RU2720713C1 - Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса - Google Patents

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса Download PDF

Info

Publication number
RU2720713C1
RU2720713C1 RU2020112609A RU2020112609A RU2720713C1 RU 2720713 C1 RU2720713 C1 RU 2720713C1 RU 2020112609 A RU2020112609 A RU 2020112609A RU 2020112609 A RU2020112609 A RU 2020112609A RU 2720713 C1 RU2720713 C1 RU 2720713C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cov
sars
pcr
coronavirus
rna
Prior art date
Application number
RU2020112609A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2720713C9 (ru
Inventor
Евгений Олегович Рубальский
Владимир Алексеевич Гущин
Олег Васильевич Рубальский
Ольга Александровна Башкина
Марина Александровна Самотруева
Эльдар Ринатович Зулькарнеев
Original Assignee
Евгений Олегович Рубальский
Владимир Алексеевич Гущин
Ольга Александровна Башкина
Марина Александровна Самотруева
Эльдар Ринатович Зулькарнеев
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Евгений Олегович Рубальский, Владимир Алексеевич Гущин, Ольга Александровна Башкина, Марина Александровна Самотруева, Эльдар Ринатович Зулькарнеев filed Critical Евгений Олегович Рубальский
Priority to RU2020112609A priority Critical patent/RU2720713C9/ru
Publication of RU2720713C1 publication Critical patent/RU2720713C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2720713C9 publication Critical patent/RU2720713C9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Технический результат изобретения заключается в обеспечении универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. 2 з.п. ф-лы, 7 пр.

Description

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды.
Коронавирус SARS-CoV-2 является причиной заболевания COVID-2019, вызвавшей пандемию в 2020 году. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].
Известные протоколы исследования направлены на выявление специфичных нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:
- ORF1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];
- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2];
- ORF1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];
- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];
- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];
- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];
- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].
Однако проведенный авторами настоящего изобретения анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2, которые получены посредством секвенирования изолятов или клинических образцов, показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка. Поэтому выявление РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР с использованием известных синтетических олигонуклеотидов не является универсально информативным при выявлении РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР.
Главной задачей, решаемой изобретением, является обеспечение универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.
Поставленная задача реализуется за счет того, что набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров.
В основу заявленного изобретения положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков - выбранных синтетических олигонуклеотидов, которые отжигаются на консервативных участках генома коронавируса SARS-CoV-2 и при этом находятся в геноме SARS-CoV-2 на расстоянии, позволяющем проводить ОТ-ПЦР, а именно: около 300 нуклеотидов или около 900 нуклеотидов.
Указанные консервативные участки генома, фланкирующие вариабельные участки генома и находящиеся на расстоянии друг от друга, составляющем или около 300 нуклеотидов, или около 900 нуклеотидов, которое позволяет проводить ОТ-ПЦР, были выявлены в результате проведенного авторами настоящего изобретения биоинформатического анализа известных полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2.
Из патентно-технической литературы и практики лабораторной диагностики COVID-19 неизвестно о наборе синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, который был бы идентичен заявленному.
Отсюда правомерен вывод о соответствия заявленного решения критерию «новизна».
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - обеспечения универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.
Предлагаемый набор может быть получен многократно, а, значит, заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих получение набора, обеспечивающего универсальную информативность выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. При этом приведенные примеры набора показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
Пример 1. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР. Анализ графиков кривых плавления и полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей показал наличие мутации в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала в сравнении с положительным контролем.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 2. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3', имеющего флуоресцентную метку, и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймера 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', флуоресцентно меченного праймера 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 3. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 4. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', - а также флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, частично комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-TCACTCTTGTAATGTAAACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда, частично комплементарного нуклеотидной последовательности 5'-TCACTCTTGTAATGTAAACAGATTTAATGTTGCTATTACCAGAGCAAAAGTAGGC-3', термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 5. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=aflaac73_4]. Проводили обратную транскрипцию с использованием праймера 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3', термостабильной высокоточной ДНК-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования по Сэнгеру.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая подтвердила специфичность ОТ-ПЦР.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 6. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из смыва с поверхности предмета быта (расчески) от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4]. Проводили ОТ-ПЦР в одной пробирке с использованием пары праймеров 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации и анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Анализ графиков кривых плавления показал наличие мутации в геноме коронавируса SARS-CoV-2 из биологического материала в сравнении с положительным контролем.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Пример 7. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров: 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', - а также флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный нуклеотидной последовательности 5'-GTATGTCCGCAATTTACAACACAGAC-3'. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, который был отрицательным при использовании известной тест-системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4]. Проводили ОТ-ПЦР в одной пробирке с использованием пары праймеров 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3', флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда, комплементарного нуклеотидной последовательности 5'-GTATGTCCGCAATTTACAACACAGAC-3', термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (препарата РНК изолята коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля, с последующим анализом графика кривых нарастания флуоресценции.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ОТ-ПЦР с праймерами 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2.
Таким образом, приведенные примеры доказывают возможность применения при диагностике COVID-19 заявляемого набора синтетических олигонуклеотидов, которые отжигаются на консервативные участки генома коронавируса SARS-CoV-2, что обеспечивает универсальную информативность выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2.

Claims (9)

1. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя пару праймеров, выбранную из ряда:
5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';
5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';
5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';
5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';
5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3';
5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'.
2. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид имеет флуоресцентную метку.
3. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров.
RU2020112609A 2020-03-27 2020-03-27 Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса RU2720713C9 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020112609A RU2720713C9 (ru) 2020-03-27 2020-03-27 Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020112609A RU2720713C9 (ru) 2020-03-27 2020-03-27 Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2720713C1 true RU2720713C1 (ru) 2020-05-12
RU2720713C9 RU2720713C9 (ru) 2020-05-18

Family

ID=70735116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020112609A RU2720713C9 (ru) 2020-03-27 2020-03-27 Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2720713C9 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500792A (zh) * 2020-06-11 2020-08-07 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
CN111979353A (zh) * 2020-08-25 2020-11-24 上海融享生物科技有限公司 一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法
RU2752902C1 (ru) * 2021-01-22 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2
RU2761358C1 (ru) * 2021-02-05 2021-12-07 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов и способ количественной оценки вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в тканях различных органов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2744198C1 (ru) * 2020-05-25 2021-03-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени
WO2022044011A1 (en) * 2020-08-25 2022-03-03 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Oligonucleotides and methods of using same
RU2750564C1 (ru) * 2021-03-03 2021-06-29 Евгений Олегович Рубальский Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2460803C2 (ru) * 2010-10-27 2012-09-10 Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления
RU2473702C1 (ru) * 2011-11-16 2013-01-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" "(ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации рнк коронавирусов видов 229е, nl63, ос43, hku1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
RU2504585C1 (ru) * 2012-10-22 2014-01-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом
CN105018644B (zh) * 2015-07-17 2018-05-29 江苏省疾病预防控制中心 一种呼吸道病原体检测试剂盒
RU2670148C2 (ru) * 2013-02-14 2018-10-18 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Колорадо Способы прогнозирования риска интерстициальной пневмонии

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2460803C2 (ru) * 2010-10-27 2012-09-10 Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления
RU2473702C1 (ru) * 2011-11-16 2013-01-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" "(ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации рнк коронавирусов видов 229е, nl63, ос43, hku1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
RU2504585C1 (ru) * 2012-10-22 2014-01-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом
RU2670148C2 (ru) * 2013-02-14 2018-10-18 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Колорадо Способы прогнозирования риска интерстициальной пневмонии
CN105018644B (zh) * 2015-07-17 2018-05-29 江苏省疾病预防控制中心 一种呼吸道病原体检测试剂盒

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500792A (zh) * 2020-06-11 2020-08-07 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
CN111979353A (zh) * 2020-08-25 2020-11-24 上海融享生物科技有限公司 一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法
RU2752902C1 (ru) * 2021-01-22 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2
RU2761358C1 (ru) * 2021-02-05 2021-12-07 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов и способ количественной оценки вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в тканях различных органов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени

Also Published As

Publication number Publication date
RU2720713C9 (ru) 2020-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2720713C9 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса
US20220251618A1 (en) Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets
Joshi et al. Polymerase chain reaction: methods, principles and application
Ai et al. Rapid identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay
Takagi et al. Development of loop-mediated isothermal amplification method for detecting Wuchereria bancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes
EP3063292B1 (en) Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification
JP2006505275A (ja) 工業製品において微生物を普遍的に検出するための一段階リアルタイムｒｔ−ｐｃｒキット
WO2014047646A1 (en) Multiplex pyrosequencing using non-interfering noise cancelling polynucleotide identification tags
AU2016266065B2 (en) Methods for pcr and hla typing using raw blood
Rajalakshmi DIFFERENT TYPES OF PCR TECHNIQUES AND ITS APPLICATIONS.
JP2011520467A5 (ru)
US20110306505A1 (en) X-STR multiplex PCR amplification system
RU2750564C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса
RU2715617C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа
CN113151599A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
KR101162422B1 (ko) 핵산 증폭용 조성물
RU2636458C1 (ru) Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий
RU2795016C1 (ru) Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2
RU2795017C1 (ru) Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2
RU2761025C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления рнк коронавируса
RU2765497C1 (ru) Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2
RU2791958C1 (ru) Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2
RU2700450C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV)
US20220002824A1 (en) Primer sets, biomarkers, kit and applications thereof
Kalland et al. Molecular Microbial Diagnostics

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Reissue of patent specification
TK4A Correction to the publication in the bulletin (patent)

Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 14-2020 FOR INID CODE(S) (73)