FI84838C - Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex. - Google Patents

Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex. Download PDF

Info

Publication number
FI84838C
FI84838C FI844866A FI844866A FI84838C FI 84838 C FI84838 C FI 84838C FI 844866 A FI844866 A FI 844866A FI 844866 A FI844866 A FI 844866A FI 84838 C FI84838 C FI 84838C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
probe
hybridization
nucleic acid
stranded
intercalator
Prior art date
Application number
FI844866A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI844866A0 (fi
FI844866L (fi
FI84838B (fi
Inventor
James P Albarella
Leslie H Anderson
Original Assignee
Miles Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miles Inc filed Critical Miles Inc
Publication of FI844866A0 publication Critical patent/FI844866A0/fi
Publication of FI844866L publication Critical patent/FI844866L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI84838B publication Critical patent/FI84838B/fi
Publication of FI84838C publication Critical patent/FI84838C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 84838
Nukleiinihapon hybridisaation määritys käyttäen vasta-aineita interkalaatiokomplekseille
Keksinnön kohteena on nukleiinihapon hybridisaation 5 määritysmenetelmiä ja reagenssisysteemejä spesifisten po- lynukleotidisekvenssien havaitsemiseksi. Nukleiinihapon hybridisaatiomäärityksen periaatteen kehittivät yhdistel-mäDNA:n alueella työskentelevät tutkijat keinoksi joidenkin erityisten kiinnostavien polynukleotidi-emässekvens-10 sien määrittämiseksi ja eristämiseksi. Havaittiin, että yksisäkeiset nukleiinihapot, esim. DNA ja RNA, jollaisia saadaan denaturoimalla niiden kaksisäikeisiä muotoja, hyb-ridisoituvat tai yhdistyvät sopivissa olosuhteissa komplementaaristen yksisäikeisten nukleiinihappojen kanssa. 15 Merkkaamalla tällaiset komplementaariset koetin-nukleiini- hapot jollakin helposti havaittavalla kemiallisella ryhmällä, tehtiin mahdolliseksi havaita jonkun kiinnostavan polynukleotidisekvenssin läsnäolo tutkittavassa alustassa, joka sisältää näytenukleiinihappoja yksisäikeisessä muo-20 dossa.
Yhdistelmä-DNA-alueen lisäksi analyyttistä hybridi-saat iotekniikkaa voidaan käyttää tärkeiden polynukleoti-dien havaitsemiseen ihmis- ja eläinlääketieteen alueilla, maanviljelyksessä ja ravintotieteessä, muiden joukossa. 25 Erityisesti tätä tekniikkaa voidaan käyttää etiologisten aineiden, kuten bakteerien ja virusten löytämiseen ja tunnistamiseen, bakteerien seulontaan antibioottiresistenssin suhteen, auttamaan geneettisten sairauksien, kuten sirppi-soluanemian ja talassemian taudinmäärityksessä, ja syöpä-30 solujen havaitsemiseen. Yleiskatsaus tästä tekniikasta ja sen nykyisestä ja tulevasta merkityksestä on esitetty julkaisussa Biotechnology (elokuu 1983), sivut 471-478.
Tekniikan tason nukleiinihapon hybridisaation määritysmenetelmät käsittävät joko koetinnukleiinihapon tai 35 näytenukleiinihappojen kemiallisen modifioinnin, tarkoi- 2 84838 tuksena merkkaaminen ja havaitseminen. Se, että nukleiinihappojen kemiallinen modifiointi on välttämätöntä, rajoittaa vakavasti tämän tekniikan käytännön sovellutusta, koska se vaatii merkattujen koettimien suurimittakaavaisen 5 valmistamisen, joka käsittää monimutkaisia ja kalliita syntetisoimis- ja puhdistusprosesseja tai merkattujen näyte-nukleiinihappojen in situ-synteesin analyysinkäyttäjän toteuttamana. Erityisesti syntyneen merkatun polynykleoti-din täytyy säilyttää kyky hybridisoitua tehokkaasti komp-10 lementaarisen näyte- tai koetinsekvenssinsä kanssa. Tällainen vaatimus rajoittaa vakavasti käyttökelpoisten syn-teesitapojen käytettävissäoloa hybridisaatioanalyyseissä käytettäviksi tarkoitettujen polynukleotidien merkkaamisen modifioinniksi.
15 Varhaiset hybridisoimismenetelmät käsittävät radioaktiivisten merkkiaineiden, kuten 3H, 32P ja 125I, käytön.
Merkattuja koettimia syntetisoidaan entsymaattisesti ra-diomerkatuista nukleotideistä ja polynukleotidista sellaisin menetelmin kuin lovi-translaatiolla, päätemerkkauksel-20 la, toisen säikeen synteesillä, käänteistranskriptiolla ja transkriptiolla. Siten tällaisten entsymaattisten menetelmien eräs lisävaatimus on, että modifioitujen tai merkattujen nukleotidien täytyy toimia tehokkaina substraatteina polymeraasientsyymeille, jotka ovat osallisina mer-25 katun polynukleotidin kokoonpanossa. Polynukleotidin suora kemiallinen modifiointi on myös mahdollinen, mutta tällainen menetelmä on kuitenkin melko tehoton merkkiaineiden yhdistämisessä polynukleotidiin ja voi vaikuttaa polynukleotidin kykyyn hybridisoitua.
30 Radioaktiivisesti merkattujen aineiden käsittely jä varastointihaitoista johtuen on tehty huomattavia jatkuvia yrityksiä kehittää käyttökelpoisia ei-radioisotoop-pisia merkkaustapoja. Tällaiset merkkiaineet ovat käsittäneet valoasäteileviä molekyylejä, kuten fluoresoivia ja 35 kemiluminoivia aineita, sekä ligandimolekyylejä, joilla on 3 84838 kyky tulla spesifisesti sidotuksi vastapuolen sitojilla, jotka vuorostaan ovat merkattuja havaittavilla kemiallisilla ryhmillä, kuten fluoresoivilla aineilla ja entsyymeillä.
5 Esimerkkejä ligandi-merkkiaineista ovat hapteenit, joita vasta-aineet spesifisesti sitovat, ja muut pienet molekyylit, joille on olemassa spesifisiä sitovia proteiineja, esim. biotiini, jonka avidiini sitoo.
GB-patentissa no. 2 019 408 selostetaan polynuk-10 leotidikoettimia, jotka on merkattu biotiinilla sytokromi C-sideryhmien kautta ja jotka sitten ovat havaittavissa entsyymimerkatulla avidiinilla. Eräs vaihtoehtoinen yritys koettimien merkkaamiseksi pienimolekyylipainoisilla ligan-deilla, kuten biotiinilla, on selostettu EPO-patenttihake-15 muksessa 63 879. Tässä menetelmässä 5-allyyli-amiini-deoksiuridiinitrifosfaatti (dUTP)-johdannaisia kondensoi-daan halutun ligandi-merkkiaineen kanssa ja täten modifioitu nukleotidi yhdistetään entsymaattisin standardimenetelmin haluttuun koettimeen. Valoasäteilevien merkkiai-20 neiden käyttöä on ehdotettu EP-patenttihakemuksissa 70 685 ja 70 687. Muita patenttikirjallisuuden edustajia, jotka koskevat hybridisaatioanalyysejä, ovat US-patentit no.
4 302 204, jonka kohteena on tiettyjen vesiliukoisten polysakkaridien käyttö hybridisaation nopeuttamiseksi kiin-25 tofaasilla; 4 358 535, jonka kohteena on taudinsynnyttä-jien havaitseminen kliinisissä näytteissä; ja 4 395 486, jonka kohteena on sirppisoluanemiapiirteen havaitseminen käyttäen synteettistä oligonukleotidi-koetinta.
Menetelmät kaksinkertaisen polynukleotidin, joka on 30 muodostunut hybridisaatio-tuotteena näyte- ja koetin-poly- nukleotidien välillä, suoraan havaitsemiseksi ja siten toimeen tulemiseksi ilman jommankumman polynukleotidin kemiallista merkkaamista, ovat yleensä olleet epäonnistuneita. Yritykset kehittää vasta-aineita, jotka selek-35 tiivisesti sitovat kaksisäikeisiä DNA/DNA-hybridejä yksi- < 84838 säikeisen DNA:n kautta, epäonnistunut [Parker ja Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", toim. Plescia ja Braun, Springer-Verlag, NY (1969) sivulta 18 alkaen]. Jonkinverran menestystä on saavutettu kehitettäessä vasta-aineita, 5 jotka sitovat RNA/DNA-sekahybridejä ja joilla on pieni affiniteetti yksisäikeisiin polynukleotideihin [Rudkin ja Stollar, Nature 265: 472 (1977); Stuart et ai., PNAS (USA) 78:3751 (1981); Reddy ja Sofer, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 103:959 (1981); ja Nakazato, Biochem. 19:2835 10 (1980)], mutta näiden menetelmien herkkyys ei kuitenkaan ole saavuttanut niitä tasoja, joita kliinisille hybridi-saatiotesteille vaaditaan, ja olisi käytettävä RNA-koetti-mia, joiden hyvin tiedetään olevan melko pysymättömiä.
Siten on olemassa tarve löytää menetelmä hybridi-15 säätiön havaitsemiseksi ilman että vaaditaan polynukleoti-dien kemiallista modifiointia tai että siihen liittyy suhteellisen yksinkertainen merkkausmenetelmä. Edelleen tällaisen menetelmän tulisi tehdä mahdolliseksi käyttää valikoimaa eri merkkiaineita, erityisesti ei-radioisotooppista 20 tyyppiä. Nukleiinihapon hybridisaation analysoimismenetel- mä ja reagenssisysteemi, joilla on nämä ja muita etuja, ovat tämän keksinnön pääkohteita.
US-patentissa no. 4 257 774 kuvataan menetelmä eri yhdisteiden havaitsemiseksi, jotka ovat vuorovaikutuksessa 25 nukleiinihappojen kanssa, erityisesti yhdisteitä, joita epäillään mahdollisiksi mutageeneiksi tai syöpää synnyttäviksi aineiksi, mittaamalla tällaisten yhdisteiden kyky estää interklaattoreiden, kuten akridiini-oranssin nukleiinihappoihin sitoutuminen. Poirier, M.C. et. ai. 30 (1982) PNAS 79:6443-6447, kuvaavat monoklonaalisen vasta- aineen valmistusta, joka on selektiivinen tietyille cis-platina/kaksisäikeisille DNAkomplekseille vapaan cis-pla-tina-yhdisteen ja kaksisäikeisen DNA:n kautta.
Nyt on keksitty, että hybridisaatio, joka tapahtuu 35 näyte-nukleiinihapon ja koettimen välillä nukleiinihapon 5 84838 hybridisaatio-analyyseissä, voidaan havaita edullisesti vasta-aineen tai sen sopivan sitovan osasen avulla, joka pystyy sitoutumaan interkalaatio-kompleksien kanssa, joita muodostuu hybridisoidun koettimen yhteydessä. Olennaista 5 on, että joku nimenomainen polynukleotidisekvenssi havaitaan tutkittavassa alustassa, joka sisältää yksisäikeisiä nukleiinihappoja, muuodostamalla hybridisaatio-kasauma tai -tuote, joka käsittää hybridisoidun koettimen ja nuk-leiinihappo-interkalaattori-yhdisteen sidottuna kaksi-10 säikeiseen nukleiinihappoon interkalaatiokompleksien muodossa. Vasta-ainetta tai sen osasta käytetään sitten interkalaatiokompleksien havaitsemiseen hybridisaatio-kasau-massa.
Nukleiinihapon hybridisaation käyttäminen analyyt-15 tisenä välineenä perustuu olennaisesti DNA:n kaksisäikei-seen, kaksoisrakenteeseen. Vetysidokset vastaavien säikeiden puriinija pyrimidiini-emästen välillä kaksisäikeisessä DNA:ssa voidaan murtaa palautuvasti. Nämä kaksi komplementaarista DNA:n yksinkertaista säiettä tästä DNA:n sulat-20 tamisesta eli denaturoinnista yhdistyvät (mistä käytetään myös nimitystä uudelleenliittäminen (reannealing) tai hybridisaatio) muodostamaan kaksoisrakenteen uudelleen. Kuten alalla on hyvin tunnettua, on ensimmäisen yksisäikeisen nukleiinihapon, joko DNA:n tai RNA:n, joka sisältää emäs-25 sekvenssin, joka on riittävän komplementraarinen (ts. "homologinen sen kanssa") kosketuksesta toisen yksisäikeisen nukleiinihapon kanssa sopivissa liuosolosuhteissa seurauksena DNA/DNA-, RNA/DNA- tai RNA/RNAhybridien muodos-. . tuminen, kuten asia voi olla.
30 Tämä keksintö tekee mahdolliseksi muodostuneiden hybridien havaitsemisen aiheuttamalla kaksisäikeisen nukleiinihapon immunogeeninen modifikaatio hybridisaation alueella tai reuna-alueilla. Syntynyt tuote voidaan sitten havaita tavanomaisilla määritysjärjestelyillä, jotka peru-35 stuvat spesifisen vasta-aineen sitoutumiseen epitooppeihin 6 84838 tai antigeenisiin determinantteihin, joita muodostuu hyb-ridisaatiotuotteelle. Kaksisäikeisen nukleiinihapon tarvittava immunogeeninen muunnos aikaansaadaan pääasiallisesti molekyylin, tavallisesti pienmolekyylipainoisen yh-5 disteen sitoutumisella kaksinkertaiseen rihmaan. Tällaisesta sitoutumisesta on seurauksena antigeenisen determinantin syntyminen, joka erottaa kaksisäikeisen nukleiinihapon sekä yksisäikeisestä nukleiinihaposta että vapaasta, sitomattomasta muuntavasta molekyylistä. Edul-10 lisesti tämä tapahtuu käyttäen modifioimisyhdistettä, joka on pääasiallisesti kykenemätön sitoutumaan yksisäikeiseen nukleiinihappoon ja joka muodostaa sitovan kompleksin kaksisäikeisen nukleiinihapon kanssa, mikä muuttaa kaksinkertaisen säikeen komplementaaristen säikeiden normaalin 15 kierukkamaisen suhteen.
Tällainen modifioiva molekyyli, jollainen tässä kuvataan, on nukleiinihapon interkalaattori, joka ensijai-sesti on vuorovaikutuksessa normaalin nukleiinihappo-kierteen kanssa ei-kovalenttisella insertiolla emäsparien 20 välissä. Tällainen insertio aiheuttaa tässä edullisessa vuorovaikutuksessa kierteen tertiaarisen rakenteen muuttumisen kiertymällä auki ja venymällä pitkin kierreakse-lia. Kaavamainen esitys tästä edullisesti interkalaatio-vuorovaikutuksesta on esitetty piirrosten kuvassa 1. Syn-25 tynyttä interkalaatiokompleksia luonnehtivat vastamuodos- tuneet antigeeniset determinantit, joiden ymmärretään käsittävän interkalatoidun modifioimisyhdisteen sekä kak-soisrihman vastaavien säikeiden uudelleensuuntautuneet fosfodiesteraasi-rungot.
30 Edullisesti interkalaattoriyhdiste on joku yleensä tasossa olevista, aromaattisista orgaanisista molekyyleistä, joiden tunnetaan muodostavan interkalaatiokomplekseja kaksisäikeisen nukleiinihapon kanssa. Tällaisista yhdisteistä ovat esimerkkejä akridiini-väriaineet, esim. akri-35 diini-oranssi, fenantridiinit, esim. etidium, fenatsiinit.
7 84838 furokumariinit, fenotiatsiinit, kinoliinit jne., kuten täydellisemmin jäljempänä selostetaan. Olisi selvästi ymmärrettävä, että samalla kun tätä keksintöä tämän jälkeen selostetaan erityisesti tällaisiin interkalaattoriyhdis-5 teisiin viitaten, käsittää tämä keksintö samanarvoisten modifioimismolekyylien käytön, jotka, kuten edellä selostettiin, sitoutuvat kaksisäikeiseen nukleiinihappoon aiheuttamaan immunogeenisen muutoksen kaksoisrihmaan.
Tämän keksinnön mukaisesti interkalaattori voidaan 10 yhdistää tutkittavan alustan kanssa ja siten joutua alttiiksi läsnäoleville kaksisäikeiseille nukleiinihapoille ja/tai muodostaa hybridisoimisreaktioseoksessa erillisenä, vapaana yhdisteenä interkalaatiokomplekseja sitoutumalla ei-kovalenttisesti tällaisiin kaksisäikeisiin nuk-15 leiinihappoihin. Vaihtoehtoisesti interkalaattori voidaan sopivasti liittää kemiallisin sidoksin, edullisesti kova-lenttisin sidoksin, koettimeen. Edellisessä tapauksessa tämä keksintö antaa menetelmän hybridisaatiomäärityksen suorittamiseksi tarvitsematta kemiallisesti modifioida 20 näyte- tai koetin-polynukleotidia hybridisaation havaitse miseksi. Jälkimmäisessä tapauksessa aikaansaadaan yksinkertainen, synteettisesti suoraan etenevä tapa polynukleo-tidien tai hybridisaatio-kasauman merkkaamiseksi käyttämällä interkalaattorin valoreaktiokykyisiä muotoja.
25 Kaikissa suoritusmuodoissa tämä keksintö antaa erittäin käyttökelpoisen, herkän ja spesifisen menetelmän hybridisaation havaitsemiseksi, joka perustuu vasta-aineen sitoutumiseen interkalaatiokomplekseihin muodostuneessa kasaumassa. Tietenkin voidaan käyttää vasta-aineen sopi-30 via osasia ja polyfunktionaalisia muotoja, kuten jäljempänä täydellisemmin selostetaan, ja on ymmärrettävä, että kun tässä esityksessä käytetään käsitettä vasta-aine, se tarkoittaa yhtä hyvin sen osasiksi tehtyjä ja polyfunktionaalisia muotoja, ellei toisin ole esitetty. Vasta-aineen 35 sitoutumisen interkalaatiokomplekseihin määrittäminen voi- s 84838 daan suorittaa joukolla erilaisia tavallisia tapoja ja edullisesti se käsittää vastaaineen käytön, joka on merkattu havaittavalla kemiallisella ryhmällä, kuten entsymaattisesti aktiivisella ryhmällä, fluoresoivalla aineel-5 la, luminoivalla aineella, spesifisesti sitoutuvalla li-gandilla tai radioisotoopilla.
Keksintö on käyttökelpoinen kaikkiin tavanomaisiin hybridisaation analyysiformaatteihin ja yleensä mille tahansa formaatille, joka mahdollisesti perustuu hybridisaa-10 tio-tuotteen tai kasauman, joka sisältää kaksisäikeisen nukleiinihapon, muodostamiseen. Erityisesti tämän keksinnön ainutlaatuista havaitsemiskaaviota voidaan käyttää liuos- ja kiintofaasi-hybridisaatioformaateissa, jotka jälkimmäisessä tapauksessa käsittävät formaatteja, joihin 15 liittyy joko näyte tai koetin-nukleiinihappojen liikkumattomaksi tekeminen, sekä kerros-formaateissa.
Tämän keksinnön mukaisesti muodostettu hybridisaa-tiotuote tai -kasauma sisältää hybridisoidun koettimen ja interkalaattorin sitoutuneena kaksisäikeiseen nukleiini-20 happoon interkalaatiokompleksien muodossa. Interkalaatio- kompleksit voivat käsittää kaksisäikeisiä alueita, jotka ovat muodostuneet hybridisaatiolla näyte- ja koetinnukle-iinihappojen välillä. Vaihtoehtoisesti tällaiset kaksi-säikeiset alueet voivat sisältyä itse koettimeen ja voivat 25 tällaisessa tapauksessa lisäksi olla interkalatoituneina ennen koettimen käyttöä analyysissä. Siten havaittavat in-terkalaatio-kompleksit voivat muodostua in situ analyysin aikana tai voivat olla olemassa koetinreagenssissa, kun se tuodaan tutkittavaan alustaan. Lisäksi interkalaatiokomp-30 leksit voidaan sitoa kemiallisesti interkalatoidun kak-soisrihman toiseen tai kumpaankin säikeeseen. Yleensä mitä tahansa muunnosta voidaan seurata, edellyttäen, että hyb-ridisaatio-tuote lopuksi sisältää interkalaatio-komplek-seja, jotka ovat havaittavia vasta-aineen sitoutumisil-35 miöllä, joka on tämän keksinnön perusta.
li 9 84338
Siten tämä keksintö tarjoaa edullisen nukleiinihapon hybridisaatiomenetelmän ja reagenssisysteemin. Lisäksi kuvataan uusi vasta-aine-reagenssi, joka pystyy sitoutumaan interkalaatiokompleksien kanssa. Lisäksi, eri-5 tyisten polynukleotidisekvenssien havaitsemisen ohella tässä esitellään yleinen menetelmä kaksisäikeisten nukleiinihappojen havaitsemiseksi lisäämällä interkalaattoria ja anti-(interkalaatiokompleksi)-vasta-ainetta ja määrittämällä vasta-aineen sitoutuminen.
10 Tämän keksinnön edut ovat merkitseviä ja lukuisia.
Keksintö sopii suurelle valikoimalle ei-radioaktiivisia havaitsemismenetelmiä. Lisäksi nukleiinihappojen merkkaaminen on suora ja siinä käytetään helposti syntetisoitavia reagensseja. Merkkaaminen interkalaattorilla ei vaadi kal-15 liitä polymeraaseja ja interkalaattorin merakkaustiheyttä voidaan helposti valvoa. Tietyillä edullisilla suoritusmuodoilla on muita etuja. Niissä suoritusmuodoissa, joissa interkalaattori/nukleiinihappo-kompleksi muodostuu in situ, ei tarvita kompleksin aikaisempaa synteesiä ja tätä 20 tapaa voidaan käyttää formaatissa, jossa koetin tehdään liikkumattomaksi kiinteällä kantimella ja upotetaan liuokseen, joka sisältää näyte-nukleiinihapon. Suoritusmuodossa, jossa interkalaattori kytketään kovalenttisesti nukleiinihappoon, interkalaattori kiinnittyy koettimeen val-25 mistusprosessin aikana, antaen kontrolloidun kyllästymist-ason. Tämä tapa minimoi myös käyttäjän altistumisen inter-kalaatioaineelle, joista monet voivat olla piilevästi vaarallisia.
Oheisista piirroksista 30 kuva 1, kuten edellä selostettiin, on kaavamainen esitys edullisesta vuorovaikutuksesta interkalaattorin ja kaksisäikeisen nukleiinihapon välillä, mistä on seurauksena interkalaatiokompleksi, joka on vasta-aineella havaittavissa.
35 Kuvat 2-5 ovat kaavamaisia diagrammeja neljästä 10 8 4 838 edullisesta hydridisaatioformaatista käytettäviksi tässä keksinnössä.
Interkalaattori
Kuten edellä selostettiin, on interkalaattori-yh-5 diste edullisesti pienmolekyylipainoinen, tasossa oleva, tavallisesti aromaattinen, mutta joskus polysyklinen, molekyyli, joka pystyy sitoutumaan kaksisäikeisten nukleiinihappojen, esim. DNA/DNA-, DNA/RNA- tai RNA/RNA-kak-sikkojen kanssa, tavallisesti insertiolla emäsparien vä-10 liin. Pääasiallisin sitoutumismekanismi on tavallisesti ei-kovalenttinen, jolloin kovalenttinen sitoutuminen tapahtuu toisena vaiheena, jossa interkalaattorilla on reak-tiokykyisiä tai aktivoituvia kemiallisia ryhmiä, jotka muodostavat kovalenttisia sidoksia viereisten kemiallisten 15 ryhmien kanssa toisella tai kummallakin interkalatoiduista kaksikkosäikeistä. Tulos interkalaatiosta on vierekkäisten emäsparien leviäminen n. kaksinkertaiseen niiden normaaliin välimatkaa, mikä johtaa kaksikon molekyylin pituuden lisääntymiseen. Lisäksi täytyy kaksoiskierteen n. 20 12-36 asteen aukikiertymisen tapahtua interkalaattorin mahduttamiseksi. Yleiskatsauksia ja lisää informaatiota voidaan saada julkaisuista Lerman, J. Mol. Biol. 3:18 (1961); Bloomfield et ai., "Physical Chemistry of Nucleic Acids" luku 7, sivut 429-476, Harper ja Rowe, NY(1974); 25 Waring. Nature 219:1320 (1968); Hartmann et al. Angew. Chem. englantilainen painos 7:696 (1968); Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211 (1978); Wilson, Intercalation Chemistry (1982), 445; ja Berman et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:87 (1981).
30 Tässä keksinnössä voidaan käyttää laajaa joukkoa ..... interkalaatio-aineita. Näiden aineiden joitakin luokkia ja esimerkkejä spesifisistä yhdisteistä annetaan seuraavassa taulukossa:
II
H 84838
Interkalaattori-luokkia ja edustavia yhdisteitä Kirjallisuusviitteet A. Akridiini-väriaineet Lerman, supra; Bloomfield et ai., supra; proflaviini, akridiini- Miller et ai., Biopolymers oranssi, kinakriini, akriflaviini 19:2091(1980) B. Fenantridiinit Bloomfield et ai., supra;
Miller et ai., ssupra etidium koralyyni Wilson et ai., J. Med.
Chem. 19:1261(1976)
ellipti siini, elliptisiini— Festy et ai., FEBS
kationi ja -johdannaiset Letters 17:321(1971);
Kohn et ai., Cancer Res. 35:71(1976); LePecq et ai., PNAS (USA)71:5078(1974); Pelaprat et ai., J. Med. Chem. 23:1330(1980) C. Fenatsiinit Bloomfield et ai., supra 5-metyylifenatsiini-kationi D. Fenotiatsiinit ibid klopromatsiini E. Kinoliinit ibid klorokiini ;V; kiniini F. Aflatoksiini ibid G. Polysykliset hiilivedyt ..
ja niiden oksiraani- loid johdannaiset 3,4-bentspyreeni „ ^ , bentsopyreeni dioli Hang ni0?10^s * epoksidi, 1-pyrenyyli^ Res. Comm. 82 :929 (1978) oksiraani * bentsantraseeni-5,6-oksidi
Ames et ai., Science 176:47(.972) i2 8 4 838 H. Aktinomyseenit Bloomfield et ai., supra
aktinomysiini D
I. Antrasyklinonit ibid -rodamysiini A daunamysiini J. Tiaksantenonit ibid
miracil D
K. Antramysiini ibid L. Mitomysiini Ogawa et ai., Nucl. Acids
Res., Spec. Pubi. 3:79(1977); Akhtar et ai., Can. J.
Chem. 53:2891(1975) M. Platina-kompleksit Lippard, supra N. Polyinterkalaattorit ekinomvsiini Waring et ai., Nature 252 :653 (1974) ;
Wakelin, Biochem. J.
157 :721 (1976) kinomysiini Lee et ai., Biochem. J.
friostiini 173:115(1978); Huano et ai., BBM928A Biochem. 19: 5537(1980); tandem Vis^amitra et ai., Nature 289:817(1981) diakridiinit LePecq et ai., PNAS (USA) 72:2915(1975); Carrelakis et ai Biochem. Biophys. Acta 418:277 . (1976); Wakelin et ai., Bio- chem. 17:5057 (1978);
: : Wakelin et ai., FEBS
Lett. 104 :261 (1979);
Capelle et ai., Biochem. 18:3354(1979); Wright et ai., Y Biochem. 19:5825(1980); : Bernier et ai., Biochem. J.
199:479(1981); King et ai., Biochem. 21:4982(1982) etidium-dimeeri Gaugain et ai., Biochem.
:;· 17:5078(1978); Kuhlman et ai.,
Nucl. Acids Res. 5:2629(1978); :Y: Marlcovits et ai., Anal. Bio- chem. 94 :259 (1979); Dervan * ' et ai., JACS 100:1968(1978); ibid 101:3664 (1979) .
elliptiseeni-dimeeritj ja analogit Ser· D 284:81(1977); Pelaprat
II
i3 84838 et ai., J. Med. Chem. 23:1336 (1980) heterodimeerit Cain et ai., J. Med. Chem.
21:658(1978); Gaugain et ai., Biochem. 17:5078(1978) trimeerit Hansen et ai., JCS Chem. Comm.
162(1983); Atnell et ai., JACS 105:2913(1983) O. Norphil1 in Λ Loun et ai., JACS 104 :3213 (1982) P. Fluoreenit ja fluorenonit Bloomfield et ai., supra fluorenodiamiinit
Witkowski et ai., Wiss. Beitr. -Martin-Luther-Univ. Halle Wittenberg, 11(1981) Q. Furokumariinit angelisiini Venema et ai., MGG, Mol. Gen.
Genet. 179 ; 1 (1980) 4,5'-dime tyyli angelis i ini Vedaldi et ai., Chem. Biol.
Interact. 36:275(1981) psoraleeni Marciani et ai., Z. Naturforsci B 27 (2) :196 (1972) 8-metoksipsoraleeni Belognzov et ai., Mutat. Res.
84 :11 (1981) ;
Scott et ai., Photcchem. Photobiol. 34:63(1981) 5-aminometyyli-8- Hansen et ai., Tet. T.ett.
• metoksi-psoraleeni 22:1847 (1981) W 4,5,8-trimetyylipsoraleeni Ben-Hur et ai., Biochem.
Biophys. Acta 331:181 (1973) 4 ’ -aminometyyli-4,5,8- Issacs et ai., Biochem.
"" tnmetyylipsoraleeni 16 :1058 (19 77) ksantotoksiini Hradecma et ai., Acta Virol.
(engl. painos) 26:305(1982) kelliini Beaumont et ai., Biochim.
: Biophys. Acta 608:1829(1980) : ' R. Bentsodipyronit Murx et ai., J. Het. Chem 12417(1975); Horter et ai., ..." Photochem. Photobiol. 20:407 (1974 : S. Monostral Fast Blue Juarranz et ai., Acta
Histochem. 70:130(1982) i4 84838 Tämän keksinnön useat suoritusmuodot käsittävät interkalaattorin kemiallisen, esim. kovalenttisen, sidoksen kaksikon toiseen tai kumpaankin komplementaariseen säikeiseen. Pääasiallisesti mitä tahansa sopivaa menetel-5 mää voidaan käyttää tällaisen sidoksen aikaansaamiseksi. Mukavasti sidos muodostetaan toteuttamalla interkalaatio reaktiokykyisellä, edullisesti valoreaktiokykyisellä in-terkalaattorilla, mitä seuraa sitomisreaktio. Eräs erityisen hyödyllinen menetelmä käsittää atsidointerkalaattorien 10 käytön. Reaktiokykyiset nitreenit kehitetään helposti aallonpituudeltaan pitkällä ultravioletti- tai näkyvällä valolla ja aryyliatsidien nitreenit antavat etusijan in-sertioreaktioille niiden uudelleenjärjestäytymistuotteiden asemesta [ks. White et ai., Methods in Enzymol. 46:644 15 (1977)]. Edustavia atsidointerkalaattoreita ovat 3-at- sidoakridiini, 9-atsidoakridiini, etidiummonoatsidi, etid-iumdiatsidi, etidiumdimeeriatsidi [Mitchell et ai., JACS 104:4265 (1982], 4-atsido-7-kloorikinoliini ja 2-at- sidofluoreeni. Muita käyttökelpoisia valoreaktiokykyisiä 20 interkalaattoreita ovat furokumariinit, jotka muodostavat [2+2]-sykloaddukteja pyrimidiini-tähteiden kanssa.. Voidaan käyttää myös alkyloimisaineita, kuten bis-kloorietyyli-amiineja ja epoksideja tai atsiridiinejä, esim. aflatok-siineja, polysyklisiä hiilivety-epoksideja, mitomysiiniä 25 ja norfiliini A:ta.
Käytetystä hybridisaattioformaatista riippuen, kuten yksityiskohtaisemmin jäljempänä selostetaan, voidaan käyttää kemiallisesti sidottuja interkalaatiokomplekseja monilla eri tavoilla tässä keksinnössä. Ne voidaan muodos-30 taa in situ hybridisaatioreaktioseoksessa tai prosessivaiheessa sen jälkeen, tai voivat olla vaiheena merkatun koetin- tai näytenukleiinihapon synteesissä. Jälkimmäisessä tapauksessa, jossa interkalaatio tapahtuu täydentyvällä alueella koetin- ja näyte-nukleiinihappojen välissä, ai-35 kaansaadaan mono-sidoksia, mitä seuraa tällaisen alueen 15 84838 denaturointi antamaan yksisäikeinen nukleiinihappo, jossa kemiallisesti sidottu interkalaattori on suuntautunut niin, että hybridisaation jälkeen sidottu interkalaattori omaksuu interkalaatio-aseman.
5 Hybridlsaatioformaatteja ja koettimia
Koetin sisältää ainakin yhden yksisäkeisen emässek-venssin, joka on pääasiallisesti komplementaarinen tai homologinen havaittavan sekvenssin kanssa. Tällaisen emäs-sekvenssin ei kuitenkaan tarvitse olle yksinkertainen jat-10 kuva polynukleotidisegmentti, vaan se voi koostua kahdesta tai useammasta yksittäisestä segmentistä, jotka ovat ei-homologisten sekvenssien katkaisemia. Nämä ei-homologiset sekvenssit voivat olla lineaarisia tai ne voivat olla it-se-komplementaarisia ja muodostavat hiusneulasilmukoita. 15 Lisäksi koettimen homologisen alueen reunoilla 3'- ja 5'-päätteillä voi olla ei-homologisia sekvenssejä, kuten sellaisia, jotka sisältävät vektori-DNA:n tai-RNA:n, joina homologinen sekvenssi oli insertoitu lisääntymistä varten. Kummassakin tapauksessa koetin tuotuna analyyttisenä reag-20 enssina antaa havaittavan hybridisaation yhdessä tai useammassa pisteessä kiinnostavien näyte-nukleiinihappojen kanssa.Koetinelmenttinä voidaan käyttää lineaarisia tai ympyränmuotoisia yksisäikeisiä polynukleotideja, joissa suuremmat tai pienemmät osat ovat kahdentuneet komplemen-25 taarisella polynykleotidisäikeellä tai säikeillä, edellyttäen, että ratkaiseva homologinen segmentti tai segmentit ovat yksisäikeisessä muodossa ja käytettävissä hybridisaatiota varten näyte-DNA:n tai-RNA:n kanssa. Erityisen edullisia ovat lineaariset tai ympyränmuotoiset koettimet, 30 joissa homologinen koetinsekvenssi on olennaisesti vain yksisäkeisessä muodossa [ks. erityisesti Hu ja Messing, Gene 17:271-277 (1982)].
Kun koetinta käytetään hybridisaatioformaatissa, joka vaatii käytettäväksi interkalaattori-merkattua koe-35 tinta, kuten seuraavassa nähdään, tällainen koetin voi ie 84838 olla joukossa eri muotoja, kuten täysin yksisäkeisenä po-lynukleotidinä, johon interkalaattori on kemiallisesti sidottu, jolloin hybridisaatiosta on tuloksena inter-kalaatiokompleksien muodostuminen. Vaihtoehtoisesti koetin 5 voi sisältää kaksisäikeisen osan tai osia, jotka on inter-kalatoitu, valinnaisesti interkalaattorin kovalenttisella sidoksella toiseen tai kumpaankin säikeeseen kaksikossa.
Hybridisaatioformaatteina tämä keksintö on keskitetty hybridisaatiokasauman muodostamiseen, joka sisältää 10 hybridisoidun koettimen ja interkalaattorin sidottuna kak-soissäikeisiin vasta-aineilla havaittavien interkalaatiok-ompleksien muodossa. Siten hybridisaatio-tapahtumaan liittyy havaittavien interkalaatiokompleksien muodostuminen. Pohjimmiltaan syntyneet interkalaatiokompleksit kasaumassa 15 voivat olla hybridisaatio-alueella näyte- ja koetin-nukle-iinihappojen välissä tai voivat olla kaksisäikeisellä alueella etäällä hybridisaatio-alueesta. Tällaisessa viimemainitussa tapauksessa interkalatoitu alue voi muodostua analyysin aikana tai voi olla interkalatoidussa tilassa, 20 kun tuodaan analyysiin, esimerkiksi kovalenttisesti sidottuina tai ei-kovalenttisesti interkalatoituina kaksi-säi-keisinä alueina, jotka toimivat merkkeinä koettimelle.
Tämän analyysimenetelmän käytäntö ei rajoitu mihinkään nimenomaiseen hybridisoimisformaattiin. Voidaan käyt-25 tää mitä tahansa tavanomaista hybridisoimismenetelmää. Kun parannuksia tehdään ja kun käsitteellisesti uusia formaatteja kehitetään, tällaisia voidaan helposti käyttää tämän menetelmän toteuttamiseen. Tavanomaiset hybridisoimisfor-maatit, jotka ovat erityisen käyttökelpoisia, käsittävät 30 sellaisia, joissa näyte-nukleiinihapot tai polynukleotidi-koetin tehdään liikkumattomaksi kiinteällä kantimella (ki-intofaasi-hybridisaatio) ja sellaisia, joissa polynuk-leotidilajit ovat kaikki liuoksessa (liuos-hybridisaatio).
Kiintofaasi-hybridisoimisformaateissa yksi polynuk-35 leotidi-lajeista, joka ottaa osaa hybridisäätiöön, kiinni- li i7 84838 tetään sopivalla tavalla yksisäikeisessä muodossaan kiinteään kantimeen. Käyttökelpoiset kiinteät kantimet ovat alalla hyvin tunnettuja ja ovat niitä, jotka sitovat nukleiinihappoja joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti.
5 Ei-kovalenttiset kantimet, joihin yleisesti ymmärretään liittyvän hydrofobinen sitominen, ovat luonnossa esiintyviä ja synteettisiä polymeeri-aineksia, kuten nitrosel-luloosa, johdettu nailon ja fluoratut polymeroidut hiilivedyt, joukossa erilaisia muotoja, kuten suodattimia tai 10 kiinteinä levyinä. Kovalenttisesti sitovat kantimet ovat myös käyttökelpoisia ja käsittävät aineksia, joissa on kemiallisesti reaktiokykyisiä ryhmiä kuten diklooritriat-siini, diatsobentsyylioksimetyyli jne., jotka voidaan aktivoida sitoutumista varten polynukleotideihin.
15 Eräs tyypillinen kiintofaasi-hybridisoimismenetelmä alkaa näyte-nukleiinihappojen liikkumattomaksi tekemisellä kantimelle yksisäikeisessä muodossa. Tämä alkuvaihe estää olennaisesti näytteen komplementaaristen säikeiden takaisin liittymisen ja voidaan käyttää keinona näyteaineksen 20 keskittämiseksi kantimelle parantamaan havaittavuutta.
Polynukleotidi-koetin saatetaan sitten kosketukseen kan-timen kanssa ja hybridisaatio havaitaan vasta-aineen sitoutumisella kuten tässä on selostettu. Kiinteä kännin antaa mukavan tavan erottaa vasta-aineen, joka sitoutuu inter-25 kalaatiokomplekseihin, jotka liittyvät hybridisoituun koe-ttimeen, erottamiseksi siitä, joka ei näin sitoudu.
Toinen kiinnostava menetelmä on kerros-hybridisaa-tiomenetelmä, jossa koettimen homologisen sekvenssin toinen kahdesta osasta tehdään liikkumattomaksi ja toinen 30 merkataan. Kiinnostavan polynukleotidisekvenssin läsnä olosta on seurauksena kaksois-hybridisaatio liikkumattomaksi tehtyihin ja merkattuihin koetinsegmentteihin, jolloin jälleen samalla tavalla lopuksi määritetään kantimeen yhdistetyt interkalaatiokompleksit. Ks. Methods in Enzymo-35 logy 65:468(1980) ja Gene 21:77-85(1983) lisäyksityis- ie 8 4 8 38 kohtia varten.
Parempaa valaisemista varten seuraavat kiintofaasi-hybridisoimismenetelmät ovat erityisen käyttökelpoisia tässä keksinnössä. Näiden perusmenetelmien kaavamaiset 5 diagrammit on annettu piirroksissa.
Menetelmätyyppi 1 Tässä menetelmässä, joka on esitetty kuvassa 2, yksisäikeiset nukleiinihapot nestemäisestä tutkittavasta alustasta tehdään ensin liikkumattomiksi kiinteälle kanti-10 melle. Hybridisaatioreaktioseos muodostetaan sitten saattamalla liikkumattomaksi tehdyt näyte-nukleiinihapot (S) kosketukseen koettimen (P) kanssa, joka tässä tapauksessa käsittää, komplementaarisen yksisäikeisen osan lisäksi ainakin yhden kaksisäikeisen osan, joka on kemiallisesti 15 sitoutunut interkalaattorin (I) kanssa interkalaatiokomp- leksien muotoon. Koettimen erityisen käyttökelpoinen muoto on pyöreä muoto, jota ovat selostaneet Hu ja Messing, supra. Syntynyt hybridisaatio-kasautuma sisältää kiinnostavan liikkumattomaksitehdyn polynukleotidin hybridisoituna koe-20 ttimen kanssa, jolla on kovalenttisesti sitoutunut, inter-kalatoitunut kaksisäikeinen alue. Kiinteä kännin, jolla on likkkumattomaksi tehtyjä kaksikkoja, erotetaan sitten ensisijaisesti reaktioseoksen muusta osasta. Vasta-aine (Ab) lisätään, edullisesti merkattuna havaittavalla ryhmällä, 25 ja syntynyt liikkumattomaksi tehty vasta-aine, joka on sitoutunut interkalaatiokomplekseihin kasautumassa, erotetaan reaktioseoksen jäljelle jääneestä osasta. Kantimeen sitoutunut vasta-aine määritetään sitten analyysin lopettamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää vasta-aine .: 30 erotetussa liuoksessa; vaikka tämä on yleensä vähemmän edullista, koska normaalisti käytetään suurta ylimäärää vasta-ainetta.
Eräs muunnos tästä menetelmästä on käyttää koetin-ta, kuten edellä, mutta jossa ei ole kovalenttisesti lii-35 tettyä interkalaattoria sitoutuneena kaksisäikeiselle alu-
II
i9 84838 eelle. Mieluummin interkalaattori liätään liikkumattomaksi tehtyyn kasautumaan, mistä on seurauksena interkalaat-torikompleksien muodostuminen sekä koettimen kaksisäi-keissä osassa että hybsidisaatiolla muodostuneella kahden-5 netulla alueella.
Menetelmätyyppi 2 Tämä on kerros-formaatti ja se on esitetty kuvassa 3. Reaktioseos muodostetaan tutkittavaan alustaan, joka sisältää kiinnostavan sekvenssin (S) ja ensimmäisen ja 10 toisen koettimen, joista kumpikin sisältää vastaavasti ainakin yhden emässekvenssin, joka on komplementaarinen kiinnostavan sekvenssin osalle, joka on muu kuin toiselle koettimelle yksisäikeisen jakson kanssa komplementaarinen osa. Ensimmäinen koetin () tehdään liikkumattomaksi kiin-15 teälle kantimelle ja toinen koetin (P2) merkataan kova- lenttisesti sidotuilla interkalaatiokomplekseilla kuten menetelmätyypissä 1 edellä. Syntynyt hybridisaatio-kasau-tuma sisältää kiinnostavan sekvenssin hybridisoituna sekä liikkumattomaksi tehtyyn ensimmäiseen koettimeen että in-20 terkalaatiokompleksilla merkattuun toiseen koettimeen.
Vasta-aine lisätään, edullisesti merkatussa muodossa, ja syntynyt liikkumattomaksi tehty vasta-aine, sitoutuneena interkalaatiokomplekseihin kasautumassa, erotetaan reak-tioseoksen muusta osasta. Sidottu vastaaine määritetään - 25 analyysin siten lopettamiseksi.
Tästä menetelmästä on olemassa useita käyttökelpoisia muunnoksia. Ensinnäkin, kuten menetelmätyypin 1 muunnoksen tapauksessa, voidaan käyttää koetinta, joka ei sisällä kovalenttisesti sidottua interkalaattoria, vaan mie-30 luummin voidaan lisätä vapaata interkalaattoria liikkumattomaksi tehtyyn kasautumaan, mistä on seurauksena interka-laattorikompleksien muodostuminen, jossa on kaikki käytettävissä olevat kaksisäikeiset alueet. Myös vaihtoehtoina toisen koettimen käyttämiselle, jossa on kaksisäikeinen 35 osa, voidaan 11 käyttää kokonaan yksisäikeisen nukleiini- 2o 8 4 8 38 hapon koetintä, johon interkalaattori on kemiallisesti liittynyt, niin että hybridisaation jälkeen muodostuu in-terkalaatiokomplekseja, tai lisäten interkalaattori niin, että interkalaatio tapahtuu kaksikkojen välillä, jotka 5 ovat muodostuneet kahden koettimen ja havaittavan sekvenssin välille.
Menetelmä tyyppi _3
Kuva 4 esittää vielä erästä edullista kiintofaasi-formaattia. Näyte-nukleiinihapot saatetaan koskeukseen 10 liikkumattomaksi tehdyn koettimen kanssa ja edullisesti syntyneet liikkumattomaksi tehdyt kaksikot erotetaan reak-tioseoksen muusta osasta. Tässä formaatissa koetin on yk-sisäikeisessä muodossa. Syntynyt hybridisaatio-tuote käsittää likkumattomaksi tehdyn koettimen hybridisoituna 15 kiinnostavan sekvenssin kanssa. Myös tämä formaatti sallii merkittävän takaisinliittymisen näytenukleiinihapon komplementaaristen alueiden välillä, mikä voi tapahtua liikku-mattomaksitehdyllä kasautumalla. Tällainen liittyminen toimii analyysin eduksi, koska se antaa lisää kaksisäi-20 keistä nukleiinihappoa myöhempää interkalaatiota varten.
Seuraavana vaiheena analyysissä on lisätä interkalaattoria ja vasta-ainetta, jälleen edullisesti merkatussa muodossa. Analyysi lopetetaan erottamis- ja vasta-aineen määritys-vaiheilla kuten edellisissä formaateissa.
: 25 Menetelmätyyppi 4 Tässä menetelmässä, joka on esitetty kuvassa 5, yksisäikeiset näyte-nukleiinihapot saatetaan kosketukseen liikkumattomaksitehdyn koettimen kanssa, jolloin, tässä tapauksessa, tällainen koetin on kemiallisesti sitoutunut, 30 esimerkiksi kovalenttisesti interkalaattoriin niin, että kaksikon muodostumisesta sidotun interkalaattorin alueella on seurauksena interkalaatiokompleksien muodostuminen. Tämä on erittäin edullinen formaatti sikäli, että se on ainoa tunnettu menetelmä, jossa koetin on sekä tehty liik-35 kumattomaksi että merkattu, mikä ei vaadi mitään liikku- li 2i 84 8 38 mattomaksitekemis- tai merkkausvaihetta suoritettavaksi analyysin aikana. Syntynyt kasautuma sisältää kovalentti-sesti sidottuja interkalaatiokomplekseja hybridisaation alueella näyte- ja koetin-nukleiinihappojen välillä ja 5 kaikilla takaisinliittyneillä näytealueilla. Vasta-aineita lisätään sitten ja analyysi lopetetaan kuten aikaisemmissa formaateissa. Tämä formaatti antaa sen edun, että analyysintekijän ei tarvitse käsitellä vapaan interkalaat-torin, joka jossakin tapauksessa voi olla piilevästi vaa-10 rallinen, liuoksia. Eräs yksinkertainen muunnos tästä menetelmästä on tehdä näyte-nukleiinihapot liikkumattomiksi eikä merkattu koetin, ja jatkaa normaaliin tapaan. Tämä on jonkinverran vähemmän edullista, mutta on eräs käytännöllinen analysoimistapa.
15 Joukkoa erilaisia liuosfaasi-hybridisaatioformaat- teja voidaan myös käyttää tähän keksintöön. Tällaisille formaateille on ominaista, että hybridisoimisvaihe käsittää sekä näyte-nukleiinihappojen että koettimen liukoisia muotoja. Tästä voi olla tuloksena merkitsevästi nopeampia 20 hybridisaatioita, koska kinetiikat ovat paljon nopeampia, kun molemmat säikeet ovat liuoksessa, verrattuna siihen, että toinen on tehty liikkumattomaksi. Normaalisti syntyvät hybridit tehdään hybridisoimisvaiheen jälkeen liikkumattomiksi havaitsemistarkoituksia varten. Tällainen :25 liikkumattomaksi tekeminen voidaan suorittaa joukolla eri tapoja. Tavanomaisesti on tunnettua tehdä kaksikot selektiivisesti liikkumattomiksi altistamalla adsorbenteille, kuten hydroksiapatiitille ja nitroselluloosa-membraaneil-le.
30 Eräs erityisen edullinen tapa liuosfaasi-hybridi- saatiolla muodostettujen hybridien liikkumattomiksiteke-miseksi käsittää koettimen käytön, jolla on sitomiskohta sideainetta varten. Hybridisoimisvaiheen jälkeen voidaan sitten lisätä sideaineen liikkumattomaksitehty muoto, joka 35 sitoutuu tehokkaasti, ja tehdä hybridit liikkumattomiksi 22 84 8 38 sitomiskohdan kautta koettimella. Tällainen sitomiskohta voi olla läsnä koettimen yksisäikeisellä hybridisoituvalla osalla tai voi olla läsnä tuloksena koettimen kemiallisesta muunnoksesta. Esimerkkejä nukelotidisekvenssissä ole-5 vista sitomiskohdista ovat ne, joissa koetin sisältää pro-moottorisekvenssin (esim. lac-promoottorin, trp-promoot-torin), jonka promoottoriproteiini (esim. bakteriofagipro-moottorit, RNA-polymeraasi) pystyy sitomaan, tai sisältää operaattorisekvenssin (esim. lac-operaattorin), jonka 10 repressoriproteiini (esim. lac-repressori) pystyy sitomaan, tai sisältää harvinaisia, antigeenisiä nukleotidejä tai sekvenssejä (esim. 5-bromi- tai 5-jodideoksiuridiini, Z-DNA), jonka spesifiset vasta-aineet voivat sitoa [ks. myös GB-patentti 2 125 964]. Koettimen kemiallisella muun-15 noksella tuodut sitomiskohdat ovat erityisen käyttökelpoisia ja käsittävät normaalisti spesifisen sidosparin toisen jäsenen kytkemisen koettimen nukleiinihappoon. Käyttökelpoisia sidospareja, joista voidaan valita, ovat biotii-ni/avidiini, hapteenit ja antigeenit/vasta-aineet, hiili-20 hydraatit/lektiinit, entsyymit/inhibiittorit jne. Kun si-dospari käsittää proteiini-jäsenen ja ei-proteiini-jäsenen, on edullista sitoa ei-proteiini-jäsen koettimeen, koska proteiini-jäsen voi olla pysymätön koettimen hybri-disaation denaturoivissa olosuhteissa. Edulliset syteemit 25 käsittävät koettimen sitomisen biotiinilla tai hapteenilla ja liikkumattomaksitehdyn avidiinin tai antihapteeni-vas-ta-aineen käyttämisen, vastaavasti. Käyttökelpoisten li-— gandi-merkattujen koettimien valmistus on kirjallisuudessa tunnettu [Langer et ai. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. 30 78:6633; Brocer (1978) Nucl. Acids Res. 5:363; Sodja et ai. (1978) Nucl. Acids Res. 5:385; Tchen et ai. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81:3466]. Sideaineen liikkumattomaksi tekeminen voi seurata tavanomaisia menetelmiä. Suuri joukko eri menetelmiä tunnetaan proteiinien tekemiseksi 35 liikkumattomiksi kiinteillä kantimilla ja nämä menetelmät
II
23 8 4 8 38 ovat käyttökelpoisia sideaineen liikkumattomaksitekemiseen /ks. Methods in Enzymology, Voi. 44 (1976)]. Esimerkiksi vasta-aineet tehdään liikkumattomiksi joko kytkemällä ko-valenttisesti tai ei-kovalenttisella adsorptiolla. Ei-ko-5 valenttisia menetelmiä, joita usein käytetään, ovat adsorptio polystyreeni-helmiin tai pienosasiin ja polyvinyy-likloridipinnalle. Monia kovalenttisia menetelmiä käytetään proteiinien liikkumattomiksitekemiseen ja jotkut harvat käsittävät syaanibromidilla aktivoituja agarooseja ja 10 dekstraaneja; glutaarialdehydi-aktivoituja nailoneita ja polyakryyliamideja; sekä epoksideja akryyli- ja muilla kantimilla.
Edellä esitetyt kuvaavat menetelmät ovat erityisen edullisia, mutta tämä keksintö ei kuitenkaan rajoitu mi-15 hinkään nimenomaiseen hybdirisaatioformaattiin. Mitä ta hansa analysoimistapaa voidaan seurata edellyttäen, että havaittavia interkalaatiokomplekseja syntyy koetin-nuk-leiinihapon hybridisaation yhteydessä. Esimerkiksi edellä esitettyjen menetelmien lisäksi voidaan suunnitella liuos-20 faasi-hybridisaatioformaatti, jossa käytetään kiintofaasi- vasta-ainetta interkalaatiokomplekseille hybridisoidun koettimen liikkumattomaksitekemiseksi. Riittävästi interkalaatiokomplekseja muodostuu hybridisaatiotuotteeseen näyte- ja koetin-nukleiinihappojen välillä, jolloin jäl-25 kimmäinen on pääasiallisesti ainoastaan yksisäikeisessä muodossa niin että sekä kiintofaasi-vasta-aine että merkattu vasta-aine voivat sitoutua.
Kiinteän faasin kanssa yhdistyneen merkkiaineen määrä mitataan sitten ja asetetaan suhteisiin määrittävän 30 sekvenssin läsnäolon kanssa. Muut käyttökelpoiset formaa tit ovat alaan tavallisesti perehtyneelle selviä. Vasta-aine-reagenssi ja havaitsemiskaavioita Tämän keksinnön perusperiaate on kyky ensin sitoa vastaaine tai sen osanen tai joku muu samanarvoinen osa 35 hybridisaatio-kasautumaan, joka sisältää hybridisoidun 24 84838 koettimenja sitten havaita tällainen vasta-aine-sitoutumi-nen. Kuten edellä todettiin, vasta-aine-reagenssi voi käsittää kokonaisia vasta-aineita, vasta-aine-osasia, poly-funktionaalisia vasta-aine-kasautumia tai yleensä minkä 5 tahansa aineen, joka sisältää yhden tai useampia interka-laatiokompleksi-spesifisiä sitomiskohtia vasta-aineesta. Kokonaisen vasta-aineen muodossa se voi kuulua johonkin tunnettujen immunoglobuliinien luokkiin ja alaluokkiin, esim. IgG, igM jne. Tällaisen vasta-aineen mitä tahansa 10 osasta, joka säilyttää spesifisen sitomisaffiniteetin in-terkalaatiokomplekseihin, voidaan myös käyttää, esimerkiksi IgG:n osasia, jotka yleensä tunnetaan Fab:na, F(ab'):ha ja F(ab')2:na. Lisäksi immunoglobuliinien tai niiden osasten kasautumia, polymeerejä ja konjugaatteja voidaan käyt-15 tää, milloin on sopivaa.
Immunoglobuliini-lähde vasta-aine-reagenssille voidaan saada jollakin käytettävissä olevalla tavalla, kuten tavanomaisilla vastaseerumi- ja monoklonaalisilla menetelmillä. Antiseerumi voidaan saada hyvin vakiintuneilla 20 menetelmillä, jotka käsittävät jonkun eläimen, kuten hii ren, kaniinin, marsun tai vuohen immunoinnin sopivalla immunogeenillä. Immunogeeni on tavallisesti ioninen kompleksi kationisen proteiinin tai proteiini-johdannaisen (esim. metyloidun naudan seerumialbumiinin) ja anionisen : 25 interkalaattorinukleiinihappo-kompleksin välillä. Ihan teellisesti interkalaattorin tulisi olla kovalenttisesti kytketty kaksisäikeiseen nukleiinihappoon. Vaihtoehtoisesti interkalaattori-DNA-konjugaatti voi olla kovalenttisesti kytketty kanninproteiiniin. Immunoglobuliineja voidaan 30 saada myös somaattisten solujen hybridisaatio-menetelmil- lä, joista tuloksena saadaan tuotteita, joita yleisesti nimetään monoklonaalisiksi vasta-aineiksi. Immunogeeni, jota käytetään primaarisiin injektioihin, jotka johtavat hybridoman muodostumiseen, on kuten edellä selostettiin. 35 Vasta-aine-reagenssille on ominaista sen kyky si- li 25 84 8 38 toutua interkalaatio kompleksin kanssa, joka on muodostunut valitun interkalaattorin ja kaksisäikeisen nukleiinihapon välille yleensä ottamatta huomioon spesifisiä emässekvenssejä lähinnä interkalaatio-kohtaa. Lisäksi se 5 on pääasiallisesti kykenemätön sitoutumaan yksisäikeisiin nukleiinihappoihin tai vapaaseen interkalaattoriin. Tuloksena vasta-ainesitoutuminen tapahtuu ainoastaan interka-laatiokomplekseilla, joita analyysiformaatin oikealla suunnittelulla on merkitsevästi läsnä ainoastaan hybridi-10 soidun koettimen yhteydessä.
Vasta-aine-reagenssin sitoutuminen hybridisaatio-kasautumaan tässä menetelmässä voidaan havaita jollakin tavanomaisella menetelmällä. Edullisesti vasta-aine-rea-genssi on itse merkattu havaittavalla kemiallisella ryh-15 mällä. Tällainen havaittava kemiallinen ryhmä voi olla joku aines, jolla on havaittava fysikaalinen tai kemiallinen ominaisuus. Tällaisia aineksia on hyvin kehitetty immunoanalyysien alueella ja yleensä miltei jokaista merkkiainetta, joka on käyttökelpoinen tällaisissa menetel-20 missä, voidaan käyttää tässä keksinnössä. Erityisen käyttökelpoisia ovat entsymaattisesti aktiiviset ryhmät, kuten entsyymit (ks. Clin. Chem. (1976) 22:1243), entsyymisubstraatit (ks. brittiläinen patentti 1 548 741), koentsyymit (ks. US-patentit no. 4 230 797 ja 4 238 565), ja entsyymi-: 25 inhibiittorit (ks. US-patentti no. 4 134 792); fluoresoi vat aineet (ks. Clin. Chem. (1979) 25:353); kromotorit; luminoivat aineet, kuten kemiluminoivat aineet ja biolumi-noivat aineet (ks. Clin. Chem. (1979)25:512 ja ibid, 1531); spesifisesti sitoutuvat ligandit; välittömästi toi-30 siinsa vaikuttavat parit; sekä radioisotoopit, kuten 3H, 35S, 32P,125I ja 14C. Tällaiset merkkiaineet ja merkkiainepa-rit havaitaan niiden omien fysikaalisten ominaisuuksiensa (esim. fluoresoivat aineet, kromoforit ja radioisotoopit) tai niiden reaktiivisten tai sitovien ominaisuuksien 35 (esim. entsyymit, substraatit, koe-entsyymit ja 26 84 8 38 inhibiittorit) perusteella. Esimerkiksi, kofaktorilla merkattu vasta-aine voidaan havaita lisäämällä entsyymiä, jolle merkkiaine on kofaktori ja substraatti entsyymille. Hapteenilla tai ligandilla (esim. biotiinilla) merkattu 5 vasta-aine voidaan havaita lisäämällä vasta-ainetta hapteenille tai proteiinille (esim. avidiinille), joka sitoo ligandin, joka on merkattu havaittavalla molekyylillä. Tällainen havaittava molekyyli voi olla joku molekyyli, jolla on mitattava fysikaalinen ominaisuus (esim. 10 fluoresenssi tai absorboivuus) tai osanottaja entsyymi-reaktiossa (esim. ks. edellä esitetty luettelo). Esimerkiksi, voidaan käyttää enstyymiä, joka toimii substraatilla kehittämään tuotteen, jolla on mitattava fysikaalinen ominaisuus. Esimerkkejä jälkimmäisestä ovat, mutta 15 rajoittumatta niihin, β-galaktosidaasi, alkalinen fosfa-taasi ja peroksidaasi. Hybridisaatio-tutkimuksia varten in situ on lopputuote ihanteellisesti veteen liukenematon. Välittömästi vuorovaikutuksessa olevia tai kytkeviä merkkiaineita, jollaisia tunnetaan immunoanalyysin alueella 20 (ks. Clin. Chem. 27:1797(1981) ja US- patentit no.
3 996 345 ja 4 233 402), voidaan käyttää tähän menetelmään käyttämällä vasta-aineiden kahta eri populaatiota, joista toinen on merkattu parin toisella jäsenellä ja toinen merkattu parin toisella jäsenellä. Esimerkiksi ensimmäinen 25 osa vasta-aineista interkalaatiokomplekseille merkataan fluoresoivalla aineella ja toinen osa merkataan tukahduttajalla. Interkalaatiokompleksien läsnäolo osoitetaan tukahduttamalla fluoresenssi, joka aiheutuu ensimmäisen ja toisen annoksen vasta-aineiden läheisestä sitoutumisesta 30 pitkin interkalatoitua nukleiinihappokaksikkoa. Samalla tavalla voidaan käyttää ensimmäistä ja toista entsyymi-merkkiainetta, jolloin toisen tuote on substraatti toiselle. Kompleksien läsnäolo osoitetaan sitten lisääntyneellä muuttumisella toisen entsyymin vaikutuksesta, mikä aiheu-35 tuu läheisen entsyymin kanavoivasta vaikutuksesta. Muut li 27 84838 merkkauskaaviot ovat alaan tavallisesti perehtyneelle selviä.
Vaihtoehtoisesti vasta-aine voidaan havaita jonkun luontaisen ominaisuuden kuten sen oman antigeenisyyden pe-5 rusteella. Merkattu anti-(vasta-aine)vasta-aine sitoutuu primaariseen vasta-aine-reagenssiin, kun merkkiaine toiselle vasta-aineelle on joku tavallinen merkkiaine kuten edellä. Edelleen vasta-aine voidaan havaita komplementti-kiinnitttymisellä tai käyttämällä merkattua proteiini A: ta 10 yhtä hyvin kuin muilla alalla tunnetuilla menetelmillä vasta-aineiden havaitsemiseksi.
Kun vasta-aine on merkattu, kuten on edullista, merkkaava osa ja vasta-aine-reagenssi yhdistävät tai sitoutuvat toisiinsa suoralla kemiallisella sidoksella, joka 15 käsittää kovalenttisia sidoksia, tai epäsuorasti sitoutumalla, kuten yhdistämällä merkkiaine mikrokapseliin tai liposomiin, joka vuorostaan kytketään vasta-aineeseen. Merkkausmenetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja tässä keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa menetel-20 mää.
Reakt ioseos
Analysoitava testinäyte voi olla mikä tahansa kiinnostava alusta ja on tavallisesti nestenäyte, jolla on lääketieteellistä, eläinlääketieteellistä, ympäristöllis-25 tä, ravintoopillista tai teollista merkitystä. Ihmis- ja eläinnäytteet sekä kehon nesteet erityisesti voidaan analysoida tällä menetelmällä, kuten virtsa, veri (seerumi tai plasma), maito, selkäydinneste, yskös, ulosteaine, keuhkoimunäyte, kurkkuvanutupot, sukuelinvanutupot ja tu-30 lehdusnesteet, peräsuolivanutupot ja nenänieluimunäytteet.
Kun testinäyte, joka on saatu potilaalta tai muusta testattavasta näytteestä, sisältää pääasiallisesti kaksisäi-keisiä nukleiinihappoja, jollaisia solut sisältävät, näytettä käsitellään nukleiinihappojen denaturoimiseksi ja, 35 jos on tarpeen, ensiksi nukleiinihappojen vapauttamiseksi 28 84 838 soluista. Nukleiinihappojen denaturointi suoritetaan edullisesti kuumentamalla kiehuvassa vedessä tai alkalikäsit-telyllä (esim. 0,1 N natriumhydroksidilla), jota, jos niin halutaan, voidaan samanaikaisesti käyttää solujen hajot-5 tamiseen. Myös nukleiinihappojen vapauttamisen voidaan saavuttaa esimerkiksi mekaanisesti hajottamalla (jäähdyt-täminen/sulattaminen, hankaaminen, äänikäsittely), fysi-kaalis-kemiallisella hajoittamisella (detergentit, kuten Triton, Tween, natriumdodekyylisulfaatti, alkalikäsittely, 10 osmoottinen shokki tai kuumuus), tai entsymaattisella hajottamisella (lysotsyymi, proteinaasi K, pepsiini). Syntynyt testialusta sisältää nukleiinihappoja yksisäikeises-sä muodossa, joka sitten voidaan analysoida tämän hybridi-soimismenetelmän mukaisesti.
15 Kuten alalla on tunnettua voidaan analyysissä käyttää erilaisia hybridisoimisolosuhteita. Tyypillisesti hybridisaatio tapahtuu lievästi korotetuissa lämpötiloissa, esim. väliltä n. 35-70 °C ja tavallisesti n. 65 °C:n tienoilla, liuoksessa, joka sisältää puskuria pH:ssa vä-20 liitä n. 6-8 ja sopivalla ioniväkevyydellä (esim. 2XSSC, jossa 1XSSC = 0,15M natriumkloridia ja 0,015 M natriumsit-raattia, pH 7,0) , proteiinia, kuten naudan seerumial- bumiinia, Ficoll (tavaramerkki, joka käsittää sakkaroosin ja epikloorihydriinin kopolymeerin, jota myy Pharmacia 25 Fine Chemicals, Piscataway, NJ) , polyvinyylipyrrolidonia ja denaturoitua vierasta DNA:ta, kuten vasikan kateenkor-vasta tai lohen siemennesteestä. Näyte- ja koetinsäikeiden täydennysaste, joka tarvitaan hybridisaation tapahtumiseksi, riippuu olosuhteiden ankaruudesta. Hybridisaation 30 ulottuvuuteen ja spesifisyyteen vaikuttavat seuraavat tärkeimmät olosuhteet: 1. Nukleiinihappo-preparaatin puhtaus 2. Koettimen emäskoostumus - G-C-emäspapereilla on suurempi lämmönkestävyys kuin A-T-emäspareilla. Siten hybri- 35 disaatiot, joihin liittyy suurempi G-C-pitoisuus, ovat 29 8 4 8 38 pysyviä korkeimmissa lämpötiloissa.
3. Homologisen emäs-sekvenssin pituus - jokaisella lyhyellä emäs-sekvenssillä (esim. vähemmän kuin 6 emästä) on suurempi todennäköisyysaste olla läsnä monissa nukleiini- 5 hapoissa. Siten vain vähän tai ei ollenkaan spesifisyyttä voidaan saavuttaa hybridisaatioissa, jotka käsittävät tällaisia lyhyitä sekvessejä. Tässä homologisessa koetin-sek-venssissä on ainakin 10 emästä, tavallisesti 20 emästä tai enemmän, ja edullisesti enemmän kuin 100 emästä. Käytännön 10 kannalta homologinen koetinsekvenssi on usein väliltä 300-1000 nukleotidia.
4. Ioniväkevyys - takaisinliittyminen nopeutuu kun in-kuboimisliuoksen ioniväkevyys kasvaa. Myös hybridien läm-mönkestävyys kasvaa.
15 5. Inkuboimislämpötila - optimaalinen takaisinliittyminen tapahtuu n. 25-30 eC sulamislämpötilan alapuolella (Tm) jollekin annetule kaksikolle. Inkubointi lämpötiloissa, jotka ovat merkitsevästi optimin alapuolella, sallii pienemmän määrän emässekvenssejä hybridisoitumisen.
20 6. Nukleiinihappoväkevyys ja inkuboimisaika - normaalis ti, reaktion viemiseksi hybridisaatiota kohti, jompaakumpaa hybridisoituvasta näyte-nukleiinihaposta tai koetin-nukleiinihaposta on läsnä ylimäärin, tavallisesti 100-ker-tainen ylimäärä tai suurempi.
25 7. Denaturoimisreagenssit - vetysidoksen rikkovien ainei den, kuten formamidin ja urean läsnäolo lisää hybridisaa-tion ankaruutta.
8. Inkuboimisaika - mitä pitempi inkuboimisaika on, sitä täydellisempi on hybridisaatio.
30 9. Tilavuutta poissulkevat aineet - näiden aineiden läs näolon, joissa esimerkkejä ovat dekstraani ja dekstraani-sulfaatti, ajatellaan tehokkasti lisäävän hybridisoimispe-rusaineiden väkevyyttä lisäten siten saadun hybridisäätiön määrää.
35 Normaalisti vasta-aine-reagenssia, ja interkalaat- 30 84 8 38 toria formaattien tapauksessa, jossa se lisätään vapaana yhdisteenä, ei ole läsnä hybridisoimisliuoksessa, mutta tämä ei kuitenkaan ole poissuljettua, kun halutaan ja kun hybridisoimisolosuhteet ovat suotuisat vasta-aineen sitou-5 tumiselle ja interkalaatiolle. Tavallisessa tapauksessa interkalaatiokompleksit, jotka yhdistyvät hybridisoidun näytteen kanssa, havaitaan hybridisoidun koettimen erottamisen jälkeen hybridisoimisliuoksesta. Kun interkalaat-tori lisätään vapaana yhdisteenä, sen pitoisuus valitaan 10 normaalisti niin, että se on riittävä kyllästämään läsnäolevat interkalaatiokompleksit, mutta ei niin suuri, että tapahtuu merkitsevää, esim. enemmän kuin 10 % interkalaat-torin itse-kasautumista. Olosuhteet interkalaatiota varten ovat yleensä lievät, esim. pH:ssa väliltä n. 6-8, kohtuul-15 lisessa ioniväkevyydessä ,<_ 1), huoneen lämpötilassa, jolloin pidennetty inkuboiminen ei ole tarpeen, esim. alle 15 minuuttia tavallisessa tapauksessa.
Interkalaatiokompleksin havaitsemiseksi vasta-ainetta kompleksille lisätään ylimäärin ja annetaan inkuboi-20 tua aika, joka vaaditaan muodostamaan havaittava tuote (esim. 5 minuuttia . 24 tuntia) olosuhteissa, joissa on neutraali pH (esim. välillä 6-8), kohtuullinen ioniväke-vyys (< 1) ja kohtuullinen lämpötila (20-40 °C). Ylimääräinen (sitoutumaton) vasta-aine poistetaan sitten pese-25 mällä samanlaisissa olosuhteissa.
Saattaa olla välttämätöntä tai toivottavaa modifioida edellä esitettyä menetelmää sisällyttämällä inter-kalaattori pesuvaiheessa nukleiinihappo-interkalaattori-kompleksin kyllästymisen ylläpitämiseksi. Myös, jos halu-30 taan, jotkut tai kaikki edellä mainitut vaiheet voidaan yhdistää, kuten lisäämällä interkalatoimisaine ja vasta-aine samanaikaisesti.
Reagenssisysteeml Tämä keksintö antaa lisäksi reagenssisysteemin, ts. 35 reagenssi-yhdistelmän, tai keinon, joka käsittää kaikki
II
3i 84 838 olennaiset perusosat, jotka tarvitaan halutun analysoimis-menetelmän toteuttamiseksi. Reagenssisysteemi annetaan kaupallisesti pakatussa muodossa, yhdistelmänä tai seoksena, kun reagenssien yhteensopivuus sallii, tes-5 tiapuneuvomuodossa, tai tavallisemmin testisarjana, ts. yhden tai useamman säiliön, välineen tai vastaavan, joka sisältää tarvittavat reagenssit, pakattuna yhdistelmänä, joka tavallisesti sisältää kirjoitetut käyttöohjeet analyysien suorittamiseksi. Tämän keksinnön reagenssisystee-10 mit käsittävät kaikki muodot ja yhdistelmät tässä kuvattujen eri hybridisaatioformaattien, erityisesti neljän menetelmätyypin, jotka on erityisesti edellä ja piirroksissa kuvattu, toteuttamiseksi.
Kaikissa tapauksissa reagenssisysteemi käsittää (1) 15 koettimen, (2) nukleiinihappo-interkalaattorin, kuten tässä on selostettu ja (3) vasta-ainereagenssin, joka edullisesti on merkattu havaittavalla kemiallisella ryhmällä, kuten tässä myös on selostettu. Systeemi voi lisäksi sisältää kiinteän kantimen yksisäikeisten nukleiinihappojen 20 tekemiseksi liikkumattomiksi testialustasta. Vaihtoehtoi sesti koetinelementti voidaan antaa liikkumattomaksi tehtynä tällaisella kantimella. Edelleen interkalaattori voi olla läsnä reagenssisysteemissä erillisenä, vapaana yhdisteenä, pääasiallisesti kompleksoimattomana nukleiinihap-25 pojen kanssa, tai voi olla sidottu koettimeen joko inter-kalaatiokompleksien muodossa, jolloin koetin sisältää kak-sisäikeisen alueen, ja valinnaisesti kovalenttisesti tai muulla tavalla kemiallisesti sidottuna toiseen tai kumpaankin säikeistä, tai se voi olla kemiallisesti sidottu, 30 esim. kovalenttisesti yksisäikeiselle koetinalueelle, niin että kaksikon muodostamisesta tällaisella alueella on tuloksena interkalaatiokompleksien muodostuminen.
Kerros-formaatin tapauksessa toinen koetin, kuten edellä selostettiin, sisällytetään systeemiin. Systeemin 35 testisarjamuoto voi lisäksi sisältää apukemikaaleja, kuten 32 8 4 8 38 hybridisoimisliuoksen komponentteja ja denaturoimisainei-ta, jotka pystyvät muuttamaan kaksisäikeiset nukleiinihapot testinäytteessä yksisäikeiseen muotoon. Edullisesti se sisältää kemiallisen hajotusaineen ja denaturoimisaineen, 5 esim alkalin, näytteen käsittelemiseksi yksisäikeisen nukleiinihapon vapauttamiseksi siitä.
Tätä keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein. Esimerkkejä I. Ainekset 10 A. tufA-koettimen, jossa on kovalenttisesti interkalatoi-tu kaksisäikeinen osa, valmistus
Nukleiinihappo-koetin on modifioitu Ml3mp9-vektori [Messing ja Vieriä (1982) Gene. 19:269; kaupallisesti saatavissa firmasta New England Biolabs, Beverly, MA], 15 joka sisältää 800 emäsparin insertio-osan RFM13m9:n Hinc II- ja EcoRIrestriktioendonukleaasi-kohtien välissä. 800 emäksen inserTT. on osanen 1.190 emäksen TufA-sekvenssistä E. coli'sta, ja on koettimen (joka koostuu vektorista ja insertistä) osa, joka todellisuudessa hybridisoituu näyte-20 nukleiinihappoon. Sitä nimitetään tufA-insertiksi. Modifioitu Ml3mp9-bakteriofagi on nimitetty M13-10:ksi ja on saatavissa kokoelman American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC 39403-B1) kautta.
E. coli-perusorganismi, jota käytetään M13-10-fagin 25 lisääntymistä varten on JM103 [ (Δlac pro), supE, thi, strA, endA, sbcB, hsdR-, F'traD36, proAB, laclg, Z4M15], jota on kaupallisesti saatavissa firmasta Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD. E. coli JM103 transformoidaan M13-10 DNA:lla ja JM103:n viljely ympätään 30 senjälkeen transformoidulla JM103:lla. M13-10:n yksisäi-keinen muoto eristetään fagi-osasista, joita infektoitu E. coli erittää alustaan. Fagi-osaset korjataan talteen ja yksisäikeinen M13-10 DNA eristetään seuraten standardimenetelmiä 35 [Messing et ai. (1981) Nucleic Acids Res. 9:309].
Il 33 8 4 8 38 Käyttäen oligonukleotidialuketta, joka on komplementaarinen M13mp3-vektorille tufA-insertin 5'-päätteellä, deoksinukleosidi-trifosfaatteja ja E. coli DNA polymeraa-sia (Klenow-osasta), syntetisoidaan toinen DNA-säie. Tämä 5 toinen säie syntetisoidaan rajoittavilla määrillä deoksi-nukleosidi-trifosfaatteja, niin että se ei ulotu tufA-in-sertio-osaan, koska tämän insertio-osan täytyy pysyä pääasiallisesti yksisäikeisenä koetinta varten ollakseen käyttökelpoinen hybridisaatioanalyysissä. Tätä menetelmää 10 on selostettu kirjallisuudessa. [Hu ja Messing (1982) Gene 17:271-277/ ja oligonukleotidialuketta (sekvenssi CACAATTCCACACAAC) on kaupallisesti saatavissa firmasta New England Biolabs, Beverly, MA.
M13-10-koettimessa läsnäolevan kaksisäikeisen DNA:n 15 määrä voidaan arvioida käyttäen radiomerkattua nukleosidi-trifosfaattia toisen säikeen synteesissä tai S-nukleaasi-uuttoa, mitä seuraa fluoresenssianalyysi etidiumbromidil-la.
M13-10-koettimen, joka on valmistettu kuten edellä 20 selostettiin, kaksisäikeinen alue interkalatoidaan ja sidotaan kovalenttisesti etidiumin kanssa fotoaffiniteetti-reaktiossa käyttäen valomerkattua etidium-johdannaista, 8-atsidoetidiumia. Tämä valoreaktiivinen interkalaattori valmistetaan ja eristetään kuten kirjallisuudessa on esi-25 tetty [Graves et ai. (1977), Biochim. Biophys. Acta 479:98104/. Sen sitoutumisen kaksisäikeiseen DNA:hän on osoitettu jäljittelevän sen emäyhdisteen, etidiumbromidin, sitoutumista /Bolton ja Kearns (1978) Nucl. Acids Res. 5:4891; Garland et ai. (1980) Biochem.19: 3221 - tässä 30 tehdyt tutkimukset osoittavat, että tämä menettelytapa antaa 3-atsido- ja 8-atsidoetidium-isomeerien seoksen]. Koska 8-atsidoetidium on valoreaktiivinen, täytyy ryhtyä standardivarotoimenpiteisiin sen käsittelyssä hajoamisen estämiseksi. Työskentelemisen pimeässä punaisen valoku-35 vaussuojavalon läsnäollessa on havaittu olevan tyydyttävä.
34 84838 8-atsidoetidiumin liuoksia voidaan varastoida jäähdytettyinä pimeässä -70 °C:ssa ainakin yksi kuukausi.
Fotolyysi näkyvällä valolla muuttaa atsido-osan 8-atsidoetidiumissa kemiallisesti reaktiiviseksi nitreenik-5 si, joka reagoi nopeasti käytettävissä olevien nukleofii-lien kanssa muodostamaan kovalentteja etidium-addukteja [Knowles (1971) Acc. Chem. Res. 5:155]. Jos 8-atsido-etidium on interkalatoitunut DNA:n emäsparien väliin, kun fotolyysi tapahtuu, tapahtuu etidiumin kovalenttinen si-10 toutuminen DNA:hän suurella tehokkuudella [Bolton ja Kearns (1978) Nucl. Acids Res. 5:4891/.
Etidium kytkeytyy kovalenttisesti M13-10:n kak-sisäikeiseen alueeseen liuoksen fotolyysillä, joka liuos sisältää n. lmM DNA emäspareja ja 0,5 mM 8-atsidoetidiumia 15 sopivassa puskurissa, kuten 20mM tris-(hydroksimetyyli)-aminometaanissa (Tris-HCl), 200 mM natriumkloridissa (NaCl), pH 8,0. Fotolyysi toteutetaan 150 W:n ulkokohde-valolla, jolloin sekoituksenalainen reaktioseos on 5-20 cm:n (cm) etäisyydellä valolähteestä. Fotolyysireaktion 20 estämiseksi ylikuumentumiselta ja kaiken aallonpituudeltaan lyhyen säteilyn, ts. alle 300 nanometriä (nm), poissulkemiselta fotolyysireaktio ympäröidään lasivesihauteel-la, joka on kytketty vedenkierrättimeen, jossa on lämpöti-lansäätö. Sopivan inkuboimisjakson, kuten 60 minuutin, 25 jälkeen etidium-ryhmät, jotka eivät ole kovalenttisesti sitoutuneet DNA:hän, poistetaan sarjalla (esim. 10), peräkkäisiä uuttoja yhtä suurella tilavuusmäärällä vedellä kyllästettyä n-butanolia. Lisätään uutta 8-atsidoetidiumia (loppupitoisuus alueella 0,4 mM) ja fotolyysi- ja uut-30 tovaiheet toistetaan. DNA:hän yhdistyneen etidiumin määrä arvioidaan käyttäen ekstinktiokertoimen arvoja £ 490 = 4 x 103 M*1 cm'1 fotolysoidulle, etidiumatsidille suhde A290:n ja A490:n välillä fotolysoidulle etidiumille, joka on sitoutunut DNA:han, [A260 = (A490 x 3,4) - 0,011], ja 260 = 1.32 x 104 ... 35 M'1 cm'1 merkatun annetun DNA:n DNA-emäsparien pitoisuudel-
II
35 84 838 le. Edullisesti koetin kyllästetään etidiumilla, niin että koettimen kaksisäikeisellä alueella on 1 etidium-osa jokaista 2 DNA-emäsparia kohti. Fotolyysireaktio ja uutot toistetaan kunnes saadaan haluttu merkkaustiheys.
5 B. Adenovirus-koettimen valmistus kerros-hybridisaatio-formaattia varten
Kerros-hybridisaatioformaatteja on selostettu kirjallisuudessa - Dunn ja Hassel (1977) Cell 12:23; Dunn ja Sambrook (1980) Methods in Enzymology 65:468, Ranki et el. 10 (1983) Gene 21:77; Ranki et ai. (1983) Curr. Topics in
Microbiology and Immunol. 104:307-310.
Tämä tapa vaatii kaksi nukleiinihappo-koetinta, joista kumpikin on komplementaarinen näytteessä olevan testattavan nukleiinihapon ainoalle alueelle. Toinen koet-15 timista tehdään liikkumattomaksi kiinteälle kantimelle, kun taas toinen merkataan jollakin tavalla ja on aluksi liuoksessa näytteen nukleiinihappojen kanssa. Näitä nimitetään kiinto- ja vastaavasti liuosfaasikoettimiksi.
Kiinto- ja nestefaasikoettimet valmistetaan DNA:n 20 adenovirus-tyypistä 2 (Ad2) restriktioendonukleaasi-uut- teista kuten ovat selostaneet Ranki et ai. (1980) Gene 21:77:85. Kiintofaasikoetin koostuu BamHl-osasista C tai D [Tooze (1980 "The Molecular Biology of Tumor Viruses" (2. painos) Osa 2: DNA Tumor viruses. Cold Spring Harbor 25 Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, sivut 933- 934] Ad2-DNA:sta, insertoituina pBR322-vektoriin. Nämä koettimet on merkitty pkTH1201:ksi ja vastaavasti pkTH1202:ksi. Liuos-faasikoetin koostuu pkTH1201:n BamHl- ja Bglll-restrik-tioendonukleaasiuutteesta, jossa osaset "haulikko"-kloona-30 taan M13mp7:n BamHl-restriktioendonukleaasi-kohtaan [Mes sing et ai. (1981) Nuc. Acids Res. 9:30]. Modifioitu M13mp7, joka sisältää insertio-osana Ad2 C-osasen on nimitetty mkTH2306:ksi.
Liuoskoetin mkTH1206 tehdään osittain kaksisäi-35 keiseksi kuten edellä osassa I-A selostettiin ja kaksisäi- 36 8 4 838 keiseksi tehty alue merkataan interkalaatioaineella, esim. etidiumilla, myös kuten on edellä selostettu osassa I-A.
C. HCMV-koettimen valmistus
EcoRI restriktioendonukleaasi-osanen 0 ihmisen sy-5 tomegalovirus (HCMV) kannasta AD169 [Tamashiro et ai.
(1982) J. Virol., toukokuu, 547-556; Chou ja Merigan (1983) New Engl. J. of Med. 308:921] kloonataan pBR322-johdannaiseen pACYC184, jota käytetään transfektoimaan E. coli kanta HBlol Rec A', kuten ovat selostaneet Tamashiro 10 et ai. Lisääntymisen ja puhdistamisen jälkeen insertio-osan sisältävällä pAVYC184:llä plasmidi uutetaan restrik-tioendonukleaasilla EcoRI ja HCMV:n 6,8 kb:n (kiloemäksen) 0- osanen puhdistetaan preparatiiviselle elektroforeesilla 0,8 %-isissa agaroosigeeleissä käyttäen standardimenetel- 15 miä [Maniatis et ai. (1982) "Moleculas Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY].
D. Interkalaattori-merkatun HCMV-koettimen valmistus
Puhdistettu kaksisäikeinen O-osanen edellä osasta 1- C merkataan sitten kovalenttisesti etidiumilla käyttäen 20 fotolabiilia etidium-johdannaista, 8-atsidoetidiumia, kuten edellä osassa I-A selostettiin.
E. Interkalaatiokompleksi-immunogeenin valmistus
Vasikan kateenkorva- tai lohen siemenneste-DNA leikataan viemällä toistuvasti ihonalaisiin pistoksiin käyte-25 ttävän neulan läpi, käsitellään Sj-nukleaasilla yksisäi-keisten alueiden poistamiseksi [Maniatis (1982) "MolecularCloning", Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY] ja erotetaan syntyneistä nukleotideistä jollakin lukuisista standardimenetelmistä (esim. etanoli-30 saostuksella, geelipoissulkemiskromatografialla tai ionin- vaihtokromatografiällä).
Puhdistettu kaksisäikeinen DNA kytketään sitten kovalenttisesti fotolabiiliin etidium-johdannaiseen 8-at-sidoetidiniumiin fotolyysillä kuten edellä osassa I-A se-35 lostettiin. Kanninproteiini valmistetaan metyloimalla kar-
II
37 8 4 8 38 boksyylihappotähteitä (Mandell ja Hershey (1960) Anal. Biochem. 1:66) ja yhdistetään sitten interkalaattorilla merkattuun DNA:hän muodostamaan sähköstaattisesti yhdistynyt nukleiinihappo-proteiinikompleksi, kuten ovat selos-5 taneet Poirier et ai. (1982) PNAS 79:6443.
F. Polyklonaalisen vastaseerumin interkalaatiokompleksille valmistaminen
Polyklonaalinen vastaseerumi interkalaattori-DNA-komplekseja vastaan saadaan kaniineista käyttäen immunoin-10 timenetelmiä ja -kaavioita, joita on selostettu kirjallisuudessa [Stollar (1980) Methods in Enzymology 70:70]. Vastaseerumi seulotaan kiintofaasianalyysissä, joka on samanlainen kuin monoklonaalisille vasta-aineille käytetty. esim. kuten ovat selostaneet Lange et ai., (1976) 15 Clin. Exp. Immunol. 25:191; Pisetsky et ai. (1981) J. Immun. Methods 41:187. Seulonnan alkukriteerio olisi sitoutuminen interkalaattori-DNA-kompleksiin.
Vasta-aineita sisältävien vastaseerumien IgG-jae eristetään muista seerumiproteiineista ammoniumsulfaatti-20 saostuksella, mitä seuraa kromatografia DEAE-selluloosalla [Livingston (1974) Methods in Enzymoloqy 34:723]. Vastaseerumien IgG-jaetta puhdistetaan edelleen affini-teettikromatografiällä pylväällä, joka sisältää hartsia, jolle DNA-interkalaattorikompleksi tehdään liikkumattomak-25 si [Stollar (1980) Methods in Enzymology 70:70. IgG-ja-keen viemisen jälkeen pylvääseen ei-spesifisesti sitoutunut proteiini poistetaan pesemällä ja spesifiset vasta-aineet eluoidaan 2M etikkahapolla kylmässä [Stollar (1980) ibid].
30 Puhdistetut vasta-aineet seulotaan perusteellisem min niiden käyttökelpoisuuden määrittämiseksi hybridisaa-tioanalyysissä. Vasta-aineiden täytyy sitoa interkalaat-tori-DNAkompleksi suurella affiniteetilla (edullisesti KA >1010 M'1); Ristireaktiivisuus vapaan interkalaattorin 35 tai yksisäikeisen DNA:n kanssa ei ole hyväksyttävää. Ana- 38 84 8 38 lyysiformaatista riippuen jonkinverran vasta-aineiden ris-tireaktiivisuutta kaksisäikeisen DNA:n kanssa voidaan hyväksyä .
G. Monoklonaalisten vasta-aineiden interkalaatiokomplek-5 sille valmistaminen Käyttäen inetrakalaattori-DNA-immunogeeniä, joka on valmistettu kuten edellä selostettiin, saadaan hiiren mo-noklonaalisia vasta-aineita interkalaattori-DNA-komoel-sille käyttäen standardimenetelmiä [Galfre ja Milstein 10 (1981) Methods in Enzym. 73:1]. Monoklonaaliset vasta- aineet seulotaan käyttäen muunnosta kirajallisuudessa selostetuista menetelmistä, esim. Lange et ai. (1976) Clin. Exp. Immunol. 25:191; Pisctsky et ai. (1981) J. Immun. Methods 41:187). Ollakseen käyttökelpoinen analyy-15 sissä DNA-interkalaattorikompleksien havaitsemiseksi tu lisi monoklonaalisen vasta-aineen sitoutua DNA-inter-kalaattorikompleksiin suurella affiniteetilla (edullisesti KA > 1010M'1., mutta se ei voi sitoutua yksisäikeiseen DNA:hän tai vapaaseen interkalatoimisaineeseen. Poikki-20 reaktiivisuus kaksisäikeisen DNA:n kanssa voi olla hyväk syttävää joissakin analyysiformaateissa.
Hiiren monoklonaalinen vasta-aine puhdistetaan kaksivaiheisella prosessilla. Laimentamaton vesivatsaneste pannaan pylvääseen, jossa on Affi-Gel-Blue-hartsia (Bio-25 Rad Laboratories, Richmond, CA). joka pylväs on tasapainotettu 10 mM Tris-HCl: 11a, 0,15 M NaCl:lla, pH 8,0, ja eluoidaan samalla puskurilla. Tämä vaihe poistaa albumiinin, joka pidättyy pylvääseen. Loppuvaihe puhdistuksessa on levittäminen DEAE-Sepharose:lie (Pharmacia Fine 30 Chemicals, Piscataway, NJ) ja eluointi 10 mM Tris-HCl:n, pH 8,0 suoraviivaisella gradientilla 10 mM Tris-HCL:aan, 200 mM NaCl:aan. Tämä antaa hiiren puhdistetun monoklonaalisen vasta-aineen, joka on vapaa saastuttavista seerumiproteiineista, kuten albumiinista ja transfer- 35 riinistä.
39 84 8 38 H. β-Galaktosidaasi-vasta-aine-konjugaatin puhdistaminen β-Galaktosidaasia (30.000 yksikköä, laatu VIII, kaupallisesti saatavissa firmasta Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) liuotettiin 2 ml:aan puskuriliuosta, joka si-5 sälsi 0,1 M N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisul-fonihappoa (HEPES) ja 0,09 M NaCl, pH 7,0. Tämä antoi B-galaktosidaasi-liuoksen, joka sisälsi 37,7 mg proteiinia (70 nmoolia) 1,84 mlrssa. Tähän liuokseen lisättiin 3,5μ-moolin annos (50-kertainen mooliylimäärä) ditiotreitolia 10 (DTT) ja seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa 4 tuntia.
DTT poistettiin entsyymi-liuoksesta kromatografoi-malla seos 2,5 x 80 cm:n pylväällä, jossa oli Sepharose 6B.Cl-hartsia (Pharmacia Fine Chemical, Piscataway, NJ) 15 käyttäen eluenttina edellä selostettua HEPES/NaCl-pus-kuria. Proteiinia sisältävät jakeet yhdistettiin antamaan kokonaistilavuudeksi 15 ml. Käyttäen E1*^ = 20,9 [Worthington Enzyme Manual (1977), Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ, s. 195] määritettiin /B-galak-20 tosidaasiväkevyyden olevan 9,62 mg/ml. Sulfhydryyli-ryh-mien lukumäärän entsyymillä määritettiin olevan 11,0 käyttäen Ellman'in reagenssia [Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70/. Tyypillisesti tämä pöytäkirja antaa 9-15 vapaata sulfhydryyli-ryhmää .β-galaktosidaasimolekyyliä 25 kohti.
Heterobifunktionaalista kytkentäreagenssia sukkii-niimidyyli-4-(N-maleimidometyyli )sykloheksaani-l-karboksy-laatti (SMCC, saatavissa firmasta Pierce Chemical Co., Rockford, IL) käytettiin β-galaktosidaasin kytkemiseen 30 vasta-aineeseen. Tämä kytkemisreagenssi sisältää maleimi- doryhmän, joka reagoi selektiivisesti sulfhydryyli-osien kanssa, ja N-hydroksisukkiini-imidiesterin amino-ryhmien kytkemiseksi. Kytkentäprosessi toteutetaan kahdessa vaiheessa: SMCC saatetaan reagoimaan vasta-aineen amino-ryh- 35 mien kanssa, mitä seuraa johdetun vasta-aineen B-galak- 40 8 4 8 38 tosidaasin kytkeminen maleimido-osan reaktiolla B-galakto-sidaasisulfhydryyliryhmien kanssa.
5,3 mg:n annos SMCC liuotettiin 250pl:aan vedetöntä N, N-dimetyyliformamidia (DMF). Reaktiivisten maleimidiryh-5 mien todellinen väkevyys tässä liuoksessa määritettiin reaktiolla tunnetun määrän kanssa glutationia, mitä seurasi glutationisulfydryyli-ryhmien määrän määrittäminen käyttäen Ellman'in reagenssia (ibid). Esimerkiksi, 40plDF-liuosta laimennettiin 3 ml:ksi HEPES/0,015 M NaCl-pusku-10 ria. 25μ1:η tilavuusmäärä SMCC-liuoksen tätä vesipitoista liuosta yhdistettiin sitten 825μ1:η kanssa HEPES/N Cl-pus-kuria ja 100μ1:η kanssa ImM glutationia. 15 minuutin seisomisen jälkeen huoneen lämpötilassa reagoimattoman gluta-tionin määrä määritettiin käyttäen Ellman'in reagenssia 15 (ibid) ja sopivia standardeja (ts. reagoimaton glutationi ja sokea koe ilman glutationia). Jokaiselle SMCC-liuokselle tehtiin useita määrityksiä ja niiden tuloksista laskettiin keskiarvo. Tämä pöytäkirja osoitti, että SMCC:n DMF-liuos, joka oli valmistettu kuten edellä selostettiin, oli 20 52 mM reaktiivisten maleimidi-ryhmien suhteen.
6,0 ,g:n (40pmoolin) annos hiiren monoklonaalista vasta-ainetta yhdistettiin 400 pmoolinkanssa SMCC HEPES/ O, 15 M NaCl lopputilavuudessa 533μ1 ja annettiin reagoida 1 tunti 30oC:ssa. Reaktioseos pantiin sitten 1 x 24 cm:n 25 pylvääseen, jossa oli Bio-Gel P-2 hartsia (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ja eluoitiin HEPES/0,15 M NaCl:lla. Kaikki proteiinia sisältävät jakeet yhdistettiin; proteii-niväkevyys määritettiin käyttäen Sedmack'in ja Grossberg'in menetelmää [Anal. Biochem. 79:544 (1977)] ja 30 maleimidi-ryhmien lukumäärä määritettiin kuten edellä selostettiin. Nämä määritykset osoittivat vasta-aine-väke-vyyden olevan 1,98 mg)ml, sisältäen 1-2 maleimidiä/vasta-ainemolekyy1i.
28 mg:n annos vasta-aine-maleimidi-konjugaattia 35 yhdistettiin 10 mg:n kanssa DTT-käsiteltyä β-galak- 4i 84 8 38 tosidaasia (lopputilavuus 2,45μ1) ja annettiin reagoida 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Seos pantiin sitten 2,5 x 80 cm: n pylvääseen, jossa oli Sepharose 6B.C1 (Pharmacia, Piscataway,NJ) ja eluoitiin HEPES/0,15M NaCl:lla 4oC:ssa. 5 Virtausnopeus oli 4 ml/h; kerättiin 3 ml:n jakeita. Jakeet analysoitiin β-galaktosdidaasi-aktiivisuuden ja vasta-aineen sitomiskyvyn suhteen. Jakeilla 39-42 oli molemmat ominaisuudet ja ne yhdistettiin.
J. Biotiini-merkattujen vasta-aineiden valmistus 10 Puhdistettuja vastaseerumeja käsitellään biotiinin
N-hydroksisukkiini-imidiesterillä (saatavissa kaupallisesti firmasta Sigma Chemical Co., St. Louis, MO tai firmasta Biosearch, San Rafael, Ca) käyttäen kirjallisuudessa selostettuja menetelmiä [Oi et ai. (1982), J. Cell. Biol. 15 93:981; Heitzmann et ai. (1974) Proc. Natl. Acad. Sei. USA
71:3537; Green (1975) Adv. Protein Chem. 29:85].
K. Radiomerkattujen vasta-aineiden valmistus
Puhdistettu vasta-aine radiomerkataan seuraten kirjallisuudessa annettuja menetelmiä. Radiojodaus suorite-20 taan saattamalla vasta-aineet reagoimaan 125I-merkatun 3-(4-hydroksifenyyli )propionihappo-N-hydroksisukkiini-imi-diesterin kanssa (saatavissa kaupallisesti firmasta New England Nuclear, Boston, MA) seuraten Bolton'in ja Hunter’in pöytäkirjaa [Biochem. J. 133:529 (1973]. Vaihto-25 ehtoisesti vastaainejae kytketään kovalenttisesti bifunk- tionaalisen kelatoivan aineen kanssa [Yeh et ai. (1979) Anal. Biochem. 100:152] ja merkataan senjälkeen sopivalla radioaktiivisella metalliionilla. Tällä viimemainitulla tavalla on etuna, ettei radioisotoopin puoliintumisaika 30 rajoita vasta-aineenjakeen varastoimisaikaa.
L. Alkalinen fosfataasi-biotiini-avidiini-kompleksin valmistus
Alkalinen fosfataasi-biotiini-avidiini-kompleksi valmistetaan kuten Leary et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. 35 USA 80:4045 (1983)] ovat selostaneet. Vasikan alkalinen 42 84838 suolifosfataasi silloitetaan ensin reaktiolla disukkimi-dyylisuberaatin kanssa ja kytketään sitten biotinyyli- -aminokaproiinihapon N-hydroksisukkiini-imidiesterin kanssa. Puhdistamisen jälkeen alkalinen fos- fataasi-biotii-5 ni-kompeleksi merkataan avidiinilla (jossa on neljä bio-tiinisitomiskohtaa/avidiinimolekyyli) yhdistämällä alkalinen fosfataasi-biotiinikompleksi pienen mooliylimäärän kanssa avidiinia. Tässä viimeisessä vaiheessa voidaan käyttää joko avidiinia tai avidiinin bakteeri-analogia, 10 steptavidiinia [Hofmann et ai. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4666-4668; jota on kaupallisesti saatavissa firmasta Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD] .
Alkalinen fosfataasi-biotiini-avidiini+kompleksia 15 varten käytetty havaitsemissysteemi koostuu nitro-sinises-tä tetratsoliumista ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaa-tista, kuten Leary et ai. (ibidi) ovat selostaneet.
II. Menetelmiä A. Gram-negatiivisten bakteerien havaitseminen virtsassa -20 (Menetelmätyyppi 1) kiintofaasi, näyte tehty liikkumatto+ maksi, hybridisaatioanalyysi tufA-koettimella, jossa on kovalenttisesti interkalatoitu kaksisäikeinen alue, tarkkailtu entsyymimerkatulla vasta-aineella (ks. kuva 2)
Koska sen sekvenssi on erittäin hyvin suojattu, 25 voidaan tufA-sekvenssiä E. coli'sta käyttää gram-negatii-visten bakteerien läsnäolon havaitsemiseksi virtsanäytteissä. Kliinisiä virtsanäytteitä selkeytetään linkoamalla lyhyt aika (esim. 5 min) pienellä keskipakovoimalla (esim. 8000 r/min Sorvali GLC-3 lingolla). Sakan päällä 30 olevassa nesteessä olevat bakteerisolut hajotetaan ja bak-teerigenomi denaturoidaan tekemällä virtsanäyte 0,5M:ksi natriumhydroksidilla (NaOH) 10 minuutiksi korotetussa lämpötilassa (65 °C). Vaihtoehtoisesti tämä voidaan tehdä kuumentamalla virtsa 90 °C:seen ja pitämällä tämä lämpöti-35 la 10 minuuttia. Hajottamisen ja denaturoimisen jälkeen 43 8 4 8 38 virtsanäyte laimennetaan ja neutraloidaan yhtä suurella tilavuusmäärällä 20xSSPE (3,6 M NaCl, 0,2 M NaPO, 20mM EDTA, pH 7,7). Virtsanäyte suodatetaan sitten välittömästi nitroselluloosamembraanin läpi lievässä tyhjössä. Liik-5 kumattomaksi tehty bakteeri-DNA kiinnitetään sitten nitro-selluloosa-membraanille kuivaamalla tyhjössä 80oC:ssa 2 tuntia. Suodatinta, joka sisältää liikkumattomaksi tehdyn näyte-DNA:n, käsitellään esi-hybridisoimisliuoksella [0,1 % (paino/tilav.) jokaista seuraavista Ficoll (Pharmacia), 10 polyvinyylipyrrolidonia ja BSA 5XSSPE:ssä, 100-200pg/ml denaturoitua, heterologista DNA] 1+3 tuntia 65 °C:ssa. Käytetään 50-100 μ1:η tilavuusmäärää esi-hybridisoimis-liuosta/cm2 suodatinta. Esi-hybridisoimiskäsittelyn jälkeen etidiumilla merkattu koetin, joka on valmistettu ku-15 ten edellä osassa I-A selostettiin, lisättiin esi-hybridi-soimisliuokseen ja hybridisoitumisen annetaan tapahtua (1-72 tuntia). Edellä esitetyt ovat kaikki standardimenetelmiä, jotka löytyvät kirjallisuudessa [Maniatis et. ai. (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 20 Cold Spring Harbor, NY].
Hybridisaation jälkeen suodatin pestään ylimääräisen koetin-DNA:n poistamiseksi. Suodatin upotetaan sitten liuokseen, joka sisältää β-galaktosidaasilla merkattuja vasta-aineita interkalaattori-DNA-kompleksille, ja inku-25 boidaan 5 minuuttia 12 tuntiin. Ylimääräinen vasta-aine poistetaan pesemällä ja suodattimeen yhdistyneen β-galak-tosidaasin määrä määritetään lisäämällä entsyymien fluoro-geenistä substraattia (esim. 4-metyyliumbelliferoni β-ga-laktosidia) ja mittaamalla fluoresenssi-voimakkuus jonkin : 30 ajan kuluttua. Koska läsnäolevan entsyymin määrä on toden näköisesti melko pieni, lisätään fluorogeenistä substraattia väkevyydessä, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin sen Michaelisvakio (Km) β-galaktosidaasille. Standardeja; joissa on määrätty määrä koetinta suodattimelle liikkumat-35 tomaksi tehtynä, voidaan käsitellä samanaikaisesti, niin 44 84 838 että hybridisaatio voidaan kvantitatiivisesti määrittää.
B. Adencviruksen havaitseminen - (Menetelmätyyppi 2) ker-roshybridisaatioanalyysi merkatulla koettimella, jossa on kovalenttisesti interkalatoitu kaksisäikeinen alue, tarkk- 5 ailtu entsyymi-merkatulla vasta-aineella (ks. kuva 3).
Tämä menetelmä perustuu kerros-hybridisaatioanalyy-siin, jonka ovat selostaneet Ranki et ai. adenovirustyypin 2 (AD2) DNA:n havaitsemiseksi kliinisissä näytteissä [Ranki et ai. 1 (1983) Gene 21:77: Ranki et ai. (1983) 10 Current Topics in Microbiology and Immunology 104, Springer-Verlag, NY, sivu 307]. Kiintofaasikoetin pKTH1202 (ks. osa I-B edellä) denaturoidaan, lovetaan ja tehdään liikkumattomaksi nitroselluloosa-suodattimille. Kiinnittämisen jälkeen (kuivaaminen tyhjössä 80 °C:ssa 2 tun-15 tia) suodattimia käsitellään esihybridisoimisliuoksella yksi tunti 65 °C:ssa, DNA:ta kliinisistä näytteistä ja in-terkalaattorilla merkattu liuos-hybridisaatiokoetin mkTH1206 (valmistettu kuten edellä osassa I-B selostettiin) lisätään esi-hybridisoimisliuokseen ja koettimien 20 hybridisoitumisen näyte-DNA:n kanssa annetaan tapahtua 1-72 tuntia. Hybridisaation jälkeen ylimääräinen liuos-koetin (mkTH1206) poistetaan pesemällä.
Hybridisaation laajuus määritetään kvantitatiivisesti käyttäen β-galaktosidaasilla merkattua vasta-ainetta 25 interkalaattori-DNA-kompleksille, kuten edellä osassa II- A esitettiin.
C. Ihmis-sytomegaloviruksen havaitseminen virtsassa ( menetelmätyyppi 3) kiintofaasi, hybridisaatioanalyysi liikkumattomaksitehdyllä koettimella, tarkkaillaan biotii- 30 ni-merkatuilla vasta-aineilla ja entsyymi-merkatulla avid- iinilla (ks. kuva 4).
Tätä menetelmää käytetään ihmis-sytomegaloviruksen (HCMV) havaitsemiseksi kliinisissä virtsanäytteissä. Puhdistettu koetin (HCMV kannan AD169 EcoRl 0-osanen, kuten - 35 edellä osassa I-C selostettiin) denaturoidaan kuumenta- 45 84 838 maila 90 °C:ssa 10 minuuttia. Jäähdytetään nopeasti jäillä (reunaturoinnin estämiseksi) ja yhdistetään yhtä suuren tilavuusmäärän kanssa 20XSSPE (3, 6M NaCl, 0, 2M NaPO«, 20 mM EDTA. pH 7,7). Yksisäikeinen koetin-DNA tehdään sitten 5 liikkumattomaksi ja kiinnitetään nitroselluloosa-membraa-nille käyttäen standardimenetelmiä. Membraania käsitellään sitten esi-hybridisoimisliuoksella, joka edullisesti sisältää heterologista DNA. Eräs esi-hybridisoimisliuos, jota voidaan käyttää, on liuos, jota on selostanut New 10 England Nuclear heidän Gene Screen Plus ™ membraaneille; tämä liuos sisältää 1 % SDS, IM NaCl ja 10 % dekstraani-sulfaattia. Vasta-aineen ei-spesifisen sitoutumisen estämiseksi havaitsemiskaavioiden loppuvaiheessa on toivottavaa sisällyttää BSA:ta esi-hybridisoimisliuokseen.
15 Testattava kliininen virtsanäyte valmistetaan ta valla, joka on samanlainen kuin Chou'n ja Merigan'in [New Engl. J. Med. 308:921 (1983)] kuvaama menetelmä. Näytteen selkeyttäminen ja HCMV-fagiosasten väkevöimisen jälkeen linkoamalla ne suspendoidaan uudelleen minimitilavuuteen 20 0,5M NaOH ja annetaan seistä 15 minuuttia. Neutraloinnin jälkeen mimimitilavuusmäärällä 20XSSPE denaturoidut kliiniset näytteet lisätään suodattimelle liuoksessa, jossa on 1 % SDS, IM NaCl, 10 % dekstraanisulfaattia ja 100pg/ml denaturoitua lohen siemenneste-DNA:ta. Hybridisaation an-25 netaan tapahtua 65 °C:ssa 1-72 tuntia; suodattimet pestään sitten 2XSSPE:ssä.
Suodattimet upotetaan minimitilavuusmäärään liuosta, joka sisältää valitun interkalaattorin (esim. etidium-bromidia submillimoolisessa väkevyydessä). Biotinyloitu 30 vasta-aine DNA-interkalaattorikompleksille (osa I-J, edel lä) lisätään sitten ja annetaan sitoutua (1-24 tuntia). Ylimääräinen vasta-aine poistetaan pesemällä. Joissakin tilanteissa saattaa olla tarpeen lisätä interkalatoimis-ainetta näissä pesuvaiheissa kaksisäikeisen DNA:n pitämi-. 35 seksi kyllästettynä.
46 8 4 8 38
Sitten lisätään streptavidiini-biotiini-alkalinen fosfataasi-kompleksi (osa I-L, edellä) ja annetaan sitoutua biotinyloituun vasta-aineeseen, joka on yhdistynyt DNA:n kanssa, kuten Ward et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei.
5 USA 80:4045 (1983)] ovat selostaneet. Senjälkeen kun aikalisien fosfataasikonjugaattien ylimäärät on pesty pois, suodattimen kanssa yhdistyneen konjugaatin läsnäolo määritetään lisäämällä kolorimetristä substraattia alkalista fosfataasia varten kuten Ward (ibid) on selostanut. Tämä 10 on suora mitta HCMV-DNA:n läsnäololle kliinisessä virtsanäytteessä.
D. Ihmis-sytomegaloviruksen havaitseminen virtsassa (Menetelmä-tyyppi 4) kiintofaasi, hybridisaatioanalyysi liik-kumattomaksitehdyllä interkalaattori-merkatulla koetti-15 mella, tarkkailu radiomerkatulla toisella vasta-aineella interkalaatiokompleksi-vasta-aineelle (ks. kuva 5).
Tämä menetelmä on samanlainen kuin edellä osassa II-C esitetty, paitsi että koetin on jo merkattu interka-latoimisaineella ja havaitsemiskaavion loppuvaihe vaatii 20 toisen, isotooppisesti merkatun vasta-aineen.
Koetin, HCMV:n etidium-merkattu Eco Rl-osanen 0 (valmistettu kuten edellä osassa I-D selostettiin) denaturoidaan, tehdään liikkumattomaksi ja kiinnitetään nitro-selluloosakantimelle, kuten edellä selostettiin osan II-'25 C menetelmälle. Virus-DNA eristetään virtsanäytteestä, denaturoidaan ja hybridisoidaan liikkumattomaksi tehtyyn koettimeen myös kuten edellä osassa II-C selostettiin, paitsi että vapaan interkalaattorin lisääminen on tarpeetonta .
30 Suodattimen pesemisen jälkeen hybridisoidulla DNA:11a lisätään ylimäärä hiiren monoklonaalista vasta-ainetta interkalaattori-DNA-kompleksiin (ks. osa I-G edellä) ja annetaan sitoutua hybridisoituun DNA-interkalaatto-rikompleksiin (30 minuutista 6 tuntiin). Ylimääräinen hii-35 ren vasta-aine poistetaan pesemällä ja lisätään ylimäärä 47 84 8 38 radiomerkattua kaniini-anti(hiiri IgG) (osa I-K). 30 minuutin - 6 tunnin inkuboinnin jälkeen ylimääräinen vasta-aine poistetaan jälleen pesemällä. Hybridisaatio määritetään kvantitatiivisesti autoradiografiällä tai gamma-las-5 kennalla.
III. Interkalaatiokompleksien antigeenisyyden osoittaminen A. Kovalenttisten etidium-DNA-kompleksien valmistus
Noin 250 mg lohen siemenneste-DNA:ta (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) liuotetaan 40 ml:aan 50 mM 10 NaCl ja leikataan viemällä viisi kertaa 23 kaliiperisen neulan läpi. Leikattu DNA pannaan 250 ml:n pulloon ja laimennetaan lisäämällä 160 ml puskuria. Lisätään 145 mik-rolitraa (145μ1) Sl-nukleaasia, 200.000 yksikköä/ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway., NJ) ja seosta 15 inkuboidaan 37oC:ssa 50 minuuttia.
Sitten reaktioseosta uutetaan kahdesti fenolikloro-formilla, kerran kloroformilla ja DNA seostetaan kahdesti etanolilla [Maniatis et ai. (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY].
20 Lopullinen sakka liuotetaan 70 ml:aan 20 mM Tis- hydrokloridipuskuria, pH 8,0.
Tämä DNA saatetaan reagoimaan 8-atsidoetidiumin kanssa seuraavissa olosuhteissa. Reaktioseos valmistetaan 33 ml:sta 2,7 mg DNA/ml, 13,5 ml:sta 4,95 mM 8-atsidoeti-25 dium'ia, 13,5 ml:sta 0,2 M Tris-hydrokloridi-puskuria, pH
8,0, 0,2 M NaCl ja 76 ml:sta vettä. Seos pannaan 250 ml:n lasiin, jota ympäröi vesivaippa, jota pidetään 22 °C:ssa. Seosta sekoitetaan ja valotetaan 60 minuuttia 150 W:n koh-devalolla 10 cm:n etäisyydeltä. Tämä fotolyysi toistetaan 30 samanlaisella reaktioseoksella.
Fotolysoidut reaktioseokset yhdistetään ja uutetaan 10 kertaa joka kerta yhtä suurella tilavuusmäärällä n-butanolia, joka on kyllästetty 20 mM Tris-hydrokloridi-puskurilla, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Uutettu DNA-liuos yhdiste-35 tään 23 ml:n kanssa 4,95 mM 8-atsidoetidiumia ja 77 ml:n 48 84 838 kanssa 20 mM Tris-hydrokloridipuskurissa, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Tätä liuosta sekoitetaan vesivaipalla varustetussa lasissa ja fotolysoidaan 90 minuuttia. Reaktiotuotteita uutetaan 10 kertaa puskurilla kyllästetyllä butanolilla, 5 kuten edellä selostettiin, ja DNA saostetaan etanolilla. Sakka liuotetaan 10 mM Tris hydrokloridi-puskuriin, pH 8,0 ImM EDTA ja absorboituvuudet 260 ja 490 nm:ssä merkitään muistiin. Laskelmat, jotka on tehty kuten esimerkissä IA edellä selostettiin osoittavat yhden etidium-tähteen yh-10 distyneen 4,5 DNAemäsparia kohti.
B. Metyloidun tyroglobuliinin valmistus 100 mg naudan tyroglobuliinia (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) yhdistetään 10 ml:n kanssa vedetöntä metano-lia ja 400 μ1:η kanssa 2,55 M HC1 metanolissa. Tätä seosta 15 sekoitetaan pyörivällä sekoittimella huoneen lämpötilassa 5 päivää. Sakka kootaan linkoamalla ja pestään kahdesti metanolilla ja kahdesti etanolilla. Sitten sitä kuivataan tyhjössä yli yön. Saadaan n. 82 mg kuivaa jauhetta.
C. Kovalenttisella etidium-DNA:11a metyloidun tyroglobul- 20 iinikompleksin valmistus 50 mg metyloitua tyroglobuliinia liuotetaan 10 ml:aan vettä ja lisätään 11,3 ml 2,2 mg/ml kovalenttisen etidiumDNA:n liuosta. Sakka muodostuu välittömästi ja suspensio laimennetaan 5,0 ml:11a 1,5 M NaCl ja 24,6 ml:11a 25 vettä.
D. Kaniinien immunisointi 2 ml seosta, joka koostuu 2,5 ml:sta kovalenttisella etidium-DNA:11a metyloitua tyroglobuliinikompleksia, 2,5 ml:sta 0,15 M fysiologista suolaliuosta ja 5,0 ml:sta 30 täydellistä Freund'in apuainetta, ruiskutetaan valkoisen
New Zealand kaniin neljään ihonalaiseen kohtaan. 3 viikkoa myöhemmin annetaan samanlainen immunointi epätäydellisellä Freund'in apuaineella, mitä seuraa lisä-immunisoinnit 4 viikon välein. 14 viikkoa alku-immunisoinnin jälkeen ver-35 ta kootaan vastaseerumin valmistamiseksi.
li 49 84 8 38 E. Vasta-aineen etidium-DNA:lie titraaminen
Vastaseerumia kovalenttiselle etidium-DNA:lie tit-rataan entsyymimerkkiaine-immunosorbanttianalyysillä. Po-lynukleotidejä adsorboidaan polystyreeni-mikrotiitterile-5 vyjen seinille ja kaniini-vasta-aineen annetaan sitoutua. Lopuksi vasta-aine havaitaan peroksidaasi-merkatulla vuo-hi-antikaniini IgGrlla.
50pl:n tasaosia liuoksia, jotka sisältävät 5pg po-lynukleotidiä/ml 15 mM natriumsitraatissa, pH 7,0, 0,15 M 10 NaCl, jaetaan Immunulon II mikrotiitterilevyjen (Dynatek, Alexandria, VA) syvennyksiin ja ravistellaan lievästi huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sitten syvennykset tyhjennetään ja pestään 10 mM natriumfosfaatti-puskurilla, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5 %-isella naudan seerumialbumiinilla 15 ja 0,5 %-isella Tween 20 (PBS/BSA/Tween).
Kaniini-vastaseerumia laimennetaan 10 mM natrium-fosfaattiin, pH 7,4, 0,15 ; NaCl, 0,5 % BSA ja 50,ul:n tasaosia lisätään syvennyksiin ja annetaan seistä 30 minuuttia. Syvennykset pestään kolme kertaa 20 PBS/BSA/Tween:illä. Peroksidaasia, joka on kovalenttisesti kytketty vuohi-antikaniini IgGriin (Cappel Laboratories, Cochranville, PA) laimennetaan 500-kertaisesti 10 mM nat-riumfosfaattiin. pH 7,4, 0,15 ; NaCl, 0,5 % BSA ja 50μ1:η tasaosia lisätään jokaiseen syvennykseen. Tämän liuoksen 25 annetaan seistä syvennyksissä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten syvennykset pestään kolme kertaa PBS/BSA/Tween:i1lä.
100μΜ etidiumbromidia sisällytetään syvennysten, jotka sisältävät ei-kovalenttista etidium-DNA-kompleksia, 30 laimennettuun vastaseerumiin ja etidium-kontrollisyvennyk-siin. Kaikki edellä selostetut pesuliuokset ja reagenssit näiden syvennysten käsittelyä varten sisältävät 100 μΜ etidiumia.
Valmistetaan peroksidaasisubstraatti-liuos, jossa 35 on 20 mg o-fenyleenidiamiinia so 8 4 8 38 5 ml 0,5 M NaHP04 12 ml 0,1 0,1 M natriumsitraattia 13 ml vettä 20μ1 30 %-ista vetyperoksidia
Syvennystä kohti lisätään 75μ1 substraatti-liuosta 5 ja annetaan reagoida 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktiot tukahdutetaan lisäämällä 50μ1 2,5 M rikkihappoa. Sitten absorboituvuudet 488 nm:ssä merkitään muistiin Artek Modell 210 mikrotiitterilevyfotometrillä (Dynatek, Alexandria, VA).
10 Normaalia kaniini-seerumia käytetään kontrollina ja käsitellään kuten kaniini-vastaseerumille selostettiin. Tulokset
Tulokset on annettu taulukossa A ja osoittavat, että vasta-aine kontrolli-kaniini- seerumissa ei sitoudu 15 merkitsevillä tasoilla yhteenkään päällystetyistä tai päällystämättömistä syvennyksistä. Sillä saattaa olla heikko vastaaine-tiitteri yksisäikeiselle DNA:lie.
Vasta-seerumilla kovalenttiselle etidium-DNA:lie on hyvin suuri tiitteri kovalenttiselle etidium-DNA:lie. Osa 20 näistä vasta-aineista sitoutuu todennäköisesti etidium-tähteisiin, jotka ovat kovalenttisesti kytkettyjä fosfaat-tiriboosi-ketjuun. Tämä johtopäätös perustuu havaintoon, että tiitterit ei-kovalenttiselle etidium-DNA-kompleksille ovat paljon pienempiä (ks. Taulukko A).
25 Nämä tulokset osoittavat, että etidium-DNA-interka- laatiokompleksille voidaan synnyttää vasta-aineita, jotka eivät merkitsevästi ristireagoi luonnon yksi- tai kaksi-säikeisen nukleiinihapon kanssa.
il 51 84838 § 5 ο ^ χ < -Ρ ?! ra rr rr in Η Ο ra Ω οο οο ο- ^roOCTi
Μ 04 -p r—i 04 I—I f—I
··—( V V ta. ·**.** tn o o o o o o £
*rH
| r—f
p- «—I
3 O OrH lO ra O
•P P T N H (N i—I i—I
2> X OOO O O O
•PC ' -
-PO OOO OOO
ω x I :rn
__ E Ή I
C I 3 P1 fö (rl g X -H -H I -1-1 § C c Ό tn -h g O-h in n- o p o in X M <ö o 00 P X < CNOirn PO P P >i X tΛ
oo C 2 2 oo in ' ooo C ro m ra "P
_« P G » *· o - δχ -H Cg] < _ O C OO OOO (DM -H m
'-'xo > C M -P
n I c S S C M m g 4j -h h m > a> 5 K-ss | _ p c < o e c ·ί e > o · z ω to m m
p £ C :ra Q -P -H » M S
H γ. -h h i m e :n ·η S
X CD rP m X P P M ^ Ή X "P p ·Ρ P X « O ·η < o oo f" p cn ·*τ M P C Ό p O n
n ra 2 rsioo o oo in x o ro p m d E
tl M Ω p o o ooo >,χ χ χ χ -p ra
- 3 *P s * . ' ' ' C P *P 0) Pl P O
-· O M OOO OOO C d) M C D i! Μχ cd cd ro E 2 w p .ora >·μ > 3 t) ό n : : : « “ iico'' m s ° S " A I .
: : : -p ro «o ro r <- I •rXMt04J(n(L.b . IE < P M -ra ·· M S .3 •h 3 δ “ < “ § m
-p ra Q to < ra g -h H
x Ό .^PgpQMD-ra
C -P ra Ω P M ·*· P
(DX 04 oj oj ra rr rr >h ra ι -h 0) c r P
h H *>**· m^rra hmEb riciRS
* .* . <0 P P P OOO ra-PDXOCP^S
> c < αλα - « rj r! >ι ro Λ c, o cu 2 ooo -h ra ra c -h cd 32 s1
X C Ω MM-h5<DpI3W
•p 4-1 CD „ -ra •P M (D > IB li > '3 d> _ Ep M-Hgb
..... -H < <0 M M g S TY
- I .—ι p 2 tn -h 9 11
P P O (N N 00 in O' H Q II) IB H ·Η (S
··. PO o ra 04 ra 04 ι—ι h ¢) -P · h ό ΰ n - - - DP OOO OOO p C M ·· IB o -H H m
xx * ·. * - PO)-H<tnPXm§L
MC OOO OOO ^C+JZlBUa)
DO C rl D Q -H C .3 H
;:: fcx « OQic »10,5«
<oxxo)raxxgSS
... pippxol3:3S
. - I M P :<0 <0 M D g U* ΰ -h -¾ b w & P -H 3 O M (β D p 3 3 Ή o Cl H ·Η O .S 2 S ,-d -H -H XXMXXDOXw» ... e l E o g DMXi-Ptn-H_y<j· --· ω ro p ooo p p o o o ro 3topra<L>xcs&
E xp ra o o xPinoo E & χ ω m fiw O S
- - -H Md) 04 CO Cd) 04 00 O _ ^ : ·.: ro ra cd o Φ p — — ~ — Jo - - P > M χ m 2 x 04 ra <r 52 84 838
Keksintöä on edellä selostettu yksityiskohtaisesti ja annettu siitä esimerkkejä. On selvää, että keksinnöstä voidaan tehdä monia muita toisintoja ja muunnoksia poikkeamatta sen hengestä ja piiristä.
li

Claims (11)

53 84 8 38
1. Menetelmä tietyn polynukleotidisekvenssin havaitsemiseksi tutkittavassa alustassa, joka sisältää yksi- 5 säikeisiä nukleiinihappoja, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa tutkittava alusta yhdistetään (i) nukleiini-happokoettimen kanssa, joka käsittää ainakin yhden yksi-säikeisen emäs-sekvenssin, joka on pääasiallisesti komplementaarinen tutkittavasta alustasta määritettävälle sek-10 venssille, olosuhteissa, jotka ovat suotuisat hybridisaa-tiolle havaittavan sekvenssin ja koettimen komplementaarisen sekvenssin välillä, ja hybridisoitu koetin määritetään, tunnettu siitä, että lisätään myös nuk-leiinihappointerkalaattoria siten, että interkalaattori 15 yhdistetään tutkittavan alustan kanssa erillisenä, vapaana yhdisteenä ja se sitoutuu ei-kovalenttisesti kaksisäikei-sen nukleiinihapon kanssa muodostamaan interkalaatiokomp-lekseja tai siten, että interkalaattori kytketään kemiallisesti koettimeen koettimen yksisäikeisellä komplementaa-20 risella alueella, jolloin hybridisaation yhteydessä näitä interkalaatiokomplekseja muodostuu tällaisella alueella, ja hybridisoitu koetin havaitaan lisäämällä vasta-ainetta, tai sen fragmentti, joka ei sitoudu vapaaseen interkalaat-toriin, eikä yksisäikeiseen nukleiinihappoon, mutta joka • 25 pystyy sitoutumaan syntyvän hybridisaatiotuotteen interka- laatiokomplekseihin, ja määritetään vasta-aine tai sen *·- fragmentti, joka sitoutuu tällaisiin komplekseihin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kiin-tofaasi-hybridisaatiotekniikan mukaisesti, tunnet- ____; 30 t u siitä, että toinen koettimesta ja yksisäikeisistä nukleiinhapoista tutkittavasta alustasta immobilisoisaan kiinteälle kantajalle ja että kiinteään kantajaan liit-tynyt vasta-aine määritetään.
: ‘ 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kiin- 35 tofaasi-kerroshybridisaatiotekniikan mukaisesti, t u n- 54 84838 n e t t u siitä, että tutkittava alusta yhdistetään ensimmäisen ja toisen nukleiinhappo-koettimen kanssa, joista kumpikin sisältää ainakin yhden yksisäikeisen emäs-sekvenssin, joka on pääasiallisesti komplementaarinen havait-5 tavan sekvenssin osalle, joka on muu kuin toiselle koet-timelle yksisäikeisen jakson kanssa komplementaarinen osa, ja että toinen koettimista immobilisoidaan kiinteälle kantajalle tai sisältää sitomiskohdan sideaineelle ja immobilisoidaan sen jälkeen tällaisen sideaineen immobili-10 soidun muodon läsnäollessa.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä liuos-faasi-hybridisaatiotekniikan mukaisesti, tunnettu siitä, että koetin käsittää sitomiskohdan sideaineelle ja että hybridisoimisvaiheen jälkeen lisätään tällaisen side- 15 aineen immobilisoitu muoto.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että interkalaattori on etidiumi.
6. Reagenssisysteemi tietyn polynukleotidisek-venssin havaitsemiseksi tutkittavassa alustassa, joka sys- 20 teemi sisältää nukleiinihappokoettimen, joka käsittää ai nakin yhden yksisäikeisen emäs-sekvenssin, joka on pääasiallisesti komplementaarinen havaittavalle sekvenssille, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi nuk-leiinihappo-interkalaattorin, joka on erillinen, vapaa 25 yhdiste, joka on pääasiallisesti kompleksoimaton nuk leiinihappojen kanssa tai joka interkalaattori on kemiallisesti sidottu koettimen yksisäikeiselle alueelle niin, • · että kaksoisrihman muodostuminen tällaisella alueella joh taa interkalaatiokompleksien muodostumiseen, ja vasta-ai-30 neen tai sen fragmentin, joka ei sitoudu vapaaseen inter-kalaattoriin, eikä yksisäikeiseen nukleiinihappoon, mutta joka pystyy sitoutumaan interkalaatiokompleksien kanssa, jotka käsittävät kaksisäikeisen nukleiinihapon komplek-soituneena interkalaatorin kanssa.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssisystee- li 55 84 838 mi, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää kiinteän kantajan tutkittavan alustan yksisäikeisten nukleiinihappojen immobilisoimiseksi.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssisys-5 teemi, tunnettu siitä, että koetin immobilisoi- daan kiinteälle kantajalle.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssisys-teemi, tunnettu siitä, että koetin käsittää sito-miskohdan sideaineelle ja lisäksi reagenssisysteemi sisäl- 10 tää tällaisen sideaineen immobilisoidun muodon.
10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssisysteemi käytettäväksi kerros-hybridisaatioformaatissa, tunnettu siitä, että se sisältää toisen nuk-leiinihappokoettimen, jolloin ensimmäinen ja toinen koetin 15 vastaavasti sisältävät ainakin yhden yksisäikeisen emäs-sekvenssin, joka on pääasiallisesti komplementaarinen havaittavan sekvenssin osalle, joka on muu kuin toiselle koettimelle yksisäikeisen jakson kanssa komplementaarinen osa, ja että jompi kumpi koettimista on leimattu havait- 20 tavalla kemiallisella ryhmällä ja toinen on immobilisoitu, tai toinen koettimista on leimattu havaittavalla kemial-. lisella ryhmällä ja toinen sisältää sitomiskohdan sideai neelle, ja reagenssisysteemi sisältää lisäksi tällaisen sideaineen immobilisoidun muodon. I 25
11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssisys- -·-· teemi, tunnettu siitä, että interkalaattori on akridiin-väriaine, fenantridiini, fenatsiini, furokumarii-ni, fenotiatsiini tai kinoliini. 56 84838
FI844866A 1983-12-12 1984-12-10 Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex. FI84838C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56042983A 1983-12-12 1983-12-12
US56042983 1983-12-12
US64585084A 1984-08-31 1984-08-31
US64585084 1984-08-31

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI844866A0 FI844866A0 (fi) 1984-12-10
FI844866L FI844866L (fi) 1985-06-13
FI84838B FI84838B (fi) 1991-10-15
FI84838C true FI84838C (fi) 1992-01-27

Family

ID=27072329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI844866A FI84838C (fi) 1983-12-12 1984-12-10 Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex.

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0146815B1 (fi)
AU (1) AU578436B2 (fi)
CA (1) CA1238575A (fi)
DE (1) DE3482995D1 (fi)
DK (1) DK160107C (fi)
ES (1) ES8607557A1 (fi)
FI (1) FI84838C (fi)
IL (1) IL73577A (fi)
NO (1) NO164384C (fi)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
CA1253777A (en) * 1984-06-01 1989-05-09 Robert J. Carrico Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
CA1290664C (en) * 1986-03-05 1991-10-15 Nanibhushan Dattagupta Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
DE3639109A1 (de) * 1986-11-15 1988-05-19 Merck Patent Gmbh Verfahren zur bestimmung von nucleinsaeuren
IL85551A0 (en) * 1987-04-01 1988-08-31 Miles Inc Rapid hybridization assay and reagent system used therein
US6326136B1 (en) 1988-04-01 2001-12-04 Digene Corporation Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes
JP2802125B2 (ja) * 1989-06-23 1998-09-24 キヤノン株式会社 核酸の検出方法
GB8927503D0 (en) * 1989-12-04 1990-02-07 Kronem Systems Inc Enzyme-amplified lanthanide chelate luminescence
US5552541A (en) * 1990-06-20 1996-09-03 Beckman Instruments, Inc. Haptenic probes for detecting capture polynucleotides
EP2390350A1 (en) 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method of DNA sequencing by polymerisation
EP2390351A1 (en) 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method of DNA sequencing by hybridisation
CA2859913C (en) 2011-12-22 2021-02-23 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method of dna detection and quantification by single-molecule hybridization and manipulation
CN105122063A (zh) 2013-01-22 2015-12-02 国家科学研究中心 通过单分子操作来检测dna修饰和蛋白结合的方法
CN107771222B (zh) 2015-05-07 2019-06-04 巴黎科学与文学联大-拉丁区 使用力诱导的链侵入原位形成发夹
FR3075820B1 (fr) 2017-12-21 2022-12-30 Paris Sciences Lettres Quartier Latin Molecule d'adn double-brin pour la detection et la caracterisation des interactions moleculaires
US11473124B2 (en) 2018-12-12 2022-10-18 Depixus Method of nucleic acid enrichment using site-specific nucleases followed by capture

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196281A (en) * 1976-10-20 1980-04-01 Regents Of The University Of California Psoralens
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
JPS5856696A (ja) * 1981-09-30 1983-04-04 Amano Pharmaceut Co Ltd カラムを用いる酵素免疫測定法
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US4423153A (en) * 1981-12-03 1983-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection and determination of cellular DNA
FR2518755B1 (fr) * 1981-12-23 1986-04-11 Pasteur Institut Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays

Also Published As

Publication number Publication date
NO164384C (no) 1990-09-26
NO844847L (no) 1985-06-13
IL73577A0 (en) 1985-02-28
DK591784A (da) 1985-06-13
AU3656084A (en) 1985-06-20
DK160107C (da) 1991-06-24
EP0146815A3 (en) 1986-08-13
CA1238575A (en) 1988-06-28
FI844866A0 (fi) 1984-12-10
FI844866L (fi) 1985-06-13
ES8607557A1 (es) 1986-06-01
DK160107B (da) 1991-01-28
NO164384B (no) 1990-06-18
FI84838B (fi) 1991-10-15
DE3482995D1 (de) 1990-09-20
IL73577A (en) 1989-10-31
AU578436B2 (en) 1988-10-27
ES538540A0 (es) 1986-06-01
EP0146815A2 (en) 1985-07-03
DK591784D0 (da) 1984-12-11
EP0146815B1 (en) 1990-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4563417A (en) Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
FI84838C (fi) Bestaemning av nukleinsyrans hybridisation genom anvaendning av antikroppar mot interkalationskomplex.
US4777129A (en) Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
CA1272443A (en) Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
FI86311B (fi) Hybridiseringsbestaemning av nukleinsyror medelst anvaendning av detekterbara antihybridantikroppar.
KR100245284B1 (ko) 이중 d-루프 형성의 진단학적 응용
US5200313A (en) Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
EP0144914A2 (en) Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents
US4752566A (en) Displacement polynucleotide method and reagent complex employing labeled probe polynucleotide
JPS60144662A (ja) 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系
JPH08298A (ja) 臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）病原体の検出のための迅速ＤＮＡ試験
EP0703296B1 (en) Polynucleotide determination by displacement of a strand on a capture probe
JPH0811079B2 (ja) 増幅ハイブリダイゼ−ション検定法
JPH07500493A (ja) 突然変異の検出法
JPS62229068A (ja) サンプル中の核酸配列の存在を検出するための液体ハイブリダイゼ−シヨン法及びそのためのキツト
JPH0343099A (ja) 増幅した遺伝子を使用する配列のアツセイ
EP0146039A2 (en) Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
JP2613203B2 (ja) ポリヌクレオチド配列の検出のための溶液相単一交雑アツセイ
EP0144913A2 (en) Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
US4840892A (en) Polynucleotide hybridization probes
JPH01501339A (ja) 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット
EP0209702A1 (en) Solid-phase hybridization assay using anti-hybrid antibodies
JPS611388A (ja) ヌクレオチド雑種形成プローブ
JPS60151559A (ja) 挿入複合体に対する抗体を使用する核酸ハイブリダイゼーシヨン分析
JP2651317B2 (ja) 核酸の検出法

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: MILES INC