NO164384B - Fremgangsmaate og reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsoeksmedium som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer. - Google Patents

Description

•Fbr.e.l iggen;de oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og et reage.nssy.stem for detektering av en spesiell polynukleo.tidT sekvens i et forsøksmedium som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer. Prinsippet for nukleinsyre-hybridiseringsana-ay.ser/'.;bl:e utviklet ved arbeider Innen f eltet .rekombinant DNA-foriskning for. å bestemme, og isolere spesielle poly-nukl>é6tide basesekvenser av interesse..Det ble funnet at enkeltk jede.te nukleinsyrer, f .eks.. DNA. og RNA, slik de oppnås ved å..denaturere de dobbeltkjedete formene, vil hybridisere eller rekombinere under egnete betingelser med komplementære enkelkjedete..nukleinsyrer. yed, å merke slike komplementære probenukleinsyrer med en lett detekterbar kjemisk gruppe, bie< detr gj.ort-mulig, å detektere, nærvær a<y> en hvilken som helst •<p>bl<y>nukleotidsekvens av interesse, i et forsøksmedium som inne-'hoTdér.prøvenukleinsyrer i enkelt:k,jedet form.

I tillegg til feltet rekombinant DNA kan den. analytiske hybri-diseringsteknikken anvendes til detektering av viktige poly-hukieotider innen feltene human-,og veterinærmedisin, jordbruk-og næringsmiddelvitenskap,. bl.a. Spesielt kan teknikken benyttes til - å-detektere og,identifisere etiologiske agenser som f.eks. bakterier og virus, å undersøke bakterier angående antibiotisk resistens, som en hjelp i diagnosen av genetiske sykdommer, som: f-.eks-. sigdcelleanemi og thalassemia, og til detektering

'av kreftceller^ En generell oversikt over teknikken og dens

nåværende-og.' fremtidige betydning, finnes i Biote.chnology

1 (.August; 1983) , ; side 471^478 ..

Teknikkens stand når det gjelder nukleinsyre-hybridiseringsana-lyseteknikker innbefatter kjemisk modifisering av enten probenukleinsyren ;eller^ prøvenukleinsyren, for merking og detektering. Nødvendigheden, av kjemisk modifisering av nukleinsyrene be-1'gré'nsér i. stor grad den praktiske bruk ay teknikken siden det \kréver-storskala.fremstilling av merkete prober som innbefatter kompliserte og dyre. syntese - og renseprosedyrer eller in situ-■synteserav merkete prøvenukleinsyrer av den som skal benytte 'analysen'..- Spesielt må det resulterende merkede polynukleotid beholde-evnen til å .hybridisere effektivt med dets komplementære prøve- eller probesekvens. Et slikt krav begrenser i stor grad tilgjengeligheten av nyttige syntesefremgangsmåter for:å merke modifikasjoner åv pblyriukleotider som skal brukes i hybridi-seringsairalyser.

De tidligere hybridiseringstéknikkene innbefattet bruk ay radio.r

3 32 125

aktive merker som f.eks. H, P og I. Merkete prober syntetiseres enzymatisk fra radioaktivt merkete nukleotider og et poiyriukleotid ved teknikker som f.eks.. nick-translasjon,, . endemerking, annenkjedesyntése,reversert transkripsjon og =. transkripsjon. Et ekstra krav til slike enzymatiske!metoder,

er derfor at de modifiserte eller merkete polynukleotidene■må

tjene som effektive substrater for polymeraseenzymene som,er, innbefattet i sammenstillingen av det merkete polynukleptidet. Direkte kjemisk modifisering av polymuikleotidét. er også,mulig,, men en slik metode er ineffektiv rear det gjelder åi irakar por; exe merker i polynukleotidet og kam påvirke polyaukleotidets evne til å undergå hybridisering. >

På grunn av 'ulempene' ved. håndtering og 1 a g r i ngi.. asy raidliipaifctiiyt merkede-materialer, har det vært nedlagt et betydelig. arbeid, f pr..å ut-, vikle nyttige "ikke-radioisotope merkef remgangsmåter,. Slike merker har innbefattet lysémitterende.molekyler, som f.eks.: fluorescerende-og kjémiluminiscerende stoff, og ligandmolekyler som er i stand til spesif ikkbinding ved tilsvarende bindende forbindelser som igjen er merket med detekterbare-kjemiske; grupper, som f.eks. fluoriscerende grupper og enzymer.. Eksempler på lignadmerker er haptener, som spesifikt bindes yed:antistoffer,

og andre små molekyler som har spesifikt bindende proteiner,

f .eks. biotin' som bindes av avi din; r..

Britisk patent rir. 2,019,408 beskriver polynukleotide prober

som er merket med biotin ved cytokrbm C bindegrupper; iog, sqnv så

er detekterbare ved enzym-merket avidin. En alternativ . f r,em-gangsmåte til merkingen av prober med ligander av lav molekylvekt, som f.eks. biotin, beskrives i europeisk patentpublikas;jp.n.j53, 879.

I denne teknikken kondenseres 5-allylamin-deoksyuridin-trifos-

fat (dUTP) derivatér med det ønskete ligandmerke og de .slik modifiserte nukleotidéne inkorporeres ved standard enzymatiske

.metoder..,i, den ønskete proben. Bruk-av lysemitterende merker .foreslås.,i europeisk patentpublikasjon nr. 7Q,685. og .70, 687. Andre ^eksempler. på pat.entlitteratur som angår hybridiseringsteknikker, . er, U;.S... patent nr. 4,302,204 som angåribruk av visse vannopp-, løslige poly sakkar ider for å akselerere hybridiseringen på. en fast ,fase; 4,358,535 angår, deteksjon av patogener i kliniske prøver;-og 4,395,486 vedrører deteksjon av sigdcelleanemisppr ved bruk av en syntetisk oligonukleotidprobe.

Teknikker.for direkte detektering av polynukleotiddupleksen dannet som produkt ved hybridiseringen mellom prøven og probe-.nukleotidet, og derved overflødiggjørelse av den.kjemiske merkingen a<y> det ene eller det andre.polynukleotid, har generelt ikke ført frem..Forsøk på å generere antistoff som selektivt binder.dobbeltkjedete DNA/DNA-hybrider fremfor enkeltkjedet DNA har,ikke ført frem [Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", ed. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY(1969)

side 18 et seg]. En viss suksess er oppnådd ved generering av antistoffer som binder RNA/DNA-blandete hybrider og som har lav.affinitet for enkeltkjedete polynukleotider [Rudkin og Stollar, Nature 265:472(1977); Stuart et al, PNAS(US))78:3751(1981);

Reddy og Sofer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 103:959(1981); og.Nakazato, Biochem. 19:2835(1980)], men følsomheten ved disse metodene har ikke nådd de nivåer som kreves for kliniske hybri-diserings forsøk og man ville måtte bruke RNA-prober som man vet er svært ustabile.

Følgelig foreligger det.et erkjent behov for en teknikk for detektering av hybridisering uten at det kreves kjemisk modifi-.kasjpn av polynukleotider eller som innbefatter en relativt

enkel merkemetode. Videre bør en slik teknikk muliggjøre bruk av forskjellige merker, spesielt av ikke-radioisotop type. Tilveiebringelse av en nukleinsyre-hybridiseringsanalysemetode bg et reagenssystem som har disse og andre fordeler er hoved-hensiktene ved foreliqaende oppfinnelse.

U.S. patent nr. 4,257,774 beskriver en fremgangsmåte for detektering av forskjellige forbindelser som vekselvirker med nukleinsyrer, spésielt forbindelser som mistenkes som mulige'mutagener eller karsinogener, ved å måle slike forbindelsers evne til'å inhibere bindingen av interkalatorer som f.eks. akridinorange til nukleinsyrer. Poirier, M.C. et al (1982) PNAS 79:6443-6447 beskriver fremstillingen av et monoklonalt antistoff selektivt for visse cis-platiria/dobbeltkjedete DNA-komplekser fremfor den frie cis-plåtina-forbindelse og dobbeltkjedet DNA.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøks-.: medium som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer, som innbefatter trinnene kombinering av forsøksmediet med (i) en nukleinsyreprobe som innbefatter minst en enkéltkjedet båsesekvens som idet vesentlige er komplementær med sekvensen somskal bestemmes i<:>forsøksmediet, under betingelser som er fordelaktige for hybridisering mellom sekvensen som skal bestemmes og den komplementære sekvensen i proben og bestemmelse'av den' hybridiserte probe. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at<*>det også tilsettes en nukleinsyreinterkalator som enten kombineres med forsøksmediet som en separat, fri forbindelse og bindes' ikke-kovalent med dobbeltkjedet nukleinsyre, slik at det<:>dannes interkaleringskomplekser, eller som er kjemisk bundet 'til proben i det enkeltkjedede komplementære området av proben'/ hvorved interkaleringskompleksene dannes i slike områder ved hybridiseringen, bg nærvær av hybridisert probe detekteres" ved tilsats av et antistoff, eller et fragment derav, som er

i stand til å reagere med interkaleringskomplekser i det resulterende hybridiseringsprodukt, mén ikke med interkalatoren alene eller med interkalatoren bundet til enkéltkjedet nukleinsyre og bestemmelse 'av antistoffet eller fragmentet derav' som-', bindes til slike komplekser.

Bruken av nukieinsyre-hybridisering som et analytisk verktøy er fundamentalt basert på den dobbeltkjedete, dupleksstrukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- bg pyrimidin-basene • i de respektive kjeder i dobbeltkjedet DNA kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som oppstår ved denne smeltingen eller denatureringen av DNA vil assosieres (også kalt rekombinering-eller hybridisering)- slik--at dupleksstrukturen i igjen.dannes. Som kjent vil kontakt av en første enkelkjedet

•nukleinsyre, enten-DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens

.som :er.tilstrekkelig komplementær til (d.v.s. "homolog med")

.■.en andre enkéltkjedet nukleinsyre under egnete oppløsningsbeting-elser:-.gi dannelse av DNA/DNA, RNA/DNA, eller RNA/RNA-hybrider.

Foreliggende oppfinnelse .muliggjør deteksjon av dannete hybrider ved innføring av en immunogen modifikasjon av dobbeltkjedet nukleinsyre i områder for hybridisering eller i tilgrensende områder. Det resulterende produkt kan så detekteres ved konvensjonelle analysemetoder basert på bindingen av spesifikke antistoffer til epitoper eller antigeniske determinanter som dannes på hybridiseringsproduktet. Den nødvendige immunogene modifi-kasjonen av dobbeltkjedet nukleinsyre oppnås først og fremst ved binding av et molekyl, vanligvis en forbindelse med lav molekylvekt, til dupleksen. En slik binding gir dannelse av en antigenisk determinant som skiller dobbeltkjedet nukleinsyre fra-både enkéltkjedet nukleinsyre og det frie, ubundne modifi-seringsmolekylet. Fortrinnsvis oppnås dette ved å anvende en modifiseringsforbindelse som i det vesentlige er ute av stand til binding med enkéltkjedet nukleinsyre og som danner et bindings-kompleks med dobbeltkjedet nukleinsyre som endrer det normale spiralforholdet mellom komplementære kjeder av dupleksen.

Et modifiseringsmolékyl som beskrevet her er en nukleinsyreinterkalator som fortrinnsvis vil vekselvirke med den normale nukleinsyrespiralen ved en ikke-kovalent innføring mellom base-

par^ En slik innføring forårsaker, ved denne foretrukne vekselvirkningen, at den tertiære strukturen av spiralen forandres ved oppvikling og forlengelse langs spiralaksen. En skjematisk illustrasjon av denne foretrukne interkaleringsvekselvirkningen er "vist i'fig. 1 i tegningene. Det resulterende:ihterkalerings-komplekset er kjennetegnet ved nydannete antigeniske determinanter som innbefatter den interkalerte modifiseringsforbindelsen

og de<1>reorienterte fosfodiesteraseryggradene i de respektive kjeder av dupleksen.

Fortrinnsvis er interkaleringsforbindelsen et av de generelt plane, aromatiske organiske molekylene som er kjent for å

danne interkaleringskomplekser med dobbeltkjedete nukleinsyrer. Slike forbindelser er f.eks. akridinfargestoffer, f.eks. akridim-orange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furokumariner, fenotiaziner, qiiinoliner, o.l. som beskrives mer detaljert nedenfor. Det skal bemerkes; at selv om foreliggende oppfinnelse heretter beskrives med spesiell referanse til slike interkale-ringsf orbindelser omfatter foreliggende oppfinnelse også anvendelse av ekvivalente modifiseringsmolekyJer som, som beskrevet ovenfor, vil bindes til dobbeltkjiedete nukleinsyrer slik at det induseres en immunogen forandring i dupleksen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan interkalatoren kombineres

med forsøksmediet, og derved eksponeres til den dobbelkjedete nukleinsyre som er tilstede, og/eller i hybridiseringsreaksjons-blandingen dannes som en separat fri forbindelse og bindes ikke-kovalent til slike dobbeltkjedete nukleinsyrer slik at det dannes interkaleringskomplekser-. Alternativt kan interkalatoren bindes med kjemiske bindinger, fortrinnsvis kovalente- bindinger, til proben.. I det første tilfellet tilveiebringer' foreliggende-oppfinnelse en. f.remgangjsmåte for utførelse av em h.ybr.'idi.sering;s-analyse uten behov for å kjemisk modifisere', hverken prøven eller probenukleotidet for å detektere' hybridiseringu. r det. sistnevnte tilfelle tilveiebringes- en enkel, syntetisk direkten fremgangsmåte for å merke polynukleotider eller hybridiserings— aggregater ved bruk av fotoreaktive former av interkalatoren-.

I alle utførelser tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en meget anvendelig, følsom, ogspesifikk fremgangsmåte for detektering av hybridisering- basert på antistoffbinding til inter-kalatorkompleksené i dé dannete aggregater-. Naturligvis kan egnete fragmenter og polyfunksjonelle. former av antistoffet benyttes' som beskrevet mer detaljert nedenfor, og det bør bemerkes at når betegnelsen antistoff her benyttes står den også for fragmenterte og. polyfunksjonelle former, med mindre"annet er angitt., Bestemmélse av bindingen mellom antistoff og interkaleringskomplekser kan utføres på en rekke konvensjonelle måter, og innbefatter fortrinnsvis bruk av et antistoff merket med en détékterbar kjémisk gruppe som f.eks. en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe, en luminiserendé gruppe, en spesifikk bindbar' ligand, eller et radioisotop.

Oppfinnelsen kan anvendes på alle konvensjonelle hybridiserings-ahalyseutførelser, og generelt på en hver utførelse som er basert på dannelse av et hybridiseringsprodukt eller aggregat som innbefatter dobbeltkjedet nukleinsyre. Spesielt kan den unike detekteringsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes ved hybridisering i oppløsning og i fast fase, innbefattet i sistnevnte tilfelle utførelser som innbefatter immobilisering av enten prøve- eller probenukleinsyrer og sandwichutførelser.

Hybridiseringsproduktet eller aggregatet som dannes ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter hybridisert probe og interkalator bundet til dobbeltkjedet nukleinsyre i form av interkaleringskomplekser. Alternativt kan slike dobbeltkjedete områder være innbefattet i selve proben, og kan i slike tilfeller være inter-kalert før proben benyttes i analysen. D.v.s. at de detekterbare interkaleringskompleksene kan dannes in situ under analysen, eller kan finnes i probereagensen når den tilsettes til forsøks-mediet. Videre kan interkaleringskompleksene være kjemisk bundet til en eller begge kjeder i den interkalerte dupleksen. Generelt kan en hvilken som helst variasjon følges forutsatt at hybridiseringsproduktet til sist innbefatter interkaleringskomplekser som er detekterbare ved det antistoffbindingsfenomenet som er det underliggende fundament for foreliggende oppfinnelse.

D.v.s. at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig fremgangsmåte for nukleinsyrehybridisering og et reagenssystem. I tillegg tilveiebringes det en ny antistoffreagens som er i

stand til binding med interkaleringskomplekser. Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse, ved siden av deteksjon av spesielle polynukleotide sekvenser, en generell fremgangsmåte for detektering av dobbeltkjedet nukleinsyre ved tilsats av interkalator og anti-(interkaleringskompleks) antistoff og bestemmelse av antistoffbinding.

Fordelene ved foreliggende oppfinnelse er mange og betydelige. Oppfinnelsen kan benyttes ved en lang rekke ikke-radipaktive deteksjonsmetoder. Videre er merkingen av nukleinsyrer enkel og benytter reagenser som lett lar seg syntetisere. Merking med interkalatoren krever ikke dyre polymeraser, og interkalatorens merketetthet kan lett kontrolleres. Visse foretrukne utførelser har andre fordeler. I de utførelser hvor interkalator-nuklein-syrekomplekset dannes in situ, kreves ingen forutgående syntese av komplekset og denne fremgangsmåten kan benyttes i en utførelse hvor en probe er immobilisert på en fast bærer og neddykket i en oppløsning som inneholder prøvenukleinsyren. I utførelsen hvor interkalatoren ér kovalent koblet til nukleinsyren, festes interkalatoren til proben under fremstillingsprosessen, dette resulterer i et kontrollert metningsnivå. Denne fremgangsmåten reduserer også brukerens kontakt med et interkaleringsmiddel, hvorav mange kan være potensielt skadelige. Fig. 1, som er beskrevet ovenfor, er en skjematisk illustrasjon av den foretrukne vekselvirkningen mellom interkalator og dobbeltkjedet nukleinsyre som gir et interkaleringskompleks som er detekterbart ved hjelp av antistoff. Figurene 2-5 er skjematiske illustrasjoner av fire foretrukne hybridiseringsutførelser for bruk i foreliggende oppfinnelse.

Som beskrevet ovenfor er interkalatorforbindelsen fortrinnsvis

et plant molekyl av lav molekylvekt, vanligvis et aromatisk molekyl, men i noen tilfeller også et polycyklisk molekyl som er i stand til binding med dobbeltkjedete nukleinsyrer, f.eks. DNA/DNA, DNA/RNA eller RNA/RNA-duplekser, vanligvis ved innskudd mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen vii vanligvis være ikke-kovalent, mens kovalent binding finner sted som et

andre trinn i tilfeller hvor interkalatoren har reaktive eller aktiverbare kjemiske grupper som danner kovalente bindinger med nabokjemiske grupper på en eller begge kjeder av den interkalerte dupleksen. Resultatet av interkaleringen er at nabobasepar spres til en separasjonsavstand som er tilnærmet dobbélt så stor som normalt, dette fører til en 'økning i molekyllehgdén for dupleksen.

Videre må det finne sted en oppvikling av dobbeltspiralen på ca. 12 til 36° for å gi plass til interkalatoren. Generelle oversikter og ytterligere informasjon kan finnes i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961); Bloomfield et al, "Physical Chemistry

of Nucleic Acids", kapittel 7, side 429-476, Harper.og Rowe, NY(1974); Waring, Nature 219:1320 (1968); Hartmann et al, Angew. Chem., Engl. Ed. 7:693(1968); Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211

(1978); Wilson, Intercalation Chemistry (1982), 44.5; og Berman et al, Ann, Rev. Biophys. Bioeng. 10:87(1981).

En lang rekke interkaleringsmidler kan benyttes i foreliggende oppfinnelse. Noen klasser av slike midler og eksempler på spesifikke'forbindelser er gitt i følgende tabell:

Flere, utførelser-av foreliggende oppfinnelse innbefatter kjemisk, d.v.s..-kovalent, binding av interkalatoren til en eller begge av de komplimentære kjedene i en dupleks. En hvilken som helst velegnet, fremgangsmåte kan benyttes for å oppnå slik binding. Bindingen, kan. hensiktsmessig dannes ved å bevirke interkalering me.d- en reaktiv, fortrinnsvis fotoreaktiv interkalator, etterfulgt ay bindingsreaksjonen. En spesielt nyttig fremgangsmåte innbefatter bruk av azidointerkalatorer. De reaktive nitrenene kan lett genereres ved synlig_lys eller ultrafiolett lys med lang bølgelengde, og nitrenene av arylazider foretrekker inn-føringsreaksjonen frem for omvandlingsprpdukter [se White et al, Methods in Enzymol. 46:644(1977)]. Eksempler på azidointerkalatorer er 3-azidoakridin, 9-azidoakridin, etidium monoazid, etidium diazid, etidium dimerazid [Mitchell et al, JACS 104:265

(1982)], 4-azido-7-kloroquinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige fotoreaktive interkalatorer er furokumarinene som danner [2+2] cykloaddisjonsforbindelse med pyrimidinrester. Alkylerings-midler kan også benyttes som f.eks. bis-kloretylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner, polycykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin, og norfillin A.

Avhengig a<y> hybridiseringsfremgangsmåten som benyttes, som beskrevet nedenfor, kan kjemisk bundne interkaleringskomplekser benyttes på en rekke forskjellige måter i foreliggende oppfinnelse. De kan dannes in situ i hybridiseringsreaksjons-blandingen eller i et senere prosesstrinn, eller kan være et trinn -i syntesen av en merket probe eller prøvenukleinsyre.

I det sistnevnte tilfellet hvor interkaleringen finner sted i kompleinentaritetsområdet mellom probe- og prøvenukleinsyrene, vil-det oppnås enkelt-binding etterfulgt ved denaturering av slike-.;områder slik at det oppstår enkéltkjedet nukleinsyre med kjemisk bundet interkalator orientert slik at den bundne interkalatoren .ved hybridiseringen vil innta en interkaleringsposisjon. • Proben-,vil innbefatte minst en enkéltkjedet basesekvens som i det;.vesentlige er komplementær til, eller homolog med, sekvensene .som. skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke*å-være et enkelt kontinuerlig polynukleotidsegment, men kan innbefatte to eller flere individuelle segmenter avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvensene kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnålsløyfer. I tillegg kan det homologe området av proben' være flankert på 3'- og 5'- endene av ikke-homcloge sekve<n>ser,-' som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologe sekvensen er innført for propagering. I et hvert tilfelle vil proben som en analytisk reagens vise detékterbar hybridisering ved ett elier flere punkter med prøvenukléinsyrer av interesse. Lineære eller sirkulære enkeltkjedéte polynukleotider kan benyttes som probeelement, med større eller mindre deler dupleksert med en komplementær polynukleotidkjedej . eller

-kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segment eller- seg'--mentene er i enkéltkjedet form og tilgjengelige for hybridisering med prøve DNA eller RNA. Spesielt f-oretrukket er lineære-eller sirkulære prober hvor den homologe probesekvensen overveiende

er i enkéltkjedet forrå se spesielt, [Hu og Messing, Gene 17':'2 71-277(1982 )1 .

Hvor proben benyttes i en hybridiseringsutførelse som -krever br.uk av en interkalator-merket probe, som beskrevet nedenfor, kan en slik probe foreligge i en rekke forskjellige former som" 'f.eks. et fullstendig enkéltkjedet polynukleotid som har interkalator kjemisk bundet til nukléotidet hvorved hybridiseringen ■ gir. " dannelse av interkaleringskomplekser. Alternativt kan proben innbefatte en dobbeltkjedet del eller deler som er blitt■inter-kalert, eventuelt med kovalent binding av interkalatoren-til en eller begge kjeder i dupleksen.

Når det gjelder hybridiseringsutførelser er foreliggende "oppfinnelse fokusert på dannelse av et hybridiseringsaggregat.som innbefatter den hybridiserte proben og interkalatoren bundet til duplekser i form av antistoff-detekterbaré interkaleringskomplekser. D.v.s. at hybridiseringen er forbundet med dannelsen av de detekterbaré interkaleringskompleksene. Fundamentalt kan de resulterende interkaleringskompleksene i aggregatet befinne seg i området for hybridisering mellom prøve- og probe-nukleinsyrene eller kan være i et dobbeltkjedet området fjernt•fra hybridiseringsbmrådet. I det sistnevnte tilfelle kan det ihterkalerte området dannes under analysen eller det kan være i interkålert tilstand når det bringes inn i analysen, d.v.s. kovalent bundne- eller ikke-kovalent interkalerte dobbeltkjedete områder som tjener som merker for proben.

Anvendelse av foreliggende analytiske fremgangsmåte er ikke begrenset til noen spesiell hybridiseringsutførelse. En hvilken som helst konvensjonell hybridiseringsteknikk kan anvendes. Ettersom det gjøres forbedringer og nye utførelses-metoder utvikles, kan slike lett anvendes ved utførelsen av foreliggende fremgangsmåte. Konvensjonelle hybridiseringsfremgangsmåter som er spesielt nyttige innbefatter de hvor prøve-nukleinsyrene eller den polynukleotide proben er immobilisert på en fast bærer (hybridisering i fast fase) og de hvor de polynukleotide forbindelser alle befinner seg i oppløsning (oppløsningshybridisering).

I utførelser med hybridisering i fast fase er et av de polynukleotide stoffene som deltar i hybridiseringen fiksert på en egnet måte i enkéltkjedet form på en fast bærer. Nyttige bærere er velkjente og innbefatter slike som binder nukleinsyrer, enten kovalent eller ikke-kovalent. Under ikke-kovalente bærere for-stås generelt bærere som innbefatter hydrofob binding, disse innbefatter naturlig forekommende og syntetiske polymere materialer, som f.eks. nitrocellulose, derivatisert nylon, og fluor-erte polyhydrokarboner, på en rekke former som f.eks. filtre eller faste lag. Bærere med kovalent binding er også nyttige,

bg innbefatter materialer som har kjemisk reaktive grupper eller grupper, som f.eks. diklortriazin, diazobenzyloksymetyl, o.l., som kan aktiveres for binding til polynukleotider.

En typisk hybridiseringsteknikk i fast fase begynner med immobilisering av' prøve-nukleinsyrer på bæreren i enkéltkjedet form. Dette "innledende trinnet'forhindrer rekombinering av komplementære kjeder fra prøven og kan benyttes for å konsentrere prøve-materialet på bæreren for å forbedre detekterbarheten. Den polynukleotide proben bringes så i kontakt med bæreren og hybridisering detekteres ved antistoffbinding som beskrevet her. Den faste bæreren tilveiebringer en velegnet innretning for separering av antistoff som bindes til interkaleringskomplekser forbundet med hybridisert probe fra antistoffer som ikke bindes på denne måten.

En annen fremgangsmåte av interesse er sandwich hybridiserings-teknikken hvor en av to gjensidig eksklusive fragmenter av den homologe sekvensen av proben immobiliseres og det andre merkes. Nærværet av den polynukleotide sekvensen av interesse resulterer i dual hybridisering til de immobiliserte og merkete probe-segmenter, igjen med det samme endelige mål for interkaleringskomplekser forbundet med bæreren. Se Methods in Enzymology 65:468(1980) og Gene 21:77-85(1983) for ytterligere detaljer.

For å tilveiebringe en bedre illustrasjon av oppfinnelsen beskrives i det følgende hybridiseringsfremgangsmåter i fast fase som er spesielt nyttige i foreliggende oppfinnelse. Skjematiske diagrammer over disse grunnleggende fremgangsmåtene er angitt i tegningene.

Fremgangsmåte type 1

I denne fremgangsmåten, vist i fig. 2, immobiliseres først de enkeltkjedete nukleinsyrene fra det flytende forsøksmediet på en fast bærer. En hybridriseringsreaksjonsblanding dannes så ved å bringe de immobiliserte prøvenukleinsyrer (S) i kontakt med proben (P) som i dette tilfelle, i tillegg til den komplementære enkeltkjedete delen, innbefatter minst en dobbeltkjedet del som er kjemisk bundet med interkalatoren (I) i form av interkaleringskomplekser. En spesielt nyttig form av proben er den sirkulære formen beskrevet av Hu og Messing, supra. Det resulterende hybridiseringsaggregatet innbefatter det immobiliserte polynukleotidet av interesse hybridisert med proben som har et kovalent bundet, interkålert dobbeltkjedet område. Den faste bæreren som bærer de immobiliserte dupleksene separeres så fortrinnsvis fra resten av reaksjonsblandingen. Antistoffet

(Ab) tilsettes, fortrinnsvis merket med et detekterbar gruppe,

og det resulterende immobiliserte antistoffet bundet til inter-kalatprkompleksene i aggregatet separeres fra resten av reaksjonsblandingen. Antistoffet bundet til bæreren bestemmes så slik at analysen fullstendiggjøres. Alternativt kan antistoffet bestemmes i en separat oppløsning; selv om dette generelt er mindre foretrukket siden det normalt kreves et stort overskudd av antistoff.

En variasjon av denne fremgangsmåten er å anvende en probe som ovenfor, som ikke har kovalent bundet interkalator bundet til det dobbeltkjedete området. I steden tilsettes interkalatoren til det immobiliserte aggregat slik at det dannes interkalatorkomplekser i både den dobbeltkjedete delen av proben og dupleks-området som er dannet ved hybridisering.

Fremgangsmåte type 2

Dette er en sandwich-utførelse som er vist i fig. 3. En reaksjonsblanding dannes i forsøksmediet som inneholder sekvensen av interesse (S) og den første og den andre proben, som hver innbefatter hhv. en basesekvens som er komplementær til en gjensidig eksklusiv del av sekvensene av interesse. Den første proben (P^) immobiliseres på en fast bærer og den andre proben (P2) merkes med kovalent bundne, interkaleringskomplekser som i fremgangsmåte type 1 ovenfor. Det resulterende hybridiseringsaggregatet innbefatter sekvensen av interesse hybridisert til både den immobiliserte første proben og den andre proben merket med interkaleringskompleks. Antistoffet tilsettes, fortrinnsvis i merket form, og det resulterende immobiliserte antistoffet bundet til interkaleringskomplekser i aggregatet separeres fra resten av reaksjonsblandingen. Det bundne antistoffet bestemmes slik at analysen fullstendiggjøres.

Det finnes flere nyttige variasjoner av denne fremgangsmåten. For det første kan man, som i variasjonen av fremgangsmåte type 1,. anvende en probe som ikke innbefatter kovalent bundet interkalator, men i stedet tilsette fri interkalator til det immobiliserte aggregatet slik at det dannes interkalatorkomplekser med alle tilgjengelige dobbeltkjedete områder. Videre kan man som et alternativ til å benytte en annen probe med en dobbeltkjedet del, benytte en probe av fullstendig enkéltkjedet nukleinsyre med interkalator kjemisk bundet til denne slik at det ved hybridisering dannes interkaleringskomplekser, eller med interkalator tilsatt slik at interkaleringen finner sted mellom dupleksené som er dannet mellom de to probene og sekvensen som skal detekteres.

Fremgangsmåte type 3

Fig. 4 viser nok en foretrukket utførelse i fast fase. Prøve-nukleinsyrene bringes i kontakt med immobilisert probe og de resulterende immobiliserte dupleksené separeres fortrinnsvis fra resten av reaksjonsblandingen. I denne utførelsen er proben i enkéltkjedet form. Det resulterende hybridiseringsproduktet innbefatter den immobiliserte proben hybridisert med sekvensen' av interesse. Videre tillater denne utførelsen betydelig rekombinasjon mellom komplementære områder av prøvenukleinsyre som kan finne sted på de.t immobiliserte aggregatet. Slik rekombinasjon virker til analysens fordel siden den tilveiebringer ekstra dobbeltkjedet nukleinsyre for etterfølgende interkalering. Det neste trinnet i analysen er å tilsette interkalator og antistoff, igjen fortrinnsvis i merket form. Analysen avsluttes ved separering og bestemmelse av antistoff som i de foregående utførelser.

i

Fremgangsmåte type 4

Ved denne fremgangsmåten, vist i fig. 5, bringes enkeltkjedete prøvenukleinsyrer i kontakt med immobilisert probe hvor, i dette tilfelle, proben er kjemisk bundet, f.eks. kovalent, til interkalatoren slik at dupleksdannelse i området ved den bundne interkalatoren gir dannelse av interkaleringskomplekser. Dette er en meget fordelaktig utførelse ved at det er den eneste kjente teknikk hvor proben er både immobilisert og merket, slik at det ikke,kreves noe immobiliserings- eller merketrinn når analysen utføres.. Det resulterende aggregatet innbefatter kovalent bundne interkaleringskomplekser i området for hybridisering mellom prøve-og probenukleinsyrer og i eventuelle rekombinerte prøveområder. Antistoff tilsettes så og analysen avsluttes som i de foregående utførelser. Denne utførelsen har den fordel at personen som ut-fører analysen slipper å håndtere oppløsninger av de frie interkalatoren som i noen tilfeller kan være potensielt skadelig.

En enkel variasjon av denne teknikken er å immobilisere prøve-nukleinsyrer i stedet for den merkete proben og gjennomføre analysen på normal måte. Dette er noe mindre fordelaktig, men er en praktisk anvendelig analysefremgangsmåte.

En rekke hybridiseringsutførelser i flytende tilstand kan også anvendes på foreliggende oppfinnelse. Slike utførelser er kjennetegnet ved det trekk at hybridiseringstrinnet innbefatter oppløslige former av både prøvenukleinsyrer og proben. Dette kan gi betydelig raskere hybridisering fordi kinetikken er mye raskere når begge kjeder er i oppløsning sammenlignet med det tilfelle at en er immobilisert. Normalt gjøres de resulterende hybrider immobile for detektering etter hybridiseringstrinnet. En slik immobilisering kan utføres på en rekke forskjellige måter. Konvensjonelt er det kjent å selektivt immobilisere duplekser ved å eksponere dem for adsorbenter som f.eks. hydroksy-apatitt og ni trocellulosemembraner.

En spesielt nyttig fremgangsmåte til immobilisering av hybrider som er dannet ved oppløsningshybridisering innbefatter bruk av en probe som inneholder en bindingsposisjon for et bindende stoff. Etter hybridiseringstrinnet kan man så tilsette en immobilisert form av det bindende stoffet som effektivt vil binde og immobilisere hybridene ved bindingsposisjonen på proben.

En slik bindingsposisjon kan være tilstede i en enkéltkjedet hybridiserbar del av proben eller kan være tilstede som et resultat av en kjemisk modifisering av proben. Eksempler på bindingsposisjoner som finnes i nukleotidsekvensen er hvor proben innbefatter en promotorsekvens (f.eks. lac-promotor, trp-promotor) som er bindbar ved et promotorprotein (f.eks. bakteriofage pro-motorer, RNA polymerase), eller innbefatter en operatorsekvens (f.eks. lac operator) som er bindbar ved et repressorprotein (f.eks. lac repressor), eller innbefatter skjeldne, antigeniske nukleotider eller sekvenser (f.eks. 5-bromo eller 5-jododeoksy-uridin, Z-DNA) som er bindbare ved spesifikke antistoffer (se også britisk patent 2,125,964). Bindingsposisjoner inn-

ført ved kjemisk modifisering av proben er spesielt nyttige og innbefatter normalt at en del av et bindende par bindes til probenukleinsyren. Nyttige bindende par er f.eks. biotin/ avidin, haptener og antigener/antistoffer, karbohydrater/ lecitiner, enzymer/inhibitorer o.l. I tilfeller hvor det bindende par består av en proteindel og en ikke-proteinholdig del, fore-trekkes det å binde den ikke-proteinholdige delen til proben siden proteindelen kan være ustabil under denatureringsbeting-elsene for hybridisering av proben. Foretrukne systemer innbefatter binding av proben med biotin eller et hapten og anvendelse av hhv. immobilisert avidin eller anti-hapten antistoff. Fremstilling av nyttige ligand-merkete prober er kjent i litteraturen [Langer et al (1981) Proe. Nati. Acad. Sei. 78:6633;

Broker (1978) Nucl. Acids Res. 5:363; Sodja et al (1978) Nucl. Acids Res. 5:385; Tchen et al (1984) Proe. Nati.' Acad. Sei. 81:3466]. Immobilisering av det bindende stoffet kan utføres ved konvensjonell teknikk.

En rekke fremgangsmåter er kjent for immobilisering av proteiner

på faste bærere og disse fremgangsmåtene kan anvendes ved immobilisering av det bindende stoffet [se Methods in Enzymology,

Vol. 44 (1976)]. Antistoffer immobiliseres f.eks. enten ved kovalent kobling eller ved ikke-kovalent adsorbsjon. Ikke-kovalente fremgangsmåter som ofte anvendes er adsorbsjon på polystyren-perler eller mikropartikler og på polyvinylkloridoverflater.

Mange kovalente fremgangsmåter benyttes for immobilisering av proteiner, og enkelte innbefatter cyanogenbromid aktiverte agaroser og dekstraner; glutaraldehydaktiverte nylonformer og polyakrylamider; og epoksyder på akrylformete eller andre bærere. De:,ovenfor omtalte fremgangsmåtene er spesielt foretrukket, men foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til spesielle hybridiseringsfremgangsmåter. En hvilken som helst analyse-

metode kan anvendes, forutsatt at det dannes detekterbaré interkaleringskomplekser i forbindelse med hybridiseringen av probenukleinsyren. F.eks. kan man i tillegg til metodene ovenfor.tenke seg en utførelse av oppløsningshybridisering hvor et fast antistoff til interkaleringskompleksene anvendes for å immobilisere den hybridiserte proben. Det vil være dannet tilstrekkelig interkaleringskomplekser i hybridiseringsproduktet mellom prøve- og probenukleinsyrer, sistnevnte i hovedsakelig enkéltkjedet form, til at både det faste antistoffet og det merkete antistoffet kan bindes. Mengden av merke forbundet med den faste fasen måles så, og relateres til nærværet av sekvensen som skal bestemmes. Andre nyttige utførelser vil være åpenbare for fagmannen.

Et fundamentalt prinsipp ved foreliggende oppfinnelse er evnen

til først å binde et antistoff, eller et fragment eller en annen ekvivalent derav, til hybridiseringsaggregatet som inn-

befatter hybridisert probe og deretter å detektere slik antistoff binding . Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensene bestå av hele antistoffer, fragmenter av antistoffer, polyfunk-sjo.nelle antistoff aggregater, eller generelt et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifikke bindingsposisjoner for interkaleringskomplekset fra et antistoff. Når det foreligger i form av hele antistoff, kan det tilhøre en hvilken som helst klasse eller underklasse av kjente immunoglobuliner, f.eks.

IgG, IgM, o.s.v. Et hvilket som helst fragment av et slikt

antistoff som beholder spesifikk bindingsaffinitet for interkaleringskomplekser kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG, konvensjonelt kjent som Fab, F(ab'), og F(ab 1)2• I tillegg kan aggregater, polymerer, og konjugater av immunoglobuliner eller fragmenter derav benyttes der hvor dette er hensiktsmessig.

Immunoglobulinkilden for antistoffreagensen kan fremstilles ved

en hvilken som helst tilgjengelig teknikk som f.eks. konvensjonelle antiserum- og monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås

ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av et dyr,

som f.eks. en mus, hare, marsvin eller geit, med et egnet immunogen. Immunogenet vil vanligvis innbefatte et ionisk kompleks' mellom et kationisk protein eller proteinderivat (f.eks. métylert bovint serum albumin) og det anioniske interkalator-nukleinsyre-komplekset. Ideelt bør interkalatoren være kovalent koblet til den dobbeltkjedete nukleinsyren. Alternativt kan interkalator-DNA-konjugatet være kovalent koblet til et bærerprotein.' Immuno-globulinene kan også oppnås ved somatisk celle-hybridiseringsteknikk, dette resulterer i såkalte monoklonale antistoffer.

De immunogenet som benyttes for primære injeksjoner som fører

til hybridomdannelse er som beskrevet ovenfor.

Antistoffreagensen vil være kjennetegnet ved sin evne til binding med et interkaleringskompleks dannet mellom en valgt interkalator og dobbeltkjedet nukleinsyre, generelt uten hensyn til de spesifikke basesekvensene som befinner seg nærmest interkaleringsposi-sjonen. Videre vil den være ute av stand til binding- til enkeltkjedete nukleinsyrer eller til frie interkalatorer. Som et resultat vil antistoffbinding bare finne sted ved interkaleringskomplekser som ved riktig utførelse av analysefremgangsmåten-

kun vil finnes assosiert med den hybridiserte proben.-

Bindingen av antistoffreagensen til hybridiseringsaggregatet

ved foreliggende fremgangsmåte kan detekteres ved en hvilken som helst velegnet teknikk. Antistoffreagensen kan selv med fordel være merket med en detekterbar kjemisk gruppe. Slike detekterbaré kjemiske grupper kan være et hvilket som helst materiale som har en detekterbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike materialer er utviklet innen feltet immunoanalyser og generelt,

kan de fleste merker som er nyttige ved slike metoder også anvendes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige er enzymatisk aktive grupper, som f.eks. enzymer (se Clin. Chem. (1976)' 22:1243), enzymsubstrater (se Britisk patent 1,548,741), koenzymer1 (se U.S. patenter 4,230,797 og 4,238,565), og enzyminhibitorer (se

U.S. patent nr. 4 ,134, 792); fluorescerende grupper (se Cl i ri.

Chem. (1979) 25:353); kromoforerende grupper; luminiscerende grupper som f.eks. kjemiluminiscerende- og bioluminiscere"nde grupper

(se Clin. Chem. (1979) 25:512, og ibid, 1531); spesifikt bindbare ligander; nabovekselvirkende par; og radioisotoper som _ , 3U 35e 32„ 125T 14„ 0,., , f.eks. H, S, P, I, og C. Slike merker og merkepar detekteres på basis av deres egne fysiske egenskaper (f.eks.

ved fluorescenseller kromoforese og radioaktivitet) eller deres reaktive- eller bindende egenskaper (f.eks. enzymer, substrater, koenzymer og inhibitorer). F.eks. kan et kofaktor-merket antistoff detekteres ved tilsats av enzymet som merket er en kofaktor for og et substrat for enzymet. Et antistoff merket med hapten eller ligand (f.eks. biotin) kan detekteres ved tilsats et antistoff til haptenen eller et protein (f.eks. avidin) som binder liganden, merket med et detekterbart molekyl. Slike detekterbaré molekyler kan være molekyler med en målbar fysisk egenskap (f.eks.f1uorescens eller absorbans) eller en-deltaker i en enzymreaksjon (se f.eks. listen ovenfor). F.eks. kan man benytte et enzym som virker på et substrat slik at det genereres et produkt med en målbar fysisk egenskap. Eksempler på sistnevnte innbefatter, men er ikke begrenset til, 8-galaktosidase, alkalisk fosfatase og peroksidase. For in situ hybridiserings-studier er sluttproduktet ideelt ikke oppløslig i vann. Nabovekselvirkende eller bindende merker slik som de er kjent fra feltet immunoanalyse (se. Clin. Chem. 27:1797 (1981) og U.S. patent 3,996,345 og 4,233,402) kan anvendes på foreliggende fremgangsmåte ved anvendelse av to forskjellige populasjoner av antistoffer, en merket med en del av paret og den andre merket med den andre delen av paret. F.eks. kan en første del av antistoffer til interkaleringskomplekser være merket med et fluorescerende stoff og en annen del være merket med en slukker. Nærværet av interkaleringskomplekser indikeres ved slukking av fluorescensenp.g.a. nabobinding av første og annen del av antistoffene langs den interkalerte nukleinsyredupleksen. Tilsvarende kan.man benytte første og andre enzymmerker hvor produktet fra den. ene er... et substrat for den andre. Nærværet av komplekser indikeres da ved en forøket overgang av det andre enzymet p.g.a. en nærliggende enzymkanaleffekt. Andre merkefremgangsmåter vil være åpenbare for fagmannen.

Alternativt kan antistoffet detekteres basert på en iboende egenskap som f.eks. dets antigenisitet. Et merket anti-(antistoff) antistoff vil bindes til den primære antistoffreagensen hvor merket for det andre antistoffet er et hvilket som helst konvensjonelt merke som ovenfor. Videre kan antistoffet detekteres ved komplementfiksering eller bruk av merket protein A, så vel som andre kjente teknikker for detektering av antistoffer.

Der hvor antistoffet, som foretrukket, er merket er merkedelen

og antistoffreagensen assosiert eller bundet til hverandre ved direkte kjemisk binding som f.eks. kovalent binding, eller ved indirekte binding som f.eks. ved inkorporering av merket i en mikrokapsel eller liposom som igjen er bundet til antistoffet. Merketeknikker er velkjente og en hvilken som helst velegnet metode kan benyttes i foreliggende oppfinnelse.

Prøven som skal analyseres kan være et hvilket som helst medium

av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk-,

■veterinærmedisinsk-, miljømessig-, ernæringsmessig- eller indu-striell betydning. Prøver fra mennesker og dyr og kroppsvæsker kan spesielt analyseres ved foreliggende fremgangsmåte, innbefattet urin, blod (serum eller plasma),', melk, cerobrospinål-væske, spytt, avføring, lungeaspirater, halsavstrykninger, geni-talavstrykninger og eksudater, rektalavstrykninger, og riasofarnygal aspiratér. Hvor prøvene som tas fra pasienten eller andre kilder

. for å undersøkes inneholder hovedsakelig dobbeltkjedéte nukleinsyrer, slik de f.eks. inneholdes i celler, behandles prøven for å denaturere nukleinsyrene, og om nødvendig først frigjøre nukleinsyrer fra cellene. Denaturering av nukleinsyrer utf.øres ■ fortrinnsvis ved oppvarming i kokende vann eller alkalibehandling (f.eks. ^0,1 N natrumhydroksyd), som om det ønskes, samtidig kan benyttes til å lysere cellene.Frigjøring av nukleinsyrer kan f.eks. oppnås ved mekanisk nedbrytning (nedfrysning/opptining, abrasjoner, ved hjelp av lydpulter), fysisk/kjemisk nedbrytning (vaskemidler som f.eks. "Triton", "Tween", dodecylsulfat, alkalibehandling, .osmotisk sjokk, eller varme) eller enzymatisk lyserinn (lysozym, proteinase K, pepsin). Det resulterende forsøksmedium vil inne-holde nukleinsyrer i enkéltkjedet form som så kan analyseres ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte.

Som kjent innen teknikken kan forskjellige hybridiseringsbeting-elser anvendes i analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved svakt forhøyete temperaturer, f.eks. mellom 35 og 70°C og vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom 6 og 8 og med egnet ionestyrke (f.eks. 2XSSC hvor 1XSSC = 0,15M natrumklorid og 0,015M natriumcitrat, pH 7,0), protein som f.eks. bovint serum albumin, "Ficoll" (en kopolymer av sukrose og epiklorohydrin), polyvinylpyrrolidon, og et denaturert fremmet DNA som f.eks. fra kalvethymus eller laksesperma. Graden av komplementaritet mellom prøve- og probekjedene som kreves for at hybridiseringen skal finne sted, avhenger av betingelsenes stringens. Omfanget og spesifisiteten av hybridiseringen påvirkes av følgende grunnleggende betingelser:

1. Renheten av den fremstilte nukleinsyren.

2. Basesammensetningen av proben - G-C basepar vil vise større termisk stabilitet enn A-T basepar. D.v.s. at hybridiseringer som innbefatter høyere innhold av G-C vil være stabile ved

høyere temperaturer.

3. Lengden av den homologe basesekvens - en hvilken som helst kort sekvens av baser (f.eks. mindre enn 6 baser), har en høyere sannsynlighet for å være tilstede i mange nukleinsyrer. D.v.s. at liten eller ingen spesifisitet kan oppnås i hybridiseringer som innbefatter slike korte sekvenser. Den foreliggende homologe probesekvensen vil være på minst 10 baser, vanligvis 20 baser eller flere, og fortrinnsvis mer enn 100 baser. Fra et praktisk synspunkt vil den homologe probesekvensen ofte være mellom 300 og 1 000 nukleotider.

4. Ionestyrke - hastigheten for rekombinering øker når ione-styrken av den inkubérte oppløsningen øker. Den termiske

stabiliteten av hybrider øker også.

5. Inkuberingstemperatur - optimal rekombinasjon finner sted ved en temperatur ca. 25-30°C under smeltetemperaturen (Tm) for en gitt dupleks. Inkubering ved temperaturer betydelig under den optimale temperatur tillater mindre relaterte base-sekvenser å hybridisere. 6. Nukleinsyrekonsentrasjon og inkubasjonstid - normalt vil en av den hybridiserbare prøvenukleinsyren eller probenuklein syren være tilstede i overskudd for å drive reaksjonen mot hybridisering, vanligvis et 100 gangers overskudd eller større. 7. Denatureringsreagenser - nærværet av midler som bryter hydro-genbindinger, som f.eks. formamid og urea, øker stringensen av hybridiseringen. 8. Inkubasjonstid - jo lengre inkubasjonstiden er jo mer fullstendig vil hybridiseringen være. 9. Volumutelukkende midler - nærværet av slike midler, f.eks. dekstran og dekstransulfat, antas effektivt å øke konsentrasjonen av de hybridiserende elementene og derved øke hastigheten for den resulterende hybridiseringen. Normalt er antistoffreagensen, og interkalatoren i utførelser hvor denne tilsettes som en fri forbindelse, ikke tilstede i hybridiseringsoppløsningen, men dette er ikke utelukket dersom det skulle være ønsket og dersom hybridiseringsbetingelsene er fordelaktige for antistoffbinding og interkalering. I det vanlige tilfelle detekteres interkaleringskompleksene .assosiert med den hybridiserte proben etter separering av den hybridiserte proben fra hybridiseringsoppløsningen. Der hvor interkalatoren tilsettes som en fri forbindelse, velges konsentrasjonen normalt slik at den er tilstrekkelig til å mette interkaleringskompleksene som er tilstede, men ikke så stor at det finner sted betydelig, f.eks. mer enn 10%, egen-stabling av interkalatoren. Interka- leringsbetingelsene vil generelt være milde, f.eks. en pH mellom 6 og 8, moderat ionestyrke 1), romtemperatur, uten behov for forlenget inkubasjon, d.v.s. vanligvis mindre enn 15-minutter. (For detektering av interkaleringskomplekset, tilsettes antistoff til komplekset i overskudd og får inkubere for den tiden som kreves for å danne et detekterbar.t produkt (f.eks. 5 minutter til 24 timer) under betingelser med nøytral pH (f.eks. mellom 6 og 8),.moderat ionestyrke 1) og moderat temperatur (20-40°C). .Overskudd (ubundet) antistoff fjernes så ved vasking under tilsvarende betingelser.

Det kan være nødvendig eller ønskelig å modifisere fremgangsmåten beskrevet ovenfor ved å innbefatte en interkalator i vaske-trinnet slik at metningen av nukleinsyre-interkalatorkomplekset opprettholdes. Videre kan, dersom det ønskes, flere eller alle trinnene ovenfor kombineres, som f.eks. tilsats av interkaleringsmiddel og antistoff samtidig.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøksmedium, som innbefatter en nukleinsyreprobe som inneholder minst en enkéltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær til sekvensen som skal detekteres. Reagenssystemet er kjennetegnet ved at det i tillegg inneholder en interkalator, som enten er en separat, fri forbindelse, som idet vesentlige ikke er kompleksdannet med nukleinsyrer, eller er kjemisk bundet til et enkéltkjedet område av proben, slik at dupleksdannelse i slike områder gir dannelse av interkaleringskomplekser, og et antistoff eller et fragment derav, som er i stand til å danne binding med interkaleringskomplekser, men ikke med interkalatoren alene eller med interkalatoren bundet til enkéltkjedet nukleinsyre, som innbefatter dobbeltkjedet nukleinsyrekompleks dannet med interkalatoren.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en probe, (2) en nukleinsyreinterkalator som beskrevet, og (3) antistoffreagensen, fortrinnsvis merket med en detekterbar kjemisk gruppe som også- er beskrevet ovenfor. Systemet kan i tillegg innbefatte en fast bærer for immobilisering av enkeltkjedete nukleinsyrer fra forsøksmediet. Alternativt kan probeelementet tilsettes immobilisert på en slik bærer. Videre kan interkalatoren være tilstede i reagenssystemet som en separat, fri forbindelse, som ikke foreligger i kompleks med nukleinsyrer, eller kan bindes til proben enten i form av interkaleringskomplekser der hvor proben innbefatter et dobbeltkjedet område, eller eventuelt kovalent eller på annen måte kjemisk bundet til en eller begge kjedene, eller ved å være kjemisk bundet, f.eks. kovalent, til et enkéltkjedet probeområde slik at dupleksdannelse i et slikt 'område<:>gir dannelse av interkaleringskomplekser. I tilfellet med sandwich-utførelsen er, som beskrevet ovenfor, en annen probe innbefattet i systemet. En forsøkspakke for systemet kan i tillegg innbefatte hjelpekjemikalier som f.eks. komponenter i hybridi-seringsoppløsningen eller denatureringsmidler som er i stand til å overføre dobbeltkjedete nukleinsyrer i en prøve til enkéltkjedet form. Fortrinnsvis er det innbefattet et kjemisk lyserings- og denatureringsmiddel, f.eks. alkali, for behandling av prøven slik at enkéltkjedet nukleinsyre frigjøres.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illusteres ved hjelp av følgende eksempler:

EKSEMPLER

I. Materialer

A. Preparering av tufA probe som har en kovalent'interkålert

dobbeltkjedet del.

Nukleinsyreproben er en modifisert Ml3mp9 vektor (Messing og Vieria (1982) Gene. 19:269; kommersielt tilgjengelig fra New. England Biolabs, Beverly, MA) som inneholder et 800 bp innskudd mellom Hine II og EcoRI restriksjonsendonukleaseposisjonene av RFMl3mp9. 800 baseinnskuddet er et fragment av 1,190 base tufA sekvensen fra E. coli; og det er den delen av proben (som består av vektor og innskudd) som vil hybridisere til prøvenukleinsyren. Det vil heretter bli referert til som tufA innskuddet. Den modifiserte Ml3mp9 bakteriofagen betegnes M13-10 og er tilgjengelig gjennom American Type Culture Collection, Rpckville, MD

(ATCC 39403-B1) .

E. coli baseorganismen som benyttes for propagering av M13-10 fagen er JM103 [(Alac pro), supE, thi, strA, endA sbcB, hsdR , F'traD36, proAB, laclq, Z6M15] som er kommersielt tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersberg, MD. E.. coli JM103 transformeres med M13-10 DNA, og en kultur av JM103. infi-seres deretter med den transformerte Jml03. Den enkeltkjedete form av M13-10 isoleres fra fagpartiklene som utskilles, i, mediet av dé infiserte E. coli. Fagpartiklene høstes og den enkeltkjedete M13-10 DNA isoleres ifølge standard fremgangsmåter [Messing et al (1981) Nucleic Acids Res. 9:309].

Ved bruk .av en oligonukleotid primer komplementær til Ml3mp9 vektoren på 5' terminalen av tufA innskuddet, deoksynukleosidet trifosfater og E. coli DNA polymerase (Klenow-fragment), syntetiseres det annen DNA-kjede. Denne andre kjeden syntetiseres med begrensete mengder av deoksynukleoside trifosfater slik at den ikke strekker seg til tufA innskuddet fordi dette innskuddet må være i hovedsak enkéltkjedet for at proben skal være nyttig i en hybridiseringsanalyse. Denne teknikken er beskrevet i litteraturen [Hu og Messing (1982) Gene 17:271-277] og den oligo-nukleotide primeren (sekvens CACAATTCCACACAAC) er kommersielt tilgjengelig fra New England Biolabs, Beverly, MA.

Mengden av dobbeltkjedet DNA som er tilstede i M13-10 proben

kan estimeres ved bruk av et radioaktivt merket nukleosid tri-fosfat i den andre kjedesyntesen eller ved S-^ nukleaseoppløs-ning etterfulgt av en fluorescensanalyse med et i diumbromid.

Det dobbeltkjedete område av M13-10 proben fremstilt som beskrevet ovenfor interkaleres og bindes kovalent med etidium i en foto-affinitetsreaksjon ved bruk av et fotomerket etidiumderivat, 8-azidoetidium. Denne fotoreaktive interkalatoren fremstilles og isoleres som beskrevet i litteraturen [Graves et al. (1977), Biochim. Biophys. Acta 479:98-104]. Dens binding til det dobbelt-kjedete, DNA har vist seg å etterligne bindingen for dens opphavs-forbindelse, etidiumbromid [Bolton og Kearns (1978) Nucl. Acids. Res. 5:4891; Garland et al (1980) Biochem. 19:3221 - foreliggende undersøkelse antyder at denne fremgangsmåten gir en blanding av 3-azido og 8-azidoetidiumisomere]. Fordi 8-azidoetidium er fotoreaktivt må det tas vanlige forhåndsregler ved behandling av materialet for å unngå dekomponering. Arbeid i mørke ved hjelp av en rød fotografisk lampe er- funnet å være tilfreds-stillende. Oppløsninger av 8-azidoetidium kan oppbevares frosset i mørke ved -r 70°C i minst 1 måned.

Fotolyse med synlig lys overfører azido-delen i 8-azidoetidium til et kjemisk reaktivt' nitren, som raskt vil reagere med tilgjengelige nukleofiler under dannelse av kovalente etidium-addisjonsprodukter [Knowles (1971) Acc. Chem. Res. 5:155].

Dersom 8-azidoetidium er interkålert mellom baseparene i DNA

når fotolysen finner sted, vil kovalent kobling av etidium til DNA foregå med høyt utbytte [Bolton og Kearns (1978) Nucl.

Acis Res. 5:4891].

Etidium bindes kovalent til det dobbeltkjedete området av M13-10 ved fotolyse av en oppløsning som inneholder tilnærmet ImM.

DNA basepar og 0,5 mM 8-azidoetidium i en egnet buffer som f.eks. 20 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan (Tris-HCl), 200 mM natrumklorid (NaCl), pH 8,0. Fotolysen utføres med en 150 watts utendørs lyskaster, mens den omrørte reaksjonsblandingen befinner seg 5-20 cm borte fra lyskilden. For å hindre at foto-lysereaksjonsblandingen blir for varm, og for å blokkere■stråling av kort bølgelengde,f.eks. kortere enn 300 nanometer (nm), er reaksjonsblandingen omgitt av et vannbad av glass som er forbundet med et sirkulasjonssystem for vann med temperaturregulering. Etter en egnet inkubasjonstid, som f.eks. 60 minutter, fjernes etidiumgrupper som ikke er kovalent bundet til DNA vedlen, serie, f.eks. 10, suksessive ekstraksjoner med like store volumer av n-butanol mettet med vann. Ekstra 8-azidoetidium tilsettes (den endelige konsentrasjon er i området rundt 0,4 mM) og fotolysen og ekstraksjonstrinnene gjentas. Mengden av etidium forbundet med DNA estimeres ved bruk av verdier for ekstinks.jons-koeffisienten på e4gg= 4 x 10 M cm for fotolysert etidium-azid, relasjonen mellom A^q °9 A490 ^or ^°tolysert etidium ,bundet til DNA <[A2>6Q = A49Q x 3,4)-0,011], og e26Q = 1,32 x IO<4 >M cm ^ for konsentrasjonen av DNA basepar for en gitt DNA som er merket. Fortrinnsvis er proben mettet med etidium slik at det er en etidiumdel for hver 2 DNA basepar i det dobbeltkjedete området av proben. Fotolysereaksjonen og ekstraksjonene gjentas inntil den ønskete merketetthet er oppnådd.

B. Fremstilling av adenovirusprober for utførelse av sandwich-hybridisering.

Sandwichhybridiseringsutførelser er beskrevet i litteraturen - Dunn og Hassell (1977) Cell 12:23; Dunn og Sambrook (1980)

Methods in Enzymology 65:468, Ranki et al (1983) Gene 21:77;

Ranki et al (1983) Curr. Topics in Microbiology and Immunol. 104: 307-310.

Denne fremgangsmåten krever to nukleinsyreprober, hvor begge er komplementære til et unikt område av nukleinsyren som undersøkes i en prøve. En av probene immobiliseres på en fast bærer, mens den andre er merket på en eller annen måte og til og begynne med befinner seg i opplosning samiuen med prøvenukleinsyrene.

Disse betegnes hhv. som fast probe og oppløsningsprobe.

Den faste proben og oppløsningsproben fremstilles fra restriksjons-endonukleasenedbrytningselementer av DNA fra adenovirus type 2 (Ad2) som beskrevet av Ranki et al (1980) Gene 21:77-85. Den faste proben består av BamHl fragmenter C eller D [Tooze (1980) "The Molecular Biology of Tumor Viruses" (annen utgave) del 2: DNA Tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, side 933-934] av Ad2 DNA innskudd i en liten pBR322 vektor. Disse probene er kalt hhv. pkTHj.201 og pkTHl202. Oppløsningsproben består av et BamHl og Bglll restriksjonsendo-nukleoasenedbrythingselement av pkTH1201 hvor fragmenter "shotgun"-klones inn i BamHl restriksjonsendonukleaseposisjonen på M13mp7 [Messing et al (1981) Nuc. Acids Res. 9:309]. Den modifiserte Ml3mp7 som inneholder som et innskudd et fragment av Ad2 C-fragmentet betegnes mkTH2306.

Oppløsningsproben mkTH1206 gjøres delvis dobbeltkjedet som beskrevet i del I-A ovenfor, og det dobbeltkjedete område merkes med et interkaleringsmiddel, f.eks. etidium, også som beskrevet i del I.A ovenfor.

C. Fremstilling av HCMV probe.

EcoRI restriksjonsendonukleasefragment 0 fra human cytomegalovirus (HCMV) stamme AD169 [Tamashiro et al (1982) J. Virol., Mai, 547-556; Chou og Merigan (1983) New. Engl. J. of Med. 308:921] klones inn i pBR322 derivatet pACYC184 som benyttes for å transfisere E. coli stamme HB101 Ree A som beskrevet av Tamashiro et al. Etter propagering og rensing av det innskudds-bærende pACYC184, nedbrytes plasmidet med restriksjons-endonuklease EcoRI, og 6,8 kb 0 fragmentet av HCMV renses ved preparativ elektroforese i 0,8% agarose gel ved hjelp av standard fremgangsmåter [Maniatis et al (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ].

D. Fremstilling av interkalator-merket HCMV probe.

Det rensete dobbelt-kjedete 0 fragmentet fra del I-C ovenfor, merkes så kovalent med etidium ved bruk av det fotolabile etidiumderivatet 8-azidoetidium, som beskrevet i del I-A ovenfor.

E. Fremstilling av interkaleringskompleks immunogen.

Kalvetymus eller laksesperma DNA kappes ved gjentatte passasjer gjennom en hypodermisk nål, behandles med S-^ nuklease slik at enkeltkjedete områder fjernes iManiatis (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYj og separeres fra de resulterende nukleotider ved en av en rekke mulige standardmetoder (f.eks.etanolutfelling, geleksklusjons-kromatografi, eller ionevekslings-kromatografi).

Den rensete dobbeltkjedete DNA kobles så kovalent til det fotolabile etidiumderivatet 8-azidoetidium ved fotolyse, som beskrevet i del I-A ovenfor. Et bærerprotein fremstilles ved mety-lering av karboksylsyrerester (Mandell og Hershey (1960) Anal. Biochem. 1:66) og kombineres så med det interkalator-merkete DNA slik at det dannes et elektrostatisk sammenholdt nukleinsyre-proteinkompleks som beskrevet av Porier et al (1982) PNAS 79: 6443 .

F. Fremstilling av polyklonalt antiserum til interkaleringskomplekset.

Polyklonalt antiserum mot interkalator-DNA komplekser bringes frem i harer ved bruk av immuniseringsteknikker og fremgangsmåter beskrevet i litteraturen [Stollar (1980) Methods in Enzymology 70:70]. Antiserumet kontrolleres i en analyse i fast fase tilsvarende den som blir benytte for monoklonale antistoffer, f.eks. som beskrevet av Lange et al (1976) Clin. Exp. Immunol. 25:191; Pisetsky et al (1981) J. Immun. Methods 41:187. Det innledende kontrollkriteriet ville være binding til interkalator-DNA komplekset.

IgG fraksjonen av antistoffene som inneholder antisera isoleres fra andre serumproteiner ved ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av kromatografi på DEAE cellulose [Livingston (1974) Methods

in Enzymology 34:723].

IgG fraksjonen av antisera renses videre ved affinitets-kromatografi på en kolonne som inneholder en harpiks hvor DNA-interkala-. torkomplekset immobiliseres [Stollar (1980) Methods in Enzymology 70:70]. Etter at IgG fraksjonen er tilført kolonnen fjernes ikke-spesifikt bundet protein ved vasking, og de spesifikke antistoffene utvaskes med 2M eddiksyre i kald tilstand, Stollar

(1980) ibid .

De rensete antistoffene sorteres mer grundig for å bestemme an-vendeligheten i hybridiseringsanalysen. Antistoffene må binde interkalator-DNA komplekset med høy affinitet (fortrinnsvis,

KA<>> 10<10> M "S; kryss-reaktivitet med fri interkalator eller . enkéltkjedet DNA er ikke aksepterbart. Avhengig av utførelsen av analysen kan en viss grad av kryss-reaktivitet for antistoffene med dobbeltkjedet DNA være aksepterbart.

G. Fremstilling av 'monoklonale antistoffer til interkalatorkomplekset.

Ved bruk av interkalator-DNA immunogenet fremstilt som beskrevet ovenfor, kan monoklonale■antistoffer fra mus til interkalator-DNA komplekset oppnås ved anvendelse av standard fremgangsmåter [Glafre og Milstein (1981) Methods in Enzym. 73:1]. De monoklonale antistoffene sorteres ved bruk av en modifikasjon av den teknikken som.er beskrevet i litteraturen, f.eks. av Lange et al (1976) Clin. Exp. Immunol. 25:191; Pisctsky et al (1981) J. Immun. Methods 41:187). For å være nyttig i analysen for detektering av DNA-interkalatorkomplekser må et monoklonalt antistoff bindes til DNA-interkalatorkomplekser med høy affinitet (fortrinnsvis, K^> 10^ M men ikke bindes til enkéltkjedet DNA eller frie interkaleringsmidler. Kryss-reaktivitet med dobbeltkjedet DNA kan være aksepterbart i noen analyseut-førelser.

Monoklonalt antistoff fra mus renses ved en to-trinns fremgangsmåte. Den rene ascitesvæsken tilføres til en kolonne av "Affi-Gel Blue" harpiks bragt til likevekt med lOmM Tris-HCl, 0,15M NaCl, pH 8,0, og vasket ut med den samme bufferen.

Dette trinnet fjerner albumin som holdes tilbake på kolonnen. Det siste rensetrinnet er tilsatt til "DEAE-Sepharose" og utvaskes med en lineær gradient av 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, til 10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl. Dette gir renset monoklonalt antistoff fra mus fritt for forurensende serumproteiner som f.eks. albumin og transferrin.

H. Fremstilling av B-galaktosidase-antistoffkonjugat.

6-galaktosidase (30 000 enheter, renhet VIII, kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble oppløst i 2 ml av en bufferoppløsning som innbefattet 0,1 M N-2-hydroksy-etylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre (HEPES), 0,09MNaCl, pH 7,0. Dette ga en S-galaktosidaseoppløsning som inneholdt 37,7 mg protein (70 nmol) i 1,84 ml. En porsjon på 3,5 ymol (et 50-

gangers overskudd) av ditiotreitol (DTT) ble tilsatt denne opp-løsningen, og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 4 timer.

DTT ble fjernet fra enzymoppløsningen ved kromatografering av blandingen på en 2,5 x 80 cm kolonne av "Sepharose 6B'C1" harpiks ved bruk av HEPES/NaCl-bufferen beskrevet ovenfor som eluent. Protein-holdige fraksjoner ble slått sammen slik at det ble oppnådd et totalt volum på 15 ml. Ved bruk av E280= 20 [Worthington Enzyme Manual (1977), Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ., side 195], ble B-galaktosidasekon-sentrasjonen bestemt til 9,62 mg/ml. Antallet sulfhydry1-grupper på enzymet ble bestemt til å være 11,0 ved bruk av Ellman's reagens [Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70]. Denne fremgangsmåten gir typisk 9-15 frie sulfhydrylgrupper pr. 6-galaktosidasemoleky1.

Den heterobifunksjonelle koblingsreagensen succinimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksan-l-karboksylat (SMCC, tilgjengelig fra Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ble benyttet for å koble B-galaktosidase til et antistoff. Denne koblingsreagensen inneholder en maleinr dogruppe som selektivt reagerer med sulhydryl-deler og en N-hydroksysuccinimidester for kobling til aminogrupper. Koblingsprosedyren består av to trinn: SMCC reagerer med antistoff aminogrupper etterfulgt av kobling mellom det avledete antistoffet til B-galaktosidase ved reaksjon av maleimidodelen med B-galaktosidase sulfhydrylgrupper.

5,3 mg SMCC ble oppløst i 250 yl vannfri N,N-dimetylformamid (DMF). Den virkelige konsentrasjonen av reaktive maleimidgrupper i denne oppløsningen ble bestemt ved reaksjon med en kjent mengde glutation, etterfulgt av bestemmelse av mengden av glutationsulf-hydrylgrupper ved bruk av Ellman's reagens (ibid). F.eks. ble 40 yl av denne DMF-oppløsningen fortynnet til 3 ml med HEPES/0,015 M NaCl-buffer. En prøve på 25 yl av denne vanndige oppløsningen av SMCC-oppløsning ble så kombinert med 825 yl HEPES/NaCl-buffer og 100 yl ImM glutation. Etter å ha stått ved romtemperatur i 15 minutter ble mengden av ureagert glutation bestemt ved bruk av Ellman's reagens (ibid) og egnete standarder (f.eks. ureagert

glutation og en prøve uten glutation). Flere bestemmelser ble gjort for hver SMCC-oppløsning, og gjennomsnittet av resultatene ble beregnet. Denne fremgangsmåten indikerte at DMF-oppløsningen av SMCC fremstilt som beskrevet ovenfor hadde en konsentrasjon på 52 mM av reaktive maleimidgrupper.

6,0 mg (40 mol) av monoklonalt antistoff fra mus ble kombinert med 400 ymol SMCC i et endelig volum av 533 yl av HEPES/0,15 M NaCl og fikk reagere 1 time ved 30°C. Reaksjonsblandingen ble så tilsatt en 1 x 24 cm kolonne av "Bio-Gel P-2" harpiks og eluert med HEPES/0,15 NaCl. Alle proteinholdige fraksjoner ble samlet sammen; proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av fremgangsmåten etter Sedmack og Grossberg [Anal. Biochem. 79:544

(1977)] og antallet maleimidgrupper ble bestemt som beskrevet ovenfor. Disse bestemmelsene indikerte en antistoffkonsentra-sjon på 1,98 mg/ml, med 1-2 maleimidgrupper/antistoffmolekyler. 28 mg av antistoff-maleimidkonjugat ble kombinert med 10 mg DTT-behandlet B-galaktosidase (endelig volum 2,45 yl) og fikk reagere 4 timer ved romtemperatur. Blandingen ble så tilsatt en 2,5 x 80 cm kolonne av "Sepharose 6B'C1" og eluert med HEPES/ 0,15M NaCl ved 4°C. Strømningshastigheten var 4 ml/timer; 3 ml fraksjoner ble samlet. Fraksjonene ble analysert med hensyn til B-galaktosidaseaktivitet og antistoff-bindingskapasitet. Fraksjonene 39-42 hadde begge egenskapene og ble samlet.

J. Fremstilling av biotin-merkete antistoffer.

Rensete antisera ble behandlet med N-hydroksysuccinimidesteren av biotin (tilgjengelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO eller Biosearch, San Rafael, CA) ved bruk av fremgangsmåter beskrevet i litteraturen [Oi et al (1982), J. Cell. Biol. 93:981; Heitzmann et al (1974) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 71:3537; Green

(1975) Adv. Protein Chem..29:85 ] .

K. Fremstilling av radioaktivt-merkete antistoffer.

Rensete antistoffer merkes radioaktivt ifølge fremgangsmåter angitt i litteraturen. Radioiodering utføres ved reaksjon

12 5

av antistoffene med I-merket 3-(4-hydroksyfenyl)propionsyre N-hydroksy succi.nimidester (tilgjengelig fra New England Nuclear, Boston, MA) ifølge fremgangsmåten angitt av Bolton og Hunter LBiochem. J. 133:529 (1973) J. Alternativt kan antistoffraksjonen kobles kovalent med et bifunksjonelt gelateringsmiddel [Yen et al (1979) Anal. Biochem. 100:152] og merkes deretter med et egnet radioaktivt metallion. Denne sistnevnte fremgangsmåten har den fordel at holdbarheten for antistoffraksjonen ikke begrenses av radioisotopens halveringstid.

L. Fremstilling alkalisk fosfatase-biotin-avidinkompleks.

Et alkalisk fosfatase-biotin-avidinkompleks fremstilles som beskrevet av Leary et al [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4045

(1983)]. Intestinal alkalisk fosfatase fra kalv kryss-bindes først ved reaksjon med di-succimidylsuberat, kobles deretter med N-hydroksysuccinimidester av biot i nyl-e-aminokapronsyre. Etter rensing merkes det alkaliske fosfatase-biotinkomplekset med avidin (som har 4 biotinbindingsposisjonur/avidinmolekyl) ved å kombinere det alkaliske fosfatase-biotinkomplekset med et lite molekylært overskudd av avidin. Enten avidin eller en bakteriell analog av avidin, steptavidin [Hofmann et al (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4666-4668; tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD] kan benyttes i dette siste trinnet.

Deteksjonssystemet som benyttes for det alkaliske fosfatase-biotin-avidinkomplekset består av nitro blå tetrazolium og 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat som beskrevet av Leary et al (ibid).

II. FREMGANGSMÅTER

A. Deteksjon av gram negativ bakterie i urin - (fremgangsmåte type 1) fast-fase, prøve immobilisert, hybridiseringsanalyse med tufA probe som har et kovalent interkålert dobbeltkjedet område, kontrollert med enzym-merket antistoff (se fig. 2).

Fordi dens sekvens er sterkt konservert, kan tufA-sekvensen fra E. coli benyttes til å detektere nærværet av gram negative bakterier i urinprøver. Kliniske urinprøver gjøres klare ved sentrifugering i kort tid (f.eks. 5 minutter) ved lav sentrifu-galkraft (f.eks. 8 000 rpm med en Sorvall GLC-3 sentrifuge). Bakterieceller i overvæsken lyæres og bakteriegenomet denatureres ved å gjøre urinprøven 0,5 M i natriumhydroksyd (NaOH) i 10 minutter ved en forhøyet temperatur (65°C). Alternativt kan dette gjøres ved å oppvarme urin til 90°C og opprettholde denne temperaturen i 10 minutter. Etter lysering og denaturering fortynnes urinprøven og nøytraliseres med et like stort volum av 20XSSPE (3,6 M NaCl, 0,2 M NaP04, 20 mM EDTA, pH 7,7). Urinprøven filtreres så gjennom en mikrocellulosemembran under svakt under-trykk. Det immobiliserte bakterielle DNA fikseres så til nitro-cellusemembranen ved oppvarming i vakuum til 80°C i 2 timer. Filteret som inneholder den immobiliserte DNA-prøven behandles med forhybridisert oppløsning [0,1% (vekt/volum) av hver av forbindelsene "Ficoll", polyvinylpyrrolidon og BSA i 5XSSPE, 100-200 yg/ml denaturert, heterolog DNA] i 1-3 timer ved 65°C.

Et volum på 50-100 yl av forhybridisert oppløsning benyttes pr. ca<2> av filteret. Etter forhybridiseringsbehandlingen tilsettes den etidiummerkete proben, fremstilt som beskrevet i del I-A ovenfor, til den forhybridiserte oppløsningen og hybridiseringen får finne sted (1-72 timer). Teknikkene som er omtalt ovenfor

er alle standard teknikker som finnes i litteraturen [Maniatis et al (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY].

Etter hybridiseringen, vaskes filteret for å fjerne overskudd probe DNA. Filteret neddykkes så i en oppløsning som inneholder B-galaktosidase-merkete antistoffer til interkalator-DNA-komplekset og inkuberes i fra 5 minutter til 12 timer. Overskuddet av antistoff fjernes så ved vasking og mengden av 6-galaktosidase forbundet med filteret bestemmes ved tilsats av et fluorogent substrat av enzymet (f.eks. 4-metylumbelliferon B-galaktosid)

og måling av f luorescens-intensiteten etter en viss tid. Fordi mengden av enzymet som er tilstede sannsynligvis er lav, tilsettes det fluorogene substratet i en konsentrasjon som er større enn eller lik dets Michaelis konstant (Km) for B-galaktosidase. Standarder med en definert mengde av probe immobilisert på filteret, kan kjøres samtidig, slik at hybridiseringen kan gjøres kvantitativ.

B. Detektering av adenovirus - (Fremgangsmåte type 2) sandwich hybridiseringsanalyse med merket probe som har et kovalent interkålert dobbeltkjedet område, kontrollert med enzym-merket antistoff (se fig. 3).

Denne fremgangsmåten er basert på sandwich hybridiseringsanalysen beskrevet av Ranki et al for detektering av adenovirus type 2 (Ad2) DNA i kliniske prøver [Ranki et al (1983) Gene 21:77, Ranki et al (1983) Current Topics in Microbiology and Immunology 104, Springer-Verlag, NY, side 307]. Den faste proben pKTHl202 (se del I-B ovenfor) .denatureres, rickes og immobiliseres på nitro-cellulosefiltere. Etter fiksering (oppvarming i vakuum ved 80°C

i 2 timer), behandles filterene med en forhybridisert oppløsning i 1 time ved 65°C. DNA fra kliniske prøver og den interkalator-merkete hybridiseringsoppløsningsprobe mkTH1206 (fremstilt som beskrevet i del I-B ovenfor) tilsettes til den forhybridiserte oppløsningen og hybridiseringen av probene med prøve DNA får finne sted i 1-72 timer. Etter hybridisering fjernes overskuddet av oppløsningsprobe (mkTHl206) ved vasking.

Omfanget av hybridiseringen bestemmes kvantitativt ved bruk av B-galaktosidase-merket antistoff til interkalator-DNA-kmmplekset som angitt i del II-A ovenfor. C. Detektering av human cytomegalovirus i urin (fremgangsmåte type 3) fast-fase, immobilisert probe hybridiseringsanalyse, kontrollert med biotin-merkete antistoffer og enzym-merket avidin (se fig. 4).

Denne fremgangsmåten benyttes for detektering av humantcytomega-logvirus (HCMV) i kliniske urinprøver. Den rensete proben (EcoRI 0 fragment av HCMV stamme AD169, som beskrevet i del I-C ovenfor) denatureres ved oppvarming til 90°C i 10 minutter, av-kjøles deretter raskt på is (for å forhindre renaturering) og kombineres med et like stort volum av 2OXESSPE (3,6 M NaCl, 0,2 M NaP04, 20 mM EDTA, pH 7,7). Den enkeltkjedete.probe DNA immobiliseres og fikseres på en nitrocellulosemembran ved hjelp av standard fremgangsmåter. Membranen behandles så med en forhybridisert oppløsning, fortrinnsvis en som ikke inneholder heterolog DNA. En forhybridiseringsoppløsning som kan benyttes er den som beskrives av New England Nuclear for deres "Gene

TM

Screen Plus " membraner; denne oppløsningen bestar av 1% SDS,

1 M NaCl, og 10% dekstransulfat. For å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffet i sluttrinnene av detekteringsprosedyren, kan det være ønskelig å innbefatte BSA i forhybridiseringsopp-løsningen.

Den kliniske urinprøven som skal undersøkes prepareres tilsvarende beskrivelsen gitt av Chou og Merigan [New Engl. J. Med. 308-921

(1983)]. Etter at prøven er gjort klar og HCMV fagpartiklene konsentrert ved sentrifugering, resuspenderes de i et minimalt volum av 0,5 M NaOK og får stå i 15 minutter. Etter nøytralisering med et minimalt volum av 20XSSPE, tilsettes de denaturerte kliniske prøvene til filteret i 1% SDS, 1 M NaCl, 10% dekstransulfat og 100 g/ml denaturert laksesperma DNA. Hybridiseringen får forløpe ved 65°C i 1-72 timer; filterene vaskes så i 2XSSPE.

Filterene neddykkes i et minimalt volum av en oppløsning som inneholder den valgte interkalator (f.eks. etidiumbromid i en submillimolar konsentrasjon). Biotinylert antistoff til DNA-interkalatorkomplekset (del I-J ovenfor) tilsettes så og får danne binding (1-24 timer). Overskudd av antistoff fjernes ved vasking. I noen tilfeller kan det være nødvendige å innbefatte interka-leringsmidlet i disse vasketrinnene, for å holde det dobbelt-kjedete DNA mettet.

Et streptavidin-biotin-alkalisk fosfatasekompleks (del I-L ovenfor) tilsettes så og forbindes til det biotinylerte antistoffet assosiert med DNA som beskrevet av Ward et al [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4045 (1983)]. Etter at overskudd av alkaliske fosfatasekonjugater er vasket bort, bestemmes nærværet av konjugater assosiert med filteret ved å tilsette et kolori-metrisk substrat for alkalisk fosfatase som beskrevet av Ward (ibid). Dette er et direkte mål for nærværet av HCMV DNA i den kliniske urinprøven. D. Deteksjon av humant cytomegalovirus i urin (fremgangsmåte type 4) fast-fase, interkalator-merket probe immobilisert hybridiseringsanalyse, kontrollert med radioaktivt-merket annet antistoff til interkaleringskompleks antistoff (se fig. 5).

Denne fremgangsmåten tilsvarer den i del II-C ovenfor, bortsett fra at proben allerede er merket med interkaleringsmidlet,•og det siste trinnet i detekteringsutførelsen krever et annet, isotopt merket antistoff.

i

Proben, etidiummerket Eco RI fragment O av HCMV (fremstilt som beskrevet i del I-D ovenfor) denatureres, immobiliseres og fikseres på en nitrocellulosebærer som beskrevet for fremgangsmåten i del II-C ovenfor. Viral DNA isoleres fra urinprøver, denatureres, og hybridiseres til den immobiliserte proben,også som beskrevet i del II-C ovenfor, bortsett fra at tilsats av fri interkalator er unødvendig.

Etter vasking av filteret med det hybridiserte DNA, tilsettes overskudd av monoklonalt antistoff fra mus til interkalator-DNA-komplekset (se del I-G ovenfor) og forbindes til det hybridiserte DNA interkalatorkomplekset (30 minutter til 6 timer). Overskudd av antistoff fra mus, fjernes ved vasking og overskudd av radioaktivt-merket hare-anti(mus IgG) (del I-K) tilsettes.

Etter en inkubering på 30 minutter til 6 timer, fjernes overskudd av antistoff igjen ved vasking. Hybridiseringen bestemmes kvantitativt ved autoradiografi eller gammatelling.

III. Demonstrasjon av antigenisitet for interkaleringskomplekser

A. Fremstilling av kovalente etidium-DNA-komplekser.

Ca. 250 mg laksesperma DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oppløses i 40 ml av 50 mM NaCl og kappes ved fem passasjer gjennom en nål (23 gauge). Det kappete DNA plasseres i en 250 ml flaske og fortynnes med 160 ml buffer. Etthundre* og førtifem mikroliter (145 yl) av S-^nuklease, 200 000 enheter pr. ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ), tilsettes og blandingen inkuberes ved 37°C i 50 minutter.

Reaksjonsblandingen ekstraheres så 2 ganger med fenol:kloroform,

en gang med kloroform, og DNA utfelles to ganger med etanol [Maniatis et al (1982) "Molecular■Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]. Den erdelige utfellingen qpp-løses i 70 ml 20 mM Tris-hydrokloridbuffer,pH 8,0.

Dette DNA reageres med 8-azidoetidium under følgende betingelser: Reaksjonsblandingen prepareres med 33 ml 2,7 mg DNA/ml, 13,5 ml

av 4,95 mM 8-azidoetidium, 13,5 ml av 0,2 M Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 02,2 M NaCl, og 76 ml vann. Blandingen plasseres i et 250 ml begerglass med en vannmantel som holdes ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 mintter ved hjelp av en 150 watts lyskaster i en avstand på 10 cm. Denne fotolysen gjentas med en identisk reaksjonsblanding.

De fotolyserte reaksjonsblandingene kombineres og ekstraheres

10 ganger, hver gang med et like stort volum av n-butanol mettet med 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Den ekstraherte DNA-oppløsningen kombineres med 23 ml av 4,.95 nuM 8-azidoetidium og 77 ml av 20 mM Tris-hybrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Denne oppløsningen omrøres i begerglasset med vannmantel, og fotolyseres i 90 minutter. Reaksjonsproduktene ekstraheres 10 ganger med buffer-mettet butanol som beskrevet ovenfor, og DNA utfelles med etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 1 mM EDTA og absorbansene ved 260 og 490 nm registreres. Beregninger utført som i eksempel IA ovenfor antyder at en etidiumrest er inkorporert pr. 4,5 DNA basepar.

B. Fremstilling av metylert tyroglobulin.

100 mg bovint tyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) kombineres med 10 ml vannfri metanol og 400 yl av 2,55 M HC1 i metanol. Denne blandingen omrøres på en rotasjonsblander ved romtemperatur i 5 dager. Utfellingen samles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Deretter tørkes den under vakuum over natten. Det oppnås ca.

82 mg tørt pulver.

C. Fremstilling av kovalent etidium-DNA metylert tyroglobulin-kompleks.

Femti milligram (50 mg) metylert tyroglobulin oppløses i 10 ml vann og 11,3 ml av en 2,2 mg/ml kovalent etidium DNA-oppløsning tilsettes. Det dannes straks et bunnfall og suspensjonen fortynnes med 5,0 ml av 1,5 M NaCl og 24,6 ml vann.

D. ■Immunisering av kaniner.

To milliliter (2 ml) av en blanding bestående av 2,5 ml av det kovalente etidium-DNA metylerte tyroglobulinkomplekset, 2,5 ml av en 0,15 M saltoppløsning og 5,0 ml av det fullstendige Freunds hjelpestoff injiseres i 4 subkutane posisjoner på en hvit New Zealand kanin. Tre uker deretter foretas tilsvarende immunisering med ufullstendig Freunds hjelpestoff etterfulgt av ytterligere immuniseringer med 4 ukers mellomrom. 14 uker etter den innledende immuniseringen, samles blod for fremstilling av antiserum.

E. Titrering av antistoff til etidium-DNA.

Antiserum til kovalent etidium-DNA titreres ved en enzymmerket immunosorbantanalyse. Polynukleotider adsorberes på veggene av polystyrenmikrotiterplater og deretter gis kaninantistoffet anledning til binding. Til sist detekteres antistoffet med peroksydasemerket geit anti-kanin IgG.

Femti mikroliter (50 wl) porsjoner av oppløsninger som inneholder

5 yg polynukleotid pr. ml i 15 mM natriumcitrat, pH 7,0, 0,15

M NaCl plasseres i brønner av "Immulon II" mikrotiterplater og rystes forsiktig ved romtemperatur i 2 timer. Deretter høstes brønnene og vaskes med 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% bovint serum albumin og 0,5% "Tween 20" (PBS/BSA/Tween).

Kanin antiserum fortynnes med 10 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% BSA og 50 yl porsjoner tilsettes brønnene og får stå

i 30 minutter. Brønnene vaskes tre ganger med PBS/BSA/Tween. Peroksydase kovalent koblet til geit-antikanin IgG (Cappel Laboratories, Cochranville, PA) fortynnes 500 ganger i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% BSA og porsjoner på 50 yl tilsettes hver brønn. Denne oppløsningen får stå i brønnene i 30 minutter ved romtemperatur og brønnene vaskes deretter tre ganger med PBS/BSA/Tween.

Etthundre mikroimolar (100 yM) etidiumbromid tilsettes det for-tynnete antiserum i brønnene som inneholder ikke-kovalent etidium-DNA-kompleks og etidium kontrollbrønnene. Alle vaskeoppløsninger og reagenser som beskrevet ovenfor for bearbeidelse av disse brønnene inneholder 100 pM etidium.

En peroksydase substratoppløsning fremstilles med:

20 mg o<->fenylendiamin

5 ml 0,5 M NaHP04

12 ml 0,1 M natriumcitrat

13 ml vann

20 1 30% hydrogenperoksyd

Syttifem mikroliter (75 yl) av substratoppløsning tilsettes hver brønn og får reagere i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene slukkes ved tilsats av 50 pl 2,5 M svovelsyre. Deretter registreres absorbansene ved 488 nm med en "Artek Model 210" mikrotiter platefotometer.

Normalt kaninserum benyttes som kontrollstoff og bearbeides som beskrevet for kaninantiserumet.

F. Resultater.

Resultatene er gjengitt i tabell A og viser at antistoffet i kontrollkaninserumet ikke bindes i betydelig grad til noen av de belagte eller ubelagte brønnene. Det kan ha en svak antistoff-titer til enkéltkjedet DNA.

Antiserum til det kovalente etidium-DNA har en svært høy titer til kovalent etidium-DNA. Deler av disse antistoffene bindes sannsynligvis til etidiumrester som er koblet kovalent til fosfat-ribosekjeden. Denne konklusjonen er basert på den observasjon at titerne til det ikke-kovalente etidium-DNA-komplekset er mye lavere (se tabell A).

Disse resultatene viser at det kan dyrkes antistoffer til etidium-DNA interkaleringskomplekset som ikke kryssreagerer i betydelig grad med opprinnelige enkelt- eller dobbeltkjedete nukleinsyrer.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøksmedium som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer, som innbefatter trinnene kombinering av forsøksmediet med (i) en nukleinsyreprobe som innbefatter minst en enkéltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal bestemmes i forsøks-mediet, under betingelser som er fordelaktige for hybridisering mellom sekvensen som skal bestemmes og den komplementære sekvensen i proben, og bestemmelse av den hybridiserte probe, karakterisert ved at det også tilsettes en nukleinsyreinterkalator som enten kombineres med forsøksmediet som en separat,fri forbindelse og bindes ikke-kovalent med dobbeltkjedet nukleinsyre, slik at det dannes interkaleringskomplekser, eller som er kjemisk bundet til proben i det enkeltkjedede komplementære området av proben, hvorved interkaleringskompleksene dannes i slike områder ved hybridiseringen, og nærvær av hybridisert probe detekteres ved tilsats av et antistoff, eller et fragment derav, som er i stand til å reagere med interkaleringskomplekser i det resulterende hybridiseringsprodukt, men ikke med interkalatoren alene eller med interkalatoren bundet til enkéltkjedet nukleinsyre og bestemmelse av antistoffet eller fragmentet derav som bindes til slike komplekser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at interkalatoren som anvendes er etidium.

3. Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøksmedium, som innbefatter en nukleinsyreprobe som inneholder minst en enkéltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær til sekvensen som skal detekteres, karakterisert ved at det i tillegg inneholder en interkalator, som enten er en separat, fri forbindelse, som i det vesentlige ikke er kompieksdannet med nukleinsyrer, eller er kjemisk bundet til et enkéltkjedet område av proben, slik at dupleksdannelse i slike områder gir dannelse av interkaleringskomplekser, og et antistoff eller et fragment derav, som er i stand til å danne binding med interkaleringskomplekser, men ikke med interkalatoren alene eller med interkalatoren bundet til enkéltkjedet nukleinsyre, som innbefatter dobbeltkjedet nukleinsyre kompleksdannet med interkalatoren•