JP4067057B2 - 核酸の固相増幅方法およびこの方法を行うために有用な試薬キット - Google Patents
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Description
本発明は、核酸の固相増幅方法およびこの方法を行うために有用な試薬キットに関する。
本発明は固相にプライマーを固定するための方法にも関する。
固相での増幅は、固体支持体に予め結合されたプライマーのＰＣＲ反応または他のタイプの増幅、例えばＬＣＲ、ＳＤＡ等の過程における伸長からなる。このような技術は、ＰＣＲ以外の工程を用いることなく、その一方の特異鎖は固相に共有結合されている、増幅産物を得ることができるこれによれば、二本鎖ＤＮＡで変性前に、または支持体を変えないＰＣＲと検出とを組合せることにより増幅産物の特異鎖の変性後に、検出を行うことができる。
核酸の固相増幅方法はＷＯ８９／１１５４６、ＡＵ４７１４４／８９およびＷＯ９３／０９２５０に記載されている。
支持体上におけるこのタイプの増幅は、すべての分子生物学的診断への応用、特に感染標的またはゲノム標的を検出する上で非常に有用であろう。この技術では検出時間とエラーリスクを減少させることができるが、その理由はサンプルがウェル毎に移し換えられず、全実験が同一支持体で行えるからである。更に、クローニングまたは配列決定のような１本の特異的ＤＮＡ鎖だけを要するすべての適用において、この技術では時間の真の節約とかなりの使いやすさを実現して、多くの中間工程を省略できる。
固体支持体に５′末端で結合されたＰＣＲに関与するプライマーは、固体支持体上で伸長させることが望まれる鎖の部分を形成していなければならない。プライマーの３′末端は、ポリメラーゼによるその伸長を行うために、遊離、未修飾で、標的と相同性でなければならない。
しかしながら、固相増幅の主な欠点は固相上における低伸長率である。
固体支持体／オリゴヌクレオチド立体相互作用を減少させて、結合プライマーと相補的増幅産物により形成されるハイブリッドへのＴａｑポリメラーゼのアクセス性を改善するために、連結または“リンカー”アームが結合プライマーの５′末端におかれる。このリンカーアームは、様々な増幅試薬とプライマーとの協調を妨げないように結合プライマーの３′末端を固体支持体から物理的に離しておく上で役立つことから、“スペーサーアーム”とも称される。
伸長率に影響を与えるパラメーターの１つは固体支持体へのプライマーの結合の様式にあることが、本発明によれば、発見された。プライマー自体のヌクレオチドは、“リンカー”と固体支持体との間で用いられるカップリング条件下で支持体との共有結合にかかわりやすく、これがプライマーの低伸長率に関する一因である。更に正確には、リンカーアームの大きさ以上に、プライマーの伸長率を増加させるものは、支持体上におけるリンカーアームの結合可能な部位の反応性および多重度であることが発見された。
本発明の主題は、官能化された耐熱性固体支持体に固定されたプライマーが用いられる核酸の固相増幅方法であって、上記プライマーは固体支持体と、多官能性分子の官能基との共有結合により固体支持体に固定されており、上記分子自体は上記プライマーの５′末端に結合されていることで特徴付けられる。
更に正確には、上記プライマーは、固体支持体とプライマーの５′末端との間におかれて、一方では固体支持体の官能基と上記多官能性分子の第一官能基との間で、しかも他方ではプライマーの５′末端と上記多官能性分子の第二官能基との間で共有結合を形成している、上記多官能性分子の残基からなる連結（または“リンカー”）アームにより固体支持体上に固定されている。
リンカーアームで官能基の数を増加させることにより、伸長率は増加する。これは、固体支持体への結合がリンカーアームにより生じる、即ちプライマー自体が実際には関与せずに生じる、確率の増加という事実のためであると思われる。
上記多官能性分子の発現官能基とは、固体支持体と共有結合を形成し得る基に関するものであると、ここでは理解される。アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、チオールおよびリン酸基が官能基として特に挙げられる。リンカーアームがプライマーに結合されていない末端側で末端リン酸基のような非常に反応性の基を有している場合には、多官能性分子が多数の官能基を有していることは不要である。しかしながら、上記多官能性分子は好ましくは少くとも５つ、更に好ましくは少くとも１０の官能基を有している。
本発明の有利な態様において、上記多官能性分子はポリマー断片からなる。好ましくは、上記ポリマー断片の各モノマー単位は少くとも１つの官能基を有している。この場合に、リンカーアーム、即ちポリマー、の大きさ増加はプライマーの末端結合にとり可能な部位の数の増加により反映され、伸長率を増加させるが、これは固体支持体へのプライマーの全体的結合レベルが一定のままとされる。
好ましくは、上記プライマーの５′末端に付加されるポリマー断片は５以上のモノマー、更に好ましくは１０以上のモノマー、特に５０以内のモノマーを有している。
有利には、本発明による上記ポリマー断片はホモポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログの断片からなる。
“ポリヌクレオチドアナログ”という用語は、モノマー単位が天然ポリヌクレオチドのホスホジエステル結合鎖に類似したホスホジエステル結合鎖により結合されているポリマーに関するものであると、ここでは理解される。換言すれば、それはヌクレオチドモノマーのヌクレオシド残基が非ヌクレオシド残基、特に脂肪族残基に置き換わったポリマーのことである。特に下記式（Ｉ）のポリマー断片が挙げられる：
上記式中、Ｒは特に炭素原子２〜２０の脂肪族残基、例えばアルキレン残基であり、Ｒは本発明による少くとも１つの官能基を有していて、ｎは特に２〜５０の整数である。
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片は各モノマー上にグラフト化されたいくつかの反応基、特にアミンまたはヒドロキシル基を有しており、この場合にｎは更に具体的には２〜１０である。
リンカーアームがホモポリヌクレオチド断片からなっている場合、それは好ましくは５以上のヌクレオチド、更に好ましくは１０以上のヌクレオチド、特に５０以内のヌクレオチドを有している。
本発明によるポリヌクレオチドアナログは、ＤＮＡを合成する方法に類似した合成方法、特に固体支持体上での自動合成により得られる。実際に、これらのポリマー断片は、常法で、ホスホルアミダイトシントン、即ち一方がジメトキシトリチル（Ｄｍｔｒ）基で他方がホスホルアミダイト基により保護された２つの末端ＯＨ基を有したシントンの使用を伴うヌクレオチド合成方法に適したモノマーシントンの縮合により得られる。ポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片はこの場合だと標準ヌクレオチドシントンに類似したシントンの縮合に相当し、その場合に５′および３′の二価ヌクレオシド残基は脂肪族残基、特にアルキレン残基で置き換えられている。
更に具体的には、式（Ｉ）のポリヌクレオチド-アナログ ポリマー断片を得るためには、下記式のホスホルアミダイトシントンを用いることが可能である：
このため、リンカーアームがポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログである場合、リンカーアームまたはリンカーアームに複合化されたプライマーは有利にはヌクレオチドタイプ合成で直接作られ、上記複合体はその後で本発明による固体支持体に複合化される。
ポリマー断片、特にホモポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログは分岐断片、即ちいくつかの分岐を含んだものであってもよい。このタイプの断片は同一シントン上でいくつかのモノマーとの縮合用のベースとして働くモノマーを用いて得られる。自動ＤＮＡ合成タイプの合成プロセスで用いられ、並行して２つのモノマーと縮合する、下記ホスホルアミダイトシントン（ｒｅｆ：Clontech製５２５０-１）が特に挙げられる：
有利には、上記ポリマー、特に固体支持体とプライマーとの間におかれるホモポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログは、その末端でプライマーに結合されていないが、固体支持体と共有結合を形成しうる反応性末端官能基を有している。ヒドロキシル基またはアミン、更に好ましくはリン酸基が、ポリマー断片の上記反応性末端官能基として特に挙げられる。
末端リン酸基の使用は、リンカーアームがポリ-Ｔであるときに特に勧められる。リン酸基の不在下では、ポリ-Ａまたはポリ-Ｃリンカーアームがより有効である。
固体支持体上での自動ＤＮＡ合成方法では、多量のオリゴヌクレオチドの末端５′末端をリン酸化することが化学的にできる。したがって、ホモポリヌクレオチドタイプまたはポリヌクレオチドアナログタイプのリンカーアーム、あるいはリンカーアームの５′末端でリン酸化されているこれらのリンカーアームおよびプライマーの複合体を作製することが、これらの方法によれば可能である。
本発明によれば、固体支持体は官能化された有機または無機ポリマーからなる。
本発明によれば、固体支持体のある特徴は、増幅産物として固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させうるという点で有利である。第一に、この固体支持体は耐熱性、即ちＰＣＲの高温（１００℃）に耐えることができねばならず、しかも良好な熱伝導性でなければならない。また、それは官能化されていること、即ち固体支持体へのオリゴヌクレオチドプライマーの安定な結合を行わせるために化学的官能基を有していなければならない。このプライマー／固体支持体結合も高温に耐えられねばならない。こういう理由から、本発明によれば共有結合が好ましい。伸長に関与するＴａｑポリメラーゼまたは他の酵素は支持体の成分により阻害されるべきでない。最後に、このような支持体はバックグラウンドノイズなしに比色または蛍光検出できる光学的性質を有しているべきである。透明支持体はあらゆるタイプの読取装置を使用できることから好ましい。
このため、高温に相当な耐性を有するタイプのプラスチックが用いられることが好ましい。特に耐熱性改質ポリスチレン、スチレン／アクリロニトリルコポリマー、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはガラスに基づくプラスチックが特に挙げられる。
ＮＨ２官能基の出現を誘導するためにＵＶ処理で官能化された固体プラスチック支持体も用いてよい（ｒｅｆ．１）。しかしながら、本発明によれば、固体支持体は多官能化された支持体、即ちプライマーに結合された上記多官能性分子からなるリンカーアームとの安定な共有結合の形成を促進する多数の官能基、特にアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシルまたはチオールを有したものであってもよい。
多数の官能基の出現を誘導するためにコロナ処理またはγ放射線により処理されたプラスチック支持体が適切には用いられる。このタイプの処理は簡単であって、官能化のための化学試薬の使用を避けられる。
特にコロナ処理またはγ放射線により官能化されたポリカーボネートまたはスチレン／アクリロニトリルコポリマーが、特に好ましい耐熱性支持体として用いられる。
オリゴヌクレオチドの末端官能基により官能化された固体支持体へのオリゴヌクレオチドの共有結合のための方法は公知である（ｒｅｆ．１〜５）。しかしながら、本発明によれば、ホモポリヌクレオチド断片は天然官能基、特にヌクレオチド塩基自体のアミンおよびヒドロキシルを介するか、あるいは末端官能基、特にリン酸を介して固体支持体に結合させてもよい。
同様に、ポリヌクレオチド-アナログタイプの断片は、モノマー上で置換された末端基または官能基の１つ、特にアミンまたはヒドロキシルを介して固体支持体に結合させてもよい。
リンカーアーム、特にホモポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログの官能基と支持体の官能基とのこのカップリングは、慣用的活性剤の存在下で化学的カップリングにより生じる。特に、多官能性支持体への化学的カップリングはＥＤＣのようなカルボジイミドタイプの活性剤の存在下で行われる。
本発明の主題は固相にプライマーを固定するための方法にも関し、このプライマーは本発明による増幅方法を行う上で有用であり、共有結合カップリングが上記官能化された支持体と上記プライマーの５′末端に結合された上記多官能性分子との間で行われることで特徴付けられる。
固体支持体はＰＣＲ反応容器の内表面でも、または反応前に容器中に導入された固体要素、例えばビーズであってもよい。微量滴定マイクロプレートウェルまたはアッセイチューブの内表面が、固体支持体として特に挙げられる。
好ましい形態はマイクロプレート形態である。この理由は、その広範な用途とこの形態周辺のすべての既存装置がそれを迅速かつ容易に自動化させうるからである。二つのタイプのマイクロプレートが常用されている。第一は平底円筒形小カップ体の標準タイプである。第二は上記のような円筒形小カップ体ではなく、小さな平底切欠チューブ形のウェルである。この形のチューブはサーモサイクラーに直ちに適用できて、優れた熱伝導性を示す。
本発明の主題は固相にプライマーを固定するための方法にも関し、このプライマーは本発明による増幅方法を行う上で有用であり、共有結合カップリングが上記官能化された支持体と上記プライマーの５′末端に結合された上記多官能性分子との間で行われることで特徴付けられる。
固相増幅では、増幅と検出を同一支持体で行える。固体表面上で伸長された増幅産物は異なる方法で検出される。支持体に結合された二本鎖は、特に第二標識プライマーによるか、あるいはエチジウムブロミド、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯまたはＰＯＰＯタイプ挿入剤の使用で、ＰＣＲ過程に取り込まれた標識を顕示させることにより検出される（molecular Probes Ｒｅｆ．６〜８）。変性後、固体支持体に特異的に結合された一本鎖は標識プローブにより検出してもよい。
検出は、例えば、プレート上で伸長された増幅産物を特異的に認識するビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させることからなる。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ複合体はハイブリッド形成したプローブのビオチン種を認識して、基質の脱リン酸後に比色または蛍光産物を生成させる。
本発明によるプライマーの結合様式は伸長の決定要因である。これは、プライマーが本発明によるリンカーアームを有していれば、伸長率がアームのタイプに応じて１５倍増加するが、結合のレベルはリンカーアームに関係なく一定のままだからである。
増幅反応で溶液中に存在するプライマーの量は、伸長率に関しても重要な役割を果たす。結合プライマーの伸長にとり最良の効率を有するためには、非平衡ＰＣＲが用いられる（ｒｅｆ．９）。ＰＣＲ中に、固体支持体に結合されているプライマー（プライマーＡ）は溶液中にも存在しているが、他の増幅プライマー（プライマーＸ）よりも低い量で、特に８〜１６分の１で存在する。増幅は二工程で起きる。増幅は溶液中のプライマーＡが枯渇されるまで最初は指数的であり、次いで固体支持体に結合されたプライマーＡは伸長されて、その後増幅は相加的になる。第一工程では多数のコピーを有することができ、このため固体支持体で更に有効な伸長を行える。溶液中におかれたプライマーの量は、相加的増幅が始まる時点を決めることから重要である。プライマーＸについて約５〜１０ｐｍｏｌおよびプライマーＡについて８〜１６分の１の量だと、良好な伸長率を示す。
本発明による増幅方法は、感染または遺伝病に関して、ＰＣＲを用いる通常の診断技術と比較したときに真の改善を示す。更に、本発明による方法は一本鎖を固相へ特異的に結合させることができるため、配列決定、特に多量で配列決定にとり必要なときと、操作の簡素化および自動化が必須とわかったときに有利かもしれない。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な態様を参照すると明らかになるであろう。
図１は固相ＰＣＲにおける様々な工程を表す。
図２は異なるリンカーアームの関数としてプライマーｐＭで結合程度を表す。
図３は異なるリンカーアームの関数として蛍光単位で伸長レベルを表す。
図４はハイブリッド形成アンチプローブｆＭｏｌで伸長率を表す。
図５は伸長のレベルについてリンカーアームの大きさの影響を表す。
図６は伸長のレベルについてリンカーアームの様々な化学官能基の影響を表す。
本発明による方法をＨＬＡ-ＤＲＢモデルで適用した（ｒｅｆ．１０および１１）。増幅産物に相当する２８０ｂｐインサートを保有したＭ１３クローンを標的として用いた。このＨＬＡ-ＤＲＢモデルでは、伸長に関与する重要なパラメーターを明らかにして、この技術の特異性の問題を最も具体的に研究することができる。
１）用いられる異なるリンカーアームの例
Ａ、 Ａ-Ｐｈ
Ａ-５Ｔ、 Ａ-１０Ｔ Ａ-２０Ｔ Ａ-３０Ｔ
Ａ-５Ｔ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ｔ-Ｐｈ
Ａ-５Ａ、 Ａ-１０Ａ
Ａ-５Ａ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ａ-Ｐｈ
Ａ-５Ｃ、 Ａ-１０Ｃ
Ａ-５Ｃ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ｃ-Ｐｈ
Ａ＝結合プライマー：ＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣ（Ｔ，Ｃ）ＴＧ
Ｐｈ＝末端５′リン酸基
ｘＴ、ｘＡ、ｘＣ＝各々ｘ塩基Ｔ、ｘ塩基Ａまたはｘ塩基Ｃの末端５′位尾部
ポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片からなるリンカーアームも用いた（図６）：
Ａ-ＮＨ２ ＊
Ａ-５Ｔ-５ＮＨ２ ＊
Ａ-（ＴＥＧ）３ ＊
Ａ-（ＴＥＧ）３ ＊Ｐｈ
アーム-ＮＨ２ ＊は、ここではClontechからのUnilink▲Ｒ▼Amino Modifierシントンから導入された下記式のアミノアルキルアームに相当する：
アーム-５Ｔ-５ＮＨ２ ＊は、ホスホルアミダイト-タイプ合成で５Ｔヌクレオチド、その後５Unilink▲Ｒ▼シントンの連続縮合に相当する。
Unilink▲Ｒ▼シントンの縮合により、モノマー上にグラフト化されたアルキルアミン残基を有するポリヌクレオチド-アナログ断片となった。
-（ＴＥＧ）３ ＊は下記式のGlen Research（ｒｅｆ：１０〜１９０９ｘ）からのシントンの縮合に相当する：
-（ＴＥＧ）３ ＊-Ｐｈは、ホスホルアミダイト合成に従い複合体Ａ-（ＴＥＧ）３ ＊の５′-末端リン酸化により得られる。
２）固体支持体
Nunc社から供給される二つのタイプの多官能化された耐熱性支持体を用いて、様々なリンカーアームを評価した。タイプＩは耐熱性改質ポリスチレンであり、タイプIIはスチレン／アクリロニトリルコポリマーである。それらはマイクロプレート形態であり、Nuncから供給されるサーモサイクラーで循環させる。
これらのプラスチック支持体はコロナ処理またはγ放射線により官能化させたが、慣例的には制御された雰囲気で固定圧下の室内に放電することからなる。この官能化によれば、プラスチック支持体をオリゴヌクレオチドプライマーに結合させることができる。この処理ではアミン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、チオール等のタイプの官能基をプラスチックの表面に出現させ、これらの基はオリゴヌクレオチドと化学的に反応して安定な結合を形成する。非常に耐熱性であるが、しかしながら形成される結合のタイプは現在のところ乏しいと理解されている。
化学的カップリングは下記操作に従い活性剤の存在下で行う。
オリゴヌクレオチド１０〜１００ｐｍｏｌを１００μｌの最終容量中ｐＨ７で１０〜５０ｍＭ最終エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および１０〜５０ｍＭ最終Ｎ-メチルイミダゾールの存在下においてウェル当たりで結合のためにおく。プレートを５０℃で５〜１５時間インキュベートし、その後５０℃に加熱された０．４Ｎ ＮａＯＨ溶液および０．２５％Tween２０で４回洗浄する。
３）固相でのプライマーの伸長
伸長はウェル当たり５０μｌの最終容量中で行う。標的ＤＮＡ１５〜１００ｎｇを１×ＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elmer）、０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Sigma）、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（Pharmacia）、プライマーＸ（ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ）８０ｎｇおよびリンカー有または無のプライマーＡ１０ｎｇとＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）１．２単位からなる混合液中で増幅する。プライマーＸは溶液中だけでみられるが、プライマーＡは固体支持体に結合し、かつ溶液中に存在している。増幅は下記方法を用いてマイクロプレートフォーマットに合わせたサーモサイクラーで行う：
サイクル１：
９４℃で５分間
サイクル２〜３０：
９４℃で３０秒間
５５℃で３０秒間
７２℃で３０秒間
サイクル３１：
７２℃で５分間
４℃
図１は固相ＰＣＲの様々な工程を表している。増幅後、固相上で伸長された増幅産物を変性させる。ウェルを空け、その後１０分間かけて０．４Ｍ水酸化ナトリウムで３回洗浄する。
４）検出
２タイプの検出を用いた。半定量酵素検出および定量放射線検出
酵素検出は文献（９）で記載されたように行う。この方法では、変性後に、固体支持体上で伸長された鎖の領域と相補的なビオチニル化プローブ１ｐＭをハイブリッド形成させる。
ハイブリッドは、基質を化学発光または蛍光比色産物に変換するストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ複合体により顕在化させる。
放射線検出の場合には、32Ｐ標識プローブを固体支持体上で伸長された鎖とハイブリッド形成させて、放射能をβカウンターでカウントする。
５）結果
固体支持体上におけるプライマーの結合能力は、放射性５′キナーゼ処理プライマーを結合させることにより定量したところ、タイプＩがウェル当たり約１ｐＭのプライマーと結合し、タイプIIが０．２ｐＭと結合したことを示すことができた。
図２は、様々なタイプのリンカーアームの関数として、２つのマイクロプレート支持体へのプライマーの結合能力を表す。所定タイプの支持体の場合、結合能力は用いられたアームの関数として有意差がない。
他方、伸長率は用いられたリンカーアームの関数としてかなり異なる。結果は図３および５に掲載され、そこでは用いられた様々なアームの関数として支持体の伸長レベルを表している。プライマーに結合されたアームの影響は伸長率の決定要因であり、用いられたリンカーのタイプに応じて１５倍増加し、結合のレベルは一定のままである。
ポリ-Ａおよびポリ-Ｃ断片はポリ-Ｔ断片よりも有効である。実際に、同サイズのリンカーアームであると、それらの方が伸長について強いシグナルを与える。リン酸基の付加は伸長率を常に改善し、この増加はポリ-Ａまたはポリ-Ｃリンカーアームよりもポリ-Ｔリンカーアームの場合で明らかである。
伸長はＰＣＲで伸長された部分と相補的な放射性プローブのハイブリッド形成により間接的に定量した。ハイブリッド形成のレベルは、既知量の結合プライマーを含有したウェルに放射性プローブをハイブリッド形成させることにより確認した。伸長のレベルは、各々タイプＩおよびタイプIIについて２〜３８ｆＭまたは１〜１７ｆＭで用いられたリンカーアームのタイプに応じて異なる。これらの結果は図４で示されている。
リンカーアーム上におけるいくつかの官能基の存在は、固体支持体に結合されたプライマーの伸長レベルを増加させることができる。このため、図６で示されたように、４５％増加は１０Ｔがプライマーと末端リン酸基との間に挿入されたときにみられる。同様に、（ＴＥＧ）３ ＊リンカーアームへのリン酸官能基の付加は、リンカーアームなしのプライマー単独と比較してシグナルを４０％および３５０％まで増加させることができる。同様の現象は５Ｔ５ＮＨ２ ＊アームが用いられたときに観察される；伸長のレベルはＮＨ２ ＊アームと比較して１１０％まで増加する。このように、いくつかの異なる化学官能基の使用は、末端結合鎖のタイプを増加させることにより固相でプライマーの伸長を促進することができる。
伸長されるオリゴヌクレオチドの量は、事実上、支持体に結合された量と比較して非常に低い。この低い量にもかかわらず、約３０のシグナル対ノイズ比が記載された酵素検出技術で達成されており、これであれば診断適用にとり全く充分である。
参考文献
本発明は固相にプライマーを固定するための方法にも関する。
固相での増幅は、固体支持体に予め結合されたプライマーのＰＣＲ反応または他のタイプの増幅、例えばＬＣＲ、ＳＤＡ等の過程における伸長からなる。このような技術は、ＰＣＲ以外の工程を用いることなく、その一方の特異鎖は固相に共有結合されている、増幅産物を得ることができるこれによれば、二本鎖ＤＮＡで変性前に、または支持体を変えないＰＣＲと検出とを組合せることにより増幅産物の特異鎖の変性後に、検出を行うことができる。
核酸の固相増幅方法はＷＯ８９／１１５４６、ＡＵ４７１４４／８９およびＷＯ９３／０９２５０に記載されている。
支持体上におけるこのタイプの増幅は、すべての分子生物学的診断への応用、特に感染標的またはゲノム標的を検出する上で非常に有用であろう。この技術では検出時間とエラーリスクを減少させることができるが、その理由はサンプルがウェル毎に移し換えられず、全実験が同一支持体で行えるからである。更に、クローニングまたは配列決定のような１本の特異的ＤＮＡ鎖だけを要するすべての適用において、この技術では時間の真の節約とかなりの使いやすさを実現して、多くの中間工程を省略できる。
固体支持体に５′末端で結合されたＰＣＲに関与するプライマーは、固体支持体上で伸長させることが望まれる鎖の部分を形成していなければならない。プライマーの３′末端は、ポリメラーゼによるその伸長を行うために、遊離、未修飾で、標的と相同性でなければならない。
しかしながら、固相増幅の主な欠点は固相上における低伸長率である。
固体支持体／オリゴヌクレオチド立体相互作用を減少させて、結合プライマーと相補的増幅産物により形成されるハイブリッドへのＴａｑポリメラーゼのアクセス性を改善するために、連結または“リンカー”アームが結合プライマーの５′末端におかれる。このリンカーアームは、様々な増幅試薬とプライマーとの協調を妨げないように結合プライマーの３′末端を固体支持体から物理的に離しておく上で役立つことから、“スペーサーアーム”とも称される。
伸長率に影響を与えるパラメーターの１つは固体支持体へのプライマーの結合の様式にあることが、本発明によれば、発見された。プライマー自体のヌクレオチドは、“リンカー”と固体支持体との間で用いられるカップリング条件下で支持体との共有結合にかかわりやすく、これがプライマーの低伸長率に関する一因である。更に正確には、リンカーアームの大きさ以上に、プライマーの伸長率を増加させるものは、支持体上におけるリンカーアームの結合可能な部位の反応性および多重度であることが発見された。
本発明の主題は、官能化された耐熱性固体支持体に固定されたプライマーが用いられる核酸の固相増幅方法であって、上記プライマーは固体支持体と、多官能性分子の官能基との共有結合により固体支持体に固定されており、上記分子自体は上記プライマーの５′末端に結合されていることで特徴付けられる。
更に正確には、上記プライマーは、固体支持体とプライマーの５′末端との間におかれて、一方では固体支持体の官能基と上記多官能性分子の第一官能基との間で、しかも他方ではプライマーの５′末端と上記多官能性分子の第二官能基との間で共有結合を形成している、上記多官能性分子の残基からなる連結（または“リンカー”）アームにより固体支持体上に固定されている。
リンカーアームで官能基の数を増加させることにより、伸長率は増加する。これは、固体支持体への結合がリンカーアームにより生じる、即ちプライマー自体が実際には関与せずに生じる、確率の増加という事実のためであると思われる。
上記多官能性分子の発現官能基とは、固体支持体と共有結合を形成し得る基に関するものであると、ここでは理解される。アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、チオールおよびリン酸基が官能基として特に挙げられる。リンカーアームがプライマーに結合されていない末端側で末端リン酸基のような非常に反応性の基を有している場合には、多官能性分子が多数の官能基を有していることは不要である。しかしながら、上記多官能性分子は好ましくは少くとも５つ、更に好ましくは少くとも１０の官能基を有している。
本発明の有利な態様において、上記多官能性分子はポリマー断片からなる。好ましくは、上記ポリマー断片の各モノマー単位は少くとも１つの官能基を有している。この場合に、リンカーアーム、即ちポリマー、の大きさ増加はプライマーの末端結合にとり可能な部位の数の増加により反映され、伸長率を増加させるが、これは固体支持体へのプライマーの全体的結合レベルが一定のままとされる。
好ましくは、上記プライマーの５′末端に付加されるポリマー断片は５以上のモノマー、更に好ましくは１０以上のモノマー、特に５０以内のモノマーを有している。
有利には、本発明による上記ポリマー断片はホモポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログの断片からなる。
“ポリヌクレオチドアナログ”という用語は、モノマー単位が天然ポリヌクレオチドのホスホジエステル結合鎖に類似したホスホジエステル結合鎖により結合されているポリマーに関するものであると、ここでは理解される。換言すれば、それはヌクレオチドモノマーのヌクレオシド残基が非ヌクレオシド残基、特に脂肪族残基に置き換わったポリマーのことである。特に下記式（Ｉ）のポリマー断片が挙げられる：
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片は各モノマー上にグラフト化されたいくつかの反応基、特にアミンまたはヒドロキシル基を有しており、この場合にｎは更に具体的には２〜１０である。
リンカーアームがホモポリヌクレオチド断片からなっている場合、それは好ましくは５以上のヌクレオチド、更に好ましくは１０以上のヌクレオチド、特に５０以内のヌクレオチドを有している。
本発明によるポリヌクレオチドアナログは、ＤＮＡを合成する方法に類似した合成方法、特に固体支持体上での自動合成により得られる。実際に、これらのポリマー断片は、常法で、ホスホルアミダイトシントン、即ち一方がジメトキシトリチル（Ｄｍｔｒ）基で他方がホスホルアミダイト基により保護された２つの末端ＯＨ基を有したシントンの使用を伴うヌクレオチド合成方法に適したモノマーシントンの縮合により得られる。ポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片はこの場合だと標準ヌクレオチドシントンに類似したシントンの縮合に相当し、その場合に５′および３′の二価ヌクレオシド残基は脂肪族残基、特にアルキレン残基で置き換えられている。
更に具体的には、式（Ｉ）のポリヌクレオチド-アナログ ポリマー断片を得るためには、下記式のホスホルアミダイトシントンを用いることが可能である：
ポリマー断片、特にホモポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログは分岐断片、即ちいくつかの分岐を含んだものであってもよい。このタイプの断片は同一シントン上でいくつかのモノマーとの縮合用のベースとして働くモノマーを用いて得られる。自動ＤＮＡ合成タイプの合成プロセスで用いられ、並行して２つのモノマーと縮合する、下記ホスホルアミダイトシントン（ｒｅｆ：Clontech製５２５０-１）が特に挙げられる：
末端リン酸基の使用は、リンカーアームがポリ-Ｔであるときに特に勧められる。リン酸基の不在下では、ポリ-Ａまたはポリ-Ｃリンカーアームがより有効である。
固体支持体上での自動ＤＮＡ合成方法では、多量のオリゴヌクレオチドの末端５′末端をリン酸化することが化学的にできる。したがって、ホモポリヌクレオチドタイプまたはポリヌクレオチドアナログタイプのリンカーアーム、あるいはリンカーアームの５′末端でリン酸化されているこれらのリンカーアームおよびプライマーの複合体を作製することが、これらの方法によれば可能である。
本発明によれば、固体支持体は官能化された有機または無機ポリマーからなる。
本発明によれば、固体支持体のある特徴は、増幅産物として固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させうるという点で有利である。第一に、この固体支持体は耐熱性、即ちＰＣＲの高温（１００℃）に耐えることができねばならず、しかも良好な熱伝導性でなければならない。また、それは官能化されていること、即ち固体支持体へのオリゴヌクレオチドプライマーの安定な結合を行わせるために化学的官能基を有していなければならない。このプライマー／固体支持体結合も高温に耐えられねばならない。こういう理由から、本発明によれば共有結合が好ましい。伸長に関与するＴａｑポリメラーゼまたは他の酵素は支持体の成分により阻害されるべきでない。最後に、このような支持体はバックグラウンドノイズなしに比色または蛍光検出できる光学的性質を有しているべきである。透明支持体はあらゆるタイプの読取装置を使用できることから好ましい。
このため、高温に相当な耐性を有するタイプのプラスチックが用いられることが好ましい。特に耐熱性改質ポリスチレン、スチレン／アクリロニトリルコポリマー、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはガラスに基づくプラスチックが特に挙げられる。
ＮＨ２官能基の出現を誘導するためにＵＶ処理で官能化された固体プラスチック支持体も用いてよい（ｒｅｆ．１）。しかしながら、本発明によれば、固体支持体は多官能化された支持体、即ちプライマーに結合された上記多官能性分子からなるリンカーアームとの安定な共有結合の形成を促進する多数の官能基、特にアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシルまたはチオールを有したものであってもよい。
多数の官能基の出現を誘導するためにコロナ処理またはγ放射線により処理されたプラスチック支持体が適切には用いられる。このタイプの処理は簡単であって、官能化のための化学試薬の使用を避けられる。
特にコロナ処理またはγ放射線により官能化されたポリカーボネートまたはスチレン／アクリロニトリルコポリマーが、特に好ましい耐熱性支持体として用いられる。
オリゴヌクレオチドの末端官能基により官能化された固体支持体へのオリゴヌクレオチドの共有結合のための方法は公知である（ｒｅｆ．１〜５）。しかしながら、本発明によれば、ホモポリヌクレオチド断片は天然官能基、特にヌクレオチド塩基自体のアミンおよびヒドロキシルを介するか、あるいは末端官能基、特にリン酸を介して固体支持体に結合させてもよい。
同様に、ポリヌクレオチド-アナログタイプの断片は、モノマー上で置換された末端基または官能基の１つ、特にアミンまたはヒドロキシルを介して固体支持体に結合させてもよい。
リンカーアーム、特にホモポリヌクレオチド断片またはポリヌクレオチドアナログの官能基と支持体の官能基とのこのカップリングは、慣用的活性剤の存在下で化学的カップリングにより生じる。特に、多官能性支持体への化学的カップリングはＥＤＣのようなカルボジイミドタイプの活性剤の存在下で行われる。
本発明の主題は固相にプライマーを固定するための方法にも関し、このプライマーは本発明による増幅方法を行う上で有用であり、共有結合カップリングが上記官能化された支持体と上記プライマーの５′末端に結合された上記多官能性分子との間で行われることで特徴付けられる。
固体支持体はＰＣＲ反応容器の内表面でも、または反応前に容器中に導入された固体要素、例えばビーズであってもよい。微量滴定マイクロプレートウェルまたはアッセイチューブの内表面が、固体支持体として特に挙げられる。
好ましい形態はマイクロプレート形態である。この理由は、その広範な用途とこの形態周辺のすべての既存装置がそれを迅速かつ容易に自動化させうるからである。二つのタイプのマイクロプレートが常用されている。第一は平底円筒形小カップ体の標準タイプである。第二は上記のような円筒形小カップ体ではなく、小さな平底切欠チューブ形のウェルである。この形のチューブはサーモサイクラーに直ちに適用できて、優れた熱伝導性を示す。
本発明の主題は固相にプライマーを固定するための方法にも関し、このプライマーは本発明による増幅方法を行う上で有用であり、共有結合カップリングが上記官能化された支持体と上記プライマーの５′末端に結合された上記多官能性分子との間で行われることで特徴付けられる。
固相増幅では、増幅と検出を同一支持体で行える。固体表面上で伸長された増幅産物は異なる方法で検出される。支持体に結合された二本鎖は、特に第二標識プライマーによるか、あるいはエチジウムブロミド、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯまたはＰＯＰＯタイプ挿入剤の使用で、ＰＣＲ過程に取り込まれた標識を顕示させることにより検出される（molecular Probes Ｒｅｆ．６〜８）。変性後、固体支持体に特異的に結合された一本鎖は標識プローブにより検出してもよい。
検出は、例えば、プレート上で伸長された増幅産物を特異的に認識するビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させることからなる。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ複合体はハイブリッド形成したプローブのビオチン種を認識して、基質の脱リン酸後に比色または蛍光産物を生成させる。
本発明によるプライマーの結合様式は伸長の決定要因である。これは、プライマーが本発明によるリンカーアームを有していれば、伸長率がアームのタイプに応じて１５倍増加するが、結合のレベルはリンカーアームに関係なく一定のままだからである。
増幅反応で溶液中に存在するプライマーの量は、伸長率に関しても重要な役割を果たす。結合プライマーの伸長にとり最良の効率を有するためには、非平衡ＰＣＲが用いられる（ｒｅｆ．９）。ＰＣＲ中に、固体支持体に結合されているプライマー（プライマーＡ）は溶液中にも存在しているが、他の増幅プライマー（プライマーＸ）よりも低い量で、特に８〜１６分の１で存在する。増幅は二工程で起きる。増幅は溶液中のプライマーＡが枯渇されるまで最初は指数的であり、次いで固体支持体に結合されたプライマーＡは伸長されて、その後増幅は相加的になる。第一工程では多数のコピーを有することができ、このため固体支持体で更に有効な伸長を行える。溶液中におかれたプライマーの量は、相加的増幅が始まる時点を決めることから重要である。プライマーＸについて約５〜１０ｐｍｏｌおよびプライマーＡについて８〜１６分の１の量だと、良好な伸長率を示す。
本発明による増幅方法は、感染または遺伝病に関して、ＰＣＲを用いる通常の診断技術と比較したときに真の改善を示す。更に、本発明による方法は一本鎖を固相へ特異的に結合させることができるため、配列決定、特に多量で配列決定にとり必要なときと、操作の簡素化および自動化が必須とわかったときに有利かもしれない。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な態様を参照すると明らかになるであろう。
図１は固相ＰＣＲにおける様々な工程を表す。
図３は異なるリンカーアームの関数として蛍光単位で伸長レベルを表す。
図４はハイブリッド形成アンチプローブｆＭｏｌで伸長率を表す。
図５は伸長のレベルについてリンカーアームの大きさの影響を表す。
図６は伸長のレベルについてリンカーアームの様々な化学官能基の影響を表す。
本発明による方法をＨＬＡ-ＤＲＢモデルで適用した（ｒｅｆ．１０および１１）。増幅産物に相当する２８０ｂｐインサートを保有したＭ１３クローンを標的として用いた。このＨＬＡ-ＤＲＢモデルでは、伸長に関与する重要なパラメーターを明らかにして、この技術の特異性の問題を最も具体的に研究することができる。
１）用いられる異なるリンカーアームの例
Ａ、 Ａ-Ｐｈ
Ａ-５Ｔ、 Ａ-１０Ｔ Ａ-２０Ｔ Ａ-３０Ｔ
Ａ-５Ｔ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ｔ-Ｐｈ
Ａ-５Ａ、 Ａ-１０Ａ
Ａ-５Ａ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ａ-Ｐｈ
Ａ-５Ｃ、 Ａ-１０Ｃ
Ａ-５Ｃ-Ｐｈ、 Ａ-１０Ｃ-Ｐｈ
Ａ＝結合プライマー：ＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣ（Ｔ，Ｃ）ＴＧ
Ｐｈ＝末端５′リン酸基
ｘＴ、ｘＡ、ｘＣ＝各々ｘ塩基Ｔ、ｘ塩基Ａまたはｘ塩基Ｃの末端５′位尾部
ポリヌクレオチド-アナログタイプのポリマー断片からなるリンカーアームも用いた（図６）：
Ａ-ＮＨ２ ＊
Ａ-５Ｔ-５ＮＨ２ ＊
Ａ-（ＴＥＧ）３ ＊
Ａ-（ＴＥＧ）３ ＊Ｐｈ
アーム-ＮＨ２ ＊は、ここではClontechからのUnilink▲Ｒ▼Amino Modifierシントンから導入された下記式のアミノアルキルアームに相当する：
Unilink▲Ｒ▼シントンの縮合により、モノマー上にグラフト化されたアルキルアミン残基を有するポリヌクレオチド-アナログ断片となった。
-（ＴＥＧ）３ ＊は下記式のGlen Research（ｒｅｆ：１０〜１９０９ｘ）からのシントンの縮合に相当する：
２）固体支持体
Nunc社から供給される二つのタイプの多官能化された耐熱性支持体を用いて、様々なリンカーアームを評価した。タイプＩは耐熱性改質ポリスチレンであり、タイプIIはスチレン／アクリロニトリルコポリマーである。それらはマイクロプレート形態であり、Nuncから供給されるサーモサイクラーで循環させる。
これらのプラスチック支持体はコロナ処理またはγ放射線により官能化させたが、慣例的には制御された雰囲気で固定圧下の室内に放電することからなる。この官能化によれば、プラスチック支持体をオリゴヌクレオチドプライマーに結合させることができる。この処理ではアミン、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、チオール等のタイプの官能基をプラスチックの表面に出現させ、これらの基はオリゴヌクレオチドと化学的に反応して安定な結合を形成する。非常に耐熱性であるが、しかしながら形成される結合のタイプは現在のところ乏しいと理解されている。
化学的カップリングは下記操作に従い活性剤の存在下で行う。
オリゴヌクレオチド１０〜１００ｐｍｏｌを１００μｌの最終容量中ｐＨ７で１０〜５０ｍＭ最終エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および１０〜５０ｍＭ最終Ｎ-メチルイミダゾールの存在下においてウェル当たりで結合のためにおく。プレートを５０℃で５〜１５時間インキュベートし、その後５０℃に加熱された０．４Ｎ ＮａＯＨ溶液および０．２５％Tween２０で４回洗浄する。
３）固相でのプライマーの伸長
伸長はウェル当たり５０μｌの最終容量中で行う。標的ＤＮＡ１５〜１００ｎｇを１×ＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elmer）、０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Sigma）、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（Pharmacia）、プライマーＸ（ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ）８０ｎｇおよびリンカー有または無のプライマーＡ１０ｎｇとＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）１．２単位からなる混合液中で増幅する。プライマーＸは溶液中だけでみられるが、プライマーＡは固体支持体に結合し、かつ溶液中に存在している。増幅は下記方法を用いてマイクロプレートフォーマットに合わせたサーモサイクラーで行う：
サイクル１：
９４℃で５分間
サイクル２〜３０：
９４℃で３０秒間
５５℃で３０秒間
７２℃で３０秒間
サイクル３１：
７２℃で５分間
４℃
図１は固相ＰＣＲの様々な工程を表している。増幅後、固相上で伸長された増幅産物を変性させる。ウェルを空け、その後１０分間かけて０．４Ｍ水酸化ナトリウムで３回洗浄する。
４）検出
２タイプの検出を用いた。半定量酵素検出および定量放射線検出
酵素検出は文献（９）で記載されたように行う。この方法では、変性後に、固体支持体上で伸長された鎖の領域と相補的なビオチニル化プローブ１ｐＭをハイブリッド形成させる。
ハイブリッドは、基質を化学発光または蛍光比色産物に変換するストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ複合体により顕在化させる。
放射線検出の場合には、32Ｐ標識プローブを固体支持体上で伸長された鎖とハイブリッド形成させて、放射能をβカウンターでカウントする。
５）結果
固体支持体上におけるプライマーの結合能力は、放射性５′キナーゼ処理プライマーを結合させることにより定量したところ、タイプＩがウェル当たり約１ｐＭのプライマーと結合し、タイプIIが０．２ｐＭと結合したことを示すことができた。
図２は、様々なタイプのリンカーアームの関数として、２つのマイクロプレート支持体へのプライマーの結合能力を表す。所定タイプの支持体の場合、結合能力は用いられたアームの関数として有意差がない。
他方、伸長率は用いられたリンカーアームの関数としてかなり異なる。結果は図３および５に掲載され、そこでは用いられた様々なアームの関数として支持体の伸長レベルを表している。プライマーに結合されたアームの影響は伸長率の決定要因であり、用いられたリンカーのタイプに応じて１５倍増加し、結合のレベルは一定のままである。
ポリ-Ａおよびポリ-Ｃ断片はポリ-Ｔ断片よりも有効である。実際に、同サイズのリンカーアームであると、それらの方が伸長について強いシグナルを与える。リン酸基の付加は伸長率を常に改善し、この増加はポリ-Ａまたはポリ-Ｃリンカーアームよりもポリ-Ｔリンカーアームの場合で明らかである。
伸長はＰＣＲで伸長された部分と相補的な放射性プローブのハイブリッド形成により間接的に定量した。ハイブリッド形成のレベルは、既知量の結合プライマーを含有したウェルに放射性プローブをハイブリッド形成させることにより確認した。伸長のレベルは、各々タイプＩおよびタイプIIについて２〜３８ｆＭまたは１〜１７ｆＭで用いられたリンカーアームのタイプに応じて異なる。これらの結果は図４で示されている。
リンカーアーム上におけるいくつかの官能基の存在は、固体支持体に結合されたプライマーの伸長レベルを増加させることができる。このため、図６で示されたように、４５％増加は１０Ｔがプライマーと末端リン酸基との間に挿入されたときにみられる。同様に、（ＴＥＧ）３ ＊リンカーアームへのリン酸官能基の付加は、リンカーアームなしのプライマー単独と比較してシグナルを４０％および３５０％まで増加させることができる。同様の現象は５Ｔ５ＮＨ２ ＊アームが用いられたときに観察される；伸長のレベルはＮＨ２ ＊アームと比較して１１０％まで増加する。このように、いくつかの異なる化学官能基の使用は、末端結合鎖のタイプを増加させることにより固相でプライマーの伸長を促進することができる。
伸長されるオリゴヌクレオチドの量は、事実上、支持体に結合された量と比較して非常に低い。この低い量にもかかわらず、約３０のシグナル対ノイズ比が記載された酵素検出技術で達成されており、これであれば診断適用にとり全く充分である。
参考文献
Claims (21)
- 官能化された耐熱性固体支持体に固定されたプライマーを用いる核酸の固相増幅方法であって、
上記プライマーが、少なくとも５つの官能基を有する多官能性分子からなるリンカーアームにより固体支持体に固定されてなり、該多官能性分子が、固体支持体と多官能性分子の第一官能基との共有結合および上記プライマーの５'末端と上記多官能性分子の第二官能基との共有結合を形成していることを特徴とする方法。 - 前記多官能性分子がポリマー断片からなる請求項１に記載の方法。
- 前記ポリマー断片が少なくとも５つのモノマー単位を有してなる請求項２に記載の方法。
- 前記ポリマー断片が少なくとも１０のモノマー単位を有してなる請求項２に記載の方法。
- 前記ポリマー断片の各モノマー単位が少なくとも１つの官能基を有してなる請求項３または４に記載の方法。
- 前記多官能性分子の官能基がアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、チオールおよびリン酸基から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記官能基がアミン、ヒドロキシルおよびリン酸基から選択されるものである請求項６に記載の方法。
- 前記多官能性分子がホモポリヌクレオチドタイプのポリマー断片またはポリヌクレオチドアナログの断片からなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマー断片が１０〜５０のヌクレオチドを含むホモポリヌクレオチドである請求項８に記載の方法。
- 前記多官能性分子が下記式のポリヌクレオチドアナログポリマー断片：
（上記式中、Ｒは少なくとも１つの官能基を有する脂肪族残基であり、ｎは２〜５０の整数である）からなる請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ポリヌクレオチドアナログポリマー断片が各モノマー上にグラフト化されたいくつかのアミンまたはヒドロキシル基を有してなる請求項１０に記載の方法。
- 前記ポリマー断片がプライマーに結合されていない末端側に末端リン酸基を有してなる請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が有機または無機ポリマーからなるものである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体がコロナ処理またはγ放射線により官能化された耐熱性プラスチック物質である請求項１３に記載の方法。
- 前記固体支持体が耐熱性改質ポリスチレンまたはポリカーボネートからなる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記耐熱性改質ポリスチレンがスチレン／アクリロニトリルコポリマーからなる請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
- 官能化された耐熱性固体支持体に結合されたプライマーが溶液中にも存在しているが、増幅反応中において溶液中における他のプライマーよりも少量で存在している請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 官能化された耐熱性固体支持体に結合されたプライマーが、溶液中における他のプライマーの８〜１６分の１の量で溶液中にも存在している請求項１７に記載の方法。
- 増幅が行われる容器の内表面が官能化された耐熱性固体支持体とされる請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
- 官能化された耐熱性固体支持体を含んでなり、かつそこにプライマーが、少なくとも５つの官能基を有し、ポリマー断片を含む多官能性分子との共有結合により固定されていることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の増幅方法を行うための試薬キット。
- 官能化された耐熱性固体支持体へのプライマーの固定方法であって、このプライマーが請求項１〜１９のいずれか一項に記載の増幅方法を行う上で有用であり、
共有結合が、官能化された耐熱性固体支持体と、上記プライマーの５'末端に結合された少なくとも５つの官能基を有する多官能性分子からなるリンカーアームとの間で行われることを特徴とする方法。
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