNV的三种结构蛋白中，HTNV糖蛋白（Gn/Gc）通过其C端黏附于病毒包膜上。由于Gn/Gc位于病毒衣壳的外层，其特异性抗体可直接与之结合，从而参与机体对病毒的免疫清除。但研究发现，尽管小鼠体内存在特异性中和抗体，仍会表现为病毒持续感染。病毒是胞内感染病原体，抗体分子不易进入细胞内，不能对胞内病毒发挥免疫清除功能，因此对胞内感染的病毒颗粒的免疫清除还主要依靠细胞免疫来执行。在病毒感染过程中，T细胞通过识别抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC）表面的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ类或Ⅱ类分子与抗原肽表位形成的复合体，发挥清除病原体的效应。HTNV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞（细胞毒性T细胞，cytotoxic T lymphocyte,CTL）在清除病毒和HFRS的发病机制中均发挥重要作用。CD8+T细胞是抗病毒免疫的主要效应细胞，可通过穿孔素途径和死亡受体途径以及分泌细胞因子杀伤病毒感染细胞，引起病毒感染细胞凋亡。特异性CD4+T细胞尤其是Th1细胞则通过分泌细胞因子调节CD8+T细胞介导的抗病毒免疫，对辅助CD8+T细胞的活化至关重要。HTNV感染所诱导的特异性CTL识别与MHC-Ⅰ类分子结合的内源性肽，长度多为8-10个氨基酸。HTNV感染所诱导的特异性CD4+T细胞则识别与MHC-Ⅱ类分子结合的长度多为13-17个氨基酸的肽段。
尽管细胞免疫应答在HFRS发生、发展和疾病的转归中起着重要作用，但迄今为止，对HTNV结构蛋白上的T细胞表位的研究只有零星报道。这种研究现状大大限制了人们对HTNV感染后适应性免疫应答规律及其与免疫保护或免疫损伤关系的认识，也限制了人们利用多肽疫苗对疾病进行治疗及控制的研究。
合成肽疫苗是近年来出现的新型疫苗研究方向，合成肽能够直接与MHC分子结合，而不需要APC的加工处理，它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果，因此合成肽疫苗广泛应用于抗病毒免疫治疗。目前已有多种基于多肽表位的合成肽疫苗进入临床研究阶段或已上市。
建立在T细胞表位鉴定基础之上的T细胞表位肽疫苗，由于人工合成多肽不包含病原生物的无关成分，只诱导特异性T细胞应答，因此安全、稳定、毒副作用少，且研制周期大大缩短。更重要的是，基于T细胞表位研发的多个T细胞表位组合，还可设计针对一种或多种病原体的多价T细胞表位肽疫苗。因此T细胞表位合成肽疫苗已成为防治HTNV感染研究的一个新策略，而对HTNV特异的T细胞表位进行鉴定即成为疫苗研究的前提和关键。
由于HTNV感染引起的HFRS有较高的发病率和死亡率，但迄今为止仍无特异的预防和治疗方法。因此迫切需要研发可用于预防和治疗HTNV感染的安全有效的表位肽疫苗。
发明内容
本发明的目的在于，提供HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽及其应用，所提供的表位肽可诱导CD4+T细胞或CTL产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，可应用于HTNV多肽疫苗的制备。
本发明是通过以下技术方案来实现：
HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为以下SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.75其中之一：
SEQ ID NO.1：MGIWKWLVMASLVWP；
SEQ ID NO.2：KWLVMASLVWPVLTL；
SEQ ID NO.3：NVYDMKIECPHTVSF；
SEQ ID NO.4：MKIECPHTVSFGENS；
SEQ ID NO.5：VSFGENSVIGYVELP；
SEQ ID NO.6：IGYVELPPVPLADTA；
SEQ ID NO.7：SVTCYDLSCNSTYCK；
SEQ ID NO.8：TLYMIVPIHACNMMK；
SEQ ID NO.9：IVPIHACNMMKSCLI；
SEQ ID NO.10：MMKSCLIALGPYRVQ；
SEQ ID NO.11：CLIALGPYRVQVVYE；
SEQ ID NO.12：KHGIFDIASVHIVCF；
SEQ ID NO.13：LDDFRSMEAFTGIFR；
SEQ ID NO.14：IASYSIVGPANAKVP；
SEQ ID NO.15：SIVGPANAKVPHSAS；
SEQ ID NO.16：FRLTEQQVNFVCQRV；
SEQ ID NO.17：GQRKVILTKTLVIGQ；
SEQ ID NO.18：KTLVIGQCIYTITSL；
SEQ ID NO.19：IGQCIYTITSLFSLL；
SEQ ID NO.20：IYTITSLFSLLPGVA；
SEQ ID NO.21：TSLFSLLPGVAHSIA；
SEQ ID NO.22：SLLPGVAHSIAVELC；
SEQ ID NO.23：GVAHSIAVELCVPGF；
SEQ ID NO.24：AALLVTFCFGWVLIP；
SEQ ID NO.25：VTFCFGWVLIPAITF；
SEQ ID NO.26：FGWVLIPAITFIILT；
SEQ ID NO.27：LIPAITFIILTVLKF；
SEQ ID NO.28：ETYKELKAHGVSCPQ；
SEQ ID NO.29：TLNLFRYKSRCYIFT；
SEQ ID NO.30：SETPLTPVWNDNAHG；
SEQ ID NO.31：LTPVWNDNAHGVGSV；
SEQ ID NO.32：WNDNAHGVGSVPMHT；
SEQ ID NO.33：AHGVGSVPMHTDLEL；
SEQ ID NO.34：GSVPMHTDLELDFSL；
SEQ ID NO.35：MHTDLELDFSLTSSS；
SEQ ID NO.36：SSSKYTYRRKLTNPL；
SEQ ID NO.37：NPLEEAQSIDLHIEI；
SEQ ID NO.38：EQTIGVDVHALGHWF；
SEQ ID NO.39：GVDVHALGHWFDGRL；
SEQ ID NO.40：HALGHWFDGRLNLKT；
SEQ ID NO.41：HWFDGRLNLKTSFHC；
SEQ ID NO.42：FHCYGACTKYEYPWH；
SEQ ID NO.43：GACTKYEYPWHTAKC；
SEQ ID NO.44：KYEYPWHTAKCHYER；
SEQ ID NO.45：PWHTAKCHYERDYQY；
SEQ ID NO.46：YERDYQYETSWGCNP；
SEQ ID NO.47：YQYETSWGCNPSDCP；
SEQ ID NO.48：VGTGCTACGLYLDQL；
SEQ ID NO.49：CTACGLYLDQLKPVG；
SEQ ID NO.50：GLYLDQLKPVGSAYK；
SEQ ID NO.51：DQLKPVGSAYKIITI；
SEQ ID NO.52：YSRRVCVQFGEENLC；
SEQ ID NO.53：NLCKIIDMNDCFVSR；
SEQ ID NO.54：IIDMNDCFVSRHVKV；
SEQ ID NO.55：NDCFVSRHVKVCIIG；
SEQ ID NO.56：IIGTVSKFSQGDTLL；
SEQ ID NO.57：VSKFSQGDTLLFFGP；
SEQ ID NO.58：STCQFGDPGDIMSPR；
SEQ ID NO.59：FGDPGDIMSPRDKGF；
SEQ ID NO.60：CPEFPGSFRKKCNFA；
SEQ ID NO.61：RKKCNFATTPICEYD；
SEQ ID NO.62：NMVSGYKKVMATIDS；
SEQ ID NO.63：GYKKVMATIDSFQSF；
SEQ ID NO.64：VMATIDSFQSFNTST；
SEQ ID NO.65：DGMLRDHINILVTKD；
SEQ ID NO.66：DFDNLGENPCKIGLQ；
SEQ ID NO.67：LGENPCKIGLQTSSI；
SEQ ID NO.68：GLQTSSIEGAWGSGV；
SEQ ID NO.69：SGVGFTLTCLVSLTE；
SEQ ID NO.70：CLVSLTECPTFLTSI；
SEQ ID NO.71：LTECPTFLTSIKACD；
SEQ ID NO.72：KSGEWISGIFSGNWI；
SEQ ID NO.73：NWIVLIVLCVFLLFS；
SEQ ID NO.74：LFSLVLLSILCPVRK；
SEQ ID NO.75：VLLSILCPVRKHKKS。
所述的表位肽SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54～SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQID NO.64、SEQ ID NO.66～SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答；
所述的表位肽SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQID NO.22～SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30～SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53～SEQ ID NO.58、SEQID NO.61～SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73可诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答；
所述的表位肽SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51、SEQ IDNO.54～SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQID NO.66、SEQ ID NO.67可同时诱导CD4+T和CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
上述HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，可用于制备T细胞表位肽疫苗，或用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞或CTL细胞。
或应用于诱导产生表位肽特异性的T细胞以及诱导和辅助B细胞产生针对HTNV-Gn/Gc的特异性抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，可诱导CD4+或CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并可辅助B细胞产生针对HTNV-Gn/Gc的特异性抗体。
由于HLA高度多态性，因此系统鉴定出的HTNV-Gn/Gc上的T细胞表位，可应用于在HLA多态性背景下T细胞表位肽多价疫苗的制备，或应用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞或细胞毒性T细胞，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为针对28组混合肽产生阳性应答的病人百分数示意图；
图2为25例HFRS病人可产生免疫应答的混合肽组数目示意图。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
申请人通过合成覆盖HTNV 76-118株Gn/Gc区全长的部分重叠15肽，利用固相酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)及磁珠分离技术检测HFRS病人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell，PBMC），系统鉴定出Gn/Gc上的CD4+15肽表位以及包含CD8+T细胞表位的15肽。
在以下的实施例中，对涉及的用语作如下的定义：
HTNV-Gn/Gc 15肽是从N端开始，依次合成部分重叠肽，每条肽长度为15个氨基酸残基，相邻两条肽重叠11个氨基酸残基。
T细胞表位肽为应用ELISPOT检测PBMC分泌干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）的水平而获得鉴定。
CD4+T细胞表位肽或CTL表位肽为应用免疫磁珠法分离去除CD8+T或CD4+T细胞后，再应用ELISOPT技术检测效应细胞分泌IFN-γ的水平而获得鉴定。
效应细胞即为CD8-PBMC（含CD4+T细胞）或CD4-PBMC（含CD8+T细胞），其中含有抗原提呈细胞提呈15肽，诱导CD4+T细胞或CD8+T细胞免疫应答。
PBMC为应用Ficoll密度梯度离心法分离获得。
以下是具体的实施过程：
首先分离HFRS患者静脉抗凝血中的外周血单个核细胞（Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC），抗原肽先分成28个混合肽组，每组包含10条15肽，第28组为11条15肽，将PBMC与合成的Gn/Gc15肽混合肽组孵育，筛选出可刺激患者PBMC分泌IFN-γ的阳性混合肽组。进一步确定该混合肽组中能诱导T细胞应答的单个15肽后，采用免疫磁珠分离去除PBMC中的CD8+或CD4+T细胞，以特定单个阳性15肽加载CD8-PBMC（去除CD8+T细胞，含CD4+T细胞）或CD4-PBMC（去除CD4+T细胞，含CD8+T细胞）作为效应细胞，ELISPOT确定该15肽是CD4+T细胞15肽表位还是包含CD8+T细胞表位的15肽。
1、从HFRS患者外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC）：
根据我国肾综合征出血热临床诊断标准（血清抗HTNV IgM抗体和临床症状），无菌采集HFRS患者不同病情（轻型、中型、重型和危重型）、不同病期（发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期）的外周血并加入肝素钠抗凝（50U/ml），对不同的采集情况进行编号。然后将采集的外周血用等量无血清RPMI 1640培养液稀释混匀，用弯头吸管将已稀释的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液上（在50ml离心管里预先加入10ml淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物公司），2000rmp去刹车离心20min，小心吸取两层界面处得白色云雾层，用5倍体积的RPMI 1640洗涤，1500rpm离心10min，再洗涤2次，获得HFRS患者外周血中分离的PBMC；直接用于后续使用或用冻存液（90%FCS，10%DMSO）重悬细胞，液氮冻存备用。
2、固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）筛选能够刺激HFRS患者PBMC产生特异性应答（分泌IFN-γ）的HTNV-Gn/Gc阳性15肽：
HTNV (病毒株76-118)的Gn/Gc由1135个氨基酸残基组成，可以由NCBI网站的蛋白质数据库获得其具体的蛋白序列（P08668.1）。从N端开始，依次合成部分重叠肽，每条肽长度为15个氨基酸残基，相邻两条肽重叠11个氨基酸残基，共合成281条15肽，从N端开始将15肽依次命名为GP1～GP281。合成肽委托西安联美生物公司完成。所有合成肽均经RP-HPLC测定，纯度在90%以上。将合成的15肽先用适量二甲基亚砜（DMSO）溶解，再用PBS配成浓度为1mmol/L的溶液，分装后-70℃冻存备用。
将281条多肽按顺序分成28组，采用商品化IFN-γELISPOT试剂盒（购自Mabtech公司）筛选可刺激PBMC分泌IFN-γ的阳性混合肽组，按照说明书进行操作如下：
复苏冻存的HFRS患者PBMC，用10%FCS/RPMI 1640培养液培养20～24h。用15μg/ml鼠抗人IFN-γmAb 50μl（1-D1K）包被96孔PVDF滤膜板，4℃过夜。PBS洗6遍，用10%FCS/RPMI 1640培养液于37℃封闭1h后，每孔加入2×105个PBMC，依次加入28组混合肽（每种15肽的终浓度为20μmol/L）。同时设阳性和阴性对照孔，阳性对照孔加入PHA（终浓度为10μg/ml），阴性对照孔不加15肽和PHA。
37℃、5%CO2孵育14～18h后洗板，再加入1μg/ml生物素化鼠抗人IFN-γmAb 50μl（7-B6-1-Biotin），室温孵育3h，洗板后加入碱性磷酸酶（ALP）-链霉亲和素50μl，室温孵育1～2h，洗板后加入BCIP/NBT显色液100μl，室温避光显色1h，自来水冲洗，晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数，每孔斑点数≥5即为阳性孔。计算IFN-γ斑点形成细胞数即T细胞频率，以分泌IFN-γ的细胞数/106PBMC表示。计算式为：
T细胞频率=[（阳性孔的斑点数－阴性对照孔的斑点数）/每孔PBMC总数]×106
进一步，将筛选得到的阳性混合肽组中的每条肽依次利用商品化IFN-γELISPOT试剂盒进行鉴定，得到可刺激HFRS患者PBMC分泌IFN-γ的单个阳性15肽。具体实施方式与混合肽组筛选相同，区别在于每孔加入单个15肽（终浓度为20μmol/L）。
3、CD4+或CD8+T细胞的分离及单个阳性15肽CD4+或CD8+T细胞表位的鉴定：
采用商品化CD4+（或CD8+T）细胞阳性分离试剂盒（购自Dynal公司），按照说明书进行操作，分离去除HFRS患者PBMC中CD4+T细胞或CD8+T细胞，具体如下：
取25μl CD4（或CD8磁珠）（Dynabeads），用1ml Buffer1（无Ca2+、Mg2+PBS w/0.1%BSA，2mM EDTA，pH7.4）重悬混匀，在磁架上静置1min，弃上清，去除游离抗体。复苏HFRS患者PBMC（等分为2份），用Buffer1调整细胞浓度为1×107/ml，加入用Buffer1重悬并洗涤过的CD4（或CD8）Dynabeads，2-8℃孵育20min。取出后在磁架上静置2min，CD4+T（或CD8+T）淋巴细胞即与磁珠结合为沉淀。收集上清，上清中为含CD8+T淋巴细胞的CD4-PBMC（或含CD4+T淋巴细胞的CD8-PBMC），可直接作为效应细胞加入ELISPOT实验检测分泌IFN-γ水平。
对磁珠分离后获得的CD4-PBMC或CD8-PBMC细胞进行免疫荧光染色和FCM分析，鉴定其纯度。调整细胞浓度为4×106/ml，取50μl CD4-PBMC或CD8-PBMC细胞悬液，加入藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）标记的CD4或CD8单克隆抗体，同型对照组加入PE-IgG1，4℃孵育30min，用FACS洗涤液洗3次后，用适量FACS固定液固定，流式细胞仪分析。结果显示CD4-PBMC（或CD8-PBMC）细胞中的CD4+T（或CD8+T）细胞含量小于5%。
再次采用商品化IFN-γELISPOT试剂盒，按照说明书进行操作，对筛选得到的单个阳性15肽分别进行CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位的鉴定，具体操作如下：
用15μg/ml鼠抗人IFN-γmAb 50μl（1-D1K）包被96孔PVDF滤膜板，4℃过夜。PBS洗6遍，用10%FCS/RPMI 1640培养液于37℃封闭1h后，每孔加入3×105～5×105个CD4-PBMC细胞（或CD8-PBMC细胞），再加入待检测15肽（终浓度为20μmol/L），共同孵育过夜。即每条15肽分别加入2种不同效应细胞（CD4-PBMC细胞或CD8-PBMC细胞）。同时设阳性和阴性对照孔，阳性孔加入PHA（终浓度为10μg/ml），阴性孔不加肽和PHA。洗板后加入1μg/ml生物素化鼠抗人IFN-γmAb 50μl（7-B6-1-Biotin），室温孵育3h，洗板后加入ALP-链霉亲和素50μl，室温孵育1～2h，洗板后加入BCIP/NBT显色液100μl，室温避光显色1h，自来水冲洗，晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数。每孔斑点数≥5即为阳性孔。计算IFN-γ斑点形成细胞数即T细胞频率，以分泌IFN-γ的细胞数/106PBMC表示。计算式为：
T细胞频率=[（阳性孔的斑点数－阴性对照孔的斑点数）/每孔PBMC总数]×106
在对HFRS患者分离出的PBMC与15肽的ELISPOT检测中，有25例患者分离的PBMC可对22组混合肽产生特异性应答（如图1和图2），最终从25例可产生应答的HFRS病人PBMC中鉴定出75个HTNV-Gn/Gc特异的T细胞表位肽，其中包含26个单独的CD4+T细胞表位肽和23个单独的CD8+T细胞表位肽，还有26条15肽可同时诱导CD4+T和CD8+T细胞产生应答。其具体鉴定出的HTNV-Gn/Gc T细胞表位如表1所示。
表1：鉴定出的HTNV-Gn/Gc T细胞表位：
上述HTNV-Gn/Gc特异性的表位肽可用于制备T细胞表位肽疫苗，或用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞或CTL细胞。
或者用于产生表位肽特异性的T细胞以及诱导和辅助B细胞产生针对HTNV-Gn/Gc的特异性抗体。
图1中的横坐标为15肽混合肽组编号，纵坐标为可对混合肽组产生特异性细胞免疫应答的病人百分数，纵坐标的意义表明可对相应15肽混合肽组产生免疫应答的病人数越多，该条混合肽组中越有可能包含HTNV-Gn/Gc的T细胞表位肽。
图2中的横坐标为25例阳性应答病人编号，纵坐标为针对每一例病人可产生特异性细胞免疫应答的混合肽组数目，纵坐标的意义表明针对每一例病人产生特异性细胞免疫应答的混合肽组数目越多，该病人针对HTNV-Gn/Gc的应答越广泛。
系统鉴定出的HFRS患者中HTNV-Gn/Gc上的T细胞表位肽，不仅在揭示HFRS发病机理方面具有重要的理论意义，而且可以为设计新型HTNV多肽疫苗提供可靠的实验依据，为制订新的临床治疗策略提供重要的理论依据，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Claims (4)
1.HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为以下SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.75其中之一：
SEQ ID NO.1：MGIWKWLVMASLVWP；
SEQ ID NO.2：KWLVMASLVWPVLTL；
SEQ ID NO.3：NVYDMKIECPHTVSF；
SEQ ID NO.4：MKIECPHTVSFGENS；
SEQ ID NO.5：VSFGENSVIGYVELP；
SEQ ID NO.6：IGYVELPPVPLADTA；
SEQ ID NO.7：SVTCYDLSCNSTYCK；
SEQ ID NO.8：TLYMIVPIHACNMMK；
SEQ ID NO.9：IVPIHACNMMKSCLI；
SEQ ID NO.10：MMKSCLIALGPYRVQ；
SEQ ID NO.11：CLIALGPYRVQVVYE；
SEQ ID NO.12：KHGIFDIASVHIVCF；
SEQ ID NO.13：LDDFRSMEAFTGIFR；
SEQ ID NO.14：IASYSIVGPANAKVP；
SEQ ID NO.15：SIVGPANAKVPHSAS；
SEQ ID NO.16：FRLTEQQVNFVCQRV；
SEQ ID NO.17：GQRKVILTKTLVIGQ；
SEQ ID NO.18：KTLVIGQCIYTITSL；
SEQ ID NO.19：IGQCIYTITSLFSLL；
SEQ ID NO.20：IYTITSLFSLLPGVA；
SEQ ID NO.21：TSLFSLLPGVAHSIA；
SEQ ID NO.22：SLLPGVAHSIAVELC；
SEQ ID NO.23：GVAHSIAVELCVPGF；
SEQ ID NO.24：AALLVTFCFGWVLIP；
SEQ ID NO.25：VTFCFGWVLIPAITF；
SEQ ID NO.26：FGWVLIPAITFIILT；
SEQ ID NO.27：LIPAITFIILTVLKF；
SEQ ID NO.28：ETYKELKAHGVSCPQ；
SEQ ID NO.29：TLNLFRYKSRCYIFT；
SEQ ID NO.30：SETPLTPVWNDNAHG；
SEQ ID NO.31：LTPVWNDNAHGVGSV；
SEQ ID NO.32：WNDNAHGVGSVPMHT；
SEQ ID NO.33：AHGVGSVPMHTDLEL；
SEQ ID NO.34：GSVPMHTDLELDFSL；
SEQ ID NO.35：MHTDLELDFSLTSSS；
SEQ ID NO.36：SSSKYTYRRKLTNPL；
SEQ ID NO.37：NPLEEAQSIDLHIEI；
SEQ ID NO.38：EQTIGVDVHALGHWF；
SEQ ID NO.39：GVDVHALGHWFDGRL；
SEQ ID NO.40：HALGHWFDGRLNLKT；
SEQ ID NO.41：HWFDGRLNLKTSFHC；
SEQ ID NO.42：FHCYGACTKYEYPWH；
SEQ ID NO.43：GACTKYEYPWHTAKC；
SEQ ID NO.44：KYEYPWHTAKCHYER；
SEQ ID NO.45：PWHTAKCHYERDYQY；
SEQ ID NO.46：YERDYQYETSWGCNP；
SEQ ID NO.47：YQYETSWGCNPSDCP；
SEQ ID NO.48：VGTGCTACGLYLDQL；
SEQ ID NO.49：CTACGLYLDQLKPVG；
SEQ ID NO.50：GLYLDQLKPVGSAYK；
SEQ ID NO.51：DQLKPVGSAYKIITI；
SEQ ID NO.52：YSRRVCVQFGEENLC；
SEQ ID NO.53：NLCKIIDMNDCFVSR；
SEQ ID NO.54：IIDMNDCFVSRHVKV；
SEQ ID NO.55：NDCFVSRHVKVCIIG；
SEQ ID NO.56：IIGTVSKFSQGDTLL；
SEQ ID NO.57：VSKFSQGDTLLFFGP；
SEQ ID NO.58：STCQFGDPGDIMSPR；
SEQ ID NO.59：FGDPGDIMSPRDKGF；
SEQ ID NO.60：CPEFPGSFRKKCNFA；
SEQ ID NO.61：RKKCNFATTPICEYD；
SEQ ID NO.62：NMVSGYKKVMATIDS；
SEQ ID NO.63：GYKKVMATIDSFQSF；
SEQ ID NO.64：VMATIDSFQSFNTST；
SEQ ID NO.65：DGMLRDHINILVTKD；
SEQ ID NO.66：DFDNLGENPCKIGLQ；
SEQ ID NO.67：LGENPCKIGLQTSSI；
SEQ ID NO.68：GLQTSSIEGAWGSGV；
SEQ ID NO.69：SGVGFTLTCLVSLTE；
SEQ ID NO.70：CLVSLTECPTFLTSI；
SEQ ID NO.71：LTECPTFLTSIKACD；
SEQ ID NO.72：KSGEWISGIFSGNWI；
SEQ ID NO.73：NWIVLIVLCVFLLFS；
SEQ ID NO.74：LFSLVLLSILCPVRK；
SEQ ID NO.75：VLLSILCPVRKHKKS。
2.如权利要求1所述的HTNV-Gn/Gc特异性的T细胞表位肽，其特征在于，所述的表位肽SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54～SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQID NO.64、SEQ ID NO.66～SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75可诱导CD4+T细胞产生细胞免疫应答；
所述的表位肽SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQID NO.22～SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30～SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.53～SEQ ID NO.58、SEQID NO.61～SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73可诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答；
所述的表位肽SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51、SEQ IDNO.54～SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64、SEQID NO.66、SEQ ID NO.67可同时诱导CD4+T和CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
3.权利要求2所述的HTNV-Gn/Gc特异性的表位肽用于制备T细胞表位肽疫苗的应用，或用于诱导产生表位肽特异性的CD4+T细胞或CTL细胞。
4.权利要求2所述的HTNV-Gn/Gc特异性表位肽用于产生表位肽特异性的T细胞以及诱导和辅助B细胞产生针对HTNV-Gn/Gc的特异性抗体。
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