JPS611388A - ヌクレオチド雑種形成プローブ - Google Patents
ヌクレオチド雑種形成プローブInfo
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- JPS611388A JPS611388A JP60103617A JP10361785A JPS611388A JP S611388 A JPS611388 A JP S611388A JP 60103617 A JP60103617 A JP 60103617A JP 10361785 A JP10361785 A JP 10361785A JP S611388 A JPS611388 A JP S611388A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はポリヌクレオチド雑種形成プローブ。
さらに詳しくは、改良されたそのようなプローブおよび
その調製法Ｊこ関する。
その調製法Ｊこ関する。
発明の背景
ポリヌクレオチド雑種形成プローフハ臨床および研究目
的のための、「標的」ヌクレオチド配列を検出し、局在
化し、単離する安価な、効率のよい、迅速な手段を提供
する。クラウスナーら、バイオテクノロジー（Ｋｌａｕ
ｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）１９８３年８月号、４１１〜４１８頁は調製法およ
び使用法の検討を含め、ポリヌクレオチド雑種形成プロ
ーブに関する興味ある背景を記載していポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブの公知の調製法および使用は文献に
よく紹介されている。例えば、サザーン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（５ｏｕｔｈｅｒｎ
、 Ｊ、 Ｍ）１．Ｂｉｏｌ、 ） ９８：５０３〜５
１７（１９７５）ｉファルコフら（ＦａＩｋａｓｅｔ
ａｌ、） 、米国特許第４３８５５３５号；し’Ｊ
’）％プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−拳オブ拳サイエンス（Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ、。
的のための、「標的」ヌクレオチド配列を検出し、局在
化し、単離する安価な、効率のよい、迅速な手段を提供
する。クラウスナーら、バイオテクノロジー（Ｋｌａｕ
ｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）１９８３年８月号、４１１〜４１８頁は調製法およ
び使用法の検討を含め、ポリヌクレオチド雑種形成プロ
ーブに関する興味ある背景を記載していポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブの公知の調製法および使用は文献に
よく紹介されている。例えば、サザーン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（５ｏｕｔｈｅｒｎ
、 Ｊ、 Ｍ）１．Ｂｉｏｌ、 ） ９８：５０３〜５
１７（１９７５）ｉファルコフら（ＦａＩｋａｓｅｔ
ａｌ、） 、米国特許第４３８５５３５号；し’Ｊ
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ミ−拳オブ拳サイエンス（Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ、。
１’ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） Ｂ
□ ： ４０４５〜４０４ ｇ（１９８３）ｉランが一
一セーファーら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・”ｊ−イエンス（Ｌ７１ｎｇｅ
ｒ −５ａｆｅｒ ｅｔ ａｌ、、Ｉ’ｒｏｃ。
□ ： ４０４５〜４０４ ｇ（１９８３）ｉランが一
一セーファーら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・”ｊ−イエンス（Ｌ７１ｎｇｅ
ｒ −５ａｆｅｒ ｅｔ ａｌ、、Ｉ’ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）７９ ： ４３８１〜
４３８５（１９８２）ｉランガーら、プロシーディンゲ
スφオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ。Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）７８：６６３３〜６６３７（
１９８１）ｉおよびコーン（Ｋｏｈｎｅ ）、ＷＯ３４
−０２７２１（１９８４年７月１９日公開〕参照。
４３８５（１９８２）ｉランガーら、プロシーディンゲ
スφオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ。Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）７８：６６３３〜６６３７（
１９８１）ｉおよびコーン（Ｋｏｈｎｅ ）、ＷＯ３４
−０２７２１（１９８４年７月１９日公開〕参照。
これらおよび他の文献に記載されているとと（、公知の
プローブの調製法は、典型的には、プローブ領域を二本
鎖ＤＮＡプラスミド中ヘ中口クローンことからなる。こ
のプラスミド担持プローブは。
プローブの調製法は、典型的には、プローブ領域を二本
鎖ＤＮＡプラスミド中ヘ中口クローンことからなる。こ
のプラスミド担持プローブは。
典型的には、酵素重合技術によりラベルされる。
コノような技術には、例えば、ニックトランスレーショ
ン〔リグビイら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｒｉｇｂｙ ｅｔａｌ 、 、 Ｊ、Ｍｏ
ｌ 、 Ｂｉ ｏｌ 、）１１３：２３７（１９７７）
〕、ギャップ充填〔ボールグイグノンら、ジャーナルー
オブ骨バイロロジー（Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ）２０ ： ２９０（１
９７６））および末端付加が包含され、これらの方法は
修飾ヌクレオチド玉リン酸の存在下に行なわれる。以下
に示す文献中に報告されているものも含め、化学的修飾
技術を用いることもできる。
ン〔リグビイら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｒｉｇｂｙ ｅｔａｌ 、 、 Ｊ、Ｍｏ
ｌ 、 Ｂｉ ｏｌ 、）１１３：２３７（１９７７）
〕、ギャップ充填〔ボールグイグノンら、ジャーナルー
オブ骨バイロロジー（Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ）２０ ： ２９０（１
９７６））および末端付加が包含され、これらの方法は
修飾ヌクレオチド玉リン酸の存在下に行なわれる。以下
に示す文献中に報告されているものも含め、化学的修飾
技術を用いることもできる。
ブリガチら、パイロロジイ（Ｂｒｉｇａｔｉ ｅｔ ａ
ｌ、。
ｌ、。
ＶｉｒｏＪｏｇｙ）１２６４３２〜５０（１９８３）は
、ビオチンが長い鎖（１１または１６個の原子）を介し
てデオキシウリジン玉リン酸（ｄＵＴＰ）に結合してい
るビオチン・ラベル・プローブの方が、短い鎖（４原子
）を介して該ヌクレオチドに結合しているビオチン・ラ
ベル・プローブより有利であることを報告している。こ
れらのポリヌク１／オチド・プローブは、Ｉ） Ｎ Ａ
ポリメラーゼ■を用い。
、ビオチンが長い鎖（１１または１６個の原子）を介し
てデオキシウリジン玉リン酸（ｄＵＴＰ）に結合してい
るビオチン・ラベル・プローブの方が、短い鎖（４原子
）を介して該ヌクレオチドに結合しているビオチン・ラ
ベル・プローブより有利であることを報告している。こ
れらのポリヌク１／オチド・プローブは、Ｉ） Ｎ Ａ
ポリメラーゼ■を用い。
ニックトランスレーションによるビオチニル化ｄＴ’ｋ
−ｒ ｐ の酵素的とり込みによってラベルされてい
る。
−ｒ ｐ の酵素的とり込みによってラベルされてい
る。
ワードら（′ｗａ、ｒｄ ｅｃａｌ 、）のヨーロッパ
特許出願ＥＰ−Ａ−６３８７９号では、ラベル分子を、
プローブの標的配列に対する水素結合を干渉するような
ヌクレオチド環の部位には結合させないことがでましい
ことを開示している。この文献ではこのための解決策と
して、ピリミジン（チミン、シトシンおよびウラシル）
の５位、プリン（アデニンおよびグアニン）の７位およ
びデアサブリンの７位におりる結合ラベル分子を開示し
ている。さらに解決策として、ワードらは、前記ブリガ
チらのような長いリンカ−・アームでヌクレオチドと結
合する結合ラベル分）を開示している。
特許出願ＥＰ−Ａ−６３８７９号では、ラベル分子を、
プローブの標的配列に対する水素結合を干渉するような
ヌクレオチド環の部位には結合させないことがでましい
ことを開示している。この文献ではこのための解決策と
して、ピリミジン（チミン、シトシンおよびウラシル）
の５位、プリン（アデニンおよびグアニン）の７位およ
びデアサブリンの７位におりる結合ラベル分子を開示し
ている。さらに解決策として、ワードらは、前記ブリガ
チらのような長いリンカ−・アームでヌクレオチドと結
合する結合ラベル分）を開示している。
−ｙ−リルス４ ； （Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ ｅｔ
ａｌ、）の英国特、？Ｆ第２０ ］、 ９４０８号は、
マニングら、バイオケミストリー（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ 、 ＋’ Ｂｉｏｅｈｅｍ、 ） １６：
１３６４（１９７７）によって報告されているシトクロ
ームＣ−ビオチン法によるポリヌクレオチド雑種分）形
成プローブの化学的修飾および試料との雑種分子形成前
または後にそのような修飾プローブのラベル付けを開示
している。化学的う３４３５（１９８４）およびトケン
ら、フ・°ロシーデイングス・オブ・ナショナル−アカ
デミ−・オブーザイｊニンス脅メフ゛参ニー・ニス串ニ
ー（’］”ｃｈｅｎｅｔ ３１．、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）８１ ：３４
６６（１９８４）にも開示されている。レンツらの方法
は前記コーリルスキーらの英国特許第２０１９４０８号
およびマニングらの方法と同様な方法で酵素を直接プロ
ーブに結合させている。
ａｌ、）の英国特、？Ｆ第２０ ］、 ９４０８号は、
マニングら、バイオケミストリー（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅ
ｔ ａｌ 、 ＋’ Ｂｉｏｅｈｅｍ、 ） １６：
１３６４（１９７７）によって報告されているシトクロ
ームＣ−ビオチン法によるポリヌクレオチド雑種分）形
成プローブの化学的修飾および試料との雑種分子形成前
または後にそのような修飾プローブのラベル付けを開示
している。化学的う３４３５（１９８４）およびトケン
ら、フ・°ロシーデイングス・オブ・ナショナル−アカ
デミ−・オブーザイｊニンス脅メフ゛参ニー・ニス串ニ
ー（’］”ｃｈｅｎｅｔ ３１．、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）８１ ：３４
６６（１９８４）にも開示されている。レンツらの方法
は前記コーリルスキーらの英国特許第２０１９４０８号
およびマニングらの方法と同様な方法で酵素を直接プロ
ーブに結合させている。
トケンらの方法では、ヌクレオチド残基の５〜１０％以
上の修飾はプローブ雑種分子形成に悪影響を及ぼす。
上の修飾はプローブ雑種分子形成に悪影響を及ぼす。
発明の概要
本発明の１つの態様は、一本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ）内のプローブ領域を、該ポリヌクレオ
チドの修飾前に該ブＩ］−ブ領域と相補配列との雑種分
子形成により、１１に択的に保護することからなるポリ
ヌクレオチド雑種形成プローブの調製法を提供するもの
である。以下に記載のごとく、該プローブ領域は、一本
川ポリヌクレオチド特異反応により、非プローブ領域中
の塩基を化学的に誘導または修飾する前に、プローブ領
域を相補オリゴまたはポリヌクレオチド配列と雑種分子
形成させることにより、選捩的に保護される。
ＡまたはＲＮＡ）内のプローブ領域を、該ポリヌクレオ
チドの修飾前に該ブＩ］−ブ領域と相補配列との雑種分
子形成により、１１に択的に保護することからなるポリ
ヌクレオチド雑種形成プローブの調製法を提供するもの
である。以下に記載のごとく、該プローブ領域は、一本
川ポリヌクレオチド特異反応により、非プローブ領域中
の塩基を化学的に誘導または修飾する前に、プローブ領
域を相補オリゴまたはポリヌクレオチド配列と雑種分子
形成させることにより、選捩的に保護される。
本発明の他の態様は、本発明の方法によって調製された
ポリヌクレオチド雑種形成プローブを提供するものであ
る。ことに、この態様において。
ポリヌクレオチド雑種形成プローブを提供するものであ
る。ことに、この態様において。
本発明は、非プｒ−Ｊ−ブ領域がラベル分子−との結合
用に透析的に修飾されているポリヌクレオチド雑種形成
プローブを提供するものである。
用に透析的に修飾されているポリヌクレオチド雑種形成
プローブを提供するものである。
本発明のもう１つ別の態様は、本発明のポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブからなるキットを提供するものであ
る。
ド雑種形成プローブからなるキットを提供するものであ
る。
発明の詳細
な説明のポリヌクレオチドプローブは、プローブ領域、
すなわち、標的配列と相補するヌクレオチド配列および
非プローブ領域、すなわち、標的配列と相補しないヌク
レオチド配列からなる。
すなわち、標的配列と相補するヌクレオチド配列および
非プローブ領域、すなわち、標的配列と相補しないヌク
レオチド配列からなる。
該プローブ領域と相補する標的配列はゲノム様物質の全
体または・一部あるいは、生物、ウィルスまたは細胞か
らのリポソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、伝令ＲＮＡまたは
インドＶ１ンＲＮＡのような核酸遺伝子生産物のいずれ
てもよい。標的配列は、典型的には、数百ヌクレオチド
のオーダーである。
体または・一部あるいは、生物、ウィルスまたは細胞か
らのリポソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、伝令ＲＮＡまたは
インドＶ１ンＲＮＡのような核酸遺伝子生産物のいずれ
てもよい。標的配列は、典型的には、数百ヌクレオチド
のオーダーである。
特に限定するものではないが１例えば、これらはヒトま
たは非ヒト病原体（いずれの感染性微生物、ウィルスま
たは寄生虫を含む生物をも包含する）に特有の配列また
は、遺伝的異常または他の状態に特有の配列や、例えば
、全ｍＲＮＡ または全細胞Ｄ Ｎ Ａのランダム・
フラグメントのようす遺伝子工学の実験から誘導される
配列のごときヒトまたは非ヒト（動物）ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列とすることができる。標的配列を同定する方法
およびプローブ領域を調製する方法は前記の文献等にも
開示されているごとく、よく知られている。該標的配列
はまた、例えば、全腸内細菌または全クラミジアのよう
な一群の、ヒトまたは非ヒト病原体に特有な核酸配列と
相補性なものとすることもできる。また、該標的配列は
、例えば、組換型ＤＮＡ生産物の製造において使用する
宿主細胞またはベクターに特有な核酸配列と相補性なも
のとして、該生産物中のそのようなＤＮＡまたはＲＮＡ
混入物の存在を検出することも゛できる。種々のＲＮＡ
タイプ壱の雑種分子形成は、例えば、コーンのＷＱ ｓ
４−０２７２１およびトレーパー、ヌクレイツク・ア
シツズ・リサーチ（Ｄｒａｐｅｒ・Ｎｕｃｌ。
たは非ヒト病原体（いずれの感染性微生物、ウィルスま
たは寄生虫を含む生物をも包含する）に特有の配列また
は、遺伝的異常または他の状態に特有の配列や、例えば
、全ｍＲＮＡ または全細胞Ｄ Ｎ Ａのランダム・
フラグメントのようす遺伝子工学の実験から誘導される
配列のごときヒトまたは非ヒト（動物）ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列とすることができる。標的配列を同定する方法
およびプローブ領域を調製する方法は前記の文献等にも
開示されているごとく、よく知られている。該標的配列
はまた、例えば、全腸内細菌または全クラミジアのよう
な一群の、ヒトまたは非ヒト病原体に特有な核酸配列と
相補性なものとすることもできる。また、該標的配列は
、例えば、組換型ＤＮＡ生産物の製造において使用する
宿主細胞またはベクターに特有な核酸配列と相補性なも
のとして、該生産物中のそのようなＤＮＡまたはＲＮＡ
混入物の存在を検出することも゛できる。種々のＲＮＡ
タイプ壱の雑種分子形成は、例えば、コーンのＷＱ ｓ
４−０２７２１およびトレーパー、ヌクレイツク・ア
シツズ・リサーチ（Ｄｒａｐｅｒ・Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ） １３７９８９ （１９８
４）に開示されている。「相補」なる語は実質的な補足
、すなわち、選択した雑種分子形成条件でプローブ領域
が標的配列と安定に雑種分子形成をするのに充分な相補
性を有することを意味する。
４）に開示されている。「相補」なる語は実質的な補足
、すなわち、選択した雑種分子形成条件でプローブ領域
が標的配列と安定に雑種分子形成をするのに充分な相補
性を有することを意味する。
非プローブ領域は線形とすることができ、あるいは、プ
ローブ領域と一緒に共有結合的に閉じた環を形成しても
よい。該非プローブ領域は化学的に修飾された残基に結
合するラベル分子を担持する役割を有する。検出可能部
またはそれを含む多くのラベル分子が公知であり５本発
明のプローブの非プローブ領域中の、ラベルして修飾す
る塩基に用いることができる。ラベル分子は直接または
。
ローブ領域と一緒に共有結合的に閉じた環を形成しても
よい。該非プローブ領域は化学的に修飾された残基に結
合するラベル分子を担持する役割を有する。検出可能部
またはそれを含む多くのラベル分子が公知であり５本発
明のプローブの非プローブ領域中の、ラベルして修飾す
る塩基に用いることができる。ラベル分子は直接または
。
他の試薬と接触させることにより間接的に検出でき、例
えば、ラベル分子が酵素からなる場合、そのような他の
試薬として、該酵素の比色用基質を用いることができる
。本発明におけるラベル分子に用いることのできる検出
可能部の例には、とりわケ、同位元素、ハプテン、フル
オレスセイン、ローダミンおよび他の螢光化合物、化学
ルミネッセンス基、レクチン、β−ガラクトシダーゼの
ような酵素、抗体および％直接的または架橋法により間
接的に結合した他の蛋白が包含される。検出可能部を修
飾残基に結合させるのに有用な親和性基にはビオチンお
よびイミノビオチンのようなその誘導体が包なされ、こ
れらはアビジンに対する強い親和性を有するう 本発明のプローブ製造に用いるポリヌクレオチド分Ｐは
公知の方法で製造することができる。これらには合成法
および生物学的方？とか包含される。
えば、ラベル分子が酵素からなる場合、そのような他の
試薬として、該酵素の比色用基質を用いることができる
。本発明におけるラベル分子に用いることのできる検出
可能部の例には、とりわケ、同位元素、ハプテン、フル
オレスセイン、ローダミンおよび他の螢光化合物、化学
ルミネッセンス基、レクチン、β−ガラクトシダーゼの
ような酵素、抗体および％直接的または架橋法により間
接的に結合した他の蛋白が包含される。検出可能部を修
飾残基に結合させるのに有用な親和性基にはビオチンお
よびイミノビオチンのようなその誘導体が包なされ、こ
れらはアビジンに対する強い親和性を有するう 本発明のプローブ製造に用いるポリヌクレオチド分Ｐは
公知の方法で製造することができる。これらには合成法
および生物学的方？とか包含される。
生物学的合成法には、典型的には分）のクローニングが
包含され、この方法では宿主微生物によって多重コピー
が製造される、 コリファージＭ１３のような一本鎖Ｄ Ｎ Ａファージ
のクローニングは、以下に記載のごとく、そのようなり
ローニングが迅速なスケール・アップおよび非プローブ
領域の修飾前の、プローブ領域保護の都合よい手段を可
能とするので、プローフ分子製造の好ましい方法である
。Ｍｌ３は組換型ＤＮＡの研究に有用な糸状の一本鎖Ｄ
ＮＡウィルスである。Ｍｌ３におけるクローニングは、
例えば、メツシング、メンッズ・オブ・エンサイモロシ
ー（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｑｌ、
）１０１ ： ２０〜７７（１９８，３）およびバーネ
スら、メソッズ・オブ−−Ｔ−：／ サイ％ ｏジー（
Ｂａｒｎｅｓ ｅｔａｌ、、Ｍｅｔｈ。
包含され、この方法では宿主微生物によって多重コピー
が製造される、 コリファージＭ１３のような一本鎖Ｄ Ｎ Ａファージ
のクローニングは、以下に記載のごとく、そのようなり
ローニングが迅速なスケール・アップおよび非プローブ
領域の修飾前の、プローブ領域保護の都合よい手段を可
能とするので、プローフ分子製造の好ましい方法である
。Ｍｌ３は組換型ＤＮＡの研究に有用な糸状の一本鎖Ｄ
ＮＡウィルスである。Ｍｌ３におけるクローニングは、
例えば、メツシング、メンッズ・オブ・エンサイモロシ
ー（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｑｌ、
）１０１ ： ２０〜７７（１９８，３）およびバーネ
スら、メソッズ・オブ−−Ｔ−：／ サイ％ ｏジー（
Ｂａｒｎｅｓ ｅｔａｌ、、Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、）１０１．：９８〜１２２（１９８３
）に記載されている。他の有用な一本鎖ファージには、
例えば、Ｓ１３、Ｇ４、Ｐｈ１Ｘ１７４、ＲＮＡファー
ジ（例えば、ＱＢ％ＭＳ２、Ｒ１７および１２）および
Ｍｌ ３］連フアージ（例えば％ ｆｄおよびＥｌ）
が包含される。プラスミドおよび二本鎖ファージを含
め、他のクローニング・ベクターも使用できるが９．あ
まり好ましくはない。
）に記載されている。他の有用な一本鎖ファージには、
例えば、Ｓ１３、Ｇ４、Ｐｈ１Ｘ１７４、ＲＮＡファー
ジ（例えば、ＱＢ％ＭＳ２、Ｒ１７および１２）および
Ｍｌ ３］連フアージ（例えば％ ｆｄおよびＥｌ）
が包含される。プラスミドおよび二本鎖ファージを含
め、他のクローニング・ベクターも使用できるが９．あ
まり好ましくはない。
Ｍ１３ｍ、１０およびＭ１３ｍ、１１におけるクローニ
ングに利用される制限エンドヌクレアーゼ開裂サイトに
は、例えばｓ Ａ（（Ｉ −Ｂａ１ｎＨＩ −ＥＣｏＲ
■、Ｈｉ ｎ ｃ Ｉｌ、Ｈｉｎｄｌｌ）、ＰｓｔＩ、
５ａｌＩ。
ングに利用される制限エンドヌクレアーゼ開裂サイトに
は、例えばｓ Ａ（（Ｉ −Ｂａ１ｎＨＩ −ＥＣｏＲ
■、Ｈｉ ｎ ｃ Ｉｌ、Ｈｉｎｄｌｌ）、ＰｓｔＩ、
５ａｌＩ。
ＳｍａＩ、５ｓｔＩ およびＸｂａ Ｉが包含される
。もちろん、他のサイトも、加えたり、代用することが
できる。すなわち１例えば、フラグメントが約１３００
〜１４００の塩基対を有し、肝炎Ｂウィルス表面抗原決
定子を担持する肝炎ＢウィルスのＢａｍＨＩフラグメン
トはプローブ領域としてＭ１３ｍｐｌＯまたはＭｌ ３
ｍｐ １１のＢ ａｍ ＨＩサイトにクローンできる。
。もちろん、他のサイトも、加えたり、代用することが
できる。すなわち１例えば、フラグメントが約１３００
〜１４００の塩基対を有し、肝炎Ｂウィルス表面抗原決
定子を担持する肝炎ＢウィルスのＢａｍＨＩフラグメン
トはプローブ領域としてＭ１３ｍｐｌＯまたはＭｌ ３
ｍｐ １１のＢ ａｍ ＨＩサイトにクローンできる。
このようなウィルス配列は肝炎Ｂウィルスに特有で、血
清中または肝、＠生検におけるその配列の検出は肝炎Ｂ
ウィルス感染の７８ 候′ｃある。必須ではないが、好
ましくは、挿入されたプローグ領域を有するＭ１３ＤＮ
Ａは天然のＭ１３ＤＮＡよりも約１０００塩基対以下長
いサイズを有する。
清中または肝、＠生検におけるその配列の検出は肝炎Ｂ
ウィルス感染の７８ 候′ｃある。必須ではないが、好
ましくは、挿入されたプローグ領域を有するＭ１３ＤＮ
Ａは天然のＭ１３ＤＮＡよりも約１０００塩基対以下長
いサイズを有する。
ポリヌクレオチドを修飾する前に、プローグ領域が実質
的に修飾されないように、プローグ領域を選択的に遮断
または保護する。本発明の一具体例においては、この遮
１折は、ブ［コープ領域を含有する第１のＭ１３ＤＮＡ
分Ｐ（ＰＪ、下、Ｍ１３プローブ１と称する）を、該プ
ローブ領域を相補する領域を含む＠２のＭ１３ＤＮＡ分
子（以下、Ｍ１３プローブ２と称する〕と雑種形成させ
ることにより行なわれる。このような分子は、例えば、
プローブ領域を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントを、二本
鎖形であるウィルス・ゲノムの複製型内で両方の可能な
方向でクローニングすることにより調製できる。標準的
な方法を用い、一本鎖ゲツムを有する後代用を製造する
。後代用の各々はプローブ１） Ｎ Ａの２つの鎖、す
なわち、Ｍ１３プローブ１またはＭ１３プローブ２の一
万を担持している。
的に修飾されないように、プローグ領域を選択的に遮断
または保護する。本発明の一具体例においては、この遮
１折は、ブ［コープ領域を含有する第１のＭ１３ＤＮＡ
分Ｐ（ＰＪ、下、Ｍ１３プローブ１と称する）を、該プ
ローブ領域を相補する領域を含む＠２のＭ１３ＤＮＡ分
子（以下、Ｍ１３プローブ２と称する〕と雑種形成させ
ることにより行なわれる。このような分子は、例えば、
プローブ領域を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントを、二本
鎖形であるウィルス・ゲノムの複製型内で両方の可能な
方向でクローニングすることにより調製できる。標準的
な方法を用い、一本鎖ゲツムを有する後代用を製造する
。後代用の各々はプローブ１） Ｎ Ａの２つの鎖、す
なわち、Ｍ１３プローブ１またはＭ１３プローブ２の一
万を担持している。
へ４１３プローブ１およびＭ１３プローブ２はプローブ
領域で相互に相補し、プローブ領域を誘導体化から選択
的に保護するために相互に雑種形成することができる。
領域で相互に相補し、プローブ領域を誘導体化から選択
的に保護するために相互に雑種形成することができる。
得られたポリヌクレオチド分子の一万または両方がプロ
ーブとして使用できる。
ーブとして使用できる。
あるいは、Ｍ ｌ ３プローブｌおよびＭ１３プローブ
２の１つを、該保護工程を行なう前に固体担体に結合さ
せることができる。これは、該ＤＮＡを固体担体に１百
接または間接的に共有的に結合させることにより、行な
うことができる。例えば、モスら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５６ ： １２６５５（
１９８１）参照。例えば、Ｍ１３プローブ１はセルロー
スに結合させることができる。ついで。
２の１つを、該保護工程を行なう前に固体担体に結合さ
せることができる。これは、該ＤＮＡを固体担体に１百
接または間接的に共有的に結合させることにより、行な
うことができる。例えば、モスら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５６ ： １２６５５（
１９８１）参照。例えば、Ｍ１３プローブ１はセルロー
スに結合させることができる。ついで。
該領域をＭ１３プローブ２と雑種形成させて保護し、部
分的に二本鎖の分子を修飾する。修飾後、Ｍ１３プロー
ブ１およびＭ１３プローブ２を脱雑種形成してＭ１３プ
ローブ１を基質に結合させて残ス。Ｍ１３プローブ１お
よび２を担持するファージは、さらにプローブ「製造者
」乏して使用することができる。
分的に二本鎖の分子を修飾する。修飾後、Ｍ１３プロー
ブ１およびＭ１３プローブ２を脱雑種形成してＭ１３プ
ローブ１を基質に結合させて残ス。Ｍ１３プローブ１お
よび２を担持するファージは、さらにプローブ「製造者
」乏して使用することができる。
他の選択的遮断法は当業者に公知である。例えば、プロ
ーブ領域を有する糸状ポリヌクレオチドは組換型プラス
ミドまたは二本鎖１）ＮＡバクテリオファージから単離
できる。ついで、該鎖は、エクソヌクレアーゼの処理に
より５例えば、３から５に、実質的にプローブ領域に切
り詰めることができ、プローブ領域の周囲側に一重鎖非
プローブ領域を有するプローブ分子を生成させることが
できる。プローブ領域は二本鎖のままであるので。
ーブ領域を有する糸状ポリヌクレオチドは組換型プラス
ミドまたは二本鎖１）ＮＡバクテリオファージから単離
できる。ついで、該鎖は、エクソヌクレアーゼの処理に
より５例えば、３から５に、実質的にプローブ領域に切
り詰めることができ、プローブ領域の周囲側に一重鎖非
プローブ領域を有するプローブ分子を生成させることが
できる。プローブ領域は二本鎖のままであるので。
誘導体化から保護される。
プローブ領域を保護したら、得られる修飾残基のラベル
付は前またはそれと同時にｌま１こはそれ以−１−の−
重鎖特異反応により無傷の分子−を修飾する。ラベル分
子の修飾残基への結合を可能にするいずれの一本鎖特異
性または実質的に一本鎖特異性の修飾方法も用いること
ができる。好ましくは、選択した一本鎖領域修飾方法は
、特定の同一反応条件下、二本鎖ポリヌクレオチドまた
は領域におけるよりも、−重鎖ポリヌクレオチドまたは
領域において少なくとも中位多い残基の修飾を生じる。
付は前またはそれと同時にｌま１こはそれ以−１−の−
重鎖特異反応により無傷の分子−を修飾する。ラベル分
子の修飾残基への結合を可能にするいずれの一本鎖特異
性または実質的に一本鎖特異性の修飾方法も用いること
ができる。好ましくは、選択した一本鎖領域修飾方法は
、特定の同一反応条件下、二本鎖ポリヌクレオチドまた
は領域におけるよりも、−重鎖ポリヌクレオチドまたは
領域において少なくとも中位多い残基の修飾を生じる。
ポリヌクレオチド・プローブ分子の一本鎖領域修飾後、
多くのラベルのいずれもを、ｌｉＩ記のように、試料と
雑種分子形成前または後に修飾分子へ結合させることが
できる。いくつかの−重鎖特異反応は保護残基の修飾制
限をもたらせるが、プローブ領域の雑種分子形成が著し
く損なわれるほどではなく、換言すれば、プローブ領域
は実質的にラベル分）を含まずに残る。好ましくは、非
プローブ領域残基はビオチニル化により修飾され。
多くのラベルのいずれもを、ｌｉＩ記のように、試料と
雑種分子形成前または後に修飾分子へ結合させることが
できる。いくつかの−重鎖特異反応は保護残基の修飾制
限をもたらせるが、プローブ領域の雑種分子形成が著し
く損なわれるほどではなく、換言すれば、プローブ領域
は実質的にラベル分）を含まずに残る。好ましくは、非
プローブ領域残基はビオチニル化により修飾され。
ラベル分子はアビジンおよび検出可能部よりなる。
好ましくは、アビジンは酵素と複合している。
一本鎖特毘的修飾方法は公知である。例えば。
マクマスターら、プロシーディンゲス・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＭｃＭａ ｓ ｔ
ｅ ｒｅｔａ＋、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）７４ ： ４８３５〜４８３８（１９
７７）は−重鎖ポリヌクレオチドのグリオキシル化を開
示している。グリオキサールは主にグアニジン残基に結
合する。得られたポリヌクレオチド環状ジオールを水性
溶液中、室温にて過ヨウ素酸ナトリウムで開裂して、ポ
リヌクレオチド上に複数の反応性ジアルデヒドを形成さ
せることができる。このポリヌクレオチドアルデヒドは
、例えば、トリチウム化水素化ホウ素ナトリウムと反応
させてトリチウム化ラベルを生成させることができ、あ
るいは水素化ホウ素ナトリウムの存在下、カダベリンの
ようなジアミノと反応させて１級アミノを生じさ吐るこ
とがてきる。このような１級アミノは、例えば、ビオチ
ニルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ
、ビオチン・ラベル・プローブを得ることかできる。
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ＭｃＭａ ｓ ｔ
ｅ ｒｅｔａ＋、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、）７４ ： ４８３５〜４８３８（１９
７７）は−重鎖ポリヌクレオチドのグリオキシル化を開
示している。グリオキサールは主にグアニジン残基に結
合する。得られたポリヌクレオチド環状ジオールを水性
溶液中、室温にて過ヨウ素酸ナトリウムで開裂して、ポ
リヌクレオチド上に複数の反応性ジアルデヒドを形成さ
せることができる。このポリヌクレオチドアルデヒドは
、例えば、トリチウム化水素化ホウ素ナトリウムと反応
させてトリチウム化ラベルを生成させることができ、あ
るいは水素化ホウ素ナトリウムの存在下、カダベリンの
ようなジアミノと反応させて１級アミノを生じさ吐るこ
とがてきる。このような１級アミノは、例えば、ビオチ
ニルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ
、ビオチン・ラベル・プローブを得ることかできる。
前記の方法の簡略法においては、アジピン酸ジヒドラジ
ドのようなジアミノを、ます１例えば、スルホスクシン
イミジルビオチン（ピアース・ケミカルｔｔ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｂｅｍｉｃａｌ Ｃｏ１ｐａｎｙ ））で
ビオチンと結合させる。得られたアミノ−ビオチンは１
亘接、過ヨウ素酸塩酸化、グリオキシルＤＮＡに添加で
きる。
ドのようなジアミノを、ます１例えば、スルホスクシン
イミジルビオチン（ピアース・ケミカルｔｔ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｂｅｍｉｃａｌ Ｃｏ１ｐａｎｙ ））で
ビオチンと結合させる。得られたアミノ−ビオチンは１
亘接、過ヨウ素酸塩酸化、グリオキシルＤＮＡに添加で
きる。
好ましい一本鎖特異的修飾法はバイサルファイド触媒ア
ミ７基転移である。ドレイパー、ニュータレイックφア
シッズーリサーチ（Ｄｒａｐｅｒ、Ｎｕｃｌ。
ミ７基転移である。ドレイパー、ニュータレイックφア
シッズーリサーチ（Ｄｒａｐｅｒ、Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） １２ ： ９８９ （１９８
４）はこの方法を用いる修飾−重鎖ＲＮＡを報告してい
る（後記実施例３廖照）。
４）はこの方法を用いる修飾−重鎖ＲＮＡを報告してい
る（後記実施例３廖照）。
ヘテロニ官能性基も、−重鎖ＤＮＡまたはラベルによる
修飾一本５ＤＮＡの架橋に用いることができる。−例は
４−アジドフェニルグリオキサールで、これは温和な条
件下、一本鎖核酸中のグアノシンと相互作用する。この
ようにして、ＤＮＡ上に導入されたアジド官能基を蛋白
質、例えば、紫外線の存在下におけるアルカリ性ホスフ
ァターゼおよびフルオレセイン化血清アルブミンと反応
さぜで核酸のラベルを行なう（ポリツクら、バイオケミ
ストリー（Ｐｏ１ｉｃｚ 、 ｅｔ ａｌ。Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 ）３０：３７２（１９８１）＃照〕。
修飾一本５ＤＮＡの架橋に用いることができる。−例は
４−アジドフェニルグリオキサールで、これは温和な条
件下、一本鎖核酸中のグアノシンと相互作用する。この
ようにして、ＤＮＡ上に導入されたアジド官能基を蛋白
質、例えば、紫外線の存在下におけるアルカリ性ホスフ
ァターゼおよびフルオレセイン化血清アルブミンと反応
さぜで核酸のラベルを行なう（ポリツクら、バイオケミ
ストリー（Ｐｏ１ｉｃｚ 、 ｅｔ ａｌ。Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 ）３０：３７２（１９８１）＃照〕。
他の一本鎖特異的修飾法は公知である。本発明のプロー
ブの製造においては、必要性および便利さに基いて、こ
れらの方法を適宜、容易に選択できる。修ｆＩＩｉ法の
例は、例えは、アカデミツク・プレス社のビイ・トソに
よる「核酸化学における基本原理」第Ｈ巻、（’Ｂａ５
ｉｃ Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｌｄ Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ’、Ｖｏｌｕｍｅ［
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
ブの製造においては、必要性および便利さに基いて、こ
れらの方法を適宜、容易に選択できる。修ｆＩＩｉ法の
例は、例えは、アカデミツク・プレス社のビイ・トソに
よる「核酸化学における基本原理」第Ｈ巻、（’Ｂａ５
ｉｃ Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｌｄ Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ’、Ｖｏｌｕｍｅ［
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
１９７４）、ことに、ディ・エム・ブラウン（Ｄ。
Ｍ、Ｂｒｏｗｎ ）による２〜９０頁に記載されている
。
。
修飾し、所望により、ラベル後、反応体を除去し、保護
プローブ領域を公邸の方法で変性し、これにより、プロ
ーブ領域を相補性標的配列にアニールする。
プローブ領域を公邸の方法で変性し、これにより、プロ
ーブ領域を相補性標的配列にアニールする。
この一本鎖特異性化学の新規な適用の土な利点は、コウ
リルスキーら（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ ）の
英国特許第２０１９４０８号に開示されている方法を含
め、プローブのラベル用の従来の酵素法と比較して、プ
ローブのラベルが容易かつ効率よく行なわれることであ
る。この方法はスケール・アップが非常に容易である。
リルスキーら（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ ）の
英国特許第２０１９４０８号に開示されている方法を含
め、プローブのラベル用の従来の酵素法と比較して、プ
ローブのラベルが容易かつ効率よく行なわれることであ
る。この方法はスケール・アップが非常に容易である。
一本鎖特異性化学修飾法により調製されたプローブは、
ラベルの存在がプローブ領域の標的配列との雑種分子形
成を有意に干渉しないので有利であり、したがって、そ
のような雑種分子形成が非常に効率的になる。さらに、
一本鎖特異的修飾は非プローブ領域の全塩基の８０〜９
０％までのラベルにも使用できるが、従来の方法ではそ
のような広範囲のラベルがプローブ領域の雑種形成を許
容しえないほどに干渉し、はなはだ高価になりうる。す
なわち５本発明のプローブにおいては、雑種形成後の検
出用により多くのラベルを存在させることができる。非
プローブ領域の塩基の修飾も非プローブ領域の非特異性
水素結合を最少にすることによりバックグラウンドを減
少させ、ヌクレオチドの作用によるような分解に対して
プローブを安定化させる。本発明のプローブは、ワード
ラ（Ｗａｒｄ ｅｔａｌ、）のＥＰ−Ａ−６３８７９号
に開示されているような、雑種形成の干渉を最少にする
位置のみでラベルされる必要はない。事実、他の位置の
ラベル付けはバックグラウンド雑種形成を、ことに、非
プローブ領域と相補性でありうる天然のゲノム様物質ま
たは核酸遺伝子生成物との雑種形成をさらに減じる。
ラベルの存在がプローブ領域の標的配列との雑種分子形
成を有意に干渉しないので有利であり、したがって、そ
のような雑種分子形成が非常に効率的になる。さらに、
一本鎖特異的修飾は非プローブ領域の全塩基の８０〜９
０％までのラベルにも使用できるが、従来の方法ではそ
のような広範囲のラベルがプローブ領域の雑種形成を許
容しえないほどに干渉し、はなはだ高価になりうる。す
なわち５本発明のプローブにおいては、雑種形成後の検
出用により多くのラベルを存在させることができる。非
プローブ領域の塩基の修飾も非プローブ領域の非特異性
水素結合を最少にすることによりバックグラウンドを減
少させ、ヌクレオチドの作用によるような分解に対して
プローブを安定化させる。本発明のプローブは、ワード
ラ（Ｗａｒｄ ｅｔａｌ、）のＥＰ−Ａ−６３８７９号
に開示されているような、雑種形成の干渉を最少にする
位置のみでラベルされる必要はない。事実、他の位置の
ラベル付けはバックグラウンド雑種形成を、ことに、非
プローブ領域と相補性でありうる天然のゲノム様物質ま
たは核酸遺伝子生成物との雑種形成をさらに減じる。
本発明のプローブはキットとして包装するのに適シてお
り、キットは、単にプローブを含有する緩衝溶液のよう
な容器からなるものでもよく、あるいは、本発明のプロ
ーブを使用するのに有用な、別々の容器に入った種々の
成分からなっていてもよい。キットの成分はプローブの
！］的とする用途およびラベル分）の選択に存在する。
り、キットは、単にプローブを含有する緩衝溶液のよう
な容器からなるものでもよく、あるいは、本発明のプロ
ーブを使用するのに有用な、別々の容器に入った種々の
成分からなっていてもよい。キットの成分はプローブの
！］的とする用途およびラベル分）の選択に存在する。
このようなキットはプローブおよび、ラベル分子（プロ
ーブが予めラベルされていない場合）、標的配列の雑腫
形成、検出および／または定置を可能にｒる試薬および
月利、検出前に標的配列を操作するための試薬および材
料のような他の試薬からなることもできる。このような
キットは、例えば、ビオチンで修飾され、ヒト・サイト
メガロウィルスに特異的な配列のようなＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列用の本発明のプローブおよび、アビジン・アル
カリ性ホスファターゼまｆこは複合ペルオキシダーゼの
ような、雑種形成したプローブ分）と結合あるいは液分
）を検出するような酵素のごときラベル分子からなるこ
とができる。さらに、ラベル分子の存在を検出する。該
酵素用の基質、好ましくは、比色用基質のごとき試薬も
、別の容器に入れてキットに包含させることができる。
ーブが予めラベルされていない場合）、標的配列の雑腫
形成、検出および／または定置を可能にｒる試薬および
月利、検出前に標的配列を操作するための試薬および材
料のような他の試薬からなることもできる。このような
キットは、例えば、ビオチンで修飾され、ヒト・サイト
メガロウィルスに特異的な配列のようなＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列用の本発明のプローブおよび、アビジン・アル
カリ性ホスファターゼまｆこは複合ペルオキシダーゼの
ような、雑種形成したプローブ分）と結合あるいは液分
）を検出するような酵素のごときラベル分子からなるこ
とができる。さらに、ラベル分子の存在を検出する。該
酵素用の基質、好ましくは、比色用基質のごとき試薬も
、別の容器に入れてキットに包含させることができる。
このような試薬には１例えば、ラベルがアルカリ性ホス
ファターゼの場合、ニトロブルー・テトラゾリウムの５
０％Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド−水中溶液および′
５−ブロモ％４−クロロ、３−インドリルホスフェート
のジメチルホルムアミド中溶液が包含される。
ファターゼの場合、ニトロブルー・テトラゾリウムの５
０％Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド−水中溶液および′
５−ブロモ％４−クロロ、３−インドリルホスフェート
のジメチルホルムアミド中溶液が包含される。
あるいは、プローブはビオニチル化およびアビジン酵素
複合体の結合により、予めラベルすることもでき、この
場合、キットには１つの容器に入れたプローブおよび他
の容器に入れたラベル分子・の存在を検出するための試
薬を包含させることができる。標準試薬および／または
標的配列に結合した特定のプローブの量を正確に定置す
るための装置も包含させることができる。より精巧なキ
ットは髄膜炎または性病のような病状の２Ｊ２＋、上の
共通した原因物質に特異的なラベルしたプローブからな
ることもできる。ラベル分子および基質に加え、このさ
らに複雑なキットには異なった標的配列用の複数の異な
ったプローブを包含させることもできる。このようなキ
ットは感染性物質の同定ならひに感染性物質のサブクラ
スへの分類を可能とする。このような、さらに複雑なキ
ットは、さらに、標的配列のさらに詳細な分析に有用な
装置および試薬からなる。例えば、家族性遺伝的障吉ま
たは他のいずれの遺伝的特性または幀向の分析も患者か
らの染色体ＤＮＡの制限およびケル電気泳動分析により
検査できる。このようなキットには、制限酵素、制限酵
素緩衝液、電気泳動マトリックス（例えば、アガロース
およびアクリルアミド）ならびに、制限分析前の細胞溶
解およびそれからの核酸抽出用試薬のような染色体Ｄ
Ｎ 、Ａ Ａ製用の他の試薬を包含させることができる
。前記のキットの組成物は説明のための具体例にすき゛
す、他の試薬および材ｑ １１らひに試薬および祠、何
の組合せは当業苦に明らかである。
複合体の結合により、予めラベルすることもでき、この
場合、キットには１つの容器に入れたプローブおよび他
の容器に入れたラベル分子・の存在を検出するための試
薬を包含させることができる。標準試薬および／または
標的配列に結合した特定のプローブの量を正確に定置す
るための装置も包含させることができる。より精巧なキ
ットは髄膜炎または性病のような病状の２Ｊ２＋、上の
共通した原因物質に特異的なラベルしたプローブからな
ることもできる。ラベル分子および基質に加え、このさ
らに複雑なキットには異なった標的配列用の複数の異な
ったプローブを包含させることもできる。このようなキ
ットは感染性物質の同定ならひに感染性物質のサブクラ
スへの分類を可能とする。このような、さらに複雑なキ
ットは、さらに、標的配列のさらに詳細な分析に有用な
装置および試薬からなる。例えば、家族性遺伝的障吉ま
たは他のいずれの遺伝的特性または幀向の分析も患者か
らの染色体ＤＮＡの制限およびケル電気泳動分析により
検査できる。このようなキットには、制限酵素、制限酵
素緩衝液、電気泳動マトリックス（例えば、アガロース
およびアクリルアミド）ならびに、制限分析前の細胞溶
解およびそれからの核酸抽出用試薬のような染色体Ｄ
Ｎ 、Ａ Ａ製用の他の試薬を包含させることができる
。前記のキットの組成物は説明のための具体例にすき゛
す、他の試薬および材ｑ １１らひに試薬および祠、何
の組合せは当業苦に明らかである。
実施例
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか
、これらに限定されるものではない。
、これらに限定されるものではない。
実施例１
一重鎖特毘的修飾
グリオキシル化ニー木調Ｍｌ ３ＣＡ２ＤＮＡ（Ｑ、
Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｐ ０４２５１’ｌｌ中、２５ μｇ
、 ＰＨ７，０）を、ジメチルスルホキシド変性を用い
ない以外は実質的にマクマスターら、プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（ＭｃＭａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃす７４ ： ４８３５〜４
８３８（１９７７）の記載に従って、１１５容のグリオ
キサールの脱イオン化６Ｍ水性溶液と、５０℃で１時間
反応させる。反応混合液を、氷１＠ Ｎ ａ Ｐ ０４
緩衝液（ｐＨ７，０）の添加により１００μｅに希釈す
る。得られた修飾、すなわち、グリオキシル化ＤＮＡを
、ｏ、 Ｉ Ｍ ＮａＰＯ４（ｐＨ７，０）中、セフ７
デツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）Ｇ −５０ゲル（）ｒ
ルマシア（Ｐｌｘａｒｍａｃｉａ） ）の１ ｍｌ床を
通ず遠心溶出で精製する。
Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｐ ０４２５１’ｌｌ中、２５ μｇ
、 ＰＨ７，０）を、ジメチルスルホキシド変性を用い
ない以外は実質的にマクマスターら、プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（ＭｃＭａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃす７４ ： ４８３５〜４
８３８（１９７７）の記載に従って、１１５容のグリオ
キサールの脱イオン化６Ｍ水性溶液と、５０℃で１時間
反応させる。反応混合液を、氷１＠ Ｎ ａ Ｐ ０４
緩衝液（ｐＨ７，０）の添加により１００μｅに希釈す
る。得られた修飾、すなわち、グリオキシル化ＤＮＡを
、ｏ、 Ｉ Ｍ ＮａＰＯ４（ｐＨ７，０）中、セフ７
デツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）Ｇ −５０ゲル（）ｒ
ルマシア（Ｐｌｘａｒｍａｃｉａ） ）の１ ｍｌ床を
通ず遠心溶出で精製する。
過ヨウｇ ｍ １Ｍ 開裂：エルセピア／ノース・ホー
ランド・バイオメディカル・プレス社、ナツプら編、ウ
ィルソンら著、「免疫螢光および関連染色技術ｊ（Ｗｉ
ｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｉｒｒｍｕｒｒｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｅｎｃｅａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｓｔａ
ｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、 ｃｄ、
’ｂｙＫｎａｐｐ ｅｔａｌ。 １ ｇ ７ Ｂ 、
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ／Ｎｏｒｔｈ１（ｏＪＪａｎｄ
ＢｉｏｍｅｄｉｃａＪ Ｐｒｅｓｓ ） ２１５〜
２２４頁（１９７８年〕の記載に実質的に従って、過ヨ
ウ素酸塩開裂により、グリオキシル化ＤＮＡ２０μｇを
反応性アルデヒドＤＮＡに変える。Ｎ□ＰＯ４緩衝液（
ｐＦ−１７，０） ９０ ｔｔｅ中、該ＤＮＡに５０℃
で１．０Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎａｒｎ １０
４ ） １０μｅを加え、時々振とうしながら、室温（
２１℃）で３０分間インキュベートする。アルデヒドＤ
ＮＡを含有する反応混合液を、１０１ＭＮａＰＯ４（Ｐ
Ｉ’−Ｔ７．Ｏ） ５００ｗｌづつを３回変更しながら
、これに対して４℃で一夜透析する。
ランド・バイオメディカル・プレス社、ナツプら編、ウ
ィルソンら著、「免疫螢光および関連染色技術ｊ（Ｗｉ
ｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｉｒｒｍｕｒｒｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｅｎｃｅａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｓｔａ
ｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、 ｃｄ、
’ｂｙＫｎａｐｐ ｅｔａｌ。 １ ｇ ７ Ｂ 、
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ／Ｎｏｒｔｈ１（ｏＪＪａｎｄ
ＢｉｏｍｅｄｉｃａＪ Ｐｒｅｓｓ ） ２１５〜
２２４頁（１９７８年〕の記載に実質的に従って、過ヨ
ウ素酸塩開裂により、グリオキシル化ＤＮＡ２０μｇを
反応性アルデヒドＤＮＡに変える。Ｎ□ＰＯ４緩衝液（
ｐＦ−１７，０） ９０ ｔｔｅ中、該ＤＮＡに５０℃
で１．０Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎａｒｎ １０
４ ） １０μｅを加え、時々振とうしながら、室温（
２１℃）で３０分間インキュベートする。アルデヒドＤ
ＮＡを含有する反応混合液を、１０１ＭＮａＰＯ４（Ｐ
Ｉ’−Ｔ７．Ｏ） ５００ｗｌづつを３回変更しながら
、これに対して４℃で一夜透析する。
ジアミノ付加：カダベリン（ｌ、５−ジアミノペンタン
〕を、前記ウィルソンらの記載する過ヨウ素酸塩酸化糖
蛋白酵素、例えば、ペルオキシダーゼをイムノグロブリ
ンＧ分子の６−アミノ基へ複合させるために用いた方法
で該アルデヒドＤＮＡに結合させる。カダベリンを含有
しない塩基を０．５Ｍ Ｎａ８２ＰＯ４で濃度ＩＭに希
釈する。カタベリン濃度１０μｅを、アルデヒドＩ）Ｎ
ＡＩＱμｇを含有する０、１Ｍ ＮａＰＯ４（ＰＨ７，
０）９０μｅに加える。
〕を、前記ウィルソンらの記載する過ヨウ素酸塩酸化糖
蛋白酵素、例えば、ペルオキシダーゼをイムノグロブリ
ンＧ分子の６−アミノ基へ複合させるために用いた方法
で該アルデヒドＤＮＡに結合させる。カダベリンを含有
しない塩基を０．５Ｍ Ｎａ８２ＰＯ４で濃度ＩＭに希
釈する。カタベリン濃度１０μｅを、アルデヒドＩ）Ｎ
ＡＩＱμｇを含有する０、１Ｍ ＮａＰＯ４（ＰＨ７，
０）９０μｅに加える。
２１℃、ｐＨ１２，０で２時間シッフ塩基の形成を進行
させ、ついで、０．５ Ｍ ＮａＯＨ中、０．２５ＭＮ
ａＢＨ４１５μｅての還元により、結合を共有結合に変
える。４℃で２時間後−２０ｒｎＭ Ｎａ Ｐ Ｏ，ｉ
、２ｍＭエチレンジアミノ四酢酸酢酸塩ＣｐＨ７）中。
させ、ついで、０．５ Ｍ ＮａＯＨ中、０．２５ＭＮ
ａＢＨ４１５μｅての還元により、結合を共有結合に変
える。４℃で２時間後−２０ｒｎＭ Ｎａ Ｐ Ｏ，ｉ
、２ｍＭエチレンジアミノ四酢酸酢酸塩ＣｐＨ７）中。
Ｐ−６０樹脂（ハ（オラ）−（ＢｉｏＲａｄ） ）の４
．５ ｍｌカラム上、少量の試薬からＤＮＡ生成物を除
外クロマトグラフィー分離により、還元を終了させる。
．５ ｍｌカラム上、少量の試薬からＤＮＡ生成物を除
外クロマトグラフィー分離により、還元を終了させる。
除外した物質（カダベリン−ラベルＤＮＡ）、ｐ含有す
るフラクションを溜め、３０ｍＭｌ−リエタノールアミ
ノ酢酸塩（ｐＨ７，６，ＴＥ Ａ ）に対して透析し、
乾燥セファデックスＧ−２００ゲル（ファルマシア）に
対して透析して濃縮する。
るフラクションを溜め、３０ｍＭｌ−リエタノールアミ
ノ酢酸塩（ｐＨ７，６，ＴＥ Ａ ）に対して透析し、
乾燥セファデックスＧ−２００ゲル（ファルマシア）に
対して透析して濃縮する。
ビオチニル化：レーリーら、プロシーディンゲス・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイｘ ：／ス（Ｌ
ｅａｒｙ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｊ＋）８０：４０４５〜４０４９ （１
９８３）のアルカリ性ホスファターゼのビオチン・ラベ
ルのための方法により、カダベリン−ラベルＤ、ＮＡの
入手てきるアミノを実質的にビオチニル化する。ビオチ
ニル化ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＩＩＡ−ＣＳ Ｅ ） （例えは、カス
ゾロら、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ。
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイｘ ：／ス（Ｌ
ｅａｒｙ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｊ＋）８０：４０４５〜４０４９ （１
９８３）のアルカリ性ホスファターゼのビオチン・ラベ
ルのための方法により、カダベリン−ラベルＤ、ＮＡの
入手てきるアミノを実質的にビオチニル化する。ビオチ
ニル化ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＩＩＡ−ＣＳ Ｅ ） （例えは、カス
ゾロら、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ。
Ｃｈｅｍ、）２５：１５７２〜１５８０（１９７９）参
照）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して、ＢＡ
ＣＳ Ｅの２０■／ ＩＩ溶液を調製する。この溶液の
２μｅを、４℃でおだやかに攪拌しながら、３０分間隔
で２回、３ ＱｍＭ ＴＥＡ１５０μｅ中、該−ｆミノ
ＤＮＡ１，５μｇに加える。、２．’５時間後、トリス
−グリシン緩衝液（０，１Ｍトリス、５８τ９．’ｔｌ
グリシン、ｐＨ７，９）１０μｅ の添加により反応を
終了させる。ビオチニル化ＤＮＡを、前記と同様にＰ−
６０ｆｆＬ！脂上で除外クロマトグラフィーにより精製
する。ビオチン含有フラクションは、各フラクション１
μａをジエチルアミノエチルポットし、前記のレーリー
らの比色アルカリ性ホスファターゼ分析で同定する。
照）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して、ＢＡ
ＣＳ Ｅの２０■／ ＩＩ溶液を調製する。この溶液の
２μｅを、４℃でおだやかに攪拌しながら、３０分間隔
で２回、３ ＱｍＭ ＴＥＡ１５０μｅ中、該−ｆミノ
ＤＮＡ１，５μｇに加える。、２．’５時間後、トリス
−グリシン緩衝液（０，１Ｍトリス、５８τ９．’ｔｌ
グリシン、ｐＨ７，９）１０μｅ の添加により反応を
終了させる。ビオチニル化ＤＮＡを、前記と同様にＰ−
６０ｆｆＬ！脂上で除外クロマトグラフィーにより精製
する。ビオチン含有フラクションは、各フラクション１
μａをジエチルアミノエチルポットし、前記のレーリー
らの比色アルカリ性ホスファターゼ分析で同定する。
生成物（〈３μｇ〕は、塩基加水分解に対する抵抗、ア
ガロース・ゲル移動度、紫外線吸収スペクトルおよび、
前記レーリーらの方法に従ったアビジン酵素複合体結合
能により、一本鎖ビオチ．ｍＪｌｚ化ＤＮＡであること
を確認した。
ガロース・ゲル移動度、紫外線吸収スペクトルおよび、
前記レーリーらの方法に従ったアビジン酵素複合体結合
能により、一本鎖ビオチ．ｍＪｌｚ化ＤＮＡであること
を確認した。
以上は一本鎖特異反応による化学修飾ＤＮＡの方法の一
具体例である。この方法は，公知の方法によりプローブ
領域の雑種形成によりプローブ領域を選択的に保護し、
ついで、前記のように一本鎖特異的化学法を採用するこ
とによるポリヌクレオチド・プローブのラベルに使用で
きる。前記の具体的に説明した化学修飾法を，保護プロ
ーブ領域を有するポリヌクレオチドに適用するには、ジ
アミノ付加工程はＰＨ１２ よりも温和なｐＨ、例えば
、ｐＨ約８〜９にて、例えば、カダベリン遊離塩基を、
ＩＮＨｃ／でｐＨ約９．５まで滴定し，ＮａＢＨ４の中
性溶液に用いることにより行なう。
具体例である。この方法は，公知の方法によりプローブ
領域の雑種形成によりプローブ領域を選択的に保護し、
ついで、前記のように一本鎖特異的化学法を採用するこ
とによるポリヌクレオチド・プローブのラベルに使用で
きる。前記の具体的に説明した化学修飾法を，保護プロ
ーブ領域を有するポリヌクレオチドに適用するには、ジ
アミノ付加工程はＰＨ１２ よりも温和なｐＨ、例えば
、ｐＨ約８〜９にて、例えば、カダベリン遊離塩基を、
ＩＮＨｃ／でｐＨ約９．５まで滴定し，ＮａＢＨ４の中
性溶液に用いることにより行なう。
このプローブは公知の方法による研究用，臨床または工
業試料中の特定のヌクレオチド分子の検出に使用され，
これには雑種分子形成前または後のラベル付り、標識配
列とプローブとの雑種分）形成が包含される。
業試料中の特定のヌクレオチド分子の検出に使用され，
これには雑種分子形成前または後のラベル付り、標識配
列とプローブとの雑種分）形成が包含される。
実施例２
ＬＴ’プローブの比較
本発明のプローブＲ＋、修飾されていない第２のプロー
ブ（Ｂ］、およびプローブおよび非プローブ領域が修飾
された第３のプローブ（Ｃ）を、ｔ’ｌ］補性を有しな
い第１のテストＤＮＡ、プローブ領域に相補性ヲ有スる
第２のテストＩ）ＮＡおよび非プローブ領域に相補性を
有する第３のテス１−ＤＮＡと雑種分子形成させて比較
する。
ブ（Ｂ］、およびプローブおよび非プローブ領域が修飾
された第３のプローブ（Ｃ）を、ｔ’ｌ］補性を有しな
い第１のテストＤＮＡ、プローブ領域に相補性ヲ有スる
第２のテストＩ）ＮＡおよび非プローブ領域に相補性を
有する第３のテス１−ＤＮＡと雑種分子形成させて比較
する。
プローブを修飾する前に、つぎのように３２ｐでラベル
して雑種形成の比較を可能にする。イー・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）熱不安定性トキシン（ＬＴ）の蛋白（７５
０塩基）を含む一本鎖Ｍ１３Ｎ）ＮＡ環（Ｍ１３プロー
ブ１）を、５ＱｍＭ）リスＨＣ４！（ｐＨ７，５）、５
ｒｒ＋Ｍ ＭｇＣｅ２ 、ｏ、 ０５ ”ｆ／／ １
ｕｌｌウシ血清アルブミン１００μｅ中、０℃にてＤＮ
Ａアーゼ１ （１２，５ｎｇ）で消化して線状にする。
して雑種形成の比較を可能にする。イー・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）熱不安定性トキシン（ＬＴ）の蛋白（７５
０塩基）を含む一本鎖Ｍ１３Ｎ）ＮＡ環（Ｍ１３プロー
ブ１）を、５ＱｍＭ）リスＨＣ４！（ｐＨ７，５）、５
ｒｒ＋Ｍ ＭｇＣｅ２ 、ｏ、 ０５ ”ｆ／／ １
ｕｌｌウシ血清アルブミン１００μｅ中、０℃にてＤＮ
Ａアーゼ１ （１２，５ｎｇ）で消化して線状にする。
ついて、ガニ／７３２Ｐ −ｄ ＡＴＩ’およびポリヌ
クレオチド・キナーゼを用いる標準的方法（例えば、ニ
ュー ヨーり州、コールド・スプリングハーバ−、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、マニアチ
スらｆＬ１９８２％モレキュラー・クローニング、ラホ
ラトジ一番マニュアル（Ｍａｎｉａｃｉｓｅｔ ａｌ。
クレオチド・キナーゼを用いる標準的方法（例えば、ニ
ュー ヨーり州、コールド・スプリングハーバ−、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、マニアチ
スらｆＬ１９８２％モレキュラー・クローニング、ラホ
ラトジ一番マニュアル（Ｍａｎｉａｃｉｓｅｔ ａｌ。
ｅｄｓ、ｌ ９８２ 、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ 、 ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ−１ａｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ 、 Ｙ 、 ）参照）によ
り、該１） Ｎ Ａの５末端を３２Ｐでラベフ ルする。得られたＤＮＡはＩ Ｘ １０ ｄｐｍ／ｐ
ｇ（Ｄ比 放射能を有し、イー・コリネ安定性トキシン
（ＬＴ）遺伝子の一部を表わす配列（プローブ領域）を
含む。
ｏｎｉｎｇ 、 ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ−１ａｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ 、 Ｙ 、 ）参照）によ
り、該１） Ｎ Ａの５末端を３２Ｐでラベフ ルする。得られたＤＮＡはＩ Ｘ １０ ｄｐｍ／ｐ
ｇ（Ｄ比 放射能を有し、イー・コリネ安定性トキシン
（ＬＴ）遺伝子の一部を表わす配列（プローブ領域）を
含む。
プローブ領域の保護、３２Ｐ−ラベルＭ１３プローブ１
ＤＮＡｌμｇを、Ｍ１３プローブ１中のプローブ領域を
相補する領（７５０塩基）を含む一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ環
（Ｍ１３プローブ２）１μｇと混合する。混合物を０．
１． Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，０）２５μｅ中
、６５℃で１０分間加熱し、５０℃で１時間アニール（
もしくは雑種形成）させ、プローブ領域の二本鎖形を生
じさせ、非プローブ領域は実質的に一本鎖に残しておく
。
ＤＮＡｌμｇを、Ｍ１３プローブ１中のプローブ領域を
相補する領（７５０塩基）を含む一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ環
（Ｍ１３プローブ２）１μｇと混合する。混合物を０．
１． Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，０）２５μｅ中
、６５℃で１０分間加熱し、５０℃で１時間アニール（
もしくは雑種形成）させ、プローブ領域の二本鎖形を生
じさせ、非プローブ領域は実質的に一本鎖に残しておく
。
修飾：前記のようにして生じたプローブＤＮＡ混合物９
． Ｑ、 ｌ Ｍ ＮａＰＯ４（Ｐ” ７．０ ）中、
緩衝液のみ、２Ｍグリオキサールまたは２Ｍグリオキサ
ール＋５０％ＤＭＳＯで処理し、各々、［ＡＩ 非修
飾ポリヌクレオチド・プローブ、ＦＢＩ 非プローブ
領域のみ修飾されたプローブ。
． Ｑ、 ｌ Ｍ ＮａＰＯ４（Ｐ” ７．０ ）中、
緩衝液のみ、２Ｍグリオキサールまたは２Ｍグリオキサ
ール＋５０％ＤＭＳＯで処理し、各々、［ＡＩ 非修
飾ポリヌクレオチド・プローブ、ＦＢＩ 非プローブ
領域のみ修飾されたプローブ。
または
（Ｃ１非プＬ１−ブおよびプローブ領域両方が修飾され
たプローブ を得る。
たプローブ を得る。
雑種形成テスト：レーリーら、プＶ］シーデインダス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・す（エン７、
（Ｌｃａｒｙ ｃｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ＋ＳＣ’−） ８０ ： ４０４５〜４０
４９（１９８３）と同様に、加熱変性およびニトロセル
ロース・フィルター」二、５０％ホルムアミドを含有す
る雑秤形成緩衝液１ ｔｔｔｉ当り、プローブＩ）ＮＡ
２５μｇを用いる雑種形成により、プローブＡ、Ｂおよ
びＣを５つのテストＩ）ＮＡ（１＝ツト・プロット）と
雑種形成させる。２つのプローブＡ、１つのプローブＢ
および１つのプローブＣ（各５μｇ〕を各テスト１）Ｎ
Ａ の各 −−−−二１１巳ｔＦ５ ハｇ、
１ｎｇ、ｏ、２ｎｇ、４０ ｐｇおよびｓｐｇと
雑種形成させる。テス）ＤＮＡをつぎの表に示す。
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・す（エン７、
（Ｌｃａｒｙ ｃｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ＋ＳＣ’−） ８０ ： ４０４５〜４０
４９（１９８３）と同様に、加熱変性およびニトロセル
ロース・フィルター」二、５０％ホルムアミドを含有す
る雑秤形成緩衝液１ ｔｔｔｉ当り、プローブＩ）ＮＡ
２５μｇを用いる雑種形成により、プローブＡ、Ｂおよ
びＣを５つのテストＩ）ＮＡ（１＝ツト・プロット）と
雑種形成させる。２つのプローブＡ、１つのプローブＢ
および１つのプローブＣ（各５μｇ〕を各テスト１）Ｎ
Ａ の各 −−−−二１１巳ｔＦ５ ハｇ、
１ｎｇ、ｏ、２ｎｇ、４０ ｐｇおよびｓｐｇと
雑種形成させる。テス）ＤＮＡをつぎの表に示す。
雑種形成は４２℃で１７時間行ない、ついで、フィルタ
ーを洗浄し、コダック（Ｋｏｄａｋ） Ｘ −Ａ ＲＸ
線フィルムに暴露し、放射性プローブＤＮＡを結合した
試料を同定する口 雑種形成実験結果をつぎの表にまとめる。表中、（−）
は雑種形成検出せず、ｃ”）は非常に強い雑種形成、（
＋）および（４＋）は、各々、弱い雑種形成および強い
雑種形成を示す。（プローブＢは本発明のプローブであ
る。プローブＡは非修飾、プローブＣは全ての領域が修
飾されている。
ーを洗浄し、コダック（Ｋｏｄａｋ） Ｘ −Ａ ＲＸ
線フィルムに暴露し、放射性プローブＤＮＡを結合した
試料を同定する口 雑種形成実験結果をつぎの表にまとめる。表中、（−）
は雑種形成検出せず、ｃ”）は非常に強い雑種形成、（
＋）および（４＋）は、各々、弱い雑種形成および強い
雑種形成を示す。（プローブＢは本発明のプローブであ
る。プローブＡは非修飾、プローブＣは全ての領域が修
飾されている。
表に示すごとく、非修飾ポリヌクレオチド・プローブで
あるプローブＡはテストＤＮＡ４と非″潜に強く、テス
トＤＮＡ２および３と強く、また、テス）ＤＮＡＩおよ
び５と弱く雑種形成する。
あるプローブＡはテストＤＮＡ４と非″潜に強く、テス
トＤＮＡ２および３と強く、また、テス）ＤＮＡＩおよ
び５と弱く雑種形成する。
非プローブ領域で修飾されているポリヌクレオチド・プ
ローブであるプローブＢは、非修飾プローブと実質的に
同程度にテストＤＮＡ３と強く雑種形成する。テス）Ｄ
ＮＡ４との雑種形成においては約１００倍もの減少が観
察される。Ｉ）ＮＡＩ’。
ローブであるプローブＢは、非修飾プローブと実質的に
同程度にテストＤＮＡ３と強く雑種形成する。テス）Ｄ
ＮＡ４との雑種形成においては約１００倍もの減少が観
察される。Ｉ）ＮＡＩ’。
２または５に対する雑種形成は見られない。全ての領域
で修飾されているポリヌクレオチド・プローブであるプ
ローブＣはいずれのＤＮＡに対しても顕著な雑種形成を
示さず、ただ、ＤＮＡ４に対しては非常に弱い雑種形成
をする。
で修飾されているポリヌクレオチド・プローブであるプ
ローブＣはいずれのＤＮＡに対しても顕著な雑種形成を
示さず、ただ、ＤＮＡ４に対しては非常に弱い雑種形成
をする。
このように、一本鎖特異性修飾は、標的配列との雑種形
成についてのプローブ領域の能力は維持し、かつ、非プ
ローブ領域相補配列または関係のな゛い配列との非特異
的雑種形成を約２オーダー程度低下させる。
成についてのプローブ領域の能力は維持し、かつ、非プ
ローブ領域相補配列または関係のな゛い配列との非特異
的雑種形成を約２オーダー程度低下させる。
実施例３
ヒトβ−グロブリン遺伝子プローブの調製ヒトβ−グロ
ブリン遺伝子に特異的な本発明のプローブを、本発明の
方法を用いてパブテン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）
でラベルスル。
ブリン遺伝子に特異的な本発明のプローブを、本発明の
方法を用いてパブテン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）
でラベルスル。
プローブ領域の保護：β−グロブリン遺伝子と相補する
１３１ｏ塩基を含有する一本鎖Ｍ１３プローブＩＤＮＡ
（Ｍ１３株ｍＰ １０１７ ）の８５μｇを、１０ｍＭ
エチレンジアミノ四酢酸塩（ＥＤＴＡ ） （ｐＨｓ、
ｏ ）、０．６ Ｍ ＮａＣｅ オヨＵＯ，０６Ｍク
エン醇ナトリウムを含有する溶液０．４ゴ中、一本鎖Ｍ
１３プローブ２ＤＮＡ（Ｍ１３株ｍＰ１１３５）８５μ
ｇと混合する。混合物を１００℃で２分間加熱し、６５
℃で３！Ｉｖ間雑種形成させる。得られた保護プローブ
ＤＮＡ、ｐエタノールで２回沈降させて精製し、最後に
ｌＱｍＭＮ ａ Ｐ ０４．１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７，０）０．１６ｙｎｌに溶解する。
１３１ｏ塩基を含有する一本鎖Ｍ１３プローブＩＤＮＡ
（Ｍ１３株ｍＰ １０１７ ）の８５μｇを、１０ｍＭ
エチレンジアミノ四酢酸塩（ＥＤＴＡ ） （ｐＨｓ、
ｏ ）、０．６ Ｍ ＮａＣｅ オヨＵＯ，０６Ｍク
エン醇ナトリウムを含有する溶液０．４ゴ中、一本鎖Ｍ
１３プローブ２ＤＮＡ（Ｍ１３株ｍＰ１１３５）８５μ
ｇと混合する。混合物を１００℃で２分間加熱し、６５
℃で３！Ｉｖ間雑種形成させる。得られた保護プローブ
ＤＮＡ、ｐエタノールで２回沈降させて精製し、最後に
ｌＱｍＭＮ ａ Ｐ ０４．１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７，０）０．１６ｙｎｌに溶解する。
修飾：保護プローブＤ Ｎ Ａ ヲドレーパー、ヌクレ
イツク・アシツズーリサーチ（Ｄｒａｐｅｒ 、 Ｎｕ
ｃｌ。
イツク・アシツズーリサーチ（Ｄｒａｐｅｒ 、 Ｎｕ
ｃｌ。
ＡｃｊｄｓＲｅｓ、） １２：９８９（１９８４）に
記載される方法に実質的に従い、以下のようにしてエチ
レンジアミノによるバイサルファイド触媒アミノ基転移
により修飾する。
記載される方法に実質的に従い、以下のようにしてエチ
レンジアミノによるバイサルファイド触媒アミノ基転移
により修飾する。
１） Ｎ Ａ混合物５０ Ｉｌｌ！をＮａ２Ｓ２０５１
５９Ｍおヨヒエチレンジアミノ２．８Ｍの溶液（ｐＨ６
，０）０、４５ ｍｌと混合する。混合液を４２℃で１
．５時間インキュベーションし、 氷Ｎ する。Ｑ、
５ Ｎ Ｎａ０Ｉ−１６０μｅを添加してｐＨを８〜８
．５に調製し、氷−ヒて３０分間インキュベーションを
つつける。３０ｍＭトリエタノールアミノ緩衝液（ｐＨ
７，６） ニ対して透析して反応体からエチレンアミノ
・ラベルＤＮＡを分離する。
５９Ｍおヨヒエチレンジアミノ２．８Ｍの溶液（ｐＨ６
，０）０、４５ ｍｌと混合する。混合液を４２℃で１
．５時間インキュベーションし、 氷Ｎ する。Ｑ、
５ Ｎ Ｎａ０Ｉ−１６０μｅを添加してｐＨを８〜８
．５に調製し、氷−ヒて３０分間インキュベーションを
つつける。３０ｍＭトリエタノールアミノ緩衝液（ｐＨ
７，６） ニ対して透析して反応体からエチレンアミノ
・ラベルＤＮＡを分離する。
ＤＮＰハプテンのアミノ付加物との共有結合を。
ＤＮＰ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２５〜
をジメチルホルムアミド０．５ ｔｔｔｌに溶解し。
をジメチルホルムアミド０．５ ｔｔｔｌに溶解し。
この試薬ｌＯμｅを透析したアミノ・ラベルＤＮＡ０、
６ ｍｌに加え、室温で１時間インキュベーションする
ことにより完了する。ついで、このＤＮＰラベルＤＮＡ
を、等容量のクロロホルム−インアミルアルコール（２
４：１）で６回抽出し、水相をエタノールで沈降させる
ことにより５反応体から分層する。最終の黄色ＤＮＡ沈
澱を１０ ｍＭ ト！ＪスＨＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）１００ ｔｔｅに溶解する。ＤＮＰ−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代すにビオチニ
ル−アミノカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルヲ用いて、同様にして、ビオチン・ラベルＤＮ
Ａプローブを調製するう 雑種形成テスト：プローブと標的ＤＮＡを混合し、標準
的な雑種形成条件下でインキュベーションした後、アガ
ロースゲル中での電気泳動移動度における変化で雑種形
成を測定する。ＤＮＰラベル・プローブは、ヒトβ−ク
ロプリン遺伝チ配列（ツクマキら、セ／Ｉ／ （Ｆｕｋ
ｕｍａｋｉ ｅｃ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ）２３：５８５
）を含有するプラスミド（ＰＴＩＢＣ６）と雑種形成す
る力ζプローブの非プローブ領域に相補するＤＮＡ試料
とは雑種形成しない。
６ ｍｌに加え、室温で１時間インキュベーションする
ことにより完了する。ついで、このＤＮＰラベルＤＮＡ
を、等容量のクロロホルム−インアミルアルコール（２
４：１）で６回抽出し、水相をエタノールで沈降させる
ことにより５反応体から分層する。最終の黄色ＤＮＡ沈
澱を１０ ｍＭ ト！ＪスＨＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）１００ ｔｔｅに溶解する。ＤＮＰ−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代すにビオチニ
ル−アミノカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルヲ用いて、同様にして、ビオチン・ラベルＤＮ
Ａプローブを調製するう 雑種形成テスト：プローブと標的ＤＮＡを混合し、標準
的な雑種形成条件下でインキュベーションした後、アガ
ロースゲル中での電気泳動移動度における変化で雑種形
成を測定する。ＤＮＰラベル・プローブは、ヒトβ−ク
ロプリン遺伝チ配列（ツクマキら、セ／Ｉ／ （Ｆｕｋ
ｕｍａｋｉ ｅｃ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ）２３：５８５
）を含有するプラスミド（ＰＴＩＢＣ６）と雑種形成す
る力ζプローブの非プローブ領域に相補するＤＮＡ試料
とは雑種形成しない。
ＤＮＰラベラベプローブの検出：ＤＮＰラベルＤ Ｎ
Ａ ｒ、ｙ Ｑ、 ５ Ｍ Ｎ ａ Ｃｅ、０．０６
Ｍ りＸ’Ｊ酸ナトリウム中で系列的に希釈し、二
１・−ハンプシャー州、−ｊ−−ン、シュライバー・ア
ンド・シュエルのマニホールド・スロット−プロット装
置（Ｍａｎｉｆｏｌｄ ’ ５ｌｏｔ −ＢｌｏＬ”
ａｐｐａｒａｔｕｓ （Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ
５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｋｃｅｎｅ 、 Ｎｅｗ Ｈａ
＋ｎｐｓｈｉｒｅ ））を用い、ニトロセルロース・フ
ィルター・シートに結合させる。チェ７ら、プロンーデ
インクス・オフ・ナショナル・アカデミ−・メブ・サイ
エンス・オブーユ−、ｘ ｘ （Ｔｃｈｅｎ ｅｔ
ａｌ＋、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａ ｒ、ｙ Ｑ、 ５ Ｍ Ｎ ａ Ｃｅ、０．０６
Ｍ りＸ’Ｊ酸ナトリウム中で系列的に希釈し、二
１・−ハンプシャー州、−ｊ−−ン、シュライバー・ア
ンド・シュエルのマニホールド・スロット−プロット装
置（Ｍａｎｉｆｏｌｄ ’ ５ｌｏｔ −ＢｌｏＬ”
ａｐｐａｒａｔｕｓ （Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ
５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｋｃｅｎｅ 、 Ｎｅｗ Ｈａ
＋ｎｐｓｈｉｒｅ ））を用い、ニトロセルロース・フ
ィルター・シートに結合させる。チェ７ら、プロンーデ
インクス・オフ・ナショナル・アカデミ−・メブ・サイ
エンス・オブーユ−、ｘ ｘ （Ｔｃｈｅｎ ｅｔ
ａｌ＋、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、） ８１ ： ３４６
６（１９８４）の他のハプテン（ＡＡＩＦ）によるＤ
Ｎ Ａ 鰹節についての記載に実質的に従い、ＤＮＩ’
に対する抗血清（ミズーリ州、セントルイス、ゲートウ
ェイ・イムノセラ・カンパ＝ −（Ｇａｔｅｗａｙ
ＩｎｙｎｕｎｏｓｅｒａＣｏ、、 Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ
、 Ｍｏ＋）およびアルカリ性ボスファターゼ複合ヤギ
抗ウサギＩｇＧ （ペンシルベニア什１、コクランビ
ル、カッペル・ラボラドリース（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａ
ｂｓ、、 Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ 、 ＰＡ）を用
いてＩ） Ｎ ＰラベルＤＮＡの位置を決定する。ＤＮ
ＰラベルＤＮＡの５０１ｇ以下の検出感度が得られた。
６（１９８４）の他のハプテン（ＡＡＩＦ）によるＤ
Ｎ Ａ 鰹節についての記載に実質的に従い、ＤＮＩ’
に対する抗血清（ミズーリ州、セントルイス、ゲートウ
ェイ・イムノセラ・カンパ＝ −（Ｇａｔｅｗａｙ
ＩｎｙｎｕｎｏｓｅｒａＣｏ、、 Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ
、 Ｍｏ＋）およびアルカリ性ボスファターゼ複合ヤギ
抗ウサギＩｇＧ （ペンシルベニア什１、コクランビ
ル、カッペル・ラボラドリース（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａ
ｂｓ、、 Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ 、 ＰＡ）を用
いてＩ） Ｎ ＰラベルＤＮＡの位置を決定する。ＤＮ
ＰラベルＤＮＡの５０１ｇ以下の検出感度が得られた。
以上１本発明の好ましい具体例について説明したが、本
発明の只想を逸脱しない範囲で種々の変形を加えること
ができ、それらも本発明範囲のものである。
発明の只想を逸脱しない範囲で種々の変形を加えること
ができ、それらも本発明範囲のものである。
特許出願人 スミスクライン・ベックマン・コーポレ
イション
イション
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）一本鎖ポリヌクレオチド内のプローブ領域を、該
ポリヌクレオチドの修飾前に該プローブ領域と相補配列
との雑種形成により選択的に保護することを特徴とする
ポリヌクレオチド雑種形成プローブの調製法。 （２）該一本鎖ポリヌクレオチドを、プローブ領域の選
択的保護前に直接的または間接的に固体担体に結合させ
る前記第（１）項の調製法。 （３）プローブ領域を選択的に保護した後、アミノ基転
移によりプローブを修飾する前記第（１）項の調製法。 （４）プローブ領域を選択的に保護した後、ビオチニル
化によりプローブを修飾する前記第（１）項の調製法。 （５）検出可能部に複合したアビジンからなるラベルで
修飾残基をラベルする前記第（４）項の調製法。 （６）プローブ領域がヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列ある
いはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸配
列に対して相補性である前記第１項の調製法。 （７）プローブ領域が非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列あ
るいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有な
核酸配列に対して相補性である前記第（１）項の調製法
。 （８）プローブ領域が組換型ＤＮＡ生成物の製造に用い
る宿主細胞またはベクターに特有なＤＮＡまたはＲＮＡ
配列に対して相補性である前記第（１）項の調製法。 （９）プローブがその中にプローブ領域を有する一本鎖
ファージＤＮＡまたはＲＮＡである前記第（１）項の調
製法。 （１０）一本鎖ファージＤＮＡまたはＲＮＡがＭ１３Ｄ
ＮＡである前記第（９）項の調製法。 （１１）一本鎖ポリヌクレオチドをプローブ領域の選択
的保護前に固体担体に直接的または間接的に結合させる
前記第（１０）項の調製法。 （１２）プローブ領域の選択的保護後、アミノ基転移に
よりプローブを修飾する前記第（１０）項の調製法。 （１３）プローブ領域の選択的保護後、ビオチニル化に
よりプローブを修飾する前記第（１０）項の調製法。 （１４）検出可能部に複合したアビジンからなるラベル
で修飾残基をラベルする前記第（１３）項の調製法。 （１５）プローブ領域がヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第（１０）項の調製法。 （１６）プローブ領域が非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第（１６）項の調
製法。 （１７）プローブ領域が、組換型ＤＮＡ生成物の製造に
用いる宿主細胞またはベクターに特有なＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列に対して相補性である前記第（１０）項の調製
法。 （１８）非プローブ領域がラベル分子との結合のために
選択的に修飾されたポリヌクレオチド雑種形成プローブ
。 （１９）修飾残基に結合したラベル分子を有する前記第
（１８）項のプローブ。 （２０）プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れた前記第（１８）項のプローブ。 （２１）プローブがビオチニル化により選択的に修飾さ
れた前記第（１８）項のプローブ。 （２２）修飾残基が、検出可能部に複合したアビジンか
らなるラベルでラベル付けされる前記第（２１）項のプ
ローブ。 （２３）プローブ領域がヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第（１８）項のプローブ
。 （２４）プローブ領域が非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第（１８）項のプ
ローブ。 （２５）プローブ領域が組換型ＤＮＡ生成物の製造に用
いる宿主細胞またはベクターに特有なＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列に対して相補性である前記第（１８）項のプロー
ブ。 （２６）その中にとり込まれたプローブ領域を有する一
本鎖ファージＤＮＡまたはＲＮＡからなる前記第（１８
）項のプローブ。 （２７）一本鎖ファージＤＮＡまたはＲＮＡがＭ１３Ｄ
ＮＡである前記第（２６）項のプローブ。 （２８）修飾残基に結合するラベル分子を有する前記第
（２７）項のプローブ。 （２９）プローブがアミノ基転移で選択的に修飾されて
いる前記第（２７）項のプローブ。 （３０）プローブがビオチニル化で選択的に修飾されて
いる前記第（２７）項のプローブ。 （３１）修飾残基が、検出可能部に複合したアビジンか
らなるラベルでラベルされる前記第（３０）項のプロー
ブ。 （３２）プローブ領域がヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第（２７）項のプローブ
。 （３３）プローブ領域が非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に相補性である前記第（２７）項のプローブ
。 （３４）プローブ領域が組換型ＤＮＡ生成物の製造に用
いる宿主細胞またはベクターに特有のＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列に対して相補性である前記第（２７）項のプロー
ブ。 （３５）前記第（１８）項のプローブからなるキット。 （３６）前記第（１９）項のプローブからなるキット。 （３７）さらに、別容器中のラベル分子からなる前記第
（３５）項のキット。 （３８）さらに、別容器中の、ラベル分子存在検出用試
薬からなる前記第（３６）項のキット。 （３９）さらに、別容器中の、ラベル分子存在検出用試
薬からなる前記第（３７）項のキット。 （４０）プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れている前記第（３７）項のキット。 （４１）プローブがビオチニル化により選択的に修飾さ
れ、ラベル分子が酵素に複合したアビジンである前記第
（３７）項のキット。 （４２）プローブ領域がヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第（３５）項のキット。 （４３）プローブ領域が非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡ配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第（３５）項のキ
ット。 （４４）プローブ領域が組換型ＤＮＡ生成物の製造に用
い、宿主細胞またはベクターに特有のＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列に対して相補性である前記第（３５）項のキット
。 （４５）プローブがプローブ領域をとり込んだ一本鎖フ
ァージＤＮＡまたはＲＮＡである前記第（３５）項のキ
ット。 （４６）一本鎖ファージＤＮＡまたはＲＮＡがＭ１３Ｄ
ＮＡである前記第（４４）項のキット。 （４１）プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れている前記第（４６）項のキット。 （４８）非プローブ領域がビオチニル化により選択的に
修飾されている前記第（４６）項のキット。 （４９）さらに、別容器中の、ラベル分子として用いる
酵素に複合したアビジンからなる前記第（４６）項のキ
ット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61036384A | 1984-05-15 | 1984-05-15 | |
| US610363 | 1984-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611388A true JPS611388A (ja) | 1986-01-07 |
Family
ID=24444714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60103617A Pending JPS611388A (ja) | 1984-05-15 | 1985-05-14 | ヌクレオチド雑種形成プローブ |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0172153B1 (ja) |
| JP (1) | JPS611388A (ja) |
| KR (1) | KR850008679A (ja) |
| AT (1) | ATE45385T1 (ja) |
| AU (1) | AU589362B2 (ja) |
| DE (1) | DE3572196D1 (ja) |
| DK (1) | DK213485A (ja) |
| ES (1) | ES8607983A1 (ja) |
| FI (1) | FI851919L (ja) |
| GR (1) | GR851153B (ja) |
| IL (1) | IL75142A0 (ja) |
| NO (1) | NO851919L (ja) |
| NZ (1) | NZ212024A (ja) |
| PT (1) | PT80451B (ja) |
| ZA (1) | ZA853621B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62260786A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-13 | 株式会社ヘキトク | 燻瓦の製造ラインにおける焼成工程後の表面仕上げ装置 |
| JPH0359339U (ja) * | 1989-10-13 | 1991-06-11 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3431219A1 (de) | 1984-08-24 | 1986-03-06 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Benzoylharnstoffe |
| EP0253894A1 (en) * | 1985-12-27 | 1988-01-27 | Toray Industries, Inc. | Dna probe and method of preparing the same |
| US4822731A (en) * | 1986-01-09 | 1989-04-18 | Cetus Corporation | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes |
| US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
| WO1989001049A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions |
| US5686579A (en) * | 1988-06-21 | 1997-11-11 | Hybrisens, Ltd. | Use of antibody/antigen interactions to protect biologically active proteins and peptides |
| CA2055755A1 (en) * | 1990-11-22 | 1992-05-23 | Toshihiko Kishimoto | Method of immobilizing single-stranded dna on carrier at terminal |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1190838A (en) * | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1338856C (en) * | 1983-07-05 | 1997-01-21 | Jannis Stavrianopoulos | In vivo labelling of polynucleotide sequences |
| US4737454A (en) * | 1983-07-14 | 1988-04-12 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
| US4777129A (en) * | 1983-12-12 | 1988-10-11 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein |
| DE3479522D1 (en) * | 1983-12-16 | 1989-09-28 | Medisense Inc | Assay for nucleic acids |
| FR2569407B1 (fr) * | 1984-08-22 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Sondes comportant des groupements adenine modifiee, leur preparation et leurs utilisations |
-
1985
- 1985-05-09 EP EP85870065A patent/EP0172153B1/en not_active Expired
- 1985-05-09 NZ NZ212024A patent/NZ212024A/xx unknown
- 1985-05-09 DE DE8585870065T patent/DE3572196D1/de not_active Expired
- 1985-05-09 AT AT85870065T patent/ATE45385T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-09 IL IL75142A patent/IL75142A0/xx unknown
- 1985-05-13 GR GR851153A patent/GR851153B/el unknown
- 1985-05-13 PT PT80451A patent/PT80451B/pt unknown
- 1985-05-14 ZA ZA853621A patent/ZA853621B/xx unknown
- 1985-05-14 ES ES543127A patent/ES8607983A1/es not_active Expired
- 1985-05-14 KR KR1019850003263A patent/KR850008679A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 DK DK213485A patent/DK213485A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 AU AU42458/85A patent/AU589362B2/en not_active Ceased
- 1985-05-14 NO NO851919A patent/NO851919L/no unknown
- 1985-05-14 FI FI851919A patent/FI851919L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 JP JP60103617A patent/JPS611388A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62260786A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-13 | 株式会社ヘキトク | 燻瓦の製造ラインにおける焼成工程後の表面仕上げ装置 |
| JPH0249269B2 (ja) * | 1986-05-08 | 1990-10-29 | Hekitoku Kk | |
| JPH0359339U (ja) * | 1989-10-13 | 1991-06-11 | ||
| JPH0454194Y2 (ja) * | 1989-10-13 | 1992-12-18 |
Also Published As
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|---|---|
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| AU4245885A (en) | 1985-11-21 |
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| IL75142A0 (en) | 1985-09-29 |
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| NO851919L (no) | 1985-11-18 |
| EP0172153A1 (en) | 1986-02-19 |
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| ATE45385T1 (de) | 1989-08-15 |
| FI851919L (fi) | 1985-11-16 |
| EP0172153B1 (en) | 1989-08-09 |
| DE3572196D1 (en) | 1989-09-14 |
| NZ212024A (en) | 1988-08-30 |
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| PT80451A (en) | 1985-06-01 |
| KR850008679A (ko) | 1985-12-21 |
| ZA853621B (en) | 1986-04-30 |
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