DE69504094T2 - Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren auf einer Festphase und Reagenziensatz dafür - Google Patents

Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren auf einer Festphase und Reagenziensatz dafür

Info

Publication number
DE69504094T2
DE69504094T2 DE69504094T DE69504094T DE69504094T2 DE 69504094 T2 DE69504094 T2 DE 69504094T2 DE 69504094 T DE69504094 T DE 69504094T DE 69504094 T DE69504094 T DE 69504094T DE 69504094 T2 DE69504094 T2 DE 69504094T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
primer
solid support
process according
amplification
polymer fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69504094T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69504094D1 (de
Inventor
Christine F-75010 Paris Peponnet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Biodevelopment SAS
Original Assignee
Genset SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genset SA filed Critical Genset SA
Application granted granted Critical
Publication of DE69504094D1 publication Critical patent/DE69504094D1/de
Publication of DE69504094T2 publication Critical patent/DE69504094T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren in der Festphase und einen Reagentiensatz zur Durchführung dieses Verfahrens.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines Primers auf einer Festphase.
  • Die Amplifikation in fester Phase besteht in einer Elongation eines zuvor auf einem festen Träger fixierten Primers im Verlauf einer PCR-Reaktion oder von anderen Amplifikationstypen wie LCR, SDA usw. Eine solche Technik ermöglicht den Erhalt eines Amplifikationsproduktes, von dem ein spezifischer Strang kovalent an die Festphase gebunden ist, ohne auf andere Schritte zurückzugreifen als die PCR. Dies ermöglicht den Nachweis des Amplifikationsprodukts vor Denaturierung in Doppelstrang-DNA oder nach Denaturierung in einem spezifischen Strang durch Aufeinanderfolge von PCR und Nachweis ohne Auswechseln des Trägers.
  • Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren in fester Phase sind in WO 89/11546, AU 47144/89 und WO 93/09250 beschrieben.
  • Diese Amplifikationstypen auf Trägern können sehr nützlich sein für alle diagnostischen Anwendungen in der Molekularbiologie, insbesondere zum Nachweis von infektiösen Zielen oder genomischen Zielen. Diese Technik ermöglicht die Verminderung der Nachweiszeit genauso wie der Risiken von Irrtümern, da die Probe nicht von einer Vertiefung in die andere übertragen wird, sondern weil das gesamte Experiment auf demselben Träger stattfindet. Da übrigens alle Anwendungen, wie die Klonierung oder die Sequenzierung, nur einen spezifischen DNA-Strang erfordern, kann diese Technik eine tatsächliche Zeitersparnis und eine große Anwendungserleichterung ermöglichen, indem viele Zwischenschritte vermieden werden.
  • Der an der PCR-Reaktion beteiligte Primer, der mit seinem 5'-Ende am festen Träger fixiert ist, muß Teil des Strangs sein, den man auf dem festen Träger verlängern möchte. Das 3'-Ende des Primers muß frei, nicht modifiziert und homolog mit dem Ziel sein, um die Elongation durch eine Polymerase zu ermöglichen.
  • Ein Hauptnachteil der Amplifikation in fester Phase ist die schlechte Ausbeute der Verlängerung auf der festen Phase.
  • Um die sterischen Wechselwirkungen des festen Trägers mit den Oligonukleotiden zu vermindern und den Zugang der Taq-Polymerase zum Hybrid zu verbessern, das zwischen dem fixierten Primer und dem komplementären Amplifikationsprodukt gebildet wird, wird ein Verbindungsarm oder "linker" mit dem 5'-Ende des fixierten Primers verknüpft. Dieser Verbindungsarm wird auch "Abstandsarm" genannt, da er dazu dient, den festen Träger vom 3'-Ende des fixierten Primers physisch zu entfernen, um das Zusammenwirken der verschiedenen Amplifikationsreagentien mit dem Primer nicht zu behindern.
  • Erfindungsgemäß wurde entdeckt, daß einer der Parameter, die die Ausbeute der Elongation beeinflussen, in der Art der Fixierung des Primers auf dem festen Träger liegt. Die Nukleotide des Primers selbst können an einer kovalenten Fixierung mit dem Träger unter den für die Kopplung verwendeten Bedingungen zwischen dem "linker" und dem festen Träger beteiligt werden, was zur schlechten Ausbeute der Elongation des Primers beiträgt. Genauer gesagt wurde entdeckt, daß mehr als die Größe des Verbindungsarms die Reaktivität oder die Multiplizität der potentiellen Fixierungsstellen des Verbindungsarms mit dem Träger die Ausbeute der Elongation des Primers erhöhen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren in fester Phase, wobei man einen auf einem funktionalisierten thermoresistenten festen Träger immobilisierten Primer verwendet, dadurch charakterisiert, daß der Primer auf dem festen Träger über ein Verbindungsglied zwischen dem festen Träger und einer funktionellen Gruppe eines polyfunktionellen Moleküls immobilisiert ist, wobei das Molekül selbst an das 5'-Ende des Primers gebunden ist.
  • Genauer gesagt wird der Primer auf dem festen Träger durch das Zwischenglied aus einem Verbindungsarm oder "linker" immobilisiert, der aus einem zwischen den festen Träger und das 5'-Ende des Primers eingeschobenen Rest des polyfunktionellen Moleküls besteht und eine kovalente Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des festen Trägers und einer ersten funktionellen Gruppe des polyfunktionellen Moleküls, andererseits zwischen dem 5'-Ende des Primers und einer zweiten funktionellen Gruppe des polyfunktionellen Moleküls ausbildet.
  • Durch Erhöhung der Anzahl der funktionellen Gruppen im Verbindungsarm wird die Ausbeute der Elongation erhöht. Man nimmt an, daß dies auf der Tatsache beruht, daß man so die Wahrscheinlichkeit erhöht, daß die Fixierung auf dem festen Träger durch das Zwischenglied des Verbindungsarms stattfindet, d. h. ohne daß der Primer selbst daran beteiligt ist.
  • Unter funktioneller Gruppe des polyfunktionellen Moleküls wird hier eine Gruppe verstanden, die eine kovalente Bindung mit dem festen Träger ausbilden kann. Insbesondere werden als funktionelle Gruppen die Gruppen Amin, Hydroxyl, Carboxyl, Aldehyd, Thiol oder Phosphat angegeben.
  • Während der Verbindungsarm eine sehr reaktive Gruppe umfaßt, wie eine terminale Phosphatgruppe, die an sein nicht mit dem Primer gebundenes Ende gebunden ist, ist es nicht notwendig, daß das polyfunktionelle Molekül eine erhöhte Anzahl von funktionellen Gruppen umfaßt. Dennoch umfaßt das polyfunktionelle Molekül bevorzugt mindestens 5, noch bevorzugter mindestens 10 funktionelle Gruppen.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfaßt das polyfunktionelle Molekül ein polymeres Fragment. Bevorzugt umfaßt jede monomere Einheit des polymeren Fragments mindestens eine funktionelle Gruppe. In diesem Fall führt die Verlängerung des Verbindungsarms, d. h. des Polymeren, zur Vermehrung der Anzahl der potentiellen Stellen zur terminalen Fixierung des Primers und ermöglicht die Erhöhung der Ausbeute der Elongation und dies, obwohl die Gesamtmenge der Fixierung des Primers auf dem festen Träger konstant bleibt.
  • Bevorzugt umfaßt das am 5'-Ende des Primers gebundene polymere Fragment mehr als 5 Monomere, noch bevorzugter mehr als 10 Monomere, insbesondere bis zu 50 Monomere.
  • Vorteilhafterweise umfaßt das polymere Fragment gemäß der Erfindung ein homopolynukleotidisches Fragment oder ein Fragment eines Polynukleotid-Analogons.
  • Unter "Polynukleotid-Analogon" wird hier ein Polymer verstanden, dessen monomere Einheiten durch eine Phosphodiesterbindung gebunden sind, die der Phosphodiester-Bindung der natürlichen Polynukleotide gleicht. In anderen Worten handelt es sich um ein Polymer, dessen nukleosidische Reste der Nukleotid-Monomere durch nicht-nukleosidische Reste ersetzt sind, nämlich aliphatische. Insbesondere werden polymere Fragmente der folgenden Formel (I) angegeben:
  • wobei R ein aliphatischer Rest ist, insbesondere mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie ein Alkylenrest, R mindestens eine funktionelle erfindungsgemäße Gruppe umfaßt und n eine ganze Zahl insbesondere zwischen 2 bis 50 ist.
  • Bevorzugt umfaßt das polymere Fragment vom Typ Polynukleotid-Analogon gemäß der Erfindung mehrere reaktive Gruppen, die auf jedes Monomer gepfropft sind, insbesondere Amingruppen oder Hydroxylgruppen, wobei in diesem Fall n insbesondere nur zwischen 2 und 10 liegen kann.
  • Wenn der Verbindungsarm aus einem Homopolynukleotid-Fragment besteht, umfaßt er bevorzugt mehr als 5 Nukleotide, noch bevorzugter mehr als 10 Nukleotide, insbesondere bis zu 50 Nukleotide.
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotid-Analoga können durch Synthesemethoden erhalten werden, die den DNA-Synthesemethoden gleichen, insbesondere durch automatische Synthese in fester Phase. In der Tat können die Polymer-Fragmente durch Kondensation der monomeren Synthone erhalten werden, die an die Nukleotid-Syntheseverfahren unter Verwendung von Phosphoramiditsynthonen adaptiert sind, d. h. ein Synthon, das in klassischer Weise zwei terminale OH-Gruppen umfaßt, von denen die eine durch eine Dimethoxytritylgruppe (Dmtr) und die andere durch eine Phosphoramidit-Gruppe geschützt ist. Das polymere Fragment vom Typ Polynukleotid-Analogon entspricht daher der Kondensation von Synthonen, die den klassischen nukleotidischen Synthonen gleichen, in denen der divalente nukleosidische Rest in 5' und 3' durch einen aliphatischen Rest, insbesondere Alkylen, ersetzt ist.
  • Genauer gesagt kann man zur Herstellung von Polynukleotid-analogen Polymer- Fragmenten der Formel (I) Phosphoramidit-Synthone der Formel
  • einsetzen.
  • Während so der Verbindungsarm ein Polynukleotid-Fragment oder Polynukleotid- Analogon ist, kann man vorteilhafterweise den Verbindungsarm oder das mit dem Verbindungsarm gebundene Primer-Konjugat direkt durch Synthese vom Nukleotid-Typ herstellen, wobei das Konjugat schließlich erfindungsgemäß an den festen Träger gekoppelt wird.
  • Das polymere Fragment, insbesondere Homopolynukleotid oder Polynukleotid- Analogon, kann ein verzweigtes Fragment sein, d. h. es umfaßt mehrere Ketten. Dieser Fragment-Typ kann durch Verwendung eines Monomeren erhalten werden, das als Kondensationsbasis mit mehreren Monomeren in demselben Synthon dienen kann.
  • Insbesondere wird das folgende Phosphoramidit-Synthon angegeben (Ref. 5250-1 von Clontech):
  • das im Syntheseverfahren vom Typ automatische DNA-Synthese dienen kann und parallel mit zwei Monomeren kondensieren kann.
  • Vorteilhafterweise umfaßt das Polymer und insbesondere das Homopolynukleotid- oder Polynukleotid-Analogon-Fragment, das zwischen dem festen Träger und dem Primer eingeschoben ist, an seinem Ende, das nicht an den Primer gebunden ist, eine terminale reaktive funktionelle Gruppe, die eine kovalente Bindung mit dem festen Träger bilden kann.
  • Als diese terminale reaktive funktionelle Gruppe des polymeren Fragments werden insbesondere eine Hydroxyl- oder Amingruppe und noch bevorzugter eine Phosphatgruppe angegeben.
  • Die Verwendung einer terminalen Phosphatgruppe wird besonders empfohlen, wenn der Bindungsarm ein Poly-T ist. In Abwesenheit einer Phosphatgruppe ist ein Verbindungsarm Poly-A oder Poly-C wirksamer.
  • Die Methoden der automatischen DNA-Synthese in der Festphase ermöglichen die chemische Phosphrylierung des terminalen 5'-Endes von bedeutenden Mengen von Oligonukleotiden. Man kann daher mit diesen Verfahren Verbindungsarme vom Homopolynukleotid-Typ oder Polynukleotid-Analogon-Typ oder Konjugate dieses Verbindungsarms und des Primers herstellen, die am 5'-Ende des Verbindungsarms phosphoryliert sind.
  • Erfindungsgemäß wird der feste Träger von einem funktionalisierten organischen oder anorganischen Polymeren gebildet.
  • Erfindungsgemäß sind bestimmte Eigenschaften des festen Trägers vorteilhaft, um einen auf einem festen Träger fixierten oligonukleotidischen Primer zu einem Amplifikationsprodukt zu verlängern. Zunächst muß der feste Träger thermoresistent sein, d. h. dazu in der Lage sein, hohen Temperaturen einer PCR (100ºC) zu widerstehen, und muß eine gute thermische Leitfähigkeit aufweisen. Er muß funktionalisiert sein, d. h. chemische Funktionen umfassen, um die stabile Fixierung eines oligonukleotidischen Primers auf dem festen Träger zu ermöglichen. Diese Bindung zwischen Primer und festem Träger muß ebenfalls beständig sein gegen hohe Temperaturen. Aus diesem Grund ist erfindungsgemäß eine kovalente Bindung bevorzugt. Die Taq-Polymerase oder andere Enzyme, die für die Elongation verantwortlich sind, dürfen nicht durch die Bestandteile des Trägers inhibiert werden. Schließlich muß ein solcher Träger optische Eigenschaften aufweisen, die den colorimetrischen oder Fluoreszenz-Nachweis ohne Hintergrundrauschen ermöglichen. Ein transparenter Träger ist bevorzugt, da er die Verwendung aller Nachweisetypen ermöglicht.
  • Man verwendet daher bevorzugt Typen von Kunststoff, die eine große Beständigkeit gegen hohe Temperaturen zeigen. Insbesondere werden Kunststoff-Materialien angegeben, bevorzugt auf Basis von modifiziertem thermorestistentem Polystyrol, Styrol-Acrylnitril- Copolymer, Polycarbonat, Polypropylen oder Glas.
  • Man kann feste Kunststoffträger verwenden, die durch UV-Behandlung funktionalisiert sind, um das Auftreten von funktionellen NH&sub2;-Gruppen zu induzieren (Ref. 1). Jedenfalls kann der feste Träger erfindungsgemäß ein polyfunktioneller Träger sein, d. h. der eine Vielzahl von funktionellen Gruppen umfaßt, insbesondere Aldehyd, Carboxyl, Amin, Hydroxyl oder Thiol, die die Ausbildung einer kovalenten stabilen Bindung mit dem Verbindungsarm begünstigen, der aus dem an den Primer gebundenen polyfunktionellen Molekül besteht.
  • In geeigneter Weise verwendet man Kunststoffträger, die durch eine Corona- Behandlung oder Gamma-Bestrahlung behandelt wurden, um das Auftreten einer Vielzahl von funktionellen Gruppen zu induzieren. Dieser Behandlungstyp wird durch die Verwendung von chemischen Funktionalisierungs-Reagentien erleichtert.
  • Als bevorzugten thermoresistenten Träger verwendet man insbesondere Polycarbonat oder Styrol-Acrylnitril-Copolymer, die unter anderem durch Corona-Behandlung oder Gamma-Bestrahlung funktionalisiert wurden.
  • Verfahren zur kovalenten Fixierung von Oligonukleotiden auf festen funktionalisierten Trägern durch ein Verbindungsglied einer terminalen funktionellen Gruppe des Oligonukleotids sind bekannt (Ref. 1 bis 5). Jedenfalls können erfindungsgemäß die Homopolynukleotid-Fragmente auf dem festen Träger durch natürliche funktionelle Gruppen, insbesondere Amin oder Hydroxyl, der nukleotidischen Basen selbst, oder durch eine terminale funktionelle Gruppe, insbesondere Phosphat, fixiert werden.
  • Genauso können sich die Fragmente vom Typ Polynukleotid-Analogon auf dem festen Träger durch eine terminale Gruppe oder eine der funktionellen Gruppen fixiert werden, insbesondere Amin oder Hydroxyl, die in den Monomeren substituiert sind.
  • Diese Kupplungen zwischen den funktionellen Gruppen des Verbindungsarms, insbesondere des Homopolynukleotid-Fragments oder des Polynukleotid-Analogon- Fragments, und den funktionellen Gruppen des Trägers kann durch chemische Kopplung in Gegenwart von üblichen Aktivierungsmitteln durchgeführt werden. Insbesondere wird die chemische Kopplung mit einem polyfunktionellen Träger in Gegenwart eines Aktivierungsmittels vom Carbodümid-Typ, wie Ethylcarbodümid (EDC) durchgeführt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Immobilisierung auf einem funktionalisierten thermoresistenten festen Träger eines Primers, der zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Amplifizierungsverfahrens einsetzbar ist, dadurch charakterisiert, daß man die kovalente Kopplung zwischen dem funktionalisierten Träger und einem Verbindungsarm, der aus einem an das 5'-Ende des Primers gebundenen polyfunktionellen Molekül besteht, durchführt.
  • Der feste Träger kann die innere Oberfläche des Gefäßes der PCR-Reaktion oder ein festes Element sein, das man vor der Reaktion in das Gefäß einführt, wie Kugeln. Als fester Träger werden insbesondere die inneren Oberflächen der Mikroplatten-Vertiefungen der Mikrotiterplatten oder die Nachweisröhrchen angegeben.
  • Das bevorzugte Format ist das der Mikroplatten. Tatsächlich ermöglichen die breite Verwendung und die im Zusammenhang mit diesem Format bereits existierenden Apparate die schnelle und leichte Automatisierung. Zwei Typen von Mikroplatten werden heute verwendet. Der erste ist ein Standard-Typ mit zylindrischen Bechern und ebenem Boden. Der zweite umfaßt keine zylindrischen Becher wie vorstehend angegeben, sondern Vertiefungen in Form von kleinen abgestumpften Röhrchen mit ebenem Boden. Diese Röhrchenform ermöglicht die leichte Anpassung an das Thermo-Zyklus-Gerät und ermöglicht eine hervorragende thermische Leitfähigkeit.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Immobilisierung einer Primers auf fester Phase, das bei der Durchführung eines Amplifikationsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, dadurch charakterisiert, daß man eine kovalente Kopplung zwischen dem funktionalisierten Träger und dem an das 5'-Ende des Primers gebundenen polyfunktionellen Molekül durchführt.
  • Die Amplifikation in fester Phase ermöglicht die Amplifikation und den Nachweis auf demselben Träger. Der Nachweis des verlängerten Amplifikationsprodukts auf der festen Oberfläche kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Der auf dem Träger fixierte Doppelstrang kann entweder durch den Nachweis eines während der PCR eingeführten Markers nachgewiesen werden, insbesondere über das Zwischenprodukt eines zweiten markierten Primers, oder durch Verwendung eines Einschubmittels vom Typ Ethidiumbromid, YOYO, TOTO, POPO (Molekularsonden Ref. 6 bis 8). Nach Denaturierung kann der spezifisch auf dem festen Träger fixierte Einfachstrang genauso durch eine markierte Sonde nachgewiesen werden.
  • Der Nachweis besteht beispielsweise in der Hybridisierung einer biotinylierten oligonukleotidischen Sonde, die spezifisch das verlängerte Amplifikationsprodukt auf der Platte nachweist. Ein Konjugat Straptavidin-alkalischen Phosphatase erkennt die Biotin- Einheit der hybridisierten Sonde, und erzeugt nach Dephosphorylierung eines Substrats ein kolorimetrisches oder fluoreszierendes Produkt.
  • Die Fixierungsart des Primers nach der vorliegenden Erfindung ist bestimmend für die Elongation. In der Tat kann die Ausbeute der Elongation um das 15-fache je nach dem Typ des Arms erhöht werden, wenn die Elongation einen Verbindungsarm gemäß der Erfindung umfaßt, während die Fixierungsmenge konstant bleibt, unabhängig vom Verbindungsarm.
  • Die Menge des in der Reaktionslösung der Amplifikation vorhandenen Primers spielt auch eine wichtige Rolle für die Ausbeute der Elongation. Um eine optimale Ausbeute der Elongation des fixierten Primers zu erzielen, wird eine desäquilibrierte PCR verwendet wird (Ref. 9). Während der PCR ist der auf dem festen Träger fixierte Primer (Primer A) ebenfalls in der Lösung vorhanden, jedoch in geringerer Menge, insbesondere 8- bis 16-fach weniger als der andere Amplifikations-Primer (Primer X). Die Amplifikation findet in zwei Schritten statt; die Amplifikation verläuft zunächst exponentiell, bis der Primer A in der Lösung verbraucht ist, die auf dem festen Träger fixierten Primer A werden anschließend verlängert, die Amplifikation wird demnach arithmetisch. Der erste Schritt ermöglicht die Herstellung einer bedeutenden Anzahl von Kopien und ermöglicht so eine effizientere Elongation auf dem festen Träger. Die Menge des in der Lösung vorhandenen Primers ist kritisch, da sie bestimmt, zu welchem Zeitpunkt die arithmetische Amplifikation beginnt. Eine Menge in der Größenordnung von 5 bis 10 pMol des Primers X und die 8- bis 16-fach kleinere Menge des Primers A ergibt gute Elongationsausbeuten.
  • Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren bringt eine tatsächliche Verbesserung verglichen mit den üblichen diagnostischen Techniken, die die PCR verwenden, sei es für infektiöse oder genetische Erkrankungen. Da das erfindungsgemäße Verfahren übrigens die spezifische Bindung eines Einzelstrangs an die feste Phase ermöglicht, kann es auch für die Sequenzierung interessant sein, insbesondere wenn große Mengen sequenziert werden müssen und eine Vereinfachung der Verfahren und eine Automatisierung unumgänglich sind.
  • Weitere Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Licht des folgenden detaillierten Ausführungsbeispiels deutlich.
  • Fig. 1 stellt die verschiedenen Schritte der PCR in fester Phase dar.
  • X-: Primer X in Lösung
  • A-: Primer A in Lösung
  • X=A: Amplifikationsprodukt
  • vvvA-: fixierter Primer A
  • Fig. 2 stellt die Ausbeute der Fixierung des Primers in pM als Funktion verschiedener Verbindungsarme dar.
  • Fig. 3 stellt die Elongationsmengen in Fluoreszenzeinheiten als Funktion verschiedener Verbindngsarme dar.
  • Fig. 4 stellt die Ausbeute der Elongation der hybridisierten Antisonde in fMol dar.
  • Fig. 5 stellt den Einfluß der Größe des Verbindungsarms auf die Elongationsmenge dar.
  • Fig. 6 stellt den Einfluß der verschiedenen chemischen Funktionen des Verbindungsarms auf die Elongationsmenge dar.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wurde an einem Modell HLA-DRB (Ref. 10 und 11) angewendet. Klone von M13, die ein Insert von 280 pb umfaßten, entsprechend dem Amplifikationsprodukt, wurden als Ziel verwendet. Das Modell HLA-DRB ermöglichte den Nachweis der wichtigen Parameter, die in die Verlängerung eingehen, und das Studium insbesondere der Probleme der Spezifität dieser Technik.
  • 1) Beispiele für verschiedene verwendete Verbindungsarme
  • A, A-Ph
  • A-ST, A-10T A-20T A-30T
  • A-5T-Ph, A-10T-Ph
  • A-SA, A-10A
  • A-SA-Ph, A-10A-Ph
  • A-SC, A-10C
  • A-SC-Ph, A-10C-Ph
  • A = fixierter Primer: CCCCACAGCACGTTTC(T,C)TG
  • Ph = 5'-terminale Phosphatgruppe
  • xT, xA, xC = Reihe von jeweils x Basen T, x Basen A oder x Basen C am 5'-terminalen Ende.
  • Man verwendete auch (Fig. 6) Verbindungsarme, die polymere Fragmente vom Typ Polynukleotid-Analogon umfaßten:
  • A - NH&sub2;*
  • A-5T-5 NH&sub2;*
  • A - (TEG)3 *
  • A - (TEG)3 *Ph
  • Der Arm - NH&sub2;* entspricht hier einem aminierten Alkylarm, der durch das Synthon Unilink® Amino Modifier von Clontech der Formel:
  • eingeführt wurde.
  • Der Arm - 5T-5NH&sub2;* entspricht der schrittweisen Kondensation von 5 Nukleotiden T, anschließend von 5 Synthonen Unilink® in einer Synthese vom Phosphoramidit-Typ. Die Kondensation der Synthone Unilink® führt zu einem Polynukleotid-Analogon- Fragment mit Alkylamin-Resten, die auf die Monomere gepfropft sind.
  • - (TEG)&sub3;* entspricht der Kondensation des Synthons von Glen Research (Ref. 10 - 1909 x) der Formel:
  • - (TEG)&sub3;* - Ph wird durch 5'-terminale Phosphorylierung des Konjugats A - (TEG)3* nach der Phosphoramidit-Synthese erhalten.
    • 2) Fester Träger
  • Zwei thermoresistente polyfunktionelle von der Firma Nung bereitgestellte Träger wurden zur Beurteilung der verschiedenen Verbindungsarme verwendet. Typ I ist ein thermoresistentes modifiziertes Polystyrol und Typ II ist ein Styrol-Acrylnitril-Copolymer. Sie weisen ein Mikroplatten-Format auf und werden in einem Thermozyklus-Gerät von Nung dem Zyklus unterzogen.
  • Diese Kunststoffträger wurden durch eine Korona-Behandlung oder Gamma- Bestrahlung funktionalisiert, die in klassischer Weise in der Anwendung von elektrischen Entladungen in einem Blitz in kontrollierter Atmosphäre und konstantem Druck besteht. Diese Funktionalisierung ermöglicht, daß der Kunststoffträger zur Fixierung der oligonukleotidischen Primer fähig wird. Diese Behandlung läßt an der Oberfläche des Kunststoffs funktionelle Gruppen vom Typ Amin, Alkohol, Aldehyd, Keton, Carbonsäure, Thiol... entstehen, die chemisch mit dem Oligonukleotid unter Bildung einer stabilen Bindung reagieren. Die Typen der gebildeten Bindungen, obwohl sehr thermoresistent, sind dennoch nur schlecht bekannt.
  • Man führt die chemische Kopplung in Gegenwart eines Aktivierungsmittels gemäß dem folgenden Verfahren durch.
  • 10 bis 100 pMol Oligonukleotide werden pro Vertiefung für die Fixierung in Gegenwart von Ethylcarbodiimid (EDC) in 10 bis 50 mM Endkonzentration und N- Methylimidazol in 10 bis 50 mM Endkonzentration bei pH 7 eingesetzt, in einem Endvolumen von 100 ul. Die Platten werden während 5 bis 15 Stunden bei 50ºC inkubiert, anschließend viermal mit einer 0,4 N NaOH-Lösung und 0,25% Tween®20 gewaschen, die jeweils auf 50ºC erhitzt worden waren.
    • 3) Elongation des Primers auf fester Phase
  • Die Elongation findet in einem Endvolumen von 50 ul pro Vertiefung statt. 15 bis 100 ng Ziel-DNA werden in einer Mischung amplifiziert, die Puffer 1X PCR Buffer II (Perkin Elmer), 0,25 mM MgCl&sub2; (Sigma), 200 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia), 80 ng Primer X (CCGCTGCACTGTGAAGCTCT) und 10 ng Primer A mit oder ohne Linker und 1,2 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer) umfaßt. Der Primer X befindet sich nur in Lösung, während der Primer A auf dem Träger fixiert ist und sich in Lösung befindet. Die Amplifikation wird in einem Thermozyklusgerät durchgeführt, das an das Mikroplaten-Format adaptiert ist, indem die folgende Methode angewendet wird:
    • Zyklus 1:
  • 5 min bei 94ºC
    • Zyklus 2 bis 30:
  • 30 s bei 94ºC
  • 30 s bei 55ºC
  • 30 s bei 72ºC
    • Zyklus 31:
  • 5 min bei 72ºC
  • 4ºC
  • Fig. 1 stellt die verschiedenen Schritte der PCR in fester Phase dar. Nach der Amplifikation werden die auf der festen Phase verlängerten Amplifikationsprodukte denaturiert. Die Vertiefungen werden geleert und anschließend dreimal mit 0,4M Soda während 10 Minuten gewaschen.
    • 4) Nachweis
  • Zwei Detektionstypen werden verwendet. Ein halbquantitativer enzymatischer Nachweis und ein quantitativer radioaktiver Nachweis.
  • Der enzymatische Nachweis wird durchgeführt wie in Literatur (9) beschrieben. In dieser Methode wird nach Denaturierung ein pM der biotinylierten Sonde, die zu einer Region des verlängerten Strangs auf dem festen Träger komplementär ist, hybridisiert.
  • Das Hybrid wird durch einen Konjugat aus Streptovidin und alkalischer Phosphatase nachgewiesen, das ein Substrat in ein kolorimetrisches fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Produkt transformiert.
  • Für den radioaktiven Nachweis wird eine mit P³² markierte Sonde mit dem auf dem festen Träger verlängerten Strang hybridisiert, und die Radioaktivität wird in einem β-Zähler gezählt.
    • 5) Ergebnisse
  • Die Fähigkeit zur Fixierung des Primers auf dem festen Träger wurde durch Fixierung von am 5'-Ende radioaktiv mit Kinase behandelten Primern quantifiziert und ermöglicht zu zeigen, daß Typ I in der Größenordnung von 1 pM Primer pro Vertiefung fixierte, während Typ II 0,2 pM fixierte.
  • Fig. 2 stellt die Fähigkeit zur Fixierung des Primers auf beiden Mikroplatten- Trägern als Funktion der verschiedenen Typen von Elongationsarmen dar. Für einen gegebenen Trägertyp variiert die Fixierungsfähigkeit nicht signifikant als Funktion der verwendeten Arme.
  • Im Gegensatz dazu variiert die Elongationsausbeute enorm als Funktion des verwendeten Verbindungsarms. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und 5 dargestellt, die die Elongationsmengen der Träger als Funktion der verschiedenen verwendeten Arme darstellen. Der Einfluß des am Primer gebundenen Arms ist bestimmt für die Ausbeute der Elongation, die um das 15-fache erhöht werden kann, je nach Typ des verwendeten Linkers, wobei die Fixierungsmenge konstant bleibt.
  • Die Fragmente Poly-A und Poly-C sind wirksamer als Poly-T. In der Tat ergeben sie für Verbindungsarme in derselben Größe für die Elongation stärkere Signale. Die Hinzufügung einer Phosphatgruppe verbessert die Ausbeute der Elongation noch, und diese Erhöhung ist empfindlicher mit den Verbindungsarm Poly-T als mit dem Verbindungsarmen Poly-A oder Poly-C.
  • Die Elongation wird indirekt durch Hybridisierung von radioaktiven Sonden gemessen, die komplementär sind zum durch PCR verlängerten Teil. Die Hybridisierungsmenge wurde durch Hybridisieren von radioaktiven Sonden mit Vertiefungen bestätigt, die eine bekannte Menge fixierter Primer enthielten. Die Elongationsmenge variiert je nach Typ des verwendeten Verbindungsarms jeweils zwischen 2 fM und 38 fM oder zwischen 1 fM und 17 fM für Typ I und Typ II. Diese Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
  • Das Vorhandensein von mehreren funktionellen Gruppen im Verbindungsarm ermöglicht die Erhöhung der Elongationsmenge des auf dem festen Träger fixierten Primers. So stellt man fest, wie in Fig. 6 gezeigt, eine Erhöhung von 45%, wenn 10T zwischen dem Primer und der terminalen Phosphatgruppe vorhanden sind. Genauso ermöglicht das Hinzufügen einer Phosphatfunktion an einen Verbindungsarm (TEG)&sub3; die Erhöhung des Signals um 40% und um 350% verglichen mit dem Primer selbst ohne Verbindungsarm. Dasselbe Phänomen wird festgestellt, wenn ein Arm 5T5NH&sub2; verwendet wird; die Elongationsmenge wird um 110% verglichen mit einem NH&sub2;-Arm erhöht. Die Verwendung von mehreren verschiedenen chemischen Funktionen ermöglicht die Begünstigung der Elongation des Primers in fester Phase, indem die Typen der terminalen Bindungen erhöht werden.
  • Die Menge der verlängerten Oligonukleotide ist in der Tat sehr gering verglichen mit der auf dem Träger fixierten Menge. Trotz dieser kleinen Menge gelangt man zu Signal- Rauschen-Verhältnissen in der Größenordnung von 30 mit der beschriebenen enzymatischen Nachweistechnik, was jedenfalls für eine diagnostische Anwendung ausreichend ist.
    • BIBLIOGRAPHIE
  • 1. "Covalent immobilization DNA onto Polystyrene microwells: the molecules are only bound at the 5' end". S. R. Rasmussen, et al. Anal. Biochem. 198, 138-142, (1991).
  • 2. "A sensitive nonisotopic hybridization assay for HIV-1 DNA". G. H. KELLER, et al. Anal. Biochem. 177, 27-32 (1989).
  • 3. "Immobilization of DNA via oligonucleotides containing an aldehyde or carboxylic acid group at the 5' terminus". J. N. Kremsky et al. Nucleic Acid Res. Vol. 15, Num. 7, 2891-2909, (1987).
  • 4. "Detection of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma from high risk pediatric patients by using the self sustained sequence replication reaction". C. E Bush, J. Clin. Microbiol. 30, 281-286, (1992).
  • 5. "Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence- specific oligonucleotide probes". R. K. Saiki, et al. pNAS 86, 6230-6234 (1989).
  • 6. "Use of the fluorescent dye YOYO-1 to quantifie oligonucleotides immobilized on plastic plates". M. Ogura, et al. Biotechniques 16, 1032 (1994).
  • 7. "Stable dye-DNA intercalaton complexes as reagents for highsensitivity fluorescent detection". A. N. Glazer, H. S. Rye, Nature 359, 859 (1992).
  • 8. "Fluorometric assay using dimeric dyes for double- and singlestranded DNA and RNA with picogram sensitivity." H. S. Rye, et al. Anal. Biochem. 208, 144 (1993).
  • 9. "Combined polymerase chain reaction-hybridization microplate assay used for detection of bovine leukemia virus and salmonella". S. R. Rasmussen, et al. Clin. Chem., 40 : 200 - 5 (1994).
  • 10. "Structure, sequence and polymorphism in the HLA-D region". J. Trowsdale, et al. lmmuno. Rev., 198, 85 : 5-43.
  • 11. "HIA class II nucleotide sequences, 1992." J. G. Bodmer. Eur. J. immunogen., 1993, 20 : 47-79.

Claims (19)

1. Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren in Festphase unter Verwendung eines auf einem thermoresistenten, funktionalisierten, festen Träger immobilisierten Primers, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer auf dem festen Träger immobilisiert ist über ein Verbindungsglied, das aus einem polyfunktionellen Molekül besteht, welches eine kovalente Bindung zwischen dem festen Träger und einer ersten funktionellen Gruppe des polyfunktionellen Moleküls und zwischen dem 5'-Terminus des Primers und einer zweiten funktionellen Gruppe des polyfunktionellen Moleküls ausbildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Molekül ein Polymerfragment umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jede Monomereinheit des Polymerfragments mindestens eine funktionelle Gruppe umfaßt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerfragment mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 Monomere umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen des Moleküls, insbesondere des Polymerfragments ausgewählt sind aus Amin-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Aldehyd-, Thiol- oder Phosphatgruppen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus Amin-, Hydroxyl- oder Phosphatgruppen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Molekül ein Polymerfragment vom Typ Homopolynucleotid oder ein Fragment eines Polynucleotidanalogen umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerfragment ein Homopolynucleotid ist, das 10 bis 50 Nucleotide umfaßt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Molekül ein Polynucleotidanalog-Polymerfragment umfaßt mit der Formel:
worin R ein aliphatischer Rest ist, der mindestens eine funktionelle Gruppe trägt und n eine ganze Zahl von 2 bis 50 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynucleotidanalog-Polymerfragment mehrere Amin- oder Hydroxylgruppen, gepfropft auf jedes Monomere, umfaßt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerfragment eine endständige Phosphatgruppe an dem Terminus, der nicht mit dem Primer verbunden ist, umfaßt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger aus einem organischen oder anorganischen Polymer gebildet ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein plastisches thermoresistentes Material, funktionalisiert durch Corona-Behandlung oder Gamma-Bestrahlung, ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger aus thermoresistentem modifiziertem Polystyrol, wie einem Styrol- Acrylnitril-Copolymeren oder Polycarbonat, besteht.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der an den festen Träger fixierte Primer auch in Lösung vorhanden ist, jedoch in einer weniger bedeutenden Menge als der andere Primer in Lösung während der Amplifikationsreaktion.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der an dem festen Träger fixierte Primer ebenfalls in Lösung vorhanden ist in einer Menge von 8- bis 16-fach unter der des anderen in Lösung befindlichen Primers.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger aus einer inneren Oberfläche innerhalb des Gefäßes, in dem die Amplifikation durchgeführt wird, gebildet wird.
18. Reagentiensatz zur Durchführung eines Amplifikationsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß er einen festen, thermoresistenten, funktionalisierten Träger umfaßt, auf dem ein Primer über eine kovalente Bindung mit einem polyfunktionellen Molekül, das insbesondere ein Polymerfragment umfaßt, immobilisiert ist.
19. Verfahren zur Immobilisierung eines Primers, der zur Durchführung des Amplifikationsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 geeignet ist, an einem festen, thermoresistenten, funktionalisierten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man eine kovalente Kupplung zwischen dem funktionalisierten Träger und einem Verbindungsglied, das aus einem polyfunktionellen Molekül, gebunden an den 5'-Terminus des Primers, besteht, durchführt.
DE69504094T 1994-10-28 1995-10-27 Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren auf einer Festphase und Reagenziensatz dafür Expired - Fee Related DE69504094T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9412972A FR2726286B1 (fr) 1994-10-28 1994-10-28 Procede d'amplification d'acides nucleiques en phase solide et trousse de reactifs utile pour la mise en oeuvre de ce procede
PCT/FR1995/001422 WO1996013609A1 (fr) 1994-10-28 1995-10-27 Procede d'amplification d'acides nucleiques en phase solide et trousse de reactifs utile pour la mise en ×uvre de ce procede

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69504094D1 DE69504094D1 (de) 1998-09-17
DE69504094T2 true DE69504094T2 (de) 1999-03-11

Family

ID=9468346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69504094T Expired - Fee Related DE69504094T2 (de) 1994-10-28 1995-10-27 Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren auf einer Festphase und Reagenziensatz dafür

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6274351B1 (de)
EP (1) EP0787205B1 (de)
JP (1) JP4067057B2 (de)
AT (1) ATE169683T1 (de)
DE (1) DE69504094T2 (de)
DK (1) DK0787205T3 (de)
ES (1) ES2122692T3 (de)
FR (1) FR2726286B1 (de)
WO (1) WO1996013609A1 (de)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9624165D0 (en) 1996-11-19 1997-01-08 Amdex A S Use of nucleic acids bound to carrier macromolecules
AU6846698A (en) 1997-04-01 1998-10-22 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid amplification
US6511803B1 (en) * 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6485944B1 (en) * 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6322968B1 (en) 1997-11-21 2001-11-27 Orchid Biosciences, Inc. De novo or “universal” sequencing array
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6872521B1 (en) * 1998-06-16 2005-03-29 Beckman Coulter, Inc. Polymerase signaling assay
DE19848403A1 (de) * 1998-10-21 2000-04-27 Guenter Von Kiedrowski Verfahren zur exponentiellen Amplifikation molekularer Matrizen
DE19853185C1 (de) * 1998-11-19 2001-01-18 Guenter Von Kiedrowski Chemische Evolution durch exponentielle Amplifikation molekularer Matrizen
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
WO2001029248A2 (en) * 1999-10-19 2001-04-26 Bionex, Inc. Method for amplifying and detecting nucleic acid
FR2802550B1 (fr) * 1999-12-17 2004-03-05 Centre Nat Rech Scient Biopuces, preparation et utilisations
EP1111068A1 (de) * 1999-12-21 2001-06-27 LION Bioscience AG Verzweigte Substanz zur Verwendung in Reaktionen zur Detektion und Analyse von Nukleinsäuren
AU2170901A (en) * 1999-12-21 2001-07-03 Lion Bioscience Ag Branched compound for use in nucleic acid detection and analysis reactions
EP1130121A3 (de) * 2000-01-26 2003-04-16 Nisshinbo Industries Inc. Immobilisierte Nukleinsäuren und Methoden zum Nchhweis von Nukleinsäuren
US7297518B2 (en) * 2001-03-12 2007-11-20 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
DE10224339A1 (de) * 2002-05-29 2003-12-11 Axaron Bioscience Ag Verfahren zur hochparallelen Nukleinsäuresequenzierung
DE602004036672C5 (de) 2003-01-29 2012-11-29 454 Life Sciences Corporation Nukleinsäureamplifikation auf Basis von Kügelchenemulsion
JPWO2004083429A1 (ja) * 2003-03-18 2006-06-22 日本電気株式会社 Ｄｎａ断片増幅方法、ｄｎａ断片の増幅を行う反応装置およびその製造方法
US8048627B2 (en) * 2003-07-05 2011-11-01 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
KR101077603B1 (ko) * 2004-01-28 2011-10-27 삼성전자주식회사 카르복실기 또는 아미노기로 코팅된 고체상 물질을 이용한핵산의 증폭 방법
DE602005020421D1 (de) 2004-02-19 2010-05-20 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen
CA2611671C (en) 2005-06-15 2013-10-08 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
SG170028A1 (en) * 2006-02-24 2011-04-29 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
EP1994180A4 (de) * 2006-02-24 2009-11-25 Callida Genomics Inc Genomsequenzierung auf dna-arrays mit hohem durchsatz
US8679741B2 (en) * 2006-05-31 2014-03-25 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample
US7910354B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090105961A1 (en) * 2006-11-09 2009-04-23 Complete Genomics, Inc. Methods of nucleic acid identification in large-scale sequencing
US20090111706A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by amplification
BRPI0807826A2 (pt) * 2007-02-02 2014-08-05 Genera Biosystems Ltd " geração de moléculas de ácido nucleico ".
GB0712882D0 (en) * 2007-07-03 2007-08-15 Leicester University Of Nucleic acid amplification
EP2191011B1 (de) * 2007-08-29 2017-03-29 Illumina Cambridge Limited Verfahren zur sequenzierung einer polynukleotidmatrize
US20090263872A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-22 Complete Genomics Inc. Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions
US8518640B2 (en) * 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US7897344B2 (en) * 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US7901890B2 (en) * 2007-11-05 2011-03-08 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US20090270273A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Complete Genomics, Inc. Array structures for nucleic acid detection
JP5438922B2 (ja) * 2008-06-25 2014-03-12 日東電工株式会社 核酸の製造方法
DE102009012169B3 (de) 2009-03-06 2010-11-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Vorrichtung und Verfahren zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats aus einem Array von Molekülen und Anwendungen derselben
EP3514244B1 (de) 2009-04-03 2021-07-07 Sequenom, Inc. Verfahren für die herstellung von nukleinsäuren
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
KR20120045909A (ko) * 2010-11-01 2012-05-09 엘지전자 주식회사 복수 종의 표적 핵산을 실시간으로 검출하는 장치 및 방법
US20120152743A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 General Electric Company Method for electroeluting genetic material from dried samples
DE102011054101A1 (de) 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen
US10167501B2 (en) * 2014-06-12 2019-01-01 Auckland Uniservices Limited Methods and apparatus for quantification of nucleic acid amplification by monitoring impedances
MX2019006753A (es) 2016-12-22 2020-01-30 Illumina Inc Paquete de celda de flujo y metodo para fabricar el mismo.
TW202120693A (zh) * 2019-08-21 2021-06-01 美商伊路米納有限公司 偵測核苷酸之聚合酶併入的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4849077A (en) * 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments
WO1990001546A1 (en) * 1988-08-05 1990-02-22 Applied Biotechnology, Inc. Equine herpesvirus-1 vaccine
WO1991000868A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 National Research Development Corporation Immobilised polynucleotides
ATE152777T1 (de) * 1989-12-04 1997-05-15 Microprobe Corp Verstärkter einfang von ziel-nukleinsäuren mittels verwendung von oligonukleotiden, die kovalent an polymere gebunden sind
JP3011987B2 (ja) * 1990-10-11 2000-02-21 旭化成工業株式会社 固相化プライマーを用いる逆転写酵素の測定法
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
WO1993004199A2 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
EP0672173B1 (de) * 1991-11-01 2002-08-28 Diatech Pty. Ltd. Feststoff-phase erweiterungsverfahren
RU2186852C2 (ru) * 1991-12-24 2002-08-10 Тепнел Медикал Лимитед Способ выполнения манипуляции с последовательностью нуклеиновой кислоты, устройство для проведения манипуляций на последовательности нуклеиновой кислоты, проточный сосуд, твердый носитель для иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, твердый носитель, способ получения носителя для иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты
CA2128891A1 (en) * 1992-01-29 1993-08-05 Cylia Keller Polynucleotide immobilized support
US5344701A (en) * 1992-06-09 1994-09-06 Minnesota Mining And Manufacturing Company Porous supports having azlactone-functional surfaces
US6060288A (en) * 1994-08-03 2000-05-09 Mosaic Technologies Method for performing amplification of nucleic acid on supports

Also Published As

Publication number Publication date
JP4067057B2 (ja) 2008-03-26
US6274351B1 (en) 2001-08-14
WO1996013609A1 (fr) 1996-05-09
EP0787205B1 (de) 1998-08-12
EP0787205A1 (de) 1997-08-06
DK0787205T3 (da) 1999-05-17
FR2726286A1 (fr) 1996-05-03
FR2726286B1 (fr) 1997-01-17
US6277604B1 (en) 2001-08-21
ES2122692T3 (es) 1998-12-16
ATE169683T1 (de) 1998-08-15
DE69504094D1 (de) 1998-09-17
JPH10507923A (ja) 1998-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69504094T2 (de) Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren auf einer Festphase und Reagenziensatz dafür
DE69327326T2 (de) Vervielfältigungs- und detektionsprozess
DE3486478T2 (de) Zusammensetzung zur Anwendung in einem Bestimmungsverfahren unter Verwendung von Polynukleotidsequenzen
DE68928853T2 (de) Befestigung von sequenzspezifischen proben
DE69028325T2 (de) Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers
DE69122457T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotides zur Verwendung bei Einzelprimeramplifikation
DE69131596T2 (de) Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen
DE69122712T2 (de) Verfahren zur nukleinsäure hybridisierung und amplifizierung
DE69128077T2 (de) Nuklein-säure amplifikation mit dns abhängigen rns polymerasen aktivität von rns-replikasen
DE69430485T2 (de) Immobilisierte fehlpaarung - bildendes protein zur detektion oder reinigung von mutationen oder polymorphismen
DE69409646T2 (de) Magnetische zyklusreaktionen
DE68908900T2 (de) Nachweis und bestimmung der menge an rns und dns.
DE69033179T2 (de) Nachweis einer nukleinsäuresequenz oder einer änderung darin
DE68923603T2 (de) Nukleotid Sonden.
DE69512003T2 (de) Oligonukleotid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation
DE69130501T2 (de) Polynukleotid-einfang-assay unter verwendung von in-vitro-amplifikation
DE68926504T2 (de) Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
DE69434066T2 (de) Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuremolekülen
DE3873842T2 (de) Verfahren zur gen-amplifikation.
DE60208278T2 (de) System und Verfahren zum Testen von Nukleinsäuremolekülen
DE69633941T2 (de) Nachweis von unterschieden in nukleinsäuren
DE69432419T2 (de) Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation
DE3853993T2 (de) Verfahren zum nachweis der zielnukleinsäure in einem specimen.
DE60033825T2 (de) Detektion von unterschieden in nukleinsäuren durch inhibierung spontaner dna verzweigungsmigration
DE3856224T2 (de) Nachweis eines Polynukleotids durch Ersätzung einer Kette an einer Fangsonde

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee