JPH0192660A - 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット - Google Patents

生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット

Info

Publication number
JPH0192660A
JPH0192660A JP8818481A JP1848188A JPH0192660A JP H0192660 A JPH0192660 A JP H0192660A JP 8818481 A JP8818481 A JP 8818481A JP 1848188 A JP1848188 A JP 1848188A JP H0192660 A JPH0192660 A JP H0192660A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
antibody titer
measuring
tracer
biological fluid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP8818481A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0562301B2 (ja
Inventor
Masahide Kawamura
雅英 川村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon DPC Corp
Original Assignee
Nippon DPC Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon DPC Corp filed Critical Nippon DPC Corp
Priority to JP8818481A priority Critical patent/JPH0192660A/ja
Publication of JPH0192660A publication Critical patent/JPH0192660A/ja
Publication of JPH0562301B2 publication Critical patent/JPH0562301B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、生物学的液体試料中の抗ＤＮＡ抗体価を測定
する方法および測定用キットに関するものである。
「従来の技術」 周知のように、全身性紅斑性狼ｉ（Ｓ　Ｌ　Ｅ　；　Ｓ
ｙ−ｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏ
ｓｕｓ）の診断には、抗核抗体（ＡＮＡ）の検出による
検査法があるが、この検査法には、検出方法の煩雑さや
、ＳＬＥ以外の結合組織疾患においても高率に陽性とな
る、いわゆる”ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ”（診断
において、検査結果か誤って陽性を呈すること）が多く
みられることがあり、鑑別診断には特異性に欠ける問題
がある。
これに対し、ＳＬＥ患者の血中にＤＮＡに対する抗体か
特異的に見出だされるという事実が明らかにされて以来
、抗ＤＮＡ抗体の測定の臨床的意義か高く評価されるよ
うになり、血清または血漿等の生物学的液体中の抗ＤＮ
Ａ抗体価の測定は、ＳＬＥの診断に極めて有用なものと
なっている。
このような抗ＤＮＡ抗体価の測定法としては、赤血球凝
集反応法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ法）がある。
赤血球凝集反応法は、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法に比べ、定量
性に欠けるという欠点があるが、安価なために広く用い
られている。これに対し、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法は定量性
がよく、Ｓ　Ｌ　Ｅ患者の重篤度または回復度とよく相
関するために臨床上極めて有効である。
「発明が解決しようとする課題」 しかし、現在広く用いられているＲＴＡ法による測定用
キットには、下記のような欠点があることが指摘されて
いる。
（イ）従来のＤＮＡ調製法では、平均２０キロベースペ
ア（ｋｂｐ）程度の長さが様々なりＮＡが得られ、これ
らには多くの一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が含まれて
いる。−本鎖ＤＮＡは、血中の補体ＣＩＱと結合する。
このため、従来の測定用キ・ソトでは、ＣＩｑを不活性
化するために、血清を５６°Ｃで３０分間も処理する必
要があるものもある。
このように、従来の測定法および測定用キットでは、使
用する二本鎖ＤＮＡ　トレーサーに一本鎖ＤＮＡか混入
してしまっており、これが測定の特異性を下げる原因と
なっている。
（ロ）抗原とするＤＮＡをヒトＤＮＡまたは牛胸腺ＤＮ
Ａをそのままの形で用いているため、分子量が大きすき
、非特異的結合を起こしゃすくなっている。さらに抗体
価とトレーサー結合量の直線性を悪くしている。
（ハ）二本鎖ＤＮＡに対する特異抗体は、ＳＬＥ患者の
みに見られるものであって、他の動物より得ることはで
きない。ＳＬＥ患者より前記特異抗体を得る場合は、重
篤な患者より多量の血液を供与してもらう必要があり、
倫理的にも、また安定供給の面からも問題が多い。
このように、従来の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の
測定法および測定用キットには、試薬の安定供給が難し
い、測定誤差が大きくなる、等の問題点があり、これら
の問題点を解決することが課題となっている。
「課題を解決するための手段」 上記従来の課題に対し、本願発明者らは鋭意研究を重ね
たところ、次のような知見を得るに至った。
近年、遺伝子組み換え法の劇的な進歩により任意の一定
の長さのＤＮＡを大量に調製することか可能となった。
従来のＤＮＡ調製法では、前記したように、平均２０キ
ロベースペア（ｋｂｐ）程度の長さが様々なりＮＡか得
られ、これらには多（の−本鎖のＤ　Ｎ　Ａ　（ｓｓＤ
　Ｎ　Ａ　）が含まれていた。長い２本鎖ＤＮＡは血中
の非特異的なタンパクと結合することか多く、−本鎖Ｄ
ＮＡは、血中の補体Ｃ■ｑと結合する。このため、従来
の測定用キットでは、Ｃ１ｑを不活性化するために、血
清を５６°Ｃで３０分間も処理する必要があるものもあ
った。
一方、抗体価と、抗体に結合するトレーサー量がよい直
線性を有するためには、トレーサー分子に対し、−分子
のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）か結合することが望ま
しい。この目的のためには、充分に短い長さの二本鎖Ｄ
ＮＡが最もよい。
また、遺伝子組み換え法に付随してＤＮＡの標識法も大
変進歩した。これまでの測定用キットにはＨｅ　ｒ　ａ
細胞に１２Ｊ−デオキシシチヂンを取り込ませるような
ｉｌ　ｖｉｖｏ標識法を用いたものがあるが、このよう
な方法では、純度の高い二本鎖ＤＮＡの調製か難しい。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ標識法としては、ニックトランレーシ
ョン法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる方法、ＤＮ
Ａポリメラーゼ・ラージフラグメント（クレノー酵素）
を用いる方法、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法
、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（Ｔ　ｄＴ　
）を用いる方法等かある。
前記ニックトランスレーション法は、最も比活性の高い
Ｄ’ＮＡを得る良い方法であるが、標識後、二本鎖ＤＮ
Ａ中に多数の一本鎖切断を生じるため、−本鎖ＤＮＡの
混入か起こり、このために、抗ＤＮＡ抗体価の測定には
向かない。
一方、ポリヌクレオチドキナーゼ、クレノー酵素、Ｔ４
−ＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｄＴを用いるようなり
ＮＡの末端のみを標識する方法は、＝８− ニ７クトランレーション法はと高比活性のＤＮＡを得る
ことはてきないか、−本鎖ＤＮＡを生しさせないため、
生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定には合った方法
である。
また、前記したように、抗ＤＮＡ抗体価の測定において
標準物質の設定も大きな問題となっている。これに対し
ては、抗ＤＮＡ抗体であるイムノグロブリンＧが５０％
飽和硫安水溶液中で沈澱するので、この５０％飽和硫安
水溶液で沈澱するＤＮＡ結合性のタンパクが標準物質と
して利用可能である。このようなタンパクとしては、ヒ
ストン、アグルチニン、リゾチーム、リボヌクレアー上
Ａ１トリプシン、キモトリプシン、チトクロームＣ等、
塩基性タンパクが考えられる。しかし、標準物質として
利用できるのは、塩基性タンパクであれば可能であり、
これらに限られる訳ではない。これらの塩基性タンパク
は、ヒト以外の生物から容易、かつ純粋に得ることがで
きるため、標準物質のロット聞誤差を小さくすることが
でき、供給も安定化することが可能となる。
本願発明者らは、上記知見に基づいて本発明をなすに至
ったものである。
本発明においては、まず、大腸菌からプラスミドＤＮＡ
を一本鎖ＤＮＡを含まぬように調製し、これを適当な制
限酵素で切断してトレーサーの材料とした。ここに用い
るプラスミドＤＮＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）より調製したが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉ
ｄａ、　Ｓａｃｃｈａｒａｍ−ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｃｉａｅ等のプラスミドを持つあらゆる生物が利用可能
であり、また、化学的に合成したＤＮＡであってもよい
。ＤＮＡの長さは、０．１〜６゜６Ｋｐｂのものが可能
であった。
さらに、本発明では、このように大腸菌等から調製した
プラスミドを適当な制限酵素で充分に短い長さに切断し
た後、その末端を前記ポリヌクレオチドキナ−七、クレ
ノー酵素、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｄＴ等
の酵素により末端を標識して抗ＤＮＡ抗体価測定用のト
レーサーとした。
また、本発明においては、抗体結合トレーサ−と遊離ト
レーサーの分離には５０％飽和硫酸アンモニウム（硫安
）水溶液を用いている。これは、前記したように、抗Ｄ
ＮＡ抗体であるイムノグロブリンＧが５０％飽和硫安水
溶液中で沈澱することを利用した方法である。この方法
を用いた場合、５０％飽和硫安水溶液で沈澱するＤＮＡ
結合性のタンパクが標準物質として利用可能である。こ
のようなタンパクとしては、ヒストン、アグルチニン、
リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ、）リプシン、キモト
リプシン、チトクロームＣ等、塩基性タンパクが考えら
れるが、塩基性タンパクであれば、これらに限られる訳
ではない。これらのタンパクは、ヒト以外の生物から容
易、かつ純粋に得ることができるため、標準物質のロフ
ト聞誤差を小さくすることができ、供給も安定化するこ
とが可能となる。
次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明する。
「実施例１」 （Ｉ）　　試薬の調製 （ｉ）　　ＤＮＡトレーサーの作製 ■　プラスミドｐＮＤＰＣ］を持ッＥ　ｃｏｌｉＫ　１
２ＪＭ１０９株をＩ−Ｂ培地（１％トリプトン、０５％
酵母エキス、０，５％ＮａＣｆ２）で培養し、通常の方
法でプラスミドを精製する。ｐＮＤＰｃｌの制限酵素地
図は、第１図に示すようである。すなわち、この地図に
示すように、プラスミドｐＮＤＰＣｌは、ｐ　Ｕ　Ｃ１
８（Ｙａｎｉｓｃｈ　Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、
、Ｇｅｎｅ　３３：１０３（１９８５））が部分的にＣ
ｆｒＩにより切断され、その後、そのままＴ　４．−　
Ｄ　Ｎ　Ａリガーセにより結合されてなるものである。
この場合の選択マーカはＡｐ’および１ａｃ−であった
。
■　ｐＮＤＰＣｌを［ＩＯＩＩＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ（！
（ｐＨ８゜５）、７　ｍＭ　Ｍ　９　ＣＱ　ｐ、２０７
１Ｍ　ＮａＣ（！、　７＊Ｍ　　２−メルカプトエタノ
ール、０．０１％牛血清アルブミン］を含む水溶液中で
、制限酵素Ｃｆｒｌにより切断する。
■　このＤＮＡ断片を、［５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ　（ｐＨ７，２）、１．０７１Ｍ　Ｍｇｓ　Ｃ１４，
１ｍＭジチオスレイトール、５００μ９／ＭＱ牛血清ア
ルブミン、ｌｉＭｄＧＴＰ］を含む水溶液中に溶解し、
”５Ｉ　−ｄＣＴ　ＰとＤＮＡポリメラーゼＩ・ラージ
フラグメント（クレノー酵素）を加え、標識を行なう。
■　この反応液をセファデックス０２５カラムにより標
識ＤＮＡを未反応”５Ｉ　−ｄＣＴ　Ｐから分離する。
これを［５０７１Ｍホウ酸ナトリウム、１５ｚＭＥＤＴ
Ａ、０．０１％ＮａＮ５］を含む水溶液に終濃度０．１
μＣｉ／ｍＱとなるように溶解する。これをトレーサー
溶液とする。
（１１）標準溶液の作製 ｌ　ｐ　ｍｏｌｅのＤＮＡに結合するタンパク量を１０
００Ｕと定義した。
牛胸腺ヒストンを［５０ｕＭリン酸カリウム（ｐＨ７゜
４）、０．１５ｍＭ　ＮａＣρ］を含む水溶液に、それ
ぞれ０．３．１０．３０．６０．１０００　／ｍＱとな
るように溶解した。
（ｆｉｔ）　　硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アン
モニウム３９０ｇを１ρの蒸留水に溶解する。
（ｎ）　　測定操作 ＝１２− （ｉ）　　試験管に標準溶液または血清（サンプル）を
２０μｇ入れる。
（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２０１１（！加え、３７
°Ｃ２時間保温する。
（山）硫酸アンモニウム溶液を１１加え、よく混和する
。
（ｉｖ）　　１５００ｇ１５分遠心し、上澄みを吸引除
去する。
（Ｖ）　　井戸型シンチレーションカウンターを用いて
、各試験管の放射能を測定する。
（ｖｌ）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第２図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。
実際に本測定法で測定した値と、従来の抗ＤＮＡ抗体価
測定用キット（アマ−ジャム社製の抗ＤＮＡ抗体価測定
用キット）で測定した値を表１に示す。
（以下、余白） ［表１］ 「実施例２」 （１）　　試薬の調製 （ｉ）　　ＤＮＡ）レーザーの作製 「実施例Ｉ」の（１）の（１）と同様とした。
（１１）標準溶液の作製 赤血球凝集反応法で抗ＤＮＡ抗体価＋＋＋十の患者の血
清をそれぞれ０，６．１２．４５．８７．１７８Ｕ　／
ｒｎＱとなるように馬血清にて希釈し、標準溶液とした
。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アン
モニウム３９０ｇをＩＱの蒸留水に溶解する（前記実施
例１と同様）。
（ＩＩ）　　測定操作 標準溶液を前記（１１）の血清とする以外は「実施例１
」と同様にした。
第３図は、この時の標準曲線を示す。
このようにして実際に本測定法で測定した値と、従来の
抗ＤＮＡ抗体価測定用キット（アマ−ジャム社製の抗Ｄ
ＮＡ抗体価測定用キット）で測定した値を前記同様に表
１に示した。
「実施例３」 この実施例は、１．１ｋｂｐと１．２ｋｂｐのＤＮＡ断
片を１２６１により標識して、これをトレーサーとし、
ＳＬＥ患者血清を標準物質とした例である。
（１）　　試薬の調製 （ｉ）　　ＤＮＡトレーサーの作製 ■　前記実施例１で用いたプラスミドｐＮ　Ｄ　ＰＣｌ
を［１０＊ＭＴｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ８，５）、７ｍ
ＭＭ９ｌ５− Ｃ（！７．７ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．１％
牛血清アルブミン（ｐＨ８，０）］を含む水溶液中で、
制限酵素Ｂａｎ１により切断する。この切断によｌ９ｐ
ＮＤＰＣｌは、１．１ｋｂｐ、　１．２ｋｂｐの２本の
ＤＮＡ断片となる。
■　これらのＤＮＡ断片を、それぞれ［５ｈ＋ＭＴ　ｒ
ｉｓｌ（Ｃ（！（ｐＨ７，２）、ｌ０１１Ｍ　ＭｙＳ　
Ｏ４＋　］　ｍＭジチオスレイトール、５００μｇ／ｍ
Ｑ牛血清アルブミン、１ｍＭ　　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄ
ＡＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ（ｐ　Ｈ７，２）］を含む水
溶液中に溶解し、１２５１−ｄＣＴＰとＤＮＡポリメラ
ーゼＩ・ラージフラグメント（クレノー酵素）を加え、
標識を行なう。
■　これらの反応液をセファデックスＧ２５カラムによ
り標識ＤＮＡを未反応１２５Ｉ　−ｄＣＴ　Ｐから分離
する。これを［５０，ＩＩＭホウ酸ナトリウム、１５肩
Ｍ　　ＥＤＴＡ、　０．０１％Ｎ　ａ　Ｎ　！ｌ　］を
含む水溶液に終濃度０．１μＣｉ／ｍ（！となるように
溶解する。これらをトレーサー溶液とする。
（１１）標準溶液の作製 抗ＤＮＡ抗体価６００Ｕ　／ｍＱのＳＬＥ患者血清を馬
血清に、それぞれ０，５．１０．２５．５０．１００Ｕ
　１ｍ（１となるように溶解した。
（ｉｉｉ　）　　硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸ア
ンモニウム３９０ｇをｌＱの蒸留水に溶解する。
（ｎ）　　測定操作 （ｉ）　　試験管に標準溶液または血清（サンプル）を
２５μｇ入れる。
（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μρ加え、３７°
ｃ２時間保温する。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液を１ｍＱ加え、よ
く混和する。
（ｉｖ）　　１５００１？　１５分遠心し、上澄みを吸
引除去する。
（Ｖ）　　井戸型シンチレーションカウンダ一を用いて
、各試験管の放射能を測定する。
（■ｉ）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第４図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、全領
域のわたって良好な標準曲線が得られる。
「実施例４」 この実施例は、６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を１２５１に
より標識して、これをトレーサーとし、Ｓ　Ｌ　Ｅ患者
の血清を標準物質とした例である。
（１）　　試薬の調製 （ｉ）　　ＤＮＡ１・レーサーの作製 ■　大腸菌由来Ｃｏ１Ｅｌ、Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｃｈａｎ　
Ｐ、Ｔ、ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｄ、　Ｃｈｅｍ、　２
６０８９２５−８９３５．　（１９８５））を［１０Ｒ
Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣＱ、　７　ｍＭ　Ｍ　９ＣＬ、１
０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃρ、７肩Ｍ　２−メルカプトエタノ
ール（Ｔ）８７．３）］を含む水溶液中で、制限酵素Ａ
ｖａ　Ｔにより切断する。この切断によりＤＮＡは、６
．６ｋｂｐの断片となる。
■　このＤＮＡ断片を、［５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ・ＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，２）、１．ＯｍＭ　ＭｉｊＳ　Ｏ４＋　１
７１Ｍジチオスレイトール、５００　μｇ／ｒｎＱ牛血
清アルブミン、１ＭＭｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＡＴＰ、１
ｍＭ　ｄＴＴＰ（＋）８７．２）］を含む水溶液中に溶
解し、１２５１−ｄＣＴ　ＰとＤＮＡポリメラーゼＩ・
ラーンフラグメント（クレノー酵素）を加え、標識を行
なう。
■　この反応液をセファデックスＧ２５カラムにより標
識ＤＮＡを未反応１２５■〜ｄＣＴＰから分離する。こ
れを［５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１５ｚＭＥＤＴＡ、
０．０１％Ｎ　ａＮ　３］を含む水溶液に終濃度Ｏ１μ
Ｃ１／ＭＱとなるように溶解する。これをトレーサー溶
液とする。
（１１）標準溶液の作製 抗ＤＮＡ抗体価６００Ｕ　／ｍＱのＳＬＥ患者血清を馬
血清に、それぞれ０，５．１０．２５．５０．１００Ｕ
　／屑ρとなるように溶解した。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アン
モニウム３９０９を１ρの蒸留水に溶解する。
（ｎ）　　測定操作 （１）試験管に標準溶液または血清（サンプル）を２５
μＱ入れる。
（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μρ加え、３７℃
　２時間保温する。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液を１７１１２加え
、よく混和する。
（ｉｖ）　　１５００ｇ１５分遠心し、上澄みを吸引除
去する。
（ｖ）井戸型シンチレーションカウンターを用いて、各
試験管の放射能を測定する。
（ｖｉ）　　標桑曲線を作製し、血清（サンプル）の抗
ＤＮＡ抗体価を読み取る。第５図は、このようにして得
た抗ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、
抗ＤＮＡ抗体価５００　／ｍＱ以上の領域で標準曲線か
なたらかとなる。
「実施例５」 この実施例は、１４１．３１３．３１５．３６８．４７
５．１３０７．１４４４ｋｂｐのＤＮＡ断片をＩｆｉ５
Ｉにより標識して、これをトレーサーとし、Ｓ　Ｌ　Ｅ
患者血清を標準物質とした例である。
（Ｔ）　　試薬の調製 （ｉ）ＤＮＡ）レーサーの作製 ■　プラスミドｐＢＲ３２２（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　１２５２２５−２４６．　（＋９７８））
を［］ＯｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣρ、ＩＯＲＭ　Ｍ　９
ＣＯ７、ｌｏｏｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃρ、ｌ０１Ｍ２−メル
カブトエタノール（ｐＨ７，３）］を含む水溶液中で、
制限酵素ＴｔｈＨＢ８１により切断する。この切断によ
りＤＮＡは、１４１．３１３．３１５．３６８．４７５
．１３０７．１４４４ｂｐの７本の断片となる。
■　これらのＤＮＡ断片を、［５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣ（！（ｐＨ７，２）、１０７１１Ｍ　Ｍ！？ｓ　Ｏ
４＋　１　ｍＭジチオスレイトール、５００μｇ／ｍρ
牛血清アルブミン、ｌ＊ＭｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＡＴＰ
、１ｍＭ　ｄＴＴＰ（ｐＨ７゜２）］を含む水溶液中に
溶解し、”５１−ｄＣＴ　ＰとＤＮＡポリメラーゼ■・
ラージフラグメント（クレノー酵素）を加え、標識を行
なう。
■　これらの反応液をセファデックスＧ２５カラムによ
り標識ＤＮＡを未反応”５＋−ｄＣＴＰから分離する。
これを［５ｈ＋Ｍホウ酸ナトリウム、１５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　０．０１％Ｎ　ａＮ　３］を含む水溶液に終濃度
０．１μＣ１／ｒｔｒＱとなるように溶解する。これを
トレーサー溶液とする。
（１１）標準溶液の作製 抗ＤＮＡ抗体価６００Ｕ　／ｍＱのＳ　Ｌ　Ｅ患者血清
を馬面ン青に、それそ゛れ０．５．１０．２５．５０．
１００Ｕ／ｚＩ２となるように溶解した。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム水溶液の作製硫酸アン
モニウム３９０ｇを１０．の蒸留水に溶解する。
（ＴＩ）　　測定操作 （１）試験管に標準溶液または血清（サンプル）を２５
μρ入れる。
（ｉｉ）　　トレーサー溶液を２００μρ加え、３７°
０２時間保温する。
（ｉｉｉ）　　硫酸アンモニウム溶液を１１加え、よく
混和する。
（ｉｖ）　　１５００ｇ１５分遠心し、上澄みを吸引除
去する。
（ｖ）井戸型シンチレーンヨンカウンターを用いて、各
試験管の放射能を測定する。
（ｖｌ）標準曲線を作製し、血清（サンプル）の抗ＤＮ
Ａ抗体価を読み取る。第６図は、このようにして得た抗
ＤＮＡ抗体価の標準曲線である。図に見るように、抗Ｄ
ＮＡ抗体価１．ＯＵ／ｍｃ以下の領域で標準曲線かなだ
らかとなる。
「実施例６」 この実施例では、補体ＣＩｑの影響を調べた。
正常者の血清における補体の影響を検討した。
１０例の正常者の血清を、 ■　そのまま（補体が活性を持った状態）、■　５６°
Ｃ３０分処理による非動化後（補体が失活した状態）、
のそれぞれでＤＮＡ　）レーサーへの結合を調べた。Ｄ
ＮＡ　トレーサーは、（ａ）前記実施例３で用いたトレ
ーサー（二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　、トレーサー、ｄｓＤＮＡ
）、（ｂ）前記実施例３のトレーサーを９５°Ｃ１分間
処理した後、水中で急冷することにより作製した一本鎖
ＤＮＡ　）レーサー（ＳＳＤＮＡ）、の２種類を用いた
。
各トレーサーＤＮＡへの結合率（Ｂ／Ｔ）は、（５０％
飽和硫安沈澱中のカウント）／（全カウント）で表した
。これを表２に示した。この表のＢ／Ｔ値は、（Ｍｅａ
ｎ±ＳＤ）値であり、単位は％である。
表から明らかなように、本発明の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤ
　Ｎ　Ａ　）では、補体失活（非動化）の効果は全＜見
うれず、このトレーサーを用いた測定法がＣ１ｑ等の補
体の影響を受けないことがわかる。
一方、−本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）では、非動化前後で
結合率に大きな差が見られ、血清検体中の補体成分が測
定に影響していることが明確に示されている。
［表２］　　Ｂ／Ｔ　（Ｍｅａｎ±ＳＤ）「実施例７」
　臨床的検討 この実施例では、健常者およびＳＬＥを含む種々の疾患
の患者の計２１３例を前記実施例３に述べた方法により
測定した。その結果を第７図に示す。
健常者１．４０例の測定により、正常値を６０／ｍｆ！
以下に設定したところ、活動期ＳＬＥでは９６４％（２
７例７２８例中）、非活動期Ｓ　Ｌ　Ｅでは６２．５％
（３０例７４８例中）、その他の膠原病では４．４％（
２例７４６例−２４＝ 中）が陽性であった。
この結果から本発明の測定方法が臨床的にも極めて良好
な特異性を有していることが明らかである。
「発明の効果」 以上説明したように、本願発明に係る生物学的液体中の
抗ＤＮＡ抗体価の測定法および測定用キットによれば、
試薬の安定供給が容易で、測定誤差が少なく、正確な測
定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の実施例で用いたプラスミドｐＮＤＰＣ
Ｉの制限酵素地図を示すもので、第２図は本発明の第１
の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲線、第３図は本発
明の第２の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲線、第４
図は本発明の第３の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体の標準曲
線、第５図は本発明の第４の実施例で得た抗ＤＮＡ抗体
の標準曲線、第６図は本発明の第５の実施例で得た抗Ｄ
ＮＡ抗体の標準曲線、第７図は本発明の臨床的効果を確
認するために行った第７の実施例の結果を示すもので、
各種疾患における抗１）　Ｎ　Ａ抗体価をプロットした
グラフである。 出願人　　二ノホン・デイ−ピーシ−・コーポレーショ
ン ■　　　の ；−二 〇　　　の −レ

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）抗原とするＤＮＡトレーサーと、このＤＮＡに対
    して結合し得る標準物質とを用い、免疫学的方法により
    生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価を測定する測定法であ
    って、 前記ＤＮＡトレーサーとして遺伝子組換法によって調製
    した一定の長さのＤＮＡを用いることを特徴とする生物
    学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定法。
  2. （２）前記ＤＮＡの標識を放射性物質、酵素、蛍光物質
    、化学的発光物質などの標識物質で行なうことを特徴と
    する請求項１記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の
    測定法。
  3. （３）前記ＤＮＡを標識する際にＤＮＡポリメラーゼ・
    ラージフラグメント（クレノー酵素）、ポリヌクレオチ
    ドキナーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルデ
    オキシトランスフェラーゼ等の酵素を用い、ＤＮＡ分子
    の末端のみを標識することを特徴とする請求項１記載の
    生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定法。
  4. （４）前記標準物質として、ヒストン、アグルーチニン
    、リゾチーム、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモト
    リプシン、チトクロームＣ等の塩基性タンパクを用いる
    ことを特徴とする請求項１記載の生物学的液体中の抗Ｄ
    ＮＡ抗体価の測定法。
  5. （５）抗原とするＤＮＡトレーサーと、このＤＮＡに対
    して結合し得る標準物質とを有し、免疫学的方法により
    生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価を測定するための測定
    用キットであって、 前記ＤＮＡトレーサーとして遺伝子組換法によって調製
    した一定の長さのＤＮＡを用いたことを特徴とする生物
    学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定用キット
  6. （６）前記ＤＮＡの標識を放射性物質、酵素、蛍光物質
    、化学的発光物質などの標識物質で行なったことを特徴
    とする請求項５記載の生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価
    の測定用キット。
  7. （７）前記ＤＮＡを標識する際にＤＮＡポリメラーゼ・
    ラージフラグメント（クレノー酵素）、ポリヌクレオチ
    ドキナーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルデ
    オキシトランスフェラーゼ等の酵素を用い、ＤＮＡ分子
    の末端のみを標識したことを特徴とする請求項５記載の
    生物学的液体中の抗ＤＮＡ抗体価の測定用キット。
  8. （８）前記標準物質として、ヒストン、アグルーチニン
    、リゾチーム、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモト
    リプシン、チトクロームＣ等の塩基性タンパクを用いた
    ことを特徴とする請求項５記載の生物学的液体中の抗Ｄ
    ＮＡ抗体価の測定用キット。
JP8818481A 1987-01-30 1988-01-28 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット Granted JPH0192660A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8818481A JPH0192660A (ja) 1987-01-30 1988-01-28 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1997087 1987-01-30
JP62-19970 1987-01-30
JP8818481A JPH0192660A (ja) 1987-01-30 1988-01-28 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2293502A Division JP2649100B2 (ja) 1990-10-30 1990-10-30 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0192660A true JPH0192660A (ja) 1989-04-11
JPH0562301B2 JPH0562301B2 (ja) 1993-09-08

Family

ID=12014052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8818481A Granted JPH0192660A (ja) 1987-01-30 1988-01-28 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0276984A3 (ja)
JP (1) JPH0192660A (ja)
KR (1) KR880009129A (ja)
CN (1) CN88100541A (ja)
AU (1) AU1070588A (ja)
PT (1) PT86643B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03167473A (ja) * 1989-11-08 1991-07-19 Nippon Dpc Corp 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット
JPH08233813A (ja) * 1995-12-13 1996-09-13 Nippon Dpc Corp ヒト体液中の抗二本鎖ｄｎａ抗体価の測定法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6280944B1 (en) 1994-05-25 2001-08-28 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for pathogenicity of anti-DNA antibodies
US5681700A (en) * 1994-05-25 1997-10-28 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for pathogenicity of anti-DNA antibodies
US5700641A (en) * 1995-03-01 1997-12-23 Salonen; Eeva-Marjatta Diagnostic method, test kit, drug and therapeutic treatment for autoimmune diseases
FI100556B (fi) * 1995-03-01 1997-12-31 Biohit Oyj Menetelmä anti-DNA-vasta-aineiden toteamiseksi, diagnostinen menetelmä , reagenssipakkaus ja lääkeaine autoimmuunisairauksia varten
JP5806816B2 (ja) 2007-12-27 2015-11-10 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 生理学的に許容されるポリマー分子を特異的に検出するための方法および組成物
KR102401369B1 (ko) * 2020-06-02 2022-05-24 경북대학교 산학협력단 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5742632A (en) * 1980-08-29 1982-03-10 Takeshi Sasaki Double-chain dna bonded to d-glutamic acid-d-lysine copolymer, its preparation and medicine containing the same
JPS5856694A (ja) * 1981-09-25 1983-04-04 Mitsui Pharmaceut Inc 抗核抗体測定用試薬
JPS6078349A (ja) * 1983-07-25 1985-05-04 ウイテイカ−　コ−ポレ−シヨン 生ｄｎａに対する抗体の免疫分析の改良方法
JPS60231693A (ja) * 1984-01-16 1985-11-18 アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル 核酸検出用キット
JPS60253869A (ja) * 1984-05-30 1985-12-14 Mitsui Pharmaceut Inc 抗人工核抗原抗体測定用試薬
JPS61195699A (ja) * 1985-02-22 1986-08-29 モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8306426D0 (en) * 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
US4623627A (en) * 1983-08-19 1986-11-18 Cetus Corporation Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5742632A (en) * 1980-08-29 1982-03-10 Takeshi Sasaki Double-chain dna bonded to d-glutamic acid-d-lysine copolymer, its preparation and medicine containing the same
JPS5856694A (ja) * 1981-09-25 1983-04-04 Mitsui Pharmaceut Inc 抗核抗体測定用試薬
JPS6078349A (ja) * 1983-07-25 1985-05-04 ウイテイカ−　コ−ポレ−シヨン 生ｄｎａに対する抗体の免疫分析の改良方法
JPS60231693A (ja) * 1984-01-16 1985-11-18 アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル 核酸検出用キット
JPS60253869A (ja) * 1984-05-30 1985-12-14 Mitsui Pharmaceut Inc 抗人工核抗原抗体測定用試薬
JPS61195699A (ja) * 1985-02-22 1986-08-29 モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03167473A (ja) * 1989-11-08 1991-07-19 Nippon Dpc Corp 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット
JPH08233813A (ja) * 1995-12-13 1996-09-13 Nippon Dpc Corp ヒト体液中の抗二本鎖ｄｎａ抗体価の測定法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0276984A2 (en) 1988-08-03
CN88100541A (zh) 1988-09-14
JPH0562301B2 (ja) 1993-09-08
PT86643A (pt) 1988-02-01
EP0276984A3 (en) 1989-05-03
PT86643B (pt) 1992-01-31
AU1070588A (en) 1988-08-04
KR880009129A (ko) 1988-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4652517A (en) Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities
CN101137758B (zh) 均相分析物检测
EP0147665A1 (en) Nucleic acid probe, test method and reagent system for detecting a polynucleotide sequence and antibody therefor
JPS60144662A (ja) 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系
JPS60100056A (ja) 核酸ハイブリダイゼ−シヨン法による細菌の検出方法
JPH0740960B2 (ja) 核酸検出用キット
JPH05168472A (ja) ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
US10041943B2 (en) Methods of using chimeric receptors to identify autoimmune disease
JPH0192660A (ja) 生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット
WO2022006536A1 (en) Crispr-cas-based detection of sars-cov-2 using recombinase polymerase amplification
JP2000502894A (ja) 均質ｄｎａプローブ滴定検定
EP0146815A2 (en) Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
Hayes et al. Blotting techniques for the study of DNA, RNA, and proteins.
US6033846A (en) Process for dosing of deoxyribonucleic acid found in an extracellular position in a medium
JPH01257266A (ja) クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法
AU746812B2 (en) Method for determining antigens
JP4838478B2 (ja) 自己免疫疾患の診断
JPH03218462A (ja) 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット
JPH08233822A (ja) Ｓｌｅ血清などの体液中における抗二本鎖ｄｎａ抗体の検出プロ−ブ
JPH0291572A (ja) ウァルスｄｎａを用いた生物学的液体中の抗ｄｎａ抗体価の測定法および測定用キット
Maley et al. Studies on identifying the allosteric binding sites of deoxycytidylate deaminase.
US5576186A (en) Diagnosis and monitoring of rheumatological diseases by detection of anti-EF1-α antibodies
JPH08233813A (ja) ヒト体液中の抗二本鎖ｄｎａ抗体価の測定法
US20240182987A1 (en) Compositions and methods for rapid covid-19 detection
JPH0531108B2 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070908

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080908

Year of fee payment: 15

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080908

Year of fee payment: 15