CN88100541A - 应用由重组体DNA技术制备的125—I—dsDNA测定在生物液体中的抗-DNA抗体效价的方法和用于此测定的分析仪器 - Google Patents

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Abstract

在生物学的流体中循环的抗-DNA抗体是应用一种给定千碱基对的、适当限定的125I-dsDNA示踪物以放射分析法测定，并通过重组体DNA技术来制备的，它不含任何88DNA污染物。已经公开了在体外制备这种示踪物的质粒并且也公开了测定抗—DNA抗体的分析参数和整套仪器.

Description

系统性红斑狼疮（SLE）病人的血清中含有可与细胞核的多种组份（包括核酸核蛋白以及双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）的多种结合）反应的自身抗体。有些可与个别的碱基或核苷酸，与鸟嘌呤和缺少胸腺嘧啶脱氧核苷的序列反应，甚至与合成的聚核苷酸（1，2）反应。而且，这些自身抗体还可与脂类抗原复合物〔如心脂和其他的血小板膜磷脂，抗-聚（ADP-核糖）、组蛋白〕反应以及和蛋白多糖，即透明质酸和硫酸软骨素反应。但是，抗体与dsDNA或天然的DNA（nDNA）的反应是这种疾病的血清学上的主要标志，而且已经证明在诊断和监测疾病活动性时其测定dsDNA的能力是特别有帮助的。
已经设计出许多分析方法以检查和半定量在SLE病人体内的dsDNA。用于鉴定这些自身抗体的方法已包括凝胶扩散法（3）、补体结合法（4）、被动皮肤过敏反应法（5）、皂土凝集作用法（6）、血红细胞凝集作用法（7）、放射电泳法（8）、应用3H或125I的放射分析法（9）和酶免疫分析法（10）。
大多数（如果不是全部的话）上述的方法缺乏特异性和灵敏性。在大多数情况下，由于缺乏SEL与其他结缔组织疾病的鉴别诊断的特异性，而得到假阳性结果的报告。
虽然在应用放射分析和酶免疫分析来测定SLE在有关病情程度和严重性方面已表明是合格的。但是，所有这些方法都是应用得自小牛胸腺的nDNA的标记制剂，而这种DNA是由不同长度的高分子量的DNA片段〔平均约含有2万碱基对（20kbp）〕聚合而成的，因此这些制剂也含有不同数量的ssDNA。
虽然在这些制剂中ssDNA污染物与补体Clq结合，但这些20kbp的DNA分子常常非特异地结合到循环的血浆蛋白质上。因此，这些通常用于测定dsDNA（nDNA）抗体的免疫学方法，常常要求在DNA示踪化合物与循环的抗-DNA抗体进行免疫学的反应之前，先将血清或血浆样品在56℃预处理30分钟以钝化补体Clq。
在理想的情况下最好是一个循环的抗-DNA    IgG分子仅与一个或两个给定长度而没有污染物（特别是ssDNA）的标记dsDNA分子相结合。
为此目的，已设计了在体内将125I-脱氧胞苷引入海拉细胞株内而制备标记的dsDNA（特别是用125I-标记的）的技术。但是，由于在这类制剂中通常有ssDNA污染物作为副产品存在，所以这些在体内标记的方法不能产生高纯度的标记dsDNA。
本发明的目的为在免疫学方法中特别是用125I-标记的dsDNA的放射分析中防止上述的缺陷发生。但是其他的标记dsDNA分析也属于本发明的范围。
本发明的目的在于设计一种具有一定长度的适当的限定碱基对的dsDNA分子，而这种制剂是不含有ssDNA的。当应用一个产生探测剂（125-碘（125I）的信号、酶标记物、萤光标记物、化学发光或生物发光标记物）标记时，这种制剂会有一个适当限定的特异活性，而且是稳定的，并且会特异地结合到在SLE血清或血浆中的循环抗-DNA抗体上。
为了达到这一目的，必须构建一个质粒DNA并且是从不含ssDNA的大肠杆菌制备的。用适当的限制性内切酶将质粒切割而产生长度不超过1.5kbp的dsDNA，并用作示踪物物质。在本发明中现在所用的质粒是由大肠杆菌制备的，但是也可以应用生物体例如用枯草杆菌、putida假单胞菌和酿酒酵母所含有的任何其他适合的质粒。其他含于生物体的质粒对本领域中有经验的人来说都是明了的。此外，化学合成的dsDNA也可以用来完成本发明的目的。
现在应用下面的实例对本发明作详细的说明：
实例1
质粒DNA、pNDPC1的制备。
图1 表示用于本发明实例中的质粒DNA、pNDPC1的限制性内切酶图。质粒pNDPC1的构建如下：用Cfr Ⅰ部份地消化pUC 18（Yanisch-Perron，C.等人，Gene 33：103（1985）），然后用在图1中所示的T4-DNA连接酶使其自身连接。选择性的标记物的APr和Lac-。
用标准的实验方法将带有2431碱基对的pNDPC    1    插入大肠杆菌K12    Jm109中并在一种LB培养基（1%胰蛋白，0.5%酵母萃取液，0.5%NaCl）中培养杆菌。然后用通常的方法纯化质粒。
在含有10mM的Tris    HCl缓冲液pH8.5和含有7mM氯化镁、20mM氯化钠和7mM    2-巯基乙醇的水溶液中，用限制性内切酶Cfr    Ⅰ或Ban    Ⅰ切割pNDPC    1。在应用含有1.1和1.2kbp的Ban    Ⅰ得到dsDNA的同时，也得到应用含有0.9和1.4kbp    Cfr    Ⅰ而得到的dsDNA。
实例2
从上文实例1所得的dsDNA的碘化作用
在体外用于包括断口平移、聚核苷酸激酶，DNA聚合酶大片段（Klenow酶）、T4-DNA聚合酶和终端的脱氧转移酶（TdT）在内的标记重组体DNA分子的碘化作用法。
断口平移法得到了极高的特异活性，但是某些标记的dsDNA似乎断裂成ssDNA，因此不适用于本发明的目的。另一方面，应用多核苷酸激酶、Klenow酶、T4-DNA聚合酶或DNA末端被标记了的TdT的碘化作用法，产生了示踪物，其活性与断口平移法相比较虽属中等活性，但却是没有ssDNA片段。因此这类方法是用于本发明的优选的碘化作用法或标记法，但不应认为对本发明有任何程度的限制性。其他的标记法对于本领域有经验的技术人员来说是明了的。
将从上文中实例1得到的dsDNA（1.1至1.2kbp）溶于含有50mM Tris HCl缓冲液（pH7.2）并含有10mM硫酸镁、1mM二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白的水溶液中，再加入dGTP、dATP和dTTP各1mM和1mCi的125I-dCTP和25单位T4-DNA聚合物Ⅰ大片段（Klenow酶），使反应在室温进行30分钟。
将碘化的DNA在含有3.1ml    3M醋酸钠（pH5.2）的99.5%乙醇（0.1∶3）中于-80℃沉淀30分钟，然后以15，000rpm离心使之进一步纯化。弃去上清液并将沉淀溶于1ml    10mM    Tris、1mM    EDTA和10mM    NaCl缓冲液（pH7.5），并用如上的含有3M醋酸钠（pH5.2）的99.5%的乙醇再沉淀。再弃去上清液并用70%乙醇洗涤沉淀后干燥之。
将碘化的DNA再悬浮于50mM硼酸钠、15mM    EDTA和0.01%叠氮化钠中，因此最终浓度为0.1    μCi/ml。所得到的溶液用作具有0.3μci/p    mol特异活性的示踪物。
实例3
循环的抗-DNA抗体的分析方法
已经制备好给定碱基对数目和特异活性、可以特定地结合到循环的抗-DNA免疫球蛋白上的适当限定的125I-dsDNA标记，从而形成了用于测定在血清样品中抗-DNA抗体滴定度的一种完善的方法的基础。
下面的放射分析法是本发明的优选的实施例，但是并没有限制性的含意：
从患SLE的病人血清制备抗-DNA校准液，并以无任何抗-DNA抗体的正常人血清来系列地稀释。用英国Amersham的Amersham公司生产的另外的放射分析来作为校准液的基准。校准液被规定为任选的单位ml/ml（u/ml）。
用上述的方法来稀释125I-标记的dsDNA以得到75，000cpm/200μl的体积。
用移液吸管取校准液和样品各25μl放入12支175mm的试管中，在每个试管中加入200μl125I-dsDNA示踪物。在37℃保温2小时后，加入1.0ml50%的硫酸铵水溶液，以使结合了示踪物的免疫球蛋白与游离的未结合的示踪物分离。以每克2000转的速度离心15分钟，轻轻倾倒出各试管中的上清液使结合部份与游离的部份分离。计算出沉淀量并读出病人样品的浓度，在校准曲线上，病人样品中的结合数量与抗-DNA滴定度的活性单位成正比。
实例4
补体Clq的效应
在对正常的样品于56℃加热处理30分钟以钝化补体Clq的前后，应用两个示踪物以本发明的方法分析正常的样品。示踪物1是得自上述实例2的125I-dsDNA并且是本发明优选的具体体现。示踪物125I-ssDNA是用下述方法制备的：
将得自上述实例1的重组体dsDNA（1.1至1.2kbp）浓缩物在95℃加热一分钟，如上文实例2所述，在用125I进行碘化作用之前使其在冰中冷却至室温。然后将所得到的碘化单链DNA（125I-ssDNA）用示踪物缓冲液稀释并用于分析中。
由此试验所得到的结果综合如下
示踪物 1.125I-dsDNA 2.125I-ssDNA
（B/T）    （B/T）
平均±SD    平均±SD
样品（N＝10）
未处理    4.5±0.3    36.7±2.2
已处理（56℃，30分钟）    4.4±0.3    21.2±6.7
这些结果清楚地显示双链DNA示踪物，示踪物1，125I-dsDNA不受存在于病人血清中的补体所影响。另一方面，单链DNA示踪物，示踪物2，125I-ssDNA则大体上受在病人血清中的补体所影响。再者，主要由于示踪物对其他循环蛋白质有较高的非特异性结合，即使在补体的钝化后，125I-ssDNA亦给出了虚假的高结果。
实例5
期望值和结果的解释
用上文实例3所述的方法分析得自正常人的、具有活动的和不活动的系统性红斑狼疮病（SLE）病人的和具有各种其他的结缔组织障碍病人的全部213个血清样品。在图2中用图解法表示了分析的结果。
健康状况    n
正常成人    91
活动性的SLE    28
不活动性的SLE    48
类风湿性关节炎    12
硬皮病    5
多肌炎-皮肤肌炎    2
斯耶格伦氏综合症    15
混合的结缔组织病    6
贝切特氏病    6
用本发明的方法测定结果为：所有91个受试的正常人其抗-DNA结果低于6u/ml，然而所有28个患有活动性SLE的病人除了一个之外（占96.4%）其结果为20u/ml或高于此数。一个患有活动性SLE的病人其抗-DNA水平为5.7u/ml。另外，在48个患有非活动性SLE的病人中有30人（占62.5%）其测定结果为高于6u/ml。
至于46个患结缔组织障碍的病人中除患SLE之外只有两人（占4.4%）其抗-DNA水平高于6u/ml。
判定水平规定在大约正常数值的上限因而可将在这个群体中活动性的SLE敏感性扩大到最大限度，同时将患SLE以外的障碍症病人中阳性结果的数目减至最少。
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Claims (8)

1、应用没有ssDNA片段的dsDNA标记以免疫学的方法测定在生物学的流体中的抗-DNA抗体滴定度的一种方法，其中的没有ssDNA片段的dsDNA标记，其中的dsDNA标记是用重组体DNA技术制备的，它具有适当限定kbp的恒定长度和给定的特异活性，而这种标记的dsDNA作为示踪物而用于所说的免疫学方法中。
2、一种根据权利要求1测定在生物学的流体中抗-DNA抗体滴定度的方法，其中这种标记的dsDNA具有1.1至1.2kbp的恒定长度但是可以有约0.2至3.0kbp的长度变化。
3、一种根据权利要求1测定在生物学的流体中抗-DNA抗体滴定度的方法，其中所说的dsDNA标记是应用一种酶如DNA聚合酶大片断（klenow酶），聚核苷酸激酶，T4-DNA聚合酶，或终端脱氧转移酶仅仅在该dsDNA终端标记的。
4、一种根据权利要求1测定在生物学的流体中抗-DNA抗体滴定度的方法，其中所说的dsDNA是用一种放射活性物质，一种萤光物质，一种化学发光物质或生物发光物质标记的。
5、一套应用没有ssDNA片段的dsDNA标记以免疫学的方法测定在生物学的流体中的抗-DNA抗体滴定度的分析仪器，其中dsDNA标记是用重组体DNA技术制备的并具有适当限定kbp的恒定长度和给定的特异活性，而这种标记的dsDNA在所说的免疫学的方法中是作为示踪物应用的。
6、一套根据权利要求5测定在生物学的流体中抗-DNA抗体的分析仪器，其中这种标记的dsDNA具有1.1至1.2kbp的恒定长度但是可以有约0.2至0.3kbp的长度变化。
7、一套根据权利要求5测定在生物学的流体中的抗-DNA抗体滴定度的分析仪器，其中所说的dsDNA标记是应用一种酶例如DNA聚合酶大片段（Klenow酶），聚核苷酸激酶，T4-DNA聚合酶，或终端脱氧转移酶仅仅在该dsDNA的终端标记的。
8、一套根据权利要求5测定在生物学的流体中抗-DNA抗体滴定度的仪器，其中的标记是一种放射活性物质、一种酶、一种萤光物质、一种化学发光物质或生物发光物质。
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