CN114317830A

CN114317830A - 新型冠状病毒的数字pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114317830A
Application number: CN202210055361.0A
Authority: CN
Inventors: 王莉; 赵志亮; 刘芳; 宋晓芸; 高晓强; 巩伟兵; 王姣乐; 高云新; 罗永�
Original assignee: Gansu International Travel Health Care Center Lanzhou Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Gansu International Travel Health Care Center Lanzhou Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括数字PCR反应液、检测ORF1ab基因和N基因片段的引物及探针、阳性对照品和阴性对照品，ORF1ab基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.1，反向序列为：SEQ ID NO.2，探针序列为：SEQ ID NO.3；N基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.5，反向序列为：SEQ ID NO.6，探针序列为：SEQ ID NO.7；本发明通过特定的数字PCR引物和探针序列，可对样本进行定量检测，从而可实现新型冠状病毒高灵敏度、高特异性检测，为新型冠状病毒的感染提供辅助诊断。

Description

新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)是由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的一种急性呼吸道传染病。自COVID-19暴发以来，疫情快速席卷全球，对全球公共卫生及经济发展造成了严重影响，根据世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)报告，截至2021年11月1日，全球已确诊COVID-19感染4525497例，死亡307395例，其传染性远超严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)，危害极其严重。由于感染者早期症状不明显且存在无症状感染者，极易造成漏诊或误诊，因此早期、精准检测出病原体对于病毒的确诊、治疗与预后监测十分重要。

实时荧光定量PCR作为新型冠状病毒感染检测金标准，是实验室目前最常用的检测方法。疫情发生后，中国疾控在内的多家机构发布了各自扩增序列和引物探针序列，涵盖了ORF1ab基因、N基因、E基因等。现在临床上使用的绝大多数试剂盒检测灵敏度在10²拷贝范围内，而且受条件限制，现有的qPCR方法只能对新型冠状病毒进行定性检测。并且由于多例出院后的病人核酸复检呈现阳性的情况，很有可能说明是由于病毒载量太低而未达到qPCR检出限导致阴性误判，所以提高病毒核酸检测灵敏度是亟待解决的问题。

数字PCR比传统的qPCR具有更高的灵敏度和准确性，最低能够检测出单个拷贝数的样本。数字PCR是将反应液生成数万个单独的微滴反应，核酸分布其中，并在每个单独的微滴反应中进行单分子扩增，从而实现绝对定量。作为灵敏度最高的技术，数字PCR已证明了它在绝对量化等应用中的可靠性，目前已成熟应用于如液体活检中肿瘤导致的突变、基因表达和microRNA定量检测、拷贝数变异(CNV)等。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒。

本发明的次要目的是提供数字PCR检测试剂盒检测新型冠状病毒的方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其包括数字PCR反应液、检测ORF1ab基因和N基因片段的引物及探针、阳性对照品和阴性对照品。

其中，ORF1ab基因的检测引物正向序列为：ATGGCTACATACTACTTATTTG(SEQ IDNO.1)，反向序列为：GCTCAAACTCTTCTTCTTC(SEQ ID NO.2)，探针序列为：FAM-TCACCTTCTTCTTCATCCTCATCTGG-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

N基因的检测引物正向序列为：GCAACAGTTCAAGAAATTC(SEQ ID NO.5)，反向序列为：CTGGTTCAATCTGTCAAG(SEQ ID NO.6)，探针序列为：VIC-AAGCAAGAGCAGCATCACCG-BHQ1(SEQ ID NO.7)。

优选地，ORF1ab基因的核苷酸序列为：ATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGC(SEQ ID NO.4)。

优选地，N基因的核苷酸序列为：GCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAG(SEQ ID NO.8)。

优选地，数字PCR反应液的体积为25μL。

反应体系包括下列组分：

上述的ORF1ab基因片段和N基因片段的引物对：正向引物和反向引物终浓度分别为10μmol/L。

ORF1ab基因和N基因的探针引物终浓度分别为10μmol/L。

反应缓冲液(含酶混合液)。

荧光素钠盐的终浓度为100μmol/L。

RNA模板及DEPC水。

优选地，阳性对照品为商品化新型冠状病毒假病毒培养液。

优选地，阴性对照品为DEPC水。

为达到上述次要目的，本发明的解决方案是：

一种利用上述的数字PCR检测试剂盒检测新型冠状病毒的方法，该方法中扩增程序为：50℃反转录10min；95℃预变性1min；95℃变性10s；57-60℃退火延伸30s。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明设计了一种基于新型冠状病毒ORF1ab和N基因序列的特异性数字PCR引物和探针，根据该引物制备的新型冠状病毒核酸检测试剂盒灵敏度高，可对样本进行定量检测，在25μL体系下可检测4.5个拷贝的ORF1ab基因和3个拷贝的N基因，特异性好，不与甲型H1N1流感病毒、甲型H3流感病毒、乙型流感病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒产生交叉反应；另外，试剂盒选取特定目的基因引物在58℃条件下扩增效果更佳。

故本发明采用数字PCR技术，通过特定的数字PCR引物和探针序列，可实现新型冠状病毒高灵敏度、高特异性检测，为新型冠状病毒的感染提供辅助诊断，可实现新型冠状病毒核酸的精准检测。

附图说明

图1为实施例3至实施例6的ORF1ab基因扩增结果。

图2为实施例3至实施例6的N基因扩增结果。

图3为实施例7的ORF1ab基因扩增结果。

图4为实施例7的N基因扩增结果。

图5为实施例8的ORF1ab基因扩增结果。

图6为实施例8的N基因扩增结果。

图7为实施例9的ORF1ab基因扩增结果。

图8为实施例9的N基因扩增结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一对用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因的引物对和探针。

扩增ORF1ab基因片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针核苷酸序列为如SEQ ID NO.3所示，该探针5’端连有FAM荧光报告基团，3’段连有BHQ1荧光淬灭基团。扩增的ORF1ab基因片段如SEQ ID NO.4所示。

扩增N基因片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，探针核苷酸序列为如SEQ ID NO.7所示，该探针5’端连有VIC荧光报告基团，3’段连有BHQ1荧光淬灭基团。扩增的ORF1ab基因片段如SEQ ID NO.8所示。

实施例2

本实施例提供一种利用实施例1的试剂盒检测方法，包括如下步骤：

病毒核酸提取

采用磁珠法使用赛默飞公司生产的病毒核酸提取试剂盒对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。

按表1配制数字PCR反应体系，总体积25μL。

表1数字PCR反应体系

数字PCR反应

生成微滴

将25μL反应体系加入反应芯片中，盖上盖子，转移至Naica Geode，同时打开压力泵，启动分区程序，温度为40℃，压力增加到大气压+1000mbar生成微滴，结束后压力降低至+950mbar。

PCR扩增

微滴生成后进入PCR扩增程序，如表2所示。

表2 PCR扩增程序

扩增结束后，取出芯片放入微滴读取仪，进行数据读取。

实施例3

本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒测试方法，采用3份阳性对照和1份阴性对照按照实施例2步骤进行检测，不同的是退火温度为57℃。

实施例4

本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是退火温度为58℃。

实施例5

本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是退火温度为59℃。

实施例6

本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是退火温度为60℃。

其中，实施例3至实施例6的ORF1ab基因扩增结果如图1所示，其中，1-4为退火温度57℃的扩增情况；5-8为退火温度为58℃的扩增情况；9-12为退火温度59℃的扩增情况；13-16为退火温度为60℃的扩增情况。其中，实施例3至实施例6的N基因扩增结果如图2所示，其中，1-4为退火温度57℃的扩增情况；5-8为退火温度为58℃的扩增情况；9-12为退火温度59℃的扩增情况；13-16为退火温度为60℃的扩增情况。

其中，图1和图2中4、8、12和16为阴性对照品扩增情况，其余为阳性对照品扩增情况。

从图1和图2可以看出，在57-60℃退火温度条件下，均有扩增，其中58℃扩增时阴阳性微滴分离最好。

实施例7

本实施例提供实施例2的试剂盒引物探针特异性实验，退火温度与实施例4相同。

本实施例选择与新型冠状病毒病毒核酸序列具有同源性、引起相同或相似临床症状的呼吸道病毒甲型H1N1流感病毒、甲型H3流感病毒、乙型流感病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒核酸进行数字PCR检测，同时设置阳性对照和阴性对照。

其中，实施例7的ORF1ab基因引物探针特异性实验结果如图3所示，其中，1-8依次为甲型H1N1流感病毒、甲型H3流感病毒、乙型流感病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒扩增结果，9和10分别为阳性对照和阴性对照扩增结果。

其中，实施例7的N基因引物探针特异性实验结果如图4所示，其中，1-8依次为甲型H1N1流感病毒、甲型H3流感病毒、乙型流感病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒扩增结果，9和10分别为阳性对照和阴性对照扩增结果。

结果如图3和图4所示，只有阳性对照可检测到ORF1ab基因和N基因阳性微滴，其余均无扩增，说明本发明数字PCR ORF1ab基因和N基因引物探针具有很强的特异性。

实施例8

本实施例提供实施例2试剂盒灵敏度实验，退火温度与实施例4相同。

本实施例将新型冠状病毒阳性对照品依次进行2倍梯度稀释，稀释至14倍，每个稀释度检测3次，阴性对照重复3次，通过实施例4给出的退火温度进行检测。

其中，实施例8的ORF1ab基因引物探针灵敏度实验结果如图5所示，其中，1-3为阳性对照品稀释2倍后的扩增结果，4-6为阳性对照品稀释4倍后的扩增结果，7-9为阳性对照品稀释6倍后的扩增结果，10-12为阳性对照品稀释8倍后的扩增结果，13-15为阳性对照品稀释10倍后的扩增结果，16-18为阳性对照品稀释12倍后的扩增结果，19-21为阳性对照品稀释14倍后的扩增结果，22-24为阴性对照品扩增结果。

其中，实施例8的N基因引物探针灵敏度实验结果如图6所示，其中，1-3为阳性对照品稀释2倍后的扩增结果，4-6为阳性对照品稀释4倍后的扩增结果，7-9为阳性对照品稀释6倍后的扩增结果，10-12为阳性对照品稀释8倍后的扩增结果，13-15为阳性对照品稀释10倍后的扩增结果，16-18为阳性对照品稀释12倍后的扩增结果，19-21为阳性对照品稀释14倍后的扩增结果，22-24为阴性对照品扩增结果。

表3不同稀释倍数阳性对照品ORF1ab基因和N基因的平均拷贝数

阳性对照品稀释倍数	ORF1ab基因(copies/μL)	N基因(copies/μL)
			2	3.81	5.03
4	1.42	2.25
			6	0.68	0.77
8	0.46	0.52
			10	0.18	0.16
12	0.18	0.12
			14	0	0

结果如图5、图6和表3所示，ORF1ab基因最低检测限为0.18copies/μl*25ul＝4.5copies/反应。N基因最低检测限为0.12copies/μL*25ul＝3copies/反应。实施例9本实施例提供实施例2的临床样本检测实验，退火温度与实施例4相同。

实施例9

本实施例选取5个已知新型冠状病毒核酸阳性样本和1个新型冠状病毒核酸阴性样本进行检测，同时设置阳性对照和阴性对照。

其中，实施例9的ORF1ab基因扩增结果如图7所示，其中，1-5为已知新型冠状病毒核酸阳性样本，6为新型冠状病毒核酸阴性样本，7为阳性对照品，8为阴性对照品。

其中，实施例9的N基因扩增结果如图8所示，其中，1-5为已知新型冠状病毒核酸阳性样本，6为新型冠状病毒核酸阴性样本，7为阳性对照品，8为阴性对照品。

由图7和图8结果所示，5个新型冠状病毒核酸阳性样本和阳性对照品均可检测到ORF1ab基因和N基因的阳性微滴，新型冠状病毒核酸阴性样本和阴性对照品ORF1ab基因和N基因均无扩增。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

序列表

<110> 甘肃国际旅行卫生保健中心（兰州海关口岸门诊部）

<120> 新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 1

atggctacat actacttatt tg 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 2

gctcaaactc ttcttcttc 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 3

tcaccttctt cttcatcctc atctgg 26

<210> 4

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 4

atggctacat actacttatt tgatgagtct ggtgagttta aattggcttc acatatgtat 60

tgttctttct accctccaga tgaggatgaa gaagaaggtg attgtgaaga agaagagttt 120

gagc 124

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 5

gcaacagttc aagaaattc 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 6

ctggttcaat ctgtcaag 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 7

aagcaagagc agcatcaccg 20

<210> 8

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 8

gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg 60

ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccag 116

Claims

1.一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：其包括数字PCR反应液、检测ORF1ab基因和N基因片段的引物及探针、阳性对照品和阴性对照品；

所述ORF1ab基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.1，反向序列为：SEQ ID NO.2，探针序列为：SEQ ID NO.3；

所述N基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.5，反向序列为：SEQ ID NO.6，探针序列为：SEQ ID NO.7。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述ORF1ab基因探针所使用的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

N基因探针所使用的荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为BHQ1；

3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述ORF1ab基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.4。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述N基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.8。

5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应液的体积为25μL；

反应体系包括下列组分：

权利要求1所述的ORF1ab基因片段和N基因片段的引物对：正向引物和反向引物终浓度分别为10μmol/L；

ORF1ab基因和N基因的探针引物终浓度分别为10μmol/L；

2×反应缓冲液(含酶混合液)；

荧光素钠盐的终浓度为100μmol/L；

RNA模板及DEPC水。

6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为商品化新型冠状病毒假病毒培养液。

7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为DEPC水。

8.一种利用权利要求1-7所述的数字PCR检测试剂盒检测新型冠状病毒的方法，其特征在于：该方法中扩增程序为：50℃反转录10min；95℃预变性1min；95℃变性10s；57-60℃退火延伸30s。