NO844846L - Hybridiseringsanalyse ved anvendelse av en merket proeve og anti-hybrid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre hybridi-seringsanalysemetoder og reagentsystemer for detektering av spesifikke polynukleotide sekvenser. Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, frem-

stilt ved å denaturere de dobbeltkjedede formene, vil hybridisere eller rekombinere under egnede betingelser med komplimentære enkeltkjedede nukleinsyrer. Ved å

merke slike komplimentære nukleinsyreprøver med en lett detekterbar kjemisk gruppe, ble det gjort mulig å oppdage nærvær av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse i et forsøksmedium som inneholder nukleinsyre-prøver i enkeltkjedet form.

I tillegg til anvendelse innen rekombinant DNA teknikk,

kan analytisk hybridisering anvendes til detektering av viktige polynukleotider innen feltene human- og veterinær-medisin, jordbruk, næringsmiddelteknikk og liknende.

Spesielt kan teknikken anvendes til å detektere og identi-fisere etiologiske midler som f.eks. bakterier og virus,

å undersøke bakterier med hensyn til antibiotisk resistanse, lette diagnosen av genetiske anemier, som f.eks. sigd-

celle anemi, og thalassemia, og til å oppdage kreftceller. En generell oversikt over teknikken og dere nårværende og fremtidige betydning finnes i Biotechnology (august 1983), s. 471-478.

Følgende informasjon tas med for å gjøre kjent bakgrunns-informasjon med mulig relevans for foreliggende oppfinnelse. Den følgende informasjon er ikke ment å utgjøre tidligere kjent teknikk som skal veies mot foreliggende oppfinnelse.

Teknikkens stand når det gjelder nukleinsyrehybridiserings-analyseteknikk innbefatter generelt en separering av hybridisert- og uhybridisert merket probe. Det påkrevde separasjonstrinnet lettes vanligvis ved å gjøre enten prøvenukleinsyrene eller nukleinsyreproben immobil på en fast bærer. Vanligvis detekteres hybridisering mellom spesielle basis frekvenser eller gener av interesse i prøvenukleinsyrene og en merket form av probenuklein-syren ved å separere den faste bæreren fra den gjen-værende reaksjonsblanding som inneholder uhybridisert probe, etterfulgt av deteksjon av merke på den faste bæreren.

Det gjøres stadig anstrengelser for å forenkle analyse-fremgangsmåten for utføring av nukleinsyrehybridiserings-analyser. Det primære mål med disse bestrebelsene er å redusere kompleksiteten ved fremgangsmåten til det punktet at dm lett og rutinemessig kan utføres i kliniske laboratorier. Nødvendigheten av et separasjonstrinn vanskeliggjør disse bestrebelsene. For å utføre separasjonstrinnet på en analytisk reproduserbar måte, kreves betydelig ekspertise, og den fysiske manipulering kan ikke lett automatiseres eller gjøres egnet for store testvolumer.

Videre opptrer ved konvensjonelle fremgangsmåter med immobilisering av prøvenukleinsyrer, to betydelige problemer. For det første er de fremgangsmåtene som er påkrevet for å oppnå immobilisering generelt tidkrevende og utgjør et ekstra trinn som er uønsket for rutinemessig bruk av teknikken i kliniske laboratorier. For det andre kan proteiner og andre materialer i den heterogene prøven, spesielt i tilfellet ved kliniske prøver, påvirke immobiliseringsprosessen.

Som alternativer til immobilisering av prøvenukleinsyrer

og tilsats av merket probe, kan man benytte en immobilisert probe og merket prøvenukleinsyre in situ, ellerman kan bruke en dobbelt hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav en er immobilisert og den andre er merket.

Det første alternativet er imidlertid enda mindre ønskelig siden in situ merking av prøvenukleinsyrer krever en høy grad av teknisk ferdighet som ikke finnes rutine-

messig hos klinisk laboratoriepersonell og det finnes ingen enkle, pålitelige fremgangsmåter for å styre merkeutbyttet, hvilket kan være et betydelig problem dersom merkemediet inneholder variable mengder av inhibitorer for merkings-reaksjonen. Dobbelthybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et inkubasjonstrinn,

og kinetikken for hybridiseringsreaksjonen kan være langsom og lite effektiv. Nøyaktigheten av analysen kan også

være variabel dersom komplimentariteten for de to prøvene med prøvesekvensen er variabel.

Noen av de problemene som er diskutert ovenfor kan løses

ved å anvende en immobilisert RNA probe og å detektere det resulterende immobiliserte DNA"RNA eller RNA"RNA

hybrider med et merket spesifikt anti-hybrid antistoff

(se U.S. Patent søknad nr. 616.132, inngitt 1. juni 1984). Denne teknikken krever fremdeles et separasjonstrinn

og har derfor de ulempene som er felles for alle hybridi-seringsteknikker som krever et separasjonstrinn som diskutert ovenfor.

Europeisk Patent søknad nr. 70.685 foreslår en hybridi-seringsanalyseteknikk hvor nødvendigheten av fysisk å separere hybridisert fra uhybridisert probe unngås.

Det forslås å anvende et par av prober som hybridiserer

til tilgrensende områder på en polynukleotidsekvens av interesse, og å merke en probe med en kjemiluminescent katalysator som f.eks. enzymet peroxidase og den andre met et absorberende molekyl for den kjemiluminisente emisjonen. Katalysatoren og de absorberende merkene må være plassert nær de tilgrensende terminalendene av de respektive prober slik at det ved hybridisering observeres slukking av den kjemiluminisente emisjonen ved energioverføring til det absorberende molekylet. For å utføre

en slik analyse må man være i stand til kontrollerbart å syntetisere to kritiske probereagenser slik at de respektive merkene bringes inn i en slukkende orientering ved hybridisering til prøvenukleinsyren, uten å påvirke-

de respektive merkede probesegmentenes affinitet for hybridisering.

Man har nå kommet frem til en nukleinsyre hybridiseringsanalyse basert på modulering av den detekterbare responsen av hybridisert merket probe ved å binde en antistoff-

reagens til hybriden som dannes mellom den merkede proben og den spesielle polynukleotide sekvensen som skal detekteres. Det vil si merket i det antistoff-bundne hybrid uttrykker

en respons som er detekterbart forskjellig fra responsen som uttrykkes av merket i uhybridisert merket probe.

På denne måten er det ikke behov for å separere hybridisert og uhybridisert probe, dette forenkler i stor grad utførelsen og automatiseringen av analysen. I tillegg er analyse-si gnålet ikke-radioisotopt av natur og tilfredsstiller derfor et annet kriterium for en anvendbar analyseprosess, anvendelse av deteksjonssystemer som ikke innebærer radio-aktivitet .

Ifølge foreliggende oppfinnelse; detekteres spesifikke nukleotide sekvenser i en testprøve ved å danne et hybrid mellom en hvilken som helst av de spesielle sekvenser som skal detekteres og en merket nukleinsyre probe som innbefatter et merke og minst en enkeltkjedet basesekvens som i hovedsak er komplementær med den sekvensen som skal detekteres. Hybridet karakteriseres ved at det har epitoper for en antistoffreagens (anti-hybrid) som ikke bindes i vesentlig grad til enkeltkjedede nukleinsyrer. Anti-

hybrid tilsettes så og vil ikke i vesentlig grad bindes til den merkede proben med mindre det hybridiserer til den sekvensen som skal detekteres. Merket i den merkede proben

tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig fra, dvs. forøket eller redusert, når den merkede proben innbefattes i et hybrid som er bundet ved anti-hybrid sammenliknet med det tilfellet at det ikke er innbefattet i et slikt hybrid-- Måling av den resulterende detekterbare responsen vil være en funksjon av nærværet av sekvensen som skal detekteres i prøven.

En foretrukket mekanisme for modulering av merket ved anti-hybridbinding innbefatter sterisk hindring. I slike situasjoner veksel-virker merket kjemisk med en reagens-del av merke-deteksjonssystemet, som f.eks. ved reaksjon eller binding;, og nærvær av anti-hybrid bundet til hybridet gir sterisk hindring av aksess til merket for en slik del av deteksjonssystemet. Foretrukne merker som anvendes for slike systemer innbefatter enzymreaksjoner, dvs., merke og den delen av reagensen som merketvekselvirker med velges fra enzymsubstrater, enzym co-faktorer, enzym inhibitorer og enzymer. Det kan oppnås detekterbare responser som er kolorimetriske, fluorimetriske, eller luminometriske.

En annen foretrukken mekanisme for modulering av merket

ved anti-hybrid er basert på bruk av nærmeste vekselvirkende merkepar. Proben merkes med ett av et første merke og et annet merke og antistoffreagens merkes med den andre, eller innbefatter i opprinnelig form en kjemisk gruppe som tjener som det andre merket, hvor vekselvirkning mellom de to merkene tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig, enten i positiv eller i negativ forstand, når den merkede antistoffreagensen bindes til et hybrid som innbefatter den merkede prøven sammenliknet med de tilfeller at den ikke er bundet på denne måten.

Når de er assosiert til det samme hybridet bringes de to merkene til en nabo-vekselvirkningsavstand fra hverandre, derved øker signalet som påvirker vekselvirkningen mellom de to merkene i stor grad sammenliknet med de relativt mindre frekvente vekselvirkningene som finner sted i bulk- oppløsningen mellom de frie, de fundrende merkede reagensene. En foretrukken vekselvirkning mellom de to merkene er en trinnvis vekselvirkning hvor det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon og danner et defunderbart produkt som deltar i en andre kjemisk reaksjon med det andre merket under dannelse av et detekterbart produkt. Det er spesielt foretrukket at det første og/ eller det andre merket er katalysatorer for henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen. F.eks.

kan antistoffreagensen være merket med et enzym og proben med en katalysator som virker på et defunderbart produkt fra enzymreaksjonen slik at det dannes et produkt som er detekterbart f.eks. ved et optisk signal i nærvær av en egnet indikator fargesammensetning. Et annet foretrukket merkepar er det som innbefatter energioverførings-vekselvirkning som f.eks. mellom et fluoriserende eller luminiserende stoff og en slukker, for fotoemisjon fra det første merket.

Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved en rekke tydlige fordeler. I tillegg til hovedfordelen som ligger i eliminering av separasjonstrinnene, kreves det ingen immobilisering hverken av prøve ellerprobe nukleinsyrer som gir opphav til ikke-spesifikk binding og reproduserbar-hetproblemer som ved de vanlige anvendte hybridiserings-teknikker. Videre er kinetikken for hybridiseringen vesentlig raskere i oppløsning sammenliknet med systemer med entro av det hybridiserbareDåret imTnobilisert.

En ekstra fordel er at analysen kan utføres uten vaske-trinn. Analysereagensene kan tilføres trinnvis til hybridiseringsmediet uten behov for å vaske uoppløselige bærermaterialer.

Et annet betydelig trekk ved foreliggende oppfinnelse

er at deteksjonssystemet som innbefattes kan være spesielt

effektivt siden dobbeltkjedede duplekser kan inneholde mange merker og bindingsposisjoner for anti-hybrid reagensen. Dette resulterer i store mengder av merket og anti-rhybrid som bindes i interaktiv konfigurasjon pr. enhet hybridisert probe. Ved å betrakte antistoffer til RNA<*>DNA eller RNA"RNA hybrider, kan et merket anti-stoff binde tilnærmet-hver 10. basepar i hybridet.

Hvis proben f.eks. er 500 baser lang, kan 40-50 antsi-stoffer binde. Tilstedeværelsen av multiple bindingsposisjoner på hybridene kan med fordel anvendes når lave nivåer av hybridene skal detekteres.

Figurene 1 - 3 er skjematiske illustrasjoner av foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende oppfinnelse. Disse fremgangsmåtene beskrives i detalj nedenfor.

Anvendelsen av nukleinsyre-hybridisering som et analytisk verktøy er i hovedsak basert på den dobbeltkjedede dupleksstrukturen til DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyrimidin basene i de respektive kjedede i dobbelt-

kjedet DNA kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjeder av DNA som oppstår ved denne "smeltingen"

eller "denatureringen" av DNA vil assosiere (også kalt regløding eller hybridisering) slik at dupleksstrukturen gjendannes. Det er nå velkjent at dersom man bringer i kontakt en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens tilstrekkelig komplementær med (dvs. "homolog med") en annen enkeltkjedet nukleinsyre under egnede betingelser, vil det dannes DNA"DNA, RNA"DNA, eller RNA"RNA hybrider, avhengig av utgangspunktet.

Proben vil innbefatte minst en enkeltkjedet basesekvens

som i det vesentlige er komplementær med eller homolog med sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens

må ikke nødvendigvis være et enkelt kontinuerlig polynukleotid segment, men kan innbefatte to eller flere individuelle segmenter avbrutt ved ikke-homologiske sekvenser. Disse ikke-homologiske sekvensene kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnålsløyfer. I tillegg kan de homologe områdene av proben være flankert ved 3'- og 5<1->endene av ikke-homologiske sekvenser, som f.eks . de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologiske sekvensen er satt inn for fremdrift. I ethvert tilfelle vil proben, som er tilstede som en analytisk reagens, vise detekterbar-hybridisering ved et eller flere punkter med prøve-nukleinsyrene av interesse. Lineære eller sirkulære enkeltkjedede polynukleotider kan benyttes som probe-element, med hoveddelen eller en mindre del dupleks-dannet med en komplementær polynukleotid kjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologiske segment eller segmentene er i enkeltkjedet form og tilgjengelig for hybridisering med prøve DNA eller RNA. Generelt foretrekkes det å anvende prober som foreligger i det vesentlige i enkeltkjedet form. Fremstillingen av en egnet probe for en spesiell analyse er et spørsmål om rutineteknikk.

Merket kan velges fra en stor mengde materialer.

Som merke kan man benytte et hvilket som helst materiale som når det innbefattes i den merkede prøven tilveiebringer en detekterbar respons som kan moduleres ved binding av anti-hybrid og som er tilstrekkelig stabilt, underhybridiseringsbetingelsene, til å tilveiebringe en målbar respons. Modulering eller modifisering av merke-responsen kan skyldes et antall forskjellige effekter som finner sted når anti-hybridet bindes til hybridet.

En spesielt foretrukket mekanisme for modulering av merkeresponsen innbefatter sterisk hindring. Normalt velges merket for å tilveiebringe den detekterbare analyseresponsen med viktig virkning, f.eks. ved kjemisk reaksjon eller binding med en del av et reagensdeteksjons-system som innbefatter et eller flere stoff som deltar sammen med merket til å tilveiebringe det målte signalet. Enten det skyldes sterisk hindring eller et annet fenomen, vil bindingen av anti-hybridet avbryte eller inn-

aktivere merket fra slik signalgenererende deltagelse. Slike effekter ved signalgenereringen vil vise nærværet

av hybridisert merket probe.

Fortrinnsvis vil merket, når det innbefattes i et system basert på sterisk hindring, være lite, f.eks. av molekylvekt mindre enn 10.000, vanligvis mindre enn 4.000, og fortrinnsvis mindre enn 2.000 dalton, og den interaktive reagensen i det foretrukne deteksjonssystemet vil normalt være betydelig større, f.eks. mer enn tre ganger større, vanligvis mer enn 10 ganger større, og fortrinnsvis 20 til 100 ganger større enn merket. Følgelig vil, i de mest foretrukne systemer med merker som har masser i størrelsesorden fra 100 til 2.000 dalton, minst en del av deteksjonssystemet som merket vekselvirker med for å tilveiebringe det detekterbare signalet, være av størrelses-orden 10.000 til 200.000 dalton eller større. Slike størrelsesforhold mellom merket og delen av deteksjonssystemet øker sannsynligheten for en betydelig sterisk effekt ved binding av anti-hybridet til det merkede hybrid. Foretrukne merker er derfor deltagere i en enzym-katalysert reaksjon, som f.eks. enzym substrater, co-enzymer, enzym prostetiske grupper, og enzym inhibitorer, siden et stort antall enzym-reaksjoner er tilgjengelige hvorfra analysekomponentene kan velges. Mange små substrater, co-enzymer, og inhibitorer, er kjente for enzymer av tilstrekkelig stor molekylvekt til at det foretrukne størrelsesforhold mellom merket og dets

vekselvirkende del av deteksjonssystemet kan oppnås.

Dette gjelder også for prostetiske grupper og deres tilsvarende apoenzymer. Ikke-proteinholdige, og spesielt stabile organiske eller uorganiske forbindelser er foretrukne som merker på grunn av de denaturerende organiske- ellerucnianiske forbindelser er foretrukne som merker på grunn av de denaturerende betingelser som hybridiseringen foretas under.

Noen spesielt foretrukne merker og fremgangsmåter for

å fremstille den merkede proben diskuteres nedenfor.

I et system, velges merket slik at den merkede proben

er et substrat for et enzym, og enzymets evne til å virke på den substratmerkede proben påvirkes, enten i positiv eller i negativ forstand, men vanligvis ved inhibering,

ved binding mellom den merkede proben og anti-hybridet. Virkningen av enzymet på den substrat-merkede proben

gir et produkt som kjennetegnes ved noen trekk, vanligvis et kjemisk eller fysisk trekk som f.eks. kjemisk reaktivitet i en indikator-reaksjon som f.eks. en fotometrisk karakter, f.eks. fluoressens eller lysabsorbsjon (farge).

Merker av denne typen beskrives generelt i US Patent søknad nr. 894.836, inngitt 10. april 1978 (hørende til U.K.

Patent 1.552.607); og i Anal .Biochem. 48:1933(1 9761 ), Anal.Biochem. 75:55(1977) ogClin.Chem. 23-1402(1977).

Ved slike enzymsubstrat-merketeknikker, vil den merkede proben ha den egenskap at den kan påvirkes av et enzym,

ved spalting eller modifisering, slik at det dannes et produkt som har en detekterbar egenskap som skiller den fra dens konjugerte forbindelse. F.eks. kan den konjugerte forbindelsen være ikke-fluoriserende under analysebetingelsene, men ved reaksjon med enzym dannes et fluoriserende produkt.

En meget nyttig klasse av substratmerker innbefatter de som undergår enkle hydrolysereaksjoner som gir fluoriserende produkter. Slike produkter kan detekteres ved lave konsentrasjoner. Eksempler på disse typene av substrater er fosfatestere, fosfordiestere, og glykosider av fluoriserende fargestoffer. Glykosider er spesielt foretrukket siden deres hastigheter for ikke-enzymatisk hydrolyse er lave, og 3-galaktosider er spesielt hensiktsmessige fordi 3-galaktosidase-enzymer er lett tilgjengelige og meget stabile.

En spesiell klasse av nyttig fluorogene substrat-merkede probekonjugerte er av formelen:

hvor G er en spaltbar gruppe som f.eks. fosfat, karboksylat, sulfat eller glykon, D er en fluorgen fargestoffenhet som ved fjernelse av G gir et fluoriserende produkt,

f.eks. kan D være umbelliferone, fluorescein, rhodamin, eller derivater av disse, R er en forbindende gruppe,

NA er nukleinsyre-proben og n er i gjennomsnittlig

antall merker pr. molekyl av proben, f.eks. mellon 1

og 50. Enzymatisk spalting (f.eks. ved fosfatase, karboksylase, sulfatase, glykosidase etc.) av den merkede konjugerte forbindelsen utføres ved å binde antihybridet til det merkede hybridet, se U.S. Patent nr. 4.279.992.

En spesielt foretrukket substrat-merket analyse-fremgangsmåte anvender en merket konjugert av typen:

hvor R, NA, og n er som definert ovenfor, og enzymet B-galaktosidases evne til å spalte den konjugerte forbindelsen til et produkt som er kjennetegnet ved fluoressens, inhiberes ved binding mellom det merkedet hybridet og anti-hybridet.

Andre nyttige substrat-merkede konjugerte forbindelser er av formelen: hvor X er et enzymspaltbar forbindelsesgruppe, f.eks. fosfat, karboksylat, og liknende, NA og n er som definert ovenfor, og D er en fluorogen fargestoffenhet som ved avspalting av X frigjør en fluoriserende indikator. En merket konjugert forbindelse av denne typen har formelen:

hvor R er en binding eller en kjede som forbinder den merkede komponent NA til den spaltbare fosfatgmuppen og R 2 er hydrogen eller en substituentgruppe som f.eks. laverealkyl, f.eks. metyl og etyl, N-alkylamido eller N-(hydroksy-substituert laverealkyl)amido, f.eks.

-CONH-(CH2)m-OH hvor m = 2-6 (se U.S. Patent nr.

4.273.715). Umbelliferon-residuet kan inneholde andre eller ytterligere substituenter (se Anal.ehem. 40:803

(1968)). Avspalting av fosfcrdfesterase bevirkes ved at anti-hybridet bindes til det merkedet hybridet. I denne prosessen kan noen av fosfordiesterbindingene i hybridet også spaltes men vil ikke påvirke analysen siden hybridiseririgen er avsluttet og moduleringen av spaltingen av substrat- merket vil i hovedsak være den samme for merker som er tilstede i intakte hybrider sammenliknet med nedbrutte deler av slike.

Et annet foretrukket fluoriserende fargestoff er 6-karboksyfluorescin, som har fluressens eksitasjons- og emisjonsmaksima ved henholdsvis 490 og 520 nm, og kan syntetiseres ved fremgangsmåten beskrevet av Ullman et al, (1976), J. Biol. Chem. 251:4172.

Det kan overføres til di-3-'galaktosid ved fremgangsmåten beskrevet av Rotman et al. Proe. Nat<1>1 Acad. Sei. 50, 1 (1963) . Dette produktet kan overføres til N-hydroksyravsyreimidester ved fremgangsmåten beskrevet av Khanna og Ullman, Anal. Biochem. 108:156(1980) for fremstillingen av korresponderende ester av 4<1>, 5<1->dimetoksy-5-karboksymetylfhorescein.

Den merkede proben i systemet med enzym co-faktor merker er sammensatt, i merkedelen, av en co-

enzymaktiv funksjonalitet, og et slikt co-enzymmerke's evne til å delta i en enzymatisk reaksjon påvirkes av bindingen mellom det merkede hybridet og anti-hybridet. Hastigheten for den resulterende enzymatiske reaksjonen

er målbar ved konvensjonelle deteksjonssystemer, slik at den gir et detekterbart signal. Merker av denne typen beskrives i U.S. Patentsøknad nr. 894.836, inngitt 10. april 1978 (svarendetil U.K. Pat. Spee. 1.552.706);

og i Anal. Biochem. 72:271(1976), Anal. Biochem, 72:283

(1976) og Anal. Biochem. 76:95(1976).

Et nyttig co-enzym fer merking er nicotamamide adenine dinukleotid (NAD). NAD kan kobles til proben ved hjelp av en bro ved 6-nitrogenet, eller 8-karbonet, i adenindelen. En fremgangsmåte for innføring av en aminoetylbro ved 6-nitrogenposisjonen beskrives av Carrico et air Anal. Biochem. 72:271(1976). Lee og Kaplan, Arch. Biochem. Biophys^168:665(1976) har beskrevet en syntese for innføring av en diaminoheksanbro ved 8-karbonet. NAD-merkene kan detekteres på en rekke forskjellige måter , som f.eks. ved enzymisk ringslutning med maleinsyre dehydrogenase og alkohol dehydrogenase.

Et annet viktig co-enzym trirosrat (ATP).. Trayer et al, Biochem. J. 139:609(1974) har beskrevet syntesen av ATP med en heksylaminbro ved 6-nitrogenet i adenin-

gruppen. Denne kan detekteres ved enzymisk ringslutning med heksokinase og pyruvat kinase. ATP kan også kobles til proben ved hjelp av ribosering. Ribosen oksyderes med natriumperiodat og kondenseres så med et dihydrazid (Wilchek og Lamed, Meth. in Enzymol., 34B:475(1974)). Det resulterende hydrazonet reduseres med natriumborhydrid. Dette merket kan detekteres følsomt med ildflue-

luciferase ved bioluminescent registrering.

En spesielt nyttig klasse av cofaktormerker er

prostetiske grupper. I slike systemer vil et katalytisk inaktivt apoenzyms evne til og kombineres med det prostetiske gruppemerket slik at det dannes et aktivt enzym (holoenzym) påvirkes ved binding mellom det merkede hybridet og anti-hybrid. Det resulterende holoenzymets aktivet er målbar ved konvensjonelle deteksjonssystemer,

slik at det oppnås et detekterbart signal. Merker av denne typen beskrives i U.S. Patent nr. 4.238.565.

En spesielt foretrukket stetisk gruppe-merket analyse-utførelse anvender flavin adenin dinukleotid (FAD), som merket og apoglukose oksidase som apoenzymet. Resulterende glukoseoksidase aktivitet er målbar ved hjelp av et kolori-metrisk deteksjonssystem som innbefatter glukose, peroksydase, og et indikatorsystem som gir en fargeforandring som er respons på hydrogenperoksyd. Fluormetrisk detektsjon av hydrogenperoksyd er også mulig ved bruk av et egnet fluor-gent substrat. FAD kan kobles til proben ved en brogruppe ved 6-nitrogenet i adenindelen. Morris et al, Anal. Chem. 53:658(1981) beskriver en fremgangsmåte for syntese av FAD med en heksylaminbro ved 6-nitrogenet, og Zappelli

et al, Eur. J. Biochem. 89:491(1978) beskriver en fremgangsmåte for innføring av en 2-hydroksy-3-karboksypropyl-

gruppe på den samme posisjonen.

Den merkede proben i systemet med enzym modulatormerker

er sammensatt, i merkedelen, av en enzymmodulerende funksjonalitet som f.eks. en enzym-inhibitor eller stimulator, og et slikt modulator-merkes evne til å modulere aktiviteten av et enzym påvirkes av bindingen mellom det merkedet hybridet og anti-hybrid. Hastigheten for den resulterende enzymatiske reaksjonen er målbar ved konvensjonelle deteksjonssystemer slik at det oppnås et detekterbart signal. Merker av denne typen beskrives i U.S. Patent nr. 4.134.792 og 4.273.866. Spesielt foretrukket er bruken av metotreksat som merket med dihydrofolat reduktase som det modulerte enzymet.

Dersom merket er en enzyminhibitor, kan det vekselvirke

med enzymet kovalent eller ikke-kovalent, og kan være et lite molekyl, f.eks. metotreksat, eller et stort molekyl, f.eks. antistoff til et enzym (se U.S. Patent 4.273.866 og U.S. Patentsøknad nr. 285.605, inngitt 21. juni, 1981) .

I et annet system er merket en katalysator og aktiviteten av katalysatormerket påvirkes ved binding mellom det merkedet hybridet og anti-hybrid. Resulterende katalytisk aktivitet er målbar ved konvensjonelle deteksjonssystemer, og gir et detekterbart signal, f.eks. absorbsjon eller fluoressens. Merker av denne typen er beskrevet i U.S. Patent nr. 4.160.645.

I et annet system innbefatter merket en epitop, dvs. en bindingsposisjon for antistoff, for et annet antistoff, dvs. anti-merke eller fragmenter av dette. Anti-merkets evne til og bindes til merket i det merkedet hybridet påvirkes ved binding til anti-hybrid. Flere kontroll- og detek-sjonsutførelser kan anvendes. I et eksempel kan epitop-merket også være et fluoriserende stoff hvis lysemisjon endres, f.eks. reduseres ved binding til et anti-fluoriserende stoff. Anti-hybridbinding til merket hybrid begrenser tilgjengeligheten av det fluoriserende merket til slukkende anti-fluoriserende stoff, (se U.S. Patent nr. 3.998.943). Ved en annen fremgangsmåte anvendes et ekstra detektormolekyl som innbefatter epitop-merket koblet til et enzym. Binding av anti-merket til dette epitop-enzymkonjugatet gir inhibering av enzymaktiviteten.

Jo mer anti-merket som utelukkes fra og bindes til merket

på det epitop-merkede hybrid ved anti-hybridbindingen,

jo mer anti-merke er tilgjengelig til og bindes til og inhibere enzymaktiviteten i epitop-enzymreagensen (se U.S.

Patent nr. 3.935.074).

Ifølge en annen foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse anvendes et par av merker slik at hybridiseringen som er avhengig av nærvær av den polynukleotide sekvensen av interesse og binding til en merket antistoffreagens til det merkede hybridet, medfører at de to merkene bringes sammen i en viss avstand slik at signalet som produseres ved vekselvirkning er målbart forskjellig fra det som produseres når merkene møtes ved diffusjon i bulken av analysemediet. Forskjellige vekselvirknings-fenomener kan anvendes i denne utførelsen. Vekselvirkningen kan være kjemisk, fysisk, eller elektrisk,

eller finne sted ved kombinasjoner av disse kreftene. Omgivelsene for merkene som dannes ved hybridisering

og binding av merkede antistoffreagenser til de dannede merkede hybrider, heretter holdt omgivelsene forbundne hybrid, må ha minst ett kritisk trekk som er distinktivt forskjellig fra bulkmediet. Siden hybridiseringen bestemmer mengden av merker som dannes i omgivelsene for det lokaliserte hybrid sammenliknet med bulkfasen,

vil den resulterende signalresponsen være avhengig av tilstedeværelsen av sekvensen som skal bestemmes i analysemediet .

En foretrukket vekselvirkning mellom to merker inn-

befatter to kjemiske reaksjoner, hvor et merke deltar i den første reaksjonen, som danner et definerbart mellomprodukt som deltar i den andre reaksjonen med det andre merket, og gir et detekterbart produkt. Mikro-omgivelsene for det bundne hybridet vil derfor inneholde en høyere lokalisert konsentrasjon av mellomproduktet,

enn bulkoppløsningen, slik at hastigheten for den signal-produserende andre merkereaksjonen økes. De.to merkene kan delta i reaksjonene som reaktant eller, hvilket er spesielt foretrukket, som katalysatorer. En eventuelt katalyse kan være enten enzymatisk eller ikke-enzymatisk.

Et stort antall enzymer og katalysatorer kan anvendes

ved denne utførelsen. Nyttige enzymer for merking av antistoffreagensen innbefatter oksydoreduktaser,

spesielt de som innbefatter nukleotider som f.eks. nikotinamid adenin, dinukleotid (NAD) og dens reduserte form (NADH), eller adenosine trifosfat (ATP) som co-faktorer eller de som danner hydrogen peroksyd eller andre små definerbare produkter. Noen få eksempler er alkohol dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, lactat dehydrogenase, malate dehydrogenase, glukose-6-

fosfat dehydrogenase, glukose oksydase, og urikase.

Andre klasser av enzymer som f.eks. hydrolaser, transferaser, lyaser, og isomeraser kan også benyttes. En detaljert liste og beskrivelse av nyttige enzymer er tilveiebragt i U.S. Patent nr. 4.233.402 og 4.275.149. Andre nyttige systemer innbefatter et enzym som det første merke som katalyserer en reaksjon som danner en prostetisk gruppe for et apoenzym eller proenzym. Ikke-enzymatiske katalysatorer kan også tjene som merker som beskrevet tidligere. Det kan.f.eks. vises til U.S. Patent nr. 4.160.645.

En annen foretrukket vekselvirkning mellom merkepar er energioverføring. Det første merket kan være et foto-emitterende stoff som f.eks. et fluoriserende eller luminiserende stoff, det førstnevnte gir emisjon ved bestråling og det andre gir emisjon ved kjemisk reaksjon. Fotoemisjonen er absorberbar av det andre merket, slik

at det enten slukker emisjonen eller tilveiebringer en annen emisjon dersom det absorberende merke selv er et fluoriserende stoff. Par av forbindelser som er nyttig for denne effekten er beskrevet i detalj i U.S. Patent nr. 4.275.149 og 5.318.981. Noen foretrukne fluoriserende/slukkende par er naphthalen/anthracen, a-nephthylamin/dansyl, tryptophan/dansyl, dansyl/fluorescein, fluorescein/rodamin, tryptophan/fluorescein,' N-(p-(2-benzoksazolyl))phenyl)maleimid (BPM(/thiokrom, BPM/8-anilino-1-naphthalensulfonat (ANS), thiokrom/N-(4-dimetylamino-3,5-dinitrofenyl)maleimid (DDPM),

og ANS/DDPM. Noen foretrukne luminiserende/slukkende par er luminol med fluorescein, eosin eller rhodamin S.

Om det ønskes kan forskjellige modifikasjoner av

den merkede proben anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Ved en variasjon innbefatter den merkede proben en fast fase som merket er forbundet til. Den faste fasen kan være veggene av reaktorbeholderen eller et dispergert fast stoff som f.eks. polyakrylamid- eller agaroseperler. Man kan også modifisere proben med en bindbar ligand som f.eks. en hapten eller biotin og innføre merket ved addisjon av et merket anti-hapten antistoff eller merket avidin før eller etter hybridiseringsreaksjonen. Det sees følgelig at merket kan forbindes til det bindende stoffet direkte eller indirekte ved hjelp av overgangskomponenter.

En- rekke fremgangsmåter kan benyttes til å merke polynukleotide prøver. Det foretrekkes å ha merke fordelt langs lengden av polynukleotidet fremfor konsentrert omkring en posisjon. Flere fremgangsmåter for merking er beskrevet nedenfor.

5-(3-amino)allyldeoksyuridin trifosfat (AA-dURP) kan syntetiseres ved fremgangsmåten beskrevet av Langer et al, Proe. Nat'1. Acad. Sei. 78:6633(1981) og kan innføres i dobbeltkjedede DNA-prober ved nick-translasjon med DNA polymerase. Proben vil ha sidekjedede aminogrupper som kan reagere med merkene beskrevet ovenfor.

N-hydroksyravsyreimid estere av 6-karboksylf.uorescein, 4<1>,,5<1->dimetoksy-6-karboksymetylfluorescein og deres 3-galaktosyl derivater kan reageres direkte med den nick-translaterte proben. De aktiverte fargestoffene anvendes i overskudd for å maksimere inkorporeringen av merket, og de ukoplede fargestoffene separeres deretter fra det merkede DNA ved en gel filtreringsfremgangsmåte.

Merkene med terminale aminer på brogruppene kan

kobles til det nick-translaterte DNA ved hjelp av bifunksjonelle reagenter som f.eks. dimetyladipimidat, heksametylen diisocyanat, og p,p'-difluoro-m,m'-dinitrofenylsulfon. Merkene kan reageres med overskudd av den bifunksjonelle reagensen, etterfulgt av fjernelse av ureagert reagens. Det aktiverte merket kan reageres med den nick-translaterte proben.

Visse planar aromatiske forbindelser interkalerer mellom baseparene av dobbeltkjedede nukleinsyrer og danner reversible komplekser. Noen interkaleringsmidler kan kobles kovalent til polynukleotidene ved fotolyse av interkaleringkompleksene. Eksempler på fotoaktiverbare interkaleringsmidler er 8-azidothidium, 8-azidomethidium, og furocoumariner som f.eks. angelicin. Disse inter kalatorene kan modifiseres ved broarmer som inneholder funksjonelle grupper. 8-azidomethidium derivater kan fremstilles som beskrevet av Hertzberg og Dervan, J. Am. Chem. Soc. 104:313(1982) og Mitchell og Dervan, J. Am. Chem. Soc. 104:4265(1972). Merkene kan kobles direkte til de modifiserte interkalatorene. F.eks. kan N-hydroksyravsyreimidestere av 6-karboksyfluorescein eller 4<1>,5<1->dimetoksy-6-karboksyfluorescein reageres med inter-kalatorderivatene slik at det dannes amidbindinger. Deretter kan disse interkalator-merkede konjugatene adderes til et polynukleotid probe og fotolyseres. Alternativt, kan de modifiserte interkalatorene fotolyseres med polynukleotidprobe og deretter kobles til de merkede f oribindelsene. 8-azidomethidium kan kobles fotolyttisk til enkeltkjedede nukleinsyrer ved en ikke-interkalerende mekanisme (Balton og Kerns (1978) Nucl. Acids Res. 5:4891). Denne fremgangsmåten kan benyttes for å koble dette interkalator derivatet til enkeltkjedet DNA og RNA.

Et kritisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er dannelsen av et hybrid mellom proben og den polynukleotide sekvensen av interesse som innbefatter bindingsposisjoner for anti-hybrid antistoff-reagensen. Et prinsipp ved analysen er at hybridiseringen av den merkede proben med den ønskede sekvensen resulterer i dannelsen av et hybrid som er bundet ved anti-hybridet og gir en målbar effekt på merke-responsen. En hvilken som helst utforming av systemet kan benyttes som gir en bindingsposisjon for anti-hybridreagensen som er unik for hybridet. Det sikres derved at den ønskede effekten ved bindingen av anti-hybrid på probemerket vil finne sted ved dannelsen av hybridet.

Bindingen av anti-hybridet til hybridet vil normalt innbefatte en meget spesifikk ikke-kovalent binding, som er karakteristisk for en rekke biologisk avleiret stoff, spesielt bindinger i proteiner, som f.eks. immunoglobuliner. En rekke bindende stoff kan anvendes for å tilveiebringe anti-hybrid som har en unik bindingsaffinitet for hybridet og ingen bindingsaffinitet for enkelt-kjedede nukleinsyre som f.eks. uhybridisert probe og uhybridiserte nukleinsyreprøver.

Spesielt foretrukne bindende stoff er antistoffreagenser

som har anti-hybridbindingsaktivitet og kan være hele antistoffer eller deler av slike, eller aggregater eller konjugater av disse, av den konvensjonelle polyklonale eller monoklonale typen..Foretrukne antistoffreagenser er de som er selektive for binding (i) DNA<*>RNA eller RNA'RNA hybrider eller (ii) interkaleringskomplekser.

Det er på det nåværende tidspunkt kjent at antistoffer kan stimuleres slik at de er selektive for DNA"RNA eller RNA"RNA hybrider, sammenliknet med enkeltkjedede nukleinsyrer, men det betraktes på det nåværende tidspunkt som umulig å generere slik selektivitet i tilfellet med DNA"DNA hybrider. I den grad selektive DNA"DNA antistoffer ut-vikles i fremtiden, vil de klart kunne anvendes i foreliggende oppfinnelse. Antistoffer til DNA"RNA hybrider kan benyttes der hvor en av proben og sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA og antistoffer til RNA<*>RNA kan benyttes når både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA.

Videre skal det bemerkes at når det her refereres til

en RNA probe benyttet med anti-DNA"RNA eller anti-RNA"RNA reagenser, antas det at ikke alle nukleotidene som innbefattes i proben er ribonukleotider, dvs. inneholder en 2<1->hydroksylgruppe. Det fundamentale trekk ved en RNA

probe som benyttet her er at den er tilstrekkelig non-

DNA i karakter til å muliggjøre stimuleringen av anti stoffer til DNA"RNA eller RNA'RNA hybrider som innbefatter en RNA probe som ikke kryssreagerer i analytisk signifikant grad med de individuelle enkeltkjedene som utgjør slike hybrider. Derfor kan en eller flere av 2'-posisjonene på nukleotidene som innbefattes .i proben være i deoksy-formen, forutsatt at antistoffbindings-egenskapene som er nødvendige for utførelsen av foreliggende analyse opprettholdes i betydelig grad. På samme måte,

i tillegg til eller alternativt til slik begrenset 2'-deoksy modifikasjon, kan en RNA probe innbefatte nukleotider som har andre 2'-modifikasjoner, eller generelt en hvilken som helst modifikasjon langs ribosefosfatryggraden forutsatt at det ikke er vesentlig interferens med spesifisiteten av antistoffet overfor det dobbeltkjedede hybridiseringsproduktet sammenliknet med dets individuelle enkeltkj eder.

Der hvor slike modifikasjoner eksisterer i en RNA probe,

vil det immunogen som benyttes for å heve antistoff-reagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som har i det vesentlige tilsvarende modifikasjoner og den andre kjeden er i det vesentlige umodifisert RNA eller DNA, avhengig av om prøven som skal detekteres er RNA eller DNA. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogenet

være identisk med den modifiserte kjeden i en RNA probe.

En eksempel på en immunogen er hybridet poly(2'-0-metyladenylsyre)*poly(21-deoksythymidylsyré ). Et annet eksempel er poly(2<1->O-etylinosinsyre)"poly(ribocytidylsyre). Følgende forbindelser er ytterligere eksempler på modifiserte nukleotider som kan innbefattes i en RNA probe: 2<1->O-metylribonukleotid, 2-0-etylribonukleotid, 2'-azido-deoksyribonukleotid, 2<1->klorodeoksyribonukleotid, 2-0-acetylribonukleotid, og metylfosfonater eller fosforotiolater av ribonukleotider eller deoksyribonukleotider. Modifiserte nukleotider kan komme til syne i RNA prober som et resultat av innføring under enzymsyntese av proben fra en sjablon. F.eks. er adenosin 5<1->0-(1-thiotrifosfat) (ATPaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA-avhengige RNA-polymeraser og DNA-polymeraser. Alternativt kan den kjemiske modifikasjonen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA probe 2'-0-acetyleres med eddiksyreanhydrid under milde betingelser i et vandig oppløsningsmiddel.

Immunogener for stimulering av antistoffer spesifikke for RNA"DNA hybrider kan innbefatte homopolymere eller heteropolymere polynukleotide duplekser. Blant de mulige, homopolymere dupleksene, er poly(rA)"poly(dT) spesielt foretrukket (Kitagawa og Stollar (1982) Mol. Immunol. 19:413). Generelt foretrekkes imidlertid heteropolymere duplekser som kan fremstilles på en rekke forskjellige måter, innbefattet transkripsjon av ØD174 virion DNA med RNA polymerase (Nakazato (1980) Biochem. 19:2835). De valgte RNA"DNA dupleksene adsorberes på et metylert protein, eller bindes på annenmåte til et konvensjonelt immunogent bærermateriale, som f.eks. bovin serum albumin, og injiseres i det ønskede verts-dyret (se også Stollar (1980) Meth. Enzymol 70:70). Antistoffer til RNA'RNA duplekser kan dyrkes mot dobbeltkjedet RNA fra virus som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer sukkerrørplanter bl.a.

Også homopolymere duplekser som f.eks. poly (ri) "poly(rC) eller poly(rA)"poly(rU), bl.a., kan benyttes til immunisering som beskrevet ovenfor. Videre informasjon angående antistoffer til RNA"DNA og RNA"RNA hybrider er tilveiebragt i U.S. Patentsøknad nr. 616-132, inngitt 1. juni, 1984.

Antistoffer til interkaleringskomplekser kan fremstilles mot et immunogen som vanligvis innbefatter et ionisk

kompleks mellom et kationisk protein eller protein-

derivat (f.eks. metylisk bovint serum albumin) og det anioniske interkalasjons-kjernesyrekomplekset. Ideelt bør interkalatoren være kovalent koblet til den dobbeltkjedede nukleinsyren. Interkalator-kjernesyrekonjugatet kan alternativt være kovalent koblet til et bærerprotein. Nukleinsyredelen av immunogenet kan innbefatte den spesifikke parede sekvensen som finnes i analysehybridet eller kan innbefatte en hvilken som helst annen ønsket sekvens siden spesifisiteten for antistoffet generelt ikke vil avhenge av den spesielle basesekvensen som er involvert. Videre informasjon vedrørende antistoffer til interkaleringskomplekser er tilveiebragt i U.S. Patent-søknda nr. 560.429, inngitt 12. desember, 1983.

Som angitt ovenfor kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, deler av antistoffer, polyfunksjonelle anti-stof f aggregater , eller generelt et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifikke bindingsposisjoner for et antistoff. Når det foreligger i form av hele anti-stoff, kan det tilhøre en hvilken som helst av klassene og underklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks.,

IgG, IgM osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slikt antistoff, som har beholdt spesifikk bindingsaffinitet for den hybridiserte proben, kan også benyttes, f.eks., fragmenter av IgG konvénsjonelt kjent som Fab, F(ab'), og F(ab<*>)2'1 tillegg kan aggregater polymere, derivater og konjugater av immunoglobuliner og fragmenter av disse, benyttes hvor det er hensiktsmessig.

Immunoglobulinkilden for antistoffreagensen kan oppnås ved en hvilken som helst tilgjengelig teknikk, som f.eks. ved konvensjonell antiserum- og monoklonal teknikk. Antiserum kan oppnås ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av dyr, som f.eks. mus, hare, marsvin eller geit, med et egnet immunogen. Immunoglobuliner kan også oppnås ved somatisk cellehybridiseringsteknikk, som resulterer i monoklonale antistoffer, som også innbefatter anvendelse av egnet immunogen.

I de tilfeller hvor det benyttes en antistoffreagens som

er selektiv for interkaleringskomplekser som en av bindings-reagensene, kan et stort antall interkalatorforbindelser anvendes. Generelt kan det sies at interkalatorforbindelsen fortrinnsvis er et plant, vanligvis aromatisk men noen ganger polycyklisk, molekyl med lav molekylvekt som er i stand til binding med dobbeltkjedet nukleinsyrer, f.eks. DNA"DNA, DNA * RNA eller RNA"RNA duplekser, vanligvis, ved inn-føring mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen er vanligvis ikke-kovalent, men kovalent binding finner sted som et andre trinn der hvor interkalatoren har reaktive eller aktiverbare kjemiske grupper som danner kovalente bindinger med nabokjemiske grupper på en eller begge av de interkalerte duplekskjedene. Resultatet av interkaleringen er at når bt>-basepar. spres til ca. det dobbelte av deres normale separasjonsavstanden, dette fører til en økning i molekyl-lengden av dupleksen. Videre må dobbeltspiralen vikles opp ved ca. 12 til 36° for at interkalatoren skal finne plass. Generelle oversikter og videre informasjon kan finnes i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961); Bloomfield et al, "Physical Chemistry of NucleidAGids", kapittel 7, s. 429-476, Harper og Rowe, et al, NY(1974 ); Waring, Nature 219: 1320.(1968); Hartmann et al, Angew. Chem., Engl. Ed. 7:693.(1968); Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211(1978); Wilson, Intercalation chemistry (1982), 445; og Berman

et al, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:87(1981); så vel som den tidligere nevnte U.S. Patent søknad 560.429. Eksempler på interkalatorer er akridinfargestoffer,

f.eks. akridin orange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furokumariner, fenotiaziner, og quinoliner.

Interkalibreringskompleksene dannes i analysemediet under hybridiseririg- ved bruk av en probe som er modifisert i dens komplimentære, enkeltkjedede område og har interkalatoren bundet til dette slik at interkaleringskompleksene dannes ved hybridisering. En hvilken som helst, velegnet fremgangsmåte kan benyttes for å tilveiebringe slik binding. Vanligvis dannes bindingen ved å utføre inter-kalerin.gen med en reaktiv, fortrinnsvis fotoreaktiv interkalator, etterfulgt av bindingsreaksjonen. En spesielt nyttig metode innbefatter azidointerkalatorene. Ved eksponering til ultrafiolett lys mellombølgelengder eller synlig lys, genereres de reaktive nitrenene lett. Nitrenene av arylazider undergår fortrinnsvis innføringsreaksjoner fremfor dannelse av omvandlingsprodukter (se White et al, Methods in Enzymol. 46:644(1977)). Eksempler på azidointer-kalatorer er 3-azidoakridin, 9-azidoakridin, etidium monoazider, etidium diazid, etidium dimer azid

(Mitchell et al, JACS 104:4265.(1982)1 , 4-azido-7-klorokinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige foto-reaktive interkalatorer er furokumariner som danner

(2. + 2) cykloaddisjonsprodukter med pyrimidinrester. Alkyleringsmidler kan også benyttes som f.eks . bis-kloroetylaminer og epoksider eller azirider, f.eks. aflatoksiner, polycykliske hydrokarbon epaksider,

mitomycin j og norfillin A. Den interkalator-modifiserte dupleksen denatureres så slik at den modifiserte enkelt-kjedede proben oppstår.

Med referanse til tegningene og eksemplene som følger,

kan et par spesifikke utførelser av foreliggende analysemetode beskrives.

Fremgangsmåten som illustreres i figur 1, innbefatter en FAD-merket polynukleotid probe som enten er RNA eller DNA når prøvesekvensen av interesse er RNA eller er RNA når prøvesekvensen er DNA. Et anti-hybrid antistoff velges slik at det er spesifikt for RNA<*>RNA eller RNA<*>DNA hybrider, avhengig av hva som foreligger. Ved dannelse av hybrider mellom sekvensen av interesse og den FAD-merkede proben, dannes det bindingsposisjoner for anti-hybridet.

Binding av anti-hybridet til det nå FAD-merkede hybridet

gjør FAD-merket ute av stand til å rekombinere med apoglukose oksydase. Den uhybridiserte eller frie proben innbefatter derimot FAD som er tilgjengelig for rekombina-

sjon slik at det dannes aktiv glukose oksydase som virker på glykose og frigjør hydrogenperoksyd som kan detekteres ved hjelp av kolorimetriske eller fluoriserende inn-

retninger.

I fremgangsmåten vist i figur 2, er proben som i figur 1, bortsett fra at den er merket med et fluoriserende stoff

(F) . Anti-hybrid og anti-fluoriserende stoff tilføres

systemet. I det dannede hybridet hindrer bindingen av

anti-hybrid binding av anti-fluoriserende stoff tri merket som beholder sin evne til . å vf luor.isere lys (hu2) ved I bestråling (hv^). Merket i den uhybridiserte proben er imidlertid tilgjengelig for binding ved anti-fluori-

serende stoff hvilket resulterer i slukking av fluor-

essensen.

Metoden som angis i figur 3, anvender en fluoriserende(F)-merket polynukleotid probe som enten er RNA eller DNA når prøvesekvensen av interesse er RNA, eller er RNA når prøve-sekvensen er DNA. Et anti-stoff som er selektivt for RNA * RNA eller RNA * DNA hybrider, avhengig av hva som foreligger, merkes med en slukkerdel (Q). Det fluoriserende stoffet og slukkeren bringes til en avstand fra hverandre a som er slik at energioverføring i det bundne hybridet kan finne sted, ved bestråling med lys av en første bølge-lengde (hv^) vil derved den emitterte energien (hv2) absorberes av slukkeren og.ikke detekteres. Fluoriserende-merket probe i bulkoppløsningen vil på den annen side befinne seg i en gjennomsnittlig avstand b fra slukkeren, som er for stor til at effektiv energioverføring kan finne sted, og fluoriserende emisjonsobserveres. Mengden av h^-lys som detekteres er invert forbundet med omfantet av hybridiseringen som finner sted.

Forsøksprøvene som skal analyseres kan være et hvilket

som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk-, veterinærmedisinsk-, miljømessig-, ernæringsmessig-, eller industriell betydning. Prøver fra mennesker og dyr, og spesielt legemsvæsker,

kan analyseres ved den foreliggende fremgangsmåten , innbefattet urin, blod (serum eller plasma), melk, foster-vann, cerebrospinal væske, spytt, avføring, lungeaspirater, halsavstrykninger, genital avstryknin gar og eksudater, rektal avstrykninger, og nasopharnygal aspirater.

Når testprøvene som oppnås fra pasienten eller andre kilder inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer,

som f.eks. i celler, behandles prøven slik at nukleinsyrene denatureres, og om nødvendig først slik at nukleinsyrene frigjøres fra cellen. Denaturering av nukleinsyrer utføres fortrinnsvis ved oppvarming i kokende vann eller ved alkalibehandling (f.eks. 0,1 N natrium hydroksyd), etter ønske, disse kan samtidig benyttes for å lyse celler. Frigjøring av nukleinsyrer kan også oppnås ved f.eks. mekanisk sprenging (frysing/opptining, abrasjon, ved hjelp av lydbølger), fysisk/kjemisk sprenging (rensemidler som f.eks. Triton, Tween, natrium dodecylsulfat, alkalibehandling, osmotisk sjokk eller varme), eller enzymatisk lysing (lysozyme, proteinkase K, pepsin). Det resulterende testmedium vil inneholde nukleinsyrer i enkeltkjedet form, som så kan analyseres i følge foreliggende hybridiserings-fremgangsmåte. I de tilfeller hvor RNA"DNA hybrider skal detekteres med merkede antistoffreagenser, kan mRNA og

rRNA i prøven hindres i å delta i bindingsreaksjonene ved konvensjonelle fremgangsmåter som f.eks. behandling under alkaliske betingelser, f.eks. de samme betingelsene som benyttes for å denaturere nukleinsyrene i prøven.

Som kjent kan forskjellige hybridiseringsbetingelser benyttes ved analysen. Hybridiseringen vil typisk:finne sted ved moderat forhøyede temperaturer, f.eks. mellom ca. 35 og 75°C, og vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med egnet ionestykke (f.eks. 5XSSC hvor 1XSSC = 0,15M natriumklorid og 0,015M natriumcitrat, pH 7,0). I tilfeller hvor det ønskes lavere hybridiseringstemperaturer kan hydrogen-bindende reagenser som f.eks. dimetylsulfoksyd og formamid innbefattes. Graden av komplementaritet mellom prøven og probekjedene som kreves for at hybridiseringen skal finne sted avhenger av stringensen for betingelsene. Faktorene som bestemmer stringensen er velkjente.

Normalt vil temperaturbetingelsene som velges for hybridiseringen være inkompatible med bindingen av anti-hybrid reagensen til dannede hybrider og deteksjon av merke-responsen. Følgelig vil anti-hybridbindingstrinnet og merke-detekteringstrinnet følge etter at hybridiserings-trinnet er fullført. Reaksjonsblandingen vil vanligvis bringes til en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, og deretter utføres bindingstrinnet og deteksjons-trinnet. Fortynning av hybridiseringsblandingen før tilsats av antistoffreagenseen er ønskelig når salt- og/eller formamidkonsentrasjonene er høye nok til i betydelig grad

å påvirke antistoffbindingsreaksjonen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. reagentkombinasjon eller innretninger, som innbefatter alle de vesentlige elementene som kreves for å gjennomføre en ønsket analysemetode. Reagenssystemet er tilstede i en kommersielt pakket form, som en sammensetning eller tilsetning hvor kompatabiliteten av reagensene tillater det, i en forsøksinnretningsutførelse, eller vanligvis som en forsøkspakke, dvs. en pakket kombina-sjon av en eller flere beholdere, innretninger eller liknende som inneholder de nødvendige reagenser, og som dessuten vanligvis innbefatter skrevne instruksjoner for utførelsen av analysene. Reagenssystemer i følge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigurasjoner og sammensetninger for utførelse av de forskjellige hybridiseringsformatene som beskrives her.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en merket nukleinsyreprobe som beskrevet, og (2) antistoff-reagensen. En form for forsøkspakkesystem kan i tillegg inneholde hjelpekjemikalier som f.eks. komponenter i hybridiseringsoppløsningen og denatureringsmidler som kan overføre dobbeltkjedede nukleinsyrer i en testprøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis inkluderes et kjemisk lysings- og denatureringsmiddel, f.eks. alkali,

for behandling av prøven slik at enkeltkjedet nukleinsyre frigjøres.

Foreliggende oppfinnelse illustreres, men begrenses ikke,

av følgende eksempler.

Eksempel 1.

Deteksjon av ribosomal RNA fra bakterier ble brukt av en FAD- merket DNA probe.

A. Flavin N -(6-aminoheksyl)adenin dinukleotid ((aminoheksyl)FAD) fremstilles etter fremgangsmåten beskrevet av Morris et al, Anal. Chem. (1981)53:658. Apoglukose oksydase fremstilles som beskrevet av Morris et al,

(1983) Meth. in Enzymol. 92:413. Antistoff til RNA * DNA-hybridet fremstilles som beskrevet av Stuart et al,

(1981) Proe. Nat!l. Acad. Sei. 78:3751. Et 565 basepar fragment av den 16s ribosomale RNA-sekvensen fra E.coli er klonet mellom Hind III posisjonene av en pBR322 vektor (Brosius et al (1978) Proe. Nat<1>1. Acad. Sei. 75:4801) . 5(3-amino)allyldeoksyuridin trifosfat syntetiseres ved fremgangsmåte beskrevet av Langer et al, (1981) Proe. Nat<1>1. Acad. Sei. 78:6633.

B. Fremstilling av merket DNA probe. pBR322 plasmidet som inneholder 565 baseoarfragmenter av 16s ribosomal RNA propageres i É. coli fra HB101 Ree. A og 16s RNA fragmentet skjæres ut ved hjelp av Hind III restriksjons-endonuklease. Fragmentet nick-translateres med 5-(3-amino) allyldeoksyuridin trifosfat ved bruk av<3>H-dATP for å kontrollere inkorporeringen som beskrevet av Langer et al, supra. Denne fremgangsmåten tilveiebringer en dobbelt-kjédet DNA med primære aminogrupper fordelt langs lengden.

Den komplementære DNA kjeden isoleres ved hybridisering

med 16s RNA fra E. coli tilgjengelig for Boehringer Mann-heim Biochemicals, Indianapolis, IN. Den nick-translaterte proben hybridiseres med overskudd av 16s RNA som beskrevet av Casey og Davidson, (1977) Nucl. Acids Ree. 4:1539. Hybridiseringsblandingen fraksjoneres ved likevekt tett-

o

hetsgradient-sentrifugering ved 23 C i 48 timer ved 33.000 rpm i en "SW39" rotor. Cs2S04oppløsningen innstilles til å begynne med på en tetthet av 1,50 g pr. kubikkcentimeter (g/cm ) og ved avslutningen av forsøket har DNA en tetthet på 1,45 g/cm<3>, RNA"DNA har 1,52 og overskuddet av RNA har tetthet 1,6 g/cm . (Bassel, Hagaski og Spigelman, 52:796(1964)).

RNA * DNA samles og RNA kjeden hydirolyseres i 0,1 molar

(M) natrium hydroksyd i seks timer ved romtemperatur. Hydrolyseblandingen innstilles deretter på pH 7,0 med fortynnet eddiksyre og DNA utfelles med kald 80% etanol.

DNA oppløses i 1 M trietylammonium bikarbonat buffer,

pH 9,3, og denne oppløsningen gjøres 3 millimolar (mM)

med dietyladipimidate dihydroklorid og får reagere i fem minutter i romtemperatur. Overskuddet av bifunksjonell bindingsreagens fjernes ved gel-filtrering på

"Sephadex G-50" på kvalitet fin, som er bragt til likevekt med 20 mM natriumkarbonat buffer, pH 9,3 ved 5°C. Kromato-grafien ble avsluttet på mindre enn 15 minutter og . x. effluenten som inneholdt DNA ble straks kombinert med et like stort volum av 1 mM (aminoheksyl) FAD i vann.

Denne reaksjonsblandingen får stå i romtemperatur i

to og en halv time, og deretter fjernes overskuddet av (aminoheksyl)FAD ved gel-filtrering i en kolonne av "Sephadex G-25", av kvaliteten medium, i 0,1 M natriumfosfat buffer, pH 7,0. Reaksjonsproduktene separerer i to gule bånd og det første som vaskes ut samles og benyttes for hybridiseringsanalysen. C. Hybridiseringsanalyse for deteksjon av 16s Ribosomal RNA. Aliquote deler av forskjellige størrelser av en flytende kultur av E. coli ble utmålt i en serie sentrifugerør slik at hvert sentrifugerør inneholdt 10^ til 10 9 celler. Suspensjonene ble sentrifugert med 10.000 x g i 10 minutter og overvannet ble fjernet. Cellene i hvert rør ble suspendert i 20 mikroliter (yl) av 10 milligram pr. milliliter (mg/ml) eggehvitelysozyme (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 10 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 0,1 M NaCl og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre. Lysatene ble ekstrahert med fenol/kloroform ved fremgangsmåten ifølge -Maniatis et al, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor (1982). Polynukletider i ekstraktene utfelles med etanol.

Utfellingen oppløses i 20 ul vann og 80 yl av en

oppløsning bestående av 60% formamid og 40% 0,16 M natrium fosfat buffer, pH 6,5, 1,44 M NaCl og 0,1% (w/v) natrium dodekylsulfat tilsettes. 20 ml av den merkede DNA-proben, 5 ng DNA, i 0,1 M natrium fosfat bulfer, pH 6,5, tilsettes. Reaksjonsrørene forsegles og inkuberes ved 5°C i 18 timer. Deretter åpnes rørene dg 500 yl av antistoff til RNA * DNA-hybrid tilsettes og får reagere i en time ved romtemperatur.

Følgende reagenser benyttes for analysen av glykose-oksydase aktivitet:

Komposittreagens - 92 mM natriumfosfat,

pH 7,0, 0,1% bovin serum albumin, 2 mM 3,5-dikloro-2-hydroksybenzen sulfonat,

0,1 M glukose, 20 mg peroksidase pr. ml.

Apoglukose oksydase reagens - 4 uM apo-

glukose oksydase bindingsposisjoner, 25%

glycerol, 4,0 mM 4-aminoantipyrin, og 0,01% (w/v) natrium azid.

Atter at hybridiseringsreaksjonene er inkubert med antistoffet, tilsettes 1,9 ml av komposittreagenset til hvert rør etterfulgt av 0,1 ml av apoglukose aksydase reagensen. Blandingene inkuberes ved 25°C i 30 minutter, og ved avslutningen av denne perioden bestemmes absorbansene ved 510 nm. Når mengden av bakterierøker vil absorbansene avta på grunn av økende mengder av ribosomal RNA

som er hybridisert til den merkede proben.

Eksempel II.

Hybridiseringsanalyse kontrollert ved fluoressens- slukking.

A. Antistoff til fluorescein dyrkes med en fluorescein bovin serum albumin konjugat (Ullman, (1976) U.S. Patent 3.998.943) .

B. 6-karboksyfluorescein syntetiseres ved

fremgangsmåten beskrevet av Ullman et al, (1976) J. Biol. Chem. 251:41 72 . (Syntesen gir en blandirig av isomerer) . N-hydroksyravsyreimidester fremstilles som beskrevet av Khanna og Ullman (1980) Anal. Biochem. 108-156 for fremstilling av en tilsvarende ester av 4',5'-dimetoksy-6-karbometylfluorescein.

C. Den nick-translaterte proben som inneholder 4-(3-amino )allyldeoksyuridin monofosfat residuet beskrevet 1 eksempel 1, del B, oppløses fra etanolutfellings-

trinnet i 100 mM natrium fosfat buffer, pH 8,0, og gjøres

2 mM med N-hydroksyravsyre imidesteren av 6-karboksymetyl-fluorescein. Denne reaksjonsblandingen får stå over natten og fraksjoneres deretter ved gel-filtrering på "Sephadex G-25", kvalitet medium , bringes til likevekt med 0,1

natrium fosfat buffer pH 8,0. Den første oppøste toppen for eksitering av fluoriserende materialer, 4 90 nanometer (nm), emisjon 520 nm er den fluorescein merkede proben som benyttes for hybridiseringsanalysene.

D. Cellelysatene beskrevet i eksempel I, del C,

kombineres med 80 yl 60% formamid og 40% 0,16 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0, 1,44 M NaCl og 0,1% natriumdodecylsulfat.

20 yl av fluorescein merket probe (5 ng DNA) i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0, tilsettes til hvert ekstraktrør. Rørene lukkes tett igjen og inkuberes ved 55°C i 18 timer. Deretter tilsettes 500 yl av antistoff til RNA * DNA hybrid

til hvert rør som deretter får stå i minst 1 time ved romtemperatur. Konsentrasjonen av antistoffene bestemmes i innledende forsøk for å kunne tilveiebringe stort overskudd sammenliknet med den mengde som kreves for å

binde alle RNA"DNA hybridene som ventes.

Til sist tilsettes 400 yl av antistoff til fluor-

escein og 10 minutter senere registreres fluressensen med 495 nm for eksitering og 519 nm for emisjon. Når antallet bakterier øker, vil mengden av ribosomal RNA

øke, og slukkingen av fluoressensen ved antistoffer til fluorescein vil avta. Følgelig vil fluoressensen øke når antallet bakterier øker.

Eksempel III.

Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus ved bruk av fluoressens energi overføring

A. Fremstilling av en fluorescein-merket probe for cytomegalovirus.

Klonede EcoRI restriksjonsfragmenter av cytomegalovirus

DNA fremstilles som beskrevet av Tamashiro, et al, (1982) Virology 42:547. 1500 baseparfragmenter betegnet

EcoRI e i Tamashiro referansen benyttes for fremstilling

av proben. Fragmentet fjernes fra plasmidet med EcoRI restriksjonsenzym og klones inn i den tilsvarende posisjon på M13 mp8 vektoren (New England Biolabs,

Beverley, MA). Viruset gros i E. coli K12JM101 og

det enkeltkjedede virionet DNA isoleres.

Den virale DNA i 20 mM tris-hydroklorid buffer ,pH 8,0,

som inneholder 10 mM MgCl2rekombineres til et molart overskudd av en 17 baseprimer GTAAAACGACGGCCAGT (New England Biolabs) ved 55°C i 45 minutter (Bankier and Barrell,

(1982) "Rechniques in Nucleic Acid Biochemistry",

Elsevier, Ireland). Denne primeren er komplementær til

et område av M13 mp8 DNA nær 31 —OH enden av EcoRI e — innskuddet. Deretter gjøres reaksjonsblandingen 15 mM

i dATP, dCTP, dGTP, og 5(3-amino)allyl-dUTP.

(Langer et al, supra) og Klenow-fragmentet av DNA polymerase I tilsettes. Reaksjonen inkuberes ved 25°C

i et tidsrom som bestemmes ved innledende forsøk.

For disse forsøkene tas prøver fra reaksjonsblandingen ved forskjellige tider og.elektroforeseres i denaturerende alkalisk agarosegel (Maniatis et al, supra). Reaksjons-tiden optimaliseres slik at man får ny syntetiserte fragmenter som strekker seg minst gjennom EcoRI e - innskuddet, og en viss utstrekning utover innskuddet inn i M13 mp8 sekvensen er akseptabelt for foreliggende anvendelse.

Deretter kobles residiet til DNA proben som interkaleringskomplekser. 8-azidoetidium fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Graves et al, Biochim. Biophys. Acta 479:97(1977). DNA proben fremstilt ovenfor ekstraheres med fenol/ kloroform og utfelles med metanol. Den oppløses i 50 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl og gjøres 0,5 mM med 8-azidoetidium. Blandingen fremstilles i et glass reaksjonskar og neddykkes i et vannbad av glass som holdes ved 20 til 30°C. Fotolysen utføres i en time 10 til 20 cm fra en 150 watts lyskaster..

Ikke-kovalent bundet etidium azid og fotolyse bi-produkter fjernes fra reaksjonsblandingen ved 10 etterfølgende ekstraheringer med n-butanol mettet med vann. Rester av butanol fjernes ved utfelling av DNA med etanol, og DNA oppløses i tris-bufferen. Kovalent-bundet etidium residuer måles spektrofotometrisk ved bruk av ekstinksjonskoeffi-3-1-1

sientene E^q * 4 x 10 ; cm for fotolysert etidium azid ,relasjonen mellom & 260°^A490^or f°to^ysert etidium bundet til DNA (A26Q = (A49Q x 3,4)-0,011) og E260x 10^ M cm for DNA baseparkonsentrasjonen.

8-azidoetidiet bindes kovalent til DNA hovedsakelig i det dobbeltkjedede området hvor interkaleringskomplekser kan dannes. Hensikten er å inkorporere et etidiumrésidium

pr. 20 til 50 basepar. Inkorporeringen kan reduseres ved å redusere fotolysetiden eller redusere 8-azddo-

etidium konsentrasjonen. Forøket inkorporering kan oppnås ved å gjenta fotolysen med ny 8-azidoetidium.

De primære aminogrupper i 5(3-amino)allyl-dUMP residuene

i DNA proben reageres med N-hydroksyravsyreimidester av 6-karboksyfluorescein. Denne reaksjonen gjennomføres som beskrevet i eksempel II, delene B og C ovenfor.

Endelig separeres den fluorescein-merkede/etidium

modifiserte proben fra M13 mp8 sjablonen ved elektro-

forese i alkalisk agarose gel (Maniatis et al, supra).

Siden proben er kortere enn vektor DNA migrerer den

hurtigere og kan gjenutvinnes fra den utskårne agarose-stykket ved elektroeluering.

B. Fremstilling av monoklonal antistoff til

etidium modifisert DNA.

1. Fremstilling av kovalente etidium-DNA komplekser.

Ca. 250 mg av laksesperma DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oppløses i 40 ml av 50 mM NaCl,, og skjæres ved fem passasjer gjennom en nål (23 gauge). Det skårede DNA plasseres i en 250 ml flaske og fortynnes med 160 ml buffer. 145 yl) av S^-nuklease, 200.000 pr. ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ), tilsettes og blandingen inkuberes ved 37°C i 5o minutter.

Deretter ekstraheres ekstraksjonsblandingen to ganger

med fenol/kloroform, en gang med kloroform og DNA ut-

felles to ganger med etanol (Maniatis et al, (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Det endelige utfelte stoffet oppløses i 70 ml av 20 mM tris hydroklorid buffer, pH 8,0.

Dette DNA reageres med 8-azidoetidium under følgende betingelser. Reaksjonsblandingen prepareres med 33 ml 2,7 mg DNA/ml, 13,5 ml av 4,95 mM 8-azidoetidium, 1-5,6 ml av 0,2 M tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl, og 76 ml vann. Blandingen plasseres i et 250 ml beger med en vannmantel som holdes ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 minutter ved hjelp av en 150 watts lyskaster i en avstand av 10 cm. Denne fotolysen gjentas med en identisk reaksjonsblanding.

De fotolyserte reaksjonsblandingene kombineres og ekstraheres 10 ganger med et like stort volum hver gang av n-butanol mettet med 20 mM tris-hydroklorid buffer,

pH 8,0, 0,2 M NaCl. Den ekstraherte DNA oppløsningen kombineres med 23 ml av 4,95 mM 8-azidoetidium og 77 ml av 20 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Denne oppløsningen fotolyseres i 60 minutter som beskrevet ovenfor. Reaksjonsproduktene ekstraheres 10 ganger med buffermettet butano som beskrevet ovenfor, og DNA utfelles med etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 1 mM EDTA og absorbansene ved 260 og 590 nm registreres,

2. Preparering av metylert, tyroglobulin.

100 mg av bovint tyroglobulin (Sigma Chemical Co.) kombineres med 10 ml av vannfri metanol og 400 yl av 2,55 M HC1 i metanol. Denne blandingen omrøres på en rotasjonsblander ved romtemperatur i 5 dager.Utfellingen samles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Det tørkes deretter under vakuum over natten. Det oppnås ca. 82 g av tørt pulver. 3. Fremstilling av etidium-DNA/metylert tyroglobulin-kompleks.

Metylert tyroglobulin (5,5mg) løses i 1,0 ml vann og 1,1 ml av en 2,2 mg/ml etidium-DNA oppløsning tilsettes.

Det dannes straks et bunnfall og suspensjonen fortynnes til 30 ml med 0,15 M NaCl. Denne suspensjonen emulgeres med et like stort volum av Freunds hjelpestoff. 4. Immunisering av mus og fremstilling av monoklonalt antistoff.

BALB/c mus immuniseres med 0,5 mL hver av det emulgerte immunogenet. De gis en ny injeksjon annen hver uke og blodprøver tas 5 til 7 dager etter hver innsprøytning.

Antistofftyper analyseres ved standard enzym-merket immunoabsorberende fremgangsmåter. "Immulon II" mikrotypebrønner belegges med enkeltkjedet DNA, dobbeltkjedet DNA eller det kovalente etidium-DNA interkaleringskomplekset ved å plassere 50 uL av en 5 ug/mL oppløsning i hver brønn. Polynukleotidene er i 0,15 M natriumsitrat buffer, pH 6,8, 0,15 M NaCl. Etter at oppløsningene har stått i brønnen ved romtemperatur i 2 timer, vaskes brønnene med 0,02 M natrium forsfat buffer, pH 7,4, som inneholder 5 mg bovimt serum albumin / mL og 0,5%

Tween 20 rensemiddel (v/v). Egnede fortynninger av antiserum tilsettes brønnene for å gi binding av antistoffene til de immobiliserte polynukleotidene. Det fortynnede antiserum vaskes bort og de bundne antistoffene detekteres med enzym merket antimus IgG ved velkjente fremgangsmåter.

Mus med høye titere til det kovalente etidium-DNA komplekset og svært lave titere til dobbelt- og enkelt- kjedede DNA velges for videre sortering med immobilisert ikke-kovalent etidium DNA kompleks. Dette innbefatter at brønnene belegges med dobbeltkjedet DNA, og innbefatter 0,1 mM etidium bromid i antistoff bindingsoppløsingen og alle etterfølgende reagenser og vaskeoppløsninger bortsett fra reagensen for måling av enzymaktiviteten. Miltceller fra mus med høye titere til ikke-kovalent etidium-DNA komplekser smeltes sammen med myeloma celler slik at det dannes hybridomer (Poirer, et al, Proe.

Nat'1. Acad. Sei., 79:6443 (1982); Galfre og Milstein, Meth. in Enzymol. 73:1 (1981)).

Klonede hybridomer gros intraperitonealt i mus slik at

det dyrkes store mengder av antistoff. Albumin fjernes fra askittvæsken ved kromatografi på "Affigel-

blå harpiks" i likevekt med 10 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, 0,15 M NaCl. Antistoffet passerer direkte gjennom kolonnen og kromatograferes på "DEAE-Sepharose"

ved bruk av lineær gradient av 10 mM tris-hydroklorid buffer, pH 8,0, til denne buffer som inneholder 0,2 M NaCl. Hovedtoppen for det eluerte protein inneholder antistoffet i det vesentlige fritt for andre proteiner.

C. Merking av monoklonalt antistoff til etidium-DNA med 4', 5<1->dimetoksy-6

karboksyfluorescein.

4<1>,5<1->dimetoksy-6-karboksyfluorescein (syntetisert som en blanding med 4 1 , 5 1-dimetoksy-5-karboksyf luorescein isomer" ) overføres til N-hydroksyravsyreesteren som beskrevet av Khanna og Ullman, supra. Dette fargestoffet ble konjugert til antistoffet til etidium-DNA interkaleringskomplekset ved fremgangsmåten beskrevet i referansen.

D. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus.

Urinprøver sentrifugeres ved 3000 rpm i 5 minutter i et "Sorvall FLC-3" instrument for å fjerne celleformet og partikkelformet materiale. Overvæsken kjøres i et poly-allomer ultrasentrifugerør ved 25.000 rpm i en "Beckman Ti50" rotor i 75 minutter.

Pelleten oppløses i 0,1 M NaOH og inkuberes ved 37°C

i 30 minutter.

150 yl av 0,2 M natriumfosfat buffer, pH 6,0, inneholdende 1,8 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat (w/v) og 1 mM EDTA tilsettes. Deretter tilsettes 20 yl av den fluorescein-merkede/etidium modifiserte proben (50 ng) og blandingen inkuberes ved 65°C i 10 timer. Reaksjonsblandingen avkjøles til romtemperatur og 650 yL av 0,1 M tris-hydroklorid buffer ,pH 8,2, som inneholder det merkede antistoff til entidium-DNA interkaleringskomplekset tilsettes. Konsentrasjonen av det merkede antistoffet i denne reagensen er optimalisert i innledende forsøk slik at det oppnås et maksimalt forhold mellom fluoressensslukking og bakgrunn. Reaksjonsblandih<en får stå ved romtemperatur i 1 time.

Deretter registreres fluoressensen for reaksjonsblandingen ved bruk av 495 nm lys for eksitering og 519 nm for emisjon. En urin som ikke er infisert med cytomegalovirus kjøres parallelt og fluoressensen som oppnås med denne kontrollen er høyere enn fluoressensen for prøven med virus. Fluoressensinnholdet vil øke når virusnivået

synker.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for detektering av en spesiell polynukleotid sekvens i en forsøks-prøve som omfatter enkeltkjedede nukleinsyrer, som innbefatter at forsøks-prøven bringes i kontakt med en merket nukleinsyreprobe som omfatter minst en enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær til den basesekvensen som skal detekteres, og bestemmelse av de resulterende hybrider, karakterisert ved at hybridene dannes slik at de har hybridepitoper for en antistoffreagense som ikke i vesentlig grad bindes til enkeltkjedede nukleinsyrer, hvor ethvert hybrid som dannes bringes i kontakt med antistoffreagensen, merket i den merkede proben tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig når den merkede proben er innbefattet i et hybrid som er bundet ved antistoffreagensen sammenliknet med det tilfellet at den ikke er innbefattet i et slikt hybrid, og den detekterbare responsen måles som en funksjon av tilstedeværelsen av sekvensen som skal detekteres i prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 , karakterisert ved at antistoffreagensen er (i) selektiv forbinding til DNA"RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, (ii) selektiv forbinding til RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) selektiv forbinding til interkaleringskomplekser hvor dupleksene som dannes ved analysen innbefatter en nukleinsyre interkalator bundet til denne slik at det dannes interkaleringskomplekser, fortrinnsvis innbefatter den merkede proben interkalatoren kjemisk bundet til proben idet enkeltkjedede komplementære området av proben hvorved interkaleringskompleksene dannes i ■ det resulterende hybridet ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 , karakterisert ved at merket vekselvirker med en reagensbestanddel i merke -deteksjonssystemet slik at den detekterbare responsen tilveiebringes og den detekterbare responsen er målbart forskjellig når den merkede proben er innbefattet i et hybrid som er bundet til antistoffreagensen som liknet med det tilfellet at den ikke er innbefattet i et slikt hybrid på grunn av sterisk hindring mellom bestanndelen av deteksjonssystemet og merket, merket er fortrinnsvis et substrat, kofaktor, eller inhibitor av et enzym som er bestanddel av merkedeteksjonssystemet som merket vekselvirker med slik at det tilveiebringes en detekterbar respons.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proben er merket med et av et første merke og et annet merke og antistoffreagensen er merket med det andre , vekselvirkningen mellom det første og det andre merket tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig når den merkede proben og den merkede anti-stof f reagensen begge er bundet til det samme hybridet sammenliknet med det tilfellet at de ikke er bundet på denne måten.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon som danner et definerbart produkt som er deltaker i en annen kjemisk reaksjon med det andre merket slik at det dannes et produkt som tilveiebringer den detekterbare responsen, det første og andre merket er fortrinnsvis katalysator for henholdsvis den første tfg den andre kjemiske reaksjonen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det første og det andre merket deltar i en vekselvirkning med energioverføring.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forsøksprøven innbefatter en biologisk prøve som har vært utsatt for betingelser som frigjør og denaturerer nukleinsyrene som er tilstede i prøven.

8. Reagenssystem for detektering av spesiell polynukleotid sekvens i en forsøks-prøve, som omfatter en merket nukleinsyreprobe som innbefatter et merke og minst en enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres , karakterisert ved at den i tillegg innbefatter en antistoffreagens som er i stand til binding til hybrider som dannes mellom hvilken som helst av de spesielle polynukleotide sekvenser som skal detekteres i prøven, og den merkede proben, men ute av stand til vesentlig binding til enkeltkjedede nukleinsyrer, merket tilveiebringer en målbar respons som er målbart forskjellig når den merkede proben er innbefattet i et hybrid som er bundet til antistoffreagensen sammenliknet med det tilfellet at den ikke er innbefattet i et slikt system.

9. Reagenssystem ifølge krav 8, karakterisert ved at antistoffreagensen er (i) selektiv for binding til DNA"RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, (ii) selektiv forbinding til RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) selektiv forbinding til interkaleringskomplekser hvor dupleksene som dannes ved analysen innbefatter en nukleinsyre interkalator bundet til denne slik at det dannes interkaleringskomplekser, fortrinnsvis innbefatter den merkede proben interkalatoren kjemisk bundet til proben i det enkeltkjedede komplementære område av proben, hvorved interkaleringskompleksene dannes i det resulterende hybrid, ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres.

10. Reagenssystem ifølge krav 8, karakterisert ved at merket vekselvirker med en reagensbestanddel i merke - deteksjonssystemet slik at den detekterbare responsen tilveiebringes og den detekterbare responsen er målbart forskjellig når den merkede proben er innbefattet i et hybrid som er bundet til antistoffreagensen sammenliknet med det tilfellet at den ikke er innbefattet i et slikt hybrid på grunn av sterisk hindring mellom bestanddelen av deteksjonssystemet og merket, merket er fortrinnsvis et substrat, kofaktor, eller inhibitor av et enzym som er bestanddel av merke-deteksjonssystemet.

11. Reagenssystem ifølge krav 8, karakterisert ved at proben er merket med ett av et første merke og et annet merke og antistoffreagensen er merket med det andre, vekselvirkning mellom det første og det andre merket tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig når den merkede proben og den merkede antistoffreagensen begge er bundet til det samme hybridet sammenliknet med det tilfellet at de .. ikke er bundet på denne måten.

12. Reagenssystem ifølge krav 11, karakterisert ved at det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon som danner et definerbart produkt som er deltaker i en annen kjemisk reaksjon med det andre merket slik at det dannes et produkt som tilveiebringer den detekterbare responsen, det første og det andre merket er fortrinnsvis katalysatorer for henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen.

13. Reagenssystem ifølge krav 11, karakterisert ved at det første og det andre merket deltar i en vekselvirkning med energioverføring.