FI102296B - Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybridisaatiot ekniikalla - Google Patents

Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybridisaatiot ekniikalla Download PDF

Info

Publication number
FI102296B
FI102296B FI920552A FI920552A FI102296B FI 102296 B FI102296 B FI 102296B FI 920552 A FI920552 A FI 920552A FI 920552 A FI920552 A FI 920552A FI 102296 B FI102296 B FI 102296B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sequence
dna
probe
target
following sequence
Prior art date
Application number
FI920552A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI920552A0 (fi
FI102296B1 (fi
Inventor
Philippe Cros
Patrice Allibert
Francois Mallet
Claude Mabilat
Bernard Mandrand
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9397483&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI102296(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Publication of FI920552A0 publication Critical patent/FI920552A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI102296B publication Critical patent/FI102296B/fi
Publication of FI102296B1 publication Critical patent/FI102296B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Inert Electrodes (AREA)
  • Current-Collector Devices For Electrically Propelled Vehicles (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

102296
Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybrid isaatiotekniikai la Förfarande för detektering av en nukleotidsekvens med sand-wich-hybridisat ionsteknik 5 Tämän keksinnön kohteena on menetelmä yksisäikeisen nukleo-tidisekvenssin detektoimiseksi näytteestä, joka sisältää tai voi sisältää sen, sandwich-hybridisaatiotekniikalla. Tätä 10 menetelmää voidaan käyttää infektio- tai geneettisten sairauksien diagnosoimiseen sekä solujen tyypittämiseen.
Tiedetään, että eräs nukleiinihappojen leimallisista ominaisuuksista on niiden mahdollisuus olla vuorovaikutuksessa 15 vastinsekvenssin kanssa vetysidoksien välityksellä ja muodostaa siten pysyvä hybridi pariutumissääntöjen A-T ja G-C mukaisest i.
Nukleiinihappoa voidaan siis käyttää koettimena osoittamaan 20 jostakin näytteestä nukleiinihapposekvenssi (jota nimitetään "kohteeksi"), joka sisältää koettimen sekvenssin vastinsek-venssin. Kohteen ja koettimen välille muodostuvan hybridin leimaaminen mahdollistaa kohteen detektoimisen ja paljouden i määrittämisen. Tätä tekniikkaa on käyttänyt Southern E.M.
\ ' 25 DNA-fragmenttien analysoimiseen geelielektroforeesi1 la suo- J ritetun erotuksen jälkeen: J. Mol. Biol 98, 503 (1975).
»·· ·
• M
* · 4 « • . Eräässä tämän tekniikan muunnelmassa, jonka etuna on erityi- • 4 ( sesti se, että kohteen sisältävää näytettä ei tarvitse puh- t i * ·’ ’ 30 distaa, käytetään niin sanottua "sandwich"-menettelyä. En simmäistä kiinteälle kantajalle kiinnitettyä nukleotidikoe- • · « 4 « *. *: tinta (ki inni t inkoet intä) käytetään sieppaamaan näytteestä 4 4 4 V * detektoitava geeni tai geeni fragmentti. Toisen koettimen /. : (detektorikoettimen), joka on komplementaarinen kohteen joi- k · · · 35 lekin toiselle alueelle, avulla voidaan suorittaa detektoin- * · ' • i *!’ ti jonkin merkintäaineen, kuten jonkin radioaktiivisen ai-
I I I
·...· neen, avulla; katso esimerkiksi Dunn, A.R. ja Hassel, J.A., ί".: Cell, 12, 23 (1977); Ranki, M. ym., Gene, 21 , 77 (1983); 2 102296
Palva, A. ym., FEMS Microbiol. Lett. 23, 83 (1984); Polsky-Cynkin, R. ym., Clin. Chem., 31, 1438 (1985).
Sandwich-hybridisaatiomenetelmä voidaan suorittaa lisäämällä 5 analysoitava näyte ja detektorikoetin yhdessä vaiheessa astiaan, jossa kiinnitinkoetin on kiinnitettynä kantajaan. Tässä tapauksessa kysymyksessä on niin sanottu "simultaani"-sandwich-hybridisaatiomenetelmä; katso esimerkiksi jo mainittuja Rankin ym., Palvan ym., Polsky-Cynkinin ym. artikkeli) leita.
Sandwich-hybridisaatiotekniikka voidaan suorittaa myös kahdessa vaiheessa; katso esimerkiksi Langdale, J.A. ym., Gene, 36, 201 (1985) ja Zolg, J.W. ym., Mol. Biochem. Parasitol, 15 22, 145 (1987).
Jotta näitä hybridisaatiotekniikoita voitaisiin käyttää rutiinikokeissa, on detektorikoettimen radioaktiivinen leimaus jätettävä pois. Tähän tarkoitukseen on ehdotettu erilaisia 20 systeemejä, joissa käytetään esimerkiksi jotakin jonkin vasta-aineen tai jonkin samankaltaisen proteiinin tunnistamaa hapteenia. Erityisesti on ehdotettu erilaisia DNArn tai RNA:n biotiinilla tai sen johdoksilla leimaamismenetelmiä; katso etenkin EP-patenttijulkaisut 0285057, 0285058, 0286898 25 ja 0097373; Forster ym., Nucleic Acid Res., 13, 745 (1985); . . Chollet A. ja Kawashima, E.H., Nucleic Acid Res. 13, 1529 *.·; (1985); Chin, B.C. ym., Nucleic Acid Res., 1 1, 6513 (1983),
Cocuzza, A.J., Tetrahedron Lett. 30, 6287 (1989). Detektio- « · · r menetelmät, joissa käytetään ei-radioakt i i visi a leimausme- I·· I 30 netelmiä, eivät kuitenkaan ole vielä riittävän herkkiä; kat-• · so esimerkiksi Zolg ym., mainittu artikkeli.
• · · . . Lisäksi perinnöllisten sairauksien diagnosoiminen, solujen tyypittäminen ja jopa tietyissä tapauksissa mutanttivirusten • · · ’·] 35 tunnistaminen edellyttävät pistemutaatioiden detektoimista genomissa. Tällaisissa tapauksissa tarpeeksi herkkien kiin- • · nit inkoett imien kehittäminen pistemutaat ion detektoimiseksi kohteen kiinnitinkoettimen sekvenssin vastinaluee11 a on vai- • · « · 3 102296 keaa. Tällä hetkellä kaupan olevat tämäntyyppisen detektion toteuttamiseen tarkoitetut koetinsysteemit eivät ole kovinkaan käytännöllisiä, sillä kutakin kaupallista systeemiä on käytettävä jossakin annetussa lämpötilassa, joka vaihtelee 5 käytetystä systeemistä riippuen, mikä estää tekemästä erilaisia määrityksiä automaattilaitteilla, jotka toimivat yhdessä ainoassa lämpötilassa.
Tämän keksinnön kohteena on sandwich-hybridisaatiotekniikalla 10 tapahtuva nukleiinihapposekvenssien detektiomenetelmä, joka on riittävän herkkä, jotta siinä voidaan käyttää ei-radioaktiivista detektorikoetinta. Tämän tekee mahdolliseksi se, että siinä käytetään kooltaan erittäin lyhyitä kiinnitinkoetti-mia, joiden on havaittu antavan sandwich-testille erittäin 15 suuren spesifisyyden hyvän herkkyyden samalla säilyessä, ja se, että niillä voidaan detektoida ja erotella yhden nukleotidin tarkkuudella homologisia sekvenssejä. Kooltaan lyhyiden oligonukleotidien käyttäminen helpottaa koettimien rakentamista suurina määrinä hyväksyttävällä saannolla ja mahdollis-20 taa erittäin suuren selektiivisyyden. Tämä on erityisen hyö-: dyllistä HLA-tyypityksessä, jossa solutyypin määrittävät mu- : taatiot paikallistuvat lyhyisiin osiin geeniä.
Lisäksi on havaittu, että kooltaan erittäin lyhyitä oligo- ’;··* 25 nukleotidikoettimia (11 nukleotidin minimimäärään saakka) "· ’· voidaan adsorboida passiivisesti suoraan johonkin polymee- • · · *.· · rikantajaan, kuten polystyreeniin, sekä kiinnittää passiivi sesti vielä lyhyempiä koettimia (aina 9 nukleotidin minimi-määrään saakka) proteiinin välityksellä, johon koetin sitou-30 tuu kovalenttisesti. Kysymyksessä on yllättävä tulos, koska tähän asti on kiinnitinkoettimina käytetty yleensä sekvens- ·..** sejä, jotka käsittävät yli 100 emästä (yleensä useita satoja • ♦ *··♦* emäksiä), tai 30-100 nukleotidin sekvenssejä, jotka sitoutu- vat kovalenttisesti kiinteään kantajaan (WO-patenttihakemus ·:·· 35 88/01302), ja myös koska oligonukleotidisekvenssit (dT) 15 ei vät kiinnity passiivisesti (toisin sanoen adsorboitumalla) polystyreeniin; katso Lacy, M.J. ja Voss, E.W., J. of Immunol. Methods, 116, 87-98 (1989). Toiset kirjoittajat ovat yrittäneet edistää kiinnitinkoettimen kiinnittymistä kylläs- 4 102296 tämällä polystyreenikantaja poly(dT) 400ο: 11a ja kytkemällä kiinnitinkoetin, joka käsittää useita kymmeniä emäksiä, poly (dA) - "häntään" , joka käsittää 30:stä yli l00:aan toistuvaa yksikköä; katso Morrissey, D.V. ja Collins, M.L., Molecular 5 and Cellular Probes, 3, 189-207 (1989). Hakijan kokemuksen mukaan kiinteän kantajan kyllästäminen poly(dT):llä ei paranna detektointia.
Lisäksi sen ansiosta, että keksinnön mukaisessa menetelmässä 10 käytetään lyhyitä koettimia, jotka tuovat mukanaan suuremman herkkyyden, saadaan mahdollisuus valita mielensä mukaan ennalta määrätty työskentelylämpötila ja rakentaa kussakin tapauksessa sopivan pituisia koettimia mitä erilaisimpien kohteiden määrittämiseksi samassa ennalta määrätyssä työskente-15 lylämpötilassa. On helppo ymmärtää menettelytavan yksinkertaistuminen ja siitä seuraavat automaatiomahdollisuudet.
Tämä keksintö koskee siis menetelmää yksisäikeisen nukleoti-disekvenssin detektoimiseksi näytteestä, joka sisältää sen 20 tai saattaa sisältää sen, sandwich-hybridisaatiotekniikalla :\· kiinnitinkoettimella, joka kiinnittynyt passiivisesti johon- : .·. kin kiinteään kantajaan, ja detektorikoettimella, joka on leimattu jollakin ei-radioaktiivisella merkintäaineella, ja • · « ]!!.' jotka kiinnitinkoetin ja detektorikoetin voivat hydridisoitua 25 vastaavasti etsityn kohdenukleotidisekvenssin kahden ei pääl-''"'J lekkäin menevän alueen kanssa, ja joka menetelmä on tunnettu • t · ’·* * siitä, että kiinnitinkoetin, joka sisältää 9-30 nukleotidiä, varsinkin 9-25 nukleotidiä ja erityisesti 9-20 nukleotidiä, on kiinnittynyt passiivisesti mainittuun kiinteään kantajaan, . 30 joka on jotakin hydrofobista materiaalia.
• · • · : ** Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa- » · · tenttivaatimuksissa.
f 35 Kun kiinnitinkoetin käsittää vähintään 11 nukleotidiä, on yleensä mahdollista kiinnittää se ei-spesifisesti (toisin sanoen adsorption avulla) kantajaan, joka on yleensä jotakin hydrofobista polymeeriä, kuten polystyreeniä tai jotakin styreeniperustaista kopolymeeriä, etenkin jotakin butadi-40 eeni/styreenikopolymeeriä tai vastaavaa. Styreenikopolymee- 5 102296 reistä mainittakoon sellaiset, jotka sisältävät vähintään 10 paino-% styreeniyksikköjä, ja erityisesti sellaiset, jotka sisältävät vähintään 30 paino-% styreeniyksikköjä. Aine, joka muodostaa keksinnön mukaan käytetyn kiinteän kantajan, 5 voi lisäksi muodostua polystyreeni- ja/tai styreenikopoly-meeeriseoksesta (erityisesti butadieeni/styreeni) jonkin muun polymeerin kanssa, jolla voidaan erityisesti parantaa kiinteän kantajan ominaisuuksia (mekaanisia, läpinäkyvyys-, jne. -ominaisuuksia). Mainittu toinen polymeeri on esimer-10 kiksi jokin styreeni/akryylinitrii1ipolymeeri, styreeni/me-tyylimetakry1aattipolymeeeri, jokin polypropeeni, jokin po-lykarbonaatti tai vastaava. Kiinteän kantajan muodostavien polymeerien seos sisältää tällöin vähintään 10 paino-% ja suositeltavimmin vähintään 30 paino-% styreeniyksikköjä.
15 Kiinteänä kantajana voidaan käyttää kartiomaista kantajaa, jota myy VITEK (USA) ja joka on valmistettu butadieeni/sty-reenikopolymeerimateriaalista, jollaista myydään kauppanimellä K-Resin.
20 On myös mahdollista, ja kun kiinnitinkoetin on erittäin lyhyt (erityisesti vähemmän kuin 11 nukleotidiä), on jopa välttämätöntä käyttää aineita, joilla saadaan parannetuksi kiinnitinkoettimen kiinnittymistä kiinteään kantajaan. Kuten edellä mainittiin, kiinnitinkoetin voidaan esimerkiksi liit-25 tää kovalenttisesti sinänsä tunnetuilla menetelmillä johon- • · kin proteiiniin, joka itse kiinnittyy passiivisesti kanta- • · · ♦ϊ ί jaan (joka on valmistettu jo mainituista aineista). Proteii- • ♦ · ni, joka edistää ki innit inkoett imen kiinnittymistä, ei tie- « « · i'"' tenkään saa häiritä detektiota; esimerkiksi kun detektori- • · : ·.: 30 koetin leimataan jollakin entsyymillä, kiinteään kantajaan « · ·*·*; kiinnitetyllä proteiinilla ei saa olla häiritsevää entsy- maattista aktiivisuutta. Proteiineista, joita voidaan käyt-.·. : tää ki innit inkoett imen epäsuoraan kiinnittämiseen kiinteään kantajaan, voidaan mainita nisäkkäiden albumiini (esimerkik-35 si hoviinialbumiini) tai jokin bakteeriperäinen proteiini- * * toksiini, kuten tetanustoksiini. Suositeltavimmin valitaan jokin proteiini ja/tai kytkentämenetelmä, jolla on mahdol- 6 102296 lista kiinnittää yksi tai kaksi kiinnitinkoetinmolekyy1iä yhtä proteiinimolekyyliä kohti.
Oiigonukleotidin ja proteiinin välinen sidonta voidaan suo-5 rittaa esimerkiksi jonkin 3-12 hiiliatomia sisältävän alky-leenihaaran välityksellä, joka voidaan lisätä kiinnitinkoet-timen muodostavan oiigonukleotidin 5'-päähän automaattisen synteesin aikana. Tässä haarassa on funktionaalinen primaarinen amiiniryhmä, joka aktivoinnin jälkeen homobifunktio-10 naalisen kytkentäaineen, kuten DITC:n (fenyleeni-1,4-di-isosyanaatin), DSStn (disukkiini-imidyy1isuberaatin) tai DIBS:n (4,4'-di - isot iosyanost ilbeeni-2,2'-disulfonihapon), ansiosta mahdollistaa ymppäytymisen albumiinin lysiinien funktionaalisiin NH^ryhmiin. Konjugaatti puhdistetaan suuren 15 erotuskyvyn nestekromatografiai 1 a ioninvaihtokolonnissa. On todettu, että kiinnitinkoettimen passiivinen kiinnittäminen jonkin proteiinin välityksellä, kuten edellä mainittiin, on erittäin edullista, varsinkin kun sillä saadaan tuloksia, joiden toistettavuusaste on erittäin korkea.
20
Itse detektorikoetin voi olla lyhyt koetin, joka sisältää 9-30 nukleotidiä. Halutun spesifisyyden takaamiseksi detek- torikoetin sisältää kuitenkin suositeltavimmin vähintään 15 nukleotidiä, esimerkiksi 15-30 nukleotidiä, kun kiinni- 25 tinkoetin on hyvin lyhyt ja sisältää erityisesti vähemmän . . kuin 15 nukleotidiä. Detektorikoetin kytketään kovalent- • » tisidoksella johonkin ei-radioaktiiviseen merkintäaineeseen, ! :*: esimerkiksi johonkin entsyymiin. Kovalentt isidos saadaan ai- • · · · ;*"· kaan tunnetuilla menetelmillä, erityisesti edellä kiinnitin- ··» : 30 koettimen muodostaman oiigonukleotidin ja jonkin proteiinin • · ,···, välisen kytkennän yhteydessä kuvatulla menetelmällä. Entsy- « · « maattisena merkintäaineena voidaan käyttää etenkin jotakin . . peroksidaasia, kuten raifortperoksidaasia, jotakin alkalista y · · fosfataasia, hapanta fosfataasia, beta-galaktosidaasia, glu- • · · *·* ' 35 koosioksidaasia, jne.
• · • · · « ·
Jotta kiinnitinkoetin ja detektorikoetin voidaan rakentaa, täytyy tietysti tuntea kohteen sekvenssi tai osa sen sek- • · 7 102296 venssistä tai tuntea kohteen koodittaman proteiinin sekvenssi tai osa siitä. Tällöin koettimet muodostavat oligonukle-otidit voidaan syntetisoida automaattisella DNA-synteesi-laitteella, kuten Applied Biosystemsin myymillä malleilla 5 380 ja 381.
Kiinnitin- ja/tai detektorikoettimet voivat muodostua DNA:sta tai RNA:sta.
10 Lisäksi keksinnön mukaiset koettimet voivat sisältää tai muodostua luonnon nukleotidien samankaltaisista alfa-nukleotideistä; katso etenkin patenttijulkaisua FR-2607507. Alfa-nukleotidit voidaan valmistaa automaattisilla syntetisaattoreilla. Ne ovat johdettavissa 3'- ja 5'-päihin ja ne kytkey-15 tyvät proteiineihin samalla tavoin kuin beta-oligonukleoti-dit. Niiden etuna on hyvä stabiilius nukleaaseihin nähden (katso Thuong, N.T. ym., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 84, 5129 (1987). Ai fa-oligonukleotidi-entsyymikonjugaatit ovat stabiilimpia liuoksena kuin vastaavat beta-konjugaatit ja niitä 20 voidaan säilyttää kauemmin suurempina laimennoksina.
Detektoitava nukleiinihappo (kohde) voi olla kaksisäikeinen DNA, yksisäikeinen DNA, DNA-RNA-hybridi tai RNA (ribosomi tai lähetti). Kun kohteena on kaksisäikeinen nukleiinihappo 25 tai jokin DNA-RNA-hybridi, se voidaan tietysti denaturoida „ . ennen detektiomenetelmän toteuttamista sandwich-hybridisaa- • · · t iotekni ikal 1 a. Kaksi säikeinen DNA voidaan vuorostaan vai- • · lii mistaa uuttamisen jälkeen tunnetuilla menetelmillä tutkitta-
Ml · ϊ"*Γ van näytteen nukleiinihapoista. Tämä ekstraktio voidaan to- c 30 teuttaa soluproteolyysin avulla, jota seuraa uuttaminen fe- « r ,*j‘, nol i/kloroformi 11 a (katso esimerkiksi Maniatis ja kollegat, • · « "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor , , Laboratory, New York (1982), tai suoremmin aikaiikäsittelyl-
• I
• I I
lä detergentin läsnäollessa ja/tai uitraäänikäsittelyl 1 ä, t · ( '·[ ' 35 tai millä tahansa muulla menetelmällä, joka vapauttaa nukle- iinihapot nestefaasiin. Käsiteltävä näyte voi sisältää solu- • · jen, bakteerien, hiivojen, virusten tai muiden mikro-orga-nismien seoksen. Tällä tavoin saatua kaksisäikeistä DNA:ta » ♦ • « 8 102296 voidaan käyttää suoraan, tunnetuilla tekniikoilla suoritetun denaturoinnin jälkeen, tai sitä voidaan käyttää matriisina nukleiinihappojen monistamiseksi riittävien määrien aikaansaamiseksi, jotta detektio on mahdollista.
5
Yksisäikeisen muodon aikaansaamiseksi jostakin DNA-RNA-hyb-ridistä tai kaksisäikeisestä DNA:sta voidaan suorittaa fysikaalinen, kemiallinen tai entsymaattinen denaturointi. Eräässä fysikaalisessa denaturointimenetelmässä erotetaan 10 kaksi säiettä kuumentamalla hybridiä, kunnes se on kokonaan denaturoitunut, esimerkiksi 80-105Ϊ!:η lämpötilassa muutamasta sekunnista muutamaan minuuttiin. Kemiallisessa denaturoint imenetelmässä esimerkiksi saatetaan kaksisäikeinen näyte kosketukseen 0,2M natriumhydroksidi1iuoksen kanssa 10 mi-15 nuutiksi, minkä jälkeen se neutraloidaan etikkahapolla, jonka pitoisuus on samanlainen (0,2M), kunnes pH-arvoksi saadaan 6-8. Eräässä entsymaattisessa denaturointimenetelmässä käytetään jotakin helikaasia. Helikaasien käyttötekniikoita kuvaa etenkin Radding, Ann. Rev. Genetics, 16, 405-437 20 (1982). Muita entsyymejä, jotka toimivat samalla tavoin, voidaan käyttää samaan tarkoitukseen.
Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan suositeltavimmin simu1taanimenetelmä1lä.
25 Tämä menetelmä käsittää: • · : - oiigonukleotidikiinnitinkoettimen passiivisen kiinnittämi- • · ·.· * sen kiinteään kantajaan, suoraan tai jonkin proteiinin väliin- tyksellä, kuten edellä mainittiin; menetellään saattamalla 30 kantaja kosketukseen koettimen sisältävän vesiliuoksen kans- • *· ♦«« _ e , • · · SflL / ♦ · · - kantajan huuhtelemisen ja mahdollisen kuivaamisen sen säi- .·. ; lyttämistä varten; • « - näin saadun kantajan saattamisen samanaikaisesti kosketuk- » · · • · · *. 35 seen liuoksen kanssa, joka sisältää analysoitavan näytteen, ·/·· ja liuoksen kanssa, joka sisältää leimatun oiigonukleotidi- : : detektorikoettimen, jolloin näyte ja detektorikoetin voidaan lisätä seoksena tai erikseen; 9 102296 - saadun seoksen inkuboinnin; - kantajan huuhtelemisen aineosien, jotka eivät ole kiinnittyneet hybridisaation avulla kantajaan, poistamiseksi; - ja kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen detektoinnin jonkin 5 reaktion avulla, joka paljastaa kantajaan kiinnitetyn mer- kintäaineen, esimerkiksi kolorimetriän, fluoresenssin tai luminesenssin avu11a.
Seuraavassa esitetään eräs keksintöä rajoittamaton erityis-10 suoritusmuoto keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi.
1. Kiinnitinkoettimen kiinnittäminen
Kiinnitinkoetin kiinnitetään panemalla mikrotiitterilevyn kuhunkin syvennykseen esimerkiksi 100 μΐ liuosta, joka si-15 sältää 0,1 μ9/ηι1 - 10 μ9/πι1 oi igonukleotidejä, suositeltavammin 1 μ9/πι1 , liuotettuna puskuriin PBS 3X (0,45M NaCl, 0,15M natriumfosfaatti, pH 7,0).
Levyn annetaan olla kosketuksessa kiinnitinkoetinliuoksen 20 kanssa vähintään 2 tuntia 37tfc:ssa, sitten se pestään PBS
1X -liuoksella (NaCl 150 mM, natriumfosfaattipuskuri 50 mM, pH 7,0, joka sisältää 0,5 % Tween 20:ä).
2. Näytteiden ja leimatun detektorikoettimen samanaikainen 25 inkubointi . , Näytteet (kohde) pannaan levylle, kun niille on ensin suori- • · · ·’ · tettu tarpeen niin vaatiessa denaturointikäsittely; liuotet- • · « ··: · tuna puskuriin PBS 3X, joka sisältää heterologista DNA:ta, • 1 f esimerkiksi lohenmaiti-DNA:ta pitoisuutena 10 μ9/ιη1.
0 : 30 : : : Leimattu koetin laimennetaan puskuriin pitoisuudeksi 20-100 μg/ml. 50 μΐ tätä liuosta pannaan sitten kohteen si-.1. 1 sältäviin syvennyksiin.
35 Mikrotiitterilevyä inkuboidaan sitten aika, joka voi vaih- « 1 '! della esimerkiksi 30 minuutista 120 minuuttiin, valitussa ·...· lämpötilassa, esimerkiksi 37<fc:ssa, tai vähemmän aikaa, mikä- .··1. li tarvitaan vähäistä herkkyyttä.
10 102296 3. Pesu
Pesu suoritetaan esimerkiksi puskurilla PBS 1X, joka sisältää 0,5 % Tween 20:ä (Merk 82 21 84).
5 4. Entsymaattinen ilmaisu
Ilmaisu suoritetaan käytettyä entsyymiä vastaavan substraatin avulla. Voidaan esimerkiksi lisätä ortofenyleenidiamii-nia (OPD) silloin, kun merkintäaineena on raifortperoksideasi, paranitrofenyylifosfaattia (PNPP) tai 5-metyy1iumbel1i-10 feryylifosfaattia (MUP) silloin, kun merkintäaineena on aikai inen fosfataasi.
Substraatin ilmaisuaika on yleensä 1-30 minuuttia, minkä jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä 1N NaOH:a, kun kysy-15 myksessä on aikaiinen fosfataasi, tai 1N H^O^ä, mikäli kysymyksessä on raifortperoksidaasi.
Lukeminen suoritetaan mikrolevylukijalla, 405 nm:llä, kun kysymyksessä on PNPP, 492 nm:llä, kun kysymyksessä on OPD, 20 ja fluoresenssilla, kun kysymyksessä on MUP (viritys 340 nm, emissio 460 nm).
Tämän jälkeen palataan peräkkäisiin inkubointi- ja pesuvai- heisiin, jotka ovat sandwich-hybridisaatiomenetelmän avain- , , 25 vaiheet. Nämä inkubointi- ja pesuvaiheet suoritetaan molem- t' mat vakiolämpöt i lassa, joka on 20-60¾ ja suositeltavimmin • · · ·* * 25-40¾. Eräs lyhyiden koettimien käytön pääeduista on se, • « • i i I että sandwich-kokeet eri kohteiden detektoimiseksi voidaan • · · suorittaa näitä eri määrityksiä silmällä pitäen yhdessä en-1/ ' 30 naita määrätyssä lämpötilassa, joka on suositeltavimmin 37^ koska kaikki analyysi laboratoriot ovat varustetut termostaatti laittei 1 la, jotka on säädetty tähän lämpötila-arvoon.
• · • · r (·;·t Tiedetään, että DNA-hybridei1lä on dissosioitumislämpötila, 35 joka riippuu hybridiemästen lukumäärästä (lämpötilan nous-.'·· tessa hybridin koon kasvun myötä) ja joka riippuu myös hyb- ί,„· ridiemästen laadusta ja kunkin hybridiemäksen kohdalla vie- ,···. rekkäisten emästen laadusta.
11 102296
Hybridien dissosioituminen tapahtuu muutaman t:n intervallilla ja se voidaan helposti määrittää UV-spektroskopiai la; hybridin optinen tiheys on nimittäin pienempi kuin vastaavien yksisäikeisten sekvenssien. Kussakin tapauksessa voidaan 5 siis määrittää tutkittavan hybridin luonteenomainen semidis-sosioitumislämpötila.
Kun tunnetaan reaktion entropia ja entalpia, voidaan lisäksi laskea (Vant'Hoffin lain mukaan) annetun hybridin semidis-10 sosioitumislämpötila standardiolosuhteissa (esimerkiksi liuoksessa, jonka suolaisuus vastaa 1M NaClra) nukleiinihapon kokonaiskonsentraation funktiona liuoksessa; katso esimerkiksi Breslauer, K.J. ym, PNAS, 83, 3476 (1986); Rychlik, W. ja Rhoads, R.E., Nucl. Acid. Res. 17, 8543 (1989); ja Frei-15 er, S.M. ym., PNAS, 83, 9373, 1986.
Käytännössä on aina mahdollista määrittää kokeellisesti annetulla koettimella vastinsekvenssin omaavan kohteen kanssa muodostetun hybridin semidissosioitumislämpötila yksinker-20 täisillä rutiinikokeilla.
Sandwich-menettelytavan hybridisaatiolämpötila (inkubointi-lämpötila ja/tai pesulämpötila) valitaan tietysti semidissosioitumislämpöti 1 an alapuolelta, koska muutoin kohde ei 25 hybridisoituisi kiinnitin- ja/tai detektorikoettimen kanssa ja kokeen tulokset olisivat virheellisiä.
• · • « · • · • · · • · ; On selvää, että tässä esitetyt huomiot semidissosioitumis- • « t lämpötilasta koskevat vähiten stabiilia hybridiä (toisin 30 sanoen sitä, jonka semidissosioitumislämpötila on alhaisin) kahdesta hybridistä, jotka kohde muodostaa toisaalta kiin-nitinkoettimen ja toisaalta detektorikoettimen kanssa. Jotta .·. ; nimittäin sandwich-menetelmä voisi toimia oikein, on tietys-
• 4 I
4... ti välttämätöntä, mikäli pyritään varmaan tulokseen, että • · « 35 nämä molemmat hybridit ovat stabiileja lämpötilassa, jossa ·.1·· koe suoritetaan.
· · • · • · • « · · • · • · 12 102296
Pistemutaatio, joka aikaansaa virheellisen pariutumisen, joka koskee yhtä ainoata emäsparia hybridissä, tuo mukanaan semidissosioiturn islämpöti1 an muutoksen, yleensä sen laskun.
5 Eräs pääetu, joka saadaan lyhyiden koettimien käyttämisestä, on se, että tällainen yksi pariutumisvirhe voi tuoda mukanaan suhteellisen suuren semidissosioitumislämpötilan laskun, noin 2-4 b. Näin ei tapahdu pitkiä koettimia käytettäessä, jolloin tällainen yksi virhepariutuminen aiheuttaa 10 vain hyvin vähäisen muutoksen semidissosioiturn is1ämpötiIässä .
Nyt on keksitty, että on eduksi käyttää lyhyitä koettimia sandwich-menetelmällä suoritettavien määritysten suorittami-15 seksi yhdessä ainoassa ennalta määrätyssä lämpötilassa, esimerkiksi 37b:ssa, kuten edellä mainittiin.
Seuraavassa tarkastellaan esimerkkinä yleensä suositeltavaa tapausta, jossa juuri kiinnitinkoetin antaa etsityn kohteen 20 kanssa hybridin, joka on vähemmän stabiili kuin kohde-detek-torikoetinhybridi. Mutta on selvää, että voidaan käyttää myös systeemiä, jossa päinvastoin juuri detektorikoetin-koh-dehybridi on pysymättömämpi (tällöin riittää, että seuraavassa korvataan ilmaisu "kiinnitinkoetin" ilmaisulla "koe-25 tin, joka antaa kohteen kanssa vähiten stabiilin hybridin", jotta tarkastelu soveltuu yhtä hyvin yleisimpään tapauk- • · · ·· · seen) .
• · • · · • · i # · · · • ♦«
On tietysti käytettävä tarpeeksi pitkää ki innitinkoetinta 30 (tai detektor ikoet intä) , jotta semidissosioitumislämpöt i la j'i'i olisi valittua lämpötilaa korkeampi. Mikäli halutaan suorit- taa erittäin herkkä koe (erityisesti yhteen mutaatioon näh-.·. f den herkkä koe), on sopivaa käyttää säädettyä kiinnitin- • t koetinta (ja/tai detektor ikoet intä) , toisin sanoen tarpeeksi • · · 35 pitkää ja sellaisen sekvenssin omaavaa, että semidissosioi- ·."·· tumislämpöt i la on vain hieman korkeampi kuin ennalta määrät- ty hybr idisaat iolämpöti la, näiden kahden lämpötilan eron .··. ollessa esimerkiksi 1-3b, sillä tällöin voidaan työskennellä • · „ 102296 hyväksyttävässä maksimilämpötilassa ei-spesifisten hybridi-saatioiden välttämiseksi, jotka saattaisivat olla mahdollisia, mikäli käytetään liian alhaista lämpötilaa täysin komplementaarisen hybridin semidissosioitumislämpötilaan verrat-5 tuna. Hyväksyttävä lämpötilaero voidaan itse asiassa määrittää kussakin tapauksessa yksinkertaisin rutiinikokein.
Edellä esitetyssä tapauksessa määrätyssä hybridisaatiolämpö-tilassa ainoastaan yksi kiinnitinkoettimen kanssa täysin 10 homologinen kohde pysyy kiinnittyneenä koettimeen, kun taas kohde, jossa on pistemutaatio koettimen vastinalueella, ei kiinnity.
Edellä olevassa esityksessä on korostettu erityisesti sel-15 laisen kiinnitinkoettimen valintaa, joka sopii valittuun hybridisaatiolämpötilaan, pääasiassa säätelemällä koettimen kokoa. Mutta alaan perehtyneille on aivan selvää, että kysymykseen voi tulla myös koettimen sekvenssin valinta, koska semidissosioitumislämpötila voi vaihdella hybridin muodos-20 tuksessa mukana olevien emäksien laadun mukaan. Myös hybri-disaatiolosuhteita voidaan vaihdella ja erityisesti inku-bointi1iuoksen ja/tai inkuboinnin jälkeen suoritettavaan pesuun käytettävän liuoksen suolapitoisuutta. Tiedetään nimittäin, että suolapitoisuuden lisääminen nostaa semidis-25 sosioitumislämpötilaa.
• · · · Keksinnön mukaisen menetelmän käytännön toteutuksessa, kun e · 1 käytetään valittuun ennalta määrättyyn lämpötilaan sopivaa « « < ki innit inkoet intä ja/tai hybridisaatio-olosuhteita, voidaan Ϊ V 30 menetellä kahdella tavalla.
• « < • · « * · · ♦
Ensimmäisen suoritusmuodon mukaan inkubointivaihe suorite- .·. · taan mainitussa ennalta määrätyssä lämpötilassa ja pesu suo- • « ... ritetaan mainitussa lämpötilassa tai alhaisemmassa lämpöti- • · « 35 lassa. Tämä suoritusmuoto on mahdollinen, koska lämpötilas- • · sa, jossa toimitaan, ainoastaan yksi kohde, joka on täysin : : homologinen kiinnitinkoettimen kanssa, on voinut hybridisoi- #···# tua, jolloin ei ole vaaraa, että jokin ei täysin homologinen • · 14 102296 kohde hybridisoituisi silloinkaan, kun pesu suoritetaan lämpötilassa, joka on inkubointi1ämpöti1aa alhaisempi.
Erään toisen suoritusmuodon mukaan inkubointivaihe suorite-5 taan lämpötilassa, joka on mainittua ennalta määrättyä lämpötilaa alhaisempi, ja pesu suoritetaan mainitussa ennalta määrätyssä lämpötilassa. Itse asiassa tässä tapauksessa pesu lämpötila on diskriminoiva ja mikään inkubointi1ämpötiIässä kiinnitinkoettimen ja ei täysin homologisen kohteen vä-10 lille mahdollisesti muodostunut hybridi ei enää ole pysyvä pesu1ämpötilassa eikä siis jää kiinni kantajaan.
Pistemutaatiodetektiota varten voidaan menetellä kahdella tavalla: 15 - joko kiinnitinkoetin sisältää etsityn mutaation vastinmu- taation, missä tapauksessa ainoastaan mutatoitunut kohde hybridisoituu hybridisaatiokokeen olosuhteissa; - tai kiinnitinkoetin on täysin homologinen ei mutatoidun kohteen vastinsekvenssin kanssa, missä tapauksessa ainoas- 20 taan ei mutatoituneet kohteet hybridisoituvat.
Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää etenkin: - viruksien DNA:n tai lähetti-RNA:n tai retrovirusten RNA:n detektoimiseen; 25 - bakteerien, parasiittien ja hiivojen DNA:n, lähetti- tai ribosomi-RNA:n ja cDNA-RNA-hybridien määrittämiseen; • ♦ *.» : - ja selkärankaisten ja erityisesti ihmisen DNA:n määrittä- • · ί miseen HLA-tyypin määrittämiseksi tai geneettisten sairauk- sien (myopatian, diabeteksen, mukoviskidoosin, jne.) detek- < l l 30 toimiseen.
• · l|( 9 9 « «
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä kuiten- . . kaan rajoittamatta.
« « « • i i * t f \ 35 Näissä esimerkeissä on esitetty nukleotidisekvenssit tavan-
4 I
omaiseen tapaan siten, että 5 '-pää on vasemmalla.
• · » · · • · • · 16 102296
Keksinnön kohteena on myös esimerkeissä kuvattujen koettimien käyttö mainitun kohteen detektoimiseen. On tietysti ymmärrettävä, että esimerkeissä mainitut koettimet tulee katsoa minimisekvensseiksi, joita voidaan pidentää (mainituissa 5 enintään 30, 25 tai 20 nukleotidin rajoissa) lisäämällä li-sänukleotidejä, jotka tietysti valitaan siten, että koetin on homologinen kohteen kanssa, jonka sekvenssi tässä oletetaan tunnetuksi. Esimerkeissä tyydyttäviksi mainitut koettimet voivat kaikki toimia SV^rssa.
10
Esimerkeissä, joissa kiinnitinkoettimelle (tai detektori-koettimelle) annetaan kaksi sekvenssiä, se tarkoittaa, että voidaan käyttää toista koettimista tai molempia koettimia. Kahden kiinnitinkoettimen ja/tai detektorikoettimen käyttä-15 minen antaa mahdollisuuden voimistaa signaalia, kun tulokset eivät ole tyydyttäviä yhdellä koettimella.
Liitteenä olevia kuvioita 1 ja 2 koskevat maininnat annetaan vastaavasti esimerkeissä 10 ja 15.
20
Esimerkki 1
Fosforiamidiittihaaran valmistaminen NH^haaran lisäämiseksi oiigonukleotidin 5'-päähän 21,0 g (0,2 mol) 5-amino-1-pentanolia (Aldrich 12304-8) liu- 25 otetaan 90 ml:aan THF:a ja lisätään 5,3 g Na^COjta. Seos ' jäähdytetään -SSlhseen ja lisätään tiputtamalla 14 g •5 ί (0,067 mol) tr ifluorietikkahappoanhydridiä (Aldrich 10623-2) • · :.· i liuotettuna 50 ml:aan THF:a 1 tunnin kuluessa.
• I f • < • / t · r i\* 30 Seoksen annetaan olla 1 tunti sekoittaen huoneeniämpötilas- sa· Suodattamisen ja THF:n haihduttamisen jälkeen tuote ti s- * lataan tyhjössä. Fraktio Eg 3 * 75-90¾ otetaan talteen ja
.·. · puhdistetaan si 1 ikageel i 1 lä käyttäen seosta CH^C^iMeOH
80:20.
35
Halutun tuotteen Rf on 0,6. Saanto on 66 %.
1 * 1 I i < « «
4 I
4 • · 16 102296 0,7 g Suojattua aminoalkoholia (3,48 10"^ mol) kuivataan pi-ridiinillä (2 x 3 ml) 3 ml:n kanssa N-etyy1idi-isopropyy-liamiinia (13,92 10"^ mol) ja liuotetaan 15 rahaan CH^l^a.
J7 1,65 g (6,96 10'J mol) 2-syanoetyy1i-N,N-di-isopropyy1ikloo-5 rifosforiamidiittia (Aldrich 30230-9) lisätään argonkehässä huoneenlämpötilassa 35 minuutin kuluessa. Lisätään 0,2 ml MeOH:a ja 10 minuutin sekoittamisen jälkeen 30 ml etyyliasetaattia. Orgaaninen faasi pestään kylmänä 2 kertaa 60 ml :11a 10 % Na-pOjilla ja sitten 2 x 80 ml:lla kyllästettyä NaClra, 10 kuivataan Na^O^:lla ja haihdutetaan sitten pyöröhaihdutti-messa.
Raakatuote puhdistetaan piidioksidikolonnissa käyttäen etyyli asetaatt i-CH^C^-NEty-seosta (45-45-10). Talteenotettu 15 fraktio (Rf 0,75) väkevöidään pyöröhaihduttimessa ja säilytetään argonkehässä.
0(0Η2)20Ν CF^NHCCH^gOP ^ 20 II ^N-[CH(CH3)2]2 o
Esimerkki 2
Konjugoidun oiigonukleotidin ASB valmistus 25 Oiigonukleotidi syntetisoidaan automaattilaitteella APPLIED 381A käyttäen fosforiamidi ittikemiaa. Fosfor iamidi itt ihaara, • :*; joka on liuotettu vedettömään asetoni tr i i 1 i in 0,2 moolin • · · • ;*; väkevyytenä, asetetaan syntetisaattorin X-asemaan ja haaran • tt · .··*. lisääminen tapahtuu standardiprotokol lan mukaisesti syntee- ,·, ; 30 sin lopussa. Kun suojaus on poistettu yön aikana öötissa • ·· t·./ 33 % NH^0H:ssa ja saostaminen suoritettu etanolissa • · · __ -20S2:ssa, oiigonukleotidi kuivataan tyhjössä ja liuotetaan
O
takaisin 1 rahaan vettä. 3.10 mol oiigonukleotidiä kuiva- • · · *· *·' taan tyhjössä ja liuotetaan takaisin 25 μl:aan 0,1M natrium- • · · * · · *.· * 35 boraatt ipuskur ia, jonka pH on 9,3. Lisätään 500 μΐ liuosta, : jossa on 30 mg/ml DITC:ä (Fluka 78480) DMF: ssa. Seosta se- • « koitetaan 1 tunti 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, ennen • · • kuin siihen lisätään 3 ml H^a. Kun liuos on uutettu bu- • « 17 102296 tanolilla (3x3 ml), jäljelle jäävä vesifaasi (500 μΐ) kui- η vataan tyhjössä ja lisätään sitten 1.10 mol (6,6 mg) BSA:ta (Pierce 30444) 200 μl:ssa boraattipuskuria. Kun konjugaattia on sekoitettu yksi yö huoneenlämpötilassa, se puhdistetaan 5 ioninvaihdon avulla CLHP:llä AX300-koionnissa (BROWNLEE 4.6 x 10 mm) NaCl-gradientissa (taulukko 1). Konjugaatin huippu dialysoidaan vettä vastaan (2x1 litra), väkevöidään tyhjössä, liuotetaan 1 ml:aan H^Drta ja varastoidaan -20°C:ssa.
10
Taulukko 1
Pituus Oliganukleotidi Tr min mM NaCl Suhde
oligo/ABS
15 20 5'-AACGCrACrACTA1TAGTAG-3' 11,96 (2M) 603 1,0 15 5'-TTCCATTTAGAGOOC-31 15,50 (1M) 395 1,4 13 5' -TCGATTTAGAGCC-3' 15,47 (1M) 385 1,1 12 5' -GCATITAGAGiOC-3' 14,49 (1M) 367 1,6 11 5'-GCATTTAGAOC-3' 14,41 (1M) 365 1,2 20 9 5' -CATTTAGAG-3' 13,99 (1M) 356 1,1 * Tr 1 retentioaika NaCl-konsentraation funktiona * Eluutiogradientti an 10-56 % puskuria B 25 minuutissa ja puskuri A = 20 mM natriumfosfaatti, pH 7,00, 25 puskuri B 1 puskuri A, joka sisältää 2M (tai 1M) NaCl:a.
• i • · • · ♦ · · • · • · · • · Esimerkki 3 • · · — • · ·
Rai fortperoksidaasi-oi igonukleot idikonjugaat in valmistus • · • · 30 Esimerkin 2 mukaisesti tyhjössä kuivattu aktivoitu oligonuk- *· 1· leotidi liuotetaan 1,25 10"' mooliin (5 mg rai f ortperoksidaa- • · · * siä (Boehringer 413470)] 200 μl:ssa boraatt ipuskur ia.
a · ί 1.: Puhdistusmenettely on samanlainen: konjugaatti varastoi- 35 daan -20tfc:ssa puskurissa 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 40 % glyse- .’ . rol i .
• · · • I » • » • 1 » • · ·;·1 Tulokset on esitetty taulukossa 2.
• · · • · c « » · a · 18 102296
Taulukko 2
5 Tyyppi Sekvenssi 5' -----> 3' Tr min mM NaCl Suhde oligo/HRP
TEM TGCCACTAACCflTGflGTG 22,26 (1M) 491 1,1 TEM ATAACACTGCGGCCAAC 20,01 (1M) 450 1,0 TEM GTTGGCCGCAGTGTTAT 11,03 (2M) 569 1,5 TEM CACTCATGGTTATGGCA 11,45 (2M) 585 1,3 10 B GLUKURONIDAASI GATCGCGGTGTCAGTTCTTT 11,85 (2M) 599 1,5 B GLUKURONIDAASI TTCCATGGGTTTCTCACAGA 11,83 (2M) 600 1,1 B GLOBIINI GTATCATGCCTCTTTGCACC 11,57 (2M) 590 1,0 B GLOBIINI TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC 11,82 (2M) 600 1,1 RAS TTCCTCTGTGTATTTGCCAT 22,99 (1M) 505 1,0 15 RAS ACATGAGGACAGGCGAAGGC 20,97 (IM) 467 1,1 C. TRACHOMATIS AATCCTGGCTGAACCAAGCCT 20,70 (1M) 462 1,0 C. TRACHOMATIS AAGGTTTCGGCGGAGATCCT 19,30 (1M) 437 1,0 HIV 1-2 GAG GAAGCTGCAGAATGGGA 9,18 (2M) 501 1,3 HIV 1 ENV AACAATTTGCTGAGGGCTAT 25,19 (1M) 545 1,0 20 HIV 2 ENV GGTCAAGAGACAACAAGAA 9,19 (2M) 501 1,4 HIV 1 POL GCCTGTTGGTGGGC 9,56 (2M) 515 1,0 HLA DR CCGGGCGGTGAC(G/T)GAGCTGGGGC 12,31 (2M) 616 1,3 HLA DR GAACAGCCAGAAGGAC 9,84 (2M) 525 1,0 HLA DQ GGCGGCCTGATGCCGAGTAC 10,16 (2M) 537 1,1 25 HPV 6/11 GACCCTGTAGGGTTACATT 10,20 (2M) 539 1,0 HPV 6/11 TGACCTGTTGCTGTGGA 9,91 (2M) 528 1,0 • · *.· · HPV 16 CCGGACAGAGCCCATTAC 11,33 (2M) 580 1,1 :.:‘i HPV 16 CTCTACGCTTCGGTTGTGC 11,65 (2M) 592 1,0 HPV 18 GTATTGCATTTAGAGCCCA 13,07 (2M) 644 1,1 30 HPV 18 TAAGGCAACATTGCAAGACA 11,16 (2M) 574 1,1 alfa-HPV 18 ACCCCGAGATTTACGTTATGT 10,80 (2M) 560 1,0 • · a • . . 1 Tr = retentioaika (minuutteina suolaliuoskonsentraation (1M tai 2M) funktiona * Gradienttiolosuhteet ovat samat kuin esimerkissä 2 kuvatut.
• • a a a · « • a a 19 102296
Esimerkki 4
Alkalinen fosfataasi-oiigonukleotidi-konjugaatin valmistus Esimerkin 2 mukaisesti aktivoitu, tyhjössä kuivattu oligo-
O
nukleotidi liuotetaan 5,7 10 mooliin (8,0 mg) alkalista 5 fosfataasia (Boehringer 567752) valmistajan puskurissa.
Puhdistusmenettely on samanlainen (taulukko 3). Konjugaatti varastoidaan +4cb:ssa puskurissa Tris-HCl 30 mM, 1M NaCl, 1mM MgC^, pH 8,0.
10
Taulukko 3 DNA-tyyppi Oligonukleotidi Tr min mM NaCl Suhde 15 oligo/entsyymi HPV 18 5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' 9,53 (2M) 550 1,6 HPV 18 5'-TRAGGCAACATTGCAAGACA-3' 13,04 (2M) 680 1,4 HPV 18/33 5'-GTCCAATGCCAGGTGGBTGA-3' 10,10 (2M) 572 1,0 20 * Tr = retentioaika (minuutteina) suolaliuoskonsentraation funktiona * Gradienttiolosuhteet ovat samat kuin esimerkissä 2.
Esimerkki 5 25 Nukleiinihapposekvenssin detektoiminen sandwich-menetelmällä Polystyreeniä (Nunc 439454) olevaan mikrotitraus1evyyn pan-Ϊ·*. naan oiigonukleotidi1iuos 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' pitoi- Φ · · : suuden ollessa 1 ng/μΐ (0,15 μΜ) PBS 3X:ssä (0,45M NaCl, • · · ,···, 0,15M natriumfosfaatti , pH 7,0). Levyä inkuboidaan 2 tuntia 30 37cb:ssa.
I I v • ·· t 9 • · · • · ·
*·* 3 Pesun jälkeen 300 μ.1:11a. PBS Tweeniä [0,15M NaCl, 0,05M
natriumfosfaattia, pH 7,0, PBS Tween 20 (Merck 822184)] • t
50 μΐ sekvenssiä (5 ’-AAGGTCAACCGGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATG
·*.··' 35 CAATACAATGTCTTGCAATGTTGCCTTA-3' ) eri pitoisuuksina 100 pg/μΐ .·. : (5 mM) - 0,01 pg/μΐ (0,5 pM) PBS-lohi-puskurissa [PBS3X + #··^ lohenmaiti-DNA 10 μg/ml (Sigma D9156)] lisätään syvennyksiin • * ja sen jälkeen 50 μΐ oiigonukleotidi-peroksidaasi1iuosta • · • · 20 102296 oiigonukleot idipi toisuutena 0,1 ng/μΐ (15 nM) PBS-hevonen-puskurissa (PBS3X + 10 % hevosen seerumia (BioMerieux 55842)]. Levyä inkuboidaan 1 tunti 37cb:ssa ja pestään 3 x 300 (il: 1 la PBS Tweeniä 100 )il:lla OPD-substraattia (or-5 to-fenyleenidiamiini, Cambridge Medical Biotehnology ref.
456) OPD-puskurissa (0,05M sitruunahappo, 0,1 M Na^iPO^, pH 4,93) pitoisuuden ollessa 4 mg/ml, johon lisätään valmistelematta H-p2:a 30 tilavuutta suhteessa 1/1000 syvennystä kohti. 20 Minuutin reaktioajan jälkeen entsymaattinen aktiivi-10 suus estetään 100 |il:lla 1N ja lukeminen suoritetaan
Axia Microreaderi1lä (BioMärieux) 492 nm:llä.
Herkkyys (taulukko 4): 15
Taulukko 4 kohde (pg) 5000 1000 500 100 50 2 0,1 0 20 O.T.-arvo >2,5 1,007 0,559 0,136 0,067 0,028 0,006 0,005 O.T. optinen tiheys 25 Detektioraja on 2 pg kohdetta eli 10“^ moolia.
• · * Systeemi on täysin spesifinen, koska lohen DNA:ta, joka on • · · j yksisäikeisessä muodossa, sisältävä syvennys ei detektoidu <»» · (syvennys, joissa on 0 pg/μΐ kohdetta).
t «·· . 30 • · ·
Esimerkki 6 * e f ' • · · * Kuten on osoitettu Anemia falciformiksen ja onkogeenien osalta (julkaisussa Human Genetic Diseases, a Practical Approach, K.E. Davis, ed., IRL Press, 1986), geenin tietyis- V · 35 sä kohdissa esiintyvät pistemutaatiot ovat syynä geneetti- .·. : siin sairauksiin ja ne voidaan detektoida hybr idisoimal la « (I « « ,···. genomi-DNA nukleotidikoettimien kanssa. Tietyissä olosuh- • · "·' teissä emäksen virheellinen pariutuminen saattaa destabiloi- « · « • · • ♦ 21 102296 da DNA-oligonukleotidi-hybridin. Niinpä Wallace, R.E. ja kollegat (Nucl. Acid. Res., 6, 3543, 1979) detektoivat am-3-mutaation (A-C mutatoituneessa geenissä normaalin geenin C-G:n tilalla) bakteriofagi Φχΐ74:η geenissä suoralla 5 hybridisaatiosysteemi1lä suodattimella.
Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot eivät olleet ekvivalentteja hybridin destabiloitumisen kannalta katsottuna. Niinpä F. Aboubela ja kollegat (Nucl. Acid. Res., 10 1_3, 481 1, 1985) havaitsevat, että virheelliset emäspariutu- miset, jotka sisältävät guaniinin (GT-GG-GA) ovat vähemmän destabiloivia kuin virhepariutumiset, jotka sisältävät sy-tosiinin (CA-CC) tai 2 pyrimidiinin välisen virhepariutumi-nen (TT-CC-TC). S. Ikuta työtovereineen (Nucl. Acid. Res.,
15 1_5, 797, 1987) osoittavat, että virhepar iutumiset GT, GA
ovat vähemmän destabiloi via kuin AA, TT, CT ja CA.
Tässä kuvattu esimerkki kuvaa täysin homologisen DNA:n de-tektoint imenetelmää sandwich-menettelyl lä 37*ΐ]:83β. Kiinni-20 tinoligonukleotidit kiinnitetään passiivisesti levyyn. Valitut 5 kohdetta kuvataan taulukossa 5.
Taulukko 5 25
.' . 3'-BTTCCGTTGTBBCGTTCTGBBCBTBBCGTBBBTCTCGGGGTTTTBCTTTBAGGCCBBCTGGBB-5* X
: 3'-BTTCCGTTGTAACGTTCTGTBBCATBACGTABGTCTCGGGGTTTTBCTTTBBGGCCAACTGGAA-5' XGT
• · « —
• :*: 3'-BTTCCGTTGTBBCGTTCTGTBBCATBBCGTBBBBCTCGGGGTTTTBCTTTBBGGCCABCTGGBB-5’ XAA
·· I ·
; * ·*· 3'-BTTCCGTTGTBBCGTTCTGTBACBTBBCGTBTBTCTCGGGGTTTTBCTTTBAGGCCBBCTGGBB-5' XTT
30 3' -BTTCCGTTGTBBCGTTCTGTBACBTBBCGTABBTBTCGGGGTTTTBCTTTBBGGCCBBCTGGBB-5 ' XBG
• ♦« — « • · · • « « • · 9 , , 4 Eri mutaatiota on sisällytetty 4 kohdesekvenssiin, jotka • « '· eroavat sekvenssistä X vain 1 ainoan mutaation osalta. Mu- « * · *·' * 35 taatiot sijaitsevat kohteen alueella 32-35. Nämä 4 virhepa-
:‘\i riutumista ovat tyyppiä GT (XGT), AA (XAA), TT (XTT) ja AG
• · (XAG) ja havaitaan 2 virhepariutumista GT ja AG, jotka ovat
t I I
vähiten destabi loi via hybridiin nähden.
• » * * • · * m 9 22 102296
Detektorikoetin D1 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3' on komplementaarinen kohteen alueelle 1-20 ja se on yhteinen kaikille kohteille. Se on leimattu 5'-päässä peroksidaasi1 la esimerkin 3 mukaan.
5
Systeemin spesifisyys saadaan aikaan kiinnitinoligonukleoti-deillä (taulukko 6).
1 0 Taulukko 6
Oi igonukleot idi 1Yn 1,00E-0g M Un 1,00E-0g M
<b kiinnitin C15 5'-TTGCATTTAGAGCXC-3' 59,4 63,8 15 kiinnitin C13 5'-TGCATTTAGAGOC-3’ 49,2 54,2 kiinnitin C12 5'-GCAITrAGAGOC-3' 43,7 48,8 kiinnitin C11 5'-GGATTTAGAGC-3' 34,3 39,8 kiinnitin C9 5'-CATTTAGAG-3' 7,7 14,1 20 Iin on laskettu hybridi saat io-olosuhteissa, toisin sanoen 600 mM:n suola- O Λ pitoisuutena 2 kohdekonsentraatiolla 10 ja 10 moolia.
Näissä 5 oiigonukleotidissä on 5'-päässä CgNI^-haara kova-·'. ! 25 lenttisen sidoksen aikaansaamiseksi häränseerumia 1 burni ini in « i (C15, C1 3 , C1 2 , C11, C9).
• · • · · • · ·
Jollei muuta mainita, sandwich-menettely on samanlainen kuin • i **·1 esimerkissä 5 kuvattu.
• » • · 1 *· ’1 30 • ·· *.1 1 Kohteen pitoisuus on 10”^ moolia/1 eli 20 pg/μΐ (taulukko 7) _o tai 10 moolia/1 eli 200 pg/μΐ (taulukko 8).
• · • · · • · · • · • · · « t « < f I I I ·
• I
« · « 23 102296
Taulukko 7 KOHDE (1,00E-09 M)
5 X XGT XAA XTT XAG
C15 2,390 0,667 0,061 0,137 0,234 C13 0,405 0,030 0,005 0,008 0,018 C12 0,271 0,015 0,003 0,005 0,007 10 C11 0,100 0,004 0,004 0,005 0,005 C9 0,005 0,004 0,005 0,005 0,005 O.T.-arvo 492 nm:llä 15 Taulukko 8 KOHDE (1,00E-08 M)
X XGT XAA XTT XAG
20 C15 >2,5 >2,5 0,211 0,973 1,328 C13 2,320 0,198 0,010 0,060 0,081 C12 1,500 0,095 0,005 0,028 0,032 C11 0,610 0,014 0,003 0,014 0,008 , , C9 0,002 0,004 0,003 0,007 0,003 25 O.T.-arvo 492 nm:llä • · • · · • · · • · · « • · ·
Tyyppiä GT olevan virhepariutumisen sisältävän kohteen kans- t ( ϊ V sa muodostunut hybridi on vähiten destabiloitunut ja siis 30 vaikein detektoida. Suhde signaali X/signaali XGT voi siis toimia viitearvona systeemin suorituskyvyn mittaamiseksi .·. : (taulukko 9 ) : • · · • · • · · • i « • I · • »
• | I
• 1 1 24 102296
Taulukko 9 SUHDE X/XGT
5 1,00E-08 1,00E-09 C15 - 4 C13 12 14 C12 16 18 C11 44 25 10 C9 -
Kiinnitinoligonukleotidi1lä C12 voidaan detektoida mikä tahansa virhepariutuminen nukleiinihapposekvenssistä samalla 15 kun kaikkien virhepariutumisten osalta säilyy alle 0,100:n signaali mainitulla 2 konsentraatiol1 a ja suhteella X/XGT>10.
Esimerkki 7 20 Täysin homologisen DNA:n detektoint imenetelmä 31°C:ssa..
Kiinnitinoligonukleotidit kytketään ASB:hen ja ne kiinnittyvät passiivisesti levyyn.
Sandwich-menettely on samanlainen kuin esimerkissä 5.
25
Ki innitinol igonukleot idit kytketään ASBrhen esimerkin 2 mu- • · · ··· 1 kaisest i .
• · · • 1 • c • · 1 ·,1· Detektor i koet in on sama kuin esimerkissä 6.
• · · : : : 30
Tulokset on esitetty taulukoissa 10, 11 ja 12.
• · • · · • · · • a • · · • · « «Il •
• I
• 4 • «
• 4 « I
• • 4 · • · · 25 102296
Taulukko 10 KOHDE (1,OOE-08 M)
5 X XGT XAA XTT XAG
C15 >2,5 >2,5 0,330 1,445 2,139 C13 >2,5 0,394 0,025 0,078 0,092 C12 2,319 0,241 0,016 0,044 0,056 10 C11 0,763 0,025 0,006 0,007 0,009 C9 0,010 0,007 0,005 0,007 0,006 O.T.-arvo 492 nm:llä 1 5 Taulukko 11 KOHDE (1,00E-09 M)
X XGT XAA XTT XAG
20 C15 2,421 1,154 0,080 0,200 0,364 C13 0,050 0,075 0,015 0,019 0,024 C12 0,423 0,043 0,007 0,010 0,013 C11 0,134 0,007 0,007 0,006 0,009 C9 0,006 0,006 0,007 0,005 0,009 25 • · · Taulukko 12 • · · • · • •r 9
·· SUHDE X/XGT
30 1,00E-08 1,00E-09 C15 - 2 : C13 >6 7 • · · ,···* C12 10 10 C11 31 19 35 C9 - - 26 102296
Kiinnitinoligonukleotidi1lä C11, joka on kytketty ASBthen, voidaan detektoida mikä tahansa virhepariutuminen nukle-iinihapposekvenssistä samalla kun kaikkien virhepariutumis-ten osalta säilyy alle 0,100:n signaali mainitulla 2 kon-5 sentraatiol1 a ja suhteella X/XGT>10.
Esimerkki 8 Täysin homologisen DNA:n detektiomenetelmä eri lämpötiloissa Detektiomenettely on sama kuin esimerkissä 7. Kiinnitinoli-10 gonukleotidi C11 on kytketty ASB:hen ja se kiinnittyy passiivisesti levyyn. Kohteen konsentraatio on vakio ja säädet- -9 ty mooliarvoon 10 . Hybridisaatiolämpötila vaihtelee (tau-1 ukko 13).
15
Taulukko 13
Lämpötila t X XGT X/XGT
22 0,155 0,007 22 20 30 0,313 0,024 13 37 0,229 0,009 25 45 0,321 0,013 25 50 0,052 0,010 5 25
Esimerkki 9 • · —1 1 1 • · · i Menetelmä täysin homologisen DNA:n detektoimiseksi eri läm- ··· *...1 Potiloissa > Detekt iomenettely on sama kuin esimerkissä 7. Ki inni t inol i - * ·· 30 gonukleotidi C13 kiinnitetään passiivisesti suoraan levyyn.
O
Kohteen konsentraatio on vakio ja säädetty mooliarvoon 10 .
: Hybridisaatiolämpötila vaihtelee (taulukko 14).
• ♦ · • · ··· • « « a 1 t
• I
• · ·
• < I
• « • « • 1 1 9 • 99 a « • « • · · · 27 102296
Taulukko 14
Lämpötila <b X XGT X/XGT
5 22 >2,5 0,343 >7 30 2,028 0,337 6 37 2,281 0,227 10 45 1,458 0,134 11 50 0,653 0,017 38 10
Esimerkki 10 E. colin (Tem) β-laktamaasin geeniä vastaavan DNA- tai RNA-sekvenssin spesifinen detektointi 15 Mikäli detektoitava sekvenssi vastaa 1ähetti-RNA:ta, se saadaan joko RNA:n erityispuhdistuksesta {Maniat is työtovereineen julkaisussa Molecular Cloning, a Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) tai liuottamalla bakteerit suoraan natriumin lisäämisen jälkeen (lopullinen 20 0,2M) bakteeripesäkkeestä. Käytetty detektiosysteemi on komplementaarinen geeniä Tem vastaavan lähetti-RNA:n säi-keelle.
Tämä systeemi muodostuu 2 kiinnitinoligonukleotidistä. Pas-25 siivinen adsorptio suoritetaan kokonaiskonsentraatiolla 0,15 μΜ käytettynä kuten esimerkissä 5 kuvattiin.
• · • · · • » · • · · · ·*·
Detektoiminen suoritetaan käyttämällä 2 peroksidaasi 1 la (ko- r ! *.: konaiskonsentraat io 15 nM) leimattua oi igonukleot idiä.
: i : 30 Käytettyjen oiigonukleotidien sekvenssit ovat seuraavat: • · • · · • · ·
Kiinnitin 1 - 5 '-GCACTGCATAATTCTT-3 ' • * «
Kiinnitin 2 - 5'-TACTGTCATGCCATCC-3' V·! 35 l"': Detektori 1 = 5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT-3'
Detektori 2 - 5 ' -CACTCATGGTTATGGCA-3 ' • · • « 28 102296
Detektio suoritetaan puhdistetusta monistamattomasta RNA:sta (taulukko 15) 5 Taulukko 15
Puhdistettu RNA O.T.-arvo 10 spesifistä RNA:ta 0,100 10 1 μς spesifistä RNA:ta 0,014 10 μ9 ei-spesifistä RNA:ta 0,006
Detektio puhdistamattomasta pesäke-RNA:sta (taulukko 16): 15
Taulukko 16
Pesäkkeiden lukumäärä O.T.-arvo 20 1,00E+08 spesifisiä pesäkkeitä 0,150 1,00E+07 spesifisiä pesäkkeitä 0,045 1,00E+06 spesifisiä pesäkkeitä 0,004 1,00E+05 spesifisiä pesäkkeitä 0,001 25 1,00E+08 ei-spesif isiä pesäkkeitä 0,001 t · • · f • « · • · · « • »e • < *··* RNA-systeemin detekt iora j a, ilman monistusta, on 1 μ9 puh- \ distettua kokonais-RNA:ta ja 10—10 bakteeripesäkkeitä.
3 0
Mikäli detektoitava sekvenssi vastaa monistamatonta DNA:ta (plasmidi pBR322, joka sisältää β-laktamaasin geenin), de- • · tektio suoritetaan suoraan denaturoidusta DNA:sta edellä • · i ,· kuvattujen olosuhteiden mukaisesti.
;.’·ΐ 35 • * « * · *···' Käytetty detektiosysteemi on seuraava: « « · • · • ·
Kiinnitin 1 = 5 ' -GGATGGCATGACAGTA-3 ' • i 29 102296
Kiinnitin 2 = 5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3'
Detektori 1 = 5'-TGCCATAACCATGAGTG-3'
Detektori 2 = 5’-ATAACACTGCGGCCAAC-3' 5
Tulokset ovat seuraavat (taulukko 17)
Tau1ukko 17 10 DNA pBR322 O.T.-arvo 1 μς 0,130 0,1 μς 0,012 15 0,01 |ftg 0,002 10 lohen DNA:ta 0,002
Herkkyys monistamattoman DNA:n kohdalla on 0,1 μ9 eli 20 3,48.10“^ moolia, mikä vastaa 2.10^® todellista molekyyliä.
Mikäli detektoitava DNA vastaa DNA:ta, joka on monistettu ketjureaktiolla käyttäen jotakin polymeraasia, monistukseen käytetyt oiigonukleotidit ovat seuraavat: 25 . . Aluke 1 - 5'-ATCAGCAATAACCAGC-3' • 9 Φ .*Y Aluke 2 = 5 ' -CCCCGAAGAACGTTTTC-3 ' • · · • · · • · · • · · • · *···' Detektoitava DNA denaturoidaan edellä mainitun menettelyta- • c • i · *. *? 30 van mukaisesti. Detektio tapahtuu käyttämällä toista tässä « *· ·.· · esimerkissä kuvatusta kahdesta systeemistä.
• · : \: Kuviossa 1 esitetään saadut tulokset abskissalla DNA:n määrä • « (ng) ja ordinaatalla optinen tiheys.
35 Y* Herkkyys on luokkaa 1 ng monistuksen jälkeen saatua DNA:ta *···* ottaen huomioon, että monistuksen jälkeen saatu DNA:n koko- naismäärä on noin 2,0 μg.
< « * 30 102296
Kun kysymyksessä on 560 emäsparin monistettu fragmentti, detektiokynnys on siis noin 2,94.10”^ moolia eli 1,7.10® todellista molekyyliä.
5 Esimerkki 11
Ihmisen papi1loomaviruksen tyypin 6 geeniä E7 vastaavan sekvenssin detektointi
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt sekvenssit ovat seuraavat: 10
Aluke 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3‘
Aluke 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-15 valla systeemillä: {säiedetektio):
Kiinnitin 1 = 5'-CAGTGTACAGAAACA-3'
Kiinnitin 2 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3' 20 Detektori 1 = 5’-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
Detektori 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
Esimerkki 12
Ihmisen papi1loomaviruksen tyypin 11 geeniä E7 vastaavan 25 DNA-sekvenssin detektoiminen . . Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt • · · ·· * sekvenssit ovat seuraavat: • · • · · • · · t ( i < • et
Aluke 1 =* 5 '-TACACTGCTGGACAACATGC-3 ' \* * 30 Aluke 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3 ' « * · « * < • * « «
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-: valla systeemillä (säiedetektio) :
• < I
1 i 1 35 Kiinnitin 1 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
Kiinnitin 2 = 5 ' -CAACTACAAGACCTTTTGC-3 ' • · < • « • · • * * .···. Detektori 1 = 5 ' -GACCCTGTAGGGTTACATT-3 ’ 31 102296
Detektori 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
Esimerkki 13
Ihmisen papi1loomaviruksen tyyppien 6 ja 11 geenejä E7 vas-5 taavan DNA-sekvenssin detektointi
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3' 10 Aluke 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä (säiedetektointi): 15 Kiinnitin 1 * 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-31
Kiinnitin 2 - 5'-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG-3'
Detektori 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
Detektori 2 = 5’-TGACCTGTTGCTGTGGA-3' 20
Esimerkki 14
Ihmisen papi1loomaviruksen tyypin 16 geeniä E7 vastaavan DNA-sekvenssin detektointi
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt . , 25 sekvenssit ovat seuraavat: t * • « • ♦ · : Aluke 1 = 5'-CCCAGCTGTAATCATGCATGGAGA-3' • · i Aluke 2 = 5 1 -GTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3 ’ • 0 0 a « • « ·♦· • ♦ ·.'·* 30 Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa- : : : valla systeemillä (säiedetektio): : Kiinnitin 1 » 5 ' -TATATGTTAGATTTGCAACC-3 ' « ♦ '
Kiinnitin 2 * 5 ’-GACAACTGATCTCTAC-3 ’ 35
Detektori 1 - 5 ’-CCGGACAGAGCCCATTAC-3 ’ • « «
Detektori 2 «5’ -CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3 1 • « · • « 32 1 0 2 2 9 6
Esimerkki 15
Ihmisen papi1loomaviruksen tyypin 18 geeniä E7 vastaavan DNA-sekvenssin detektointi
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt 5 sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-CGACAGGAACGACTCCAACG-3'
Aluke 2 * 5'-GCTGGTAAATGTTGATGATTAACT-3’ 10 Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä (säiedetektio):
Kiinnitin 1 = 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
Kiinnitin 2 = 5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3' 15
Detektori 1 = 5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3'
Detektori 2 = 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
Detektoitava DNA denaturoidaan edellä mainitun menettelyta-20 van mukaisesti.
Kuviossa 2 esitetään saadut tulokset abskissalla DNA:n määrä ja ordinaatalla optinen tiheys (kuviosta 2 nähdään, että ainoastaan HPV 18 on detektoitu), HPV 16 ei ole detektoitu. 25 . Herkkyys on luokkaa 1 ng DNA:ta.
• « • · · • · • · · ··* ' Esimerkki 1 6 li· "··· Ihmisen papi 1 loomavi ruksen tyyppien 6, 11, 16 ja -jg detek- • « · *. · 30 toint isysteemi * · V * Esimerkissä kuvataan kunkin tyypin detektoimista ei-spesi fisen monistuksen jälkeen ketjureaktiolla polymeraasia käyt-täen.
* 35 Se suoritetaan kaikkien esimerkeissä 11, 12, 13/ 14 ja 15 kuvattujen oiigonukleotidien seoksella.
« ;’"j Kutakin oiigonukleotidiä käytetään konsentraationa 0 3 μΜ 1 « 102296 33
Kiinnitys tapahtuu käyttämällä kaikkia esimerkeissä 11, 12, 13, 14 ja 15 kuvattuja kiinnitinoligonukleotidejä (passiivinen adsorptio, esimerkissä 5 kuvattu menettelytapa).
5 Detektio suoritetaan spesifisesti käyttäen yhtä esimerkeissä 11, 12, 13, 14 ja 15 kuvatuista peroksidaasi1la leimatuista oiigonukleot idipareista.
Saadut tulokset ja spesifisyys ovat seuraavat, mikäli detek-10 tio suoritetaan käyttäen 1/1000 monistustuotteesta (taulukko 18) .
Taulukko 18 15
Detekt iosysteemi
Monistettu DNA HPV18 HPV16 HPV6/11 HPV6 0,001 0,004 1,100 HPV16 0,002 0,840 0,008 20 HPV18 0,600 0,028 0,002 HPV6+16 0,001 0,845 0,480 HPV6+16+18 0,540 0,821 0,320 HPV6+18 0,580 0,020 0,687 HPV16+18 0,516 0,740 0,007 ·, ; 25 ei-spesifinen HPV2 0,001 0,018 0,002 vesi: ei-spesi f inen verrokki 0,001 0,014 0,001 • · ·· · • · • t i • · · • · · · ·♦* • « *···* Esimerkki 17 • o “ " —
* · P
*.30 Chlamydia trachomatiksen ulkokalvon pääproteiinin (MOMP) « t ·.· · geeniä vastaavan DNA-sekvenssin detektio
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt i V* sekvenssit ovat seuraavat: (
Monistusaluke 1 - 5'-CACCATAGTAACCCATACGC-3' 35 Monistusaluke 2 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3 « « '·;·* Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa- valla systeemillä (säiedetektio): • · « 34 102296
Kiinnitin 1 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3'
Kiinnitin 2 = 5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3'
Detektori 1 = 5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3' 5 Detektori 2 = 51-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3'
Esimerkki 18
Retrovirus HIV-1:n aluetta GAG vastaavan DNA-sekvenssin de-tekt io 10 Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-GGACATCAAGCAGCCATGC-3'
Aluke 2 = 5'-CTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3’ 15
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä:
Kiinnitin 1 = 5'-AATGTTAAAAGAGAC-3' 20 Detektori 1 = 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
Esimerkki 19
Retrovirus HIV-2:n aluetta GAG vastaavan DNA-sekvenssin de-tekt io 25 Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt . . sekvenssit ovat seuraavat: • · · e · ·· · • · • · 9 !,: 1 Aluke 1 = 5 ' -GACCATCAAGCAGCCATGC-3 ' cc·
Aluke 2 - 5 '-CTTGTTGTCCCTGCTATGTC-3 ' « · < « · ·. 30 ·.· · Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa- valla systeemillä: • · • · · c t f
Kiinnitin 1 « 5 ' -CTTACCAGCGGGGCAGC-3 ' I i * / , 35 Detektori 1 = 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3' « « 4 • 4 4 • « • · · f 4 • · 4 4 4 » • » · « # • · • 44 4 * · 4 4 · „ 102296
JO
Esimerkki 20
Retrovirus HIV-2:n aluetta ENV vastaavan DNA-sekvenssin de-tekt io
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt 5 sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-CAGGAAGCACTATGGGCGC-3'
Aluke 2 = 5'-GCTGCTTGATGCCCCAGAC-3' 10 Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä:
Kiinnitin 1 1 5'-TGTCTGGTATAGTGCA-3'
Detektori 1 - 5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3' 15
Esimerkki 21
Retrovirus HIV-2:n aluetta ENV vastaavan DNA-sekvenssin de-tekt io
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt 20 sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-CAGGCAGTTCTGCAATGGG-3'
Aluke 2 = 5’-GGTTTTTCGTTCCCCAGACG-3' 25 Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa- . . valla systeemillä: • · · 1 • · • · · • « • · « ·1;;/ Kiinnitin 1 - 5 ' -GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3 '
Detektori 1 - 5 '-GGTCAAGAGACAACAAGAA-3 ' • · • < « ·. - 30 « ·· V · Esimerkki 22
Retrovirus HIV-1:n aluetta POL vastaavan DNA-sekvenssin de-;1·,· tektio .1J‘. Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt i 35 sekvenssit ovat seuraavat: « · « · ·
Aluke 1 = 5 '-ATTAGCAGGAAGATGGCCAG-3 '
Aluke 2 = 5'-CTGCCATTTGTACTGCTGGTC-3 36 102296
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä:
Kiinnitin 1 = 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3' 5 Detektori 1 = 5'-GCCTGTTGGTGGGC-3'
Esimerkki 23 E. colin β-glukuronidaasialueen geeniä vastaavan DNA-sek-venssin detektio 10 Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-CAATACGCTCGAACGACGT-3'
Aluke 2 = 51-CACGGGTTGGGGTTTCTAC-3' 15
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä (säiedetektio):
Kiinnitin 1 * 5'-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3' 20 Kiinnitin 2 = 5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3'
Detektori 1 = 5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT-3'
Detektori 2 = 5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3' 25 Esimerkki 24 . „ Ihmisen β-globiinialueen geeniä vastaavan DNA-sekvenssin • · · .**.* detektio • · · •|j · Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt « *··-’ sekvenssit ovat seuraavat: 30 V : Aluke 1 = 5'-GACTCAGAATAATCCAGCCT-3'
Aluke 2 - 5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3' • · » • ci
• I
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa- • · · t* t 35 valla systeemillä (säiedetektio): • e « ♦ * · • · • · ·
Kiinnitin 1 - 5 '-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3 ' .···· Kiinnitin 2 = 5 ' -CACATATTGACCAAATCAGG-3 ' • · 37 102296
Detektori 1 = 51-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3 *
Detektori 2 = 5'-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC-3’
Esimerkki 25 5 Ras-onkogeeniä vastaavan DNA-sekvenssin detektio
Mikäli detektoitava sekvenssi on monistettu DNA, käytetyt sekvenssit ovat seuraavat:
Aluke 1 = 5'-TGTTATGATGGTGAAACCTG-3' 10 Aluke 1 - 5'-CTGTAGAGGTTAATATCCGCAAA-3'
Monistettu tai monistamaton DNA voidaan detektoida seuraa-valla systeemillä (säiedetektio): 15 Kiinnitin 1 = 5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3’
Kiinnitin 2 * 5’-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3’
Detektori 1 = 5'-TTCCTCTGTGTATTTGCCAT-3'
Detektori 2 = 5'-ACATGAGGACAGGCGAAGGC-3' 20
Esimerkki 26
Peroksidaasi11 a leimatun aifa-oligonukleotidin käyttö detek-t ioon
Menettelytapa esimerkin 5 mukainen.
25 . Kohde: a · ·
/V 5'-TCATCGTTTTCTTCCTCTGAGTCGCTTAATTGCTCGTGACATAGAAGGTCAACCG
• · · : gaatttcattttggggctctaaatgcaatacaatgtcttgcaatgttgcctta-3' • · · • ( • · • · · 30 Kiinnitin: 5 ' -TCAGAGGÄAGAAAACGATGA-3 ' • i · • * < t · (
Käytetty detektorikoetin on aifa-oligonukleotidi 5'-ACCCCGA
•‘·r’ GATTTAGGTTATGT-3', joka on haarotettu raifortperoksidaasi11 a < esimerkin 3 mukaan.
. 35 111 -17 Ί Detektioraja on 5 pg kohdetta eli 5.10 moolia (taulukko i i < 19).
• i · · 4 4· 4 4 4 4 4 38 102296
Taulukko 19 Kohde (pg) 5000 500 50 5 0,5 0 5 0.T.-arvo >2,5 0,622 0,073 0,025 0,008 0,007
Esimerkki 27
Aikaiinen fosfataasi detektioentsyyminä kolorimetriassa.
10 Menettelytapa esimerkin 5 mukainen.
Detektorikoetin 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3' on kytketty alka-liseen fosfataasiin esimerkin 4 mukaisesti.
15 100 μΐ PNPP-substraattia (Sigma 104-0), väkevyys 2 mg/ml (puskurissa dietanoliamiini 1,29 M; MgSO^ 0,56 mM; Na^ 0,38 mM; HCl 0,012 N; pH 9,8) lisätään kuhunkin syvennykseen. 20 Minuutin reaktioajan jälkeen entsymaattinen aktiivisuus estetään 100 μ 1 : 11a 1N NaOH:a ja lukeminen suorite-20 taan Axia Microreaderi1lä (BioMerieux) 402 nm:llä.
Kiinnitin: 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
Kohde: plasmidi pBR322, joka sisältää PVH tyypin 18 geenin 25 20 μg/ml väkevyytenä.
4 4 t · · • · • · · • t • · · ··’ * Taulukko 20 • « · ———————— • u • · · • · • « · 30 Kohteen laimennus 0: 100 500 1000 2000 5000 blanko O.T.-arvo 0,505 0,086 0,054 0,029 0,008 0,008 • · • · · * « ’
« 4 I
< , 35 Detektioraja on 1/2000 kohteesta (taulukko 20) toisin sanoen '· ’· luokkaa 500 pg eli 1,8 10“^ moolia.
• * · · · 39 102296
Esimerkki 28
Aikaiinen fosfataasi detektioentsyyminä fluoresenssilla mitattaessa.
Menettelytapa on sama kuin esimerkissä 27, mutta substraa-5 tiksi lisätään 100 μΐ 4-metyyliumbel 1iferyylifosfaattia (MUP, Boehringer ref. 405663) puskurissa, joka sisältää gly-siini-NaOH:a 100 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 0,1 mM, NaN3 0,5 g/1, pH 10,3, konsentraat ion ollessa 80 μ9/ιη1.
10 Reaktio sammutetaan 20 minuutin kuluttua 100 μ1:1^ KH^O^ 0,5M, pH 10,4, 10 mM EDTA ja luetaan fluorimetri1lä (viritys 340 nm, emissio 460 nm) (taulukko 21).
15 Taulukko 21
Kohteen laimennus 100 500 1000 2000 5000 blanko fluoresenssiyksikköä 643 167 94 82 66 47 20
Esimerkki 29 HIV-1-viruksen detektio a) NEF-alue 25 Monistukseen käytetään seuraavia sekvenssejä: • · · .*v Aluke 1 5'-CATTGGTCTTAAAGGTACCTG-3' « ♦ « · Aluke 2 5' -AAGATGGGTGGCAAITGGTC-3' • · « * % • · e e · *. * 30 Kiinnitin- ja detektorikoettimet ovat seuraavat: < e· « < • · ·
Kiinnitin: 5 *-GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA-3· j*·,· Detektori : 5'-GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG-3' « « 1 « 4 t 4
• I
• « * * I * I 4 4 4 « * · 4 4 ,ο 102296 b) VPR-alue
Monistukseen käytetään seuraavia sekvenssejä:
Aluke 1: 5'-TGGAACAAGCCCCAGIAGACC-3' 5 Aluke 2: 5'-TGCTATGTIGACACCCAATTCTG-3'
Kiinnitin- ja detektorikoettimet ovat seuraavat:
Ki innit in: 5'-TATGAAACTTATGGGGATAC-3' 10 Detektori : 5'-GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3' c) POL-alue
Kiinnitin- ja detektorikoettimet ovat seuraavat: 15 Kiinnitin: 5'-TGAACAAGTAGATAAATTAG-3'
Detektori : 5'-GGAATCAGIAAAGTACTATT-3' .
« 1 « (
If· • · • · · • 9 • I f
• · I
• · · · ··» • r • < «·· • t % 9 9 • r · • c
• M
• · « • « · • · • · 1 • 1 f • t 4 · t « « « a I ( • t « a «
• I I
• I ( «
I I
• I « I · • I · • « til ·

Claims (26)

  1. 41 102296
  2. 1. Menetelmä yksisäikeisen kohdenukleotidisekvenssin de-tektoimiseksi näytteestä, joka mahdollisesti sisältää sen, 5 sandwich-hybridisaatiotekniikalla, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: (a) näytteen inkuboiminen: 10 (1) kiinnitinkoettimen kanssa, joka on kiinnitetty kiinteään, hydrofobisesta materiaalista koostuvaan kantajaan, ja joka kiinnitinkoetin koostuu oligonukleotidista, jolla on kyky sitoutua adsorption avulla kiinteään kantajaan, tai proteiiniin kovalenttisesti sitoutuneesta oligo-15 nukleotidista, jolloin oligonukleotidi on sitoutunut adsorption avulla kiinteään kantajaan joko suoraan tai proteiinin välityksellä silloin kun sellainen esiintyy, jolloin oligonukleotidillä on 9-30 nukleotidiä, jolloin oletetaan, että kun kiinnitinkoetin koostuu oligonukleotidistä, joka 20 ei ole proteiiniin sidottu, käsittää oligonukleotidi vähin-. . tään 11 nukleotidiä, ja ; · (2) jollakin ei-radioaktiivisella merkkiaineella leima- • · · • ' · tun detektorikoettimen kanssa, * * · 25 jolloin kiinnitin- ja detektorikoettimet kykenevät hybridi- • · · ’•J : soitumaan vastaavasti etsityn kohdenukleotidisekvenssin kahden ei päällekkäin menevän alueen kanssa, ja sitten • · • · * • · 30 (b) kiinteän kantajan peseminen hybridisoitumalla kiinnit- tymättä jääneen reagenssin poistamiseksi, ja • · • · · • · · (c) kohdesekvenssin detektoiminen reaktiolla, jossa tuodaan esiin kantajaan kiinnittynyt merkkiaine. 35
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hydrofobinen aine on jokin hydrofobinen polymeeri. 42 102296
  4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu polymeeri on jokin styreenipolymeeri tai -kopolymeeri.
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että oligonukleotidi sisältää korkeintaan 25 ja erityisesti korkeintaan 20 nukleotidiä.
  6. 5. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-10 nen menetelmä, tunnettu siitä, että toimitaan jossakin ennalta määrätyssä lämpötilassa ja että kiinnitin- ja detek-torikoettimet valitaan kooltaan riittävän pitkiksi ja sekvenssiltään sellaisiksi, että hybridi, jonka kukin koetin muodostaa etsityn kohteen kanssa, on stabiili mainitussa 15 lämpötilassa, käytetyissä hybridisaatio-olosuhteissa.
  7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinnitinkoetin ja/tai detektorikoetin on riittävän lyhyt ja sekvenssiltään sellainen, että ainoastaan täy- 20 sin homologisen vastinsekvenssin läsnäolo kohteessa antaa mahdollisuuden muodostaa mainitun riittävän lyhyen koetti-: .·. men kanssa mainitussa lämpötilassa, käytetyissä hybridissä- : .·. tio-olosuhteissa. 1". 25 7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnet- ** · tu siitä, että inkubointivaihe suoritetaan mainitussa en- mmm naita määrätyssä lämpötilassa ja että pesu suoritetaan mainitussa lämpötilassa tai alhaisemmassa lämpötilassa. • · • · · • · · • · • · · • : : 30 8. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnet- ··[ tu siitä, että inkubointivaihe suoritetaan lämpötilassa, • · · joka on mainittua ennalta määrättyä lämpötilaa alhaisempi, • · *!* ja että pesu suoritetaan mainitussa ennalta määrätyssä läm- • · · pöt ilassa.
  8. 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ennalta määrätty lämpötila on 20-60 °C, etenkin 25-40 °C ja erityisesti 37 °C. ·:· 35 43 102296
  9. 10. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että detektorikoetin sisältää vähintään 9 nukleotidiä.
  10. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että detektorikoetin sisältää vähintään 15 nukleotidiä.
  11. 12. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai-10 nen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinnitinkoettimen ja etsityn kohteen muodostama hybridi on vähemmän stabiili kuin hybridi, jonka mainittu kohde muodostaa detektorikoet-timen kanssa.
  12. 13. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu detektorikoetin on pidempi kuin kiinnitinkoetin nukleotidimäärältään.
  13. 14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-12 mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että kiinnitinkoetin ja/tai detekto-rikoetin sisältää tai on muodostunut alfa-D-nukleotidistä. : .·, 15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-14 mukainen mene- i!/ telmä, tunnettu siitä, että mainittu proteiini on jokin ni- » « 25 säkkään albumiini tai jokin bakteeriperäinen proteiinitok- ’· " siini. ··· • · · • · ♦
  14. 16. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- • · nen menetelmä, tunnettu siitä, että toimitaan simultaani-30 sandwich-hybridisaatiotekniikalla. ♦ »· • · • · ·
  15. 17. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- *" nen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinnitinkoetin on joko « · · :,t,: kohteen vastinsekvenssin kanssa täysin homologinen sekvens- ·:·: 35 si tai sekvenssi, joka sisältää jonkin pistemutaation koh teen vastinsekvenssiin nähden.
  16. 18. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että: 44 102296 a) kohde on ihmisen papilloomaviruksen HPV 18 DNA-sekvenssi ja että kiinnitinkoetin sisältää sekvenssin TCAGAGGAAGAAAACGATGA, tai 5 b) kohdassa a) detektorikoetin sisältää sekvenssin TAAGGCAACATTGCAAGACA, tai 10 c) kohde on lähetti-RNA-sekvenssi, joka vastaa E. colin (Tem) β-laktamaasin geeniä, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-GCACTGCATAATTCTT- 3' 15 tai 5'-TACTGTCATGCCATCC- 3', tai d) kohdassa c) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 20 5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT- 3' I tai 5'-CACTCATGGTTATGGCA-3’, tai : .·. e) kohde on DNA-sekvenssi, joka sisältää E. colin β-lakta- maasin geenin, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan 25 sekvenssin: • · · : 5 ' -GGATGGCATGACAGTA- 3 ' tai 5'-AGAGAATTATGCAGTGC- 3', tai • · • · · • ♦ « ♦ ♦ i.* ? 30 f) kohdassa e) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens- sin: *... 5'-TGCCATAACCATGAGTG-3' • · *”·* tai 5 ' - ATAACACTGCGGCCAAC- 3 ' , tai • · · g) kohde on DNA-sekvenssi, joka vastaa ihmisen papillooma-t*: 35 viruksen tyypin 6 geeniä E7, ja että kiinnitinkoetin sisäl tää seuraavan sekvenssin: 5'-CAGTGTACAGAAACA-3' tai 5'-GAGTGCACAGACGGA-3', tai 45 102296 h) kohdassa g) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' 5 tai 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3', tai i) kohde on DNA-sekvenssi, joka vastaa ihmisen papillooma-viruksen tyypin 11 geeniä E7, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 10 5'-GAGTGCACAGACGGA-3' tai 5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3', tai j) kohdassa i) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens-15 sin: 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' tai 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3', tai 20 k) kohde on DNA-sekvenssi, joka vastaa ihmisen papillooma-: viruksen tyypin 6 tai 11 geenejä E7, ja että kiinnitinkoe- | tin sisältää seuraavan sekvenssin: ‘ V 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3' . 25 tai 5 -CAGCAACGT (T/C) CGACTGGTTG- 3 1 , tai • · · • · · *·’ 1) kohdassa k) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens sin: • · • · i • · · • · 30 51 - gaccctgtagggttacatt - 3 il tai 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3', tai • «4 • · · « « • · ”* m) kohde on DNA-sekvenssi, joka vastaa ihmisen papillooma- • I · viruksen tyypin 16 geeniä E7, ja että kiinnitinkoetin si-35 sältää seuraavan sekvenssin: 5'-TATATGTTAGATTTGCAACC-3' tai 5·-GACAACTGATCTCTAC-3', tai 46 102296 n) kohdassa m) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3' 5 tai 5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3', tai o) kohde on ihmisen papilloomaviruksen tyypin 18 geeniä E7 vastaava DNA-sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 10 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' tai 51-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3', tai p) kohdassa o) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens-15 sin: 5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' tai 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3', tai 20 q) kohde on ihmisen papilloomaviruksen tyypin 18 geeniä E7 vastaava DNA-sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää : seuraavan sekvenssin: • I I ' ·:.' 51 -TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3·, tai 25 r) kohdassa q) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens- • · · *«* * sin: :X: 51-TAAGGCAACATTGCAAGACA-31, tai «·« ::: 30 j·] s) kohde on Chlamydia trachomatiksen ulkokalvon pääproteii- • * * nin (MOMP) geeniä vastaava DNA-sekvenssi, ja että kiinni- • · *V tinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: t . 35 5·-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC- 3’ tai 5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG- 3', tai t) kohdassa s) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 102296 5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3' tai 5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3', tai u) kohde on sekvenssi, joka DNA:n muodossa vastaa retrovi-5 ruksen HIV-1 aluetta GAG, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-AATGTTAAAAGAGAC-3', tai 10 v) kohdassa u) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3', tai 15 w) kohde on sekvenssi, joka DNA:n muodossa vastaa retrovi-ruksen HIV-2 aluetta GAG ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-CTTACCAGCGGGGCAGC- 3', tai . : 20 : x) kohdassa w) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvens- * Λ · : sin: • · · » · . \ 5 ’ - GAAGCTGCAGAATGGGA- 3 ' , tai · · 25 *·" * y) kohde on sekvenssi, joka DNA:n muodossa vastaa retrovi- ruksen HIV-l aluetta ENV, ja että kiinnitinkoetin sisältää • · seuraavan sekvenssin: ««« • · · • · · :·*. 30 5 ' -TGTCTGGTATAGTGCA- 3 ' , tai • · · ·«« » · • · *!* z) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: ··· • ♦ • · • « · •:'1ί 5·-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3', tai 35 aa) kohde on sekvenssi, joka DNA:n muodossa vastaa retrovi-ruksen HIV-2 aluetta ENV, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 48 102296 b'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3', tai bb) kohdassa aa) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5 5'-GGTCAAGAGACAACAAGAA-3', tai cc) kohde on sekvenssi, joka DNA:n muodossa vastaa retrovi-ruksen HIV-1 aluetta POL, ja että kiinnitinkoetin sisältää 10 seuraavan sekvenssin: 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3', tai dd) kohdassa cc) detektorikoetin sisältää seuraavan sek-15 venssin: 5'-GCCTGTTGGTGGGC- 3' , tai ee) kohde on E. colin β-glukuronidaasialueen geeniä vastaa-• 20 va DNA-sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraa van sekvenssin: 5 ' - TGGCTTCTGTCAACGCTGTT - 3 ' tai 5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3', tai 25 ’·* * ff) kohdassa ee) detektorikoetin sisältää seuraavan sek venssin: • · • · · • · · * · :[♦·*: 5 ' -GATCGCGGTGTCAGTTCTTT- 3 ' 30 tai 5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3', tai • · · • · · « · • · *!* gg) kohde on ihmisen β-globuliinialueen geeniä vastaava ··· ·...· DNA-sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 35 5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG-3' tai 5'-CACATATTGACCAAATCAGG- 3', tai 49 102296 hh) kohdassa gg) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3' 5 tai S 1 -TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC- 3 ' , tai ii) kohde on ras-onkogeeniä vastaava DNA-sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 10 5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3 » tai 5'-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3', tai jj) kohdassa ii) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 15 5'-TTCCTCTGTGTATTTGCCAT- 3' tai 5'-ACATGAGGACAGGCGAAGGC- 3', tai kk) kohde on HPV tyypin 18 DNA-sekvenssi ja että kiinnitini' ·.: 20 koetin sisältää seuraavan sekvenssin: :*!·. 5 ' -TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3 ' , tai i « I • 44 4 t I 4 11. kohdassa kk) detektorikoetin sisältää seuraavan (a-nuk-25 leotidi-) sekvenssin: • 4 ·
  17. 4. I a-oligonukleotidi 5'-ACCCCGAGATT, tai • · • · · • · · • · • · · · mm) kohde on retroviruksen HIV-1 aluetta NEF vastaava sek- 30 venssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvens- • · · !·”. sin: • · • · · • · · :..5 ' - GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA- 3 ' , tai 35 nn) kohdassa mm) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5'-GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG-3', tai so 102296 oo) kohde on retroviruksen HIV-1 aluetta VPR vastaava sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 5 5'-TATGAAACTTATGGGGATAC- 3', tai pp) kohdassa oo) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 10 5'-GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3', tai qq) kohde on retroviruksen HIV-l aluetta POL vastaava sekvenssi, ja että kiinnitinkoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 15 5'-TGAACAAGTAGATAAATTAG- 3', tai rr) kohdassa qq) detektorikoetin sisältää seuraavan sekvenssin: 0-1 20 : :': 5'-GGAATCAGIAAAGTACTATT-3'. 25 1. Förfarande för detektion av en enkelsträngad mälnukleo- · · tidsekvens i ett prov som eventuellt innehäller den, enligt sandwich-hybridiseringsförfarandet, kännetecknat av att det • · · *·*·* omfattar stegen som bestär i: • · · • · < • · · « ·*·.. 30 (a) att man inkuberar provet: • t« • · • · • · · (l) med en infängningsprob bunden pä en fast bärare, • · *···* vilken fasta bärare är utförd i ett hybrofobt material och vilken infängningsprob utgörs av en oligonukleotid med 35 förmäga att bindas med adsorption pä den fasta bäraren eller med en oligonukleotid kovalent bunden tili ett protein, varvid oligonukleotiden är bunden med adsorption pä den fasta bäraren antingen direkt eller med förmedling av proteinet. när det föreligger, varvid oligonukleotiden har si 102296 frän 9 till 30 nukleotider, varvid avses att när infäng-ningsproben utgörs av en oligonukleotid som inte är bunden vid ett protein omfattar oligonukleotiden minst ll nukleotider, och 5 (2) med en detektionsprob markerad med en icke-radioak-tiv markör, varvid ingängnings- och detektionsproberna har förmäga att hybridisera med tvä icke överlappande regioner av den sökta nukleotidmalsekvensen, sedan 10 (b) att man tvättar den fasta bäraren for att eliminera reagens som inte bundits med hybridisering, och (c) att man detekterar mälsekvensen med en reaktion för 15 framkallning av markören bunden pä bäraren.
  18. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det hydrofoba materialet är en hydrofob polymer. : ' j 20 3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att po- i lymeren är en polymer eller sampolymer av styren. • « ·
  19. 4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att • * · .·. : oligonukleotiden innehäller högst 25, och i synnerhet högst 25 20 nukleotider. . . 5. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän- • · · *·[·* netecknat av att man arbetar vid en förutbestämd tempera- V ' tur, och att man väljer infängnings- och detektionsprober :\t 30 med tillräcklig längd och med sädan sekvens att hybriden som varje prob bildar med det sökta mälet är stabil vid • · · denna temperatur, vid de använda hybridiseringsförhällan- • · *···’ dena. 35 6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att infängningsproben och/eller detektionsproben är tillräck-ligt kort och med sädan sekvens att endast närvaron av en perfekt homolog komplementär sekvens i mälet medger bild-ning av en stabil hybrid med den tillräckligt korta proben 52 102296 vid denna temperatur vid de använda hybridiseringsförhil-landena.
  20. 7. Förfarande enligt patentkrav 5 eller 6, kännetecknat av 5 att man -istadkommer inkubationssteget vid denna forutbe- stämda temperatur och att man ästadkommer tvättning vid denna temperatur eller vid en ligre temperatur.
  21. 8. Förfarande enligt patentkrav 5 eller 6, kannetecknat av 10 att man istadkommer inkubationssteget vid en temperatur ligre in den forutbestimda temperaturen, och att man istadkommer tvättning vid den forutbestimda temperaturen.
  22. 9. Förfarande enligt nigot av patentkrav 5 till 8, kanne-15 tecknat av att den förutbestämda temperaturen är mellan 20 och 60 °C, sirskilt mellan 25 och 40 °C och i synnerhet lika med 37 °C.
  23. 10. Förfarande enligt nigot av föregäende patentkrav, kin- ] 20 neteckna·· av att detektionsproben innehiller minst 9 nuk- : leotider. . 11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att * I « : detektionsproben innehiller minst 15 nukleotider. 25 • · < * 12. Förfarande enligt nigot av föregäende patentkrav, kän netecknat av att hybriden bildad av infingningsproben och * · * *·*·’ det sökta mälet är mindre stabil in hybriden bildad av • « A * malet och detektionsproben. 30 • < · ♦ .·**. 13. Förfarande enligt nigot av föregäende patentkrav, kän- • · « netecknat av att detektionsproben är langre, i antal nuk- • · *···* leotider, in infingningsproben. 35 14. Förfarande enligt nigot av föregäende patentkrav, kän netecknat av att infingningsproben och/eller detektionsproben innehiller eller utgörs av alfa-D-nukleotider. 53 102296
  24. 15. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän-netecknat av att proteinet är ett däggdjursalbumin eller ett batktrietoxinprotein. 5 16. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän- netecknat av att man arbetar enligt det simultana sandwich-hybridiseringsförfarandet.
  25. 17. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän-10 netecknat av att oligonukleotiden antingen är en sekvens perfekt homolog med sekvensen komplementär med mälet, eller en sekvens som innehäller en punktmutation i förhällande tili sekvensen komplementär med mälet. 15 18. Förfarande enligt nägot av föregäende patentkrav, kän- netecknat av att a) mälet är DNA-sekvensen frän humant papillomavirus HPV 18 och att infängningsproben innehäller sekvensen: i 20 TCAGAGGAAGAAAACGATGA, eller * i : b) vid punkt a) detektionsproben innehäller sekvensen: < I • · t » .*. : TAAGGCAACATTGCAAGACA, eller 25 c) mälet är en budbärar-RNA-sekvens som motsvarar genen för β-laktamas frän E. coli (Tem) och att infängningsproben innehäller följande sekvens: • » · • « i 30 5'-GCACTGCATAATTCTT-3 ’ eller 5'-TACTGTCATGCCATCC-3', eller Ml • · · • · ··*. d) vid punkt c) detektionsproben innehäller följande sek- i * I i vens: 35 5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT-3' eller 5'-CACTCATGGTTATGGCA-3', eller 102296 e) millet är en DNA-sekvens som innehäller genen for β-laktamas frän E-coli och att infängningsproben innehäller följande sekvens: 5 5 ' - GGATGGCATGACAGTA- 3 ' eller 5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3', eller f) vid punkt e) detektionsproben innehiller följande sekvens: 10 5'-TGCCATAACCATGAGTG-3' eller 5'-ATAACACTGCGGCCAAC- 3', eller g) mälet är en DNA-sekvens som motsvarar genen E7 frän 15 humant papillomavirus typ 6 och att infängningsproben inne-häller följande sekvens:
  26. 51 -CAGTGTACAGAAACA-3' eller 5'-GAGTGCACAGACGGA-3', eller .·. : 20 . h) vid punkt g) detektionsproben innehäller följande . V* sekvens: : : 5 ' -GACCCTGTAGGGTTACATT- 3' 25 eller 5' -TGACCTGTTGCTGTGGA-3', eller « · ♦ » · · i) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar genen E7 frän hu-mant papilloma varus typ 11 och att infängningsproben inne- • · häller följande sekvens: 30 • · : '* 5' -GAGTGCACAGACGGA-3 ' • * · eller 5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3', eller • · · • · • r < i · j) vid punkt i) detektionsproben innehäller följande sek-35 vens: 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' eller 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3', eller 55 102296 k) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar generna E7 frän humant papillomavirus typ 6 eller 11, och att infängnings-proben innehäller följande sekvens: 5 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG- 3' eller 5'-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG- 3', eller l) vid punkt k) detektionsproben innehäller följande sekvens : 10 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT- 3' eller 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3', eller m) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar genen E7 frän hu-15 mant papillomavirus typ 16 och att infängningsproben inne- häller följande sekvens: 5'-TATATGTTAGATTTGCAACC- 3' eller S'-GACAACTGATCTCTAC-31, eller 20 n) vid punkt m) detektionsproben innehäller följande ; ' sekvens: * · · * · ♦ · 5 ' -CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3 ' •y.j 25 eller 5 ’ -CCGGACAGAGCCCATTAC-3', eller • · · • « · ♦ o) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar genen E7 frän hu-mant papillomavirus typ 18 och att infängningsproben inne- • · häller följande sekvens: • · 4 30 ·· : * * * 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' eller 5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3', eller • · · • · • r p) vid p>’nkt o) detektionsproben innehäller följande 35 sekvens: 5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' eller 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3', eller 56 1 0 2 2 9 6 q) mdlet är DNA-sekvensen som motsvarar humant papillomavirus typ 18 och att infdngningsproben innehäller följande sekvens: 5 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3', eller r) vid punkt q) detektionsproben innehdller följande sekvens : 10 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3', eller s) mdlet är DNA-sekvensen som motsvarar genen för det stör-re yttre membran-proteinet (MOMP) frän Chlamydia trachomatis och att infdngningsproben innehäller följande sekvens: 15 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3' eller 5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3', eller t) vid punkt s) detektionsproben innehäller följande sek- . . 20 vens: 5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3' : i eller 5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3', eller * I I • · 25 u) mdlet är en sekvens som i form av DNA motsvarar GAG-: i : regionen hos retrovirus HIV 1 och att infdngningsproben innehdller följande sekvens: • · • · · • · · .···. 5 ' -AATGTTAAAAGAGAC- 3 ' , eller • · 30 ·♦ • · i " v) vid punkt u) detektionsproben innehdller följande sekvens: • · · • · • · • · · 5 ' -GAAGCTGCAGAATGGGA- 3 1 , eller 35 w) mdlet är en sekvens som i form av DNA motsvarar GAG-regionen hos retrovirus HIV 2 och att infdngningsproben innehdller följande sekvens: 5'-CTTACCAGCGGGGCAGC- 3', eller 57 102296 x) vid punkt w) detektionsproben innehäller följande sekvens: 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3', eller 5 y) mälet är en sekvens som i form av DNA motsvarar ENV-re-gionen hos retrovirus HIV 1 och att infängningsproben innehäller följande sekvens: 5'-TGTCTGGTATAGTGCA-3', eller 10 z) detektionsproben innehäller följande sekvens: b’-AACAATTTGCTGAGGGCTAT- 3', eller 15 aa) mälet är en sekvens i form av DNA som motsvarar ENV-re-gionen hos retrovirus HIV 2 och att infängningsproben inne-häller följande sekvens: 5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA- 3', eller 20 / / bb) vid punkt aa) detektionsproben innehäller följande sek- : : : vens: « · · :...: 5'-GGTCAAGAGACAACAAGAA- 3', eller 0·! 25 cc) mälet är en sekvens i form av DNA som motsvarar POL-re-gionen hos retrovirus HIV 1 och att infängningsproben inne-häller följande sekvens: * · • * * • · · I I t 30 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3', eller • · • · • *« • · « dd) vid punkt cc) detektionsproben innehäller följande .*·*. sekvens: < · I 35 51 -GCCTGTTGGTGGGC- 31, eller ee) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar genen for β-gluk-uronidas-regionen hos E.coli, och att infängningsproben innehäller följande sekvens: 58 102296 5'-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT- 3' el1er 5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3', el1er 5 ff) vid punkt ee) detektionsproben innehäller följande sek-vens: 5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT- 3' eller 5'-TTCCATCGGTTTCTCACAGA-3', eller 10 gg) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar genen for den hu-mana β-globulin-regionen och att infangningsproben innehäller följande sekvens: 15 5'-TGTTTACGCAGTCTGCCTAG- 3' eller 5'-CACATATTGACCAAATCAGG- 31, eller hh) vid punkt gg) detektionsproben innehäller följande sekvens: . . 20 // 5'-GTATCATGCCTCTTTGCACC- 3' ··: i eller 5'-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC-3 ', eller • « • · · ii) mälet är DNA-sekvensen som motsvarar ras-onkogenen och :/.: 25 att infängningsproben innehäller följande sekvens: « « I « · « 5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3' eller 5' -CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3' , eller • · · • * ··· ♦ « · • « 30 jj) vid punkt ii) detektionsproben innehäller följande • · i sekvens: • · « • · • · • · · .··. 5 ' -TTCCTCTGTGTATTTGCCAT-3 ' el1er 5'-ACATGAGGACAGGCGAAGGC- 3', eller 35 kk) mälet är DNA-sekvensen hos HPV typ 18 och att infängningsproben innehäller följande sekvens: 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA- 3', eller 59 102296 11. vid punkt kk) detektionsproben innehäller följande (OC-nukleotid) sekvens: 5 a-oligonukleotid 5'-ACCCCGAGATT, eller mm) mälet är en sekvens som motsvarar NEF-regionen hos retrovirus HIV l, och att infängningsproben innehäller följande sekvens: 10 5'-GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA-3', eller nn) vid punkt mm) detektionsproben innehäller följande sekvens: 15 5'-GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG- 3·, eller oo) mälet är en sekvens som motsvarar VPR-regionen hos retrovirus HIV l, och att infängningsproben innehäller följan-, 20 de sekvens: 5'-TATGAAACTTATGGGGATAC- 3', eller pp) vid punkt oo) detektionsproben innehäller följande 25 sekvens: • V t 5'-GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG- 3', eller • · • · · • · · • t qq) mälet är en sekvens som motsvarar POL-regionen hos • « · ]· 30 retrovirus HIV 1, och att infängningsproben innehäller föl- i **· jande sekvens: • · # • · • · • · · 5 ' -TGAACAAGTAGATAAATTAG- 3 1 , eller 35 rr) vid punkt qq) detektionsproben innehäller sekvensen: 5'-GGAATCAGIAAAGTACTATT- 3' .
FI920552A 1990-06-11 1992-02-10 Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybridisaatiotekniikalla FI102296B1 (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9007249A FR2663040B1 (fr) 1990-06-11 1990-06-11 Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich.
FR9007249 1990-06-11
FR9100468 1991-06-11
PCT/FR1991/000468 WO1991019812A1 (fr) 1990-06-11 1991-06-11 Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI920552A0 FI920552A0 (fi) 1992-02-10
FI102296B true FI102296B (fi) 1998-11-13
FI102296B1 FI102296B1 (fi) 1998-11-13

Family

ID=9397483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI920552A FI102296B1 (fi) 1990-06-11 1992-02-10 Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybridisaatiotekniikalla

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0486661B1 (fi)
JP (1) JP3289089B2 (fi)
AT (1) ATE133995T1 (fi)
AU (1) AU650885B2 (fi)
CA (1) CA2059657C (fi)
DE (1) DE69116993T2 (fi)
DK (1) DK0486661T3 (fi)
ES (1) ES2084167T3 (fi)
FI (1) FI102296B1 (fi)
FR (1) FR2663040B1 (fi)
PT (1) PT97939B (fi)
WO (1) WO1991019812A1 (fi)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876922A (en) * 1985-07-31 1999-03-02 Institute Pasteur Papillomavirus probe and a process for in vitro diagnosis of papillomavirus infections
CA1276575C (fr) * 1984-11-30 1990-11-20 Sylvie Beaudenon Sondes a papillomavirus et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus
AU615159B2 (en) 1986-03-21 1991-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ltd Determined dna sequences derived from a papillomavirus genome, their uses for in vitro diagnostic purposes and the production of antigenic compositions
CA2052413C (en) * 1990-09-28 2004-07-13 Jeffrey L. Joseph Nucleotides sequences useful as type-specific probes, pcr primers and lcr probes for the amplifications and detection of human papilloma virus, and related kits and methods
FR2679255B1 (fr) * 1991-07-17 1993-10-22 Bio Merieux Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation.
EP0726962B1 (en) 1991-12-23 2006-06-07 Chiron Corporation Sets of HIV probes for use in solution phase sandwich hybridisation assays
US5656432A (en) * 1992-02-10 1997-08-12 Bio Merieux Genomic DNA fragment of Streptococcus pneumoniae, hybridization probe, amplification primer, reagent and method for the detection of Streptococcus pneumoniae
FR2687168B1 (fr) * 1992-02-10 1994-03-25 Bio Merieux Fragment de l'adn genomique de streptococcus pneumoniae, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, reactif et procede de detection de streptococcus pneumoniae.
JPH07509361A (ja) * 1992-07-28 1995-10-19 日立化成工業株式会社 遺伝子検出システム
FR2694754B1 (fr) * 1992-08-12 1994-09-16 Bio Merieux Fragments d'ADN de mycobactéries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, réactifs et procédé de détection de détection de mycobactéries.
FR2701961B1 (fr) * 1993-02-24 1995-04-21 Bio Merieux Procédé de destabilisation d'une structure secondaire intracaténaire d'un polynucléotide simple brin, et de capture dudit nucléotide.
AU6945694A (en) * 1993-05-06 1994-12-12 Dade International Inc. Human papillomavirus detection assay
FR2706618B1 (fr) * 1993-06-11 1995-09-01 Bio Merieux Dispositif pour le dosage d'haptènes et son utilisation.
FR2707010B1 (fi) * 1993-06-25 1995-09-29 Bio Merieux
US5601978A (en) * 1993-09-03 1997-02-11 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US5610287A (en) * 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
FR2726277B1 (fr) 1994-10-28 1996-12-27 Bio Merieux Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin
FR2728687A1 (fr) * 1994-12-21 1996-06-28 Bio Merieux Procede de dosage d'un haptene selon une technique de competition
FR2730545B1 (fr) * 1995-02-13 1997-03-28 Bio Merieux Vanne statique a congelation, et enceinte de traitement controlee par au moins une vanne
FR2733755B1 (fr) * 1995-05-03 1997-07-11 Bio Merieux Fragment nucleotidique de l'arn ribosomique 16s de corynebacteries, sondes et amorces derivees, reactif et procede de detection
WO1997038131A1 (fr) * 1996-04-11 1997-10-16 Valentina Filippovna Kulikova Procede de detection d'une chaine d'acides nucleiques devant etre analysee
BE1011052A3 (fr) * 1997-03-20 1999-04-06 Jose Remacle Procede et trousse de diagnostic et/ou de quantification par hybridation de type sandwich de sequences d'acides nucleiques sur support solide.
GB9620075D0 (en) * 1996-09-26 1996-11-13 Dynal As Method
EP0843019A3 (en) * 1996-11-08 2002-10-09 Kyowa Medex Co., Ltd. Method for determination of specific nucleic acid sequence, and a reagent therefor
JP4185185B2 (ja) * 1997-05-08 2008-11-26 征夫 軽部 部分二重鎖ｄｎａを利用したｄｎａの検出方法
GB9712483D0 (en) 1997-06-17 1997-08-20 Kathirgamanathan Poopathy Fabrication of light emitting devices from chelates of transition metals, lanthanides and actinides
US6001558A (en) * 1997-06-25 1999-12-14 Ortho Clinical Diagnostics, Inc. Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2
IT1297096B1 (it) * 1997-12-03 1999-08-03 Sorin Diagnostics S R L Metodo per la rivelazione di analiti di dna a singola elica
AU3219400A (en) * 1999-02-03 2000-08-25 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and reagents for molecular detection of hiv-1 groups m, n and
FR2797889A1 (fr) 1999-09-01 2001-03-02 Bio Merieux Procede de detection de l'expression d'une proteine d'enveloppe d'un retrovirus endogene humain et utilisations d'un gene codant pour cette proteine
EP1294939B1 (en) * 2000-04-03 2010-01-27 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using pna probes
GB0016836D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
FR2829580B1 (fr) 2001-09-07 2004-02-13 Bio Merieux Procede de lecture, de detection ou de quantification, hybrides ou complexes utilises dans ce procede et biopuce mettant en oeuvre ledit procede
FR2855832B1 (fr) 2003-06-03 2007-09-14 Biomerieux Sa Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique
FR2857375B1 (fr) 2003-07-10 2007-11-09 Biomerieux Sa Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus
FR2868433B1 (fr) 2004-04-06 2008-01-18 Biomerieux Sa Procede pour le pronostic et/ou le diagnostic d'un cancer
FR2881437B1 (fr) 2005-01-31 2010-11-19 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique
JP5832903B2 (ja) 2009-01-19 2015-12-16 ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ 院内感染罹患の患者の易罹患性を判定し、敗血症症候群の進行の予後を確立する方法
JP5916718B2 (ja) 2010-06-04 2016-05-11 ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ 結腸直腸癌の予後判定のための方法及びキット
US9110079B2 (en) 2010-09-29 2015-08-18 Biomerieux Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS
FR2970975B1 (fr) 2011-01-27 2016-11-04 Biomerieux Sa Procede et kit pour determiner in vitro le statut immunitaire d'un individu
WO2012129758A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Biomerieux Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer
KR102018934B1 (ko) * 2012-02-27 2019-09-06 도레이 카부시키가이샤 핵산의 검출 방법
FR3000966B1 (fr) 2013-01-11 2016-10-28 Biomerieux Sa Procede pour etablir in vitro un pronostic de severite chez un patient en choc septique
CN104178562B (zh) 2013-05-21 2018-11-09 生物梅里埃股份公司 一种大肠癌预后试剂盒

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8509880D0 (en) * 1985-04-17 1985-05-22 Ici Plc Testing device
ES8707343A1 (es) * 1985-06-13 1987-07-16 Amgen Un metodo para aislar una secuencia de acido nucleico objetivo seleccionada
JP2641880B2 (ja) * 1986-08-11 1997-08-20 シスカ・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 核酸プローブアッセイ法および組成物
DE3681176D1 (de) * 1986-12-01 1991-10-02 Molecular Biosystems Inc Verfahren zur erhoehung der empfindlichkeit von nukleinsaeure-hybridisierungstesten.
ATE87932T1 (de) * 1986-12-02 1993-04-15 Centre Nat Rech Scient Alpha-oligonukleotide.
EP0425563B1 (en) * 1988-07-20 1996-05-15 David Segev Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
EP0405592A3 (en) * 1989-06-30 1991-07-17 Sanyo Chemical Industries Ltd. A method for detection of nucleic acid and reagents for their detection
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
EP0439968A1 (en) * 1990-02-02 1991-08-07 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of haemophilus ducreyi strains
GB2249500B (en) * 1990-09-19 1994-10-19 Yakuzky Ni I Pi Almazodobyva Flotation machine

Also Published As

Publication number Publication date
FI920552A0 (fi) 1992-02-10
AU7995391A (en) 1992-01-07
DK0486661T3 (da) 1996-06-17
CA2059657A1 (fr) 1991-12-12
ATE133995T1 (de) 1996-02-15
JP3289089B2 (ja) 2002-06-04
PT97939B (pt) 2001-05-31
FR2663040A1 (fr) 1991-12-13
EP0486661A1 (fr) 1992-05-27
DE69116993T2 (de) 1996-11-14
FR2663040B1 (fr) 1995-09-15
JPH05501957A (ja) 1993-04-15
AU650885B2 (en) 1994-07-07
PT97939A (pt) 1992-03-31
FI102296B1 (fi) 1998-11-13
CA2059657C (fr) 2003-01-07
ES2084167T3 (es) 1996-05-01
DE69116993D1 (de) 1996-03-21
EP0486661B1 (fr) 1996-02-07
WO1991019812A1 (fr) 1991-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI102296B (fi) Menetelmä nukleotidisekvenssin detektoimiseksi sandwich-hybridisaatiot ekniikalla
US5695926A (en) Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
AU599083B2 (en) Detection of microorganisms in a nucleic acid containing sample
US4777129A (en) Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
CN103946397B (zh) 用于通用实时多重分析检测的双功能寡核苷酸探针
US5580971A (en) Fungal detection system based on rRNA probes
EP0281927A2 (en) Assay for nucleic acid sequences in a sample
US20040072158A1 (en) Electrochemical detection of nucleic acid sequences
IL95800A (en) Biotin-labelled DNA by polymerase chain reaction and detection thereof
JPH08501689A (ja) 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体
US7749699B2 (en) Detection of chemical ligation using fluorescence quenching leaving groups
CN113186341B (zh) CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法
FI84838C (fi) Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex.
JP4662578B2 (ja) 抗生物質耐性微生物を同定するための方法およびキット
US4840892A (en) Polynucleotide hybridization probes
JPS617469A (ja) 分子遺伝プロ−ブ及びその形成方法及び検査方法及び分子遺伝プロ−ブを使用する方法
WO2005083114A1 (en) Method, kit and system for enhanced nested pcr
EP0660844A4 (en) ISOLATED NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR THE IDENTIFICATION OF NEISSERIA GONORRHOEAE.
JP2010515451A (ja) 大腸菌検出用ｄｎａチップ
Faikhruea et al. Enhancing peptide nucleic acid–nanomaterial interaction and performance improvement of peptide nucleic acid-based nucleic acid detection by using electrostatic effects
JPS62265999A (ja) 核酸含有試料中の微生物の検出
JP2008161170A (ja) 高感度なサルモネラ属菌検出用オリゴヌクレオチド、それを用いた検出方法および検出キット
Tu et al. The application of alkaline phosphatase labeled HBV probe in serum detection
EP2929050A1 (en) Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
US20220127670A1 (en) Oligonucleotide-Templated Photoreduction Fluorogenic Probe Pairs and Their Use in Quantitative Detection of Target RNA Sequences