NO851919L

NO851919L - Fremgangsmaate for fremstilling av en polynukleotid-hybridiserings-probe.

Info

Publication number: NO851919L
Application number: NO851919A
Authority: NO
Inventors: Craig W Adams; Jeffry Joseph Leary; Martin Rosenberg
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1984-05-15
Filing date: 1985-05-14
Publication date: 1985-11-18
Also published as: DK213485D0; JPS611388A; IL75142A0; PT80451B; FI851919A0; ZA853621B; KR850008679A; EP0172153A1; EP0172153B1; GR851153B; ES543127A0; ES8607983A1; AU589362B2; DE3572196D1; DK213485A; NZ212024A; ATE45385T1; AU4245885A; PT80451A; FI851919L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører polynukleotid - hybridiseringsprober og spesielt forbedrede prober og fremstilling av disse.

Polynukleotid-hybridiseringprober gir et billig, effek-tivt og raskt middel for å påvise, lokalisere og isolere "mål" nukleotid-sekvenser for kliniske og forskningsformål. Klausner et al., Biotechnology, August 1983: 471 - 478, gir

en interessant bakgrunn for polymukleotid-hybridiserings-prober som inneholder omtale av fremstilling og bruk.

Kjente metoder for å fremstille hybridiserings-prober

og for bruk av slike prober er godt beskrevet i litteraturen. Se for eksempel Southern, J. Moi. Biol. 98: 503-517 (1975); Falkow et al., U.S. Patent 4.385.535; Leary et al., Proe Nati. Acad. Sei. 80: 4045-4049 (1983 ); Langer-Safer et al., Proe. Nati. Acad. Sei♦ 79: 4381-4385 (1982); og Langer et al., Proe, nati. Acad. Sei. 78: 6633-6637 (1981); and Kohne, WO84-02721, utgitt 19.juli 1984.

Som beskrevet i disse og andre henvisninger, omfatter slike kjente metoder for fremstilling av prober gjerne kloning av et probeområde i et dobbeltkjedet DNA plasmid.

Plasmidet som inneholder probeområdet, er markert, gjerne

ved enzymatiske polymeriseringsteknikker. Slike teknikker innbefatter f.eks. innsnitt translasjon (Rigby et al,. J. Moi. Biol. 113:237 (1977) ); hulromfylling (Bourguignon et al., J. Virol. 20: 290 (1976) ); og terminaladdisjon, hvilke teknikker utføres i nærvær av modifiserte nukleotid trifosfater. Kjemiske modifiseringsteknikker innbefattet slike som er beskrevet i henvisningene nedenunder, kan også brukes:

Brigati et al., Virologi 126:32-50 (1983), beskriver

at biotin-markerte brober hvori biotinet er bundet til deoksy-uridin trifosfat (duTP) med en lang kjede (11 eller 16 atomer) er fordelaktigere enn prober hvori biotin-markøren er bundet til nukleotidene med en kort kjede (4 atomer). Polynukleotid-probene markeres ved enzymatisk innbygning av biotinylert duTP ved innsnitt translasjon ved bruk av DNA polymerase I.

Ward et al., EP-A-63.879, beskriver at markørmolekyler fortrinnsvis ikke er bundet til stillinger i en nukleotid-ring som ville bevirke interferens med hydrogenbinding av en probe til en målsekvens. Forfatterne beskriver, som en løs-ning på dette problem, binding av markørmolekyler ved frem-stillingene til pyrimidiner (tymin, cytosin og uracil), ved 7-stillingene til puriner (adenin og guanin), og ved 7-stillingene til deazapuriner. Som en ytterligere løsning beskriver Ward et al. binding av markørmolekyler til nukleotider med en forlenget bindearm, som hos Brigati et al., ovenfor.

Kourilsky et al., GB 2.019408 beskriver kjemisk modifi-kasjon ved cytokrom C-biotin-teknikken beskrevet av Manning et al., Biochem. 16: 1364 (1977) av polynukleotid-hybridiser-ingsprober og markering av slike modifiserte prober før eller etter hybridisering til en prøve. Kjemiske merkings-metoder er også beskrevet av Renz et al., Nucl. Acids Res. 3^:3435 (1984) og Tchen et al., Proe. Nat' 1. Sei USA 81: 3466 (1984). Renz fremgangsmåte kobler enzymer direkte til prober ved lignende metoder som hos Kourilsky et al.,

GB 2.019.408 og Manning et al., angitt ovenfor. I Tchen-metoden påvirker større modifisering enn 5 til 10% av nukleotid-restene probehybridisering uheldig.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte ved fremstilling av en polynukleotid-hybridiseringsprobe hvilken består av selektiv beskyttelse av et probeområde

i et enkeltkjedet polynukleotid (DNA eller RNA) ved å hybridisere probeområdet til en komplementær sekvens før modifisering av polynukleotidet. Som beskrevet nedenunder beskyttes probe-området selektivt ved hybridisering av probeområdet til en

komplementær oligo eller polynukleotid sekvens før kjemisk derivat-dannelse, eller modifisering av baser i ikke-probe området ved enkeltkjedet polynukleotid spesifikke reaksjoner.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er en polynukleotid-hybridiseringsprobe fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I dette aspekt er oppfinnelsen spesielt en polynukleotid-hybridiseringsprobe hvori ikke-probeområdet er selektivt modifisert for kobling av markørmolekyler.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er et sett omfattende polynukleotid-hybridiseringsproben ifølge oppfinnelsen.

Polynukleotidproben ifølge oppfinnelsen omfatter et probeområde, d.v.s. en nukleotid-sekvens som er komplementær til målsekvensen, og et ikke-probeområde, d.v.s. en nukleotid-sekvens som ikke er komplementær med målsekvensen.

Målområdet som probeområdet er komplementært til, kan være hvilket som helst helt eller en del av genomisk materiale eller nuklein-syre gen-produkt så som ribosom, over-førings, budbringer eller intron RNA, fra en organisme, virus eller celle. Målsekvenser ligger typisk i størrelsesorden noen hundre nukleotider. De kan f.eks. og uten begrensning være sekvenser som er karakteristisk for et menneske - eller ikke menneske - patogen (hvilket innbefatter alle infektiøse mikroorganismer, virus eller organismer innbefattet para-sitter, menneske eller ikke menneske (dyr) DNA eller RNA sekvenser så som sekvenser som er karakteriske for en gene-tisk abnormalitet eller annen tilstand, og sekvenser avledet fra gene-spleisings_eksperimenter så som f.eks. total mRNA eller tilfeldige fragmenter av helcelle DNA. Metoder for å identifisere målsekvensen og for å fremstille probeområder er velkjente som vist i de ovenfor nevnte henvisninger. Målsekvensen kan f.eks. også være komplementær med en nuklein-syre som er karakteristisk for en klasse av menneske eller ikke menneske patogener, for eksempel alle enteriske basiller og alle klamydia. Målsekvensen kan også for eksempel være komplementær med en nuklein-syre-sekvens som er karakteristisk for vertscelle eller vektor som brukes i fremstilling av rekombinant DNA produkter, så som for å påvise nærvær av sådan DNA eller RNA kontaminant i produktet. Hybridisering til forskjellige RNA typer er f.eks. beskrevet av Kohne, WO 84-02721, og Draper, Nucl. Acids Res. 13: 989 (1984). Med "komplementær" menes i det vesentlige komplementær, d.v.s.

med tilstrekkelig komplementæritet til å få probeområdet til å hybridisere stabilt med målsekvensen under utvalgte hybridiseringsbetingelser.

Ikke-probe området kan være lineært eller sammen med probeområdet danne en kovalent lukket sirkel. Ikke probe-området tjener til å bære markør-molekyler bundet til kjemisk modifiserte rester. Mange markørmolekyler som er eller omfatter en påviselig rest, er kjente og kan brukes til å feste modifiserte baser i ikke-probe-området til proben ifølge oppfinnelsen. Markørmolekylene kan påvises direkte eller indirekte ved å kontakte markørmolekylene med et annet reagens; f.eks. når markørmolekyletomfatter et enzym vil et slikt annet reagens gjerne være et kolorimetrisk substrat for enzymet. Eksempler på påviselige rester som kan brukes i markørmolekyler i foreliggende oppfinnelse omfatter blant annet isotoper, haptener, fluorescein, rhodamin og andre fluoreserende forbindelser, kjemiluminisens-grupper, lektiner, enzymer så som betagalactosidase, antistoffer og andre proteiner, enten disse er knyttet direkte eller indirekte ved bro-dannelsesteknikker. Affinitetsgrupper som er anvendelig for kobling av påviselige rester til modifiserte rester omfatter biotin og derivater derav, så som iminobiotin, hvilke har en sterk affinitet til avidin.

Polynukleotid-molekyler som brukes ved fremstilling av proben ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles ved kjente teknikker. Disse innbefatter syntetisk og biologiske teknikker. Biologisk syntese innbefatter gjerne kloning av molekyler hvorunder flere kopier "fremstilles" av en vertsmikroorgan-isme.

Kloning i en enkeltkjedet DNA fag så som kolifagen M13 er den foretrukne metode for å fremstille probemolekyler fordi, som beskrevet nedenunder, slik kloning muliggjør rask "scale-up" og et greit middel for påvisning av probeområder før modifisering av ikke-probeområdene. Ml3 er en trådformet, enkel-kjedet DNA virus som brukes i rekombinant DNA forskning. Kloning i M13 er f.eks. beskrevet av Messing, Meth. Enzymol 101:20-77 (1983) og Barnes et al., Meth. Enzymol. 101:98-122

(1983). Andre anvendelige enkjedede fager er, f.eks. S13, G4, phixl74; RNA fager så som QB, MS2, R17 og f2; og fager be-slektet med M13 så som fd og fl. Andre kloningsvektorer innbe fattet plasmider og dobbeltkjedet fag kan brukes, men er mindre foretrukne.

Restriksjons-endonuklease spaltningspunkter som er til-gjengelig for kloning i M13mpl0 og M13mpll e,r f. eks. AccI, BamHI, EcoRI, HincII, Hindlll,Pstl, Sali, Smal, Sstl og Xbal. Andre punkter kan selvfølgelig tilføyes eller skiftes ut. Således kan f.eks. et BamHI-fragment fra hepatit B~virus, hvilket fragment er ca. 1300-1400 basepar og som inneholder determinanten for hepatit B-virus overflate-antigen, klones i BamHI-punktet i M13mpl0 eller M13mpll som probeområdet. Slike virussekvenser er karakteristiske for hepatit B-virus, og påvisning av sådanne i serum eller lever~biopsy er tegn på hepatit B-virus infeksjon. Fortrinnsvis, skjønt ikke nødvendigvis, er størrelsen av M13 DNA med probeområdet innsatt mindre enn ca. 1000 baser lengre enn det opprinnelige M13 DNA.

Før modifisering av polynukleotidet blokkeres probe-området selektivt, eller beskyttes slik at probeområdet ikke vil modifiseres vesentlig. I et eksempel på en utførelses-form av oppfinnelsen utføres denne blokkering ved hybridisering av et første M13 DNA molekyl som inneholder probeområdet (heri kalt M13 probe 1) til et andre M13 DNA molekyl som inneholder et område som er komplementært med probeområdet

(heri kalt M13 probe 2). Slike molekyler kan f.eks. fremstilles ved å klone et dobbeltkjedet DNA fragment som inneholder probeområdet i begge mulige orienteringer innenfor den replikative form av det virale genom, hvilket form er dobbeltkjedet. Ved bruk av standard teknikker produseres avkom-fag, hvor avkommet har enkelt-kjedede genomer. Hver av avkom fagene har en av de to kjeder av probe DNA, d.v.s. en av M13 probe 1 eller M13 probe 2. M13 probe 1 og M13 probe 2 er komplementære med hverandre i probeområdet og kan hybridiseres til hverandre for selektivt å beskytte probeområdet mot deri-vatisering. Hvert av eller begge resulterende polynukleotid molekyler kan anvendes som prober. Eller en av M13 probe 1

og M13 probe 2 kan bindes til en fast bærer før beskyttelses-trinnet utføres. Dette kan oppnås ved kovalent kopling av

DNA, enten direkte eller indirekte, til en fast bærer.

Se f.eks. Moss et al., J. Biol. Chem. 256:12655 (1981).

For eksempel kan M13 probe 1 bindes til cellulose. Så beskyttes området ved hybridisering til M13 probe 2, og de partielt dobbeltkjedede molekyler modifiseres. Etter modifisering dehybridiseres M13 probe 1 og M13 probe 2, slik at M13 probe 1 forblir bundet til substratet. Fag med M13 prober 1 og 2 kan også brukes som "fabrikanter" for ytterligere prober.

Andre selektive blokkeringsmetoder vil være åpenbare for en fagmann. F.eks. kan et lineært polynukleotid med probeområdet isoleres fra et rekombinant plasmid eller dobbeltkjedet DNA bakteriofag. Så kan kjedene skjæres til-bake, f.eks. 3' til 5', hovedsaklig til probeområdet ved behandling med en exonuklease for å fremstille et probemolekyl med et enkeltkjedet ikke-probeområde på omgivende sider av probeområde. Probeområdet beskyttes mot derivat-dannelse fordi det forblir dobbeltkjedet.

Med probeområdet beskyttet, modifiseres det intakte molekylet ved en eller flere enkeltkjede spesifikke reaksjoner før eller samtidig med markering av således modifiserte rester. Enhver enkeltkjede spesifikk, eller i det vesentlige enkeltkjede spesifikk modifikasjons-fremgangsmåte, som gjør det mulig å binde et markørmolekyl til de modifiserte rester, kan brukes. Fortrinnsvis fører den valgte enkeltkjede spesifikke modifikasjonsmetode til modifisering av i det minste ti ganger flere rester i et enkeltkjedet polynukleotid eller område enn i et dobbeltkjedet polynukleotid eller område under spesifikke identiske reaksjonsbeting-elser. Etter modifisering av enkeltkjedeområder av et polynukleotid probemolekyl, kan ethvert antall markører bindes eller kobles til de modifiserte rester før eller etter hybridisering til en prøve som ovenfor omtalt. Noen enkelt-kjede spesifikke reaksjoner vil føre til begrenset modifisering av beskyttede rester, men ikke i slik grad at hybridisering av probeområdet påvirkes vesentlig, med andre ord, probeområdet forblir i det vesentlige fritt for markør- molekyler. Fortrinnsvis modifiseres ikke-probeområdet rester ved biotinylering og markørmolekyler omfatter avidin og en påviselig rest. Fortrinnsvis konjugeres avidinet til et enzym.

Enkeltkjede spesifikke modifikasjons-metoder er kjente. McMaser et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74:4835-4838 (1977) beskriver f.eks. glyoksylering av enkeltkjedede polynukleotidet. Glyoksal binder seg primært til guanadin-rester. Resulterende polynukleotid sykliske dioler kan spaltes med natrium -periodat ved romtemperatur i vandig løsning og danner multiple, reaktive dialdehyder på polynukleotidet. Polynukleotid aldehydet kan omsettes f.eks. med tritiert natriumborhydrid og gi en tritiert markør, eller med et diamin, så som kadaverin, i nærvær av natriumborhydrid og gi et primært amin. Slike primære aminer kan videre f.eks. omsettes med biotinyl-N-hydroksysuksinimid ester for å fremstille en biotinmerket probe.

I en forenklet versjon av det ovenfor beskrevne kobles først et diamin så som adipinsyre-dihydrasid til biotin med f.eks. sulfosuccinimidyl-biotin (Pierce Chemical Company). Det resulterende amin-biotin kan så settes direkte til periodat-oksydert, glyoksylert DNA.

Den foretrukne enkeltkjede spesifikke modifikasjons-metoden er bisulfit-katalysert transaminering. Draper,

Nucl. Acids Res. 12_: 989 (1984), beskriver bruk av denne metoden for å modifisere enkeltkjedet RNA. Se eksempel 3 nedenunder.

Heterobifunksjonelle reagenser kan også brukes for å kryssbinde enkeltkjedet DNA eller modifisert enkeltkjedet DNA med markør. Et eksempel er 4-azidofenylglyoksal som vil samvirke med guanosin i enkeltkjedede nuklein-syrer under milde betingelser. Den således innførte funksjonelle azid-gruppen på DNA vil så reagere med proteiner, f.eks. alkalifosfatase og fluoreseinert serum-albumin i nærvær av ultrafiolet lys for å gi merking av nuklein-syren. Politz, et al., Biochem. 30:372 (1981).

Andre enkeltkjede spesifikke modifikasjonsmetoder er velkjente. En fremstiller av proben ifølge oppfinnelsen kan lett foreta sitt valg blant slike metoder ut fra behov og letthet. Eksempler på modifikasjons-prosedyrer er f.eks. beskrevet i "Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry", Volume II, Academic Press, 1974, ved P.Tso, spesielt 2-90,

av D.M. Brown.

Etter modifisering og eventuell markering fjernes reaktantene og det beskyttede probeområdet denatureres ved kjente teknikker, hvorved probeområdet utsettes for etter-følgende behandling med en komplementær målsekvens.

En hovedfordel ved denne nye anvendelse av enkjede spesifikk kjemi er hvor lett og virkningsfullt probene kan merkes sammenlignet med konvensjonell enzymatisk teknikk for probemerking innbefattet teknikken som er beskrevet av Kourilsky et al., GB 2.019.408. Teknikken er særdeles egnet for "scale-up".

Prober fremstilt ved enkeltkjede spesifikke kjemiske modifikasjonsteknikker er fordelaktig fordi markørens nærvær ikke vesentlig interfererer med hybridisering av probeområdet for målsekvenser og derved gjør slik hybridisering meget virkningsfull. Videre kan enkeltkjede spesifikk modi-fikasjon også brukes til å markere opp til 80 - 90% av alle ikke-probeområdebaser, mens vanlige teknikker, så som utstrakt merking i uakseptabel grad kan interferere med hybridisering av probeområdet og kan være altfor kostbare. I proben ifølge oppfinnelsen kan således mer markør tilveiebringes for påvisning etter hybridisering. Modifikasjoner av baser i ikke-probeområder reduserer også bakgrunnen ved å minimalisere ikke-spesifikk hydrogenbinding av ikke-probeområde base og stabiliserer probene mot nedbrytning så som ved innvirkning av nukleaser. Probene ifølge oppfinnelsen behøver ikke merkes bare i stillinger som ville minimalisere interferens med hybridisering, så som beskrevet av Ward et al., EP-A-63.879. Faktisk kan markering ved andre stillinger ytterligere redus-ere bakgrunnshybridisering, spesielt for naturlig forekommende genomisk materiale eller nukleinsyre gene-produkt som kan være komplementært med ikke-probeområde.

Probene ifølge oppfinnelsen egner seg for pakking i et sett som ganske enkelt kan bestå av en beholder med probe,

så som en puffert-løsning, eller som kan omfatte flere ytter-bestanddeler i separate beholdere anvendelig for bruk av proben ifølge oppfinnelsen. Bestanddelene i settet vil avhenge av den tilsiktede bruk av proben samt valget av mar-ørmolekyler. Slike sett kan omfatte proben og andre reagenser så som markørmolekyler (hvis proben ikke er forut markert), reagenser og materialer som muliggjør hybridisering og påvisning og/eller kvantifisering av målsekvenser og reagenser og materialer for manipulering av målsekvenser før påvisning. Slike sett kan omfatte proben ifølge oppfinnelsen modifisert med f.eks. biotin og rettet mot DNA eller RNA frekvenser,

så som sekvenser som er spesifikke for human cytomegalovirus, og markørmolekyler, så som et avidin-alkali_fosfatase eller peroksidase-konjugat, slik at enzymet vil bindes til eller på annen måte påvise hybridiserte probemolekyler. I tillegg kan et reagens for påvisning av markørmolekyler, så som et substrat for enzymet, fortrinnsvis et kolorimetrisk substrat, inntas i settet i en separat beholder. Slik reagens kan f. eks. når markøren er alkalifosfatase inneholde løsninger av nitroblått tetrazolium i 50% N.N-dimetylformamid; vann og

5-brom, 4-klor, 3-indolylfosfat i dimetylformamid. Alterna-tivt kan «.proben være for-markert, så som med biotinylering og kobling av et avidin enzym-konjugat, i hvilket tilfelle settet kan inneholde proben i e"n beholder, og reagenset for påvisning av markørmolekyler i en annen beholder. Standarder og/eller utstyr for nøyaktig kvantifisering av mengden spesifikk probe bundet til målsekvensene kan også inngå. Et mer utviklet sett kan omfatte merkede prober som er spesifikke for to eller vanligere etiologiske reagenser for et sykdomssyndrom så som meningit eller venerisk sykdom. I tillegg til markørmolekylen og substratene, kan dette mer komplekse sett inneholde flere forskjellige prober for forskjellige målsekvenser. Et slikt sett vil muliggjøre identifisering av et infeksjonsreagens

samt klassifisering av infeksjonsreagenset i underklasser .

Et slikt mer kompleks sett kan videre omfatte utstyr og reagenser som er anvendelig for mer detaljert analyse av målsekvensene. F.eks. kan analyse av familiære genetiske for-styrrelser eller andre genetiske trekk eller tendenser under-søkes ved restriksjon og gel-elektroforetisk analyse av kromosomalt DNA som stammer fra en pasient. Et slikt sett kunne inneholde restriksjonsenzymer, restriksjonsenzym-puffere,

en elektroforese-matrise (f.eks. agarose og akrylamid) samt andre reagenser for fremstilling av kromosomalt DNA, så som reagenser for celle-lysing og ekstraksjon av nuklein-syre fra slike før restriksjonsanalyse. De ovenfor beskrevne bestand-deler av settet ifølge oppfinnelsen er bare illustrerende. Andre reagenser og materialer og kombinasjoner av reagenser og materialer vil være åpenbare for en fagmann.

De følgende eksempler er illustrerende for oppfinnelsen og ikke å anse som begrensende.

Eksempel 1.

Enkelt- kjede spesifikk modifisering.

Glyoksylering. Enkelt-kjedet M13 CA2 DNA (25 yg i

25 yl av 0,1 M NaP04, pH 7,0) ble omsatt med 1/5 volum av en ionefri 6 M vandig løsning av glyoksal ved 50°C i en time,

i det vesentlige som beskrevet av McMaster et al., Proe. Nati. Acad. Sei 74: 4835 - 4838 (1977), bortsett fra at dimetyl-sulfoksid-denaturant ikke ble brukt. Reaksjonsblandingen ble fortynnet til et volum på 100 ul ved tilsetning av iskald NaP04puffer (pH 7,0). Det resulterende modifiserte, d.v.s. glyoksylerte, DNA ble renset ved sentrifugal eluering gjennom et 1 ml skikt av Sephadex G-50 gel (Pharmacia) i 0,1 M NaP04(pH 7,0).

Periodat- spaltning. 20 ug av det glyoksylerte DNA ble overført til reaktivt aldehyd DNA ved periodat-spaltning (oksidasjon) hovedsaklig som beskrevet av Wilson et al., Immunofluoresence and Related Staining Techniques, ed. av Knapp et al., 1978, Elsevier/North Holland Biomedical Press side 215-224 (1978). Ti ul av 1,0 M natrium meta-periodat (NamlOj ved 50°C ble satt til DNAet i 90 u'l NaPO. puffer og inkubert ved romtemperatur (21 oC) i 30 min. under leilig-hetsvis rysting. Reaksjonsblandingen som inneholdt aldehyd DNA ble så dialysert natten over ved 4°C mot tre forandringer av 500 ml 10 mM NaP04(pH 7,0).

Diamin- tilsetning. Kadaverin (1,5-diaminopentan) ble koblet til aldehyd DNAet ved en teknikk som brukes for å konjugere periodat-oksyderte glykoprotein-enzymer, f.eks. peroksydase, til epsilon amino-grupper på immunoglobulin G-molekyler beskrevet av Wilson et al., angitt ovenfor. Kadaverinfri base ble fortynnet til en 1 M konsentrasjon

med 0,5 M NaH2?04. Ti ul av kadaverin-løsningen ble satt til 9 0 ul 0,1 M NaP04(pH 7,0) som inneholdt 10ug aldehyd DNA. Schiffs basedannelse fikk forløpe i 2 timer ved 21°C, pH 12,0, hvoretter bindingen ble overført til kovalent-binding ved reduksjon med 15 ul 0,25 M NaBH4i 0,5 M NaOH. Reduksjonen ble avbrudt etter 2 timer ved 4°C ved eksklusjons-

kromatografisk separasjon av DNA-produktet fra de små reagenser på en 4,5 ml kolonne av P-60 harpiks (BioRad) i 20 mM NaP04, 2 mM etylendiaminetetra-acetat (pH 7,0). Fraksjoner som inneholdt det ekskluderte materiale (kadaverin-merket DNA) ble slått sammen, dialysert mot 30 mM trietanolamin:acetat (pH 7,6) (TEA) og konsentrert ved dialyse mot tørr Sephadex G-200 gel (Pharmacia).

Biotinylering. Tilgjengelige aminer i det kadaverin-merkede DNA ble biotinylert hovedsaklig etter fremgangsmåten til Leary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 80:4045-4049 (1983)

for biotin-merking av alkalisk fosfatase. Biotinyl- epsilon-aminokapronsyre N-hydroksysuccinimid ester (BACSE), (se Costello et al., Clin. Chem. 25:1572-1580 (1979) ble oppløst i N.N-dimetylformamid for å fremstille en 20 mg/ml løsning av BACSE. To Pl av løsningen ble satt til 1,5 yg av amin DNAet i 150 ul 30 mM TEA, to ganger ved 30 min. intervaller, under forsiktig røring ved 4°C. Reaksjonen ble avsluttet etter 2,5 timer ved tilsetning av 10 yl Tris:glycin-puffer (0,1 M Tris, 58 mg/ml glycin, pH 7,8). Biotinylert DNA ble renset ved eksklusjons-kromatografi pp P-60 harpiks som beskrevet ovenfor. Fraksjoner som inneholdt biotin ble identi-fisert ved å sette 1<y>l av hver fraksjon på dietylaminoetyl-papir og den kolorimetriske alkalie fosfatase-målingen til Leary et al., som er angitt ovenfor.

Produktet (< 3<y>g ) ble bekreftet å være enkeltkjedet biotinylert DNA ved bestandighet overfor basehydrolyse, agarose gel-mobilitet, ultrafiolet absorbsjonsspektre og evne til å binde avidin:enzym-komplekser som ifølge Leary et al., angitt ovenfor.

Det ovennevnte er illustrerende for en fremgangsmåte for kjemisk modifisering av DNA med en enkeltkjedet spesifikk reasjon. Fremgangsmåten kan brukes til å merke en polynukleotid probe ved først å hybridisere probeområdet ved kjente teknikker, og selektivt beskytte probeområdet og deretter anvende enkeltkjede spesifikk kjemi så som ovenfor beskrevet. Ved å anvende den ovenfor illustrerte kjemiske modifikasjons- metoden på et polynukleotid med et beskyttet probeområde, utføres diamin-tilsetningstrinnet ved en mildere pH, f.eks.

ca. 8 - 9, istedenfor ved pH 7, f.eks. ved titrering av kadaverinfri base til en pH på ca. 9,5 med 1 N HC1 og anvende nøytrale løsninger av NaBH^.

Proben brukas til å påvise nærvær av et spesifikt nukleotid-molekyl i en forsknings-, klinisk eller industriell prøve ved kjente teknikker, hvilket innbefatter merking av proben før eller etter hybridisering og måling av hybridisering av proben til målsekvensen.

Eksempel 2.

Sammenligning av LT prober.

En probe ifølge oppfinnelsen (A), en andre probe som ikke var modifisert (B) og en tredje probe som var modifisert i probe og ikke-probeområder (C) ble sammenlignet ved å hybridisere probene til et første prøve DNA uten komplementæritet, et andre prøve DNA med komplementæritet i probe-området og et tredje prøve DNA med komplementæritet i ikke-probeområdet.

Før modifisering av probene, ble probene merket med

<32>P for å muliggjøre sammenligning av hybridisering som følger. Enkelt-kjedede M13 DNA ringer inneholdende en del (750 baser) av E. coli varme-labil toxin (LT) (M13 probe 1) (10 yg) ble lineærisert ved spaltning ved 0°C med DNAase 1 (12,5 ng) i 100

yl 50 mM TrisrHCl, pH 7,5, 5mM Mg Cl„, 0,05 mg/ml bovine serum albumin. DNA ble så merket med<32>P på 5 merket endene

32

med standard metode ved bruk av gamma P-dATP og polynukleotid kinase (se f.eks. Maniatis et al., (eds.) 1982,

Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Det resulterende DNA hadde en spesifikk radioaktivitet på 1x10<7>dpm/ yg og inneholdt en sekvens (probeområde) som representerer en del av det E. coli labile toxin (LT) gen.

Beskyttelse av probeområdet. En y.g av det 3 2P merkede M13 probe 1 DNA ble blandet med 1 yg enkelt-kjedet M13 DNA ringer inneholdende et område (750 baser) som var komplementært til probeområdet i M13 probe 1 (ml3 probe 2). Blanding-ene ble oppvarmet til 65°C i 25 yl 0,1 M NaP04puffer, pH 7,0, i 10 minutter og fikk herde (eller hybridisere) ved 50°C i 1 time og danne den dobbeltkjedede form av probeområdet, idet ikke-probeområder hovedsaklig forblir enkelt-kjedede.

Modifisering. Probe DNA blandinger fremstilt som ovenfor ble behandlet i alternativet med puffer alene, 2 M glyoksal, eller 2M glyoksal pluss 50% DMSO ved 50°C i 1 time i 0,1 NaPO^, pH 7,0, for henholdsvis å danne,

(A) ikke-modifisert polynukleotid probe,

(B) probe som bare var modifisert i ikke-probeområdet, (C) probe modifisert i både ikke-probe og probeområdene. Hybridiseringsprøver. Probene A, B og C ble hybridisert til 5 prøve DNAer (flekk plotter) som ifølge Leary et al., Proe. Nati. Acid. Sei. 8^:4045-4049 (1983) ved varmedenaturering og hybridisering på nitrocellulose-filtre ved bruk av 25 ng probe DNA pr. ml hybridiseringspuffer inneholdende 50% formamid. To prober A, en probe B og en probe C (5 yg hver) ble hybridisert til 5 ng, 1 ng, 0,2 ng, 40 pg og 8 pg av hver av prøve DNAene. Prøve DNAene er beskrevet i den følg-ende tabell.

Hybridisering ble utført ved 42°C i 17 timer, hvoretter filtrene ble vasket og utsatt for Kodak X-AR-røntgenfilm for å identifisere prøvene som bandt radioaktivt probe DNA.

Samlede resultater av hybridiseringseksperimentet er angitt i den følgende tabell hvor (-) angir at ingen hybridisering ble påvist, (+++) viser meget sterk hybridisering og

( + ) og (++) viser svak hybridisering og sterk hybridisering henholdsvis. (Probe B er proben ifølge oppfinnelsen. Probe A er ikke modifisert. Probe C er modifisert i alle områder.)

Prøve DNA

Som vist, hybridiserte probe A, den ikke-modifiserte polynukleotid-probe, meget sterkt til prøve DNA 4, sterkt til prøve DNAer 2 og 3 og svakt til prøve DNAer 1 og 5.

Probe B, polynukleotid-proben som er modifisert i ikke-probeområdet, hybridiserte sterkt til prøve DNA 3, hovedsaklig i samme grad som den ikke-modifiserte probe. En ca. 100 ganger reduksjon av hybridisering til forsøks DNA 4 ble observert. Ingen hybridisering til DNAer 1, 2 eller 5 ble observert.

Probe C, polynukleotid-probe modifisert i alle områder hybridiserte ikke signifikant til noe prøve DNA med unntak av meget svak hybridisering til prøve 4.

Den enkelt-kjede spesifikke modifisering senket således ikke spesifikk hybridisering til ikke-probe område komplementære sekvenser eller ikke-beslektede sekvenser med størrelses-orden ca. 2 ganger, mens probeområdets evne til å hybridisere til målsekvensen ble bibeholdt.

Eksempel 3.

Fremstilling av human beta- globin gene- prober.

En probe ifølge oppfinnelsen som er spesifikk for human beta-globin gene ble merket med haptenet, dinitrofenol (DNP}, ved bruk av metoden i oppfinnelsen.

Beskyttelse av probeområdet.

85 ug enkeltkjedet M13 probe 1 DNA (M13 stamme mpl017) inneholdende 1310 baser komplementære til betaglobingene ble blandet med 85 yg enkeltkjedet Ml3 probe 2 DNA (M13 stamme mpll35) i 0,4 ml løsning inneholdende 10 mM etylen-diamin - tetraacetat (EDTA) pH 8,0; 0,6 NaCl og 0,06 M natrium-citrat. Blandingen ble oppvarmet til 100°C i 2 min. og fikk så hybridisere ved 65°C i 3 timer. Det beskyttede probe DNA ble i det vesentlige renset ved to gangers utfelling metanol og til slutt oppløst i 0,16 ml 10 mM NaP04, l,0mM EDTA ph 7,0.

Modifisering.

Det beskyttede probe DNA ble modifisert ved bisulfit-katalysert transaminering med etylen-diamin hovedsaklig som beskrevet av Draper, Nucl. Acids Res. 12: 989 (1984) og som forklart nedenunder. 50 .yl DNA blanding ble blandet med 0,45 ml av en løs-ning av Na2S205(1,59 M) og etylen-diamin (2,8 M)ved ph 6,0. Blandingen ble inkubert ved 42°C i 1,5 timer og så avkjølt på is. PH ble justert til 8 - 8,5 ved tilsetting av 60 yl 0,5 N NaOH og inkubering på is ble fortsatt i 30 minutter. Det etylenmerkede DNA ble separert fra reaktantene ved dialyse mot 30 mM trietanolamin-puffer, pH 7,6.

Kovalent-binding av DNP haptenet til aminaduktet ble utført ved å oppløse 25 mg DNP-N-hydroksysuccinimid-ester i 0,5 ml dimetylformamid og tilsatt 10 yl av dette reagens til 0,6 ml dialysert, aminmerket DNA, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Det DNP merkede DNA ble så renset fra reaktantene ved å ekstrahere blandingen 6 ganger med et tilsvar-ende volum kloroform:isoamyl-alkohol (24:1) og utfelle den vandige fase med etanol. Den endelige gule DNA utfelling ble oppløst i 100 yl 10 mM Tris: HC1, 1 mM EDTA, pH 7,5. Biotinmerket DNA prober ble fremstilt på lignende måte ved å bruke biotinyl-aminokaproyl-H-hydroksysuccinimid-ester istedenfor DNP-N-hydroksysuccinimid ester.

Hybridiseringsprøver.

Hybridisering ble bestemt ved forandringer i elektroforetisk mobilitet i agarose geler etter blanding av probe og mål DNAer og inkubere ved standard hybridiseringsbetingelser. Den DNP merkede probe ble vist å hybridisere til et plasmid (pHBC6) inneholdende human betaglobingeneprodukt,

Fukumaki et al., Cell 28:585 (1982), men hybridiserte ikke til DNA prøver som var komplementære til ikke-probe-område til probene.

Påvisning av DNP merkede prober.

DNP merket DNA ble seriemessig fortynnet i 0,6 M NaCl, 0,06 M natrium-citrat og bundet til nitrocellulose-filter ark ved bruk av en Minifold "Slot-Blot" apparatur (Schleicher and Schuell, Keene, New Hampshire). Lokalisering av DNP merket DNA ble bestemt ved bruk av antiserum mot DNP

(Gateway Immunosera Co., St. Louis, MO) og alkalisk fosfatase-konjugert geite anti-kanin IgG (Cappel Labs., Cochranville, PA) hovedsaklig som beskrevet av Tchen et al., Proe. Nati. Acid Sei. US. 8J_: 3466 (1984) for DNA modifisert med et annet hap-ten (AAIF). En påvisnings-sensitivitet på mindre enn 50 pg av DNP merket DNA ble oppnådd.

Selv om oppfinnelsen og dens foretrukne utførelsesformer er fullstendig beskrevet ovenfor, skal det være klart at oppfinnelsen omfatter alle fremgangsmåter og modifiseringer som faller innenfor omfanget av de etterfølgende krav.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en polynukleotid-hybridiseringsprobe, karakterisert ved at man selektivt beskytter et probeområde innenfor et enkelt-kjedet polynukleotid med hybridisering av probeområde til en komplementær sekvens før modifisering av polynukleotidet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det enkeltkjedede polynukleotid bindes direkte eller indirekte til en fast bærer før probeområdet beskyttes selektivt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man modifiserer proben ved transaminering etter selektiv beskyttelse av probeområdet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man modifiserer proben ved biotinylering etter selektiv beskyttelse av probeområdet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at de modifiserte rester merkes med en markør omfattende avidin konjugert til en påviselig rest.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender et komplementært probeområde til en human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens fra en humanpatogen eller en klasse av humanpatogener.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et komplementært probeområde til en ikke-human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens for et ikke-humant patogen eller en klasse av ikke-human patogener.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et probeområde komplementært til en DNA eller RNA sekvens sekvens karakteristisk for en vertscelle eller for en vektor som brukes ved fremstilling av et rekombinant DNA produkt.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som probe anvendes enkeltkjedet fag DNA eller RNA med et probeområde deri.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det som enkeltkjedet fag DNA eller RNA anvendes Ml3 DNA.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det enkeltkjedede polynukleotid bindes direkte eller indirekte til en fast bærer før probeområdet beskyttes selektivt .

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man modifiserer proben med transaminering etter selektiv beskyttelse av probeområdet.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man modifiserer proben ved biotinylering etter selektiv beskyttelse av probeområdet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at de modifiserte rester merkes med en markør omfattende avidin konjugert til en påviselig rest.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes et probeområde komplementært til en human DNA eller RNA sekvens eller en karakteristisk nukleinsyresekvens fra et humanpatogen eller en klasse av humanpatogener.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en ikke-human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens fra et ikke-humant patogen eller en klasse av ikke-humanpatogener.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes et probeområde komplementært til en DNA eller RNA sekvens karakteristisk for et vertscelle eller en vektor som brukes ved fremstilling av et rekombinant DNA-produkt.

18. En polynukleotid-hybridiseringsprobe karakterisert ved at ikke-probeområdet er selektrivt modifisert for kopling av markørmolekyler.

19. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at den har markørmolekyler koplet til modifiserte rester.

20. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved transaminering.

21. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved biotinylering.

22. Probe ifølge krav 21, karakterisert ved at de modifiserte rester er merket med en markør omfattende avidin konjugert med en påviselig rest.

23. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en human DNA eller RNA sekvens eller en karakteristisk nukleinsyresekvens fra et humanpatogen eller en klasse av humanpatogener.

24. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en ikke-human DNA eller RNA sekvens eller en nukleinsyresekvens karakteristisk for et ikke-human patogen eller en klasse ikke-humanpatogener.

25. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at probeområdet er komplementært med en DNA eller RNA-sekvens karakteristisk for en vertcelle eller vektor som brukes ved fremstilling av et rekombinant DNA-produkt.

26. Probe ifølge krav 18, karakterisert ved at den omfatter enkelt-kjedet fag DNA eller RNA med et probe-område innsatt deri.

27. Probe ifølge krav 26, karakterisert ved at det enkeltkjedede DNA eller RNA er M13 DNA.

28. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at den har markørmolekyler koplet til modifiserte rester.

29. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved transaminering.

30. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved biotinylering.

31. Probe ifølge krav 30, karakterisert ved at de modifiserte rester er merket med en markør omfattende avidin konjugert med en påviselig rest.

32. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens fra et humanpatogen eller en klasse humanpatogener.

33. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en ikke-human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens fra et ikke-humant patogen eller en klasse av ikke-humanpatogener.

34. Probe ifølge krav 27, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en DNA eller RNA sekvens karakteristisk for en vertcelle eller vektor som brukes ved fremstilling av et rekombinant DNA produkt.

35. Sett karakterisert ved at det omfatter proben ifølge krav 18.

36. Sett karakterisert ved at det omfatter proben ifølge krav 19.

37. Sett ifølge krav 35, karakterisert ved at det videre i en separat beholder omfatter markørmolekyler.

38. Sett ifølge krav 36, karakterisert ved at det videre i en separat beholder omfatter et reagens for påvisning av nærvær av markørmolekyler.

39. Sett ifølge krav 37, karakterisert ved at en separat beholder videre omfatter et reagens for påvisning av markø rmolekyler.

40. Sett ifølge krav 37, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved transaminering.

41. Sett ifølge krav 37, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved biotinylering og markør- molekylene er avidin konjugert til et enzym.

42. Sett ifølge krav 35, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens for et humanpatogen eller en klasse av humanpatogener.

43. Sett ifølge krav 35, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en ikke-human DNA eller RNA sekvens eller til en karakteristisk nukleinsyresekvens for et ikke-humant patogen eller en klasse av ikke-humanpatogener.

44. Sett ifølge krav 35, karakterisert ved at probeområdet er komplementært til en DNA eller RNA sekvens karakteristisk for et vertcelle eller vektor som brukes ved fremstilling av et rekombinant DNA-produkt.

45. Sett ifølge krav 35, karakterisert , ved at proben er enkelt-kjedet fag DNA eller RNA med et probe-område innsatt deri.

46. Sett ifølge krav 44, karakterisert ved at det enkeltkjedede fag DNA eller RNA er M13 DNA.

47. Sett ifølge krav 46, karakterisert ved at proben er selektivt modifisert ved transaminering.

48. Sett ifølge krav 46, karakterisert ved at ikke-probeområdet er selektivt modifisert ved biotinylering .

49. Sett ifølge krav 48, karakterisert ved at det videre i en separat beholder omfatter avidin konjugert til et enzym for bruk som markørmolekyler.