JPS611388A - ヌクレオチド雑種形成プローブ - Google Patents
ヌクレオチド雑種形成プローブInfo
- Publication number
- JPS611388A JPS611388A JP60103617A JP10361785A JPS611388A JP S611388 A JPS611388 A JP S611388A JP 60103617 A JP60103617 A JP 60103617A JP 10361785 A JP10361785 A JP 10361785A JP S611388 A JPS611388 A JP S611388A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- item
- dna
- human
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Emergency Protection Circuit Devices (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Electroluminescent Light Sources (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はポリヌクレオチド雑種形成プローブ。
さらに詳しくは、改良されたそのようなプローブおよび
その調製法Jこ関する。
その調製法Jこ関する。
発明の背景
ポリヌクレオチド雑種形成プローフハ臨床および研究目
的のための、「標的」ヌクレオチド配列を検出し、局在
化し、単離する安価な、効率のよい、迅速な手段を提供
する。クラウスナーら、バイオテクノロジー(Klau
sner et al、、 Biotechnolog
y)1983年8月号、411〜418頁は調製法およ
び使用法の検討を含め、ポリヌクレオチド雑種形成プロ
ーブに関する興味ある背景を記載していポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブの公知の調製法および使用は文献に
よく紹介されている。例えば、サザーン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー(5outhern
、 J、 M)1.Biol、 ) 98:503〜5
17(1975)iファルコフら(FaIkaset
al、) 、米国特許第4385535号;し’J
’)%プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−拳オブ拳サイエンス(Leary et al、。
的のための、「標的」ヌクレオチド配列を検出し、局在
化し、単離する安価な、効率のよい、迅速な手段を提供
する。クラウスナーら、バイオテクノロジー(Klau
sner et al、、 Biotechnolog
y)1983年8月号、411〜418頁は調製法およ
び使用法の検討を含め、ポリヌクレオチド雑種形成プロ
ーブに関する興味ある背景を記載していポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブの公知の調製法および使用は文献に
よく紹介されている。例えば、サザーン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー(5outhern
、 J、 M)1.Biol、 ) 98:503〜5
17(1975)iファルコフら(FaIkaset
al、) 、米国特許第4385535号;し’J
’)%プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−拳オブ拳サイエンス(Leary et al、。
1’roc、 Natl、Acad、Sci、) B
□ : 4045〜404 g(1983)iランが一
一セーファーら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・”j−イエンス(L71nge
r −5afer et al、、I’roc。
□ : 4045〜404 g(1983)iランが一
一セーファーら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・”j−イエンス(L71nge
r −5afer et al、、I’roc。
Natl、Acad、Sci、)79 : 4381〜
4385(1982)iランガーら、プロシーディンゲ
スφオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
(Langer et al。Proc、 Natl、
Acad、 Sci、)78:6633〜6637(
1981)iおよびコーン(Kohne )、WO34
−02721(1984年7月19日公開〕参照。
4385(1982)iランガーら、プロシーディンゲ
スφオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
(Langer et al。Proc、 Natl、
Acad、 Sci、)78:6633〜6637(
1981)iおよびコーン(Kohne )、WO34
−02721(1984年7月19日公開〕参照。
これらおよび他の文献に記載されているとと(、公知の
プローブの調製法は、典型的には、プローブ領域を二本
鎖DNAプラスミド中ヘ中口クローンことからなる。こ
のプラスミド担持プローブは。
プローブの調製法は、典型的には、プローブ領域を二本
鎖DNAプラスミド中ヘ中口クローンことからなる。こ
のプラスミド担持プローブは。
典型的には、酵素重合技術によりラベルされる。
コノような技術には、例えば、ニックトランスレーショ
ン〔リグビイら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Rigby etal 、 、 J、Mo
l 、 Bi ol 、)113:237(1977)
〕、ギャップ充填〔ボールグイグノンら、ジャーナルー
オブ骨バイロロジー(Bourguignon et
al、、 J、Virol、 )20 : 290(1
976))および末端付加が包含され、これらの方法は
修飾ヌクレオチド玉リン酸の存在下に行なわれる。以下
に示す文献中に報告されているものも含め、化学的修飾
技術を用いることもできる。
ン〔リグビイら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Rigby etal 、 、 J、Mo
l 、 Bi ol 、)113:237(1977)
〕、ギャップ充填〔ボールグイグノンら、ジャーナルー
オブ骨バイロロジー(Bourguignon et
al、、 J、Virol、 )20 : 290(1
976))および末端付加が包含され、これらの方法は
修飾ヌクレオチド玉リン酸の存在下に行なわれる。以下
に示す文献中に報告されているものも含め、化学的修飾
技術を用いることもできる。
ブリガチら、パイロロジイ(Brigati et a
l、。
l、。
ViroJogy)126432〜50(1983)は
、ビオチンが長い鎖(11または16個の原子)を介し
てデオキシウリジン玉リン酸(dUTP)に結合してい
るビオチン・ラベル・プローブの方が、短い鎖(4原子
)を介して該ヌクレオチドに結合しているビオチン・ラ
ベル・プローブより有利であることを報告している。こ
れらのポリヌク1/オチド・プローブは、I) N A
ポリメラーゼ■を用い。
、ビオチンが長い鎖(11または16個の原子)を介し
てデオキシウリジン玉リン酸(dUTP)に結合してい
るビオチン・ラベル・プローブの方が、短い鎖(4原子
)を介して該ヌクレオチドに結合しているビオチン・ラ
ベル・プローブより有利であることを報告している。こ
れらのポリヌク1/オチド・プローブは、I) N A
ポリメラーゼ■を用い。
ニックトランスレーションによるビオチニル化dT’k
−r p の酵素的とり込みによってラベルされてい
る。
−r p の酵素的とり込みによってラベルされてい
る。
ワードら(′wa、rd ecal 、)のヨーロッパ
特許出願EP−A−63879号では、ラベル分子を、
プローブの標的配列に対する水素結合を干渉するような
ヌクレオチド環の部位には結合させないことがでましい
ことを開示している。この文献ではこのための解決策と
して、ピリミジン(チミン、シトシンおよびウラシル)
の5位、プリン(アデニンおよびグアニン)の7位およ
びデアサブリンの7位におりる結合ラベル分子を開示し
ている。さらに解決策として、ワードらは、前記ブリガ
チらのような長いリンカ−・アームでヌクレオチドと結
合する結合ラベル分)を開示している。
特許出願EP−A−63879号では、ラベル分子を、
プローブの標的配列に対する水素結合を干渉するような
ヌクレオチド環の部位には結合させないことがでましい
ことを開示している。この文献ではこのための解決策と
して、ピリミジン(チミン、シトシンおよびウラシル)
の5位、プリン(アデニンおよびグアニン)の7位およ
びデアサブリンの7位におりる結合ラベル分子を開示し
ている。さらに解決策として、ワードらは、前記ブリガ
チらのような長いリンカ−・アームでヌクレオチドと結
合する結合ラベル分)を開示している。
−y−リルス4 ; (Kourilsky et
al、)の英国特、?F第20 ]、 9408号は、
マニングら、バイオケミストリー(Manning e
t al 、 +’ Bioehem、 ) 16:
1364(1977)によって報告されているシトクロ
ームC−ビオチン法によるポリヌクレオチド雑種分)形
成プローブの化学的修飾および試料との雑種分子形成前
または後にそのような修飾プローブのラベル付けを開示
している。化学的う3435(1984)およびトケン
ら、フ・°ロシーデイングス・オブ・ナショナル−アカ
デミ−・オブーザイjニンス脅メフ゛参ニー・ニス串ニ
ー(’]”chenet 31.、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA)81 :34
66(1984)にも開示されている。レンツらの方法
は前記コーリルスキーらの英国特許第2019408号
およびマニングらの方法と同様な方法で酵素を直接プロ
ーブに結合させている。
al、)の英国特、?F第20 ]、 9408号は、
マニングら、バイオケミストリー(Manning e
t al 、 +’ Bioehem、 ) 16:
1364(1977)によって報告されているシトクロ
ームC−ビオチン法によるポリヌクレオチド雑種分)形
成プローブの化学的修飾および試料との雑種分子形成前
または後にそのような修飾プローブのラベル付けを開示
している。化学的う3435(1984)およびトケン
ら、フ・°ロシーデイングス・オブ・ナショナル−アカ
デミ−・オブーザイjニンス脅メフ゛参ニー・ニス串ニ
ー(’]”chenet 31.、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA)81 :34
66(1984)にも開示されている。レンツらの方法
は前記コーリルスキーらの英国特許第2019408号
およびマニングらの方法と同様な方法で酵素を直接プロ
ーブに結合させている。
トケンらの方法では、ヌクレオチド残基の5〜10%以
上の修飾はプローブ雑種分子形成に悪影響を及ぼす。
上の修飾はプローブ雑種分子形成に悪影響を及ぼす。
発明の概要
本発明の1つの態様は、一本鎖ポリヌクレオチド(DN
AまたはRNA)内のプローブ領域を、該ポリヌクレオ
チドの修飾前に該ブI]−ブ領域と相補配列との雑種分
子形成により、11に択的に保護することからなるポリ
ヌクレオチド雑種形成プローブの調製法を提供するもの
である。以下に記載のごとく、該プローブ領域は、一本
川ポリヌクレオチド特異反応により、非プローブ領域中
の塩基を化学的に誘導または修飾する前に、プローブ領
域を相補オリゴまたはポリヌクレオチド配列と雑種分子
形成させることにより、選捩的に保護される。
AまたはRNA)内のプローブ領域を、該ポリヌクレオ
チドの修飾前に該ブI]−ブ領域と相補配列との雑種分
子形成により、11に択的に保護することからなるポリ
ヌクレオチド雑種形成プローブの調製法を提供するもの
である。以下に記載のごとく、該プローブ領域は、一本
川ポリヌクレオチド特異反応により、非プローブ領域中
の塩基を化学的に誘導または修飾する前に、プローブ領
域を相補オリゴまたはポリヌクレオチド配列と雑種分子
形成させることにより、選捩的に保護される。
本発明の他の態様は、本発明の方法によって調製された
ポリヌクレオチド雑種形成プローブを提供するものであ
る。ことに、この態様において。
ポリヌクレオチド雑種形成プローブを提供するものであ
る。ことに、この態様において。
本発明は、非プr−J−ブ領域がラベル分子−との結合
用に透析的に修飾されているポリヌクレオチド雑種形成
プローブを提供するものである。
用に透析的に修飾されているポリヌクレオチド雑種形成
プローブを提供するものである。
本発明のもう1つ別の態様は、本発明のポリヌクレオチ
ド雑種形成プローブからなるキットを提供するものであ
る。
ド雑種形成プローブからなるキットを提供するものであ
る。
発明の詳細
な説明のポリヌクレオチドプローブは、プローブ領域、
すなわち、標的配列と相補するヌクレオチド配列および
非プローブ領域、すなわち、標的配列と相補しないヌク
レオチド配列からなる。
すなわち、標的配列と相補するヌクレオチド配列および
非プローブ領域、すなわち、標的配列と相補しないヌク
レオチド配列からなる。
該プローブ領域と相補する標的配列はゲノム様物質の全
体または・一部あるいは、生物、ウィルスまたは細胞か
らのリポソームRNA、転移RNA、伝令RNAまたは
インドV1ンRNAのような核酸遺伝子生産物のいずれ
てもよい。標的配列は、典型的には、数百ヌクレオチド
のオーダーである。
体または・一部あるいは、生物、ウィルスまたは細胞か
らのリポソームRNA、転移RNA、伝令RNAまたは
インドV1ンRNAのような核酸遺伝子生産物のいずれ
てもよい。標的配列は、典型的には、数百ヌクレオチド
のオーダーである。
特に限定するものではないが1例えば、これらはヒトま
たは非ヒト病原体(いずれの感染性微生物、ウィルスま
たは寄生虫を含む生物をも包含する)に特有の配列また
は、遺伝的異常または他の状態に特有の配列や、例えば
、全mRNA または全細胞D N Aのランダム・
フラグメントのようす遺伝子工学の実験から誘導される
配列のごときヒトまたは非ヒト(動物)DNAまたはR
NA配列とすることができる。標的配列を同定する方法
およびプローブ領域を調製する方法は前記の文献等にも
開示されているごとく、よく知られている。該標的配列
はまた、例えば、全腸内細菌または全クラミジアのよう
な一群の、ヒトまたは非ヒト病原体に特有な核酸配列と
相補性なものとすることもできる。また、該標的配列は
、例えば、組換型DNA生産物の製造において使用する
宿主細胞またはベクターに特有な核酸配列と相補性なも
のとして、該生産物中のそのようなDNAまたはRNA
混入物の存在を検出することも゛できる。種々のRNA
タイプ壱の雑種分子形成は、例えば、コーンのWQ s
4−02721およびトレーパー、ヌクレイツク・ア
シツズ・リサーチ(Draper・Nucl。
たは非ヒト病原体(いずれの感染性微生物、ウィルスま
たは寄生虫を含む生物をも包含する)に特有の配列また
は、遺伝的異常または他の状態に特有の配列や、例えば
、全mRNA または全細胞D N Aのランダム・
フラグメントのようす遺伝子工学の実験から誘導される
配列のごときヒトまたは非ヒト(動物)DNAまたはR
NA配列とすることができる。標的配列を同定する方法
およびプローブ領域を調製する方法は前記の文献等にも
開示されているごとく、よく知られている。該標的配列
はまた、例えば、全腸内細菌または全クラミジアのよう
な一群の、ヒトまたは非ヒト病原体に特有な核酸配列と
相補性なものとすることもできる。また、該標的配列は
、例えば、組換型DNA生産物の製造において使用する
宿主細胞またはベクターに特有な核酸配列と相補性なも
のとして、該生産物中のそのようなDNAまたはRNA
混入物の存在を検出することも゛できる。種々のRNA
タイプ壱の雑種分子形成は、例えば、コーンのWQ s
4−02721およびトレーパー、ヌクレイツク・ア
シツズ・リサーチ(Draper・Nucl。
Ac1ds Res、 ) 137989 (198
4)に開示されている。「相補」なる語は実質的な補足
、すなわち、選択した雑種分子形成条件でプローブ領域
が標的配列と安定に雑種分子形成をするのに充分な相補
性を有することを意味する。
4)に開示されている。「相補」なる語は実質的な補足
、すなわち、選択した雑種分子形成条件でプローブ領域
が標的配列と安定に雑種分子形成をするのに充分な相補
性を有することを意味する。
非プローブ領域は線形とすることができ、あるいは、プ
ローブ領域と一緒に共有結合的に閉じた環を形成しても
よい。該非プローブ領域は化学的に修飾された残基に結
合するラベル分子を担持する役割を有する。検出可能部
またはそれを含む多くのラベル分子が公知であり5本発
明のプローブの非プローブ領域中の、ラベルして修飾す
る塩基に用いることができる。ラベル分子は直接または
。
ローブ領域と一緒に共有結合的に閉じた環を形成しても
よい。該非プローブ領域は化学的に修飾された残基に結
合するラベル分子を担持する役割を有する。検出可能部
またはそれを含む多くのラベル分子が公知であり5本発
明のプローブの非プローブ領域中の、ラベルして修飾す
る塩基に用いることができる。ラベル分子は直接または
。
他の試薬と接触させることにより間接的に検出でき、例
えば、ラベル分子が酵素からなる場合、そのような他の
試薬として、該酵素の比色用基質を用いることができる
。本発明におけるラベル分子に用いることのできる検出
可能部の例には、とりわケ、同位元素、ハプテン、フル
オレスセイン、ローダミンおよび他の螢光化合物、化学
ルミネッセンス基、レクチン、β−ガラクトシダーゼの
ような酵素、抗体および%直接的または架橋法により間
接的に結合した他の蛋白が包含される。検出可能部を修
飾残基に結合させるのに有用な親和性基にはビオチンお
よびイミノビオチンのようなその誘導体が包なされ、こ
れらはアビジンに対する強い親和性を有するう 本発明のプローブ製造に用いるポリヌクレオチド分Pは
公知の方法で製造することができる。これらには合成法
および生物学的方?とか包含される。
えば、ラベル分子が酵素からなる場合、そのような他の
試薬として、該酵素の比色用基質を用いることができる
。本発明におけるラベル分子に用いることのできる検出
可能部の例には、とりわケ、同位元素、ハプテン、フル
オレスセイン、ローダミンおよび他の螢光化合物、化学
ルミネッセンス基、レクチン、β−ガラクトシダーゼの
ような酵素、抗体および%直接的または架橋法により間
接的に結合した他の蛋白が包含される。検出可能部を修
飾残基に結合させるのに有用な親和性基にはビオチンお
よびイミノビオチンのようなその誘導体が包なされ、こ
れらはアビジンに対する強い親和性を有するう 本発明のプローブ製造に用いるポリヌクレオチド分Pは
公知の方法で製造することができる。これらには合成法
および生物学的方?とか包含される。
生物学的合成法には、典型的には分)のクローニングが
包含され、この方法では宿主微生物によって多重コピー
が製造される、 コリファージM13のような一本鎖D N Aファージ
のクローニングは、以下に記載のごとく、そのようなり
ローニングが迅速なスケール・アップおよび非プローブ
領域の修飾前の、プローブ領域保護の都合よい手段を可
能とするので、プローフ分子製造の好ましい方法である
。Ml3は組換型DNAの研究に有用な糸状の一本鎖D
NAウィルスである。Ml3におけるクローニングは、
例えば、メツシング、メンッズ・オブ・エンサイモロシ
ー(Messing 、 Meth、Enzymql、
)101 : 20〜77(198,3)およびバーネ
スら、メソッズ・オブ−−T−:/ サイ% oジー(
Barnes etal、、Meth。
包含され、この方法では宿主微生物によって多重コピー
が製造される、 コリファージM13のような一本鎖D N Aファージ
のクローニングは、以下に記載のごとく、そのようなり
ローニングが迅速なスケール・アップおよび非プローブ
領域の修飾前の、プローブ領域保護の都合よい手段を可
能とするので、プローフ分子製造の好ましい方法である
。Ml3は組換型DNAの研究に有用な糸状の一本鎖D
NAウィルスである。Ml3におけるクローニングは、
例えば、メツシング、メンッズ・オブ・エンサイモロシ
ー(Messing 、 Meth、Enzymql、
)101 : 20〜77(198,3)およびバーネ
スら、メソッズ・オブ−−T−:/ サイ% oジー(
Barnes etal、、Meth。
Enzymol、)101.:98〜122(1983
)に記載されている。他の有用な一本鎖ファージには、
例えば、S13、G4、Ph1X174、RNAファー
ジ(例えば、QB%MS2、R17および12)および
Ml 3]連フアージ(例えば% fdおよびEl)
が包含される。プラスミドおよび二本鎖ファージを含
め、他のクローニング・ベクターも使用できるが9.あ
まり好ましくはない。
)に記載されている。他の有用な一本鎖ファージには、
例えば、S13、G4、Ph1X174、RNAファー
ジ(例えば、QB%MS2、R17および12)および
Ml 3]連フアージ(例えば% fdおよびEl)
が包含される。プラスミドおよび二本鎖ファージを含
め、他のクローニング・ベクターも使用できるが9.あ
まり好ましくはない。
M13m、10およびM13m、11におけるクローニ
ングに利用される制限エンドヌクレアーゼ開裂サイトに
は、例えばs A((I −Ba1nHI −ECoR
■、Hi n c Il、Hindll)、PstI、
5alI。
ングに利用される制限エンドヌクレアーゼ開裂サイトに
は、例えばs A((I −Ba1nHI −ECoR
■、Hi n c Il、Hindll)、PstI、
5alI。
SmaI、5stI およびXba Iが包含される
。もちろん、他のサイトも、加えたり、代用することが
できる。すなわち1例えば、フラグメントが約1300
〜1400の塩基対を有し、肝炎Bウィルス表面抗原決
定子を担持する肝炎BウィルスのBamHIフラグメン
トはプローブ領域としてM13mplOまたはMl 3
mp 11のB am HIサイトにクローンできる。
。もちろん、他のサイトも、加えたり、代用することが
できる。すなわち1例えば、フラグメントが約1300
〜1400の塩基対を有し、肝炎Bウィルス表面抗原決
定子を担持する肝炎BウィルスのBamHIフラグメン
トはプローブ領域としてM13mplOまたはMl 3
mp 11のB am HIサイトにクローンできる。
このようなウィルス配列は肝炎Bウィルスに特有で、血
清中または肝、@生検におけるその配列の検出は肝炎B
ウィルス感染の78 候′cある。必須ではないが、好
ましくは、挿入されたプローグ領域を有するM13DN
Aは天然のM13DNAよりも約1000塩基対以下長
いサイズを有する。
清中または肝、@生検におけるその配列の検出は肝炎B
ウィルス感染の78 候′cある。必須ではないが、好
ましくは、挿入されたプローグ領域を有するM13DN
Aは天然のM13DNAよりも約1000塩基対以下長
いサイズを有する。
ポリヌクレオチドを修飾する前に、プローグ領域が実質
的に修飾されないように、プローグ領域を選択的に遮断
または保護する。本発明の一具体例においては、この遮
1折は、ブ[コープ領域を含有する第1のM13DNA
分P(PJ、下、M13プローブ1と称する)を、該プ
ローブ領域を相補する領域を含む@2のM13DNA分
子(以下、M13プローブ2と称する〕と雑種形成させ
ることにより行なわれる。このような分子は、例えば、
プローブ領域を含む二本鎖DNAフラグメントを、二本
鎖形であるウィルス・ゲノムの複製型内で両方の可能な
方向でクローニングすることにより調製できる。標準的
な方法を用い、一本鎖ゲツムを有する後代用を製造する
。後代用の各々はプローブ1) N Aの2つの鎖、す
なわち、M13プローブ1またはM13プローブ2の一
万を担持している。
的に修飾されないように、プローグ領域を選択的に遮断
または保護する。本発明の一具体例においては、この遮
1折は、ブ[コープ領域を含有する第1のM13DNA
分P(PJ、下、M13プローブ1と称する)を、該プ
ローブ領域を相補する領域を含む@2のM13DNA分
子(以下、M13プローブ2と称する〕と雑種形成させ
ることにより行なわれる。このような分子は、例えば、
プローブ領域を含む二本鎖DNAフラグメントを、二本
鎖形であるウィルス・ゲノムの複製型内で両方の可能な
方向でクローニングすることにより調製できる。標準的
な方法を用い、一本鎖ゲツムを有する後代用を製造する
。後代用の各々はプローブ1) N Aの2つの鎖、す
なわち、M13プローブ1またはM13プローブ2の一
万を担持している。
へ413プローブ1およびM13プローブ2はプローブ
領域で相互に相補し、プローブ領域を誘導体化から選択
的に保護するために相互に雑種形成することができる。
領域で相互に相補し、プローブ領域を誘導体化から選択
的に保護するために相互に雑種形成することができる。
得られたポリヌクレオチド分子の一万または両方がプロ
ーブとして使用できる。
ーブとして使用できる。
あるいは、M l 3プローブlおよびM13プローブ
2の1つを、該保護工程を行なう前に固体担体に結合さ
せることができる。これは、該DNAを固体担体に1百
接または間接的に共有的に結合させることにより、行な
うことができる。例えば、モスら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Moss et al、、 J
、 Biol、Chem、)256 : 12655(
1981)参照。例えば、M13プローブ1はセルロー
スに結合させることができる。ついで。
2の1つを、該保護工程を行なう前に固体担体に結合さ
せることができる。これは、該DNAを固体担体に1百
接または間接的に共有的に結合させることにより、行な
うことができる。例えば、モスら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Moss et al、、 J
、 Biol、Chem、)256 : 12655(
1981)参照。例えば、M13プローブ1はセルロー
スに結合させることができる。ついで。
該領域をM13プローブ2と雑種形成させて保護し、部
分的に二本鎖の分子を修飾する。修飾後、M13プロー
ブ1およびM13プローブ2を脱雑種形成してM13プ
ローブ1を基質に結合させて残ス。M13プローブ1お
よび2を担持するファージは、さらにプローブ「製造者
」乏して使用することができる。
分的に二本鎖の分子を修飾する。修飾後、M13プロー
ブ1およびM13プローブ2を脱雑種形成してM13プ
ローブ1を基質に結合させて残ス。M13プローブ1お
よび2を担持するファージは、さらにプローブ「製造者
」乏して使用することができる。
他の選択的遮断法は当業者に公知である。例えば、プロ
ーブ領域を有する糸状ポリヌクレオチドは組換型プラス
ミドまたは二本鎖1)NAバクテリオファージから単離
できる。ついで、該鎖は、エクソヌクレアーゼの処理に
より5例えば、3から5に、実質的にプローブ領域に切
り詰めることができ、プローブ領域の周囲側に一重鎖非
プローブ領域を有するプローブ分子を生成させることが
できる。プローブ領域は二本鎖のままであるので。
ーブ領域を有する糸状ポリヌクレオチドは組換型プラス
ミドまたは二本鎖1)NAバクテリオファージから単離
できる。ついで、該鎖は、エクソヌクレアーゼの処理に
より5例えば、3から5に、実質的にプローブ領域に切
り詰めることができ、プローブ領域の周囲側に一重鎖非
プローブ領域を有するプローブ分子を生成させることが
できる。プローブ領域は二本鎖のままであるので。
誘導体化から保護される。
プローブ領域を保護したら、得られる修飾残基のラベル
付は前またはそれと同時にlま1こはそれ以−1−の−
重鎖特異反応により無傷の分子−を修飾する。ラベル分
子の修飾残基への結合を可能にするいずれの一本鎖特異
性または実質的に一本鎖特異性の修飾方法も用いること
ができる。好ましくは、選択した一本鎖領域修飾方法は
、特定の同一反応条件下、二本鎖ポリヌクレオチドまた
は領域におけるよりも、−重鎖ポリヌクレオチドまたは
領域において少なくとも中位多い残基の修飾を生じる。
付は前またはそれと同時にlま1こはそれ以−1−の−
重鎖特異反応により無傷の分子−を修飾する。ラベル分
子の修飾残基への結合を可能にするいずれの一本鎖特異
性または実質的に一本鎖特異性の修飾方法も用いること
ができる。好ましくは、選択した一本鎖領域修飾方法は
、特定の同一反応条件下、二本鎖ポリヌクレオチドまた
は領域におけるよりも、−重鎖ポリヌクレオチドまたは
領域において少なくとも中位多い残基の修飾を生じる。
ポリヌクレオチド・プローブ分子の一本鎖領域修飾後、
多くのラベルのいずれもを、liI記のように、試料と
雑種分子形成前または後に修飾分子へ結合させることが
できる。いくつかの−重鎖特異反応は保護残基の修飾制
限をもたらせるが、プローブ領域の雑種分子形成が著し
く損なわれるほどではなく、換言すれば、プローブ領域
は実質的にラベル分)を含まずに残る。好ましくは、非
プローブ領域残基はビオチニル化により修飾され。
多くのラベルのいずれもを、liI記のように、試料と
雑種分子形成前または後に修飾分子へ結合させることが
できる。いくつかの−重鎖特異反応は保護残基の修飾制
限をもたらせるが、プローブ領域の雑種分子形成が著し
く損なわれるほどではなく、換言すれば、プローブ領域
は実質的にラベル分)を含まずに残る。好ましくは、非
プローブ領域残基はビオチニル化により修飾され。
ラベル分子はアビジンおよび検出可能部よりなる。
好ましくは、アビジンは酵素と複合している。
一本鎖特毘的修飾方法は公知である。例えば。
マクマスターら、プロシーディンゲス・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(McMa s t
e reta+、、 Proc、 Natl、 Ac
ad、Sci、)74 : 4835〜4838(19
77)は−重鎖ポリヌクレオチドのグリオキシル化を開
示している。グリオキサールは主にグアニジン残基に結
合する。得られたポリヌクレオチド環状ジオールを水性
溶液中、室温にて過ヨウ素酸ナトリウムで開裂して、ポ
リヌクレオチド上に複数の反応性ジアルデヒドを形成さ
せることができる。このポリヌクレオチドアルデヒドは
、例えば、トリチウム化水素化ホウ素ナトリウムと反応
させてトリチウム化ラベルを生成させることができ、あ
るいは水素化ホウ素ナトリウムの存在下、カダベリンの
ようなジアミノと反応させて1級アミノを生じさ吐るこ
とがてきる。このような1級アミノは、例えば、ビオチ
ニルN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ
、ビオチン・ラベル・プローブを得ることかできる。
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(McMa s t
e reta+、、 Proc、 Natl、 Ac
ad、Sci、)74 : 4835〜4838(19
77)は−重鎖ポリヌクレオチドのグリオキシル化を開
示している。グリオキサールは主にグアニジン残基に結
合する。得られたポリヌクレオチド環状ジオールを水性
溶液中、室温にて過ヨウ素酸ナトリウムで開裂して、ポ
リヌクレオチド上に複数の反応性ジアルデヒドを形成さ
せることができる。このポリヌクレオチドアルデヒドは
、例えば、トリチウム化水素化ホウ素ナトリウムと反応
させてトリチウム化ラベルを生成させることができ、あ
るいは水素化ホウ素ナトリウムの存在下、カダベリンの
ようなジアミノと反応させて1級アミノを生じさ吐るこ
とがてきる。このような1級アミノは、例えば、ビオチ
ニルN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ
、ビオチン・ラベル・プローブを得ることかできる。
前記の方法の簡略法においては、アジピン酸ジヒドラジ
ドのようなジアミノを、ます1例えば、スルホスクシン
イミジルビオチン(ピアース・ケミカルtt(Pier
ce Cbemical Co1pany ))で
ビオチンと結合させる。得られたアミノ−ビオチンは1
亘接、過ヨウ素酸塩酸化、グリオキシルDNAに添加で
きる。
ドのようなジアミノを、ます1例えば、スルホスクシン
イミジルビオチン(ピアース・ケミカルtt(Pier
ce Cbemical Co1pany ))で
ビオチンと結合させる。得られたアミノ−ビオチンは1
亘接、過ヨウ素酸塩酸化、グリオキシルDNAに添加で
きる。
好ましい一本鎖特異的修飾法はバイサルファイド触媒ア
ミ7基転移である。ドレイパー、ニュータレイックφア
シッズーリサーチ(Draper、Nucl。
ミ7基転移である。ドレイパー、ニュータレイックφア
シッズーリサーチ(Draper、Nucl。
Ac1ds Res、) 12 : 989 (198
4)はこの方法を用いる修飾−重鎖RNAを報告してい
る(後記実施例3廖照)。
4)はこの方法を用いる修飾−重鎖RNAを報告してい
る(後記実施例3廖照)。
ヘテロニ官能性基も、−重鎖DNAまたはラベルによる
修飾一本5DNAの架橋に用いることができる。−例は
4−アジドフェニルグリオキサールで、これは温和な条
件下、一本鎖核酸中のグアノシンと相互作用する。この
ようにして、DNA上に導入されたアジド官能基を蛋白
質、例えば、紫外線の存在下におけるアルカリ性ホスフ
ァターゼおよびフルオレセイン化血清アルブミンと反応
さぜで核酸のラベルを行なう(ポリツクら、バイオケミ
ストリー(Po1icz 、 et al。Bioch
em、 )30:372(1981)#照〕。
修飾一本5DNAの架橋に用いることができる。−例は
4−アジドフェニルグリオキサールで、これは温和な条
件下、一本鎖核酸中のグアノシンと相互作用する。この
ようにして、DNA上に導入されたアジド官能基を蛋白
質、例えば、紫外線の存在下におけるアルカリ性ホスフ
ァターゼおよびフルオレセイン化血清アルブミンと反応
さぜで核酸のラベルを行なう(ポリツクら、バイオケミ
ストリー(Po1icz 、 et al。Bioch
em、 )30:372(1981)#照〕。
他の一本鎖特異的修飾法は公知である。本発明のプロー
ブの製造においては、必要性および便利さに基いて、こ
れらの方法を適宜、容易に選択できる。修fIIi法の
例は、例えは、アカデミツク・プレス社のビイ・トソに
よる「核酸化学における基本原理」第H巻、(’Ba5
ic Pr1nciples in Nucleic
Acld Chernistry’、Volume[
、Academic Press。
ブの製造においては、必要性および便利さに基いて、こ
れらの方法を適宜、容易に選択できる。修fIIi法の
例は、例えは、アカデミツク・プレス社のビイ・トソに
よる「核酸化学における基本原理」第H巻、(’Ba5
ic Pr1nciples in Nucleic
Acld Chernistry’、Volume[
、Academic Press。
1974)、ことに、ディ・エム・ブラウン(D。
M、Brown )による2〜90頁に記載されている
。
。
修飾し、所望により、ラベル後、反応体を除去し、保護
プローブ領域を公邸の方法で変性し、これにより、プロ
ーブ領域を相補性標的配列にアニールする。
プローブ領域を公邸の方法で変性し、これにより、プロ
ーブ領域を相補性標的配列にアニールする。
この一本鎖特異性化学の新規な適用の土な利点は、コウ
リルスキーら(Kourilsky et al )の
英国特許第2019408号に開示されている方法を含
め、プローブのラベル用の従来の酵素法と比較して、プ
ローブのラベルが容易かつ効率よく行なわれることであ
る。この方法はスケール・アップが非常に容易である。
リルスキーら(Kourilsky et al )の
英国特許第2019408号に開示されている方法を含
め、プローブのラベル用の従来の酵素法と比較して、プ
ローブのラベルが容易かつ効率よく行なわれることであ
る。この方法はスケール・アップが非常に容易である。
一本鎖特異性化学修飾法により調製されたプローブは、
ラベルの存在がプローブ領域の標的配列との雑種分子形
成を有意に干渉しないので有利であり、したがって、そ
のような雑種分子形成が非常に効率的になる。さらに、
一本鎖特異的修飾は非プローブ領域の全塩基の80〜9
0%までのラベルにも使用できるが、従来の方法ではそ
のような広範囲のラベルがプローブ領域の雑種形成を許
容しえないほどに干渉し、はなはだ高価になりうる。す
なわち5本発明のプローブにおいては、雑種形成後の検
出用により多くのラベルを存在させることができる。非
プローブ領域の塩基の修飾も非プローブ領域の非特異性
水素結合を最少にすることによりバックグラウンドを減
少させ、ヌクレオチドの作用によるような分解に対して
プローブを安定化させる。本発明のプローブは、ワード
ラ(Ward etal、)のEP−A−63879号
に開示されているような、雑種形成の干渉を最少にする
位置のみでラベルされる必要はない。事実、他の位置の
ラベル付けはバックグラウンド雑種形成を、ことに、非
プローブ領域と相補性でありうる天然のゲノム様物質ま
たは核酸遺伝子生成物との雑種形成をさらに減じる。
ラベルの存在がプローブ領域の標的配列との雑種分子形
成を有意に干渉しないので有利であり、したがって、そ
のような雑種分子形成が非常に効率的になる。さらに、
一本鎖特異的修飾は非プローブ領域の全塩基の80〜9
0%までのラベルにも使用できるが、従来の方法ではそ
のような広範囲のラベルがプローブ領域の雑種形成を許
容しえないほどに干渉し、はなはだ高価になりうる。す
なわち5本発明のプローブにおいては、雑種形成後の検
出用により多くのラベルを存在させることができる。非
プローブ領域の塩基の修飾も非プローブ領域の非特異性
水素結合を最少にすることによりバックグラウンドを減
少させ、ヌクレオチドの作用によるような分解に対して
プローブを安定化させる。本発明のプローブは、ワード
ラ(Ward etal、)のEP−A−63879号
に開示されているような、雑種形成の干渉を最少にする
位置のみでラベルされる必要はない。事実、他の位置の
ラベル付けはバックグラウンド雑種形成を、ことに、非
プローブ領域と相補性でありうる天然のゲノム様物質ま
たは核酸遺伝子生成物との雑種形成をさらに減じる。
本発明のプローブはキットとして包装するのに適シてお
り、キットは、単にプローブを含有する緩衝溶液のよう
な容器からなるものでもよく、あるいは、本発明のプロ
ーブを使用するのに有用な、別々の容器に入った種々の
成分からなっていてもよい。キットの成分はプローブの
!]的とする用途およびラベル分)の選択に存在する。
り、キットは、単にプローブを含有する緩衝溶液のよう
な容器からなるものでもよく、あるいは、本発明のプロ
ーブを使用するのに有用な、別々の容器に入った種々の
成分からなっていてもよい。キットの成分はプローブの
!]的とする用途およびラベル分)の選択に存在する。
このようなキットはプローブおよび、ラベル分子(プロ
ーブが予めラベルされていない場合)、標的配列の雑腫
形成、検出および/または定置を可能にrる試薬および
月利、検出前に標的配列を操作するための試薬および材
料のような他の試薬からなることもできる。このような
キットは、例えば、ビオチンで修飾され、ヒト・サイト
メガロウィルスに特異的な配列のようなDNAまたはR
NA配列用の本発明のプローブおよび、アビジン・アル
カリ性ホスファターゼまfこは複合ペルオキシダーゼの
ような、雑種形成したプローブ分)と結合あるいは液分
)を検出するような酵素のごときラベル分子からなるこ
とができる。さらに、ラベル分子の存在を検出する。該
酵素用の基質、好ましくは、比色用基質のごとき試薬も
、別の容器に入れてキットに包含させることができる。
ーブが予めラベルされていない場合)、標的配列の雑腫
形成、検出および/または定置を可能にrる試薬および
月利、検出前に標的配列を操作するための試薬および材
料のような他の試薬からなることもできる。このような
キットは、例えば、ビオチンで修飾され、ヒト・サイト
メガロウィルスに特異的な配列のようなDNAまたはR
NA配列用の本発明のプローブおよび、アビジン・アル
カリ性ホスファターゼまfこは複合ペルオキシダーゼの
ような、雑種形成したプローブ分)と結合あるいは液分
)を検出するような酵素のごときラベル分子からなるこ
とができる。さらに、ラベル分子の存在を検出する。該
酵素用の基質、好ましくは、比色用基質のごとき試薬も
、別の容器に入れてキットに包含させることができる。
このような試薬には1例えば、ラベルがアルカリ性ホス
ファターゼの場合、ニトロブルー・テトラゾリウムの5
0%N、N−ジメチルホルムアミド−水中溶液および′
5−ブロモ%4−クロロ、3−インドリルホスフェート
のジメチルホルムアミド中溶液が包含される。
ファターゼの場合、ニトロブルー・テトラゾリウムの5
0%N、N−ジメチルホルムアミド−水中溶液および′
5−ブロモ%4−クロロ、3−インドリルホスフェート
のジメチルホルムアミド中溶液が包含される。
あるいは、プローブはビオニチル化およびアビジン酵素
複合体の結合により、予めラベルすることもでき、この
場合、キットには1つの容器に入れたプローブおよび他
の容器に入れたラベル分子・の存在を検出するための試
薬を包含させることができる。標準試薬および/または
標的配列に結合した特定のプローブの量を正確に定置す
るための装置も包含させることができる。より精巧なキ
ットは髄膜炎または性病のような病状の2J2+、上の
共通した原因物質に特異的なラベルしたプローブからな
ることもできる。ラベル分子および基質に加え、このさ
らに複雑なキットには異なった標的配列用の複数の異な
ったプローブを包含させることもできる。このようなキ
ットは感染性物質の同定ならひに感染性物質のサブクラ
スへの分類を可能とする。このような、さらに複雑なキ
ットは、さらに、標的配列のさらに詳細な分析に有用な
装置および試薬からなる。例えば、家族性遺伝的障吉ま
たは他のいずれの遺伝的特性または幀向の分析も患者か
らの染色体DNAの制限およびケル電気泳動分析により
検査できる。このようなキットには、制限酵素、制限酵
素緩衝液、電気泳動マトリックス(例えば、アガロース
およびアクリルアミド)ならびに、制限分析前の細胞溶
解およびそれからの核酸抽出用試薬のような染色体D
N 、A A製用の他の試薬を包含させることができる
。前記のキットの組成物は説明のための具体例にすき゛
す、他の試薬および材q 11らひに試薬および祠、何
の組合せは当業苦に明らかである。
複合体の結合により、予めラベルすることもでき、この
場合、キットには1つの容器に入れたプローブおよび他
の容器に入れたラベル分子・の存在を検出するための試
薬を包含させることができる。標準試薬および/または
標的配列に結合した特定のプローブの量を正確に定置す
るための装置も包含させることができる。より精巧なキ
ットは髄膜炎または性病のような病状の2J2+、上の
共通した原因物質に特異的なラベルしたプローブからな
ることもできる。ラベル分子および基質に加え、このさ
らに複雑なキットには異なった標的配列用の複数の異な
ったプローブを包含させることもできる。このようなキ
ットは感染性物質の同定ならひに感染性物質のサブクラ
スへの分類を可能とする。このような、さらに複雑なキ
ットは、さらに、標的配列のさらに詳細な分析に有用な
装置および試薬からなる。例えば、家族性遺伝的障吉ま
たは他のいずれの遺伝的特性または幀向の分析も患者か
らの染色体DNAの制限およびケル電気泳動分析により
検査できる。このようなキットには、制限酵素、制限酵
素緩衝液、電気泳動マトリックス(例えば、アガロース
およびアクリルアミド)ならびに、制限分析前の細胞溶
解およびそれからの核酸抽出用試薬のような染色体D
N 、A A製用の他の試薬を包含させることができる
。前記のキットの組成物は説明のための具体例にすき゛
す、他の試薬および材q 11らひに試薬および祠、何
の組合せは当業苦に明らかである。
実施例
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか
、これらに限定されるものではない。
、これらに限定されるものではない。
実施例1
一重鎖特毘的修飾
グリオキシル化ニー木調Ml 3CA2DNA(Q、
I M N a P 04251’ll中、25 μg
、 PH7,0)を、ジメチルスルホキシド変性を用い
ない以外は実質的にマクマスターら、プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
(McMaster et al、、 Proc、 N
atl、 Acad、 Scす74 : 4835〜4
838(1977)の記載に従って、115容のグリオ
キサールの脱イオン化6M水性溶液と、50℃で1時間
反応させる。反応混合液を、氷1@ N a P 04
緩衝液(pH7,0)の添加により100μeに希釈す
る。得られた修飾、すなわち、グリオキシル化DNAを
、o、 I M NaPO4(pH7,0)中、セフ7
デツクス(5ephadex )G −50ゲル()r
ルマシア(Plxarmacia) )の1 ml床を
通ず遠心溶出で精製する。
I M N a P 04251’ll中、25 μg
、 PH7,0)を、ジメチルスルホキシド変性を用い
ない以外は実質的にマクマスターら、プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
(McMaster et al、、 Proc、 N
atl、 Acad、 Scす74 : 4835〜4
838(1977)の記載に従って、115容のグリオ
キサールの脱イオン化6M水性溶液と、50℃で1時間
反応させる。反応混合液を、氷1@ N a P 04
緩衝液(pH7,0)の添加により100μeに希釈す
る。得られた修飾、すなわち、グリオキシル化DNAを
、o、 I M NaPO4(pH7,0)中、セフ7
デツクス(5ephadex )G −50ゲル()r
ルマシア(Plxarmacia) )の1 ml床を
通ず遠心溶出で精製する。
過ヨウg m 1M 開裂:エルセピア/ノース・ホー
ランド・バイオメディカル・プレス社、ナツプら編、ウ
ィルソンら著、「免疫螢光および関連染色技術j(Wi
lson et al、、 Irrmurrofluo
resenceand Re1ated Sta
ining Techniques 、 cd、
’byKnapp etal。 1 g 7 B 、
Elsevier /North1(oJJand
BiomedicaJ Press ) 215〜
224頁(1978年〕の記載に実質的に従って、過ヨ
ウ素酸塩開裂により、グリオキシル化DNA20μgを
反応性アルデヒドDNAに変える。N□PO4緩衝液(
pF−17,0) 90 tte中、該DNAに50℃
で1.0Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(Narn 10
4 ) 10μeを加え、時々振とうしながら、室温(
21℃)で30分間インキュベートする。アルデヒドD
NAを含有する反応混合液を、101MNaPO4(P
I’−T7.O) 500wlづつを3回変更しながら
、これに対して4℃で一夜透析する。
ランド・バイオメディカル・プレス社、ナツプら編、ウ
ィルソンら著、「免疫螢光および関連染色技術j(Wi
lson et al、、 Irrmurrofluo
resenceand Re1ated Sta
ining Techniques 、 cd、
’byKnapp etal。 1 g 7 B 、
Elsevier /North1(oJJand
BiomedicaJ Press ) 215〜
224頁(1978年〕の記載に実質的に従って、過ヨ
ウ素酸塩開裂により、グリオキシル化DNA20μgを
反応性アルデヒドDNAに変える。N□PO4緩衝液(
pF−17,0) 90 tte中、該DNAに50℃
で1.0Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(Narn 10
4 ) 10μeを加え、時々振とうしながら、室温(
21℃)で30分間インキュベートする。アルデヒドD
NAを含有する反応混合液を、101MNaPO4(P
I’−T7.O) 500wlづつを3回変更しながら
、これに対して4℃で一夜透析する。
ジアミノ付加:カダベリン(l、5−ジアミノペンタン
〕を、前記ウィルソンらの記載する過ヨウ素酸塩酸化糖
蛋白酵素、例えば、ペルオキシダーゼをイムノグロブリ
ンG分子の6−アミノ基へ複合させるために用いた方法
で該アルデヒドDNAに結合させる。カダベリンを含有
しない塩基を0.5M Na82PO4で濃度IMに希
釈する。カタベリン濃度10μeを、アルデヒドI)N
AIQμgを含有する0、1M NaPO4(PH7,
0)90μeに加える。
〕を、前記ウィルソンらの記載する過ヨウ素酸塩酸化糖
蛋白酵素、例えば、ペルオキシダーゼをイムノグロブリ
ンG分子の6−アミノ基へ複合させるために用いた方法
で該アルデヒドDNAに結合させる。カダベリンを含有
しない塩基を0.5M Na82PO4で濃度IMに希
釈する。カタベリン濃度10μeを、アルデヒドI)N
AIQμgを含有する0、1M NaPO4(PH7,
0)90μeに加える。
21℃、pH12,0で2時間シッフ塩基の形成を進行
させ、ついで、0.5 M NaOH中、0.25MN
aBH415μeての還元により、結合を共有結合に変
える。4℃で2時間後−20rnM Na P O,i
、2mMエチレンジアミノ四酢酸酢酸塩CpH7)中。
させ、ついで、0.5 M NaOH中、0.25MN
aBH415μeての還元により、結合を共有結合に変
える。4℃で2時間後−20rnM Na P O,i
、2mMエチレンジアミノ四酢酸酢酸塩CpH7)中。
P−60樹脂(ハ(オラ)−(BioRad) )の4
.5 mlカラム上、少量の試薬からDNA生成物を除
外クロマトグラフィー分離により、還元を終了させる。
.5 mlカラム上、少量の試薬からDNA生成物を除
外クロマトグラフィー分離により、還元を終了させる。
除外した物質(カダベリン−ラベルDNA)、p含有す
るフラクションを溜め、30mMl−リエタノールアミ
ノ酢酸塩(pH7,6,TE A )に対して透析し、
乾燥セファデックスG−200ゲル(ファルマシア)に
対して透析して濃縮する。
るフラクションを溜め、30mMl−リエタノールアミ
ノ酢酸塩(pH7,6,TE A )に対して透析し、
乾燥セファデックスG−200ゲル(ファルマシア)に
対して透析して濃縮する。
ビオチニル化:レーリーら、プロシーディンゲス・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイx :/ス(L
eary et al、、 Proc、Natl、
Acad、Scj+)80:4045〜4049 (1
983)のアルカリ性ホスファターゼのビオチン・ラベ
ルのための方法により、カダベリン−ラベルD、NAの
入手てきるアミノを実質的にビオチニル化する。ビオチ
ニル化ε−アミノカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル(IIA−CS E ) (例えは、カス
ゾロら、クリニカル・ケミストリー(CIin。
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイx :/ス(L
eary et al、、 Proc、Natl、
Acad、Scj+)80:4045〜4049 (1
983)のアルカリ性ホスファターゼのビオチン・ラベ
ルのための方法により、カダベリン−ラベルD、NAの
入手てきるアミノを実質的にビオチニル化する。ビオチ
ニル化ε−アミノカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル(IIA−CS E ) (例えは、カス
ゾロら、クリニカル・ケミストリー(CIin。
Chem、)25:1572〜1580(1979)参
照)をN、N−ジメチルホルムアミドに溶解して、BA
CS Eの20■/ II溶液を調製する。この溶液の
2μeを、4℃でおだやかに攪拌しながら、30分間隔
で2回、3 QmM TEA150μe中、該−fミノ
DNA1,5μgに加える。、2.’5時間後、トリス
−グリシン緩衝液(0,1Mトリス、58τ9.’tl
グリシン、pH7,9)10μe の添加により反応を
終了させる。ビオチニル化DNAを、前記と同様にP−
60ffL!脂上で除外クロマトグラフィーにより精製
する。ビオチン含有フラクションは、各フラクション1
μaをジエチルアミノエチルポットし、前記のレーリー
らの比色アルカリ性ホスファターゼ分析で同定する。
照)をN、N−ジメチルホルムアミドに溶解して、BA
CS Eの20■/ II溶液を調製する。この溶液の
2μeを、4℃でおだやかに攪拌しながら、30分間隔
で2回、3 QmM TEA150μe中、該−fミノ
DNA1,5μgに加える。、2.’5時間後、トリス
−グリシン緩衝液(0,1Mトリス、58τ9.’tl
グリシン、pH7,9)10μe の添加により反応を
終了させる。ビオチニル化DNAを、前記と同様にP−
60ffL!脂上で除外クロマトグラフィーにより精製
する。ビオチン含有フラクションは、各フラクション1
μaをジエチルアミノエチルポットし、前記のレーリー
らの比色アルカリ性ホスファターゼ分析で同定する。
生成物(〈3μg〕は、塩基加水分解に対する抵抗、ア
ガロース・ゲル移動度、紫外線吸収スペクトルおよび、
前記レーリーらの方法に従ったアビジン酵素複合体結合
能により、一本鎖ビオチ.mJlz化DNAであること
を確認した。
ガロース・ゲル移動度、紫外線吸収スペクトルおよび、
前記レーリーらの方法に従ったアビジン酵素複合体結合
能により、一本鎖ビオチ.mJlz化DNAであること
を確認した。
以上は一本鎖特異反応による化学修飾DNAの方法の一
具体例である。この方法は,公知の方法によりプローブ
領域の雑種形成によりプローブ領域を選択的に保護し、
ついで、前記のように一本鎖特異的化学法を採用するこ
とによるポリヌクレオチド・プローブのラベルに使用で
きる。前記の具体的に説明した化学修飾法を,保護プロ
ーブ領域を有するポリヌクレオチドに適用するには、ジ
アミノ付加工程はPH12 よりも温和なpH、例えば
、pH約8〜9にて、例えば、カダベリン遊離塩基を、
INHc/でpH約9.5まで滴定し,NaBH4の中
性溶液に用いることにより行なう。
具体例である。この方法は,公知の方法によりプローブ
領域の雑種形成によりプローブ領域を選択的に保護し、
ついで、前記のように一本鎖特異的化学法を採用するこ
とによるポリヌクレオチド・プローブのラベルに使用で
きる。前記の具体的に説明した化学修飾法を,保護プロ
ーブ領域を有するポリヌクレオチドに適用するには、ジ
アミノ付加工程はPH12 よりも温和なpH、例えば
、pH約8〜9にて、例えば、カダベリン遊離塩基を、
INHc/でpH約9.5まで滴定し,NaBH4の中
性溶液に用いることにより行なう。
このプローブは公知の方法による研究用,臨床または工
業試料中の特定のヌクレオチド分子の検出に使用され,
これには雑種分子形成前または後のラベル付り、標識配
列とプローブとの雑種分)形成が包含される。
業試料中の特定のヌクレオチド分子の検出に使用され,
これには雑種分子形成前または後のラベル付り、標識配
列とプローブとの雑種分)形成が包含される。
実施例2
LT’プローブの比較
本発明のプローブR+、修飾されていない第2のプロー
ブ(B]、およびプローブおよび非プローブ領域が修飾
された第3のプローブ(C)を、t’l]補性を有しな
い第1のテストDNA、プローブ領域に相補性ヲ有スる
第2のテストI)NAおよび非プローブ領域に相補性を
有する第3のテス1−DNAと雑種分子形成させて比較
する。
ブ(B]、およびプローブおよび非プローブ領域が修飾
された第3のプローブ(C)を、t’l]補性を有しな
い第1のテストDNA、プローブ領域に相補性ヲ有スる
第2のテストI)NAおよび非プローブ領域に相補性を
有する第3のテス1−DNAと雑種分子形成させて比較
する。
プローブを修飾する前に、つぎのように32pでラベル
して雑種形成の比較を可能にする。イー・コリ(E、
coli )熱不安定性トキシン(LT)の蛋白(75
0塩基)を含む一本鎖M13N)NA環(M13プロー
ブ1)を、5QmM)リスHC4!(pH7,5)、5
rr+M MgCe2 、o、 05 ”f// 1
ullウシ血清アルブミン100μe中、0℃にてDN
Aアーゼ1 (12,5ng)で消化して線状にする。
して雑種形成の比較を可能にする。イー・コリ(E、
coli )熱不安定性トキシン(LT)の蛋白(75
0塩基)を含む一本鎖M13N)NA環(M13プロー
ブ1)を、5QmM)リスHC4!(pH7,5)、5
rr+M MgCe2 、o、 05 ”f// 1
ullウシ血清アルブミン100μe中、0℃にてDN
Aアーゼ1 (12,5ng)で消化して線状にする。
ついて、ガニ/732P −d ATI’およびポリヌ
クレオチド・キナーゼを用いる標準的方法(例えば、ニ
ュー ヨーり州、コールド・スプリングハーバ−、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、マニアチ
スらfL1982%モレキュラー・クローニング、ラホ
ラトジ一番マニュアル(Maniaciset al。
クレオチド・キナーゼを用いる標準的方法(例えば、ニ
ュー ヨーり州、コールド・スプリングハーバ−、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、マニアチ
スらfL1982%モレキュラー・クローニング、ラホ
ラトジ一番マニュアル(Maniaciset al。
eds、l 982 、 Mo1ecular Cl
oning 、 ALaboratory Manu
al、 Co1d Spring l−1abo
rLaboratory、 Co1d Spring
Harbor、 N 、 Y 、 )参照)によ
り、該1) N Aの5末端を32Pでラベフ ルする。得られたDNAはI X 10 dpm/p
g(D比 放射能を有し、イー・コリネ安定性トキシン
(LT)遺伝子の一部を表わす配列(プローブ領域)を
含む。
oning 、 ALaboratory Manu
al、 Co1d Spring l−1abo
rLaboratory、 Co1d Spring
Harbor、 N 、 Y 、 )参照)によ
り、該1) N Aの5末端を32Pでラベフ ルする。得られたDNAはI X 10 dpm/p
g(D比 放射能を有し、イー・コリネ安定性トキシン
(LT)遺伝子の一部を表わす配列(プローブ領域)を
含む。
プローブ領域の保護、32P−ラベルM13プローブ1
DNAlμgを、M13プローブ1中のプローブ領域を
相補する領(750塩基)を含む一本鎖M13DNA環
(M13プローブ2)1μgと混合する。混合物を0.
1. M NaPO4緩衝液(pH7,0)25μe中
、65℃で10分間加熱し、50℃で1時間アニール(
もしくは雑種形成)させ、プローブ領域の二本鎖形を生
じさせ、非プローブ領域は実質的に一本鎖に残しておく
。
DNAlμgを、M13プローブ1中のプローブ領域を
相補する領(750塩基)を含む一本鎖M13DNA環
(M13プローブ2)1μgと混合する。混合物を0.
1. M NaPO4緩衝液(pH7,0)25μe中
、65℃で10分間加熱し、50℃で1時間アニール(
もしくは雑種形成)させ、プローブ領域の二本鎖形を生
じさせ、非プローブ領域は実質的に一本鎖に残しておく
。
修飾:前記のようにして生じたプローブDNA混合物9
. Q、 l M NaPO4(P” 7.0 )中、
緩衝液のみ、2Mグリオキサールまたは2Mグリオキサ
ール+50%DMSOで処理し、各々、[AI 非修
飾ポリヌクレオチド・プローブ、FBI 非プローブ
領域のみ修飾されたプローブ。
. Q、 l M NaPO4(P” 7.0 )中、
緩衝液のみ、2Mグリオキサールまたは2Mグリオキサ
ール+50%DMSOで処理し、各々、[AI 非修
飾ポリヌクレオチド・プローブ、FBI 非プローブ
領域のみ修飾されたプローブ。
または
(C1非プL1−ブおよびプローブ領域両方が修飾され
たプローブ を得る。
たプローブ を得る。
雑種形成テスト:レーリーら、プV]シーデインダス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・す(エン7、
(Lcary ct al、、 Proc、 Nat
l、Acad+SC’−) 80 : 4045〜40
49(1983)と同様に、加熱変性およびニトロセル
ロース・フィルター」二、50%ホルムアミドを含有す
る雑秤形成緩衝液1 ttti当り、プローブI)NA
25μgを用いる雑種形成により、プローブA、Bおよ
びCを5つのテストI)NA(1=ツト・プロット)と
雑種形成させる。2つのプローブA、1つのプローブB
および1つのプローブC(各5μg〕を各テスト1)N
A の各 −−−−二11巳tF5 ハg、
1ng、o、2ng、40 pgおよびspgと
雑種形成させる。テス)DNAをつぎの表に示す。
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・す(エン7、
(Lcary ct al、、 Proc、 Nat
l、Acad+SC’−) 80 : 4045〜40
49(1983)と同様に、加熱変性およびニトロセル
ロース・フィルター」二、50%ホルムアミドを含有す
る雑秤形成緩衝液1 ttti当り、プローブI)NA
25μgを用いる雑種形成により、プローブA、Bおよ
びCを5つのテストI)NA(1=ツト・プロット)と
雑種形成させる。2つのプローブA、1つのプローブB
および1つのプローブC(各5μg〕を各テスト1)N
A の各 −−−−二11巳tF5 ハg、
1ng、o、2ng、40 pgおよびspgと
雑種形成させる。テス)DNAをつぎの表に示す。
雑種形成は42℃で17時間行ない、ついで、フィルタ
ーを洗浄し、コダック(Kodak) X −A RX
線フィルムに暴露し、放射性プローブDNAを結合した
試料を同定する口 雑種形成実験結果をつぎの表にまとめる。表中、(−)
は雑種形成検出せず、c”)は非常に強い雑種形成、(
+)および(4+)は、各々、弱い雑種形成および強い
雑種形成を示す。(プローブBは本発明のプローブであ
る。プローブAは非修飾、プローブCは全ての領域が修
飾されている。
ーを洗浄し、コダック(Kodak) X −A RX
線フィルムに暴露し、放射性プローブDNAを結合した
試料を同定する口 雑種形成実験結果をつぎの表にまとめる。表中、(−)
は雑種形成検出せず、c”)は非常に強い雑種形成、(
+)および(4+)は、各々、弱い雑種形成および強い
雑種形成を示す。(プローブBは本発明のプローブであ
る。プローブAは非修飾、プローブCは全ての領域が修
飾されている。
表に示すごとく、非修飾ポリヌクレオチド・プローブで
あるプローブAはテストDNA4と非″潜に強く、テス
トDNA2および3と強く、また、テス)DNAIおよ
び5と弱く雑種形成する。
あるプローブAはテストDNA4と非″潜に強く、テス
トDNA2および3と強く、また、テス)DNAIおよ
び5と弱く雑種形成する。
非プローブ領域で修飾されているポリヌクレオチド・プ
ローブであるプローブBは、非修飾プローブと実質的に
同程度にテストDNA3と強く雑種形成する。テス)D
NA4との雑種形成においては約100倍もの減少が観
察される。I)NAI’。
ローブであるプローブBは、非修飾プローブと実質的に
同程度にテストDNA3と強く雑種形成する。テス)D
NA4との雑種形成においては約100倍もの減少が観
察される。I)NAI’。
2または5に対する雑種形成は見られない。全ての領域
で修飾されているポリヌクレオチド・プローブであるプ
ローブCはいずれのDNAに対しても顕著な雑種形成を
示さず、ただ、DNA4に対しては非常に弱い雑種形成
をする。
で修飾されているポリヌクレオチド・プローブであるプ
ローブCはいずれのDNAに対しても顕著な雑種形成を
示さず、ただ、DNA4に対しては非常に弱い雑種形成
をする。
このように、一本鎖特異性修飾は、標的配列との雑種形
成についてのプローブ領域の能力は維持し、かつ、非プ
ローブ領域相補配列または関係のな゛い配列との非特異
的雑種形成を約2オーダー程度低下させる。
成についてのプローブ領域の能力は維持し、かつ、非プ
ローブ領域相補配列または関係のな゛い配列との非特異
的雑種形成を約2オーダー程度低下させる。
実施例3
ヒトβ−グロブリン遺伝子プローブの調製ヒトβ−グロ
ブリン遺伝子に特異的な本発明のプローブを、本発明の
方法を用いてパブテン、ジニトロフェノール(DNP)
でラベルスル。
ブリン遺伝子に特異的な本発明のプローブを、本発明の
方法を用いてパブテン、ジニトロフェノール(DNP)
でラベルスル。
プローブ領域の保護:β−グロブリン遺伝子と相補する
131o塩基を含有する一本鎖M13プローブIDNA
(M13株mP 1017 )の85μgを、10mM
エチレンジアミノ四酢酸塩(EDTA ) (pHs、
o )、0.6 M NaCe オヨUO,06Mク
エン醇ナトリウムを含有する溶液0.4ゴ中、一本鎖M
13プローブ2DNA(M13株mP1135)85μ
gと混合する。混合物を100℃で2分間加熱し、65
℃で3!Iv間雑種形成させる。得られた保護プローブ
DNA、pエタノールで2回沈降させて精製し、最後に
lQmMN a P 04.1.0mM EDTA(p
H7,0)0.16ynlに溶解する。
131o塩基を含有する一本鎖M13プローブIDNA
(M13株mP 1017 )の85μgを、10mM
エチレンジアミノ四酢酸塩(EDTA ) (pHs、
o )、0.6 M NaCe オヨUO,06Mク
エン醇ナトリウムを含有する溶液0.4ゴ中、一本鎖M
13プローブ2DNA(M13株mP1135)85μ
gと混合する。混合物を100℃で2分間加熱し、65
℃で3!Iv間雑種形成させる。得られた保護プローブ
DNA、pエタノールで2回沈降させて精製し、最後に
lQmMN a P 04.1.0mM EDTA(p
H7,0)0.16ynlに溶解する。
修飾:保護プローブD N A ヲドレーパー、ヌクレ
イツク・アシツズーリサーチ(Draper 、 Nu
cl。
イツク・アシツズーリサーチ(Draper 、 Nu
cl。
AcjdsRes、) 12:989(1984)に
記載される方法に実質的に従い、以下のようにしてエチ
レンジアミノによるバイサルファイド触媒アミノ基転移
により修飾する。
記載される方法に実質的に従い、以下のようにしてエチ
レンジアミノによるバイサルファイド触媒アミノ基転移
により修飾する。
1) N A混合物50 Ill!をNa2S2051
59Mおヨヒエチレンジアミノ2.8Mの溶液(pH6
,0)0、45 mlと混合する。混合液を42℃で1
.5時間インキュベーションし、 氷N する。Q、
5 N Na0I−160μeを添加してpHを8〜8
.5に調製し、氷−ヒて30分間インキュベーションを
つつける。30mMトリエタノールアミノ緩衝液(pH
7,6) ニ対して透析して反応体からエチレンアミノ
・ラベルDNAを分離する。
59Mおヨヒエチレンジアミノ2.8Mの溶液(pH6
,0)0、45 mlと混合する。混合液を42℃で1
.5時間インキュベーションし、 氷N する。Q、
5 N Na0I−160μeを添加してpHを8〜8
.5に調製し、氷−ヒて30分間インキュベーションを
つつける。30mMトリエタノールアミノ緩衝液(pH
7,6) ニ対して透析して反応体からエチレンアミノ
・ラベルDNAを分離する。
DNPハプテンのアミノ付加物との共有結合を。
DNP−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル25〜
をジメチルホルムアミド0.5 tttlに溶解し。
をジメチルホルムアミド0.5 tttlに溶解し。
この試薬lOμeを透析したアミノ・ラベルDNA0、
6 mlに加え、室温で1時間インキュベーションする
ことにより完了する。ついで、このDNPラベルDNA
を、等容量のクロロホルム−インアミルアルコール(2
4:1)で6回抽出し、水相をエタノールで沈降させる
ことにより5反応体から分層する。最終の黄色DNA沈
澱を10 mM ト!JスHC1,1mM EDTA
(pH7,5)100 tteに溶解する。DNP−N
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代すにビオチニ
ル−アミノカプロイル−N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルヲ用いて、同様にして、ビオチン・ラベルDN
Aプローブを調製するう 雑種形成テスト:プローブと標的DNAを混合し、標準
的な雑種形成条件下でインキュベーションした後、アガ
ロースゲル中での電気泳動移動度における変化で雑種形
成を測定する。DNPラベル・プローブは、ヒトβ−ク
ロプリン遺伝チ配列(ツクマキら、セ/I/ (Fuk
umaki ec al、、 Ce1l)23:585
)を含有するプラスミド(PTIBC6)と雑種形成す
る力ζプローブの非プローブ領域に相補するDNA試料
とは雑種形成しない。
6 mlに加え、室温で1時間インキュベーションする
ことにより完了する。ついで、このDNPラベルDNA
を、等容量のクロロホルム−インアミルアルコール(2
4:1)で6回抽出し、水相をエタノールで沈降させる
ことにより5反応体から分層する。最終の黄色DNA沈
澱を10 mM ト!JスHC1,1mM EDTA
(pH7,5)100 tteに溶解する。DNP−N
−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代すにビオチニ
ル−アミノカプロイル−N−ヒドロキシスクシンイミド
エステルヲ用いて、同様にして、ビオチン・ラベルDN
Aプローブを調製するう 雑種形成テスト:プローブと標的DNAを混合し、標準
的な雑種形成条件下でインキュベーションした後、アガ
ロースゲル中での電気泳動移動度における変化で雑種形
成を測定する。DNPラベル・プローブは、ヒトβ−ク
ロプリン遺伝チ配列(ツクマキら、セ/I/ (Fuk
umaki ec al、、 Ce1l)23:585
)を含有するプラスミド(PTIBC6)と雑種形成す
る力ζプローブの非プローブ領域に相補するDNA試料
とは雑種形成しない。
DNPラベラベプローブの検出:DNPラベルD N
A r、y Q、 5 M N a Ce、0.06
M りX’J酸ナトリウム中で系列的に希釈し、二
1・−ハンプシャー州、−j−−ン、シュライバー・ア
ンド・シュエルのマニホールド・スロット−プロット装
置(Manifold ’ 5lot −BloL”
apparatus (Schleicherand
5chuell、 Kcene 、 New Ha
+npshire ))を用い、ニトロセルロース・フ
ィルター・シートに結合させる。チェ7ら、プロンーデ
インクス・オフ・ナショナル・アカデミ−・メブ・サイ
エンス・オブーユ−、x x (Tchen et
al+、 Proc、 Natl。
A r、y Q、 5 M N a Ce、0.06
M りX’J酸ナトリウム中で系列的に希釈し、二
1・−ハンプシャー州、−j−−ン、シュライバー・ア
ンド・シュエルのマニホールド・スロット−プロット装
置(Manifold ’ 5lot −BloL”
apparatus (Schleicherand
5chuell、 Kcene 、 New Ha
+npshire ))を用い、ニトロセルロース・フ
ィルター・シートに結合させる。チェ7ら、プロンーデ
インクス・オフ・ナショナル・アカデミ−・メブ・サイ
エンス・オブーユ−、x x (Tchen et
al+、 Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 U、S、) 81 : 346
6(1984)の他のハプテン(AAIF)によるD
N A 鰹節についての記載に実質的に従い、DNI’
に対する抗血清(ミズーリ州、セントルイス、ゲートウ
ェイ・イムノセラ・カンパ= −(Gateway
InynunoseraCo、、 St、 Louis
、 Mo+)およびアルカリ性ボスファターゼ複合ヤギ
抗ウサギIgG (ペンシルベニア什1、コクランビ
ル、カッペル・ラボラドリース(Cappel La
bs、、 Cochranville 、 PA)を用
いてI) N PラベルDNAの位置を決定する。DN
PラベルDNAの501g以下の検出感度が得られた。
6(1984)の他のハプテン(AAIF)によるD
N A 鰹節についての記載に実質的に従い、DNI’
に対する抗血清(ミズーリ州、セントルイス、ゲートウ
ェイ・イムノセラ・カンパ= −(Gateway
InynunoseraCo、、 St、 Louis
、 Mo+)およびアルカリ性ボスファターゼ複合ヤギ
抗ウサギIgG (ペンシルベニア什1、コクランビ
ル、カッペル・ラボラドリース(Cappel La
bs、、 Cochranville 、 PA)を用
いてI) N PラベルDNAの位置を決定する。DN
PラベルDNAの501g以下の検出感度が得られた。
以上1本発明の好ましい具体例について説明したが、本
発明の只想を逸脱しない範囲で種々の変形を加えること
ができ、それらも本発明範囲のものである。
発明の只想を逸脱しない範囲で種々の変形を加えること
ができ、それらも本発明範囲のものである。
特許出願人 スミスクライン・ベックマン・コーポレ
イション
イション
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)一本鎖ポリヌクレオチド内のプローブ領域を、該
ポリヌクレオチドの修飾前に該プローブ領域と相補配列
との雑種形成により選択的に保護することを特徴とする
ポリヌクレオチド雑種形成プローブの調製法。 (2)該一本鎖ポリヌクレオチドを、プローブ領域の選
択的保護前に直接的または間接的に固体担体に結合させ
る前記第(1)項の調製法。 (3)プローブ領域を選択的に保護した後、アミノ基転
移によりプローブを修飾する前記第(1)項の調製法。 (4)プローブ領域を選択的に保護した後、ビオチニル
化によりプローブを修飾する前記第(1)項の調製法。 (5)検出可能部に複合したアビジンからなるラベルで
修飾残基をラベルする前記第(4)項の調製法。 (6)プローブ領域がヒトDNAまたはRNA配列ある
いはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸配
列に対して相補性である前記第1項の調製法。 (7)プローブ領域が非ヒトDNAまたはRNA配列あ
るいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有な
核酸配列に対して相補性である前記第(1)項の調製法
。 (8)プローブ領域が組換型DNA生成物の製造に用い
る宿主細胞またはベクターに特有なDNAまたはRNA
配列に対して相補性である前記第(1)項の調製法。 (9)プローブがその中にプローブ領域を有する一本鎖
ファージDNAまたはRNAである前記第(1)項の調
製法。 (10)一本鎖ファージDNAまたはRNAがM13D
NAである前記第(9)項の調製法。 (11)一本鎖ポリヌクレオチドをプローブ領域の選択
的保護前に固体担体に直接的または間接的に結合させる
前記第(10)項の調製法。 (12)プローブ領域の選択的保護後、アミノ基転移に
よりプローブを修飾する前記第(10)項の調製法。 (13)プローブ領域の選択的保護後、ビオチニル化に
よりプローブを修飾する前記第(10)項の調製法。 (14)検出可能部に複合したアビジンからなるラベル
で修飾残基をラベルする前記第(13)項の調製法。 (15)プローブ領域がヒトDNAまたはRNA配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第(10)項の調製法。 (16)プローブ領域が非ヒトDNAまたはRNA配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第(16)項の調
製法。 (17)プローブ領域が、組換型DNA生成物の製造に
用いる宿主細胞またはベクターに特有なDNAまたはR
NA配列に対して相補性である前記第(10)項の調製
法。 (18)非プローブ領域がラベル分子との結合のために
選択的に修飾されたポリヌクレオチド雑種形成プローブ
。 (19)修飾残基に結合したラベル分子を有する前記第
(18)項のプローブ。 (20)プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れた前記第(18)項のプローブ。 (21)プローブがビオチニル化により選択的に修飾さ
れた前記第(18)項のプローブ。 (22)修飾残基が、検出可能部に複合したアビジンか
らなるラベルでラベル付けされる前記第(21)項のプ
ローブ。 (23)プローブ領域がヒトDNAまたはRNA配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第(18)項のプローブ
。 (24)プローブ領域が非ヒトDNAまたはRNA配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第(18)項のプ
ローブ。 (25)プローブ領域が組換型DNA生成物の製造に用
いる宿主細胞またはベクターに特有なDNAまたはRN
A配列に対して相補性である前記第(18)項のプロー
ブ。 (26)その中にとり込まれたプローブ領域を有する一
本鎖ファージDNAまたはRNAからなる前記第(18
)項のプローブ。 (27)一本鎖ファージDNAまたはRNAがM13D
NAである前記第(26)項のプローブ。 (28)修飾残基に結合するラベル分子を有する前記第
(27)項のプローブ。 (29)プローブがアミノ基転移で選択的に修飾されて
いる前記第(27)項のプローブ。 (30)プローブがビオチニル化で選択的に修飾されて
いる前記第(27)項のプローブ。 (31)修飾残基が、検出可能部に複合したアビジンか
らなるラベルでラベルされる前記第(30)項のプロー
ブ。 (32)プローブ領域がヒトDNAまたはRNA配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第(27)項のプローブ
。 (33)プローブ領域が非ヒトDNAまたはRNA配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に相補性である前記第(27)項のプローブ
。 (34)プローブ領域が組換型DNA生成物の製造に用
いる宿主細胞またはベクターに特有のDNAまたはRN
A配列に対して相補性である前記第(27)項のプロー
ブ。 (35)前記第(18)項のプローブからなるキット。 (36)前記第(19)項のプローブからなるキット。 (37)さらに、別容器中のラベル分子からなる前記第
(35)項のキット。 (38)さらに、別容器中の、ラベル分子存在検出用試
薬からなる前記第(36)項のキット。 (39)さらに、別容器中の、ラベル分子存在検出用試
薬からなる前記第(37)項のキット。 (40)プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れている前記第(37)項のキット。 (41)プローブがビオチニル化により選択的に修飾さ
れ、ラベル分子が酵素に複合したアビジンである前記第
(37)項のキット。 (42)プローブ領域がヒトDNAまたはRNA配列あ
るいはヒト病原体または一群のヒト病原体に特有な核酸
配列に対して相補性である前記第(35)項のキット。 (43)プローブ領域が非ヒトDNAまたはRNA配列
あるいは非ヒト病原体または一群の非ヒト病原体に特有
な核酸配列に対して相補性である前記第(35)項のキ
ット。 (44)プローブ領域が組換型DNA生成物の製造に用
い、宿主細胞またはベクターに特有のDNAまたはRN
A配列に対して相補性である前記第(35)項のキット
。 (45)プローブがプローブ領域をとり込んだ一本鎖フ
ァージDNAまたはRNAである前記第(35)項のキ
ット。 (46)一本鎖ファージDNAまたはRNAがM13D
NAである前記第(44)項のキット。 (41)プローブがアミノ基転移により選択的に修飾さ
れている前記第(46)項のキット。 (48)非プローブ領域がビオチニル化により選択的に
修飾されている前記第(46)項のキット。 (49)さらに、別容器中の、ラベル分子として用いる
酵素に複合したアビジンからなる前記第(46)項のキ
ット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61036384A | 1984-05-15 | 1984-05-15 | |
US610363 | 1984-05-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS611388A true JPS611388A (ja) | 1986-01-07 |
Family
ID=24444714
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60103617A Pending JPS611388A (ja) | 1984-05-15 | 1985-05-14 | ヌクレオチド雑種形成プローブ |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0172153B1 (ja) |
JP (1) | JPS611388A (ja) |
KR (1) | KR850008679A (ja) |
AT (1) | ATE45385T1 (ja) |
AU (1) | AU589362B2 (ja) |
DE (1) | DE3572196D1 (ja) |
DK (1) | DK213485A (ja) |
ES (1) | ES8607983A1 (ja) |
FI (1) | FI851919L (ja) |
GR (1) | GR851153B (ja) |
IL (1) | IL75142A0 (ja) |
NO (1) | NO851919L (ja) |
NZ (1) | NZ212024A (ja) |
PT (1) | PT80451B (ja) |
ZA (1) | ZA853621B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62260786A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-13 | 株式会社ヘキトク | 燻瓦の製造ラインにおける焼成工程後の表面仕上げ装置 |
JPH0359339U (ja) * | 1989-10-13 | 1991-06-11 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3431219A1 (de) | 1984-08-24 | 1986-03-06 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Benzoylharnstoffe |
EP0253894A1 (en) * | 1985-12-27 | 1988-01-27 | Toray Industries, Inc. | Dna probe and method of preparing the same |
US4822731A (en) * | 1986-01-09 | 1989-04-18 | Cetus Corporation | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes |
US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
WO1989001049A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions |
US5686579A (en) * | 1988-06-21 | 1997-11-11 | Hybrisens, Ltd. | Use of antibody/antigen interactions to protect biologically active proteins and peptides |
CA2055755A1 (en) * | 1990-11-22 | 1992-05-23 | Toshihiko Kishimoto | Method of immobilizing single-stranded dna on carrier at terminal |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1190838A (en) * | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
CA1338856C (en) * | 1983-07-05 | 1997-01-21 | Jannis Stavrianopoulos | In vivo labelling of polynucleotide sequences |
US4737454A (en) * | 1983-07-14 | 1988-04-12 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
US4777129A (en) * | 1983-12-12 | 1988-10-11 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein |
DE3479522D1 (en) * | 1983-12-16 | 1989-09-28 | Medisense Inc | Assay for nucleic acids |
FR2569407B1 (fr) * | 1984-08-22 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Sondes comportant des groupements adenine modifiee, leur preparation et leurs utilisations |
-
1985
- 1985-05-09 EP EP85870065A patent/EP0172153B1/en not_active Expired
- 1985-05-09 NZ NZ212024A patent/NZ212024A/xx unknown
- 1985-05-09 DE DE8585870065T patent/DE3572196D1/de not_active Expired
- 1985-05-09 AT AT85870065T patent/ATE45385T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-09 IL IL75142A patent/IL75142A0/xx unknown
- 1985-05-13 GR GR851153A patent/GR851153B/el unknown
- 1985-05-13 PT PT80451A patent/PT80451B/pt unknown
- 1985-05-14 ZA ZA853621A patent/ZA853621B/xx unknown
- 1985-05-14 ES ES543127A patent/ES8607983A1/es not_active Expired
- 1985-05-14 KR KR1019850003263A patent/KR850008679A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 DK DK213485A patent/DK213485A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 AU AU42458/85A patent/AU589362B2/en not_active Ceased
- 1985-05-14 NO NO851919A patent/NO851919L/no unknown
- 1985-05-14 FI FI851919A patent/FI851919L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-05-14 JP JP60103617A patent/JPS611388A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62260786A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-13 | 株式会社ヘキトク | 燻瓦の製造ラインにおける焼成工程後の表面仕上げ装置 |
JPH0249269B2 (ja) * | 1986-05-08 | 1990-10-29 | Hekitoku Kk | |
JPH0359339U (ja) * | 1989-10-13 | 1991-06-11 | ||
JPH0454194Y2 (ja) * | 1989-10-13 | 1992-12-18 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK213485D0 (da) | 1985-05-14 |
AU4245885A (en) | 1985-11-21 |
FI851919A0 (fi) | 1985-05-14 |
ES543127A0 (es) | 1986-06-01 |
PT80451B (en) | 1987-01-14 |
AU589362B2 (en) | 1989-10-12 |
IL75142A0 (en) | 1985-09-29 |
DK213485A (da) | 1985-11-16 |
NO851919L (no) | 1985-11-18 |
EP0172153A1 (en) | 1986-02-19 |
GR851153B (ja) | 1985-11-25 |
ATE45385T1 (de) | 1989-08-15 |
FI851919L (fi) | 1985-11-16 |
EP0172153B1 (en) | 1989-08-09 |
DE3572196D1 (en) | 1989-09-14 |
NZ212024A (en) | 1988-08-30 |
ES8607983A1 (es) | 1986-06-01 |
PT80451A (en) | 1985-06-01 |
KR850008679A (ko) | 1985-12-21 |
ZA853621B (en) | 1986-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4822731A (en) | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes | |
US4563417A (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
US4777129A (en) | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein | |
CA1272443A (en) | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
US4963477A (en) | Probe containing a modified nucleic acid, recognizable by specific antibodies and use of this probe and theses specific antibodies to detect and characterize a homologous DNA sequence | |
Dale et al. | Mercurated polynucleotides. New probes for hybridization and selective polymer fractionation | |
EP0360940B1 (en) | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites | |
US4968602A (en) | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
EP0163220B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies | |
JPH0420300A (ja) | 核酸ハイブリツド形成アツセイ用固体支持体 | |
HU196453B (en) | Process for the identification of nucleinic acids | |
JPH10508741A (ja) | 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法 | |
IE880697L (en) | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and¹kit therefor | |
AU619170B2 (en) | Diagnostic assays using nucleic acid probes | |
US4840892A (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
EP0146815B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
Adler et al. | Studies of SV 40 DNA. V. Conversion of circular to linear SV 40 DNA by restriction endonuclease from Escherichia coli B | |
EP0146039A2 (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding | |
CA1290664C (en) | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
JPS611388A (ja) | ヌクレオチド雑種形成プローブ | |
WO1988004289A1 (en) | Non-radioactive nucleic acid probes | |
JPS61502889A (ja) | 化学的にラベルした刻酸、その利用法およびその実行用キット | |
Mackey et al. | Transforming region of group A, B, and C adenoviruses: DNA homology studies with twenty-nine human adenovirus serotypes | |
JPH05276996A (ja) | コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット | |
CA1250232A (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by anti-hybrid binding |